Analyses structurales des protéines par MS

en condition in situ

Julien Franck

Laboratoire PRISMProtéomique, Réponse Inflammatoire &

Spectrométrie de MasseINSERM U1192

Laboratoire PRISM (Protéomique, Réponse Inflammatoire & Spectrométrie de Masse)-Campus Universitaire Lille 1-Bâtiment SN3, 1er étage

Localisation

Mr. Jean-Pascal Gimeno

Plateforme CLIC-Imaging Bâtiment SN3, Porte 107, Université Lille 1

59655 Villeneuve d’Ascq CedexTel : (+33) 03 20 33 60 32

Jean-Pascal.Gimeno@univ-lille1.fr

Nous contacter

Plateforme CLIC-IMAGINGImagerie MALDI MS et Micro-protéomique

Plateforme CLIC-IMAGINGImagerie MALDI MS et Micro-protéomique

Spectromètres (8)- MALDI-TOF/TOF, Ultraflex II, Bruker Daltonics- MALDI-TOF, Autofkex Speed, Bruker daltonics- MALDI-LTQ-Orbitrap, Thermo Scientific- SYNAPT 2GS, IMS, ETD, Waters- QExactive, Thermo Scientific- Qexactive+, Thermo Scientific- HCT Ultra, ETD, Bruker Daltonics

Equipements

Techniques Séparatives- 1 Nano LC, Easy-nLC II, Proxeon- 1 Nano UHPLC, EASY- nLC 1000, Proxeon- 1 Nano UPLC, Aquity, Waters- 1 électrophorèse capillaire , PA 800, Beckman -Coulter

Préparation d’Echantillons- 1 système nanoESI haut débit + micro-extraction par LMJ, LESA Nanomate

Triversa, Advion- 1 Micro-spoteur piézoélectrique, CHIP 1000, Shimadzu- 1 Micro-sprayeur, ImagPrep, Bruker Daltonics- 1 cryostat- 1 Scanner de lames

2 IE (1 ½ ETP) Jean-Pascal Gimeno et Dounia MouajjahPersonnels

I. Sacrifice & dissection de l’organe

II. sections & transfert sur lames de verre ITO

III. Dépôt de la matrice

(Cryostat, Microtome)

M/z

Inte

nsity

(a.u

.)

M/z1 M/z2 M/z3

x1 x2 x3 x4 … … xn

y1 I1;1 I1;2 I1;3 I1;4 … … I1;n

y2 I2;1 I2;2 I2;3 I2;4 … … I2;n

y3 I3;1 I3;2 I3;3 I3;4 … … I3;n

y4 I4;1 I4;2 I4;3 I4;4 … … I4;n

y5 I5;1 I5;2 I5;3 I5;4 … … I5;n

y6 I6;1 I6;2 I6;3 I6;4 … … I6;n

y7 I7;1 I7;2 I7;3 I7;4 … … I7;n

x1 x2 x3 x4 … … xn

y1 I1;1 I1;2 I1;3 I1;4 … … I1;n

y2 I2;1 I2;2 I2;3 I2;4 … … I2;n

y3 I3;1 I3;2 I3;3 I3;4 … … I3;n

y4 I4;1 I4;2 I4;3 I4;4 … … I4;n

y5 I5;1 I5;2 I5;3 I5;4 … … I5;n

y6 I6;1 I6;2 I6;3 I6;4 … … I6;n

y7 I7;1 I7;2 I7;3 I7;4 … … I7;n

x1 x2 x3 x4 … … xn

y1 I1;1 I1;2 I1;3 I1;4 … … I1;n

y2 I2;1 I2;2 I2;3 I2;4 … … I2;n

y3 I3;1 I3;2 I3;3 I3;4 … … I3;n

y4 I4;1 I4;2 I4;3 I4;4 … … I4;n

y5 I5;1 I5;2 I5;3 I5;4 … … I5;n

y6 I6;1 I6;2 I6;3 I6;4 … … I6;n

y7 I7;1 I7;2 I7;3 I7;4 … … I7;n

IV. Analyse MALDI

V. Traitement des données et reconstruction des images

micro-dépôtou micro-sprayautomatique

Fournier et al., Expert Rev. Proteomics (2008) 5(3): 413Wisztorski et al. Dev. Neurobiol. (2008) 68: 845Franck et al., Mol. Cell. Proteomics (2009) 8(9): 8023

m/z1 m/z2 m/z3

Imagerie MALDI MS

m/zIn

ten

[a.u

.]m/z

Inte

n [a

.u.]

