Acervo (representando espécies e variantes genéticos de Leishmania do Novo Mundo): 2.500 estoques criopreservados em diversos intervalos de tempo desde 1980.

Coleção de Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz

Leishmania Type Culture Collection (WDCM)

Laboratório de Pesquisas em Leishmaniose (Departamento de Imunologia/IOC)

Centro de referência (WHO International Leishmania Reference Strain Center e SVS/MS)

FIOCRUZ

Equipe

Curadores - Elisa Cupolillo (PhD) e Gabriel Grimaldi (PhD)

Luiz Eduardo de Carvalho Paes – Tecnologista, BSc

Ângela Cristina Volpini – Tecnologista, PhD

Lilia Macedo Firoozmand – Tecnologista, BSc

Adriana Gaspar – Apoio Técnico

FIOCRUZ

Serviços prestados:

•Consultorias

•Formação de pessoal

•Depósito (guarda) de amostras

•Fornecimento, gratuito, de cepas de referência de Leishmania para grupos de pesquisas do Brasil e do exterior

•Tipagem bioquímica e molecular de amostras e isolados 

FIOCRUZ

Perfil da coleção de Leishmania do IOC

•Trabalhos em colaboração com vários pesquisadores na América Latina

•Depósito de cepas de outros laboratórios, onde eram mantidas em cultura ou criobancos

•Isolados originais enviados diretamente ao nosso laboratório para identificação e que são depositados.

Nos últimos 5 anos, foram coletados mais de 1.000 isolados, provenientes de diversas áreas endêmicas no Brasil e outros países da América do Sul.

FIOCRUZ

Catalogação de dados relevantes da coleção

• Entrada das amostrasCada estoque depositado no Banco recebe um número de identificação

(IOC/L), sendo informatizados os dados relevantes sobre o

estoque.

Os estoques são reconhecidos pelo seu código (WHO 1990), que indica (1) espécie do animal reservatório ou vetor, de onde o parasito foi isolado; (2) país e (3) ano de isolamento; e (4) designação da cepa original

Ex.: MHOM/BR/1980/LSP MCHO/CR/1987/356 IFLA/BR/1967/P32

• Tipagem Bioquímica e Molecular e Classificação Taxonômica

1. Todas as amostras são classificadas em zimodemas empregando 18 sistemas loci-enzimáticos – IOC/Z

2. Perfis de RFLP dos ITSrDNA estão sendo construídos e adicionados ao banco FIOCRUZ

LeishmaniaLeishmania

-Protozoário unicelularProtozoário unicelular

- FlageladoFlagelado

- HeteroxenoHeteroxeno

- Dimórfico Dimórfico

FIGURA 1. Amastigotas FIGURA 2. Promastigotas

Espécies

L. (V. ) braziliensis

L . (V .) per uviana

Complexo

L . b r az il iens is

Espécie

L. (V. ) naiffi

Espécie

L. (V. ) lainsoni

Espécie

L. (V. ) lindembergi

Espécies

L. (V. ) guyanensis

L. (V. ) shawi

L . (V .) panamens is

Complexo

L . guyanens is

S ubgênero

V iannia

Espécie

L. (L. ) chagasi

Complexo

L . donovani

Espécies

L . (L .) mex icana

L. (L. ) amazonensis

L . (L .) venez uelens is

Complexo

L . mex icana

S ubgênero

Leishmania

Gênero

Leishmania

Família

T r ypanosomat idae

Adaptado WHO 1990 e Cupolillo et al. 1994

CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DE Leishmania NO

NOVO MUNDO

Centro de referência em Leishmania (WDCM 731)

-Estoques congelados:

(a) Leishmania na forma promastigota

(b) A maior parte dos estoques está criopreservados com glicerol 8%

- Informatização dos dados e cadastro dos estoques

Laboratório de Pesquisas

em Leishmaniose/ IOC

COLEÇÃO DE Leishmania DO IOC

1)Avaliar a estabilidade molecular (identidade) dos parasitos recuperados nas culturas empregando técnicas bioquímicas e moleculares;

2) Estabelecer um padrão ideal do número e forma morfológica dos parasitos a serem novamente criopreservados a fim de garantir amostras viáveis em um futuro descongelamento;

3) Determinar a viabilidade dos parasitos correlacionando com o tempo e condições que se mantiveram criopreservadas;

4) Garantir uma re-criopreservação com sucesso para que mais tarde as amostras ao serem descongeladas se apresentem estáveis e viáveis, isso através do conhecimento de uma faixa ideal do número de parasitas no momento da criopreservação;

6-fosfogluconato desidrogenase

Nucleosídio Hidrolase

Aconitato Hidratase

Fumarase

Glicose-Fosfo-Isomerase

Glicose-6-Fosfato-Desidrogenase

Hexoquinase

Isocitrato desidrogenase

Malato desidrogenase

Enzima Málica

Manose-Fosfato-Isomerase

Nucleotidase

Peptidase

Fosfo-Gluco-Mutase

Fosfatase Ácida

6PGDH -

NH -

ACON -

FUM -

GPI -

G6PDH -

HK -

IDH -

MDH -

ME -

MPI -

NH -

PEPD -

PGM -

ACP -

Isoenzimas

Métodos empregados nos estudos taxonômicos

          

Caracterização por MLEE – várias espécies de Leishmania

PCR ITSrDNA Os primers usados: ITS 1(5’ GCTGTAGGTGAACCTGCAGCAGCTGGATCATT-3’) e ITS 2 (5’-GCGGGTAGTCCTGCCAAACACTCAGGTCTG-3’)

SSU 5.8S LSU(1)

IR1 IR2

NTS

ITS

PCR - Produto específico de ITS rDNA

Organização estrutural do lócus rRNA.

RFLP

Classificação e relação filogenética

L. enriettii

Leptomonas

L.(S.) gymnodactyli

L. (S.) tarentolaeL. (S.) hoogstraali

L. (L.) amazonensisL. (L.) mexicana

L. (L.) donovani

L. (L.) tropicaL. (L.) major

L.hertigi

L. colombiensis

L. colombiensisL. equatoriensis

L. (V.) braziliensis

L. (V.) sp

L. (V.) guyanensis

L. (V.) panamensis

L. (V.) panamensis

0.1

100

57

100

100

100

100

96

70

100

98

82

94

PARALEISHMANIA

L. (Viannia)

L. (Sauroleishmania)

L. (Leishmania)

FIOCRUZ

35%

65% 69%65%

35% 31%

20 17 29

0%

20%

40%

60%

80%

100%

2 a 7 8 a 13 > 14

Intervalo de tempo em anos

Cu

ltu

ra (

%)

Negativo Positivo Amostragem

viabilidade relacionada ao tempo

Viabilidade celular de

L (L.) chagasi em relação ao tempo de

criopreservação.

GLICEROL

viabilidade relacionada a solução de congelamento

Relação entre o crioprotetor

utilizado para a preservação de

Leishmania

Procedimentos operacionais usados na manutenção e controle de qualidade dos espécimes colecionados:

•Normas padronizadas - “World Federation for Culture Collections” (WFCC), “American Type Culture Collection” (ATCC), Organização Mundial da Saúde (OMS)

•Manutenção – passagens seriadas

•Preservação – Nitrogênio líquido

•Controle de qualidade: tipagem períodica por métodos bioquímicos e moleculares

FIOCRUZ