Agarose Gel Electrophoresis

الكهربائي( الفصل)هالم الرحالن

• Gel electrophoresis is a widely used technique

for the analysis of nucleic acids and proteins.

Agarose gel electrophoresis is routinely used

for the preparation and analysis of DNA

هالم الرحالن الكهربائي هو أحد التقنيات واسعة اإلستخدام لتحليل •

األحماض النووية والبروتين

تستخدم هذه التقنية بشكل روتيني لتحضير وتحليل الدنا•

• Gel electrophoresis is a procedure that

separates molecules on the basis of their rate

of movement through a gel under the influence

of an electrical field

هذه التقنية هي عملية لفصل الجزيئات على قاعدة معدل تحركها عبر •

الجل تحت تأثير الحقل الكهربائي

• We will be using agarose gel electrophoresis

to determine the presence and size of PCR

products. PCR products indicate the

presence of DNA

يستخدم هالم الرحالن الكهربائي لتحديد وجود وحجم منتج •

، حيث أن وجود منتج البلمرة (PCR)اإلسترداد أو البلمرة

أواإلسترداد يعني وجود الدنا

• DNA is negatively charged

يحمل الدنا شحنات كهربائية سالبة

+ -

Power الطاقة

DNA

• When placed in an electrical field, DNA will migrate toward the positive pole (anode)

(األنود)عندما يوضع في حقل كهربائي، فإن الدنا يهاجر نحو القطب الموجب

H

O2

Scanning Electron Micrograph

of Agarose Gel (1×1 µm)

• Polymerized agarose is porous,

allowing for the movement of DNA

يسمح مبلمر األقروز غير المسامي بحركة الدنا

+ -

Power

DNA

How fast will the DNA migrate?

بأي سرعة يهاجر الدنا؟

Size of the DNA! حجم الدنا

*Small DNA move faster than large DNA

النا الصغير يتحرك أسرع من الدنا الكبير…gel electrophoresis separates DNA according to size

هالم الرحالن يفصل الدنا بحسب حجمها

small large

Within an agarose gel, linear DNA migrate inversely proportional to the log10 of their molecular weight

في الهالم يتحرك الدنا الخطي بمعدل عكسي الى لوغريثم وزنها الجزيئ

Agarose

Agarose is a linear polymer extracted from seaweed

األقاروز عبارة عن مبلمر خطي مستخرج من األعشاب البحرية

D-galactose 3,6-anhydro L-galactose

•Agarose was first used in biology when Robert Koch* used it as a culture medium for Tuberculosis bacteria in 1882

أستخدم األقاروز في األحياء الول مرة •

بواسطة روبرت كوخ كوسط مزرعي لبلكتريا 1882الدرن سنة

Making an Agarose Gel كيفية عمل هالم األقاروز

An agarose gel is prepared by combining agarose powder and a buffer solution

يحضر األقروز بخلط مسحوق القروز بمحلول البفر

Agarose

األقروز

Buffer

البفر

Flask for boiling

قارورة للغلي

Casting tray

صينية صبGel combs

Power supply

مصدر للطاقة

Gel tank

وعاء الهالم

Cover

غطاء

Electrical leads

وصالت كهربائية

Electrophoresis Equipment معدات الرحالن الكهربائي

Gel combs

أمشاط الهالم

Gel casting tray & combs

صينية الصب واألمشاط

Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the surface of the casting tray

يجب اال يلتصق أي . إلزق حواف صينية الصب ثم ضع األمشاط، ضع صينية الصب على سطح مستوي

من أمشاط الهالم سطح صينية الصب

Preparing the Casting Tray

تحضير صينية الصب

Agarose

األقروزBuffer Solution

محلول البفر

Combine the agarose powder and buffer solution. Use a flask that is several times larger than the volume of buffer

إستخدم قارورة يكون حجمها أكبر من حجم البفر‘ إمزج مسحوق األقروز بمحلول البفر

Agarose is insoluble at room temperature (left) (لليسار)األقروز غير قابل للذوبان في درجة حرارة الغرفة

