Análisis PCR cuantitativo de ADN, ARN y proteínas en la misma célula única

A. Ståhlberg, C. Thomsen, D. Ruff y P. Åman

Diciembre de 2012

http://www.clinchem.org/content/58/12/1682.full

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IntroducciónIntroducciónEl valor agregado de los análisis de células únicas

Permiten realizar estudios entre diferentes subpoblaciones/tipos de células en una muestra biológica combinada

Permiten realizar estudios de heterogeneidad dentro de un tipo específico de células

Permiten la detección y el estudio de células poco comunes

>Ejemplos de aplicaciones para células únicas- Caracterización del destino de las células en la diferenciación de las células madre

- Identificación y caracterización de células tumorales en circulación

- Caracterización del genotipo y fenotipo de células tumorales

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IntroducciónIntroducciónTécnicas de células únicas (ejemplos)

Secuenciación de nueva generación Citometría de flujo Espectrometría de masas Técnicas de hibridización de fluorescencia in situ Microarreglos

>PCR cuantitativo en tiempo real- Tecnología tradicional con muchos usuarios

- Aceptación y conocimientos amplios en la comunidad científica

- Puede combinarse con otros métodos- Diversas aplicaciones

Consultar editorial adjunto: S. Darmanis, C. Gallant y U. Landegren. PCR-Based Multiparametric Assays in Single Cells (Ensayos multiparamétricos basados en PCR en células únicas). Clin Chem 2012;58:1618-19.

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Pregunta 1Pregunta 1

¿Cuáles son las ventajas y desventajas de las actuales técnicas de células únicas?

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Materiales y métodos Materiales y métodos Muestras

- Línea celular de fibrosarcoma humano HT1080- Expresión ectópica de proteína verde fluorescente con marca fundida en sarcoma (FUS-GFP) usando transfección transitoria

Obtención de células- Disociación de células con tratamiento de tripsina- Obtención de células mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)

Protocolo libre de purificación- Solución amortiguadora liberadora de analitos- Lisis eficiente de todos los analitos sin inhibición (consultar suplemento para obtener detalles)

División de muestras- PLA y RT requieren diferentes condiciones para la ejecución

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Figura 1. Esquema del flujo de trabajo experimental para la medición de ADN, ARN y proteínas en la misma célula única. Usamos el 40% de cada célula para el análisis de proteínas, el 40% para el análisis de ARN y el 20% para el análisis de ADN.

Diseño Diseño experimentalexperimental

Muestra biológica

Análisis de

datos

Análisis de datos

Análisis de datos

PCR en tiempo real

PCR en tiempo real

PCR en tiempo real

Transcripción inversa

Ensayo de ligadura de proximidad

Obtención de células y lisis

Suspensión en célula única

Análisis de proteínas

Análisis de ADN

Análisis de ARN

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Pregunta 2.Pregunta 2.

¿Cuáles son los cuellos de botella del flujo de trabajo experimental actual?

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ResultadosResultados

Resultado de los ensayos de ARN y ADN Todos los ensayos fueron específicos y sensibles para

la detección de todos los analitos en el nivel de célula única, teóricamente al nivel de molécula única

En principio, rango dinámico ilimitadoResultado del ensayo de proteínas

Específicos y sensibles para detectar proteínas en el nivel de célula única

Rango dinámico: ~3 órdenes de magnitud Genera señal de fondo debido a ligadura no específica

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Figura 3. Análisis de concentraciones de proteína en células únicas con producción de proteína FUS-GFP variable. (A), Células individuales con diferentes niveles de fluorescencia GFP (ninguna, baja, intermedia y alta) medidas y ordenadas mediante FACS. (B), Análisis de PLA-qPCR de concentraciones de proteína FUS-GFP correlacionados con fluorescencia GFP con medición de FACS (Coeficiente de correlación de Spearman, 0.86. P < 0.001). Tener en cuenta que algunas células sin fluorescencia GFP medidas por FACS demostraron una producción de proteína FUS-GFP sobre aquella de control negativo para proteínas (NPC).

Validación de reacción en cadena de la Validación de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con prueba de polimerasa cuantitativa con prueba de ligadura de proximidad (PLA-qPCR) ligadura de proximidad (PLA-qPCR) mediante FACSmediante FACS

Figura 3:En donde:GPF low = GPF bajoGPF intermediate = GPF intermedioGPF high = GPF alto

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Correlaciones de Spearman entre todos los analitos para todas las Correlaciones de Spearman entre todos los analitos para todas las células únicas con incremento de la intensidad de fluorescencia GFPcélulas únicas con incremento de la intensidad de fluorescencia GFP

Proteína FUS-GFP

ADNFUS-GFP

mARNFUS-GFP

ADN/ARNFUS

mARN CCND1

mIARN MIR31

ncARNSNORD48

Proteína FUS-GFP

1

ADN FUS-GFP

0.37** 1

mARN FUS-GFP

0.31** 0.41** 1

ADN/ARN FUS

0.36** 0.44** 0.92** 1

mARN CCND1

-0.11 -0.29* -0.16 0.10 1

mIARN MIR31

-0.10 -0.11 0.02 0.17 0.59** 1

ncARN SNORD48

-0.10 -0.21 0.07 0.24* 0.71** 0.66** 1

Correlaciones moderadas entre ADN FUS-GFP,

mARN y proteína

FUS es un factor de transcripción

CCND1, MIR31 y SNORD48 son

potenciales objetivos descendentes de FUS

Tabla 1. Los coeficientes de correlación de Spearman estadísticamente significativos (P < 0.01, y P < 0.05) están marcados (* y **, respectivamente). ADN FUS-GFP indica ADN codificador de FUS-GFP; ARN FUS-GFP indica ARN codificador de FUS-GFP; CCND1 ciclina D1; FUS, fusionado en sarcoma; MIR31, microARN 31; SNORD48, ARN pequeño nucleolar, C/D box 48

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Pregunta 3.Pregunta 3.

¿Cómo pueden utilizarse las correlaciones entre analitos para abordar cuestiones biológicas?

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Figura 4. El efecto de la expresión de FUS ectópica. CCND1 (verde), miR31 (rojo) y SNORD48 (azul) correlacionadas con (A) FUS endógeno (negro), pero no (B) FUS de expresión ectópica (negro). Al dar por supuesta la ergodicidad, las distribuciones en un punto de tiempo dado pueden observarse como una expresión con el transcurso del tiempo. La correlación positiva entre los ARN puede explicarse, por ejemplo, mediante una regulación de transcripción común.

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ConclusionesConclusiones

El ADN, el ARN, y las proteínas pueden medirse de forma precisa en la misma célula única usando PCR cuantitativa.

El método descripto es compatible con la mayoría de los enfoques de muestreo celular y genera resultados para el mismo parámetro de todos los analitos medidos, una característica que facilita el análisis de datos comparativo.

El análisis de múltiples analitos en la misma célula única ofrece nuevas posibilidades para estudios de correlación detallados.

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