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P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USAV o l . 8 4 , p p . 4 4 0 8 - 4 4 1 2 , J u l y 1 9 8 7B i o c h e m i s t r y

C e l l l i n e s a n d p e r i p h e r a l b l o o d l e u k o c y t e s d e r i v e d f r o m i n d i v i d u a l sw i t h c h r o n i c m y e l o g e n o u s l e u k e m i a d i s p l a y v i r t u a l l y i d e n t i c a lp r o t e i n s p h o s p h o r y l a t e d o n t y r o s i n e r e s i d u e s( p r o t e i n - t y r o s i n e k i n a s e / a n t i - p h o s p h o t y r o s i n e a n t i b o d y / A B L g e n e )

R I C H A R D D . H U H N * , MARSHALL R . P O S N E R * , S Y D O N I A I . R A Y T E R S t , J . GORDON F O U L K E S t t ,AND A . RAYMOND F R A C K E L T O N , J R . * * D e p a r t m e n t o f M e d i ci n e, R o g e r W i l l i a m s G e n e r a l H o s p i t a l a n d B r o w n U n i v e r s i t y , P r o v i d e n c e , R I 0 2 9 0 8 ; a n d t L a b o r a t o r y o f E u k a r y o t i c M o l e c u l a r G e n e t i c s ,N a t i o n a l I n s t i t u t e f o r M e d i c a l R e s e a r c h , T h e R i d g e w a y , M i l l H i l l , L o n d o n NW7 1 A A , E n g l a n dC o m m u n i c a t e d b y E d w i n G . K re bs , M a r c h 1 6 , 1 9 8 7 ( r e c e i v e d f o r r e v i e w O c t o b e r 1 0 , 1 9 8 6 )ABSTRACT An a b e r r a n t p 2 j 0 B C R - A B L p r o t e i n t h a t p o s -s e s s e s c o n s t i t u t i v e p r o t e i n - t y r o s i n e k i n a s e a c t i v i t y i s p r e s u m e dt o b e i n v o l v e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f t h e n e o p l a s t i c p h e n o t y p ei n c h r o n i c m y e l o g e n o u s l e u k e m i a ( C M L ) . U s i n g a h i g h l ys p e c i f i c a n t i b o d y a g a i n s t p h o s p h o t y r o s i n e , w e h a v e i s o l a t e d t h et y r o s i n e - p h o s p h o r y l a t e d p 2 1 0 B C R - A B L a n d s e v e r a l o t h e r p r o -t e i n s c o n t a i n i n g p h o s p h o t y r o s i n e f r o m a v a r i e t y o f C M L c e l ll i n e s . p 2 l o B C R - A B L i s o l a t e d b y t h e m o n o c l o n a l a n t i - p h o s p h o -t y r o s i n e a n t i b o d y p o s s e s s e d p r o t e i n - t y r o s i n e k i n a s e a c t i v i t y i nv i t r o c o m p a r a b l e t o t h a t o f t h e p 2 1 O B C R - A B L i s o l a t e d b y a n t i -b o d y t o a s p e c i f i c p e p t i d e s e q u e n c e i n t h e ABL p r o t e i n - t y r o s i n ek i n a s e . O t h e r p r o m i n e n t p r o t e i n s c o n t a i n i n g p h o s p h o r y l a t e dt y r o s i n e r e s i d u e s w e r e o b s e r v e d a t 1 8 5 , 1 5 0 , 1 2 0 , 1 0 5 , 6 3 , 5 6 ,3 6 , a n d 3 2 k D a , a n d l e s s p r o m i n e n t p r o t e i n s w e r e o b s e r v e d a t1 9 5 , 1 5 5 , 9 4 , 5 3 , 4 0 , a n d < 2 9 k D a . S t a p h y l o c o c c a l V 8 p e p t i d em a p p i n g i n d i c a t e d t h a t p r o t e i n s o f s i m i l a r m o l e c u l a r w e i g h t sw e r e h i g h l y h o m o l o g o u s t o e a c h o t h e r a c r o s s c e l l l i n e s , d e s p i t et h e d i v e r s e h e m a t o p o e t i c l i n e a g e s o f t h e s e c e l l s a n d t h e g e n e t i ch e t e r o g e n e i t y o f t h e p a t i e n t s f r o m whom t h e CML c e l l l i n e sw e r e d e r i v e d . P h o s p h o p e p t i d e m a p p i n g a l s o r e v e a l e d t h a tt h e s e p r o t e i n s w e r e d i s t i n c t f r o m e a c h o t h e r a s w e l l a s f r o mp 2 1 0 B C R - A B L . B e c a u s e v i r t u a l l y i d e n t i c a l p h o s p h o t y r o s i n e - c o n -t a i m i n g p r o t e i n s w e r e f o u n d i n p e r i p h e r a l b l o o d l e u k o c y t e st a k e n d i r e c t l y f r o m C M L p a t i e n t s , t h e s e p r o t e i n s a r e n o t a na r t i f a c t o f l o n g - t e r m t i s s u e c u l t u r e b u t a p p e a r t o b e a n i n t e g r a lp a r t o f t h e CML p h e n o t y p e .H e m a t o p o i e t i c c e l l s o f o v e r 9 0 % o f p a t i e n t s w i t h c h r o n i cm y e l o g e n o u s l e u k e m i a ( C M L ) h a v e t h e P h i l a d e l p h i a c h r o -mosome ( P h ' ) , a c y t o g e n e t i c a b n o r m a l i t y r e s u l t i n g f r o mr e c i p r o c a l t r a n s l o c a t i o n o f t h e l o n g a r m s o f c h r o m o s o m e 9a n d 2 2 ( 1 - 3 ) . A s a c o n s e q u e n c e o f t h i s e v e n t , t h e ABLo n c o g e n e i s t r a n s l o c a t e d f r o m i t s n o r m a l p o s i t i o n o n c h r o -mosome 9 t o c h r o m o s o m e 2 2 , r e s u l t i n g i n t h e f u s i o n o f t h e 5 's e q u e n c e o f t h e BCR g e n e o n c h r o m o s o m e 2 2 t o 3 ' - A B Ls e q u e n c e s ( 4 - 7 ) . A s p e c i f i c 8 - k i l o b a s e m R N A t r a n s c r i p t o ft h e BCR-ABL f u s i o n g e n e c a n b e i s o l a t e d f r o m P h ' - p o s i t i v eCML c e l l l i n e s a n d p a t i e n t s a m p l e s ( 8 - 1 1 ) . T h i s t r a n s c r i p t i st r a n s l a t e d i n t o a c h i m e r i c BCR-ABL p h o s p h o p r o t e i n o f- 2 1 0 - k D a ( p 2 l 0 B C R - A B L ) t h a t e x h i b i t s c o n s t i t u t i v e p r o t e i n -t y r o s i n e k i n a s e a c t i v i t y ( E C 2 . 7 . 1 . 1 1 2 ) ( 1 2 , 1 3 ) .Two i n d e p e n d e n t l i n e s o f r e s e a r c h h a v e p r o v i d e d muchc i r c u m s t a n t i a l e v i d e n c e i m p l i c a t i n g p r o t e i n - t y r o s i n e k i n a s e si n b o t h n e o p l a s t i c t r a n s f o r m a t i o n a n d i n t h e c o n t r o l o f n o r m a lc e l l g r o w t h ( r e v i e w e d i n r e f s . 1 4 a n d 1 5 ) . F i r s t , t h e t r a n s -f o r m i n g p r o t e i n s o f m a n y r e t r o v i r u s e s [ e . g . , A B L ( A b e l s o nm u r i n e l e u k e m i a v i r u s ) , SRC ( R o u s s a r c o m a v i r u s ) , FM S( M c D o n o u g h f e l i n e s a r c o m a v i r u s ) , a n d ERBB ( a v i a n e r y t h -

