Aislamiento de plásmidos

Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico

Realizar el aislamiento de DNA plasmídico

Organismo/otro Pares de bases (pb) Genes Comentarios

E. coli K-12 4,639,221 4,377 4,290 of these genes encode proteins; the rest

RNAs

E. coli O157:H7 5.44 x 106 5,416 strain that is pathogenic for humans; has 1,346

genes not found in E. coli K-12

Vector

recombinante

pEXP42-ZmHXK8

7312 4 ZmHXK8, gen de resistencia ampilicina (β-

lactamasa), represor lac, Proteína Rop

DNA cromosomal

La extensión de DNA

que tiene cada

organismo no es la

misma.

El DNA a pesar de su

extensión tiende a

formar una estructura

helicoidal compacta.

Doble hélice

Estabilizada por puentes de hidrógeno

En la célula generalmente superempacada o superenrollada

Linealizado: Es decir cuando se ha cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez.

Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas

DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado.

Superenrrolado: Covalentemente cerrado y muy empacado

Superenrollado desnaturalizado. Parecido al anterior pero un poco menos empacado

Existen varias conformaciones de los plásmidos en el estado superenrollado.

Propiedad que modifica su migración en un campo eléctrico: mismo

peso molecular distinta migración

Relajado-

Superenrollado-

El calor, pH, la concentración de iones, influyen en la estabilidad de la doble hélice.

En la desnaturalización se deshace su estructura nativa, es decir se eliminan sus puentes de hidrógeno.

Dos hebras separadas que se pueden volver a unir o renaturalizar.

Se puede renaturalizar

Para renaturalizar el DNA hay que hacerlo en condiciones suaves para que el apareo de bases sea el correcto.

De no ser así se pueden producir agregados fácilmente precipitables.

Apareamiento parcial

Cuando los puentes de hidrógeno entre las cadenas complementarias

del DNA plasmídico circular se rompen, ya sea por calentamiento o

por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el

enrollamiento de las dos cadenas no se ha perturbado grandemente.

En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA cromosomal se

renaturalizan rápidamente ya sea por enfriamiento o al restaurar el

pH neutro de la solución y la fidelidad de la reasociación es

substancialmente diferente para ambas macromoléculas.

La re-naturalización de los plásmidos circulares es rápida

porque las cadenas se encuentran próximas. Mientras el DNA

lineal se re-naturaliza menos rápidamente formando agregados

que se pueden remover de la suspensión por centrifugación.

El plásmido permanece en solución y puede ser precipitado con

alcohol después de remover el DNA cromosomal.

1. Lisar células y desnaturalizar

biomoléculas.

2. Neutralización. Se renaturaliza solo el

DNA plasmídico generalmente usando

una solución de acetato de sodio (la alta

[acetato de sodio] ocasiona la

precipitación de los complejos proteína-

SDS y el RNA de alto peso molecular)

3. Centrifugar para separar DNA

cromosomal y los contaminantes del

DNA plasmídico

4. Precipitación alcohol para purificar el

plásmido o purificación a través de

columna.

1

2 3 4

Columna de intercambio aniónico

Ejemplos: POROS Anion Exchange Resins, Qiagen, Toso

Haas, Sterogene, Spherodex, Nucleopac, and Pharmacia.

The column is washed with several bed volumes of the

buffer.

The flow-through peak contains virtually no plasmid DNA,

indicating nearly complete DNA binding to the column matrix.

Plasmid DNA is eluted from the column with a single step salt

elution

Columnas de silica

Unión de DNA por absorción en

presencia de alta concentración de

sales y con un agente agregante

(polietilenglicol) para mantener el

DNA en forma compacta

(superenrollada o supercoiled)

El DNA se une a la resina en

presencia de polietilenglicol

El DNA se eluye en presencia o

ausencia del polietilenglicol con

la adición de sales.

Formación de puentes salinos

Published in: Peter E. Vandeventer; Jessica S. Lin; Theodore J. Zwang; Ali Nadim; Malkiat S. Johal; Angelika Niemz; J. Phys. Chem. B 2012, 116, 5661-5670.

DOI: 10.1021/jp3017776

Copyright © 2012 American Chemical Society

Reversible interactions between DNA and silica are utilized in the solid phase

extraction and purification of DNA from complex samples. Chaotropic salts

commonly drive DNA binding to silica but inhibit DNA polymerase amplification.

GenElute™ Plasmid Miniprep Kit

200 µL Lysis solution

350 µL Neutralization solution

500 µL Column preparation solution

750 µL Wash solution

100 µL Elution solution

200 µL Resuspension solution

Una vez que se tenga el plásmido purificado entonces:

A. Medir la absorbancia a 260 y 280 m. B. Estimar la concentración. C. Correr una muestra en un gel de agarosa

(Sin embargo, haremos la restricción antes de correr)

D. Guardar a –20°C o HACER RESTRICCIÓN

Determinación de concentración

Determinación de pureza

Determinación de integridad (corrimiento electroforético)

Índice de absorbancias a 260 / 280 nm

Ensayo de restricción (2 h incubación de DNA con enzimas) + adición de RNAasa.

Corrimiento electroforético: Gel de agarosa (aprox 45 min; próxima sesión de 4 h)

Continuamos con:

https://www.youtube.com/watch?v=O4oLyd2mZv8&nohtml5=False