m/z

Inte

n [a

.u.] =+++

5

Imagerie MALDI MS

Imagerie MALDI MSm/z 1066.63

m/z 2110.14

2015

Outils Bioinformatiques

Temps d’Acquisition

Résolution Spectrale

2002

Résolution Spatiale

Domaines d’Applications de CLIC-Imaging

•Cancer- Cancer gynécologiques (ovaires, trompes, endomètres,…)- Cancer de la prostate- Gliomes

Oncologies

•Maladies neurodégénératives- Parkinson, Alzheimer, Epilepsie, ALS

Pathologies du Système Nerveux

• Cerveau et périphérie- Lésion de la moelle épinière- Microbiome(Intestin)- Rate, poumon (infection bactérienne)- Inflammation de la peau(psoriasis, Acné, dermatite)- Yeux

Inflammation

• Perturbateurs Endocriniens• Petites molécules

Maladies endocrines

MSI TriclosanCancer prostate

Imagerie MALDI MS Exemples d’Applications

Suivi & Quantification de Médicaments- Organes ou Whole Body, Etudes DMPK

Imagerie de Xénobiotiques- Triclosan dans le Cancer de la prostate

Imagerie de lipides Imagerie de peptides/protéines

MSI lipides dansl’œil de lapin

Recherche de marqueurs de pathologies- Cancer, maladies neurodégénératives,….

Identification des marqueurs (micro-protéomique)- Marqueurs diagnostics / pronostics- Compréhension des mécanismes physiopathologiques

Histologie Moléculaire- Classification de pathologies

m/z 1066.63

MSI peptides hyppocampe de

patients TLE

MSI Imatinibrein de souris

2-hydroxymethyl metabolite

N-desmethyl metabolite

MSI Olanzapine et métabolites dans WBA souris

Micro-protéomique

m/z 782.528m/z 782.579m/z 782.633

Cancer Normal

MSI Peptidescolonie bactérienne

MSI marqueurCancer de l’ovaire

Identification de marqueurs Cancer de l’ovaire

OLZ

De l’Imagerie MS à l’identification de MarqueursUn lien entre l’imagerie et la protéomique

???

MALDI MSI

Localisation & Classification Moléculaire

Protéomique Conventionnelle

Identification &

Quantification

MALDI MS Imaging & Identification• MS2 in-situ sur tissue• Top-Down: ISD (par de sélection d’ion précurseur, non applicable sur FFPE)• Bottom-Up: Très forte complexité due à la digestion enzymatique

Micro-échantillonnage par Microextraction (LMJ)

S1P111

S2P117

S3P140

48

8453

1405

S1 vs S3 S2 vs S3

S1 vs S2

Position 1: Thalamic nucleus

• 1350 grouped proteinsidentifiées

• 1900 cellules analysées• Grande reproductibilité (< 5%

variation pour une même position)

197 2721137

Quanico et al, J. Proteomics (2013) 79: 200-18

Bottom-Up Microproteomique

De l’Imagerie MS à l’identification de Marqueurs

Longuespée R. et al., Proteomics Clin Appl. (2013) 7 (5-6): 337 / Wisztorski M. et al., Proteomics Clin. Appl. (2013) 7(3-4): 234Longuespée R. et al., Cancer Metastasis Rev., 2012, 31(3-4):713 / Vaysse C. et al., J Gynecol Oncol., 2011, 22(1): 9

85% de cancers épithéliaux- 70% origine séreuse dont 90% de hauts grades & 10% de bas grades-Autres: carcinomes endométrioïdes (10-15%), cellules claires (10%) & mucineux(3%)

Cancer Séreux de Haut Grade (HGSC) FFPE conservation 10 ans

Mésothélium Vaisseau sanguin Microdigestion & Microextraction

Région Bénigne

Région cancéreuse

315 123669CD44

VCANEZRIN

MAPK1

STIP-1

Myc

ARF

HUWE1 p53

RPL5

TIF-1

PML ACTR3

Bénin

Cancer

Application à l’étude de tissus FFPE du Cancer de l’Ovaire

Stratégie

Franck et al, Anal. Chem., 2013 85(17): 8127-34

4. Identification des Protéines

1. Echantillonnage des TissusQuadrillage de pixels

eg. Parafilm Assisted Micro-exision

5. Quantification Relative1 pixel vs tous les autres (Label Free)

2. Collecte des TissusPar pixels

3. Analyse Protéomiqueeg. ShotGun

6. Reconstruction des Images sur les données de

quantification

[x1, y1] [x2, y1]-------------------------- [xn, y1][x1, y1]