r o b l a s t o s i s v i r u s ) ] a r e c o n s t i t u t i v e l y a c t i v e p r o t e i n - t y r o s i n ek i n a s e s t h a t p h o s p h o r y l a t e t h e m s e l v e s a n d / o r v a r i o u s c e l l u -l a r p r o t e i n s ( 1 6 - 2 0 ) . S t u d i e s w i t h t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e a n dd e l e t i o n m u t a n t s o f s e v e r a l o f t h e s e v i r u s e s h a v e d e m o n -s t r a t e d t h a t t h e i r a b i l i t y t o t r a n s f o r m c e l l s i s d e p e n d e n t o nt h e i r e x p r e s s i o n o f a n a c t i v e p r o t e i n - t y r o s i n e k i n a s e ( 2 1 - 2 4 ) .S e c o n d , t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n h a s b e e n i m p l i c a t e d i nt h e c o n t r o l o f c e l l g r o w t h b e c a u s e c e l l u l a r r e c e p t o r s f o rs e v e r a l p o l y p e p t i d e g r o w t h f a c t o r s a r e p r o t e i n - t y r o s i n e k i -n a s e s t h a t a r e a c t i v a t e d b y t h e b i n d i n g o f t h e i r r e s p e c t i v el i g a n d s t o p h o s p h o r y l a t e t h e m s e l v e s a s w e l l a s o t h e r c e l l u l a rp r o t e i n s ( 2 5 - 2 9 ) .A t t e m p t s t o i d e n t i f y a n d p u r i f y p h y s i o l o g i c a l l y r e l e v a n tp h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s h a v e b e e n h a m p e r e d b yt h e l o w a b u n d a n c e o f t h o s e p r o t e i n s a n d t h e p r o b l e m si n v o l v e d i n d i s t i n g u i s h i n g t h e m f r o m p r o t e i n s c o n t a i n i n g o n l yp h o s p h o s e r i n e a n d p h o s p h o t h r e o n i n e ( 1 4 , 1 5 , 2 3 , 3 0 , 3 1 ) . T oo v e r c o m e t h e s e d i f f i c u l t i e s a n t i - p h o s p h o t y r o s i n e a n t i b o d i e sh a v e b e e n d e v e l o p e d t h a t h a v e e n a b l e d t h e i d e n t i f i c a t i o n a n dp u r i f i c a t i o n o f s p e c i f i c p h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n sf r o m a v a r i e t y o f n o r m a l a n d n e o p l a s t i c c e l l s , i n c l u d i n g t h et r a n s f o r m i n g p r o t e i n s ABL a n d S R C , a s w e l l a s t h e a c t i v a t e dr e c e p t o r s f o r e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r , p l a t e l e t - d e r i v e dg r o w t h f a c t o r , a n d i n s u l i n ( 2 9 , 3 2 - 3 7 ) .A s a f i r s t s t e p t o d e t e r m i n e t h e r o l e o f t h e A BL p r o t e i n -t y r o s i n e k i n a s e i n CML, we h a v e u s e d a h i g h l y s p e c i f i cm o n o c l o n a l a n t i b o d y t o p h o s p h o t y r o s i n e t o a f f i n i t y - p u r i f y t y -r o s i n e - p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i n s f r o m P h ' - p o s i t i v e CM L c e l ll i n e s a n d f r o m p e r i p h e r a l b l o o d l e u k o c y t e s o f CM L p a t i e n t s . I na d d i t i o n t o t h e t y r o s i n e - p h o s p h o r y l a t e d p 2 1 0 B C R - A B L , we h a v ei s o l a t e d s e v e r a l o t h e r p h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s t h a ta r e c a n d i d a t e s f o r c e l l u l a r s u b s t r a t e s o f t h e a b e r r a n t A BLp r o t e i n - t y r o s i n e k i n a s e . R e m a r k a b l y , b o t h t h e p e r i p h e r a l l e u -k o c y t e s f r o m p a t i e n t s a n d e a c h o f t h e c u l t u r e d CM L c e l l l i n e sh a r b o r v i r t u a l l y i d e n t i c a l p h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s .MATERIALS A ND MET H O D S