The agarose solution is boiled until clear (right) (لليمين)عند غلي محلول األقروز يصبح نقيا

Gently swirl the solution periodically when heating to allow all the grains of agarose to dissolve

لضمان تذويب كل حبوب األقروز، يجب تحريك المحلول على فترات عند التسخين ***Be careful when boiling - the agarose solution may become superheated and may boil violently if it has been heated too long in a microwave oven

يجب الحذر عند غلي القروز حيث أن التسخين الزائد قد يؤدي لغليان األقروز بعنف

Melting the Agarose

تذويب األقروز

Allow the agarose solution to cool slightly (~60ºC) and then carefully pour the melted agarose solution into the casting tray. Avoid air bubbles

ومن ثم صب األقروز الذائب في الصينية، تفادي ( درجة مئوية 60)أترك األقروز ليبرد قليال

فقاعات الهواء

Pouring the gel (الجل)صب الهالم

Each of the gel combs should be submerged in the melted agarose solution

يجب أن تكون أمشاط الهالم مغمورة في محلول األقروز الذائب

When cooled, the agarose polymerizes, forming a flexible gel. It should appear lighter in color when completely cooled (30-45 minutes). Carefully remove the combs and tape

عندما تبرد مبلمرات األقروز فإنها تكون هالم مرن، ويجب أن يظهر بلون فاتح عندما تبرد تماما ، أزل األمشاط والشريط بحذر(درجة مئوية 30-45)

Place the gel in the electrophoresis chamber

ضع الهالم في غرفة الرحالن

buffer

البفر

Add enough electrophoresis buffer to cover the gel to a depth of at least 1 mm. Make sure each well is filled with buffer.

مم، تأكد من أن كل الفتحات مليئة بالبفر 1أضف مقدار كاف من البفر ليغطي الهالم لعمق

Cathode

القطب السالب(negative )

Anode

القطب المجب(positive)

Wells

فتحات

DNA

الدنا

6X Loading Buffer:

البفر Bromophenol Blue (for color)

(للون)البروموفينول األزرق Glycerol (for weight)

(للوزن)الجليسرول

Sample Preparation

تحضير العينةMix the samples of DNA with the 6X sample loading buffer (w/ tracking dye). This allows the samples to be seen when loading onto the gel, and increases the density of the samples, causing them to sink into the gel wells

أحجام من البفر الممزوجة بصبغة تتبع تسمح برؤية العينات في الهالم إضافة 6أمزج عينة الدنا مع الى زيادة كثافة العينات وجعلها تغرق في فتحات الهالم

Loading the Gel تحميل الهالم

Carefully place the pipette tip over a well and gently expel the sample. The sample should sink into the well. Be careful not to puncture the gel with the pipette tip

يجب إغراق العينة في الفتحة، يجب الحذر لعدم . ضع طرف الماصة فوق الفتحة وبرفق فرغ العينة

ثقب الهالم بطرف الماصة

Place the cover on the electrophoresis chamber, connecting the electrical leads. Connect the electrical leads to the power supply. Be sure the leads are attached correctly - DNA migrates toward the anode (red). When the power is turned on, bubbles should form on the electrodes in the electrophoresis chamber

يبدأ الدنا في . ضع الغطاء على غرفة الرحالن، صل الوصالت الكهربائية، صل الوصالت مع مصدر التيار عند إيصال التيار فتتكون فقاعات في األقطاب في غرفة الرحالن(. األحمر)الهجرة تجاه األنود

Running the Gel تشغيل الهالم

Wells

الفتحات Bromophenol Blue

البروموفينول األزرق

Cathode

الكاثود(-)

Anode

األنود(+)

After the current is applied, make sure the Gel is running in the correct direction. Bromophenol blue will run in the same direction as the DNA

بعد تمرير التيار، تأكد من أن الهالم يجري في اإلتجاه الصحيح، يجري البروموفينول األزرق في نفس إتجاه الدنا

DNA (-)