[x1, y2]

[x1, yn]

0 1 2 1 1 2

1 1 1 1 0 0 0

2 1 0 0 1 0 0

1 0 0 0 0 0 1

0 1 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 1 1

0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 1

0 0 0 0 0 0

Toll-interacting protein

Vers l’imagerie MS Quantitative des Protéines

Imagerie Possible des Protéines de plus faible abondance

Parafilm Assisted Micro-excision sur coupe entière

Franck et al, Anal. Chem., 2013 85(17): 8127-34

ProSAAS Chromogranin-B Chromogranin-C Granulins Angiotensin-converting enzyme

Oxytocin-neurophysin 1

Vasopressin-neurophysin 2-

copeptin

Somatostatin Proenkephalin-ACD82 antigen

IL-16 Glia maturation factor beta

Pleiotrophin Disks large homolog 4

Basigin/Glycoprotein CE9

Leucine-rich glioma-inactivated protein 1

Macrophage migration inhibitory

factor

Prohibitin

100 %

0 %

Vers l’imagerie MS Quantitative des Protéines

Images MALDI Segmentation

Tumor

PAM

Bénin Tumeur

117 2081154

Identification des protéines

Analyse des réseaux de protéines

Tissu tumoralProstate tumors

Application à l’étude de tissus frais du Cancer de la prostate

Identification Top-Down par Microproteomique

MWexp = 17268.949 DaMWth = 17.268.9 Da

Error = 4.31 ppm

PTM profile de la Stathmin

ROI1

ROI2

80 Da

Nter-Ac + 1P + 2 P

80 Da

ROI3

m/z 772.577

m/z 844.703

80 Da

80 Da 80 Da

15 178

115 5

16

ROI3ROI1

ROI2

ROI1 ROI2

ROI3

m/z 864.686

Micro-Echantillonnage par Microextraction

1983

Today

Low spatial resolution2D imaging High spatial

resolution 2D imaging High spatial resolution 3D imaging

Vers un Imagerie Basée sur la Quantification HR et 3DAnalyse Structurale in situ?

Vers l’imagerie MS Quantitative des Protéines

Pontages intra-protéine

Pontage inter-protéine

Pontage Digestion

Analyses MS(MALDI-TOF)

Helin et al, RCMS, 1999

Pontages intra-protéines• Repliement de la protéine• Résidus proches • Informations sur la structure

Pontages inter-protéines• Partenaires d’interaction• Régions et distances d’interaction

Analyses MS & MS2

Peptides non pontés

Vers l’analyse structurale in situ par pontage chimiquePrincipe de la stratégie de pontage chimique par MS (XLMS)

Purification par affinité Sélection par marquage isotopique

Sulfo-SBED

Δ = 4.0247 Da

4Δ = 4.0243 Da

ESI-MS

xQuest/xProphet

Candidat peptide

Protéine cible

Partenaire

Purification par affinité sur colonne

de streptavidine

Protéines pontées avec réactif léger

Protéines pontées avec réactif lourd

biotine

Vers l’analyse structurale in situ par pontage chimiqueXLMS de mélanges complexes

Définition et découped’une région d’intérêt

2 mm

1

1. Réaction de pontage2. Réduction, alkylation,

digestion3. Dessalage

2 4

Analyse des 3 fractionspar nanoLC-MS/MS

3 Fractions

Fractionnement par chromatographie

d’exclusion stérique

Abso

rban

ce (A

U)

Volume (mL)

3

1 2 3

Fractions

5 6 7

I D E N T I F I C A T I O N D E S P R O T É I N E S E T P O N T A G E S P A R A N A L Y S E B I O I N F O R M A T I Q U E

P O N T A G E C H I M I Q U E S U R T I S S U E T A N A L Y S E P A R S P E C T R O M É T R I E D E M A S S E

Fraction 1

Fraction 2

Fraction 3

PROTEOMEDISCOVERER

Fraction 3 Fraction 1Fraction 2

8

Identification des protéines de la région

d’intérêt

Génération de labase de données

.fasta

Validationdes pontages identifiés

Recherchedes pontages

Vérification de lastructure

tridimensionnelle

Vers l’analyse structurale in situ par pontage chimiqueStratégie pour le XLMS sur tissus (TXLMS)

Heat shock cognate 71 kDa proteinLys325-Lys319 D = 9.7 Å

Spectre MS/MS d’un fragment ponté intramoléculairede la protéine HSC 70

Validation des données d’interaction obtenues / structure tertiaire

Ions fragments non pontésIons fragments pontés

DAKLDKSQIHDIVLVGGSTR

GTLDPVEKALR

Vers l’analyse structurale in situ par pontage chimiqueTXLMS et pontages intramoléculaires

Histone H2B (bleu)-H2A (cyan)K35-K37, Score = 34.31D = 15.4 Å

Tubuline α1(bleu)-Tubulineβ4(cyan) K112-K252, Score = 36.86D = 19.5 Å

Actine F homodimère pontageinter chaineK113-K191, Score = 42.12D = 14.9 A

Histone H2B (bleu)-H2A (cyan)K37-K86, Score = 26.58D = 20.4 Å

ATP synthase sous unité βK133-K159, Score = 30.23D = 14.3 Å

Tubuline α1 K96-K112, Score = 27.88D = 13.5 Å

Pompe Na/K sous unité a ATPaseK602-K352, Score = 28.44D = 24.4 Å

Heat shock cognate 71 kDaproteinK505-K510, Score = 31.18 D = 13.4 Å

Profilin 2K89-K68, Score = 30.23D = 5.7 Å

Malate deshydrogenaseK239-K236, Score = 35.62D = 5.5 Å

Histone H3K57-K65 Score = 36.88D = 20.3 Å

1433-gK69-K78, Score = 34.28D = 10.8 Å

Vesicle-associated membrane protein 2K59-K52, Score = 37.17D = 10.3 Å

Heat shock cognate 71 kDa proteinK325-K319, Score = 40.56D = 9.7 Å

Vers l’analyse structurale in situ par pontage chimiqueTXLMS et pontages intramoléculaires

Syntaxin binding proteinP sur S306, S313 et T574

Serine/threonine proteinphosphatase 5

Ions fragments non pontésIons fragments pontés

• Technique capable d’identifier de probables nouvelles interactions• Pourrait permettre de décrire de nouveaux processus biologiques importants

REPLPSLEAVYLITPSEKVSMSLISDFK

KYIKGYYR

Vers l’analyse structurale in situ par pontage chimiqueTXLMS et interactions protéines-protéines

Vers l’analyse structurale in situ échange H/DPrincipe de l’échange H/D in situ (TDXMS)

Vers l’analyse structurale in situ échange H/DPrincipe de l’échange H/D in situ (TDXMS)

Vers l’analyse structurale in situ échange H/DComparaison HDX solution vs tissu

Solution

Tissu

0

10

20

30

40

50

0 200 400

Deut

eriu

m In

corp

orat

ed

Time, min

m/z 8128

R1R2R3

Vers l’analyse structurale in situ échange H/DTDXMS à partir de 3 régions différentes

Taux d’échange différent dans la région 3• Partenaires d’interaction différents?• Différente conformation?

Vers l’analyse structurale in situ échange H/DTDXMS à partir de 3 régions différentes

kexFast Slow

R1 0.0184 3.30E-03R2 0.0061 3.30E-03R3 0.0186 1.90E-03

• Scientifiques M. Salzet, M. Wisztorski, C.Meriaux, J-P. Gimeno, D.Mouajjah, J. Quanico, A. DesmonsB. Fatou, M. Duhamel, S. Devaux, P. Saudemont, T. Maulouet

• Cliniciens CHRU et COLProf. D. Vinatier, Prof. P. Collinet, Dr. J-P. LucotProf. E. Leblanc, Dr. F. Narducci, Dr. Y-M. Robin, Dr. I. Farré,

MENESR-Institut Universitaire de France (IUF Junior)

INCA-SIRIC ONCOLILLE , Grant INCA-DGOS-INSERM 6041aa

ANR-ANR Santé-Bien Etre CE17, REALITY’MS

INSERM-Programme PhysiCancer

MATWIN-Best Breakthrough Innovation Awards

Soutiens Financiers

ET MERCI POUR VOTRE ATTENTION…

Merci à

Remerciements