100 200 300

1,650

1,000

500

850

650

400

12,000 bp

5,000

2,000

Inclusion of a DNA ladder (DNAs of know sizes) on the gel makes it easy to determine the sizes of unknown DNAs

في الهالم يجعل تحديد حجم الدنا المجهول سهال ( دنا معروف الحجم)إضافة الدر الدنا

+

bromophenol blue

Note: bromophenol blue migrates at approximately the same rate as a 300 bp DNA molecule

يالحظ أن البروموفينول األزرق

300يجري بمعدل يساوي

بيزبير من حجم الدنا

DNA Migration

هجرة الدنا

DNA Ladder Standard

الدر الدنا القياسي

Staining the Gel تصبيغ الهالم

• Ethidium bromide binds to DNA and fluoresces under UV light, allowing the visualization of DNA on a Gel

يرتبط بروميد اإليثيديوم مع الدنا ويتفلور تحت األشعة فوق البنفسجية وبالتالي يسمح برؤية الدنا في الهالم

• Ethidium bromide can be added to the gel and/or running buffer before the gel is run or the gel can be stained after it has run

أو البفر قبل جريان الهالم أو يمكن تصبيغ الهالم بعد /يمكن إضافة بروميد اإليثديوم الى الهالم و الجريان

***CAUTION! Ethidium bromide is a powerful mutagen and is moderately toxic. Gloves should be worn at all times

يجب لبس القفازات . يعتبر بروميد اإليثيديوم مادة مسرطنة قوية ومتوسط السمية: تحذير على الدوام

Safer alternatives to Ethidium Bromide

من البدائل اآلمنة لبروميد اإليثيديوم Methylene Blue

الميثلين األزرق

Bio-Safe DNA Stain

صبغة الدنا اآلمنة

Ward’s - QUIKView DNA Stain

كويك فيو-صبغة وارد

Carolina BLU Stain

صبغة كارولينا الزرقاء

Advantages

المزاياInexpensive

رخيصةLess toxic

أقل سميةNo UV light required

ال تحتاج لألشعة فوق البنفسجيةNo hazardous waste disposal

ال توجد مخاطر منها كنفايات

Disadvantages

العيوبLess sensitive

أقل حساسية More DNA needed on gel

تتطلب المزيد من الدنا في الهالم Longer staining/destaining time

تحتاج لوقت أطول للتصبيغ وإزالة الصبغة

Staining the Gel تصبيغ الهالم

• Place the gel in the staining tray containing warm diluted stain

ضع الهالم في صينية الصبغة التي تحتوي على الصبغة الدافئة المخففة • Allow the gel to stain for 25-30 minutes

دقيقة 30-25دع الهالم ليصتبغ لحوالي • To remove excess stain, allow the gel to destain in water

ألزالة الصبغة الزائدة، ضع الهالم في الماء • Replace water several times for efficient destain

لإلزالة التامة للصبغة الزائدة إستبدل الماء عدة مرات

Ethidium Bromide requires an ultraviolet light source to visualize

يحتاج بروميد اإليثيديوم الى مصدرلألشعة فوق البنفسجية للرؤية

Visualizing the DNA (ethidium bromide)

(بروميد اإليثيديوم)تصور الدنا

100 200 300

1,650 1,000

500

850 650

400

5,000 bp 2,000

DNA ladder

الدر الدنا

DNA ladder

الدر الدنا

PCR Product

منتج اإلسترداد

1 2 3 4 5 6 7 8 Wells

الفتحات

+ - - + - + + - Samples # 1, 4, 6 & 7 were positive for DNA

(1،4،6،7)العينات الموجبة للدنا

Visualizing the DNA (QuikVIEW stain)

(صبغة كويك فيو)تصور الدنا

DNA ladder

الدر الدنا

PCR

Product

منتج اإلستردا

Wells

الفتحات

Samples # 1, 6, 7, 10 & 12 were positive for DNA

(1،6،7،10،12)العينات الموجبة

1,000

500

2,000 bp