C e l l s . K 5 6 2 , B V 1 7 3 ( o b t a i n e d f r o m J . R i t z ) , a n d RWLeu4a r e P h ' - p o s i t i v e c e l l l i n e s d e r i v e d f r o m i n d i v i d u a l p a t i e n t s i nt h e a c u t e p h a s e o f CML ( 3 8 - 4 0 ) . T h e s e c e l l s a n d H L - 6 0( a c u t e p r o m y e l o c y t i c ) ( 4 1 ) , H EL ( h u m a n e r y t h r o l e u k e m i c ) ,ANN-1 ( A b e l s o n m u r i n e l e u k e m i a v i r u s - t r a n s f o r m e d f i b r o -b l a s t s ) ( 4 2 ) , 2 9 8 - 1 8 ( A b e l s o n m u r i n e l e u k e m i a v i r u s - t r a n s -f o r m e d m u r i n e p r e - B l y m p h o c y t e s ) ( 4 3 ) , a n d B A L B / c 3 T 3 ( an o n t r a n s f o r m e d m u r i n e f i b r o b l a s t c e l l l i n e ) w e r e g r o w n i nA b b r e v i a t i o n s : CML, c h r o n i c m y e l o g e n o u s l e u k e m i a ; P h ' , t h eP h i l a d e l p h i a c h r o m o s o m e .t P r e s e n t a d d r e s s : O n c o g e n e S c i e n c e I n c . , M a n h a s s e t , NY 1 1 0 3 0 . T o whom r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .

4 4 0 8

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA 8 4 ( 1 9 8 7 ) 4 4 0 9s u p p l e m e n t e d RPMI 1 6 4 0 a s d e s c r i b e d ( 3 3 ) . K 5 6 2 , H L - 6 0 ,HEL, a n d BALB/c 3 T 3 c e l l s w e r e o b t a i n e d f r o m t h e A m e r -i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n . P e r i p h e r a l b l o o d l e u k o c y t e sf r o m t w o p a t i e n t s ( A . G . a n d C . C . ) i n t h e a c u t e p h a s e o f CMLw e r e p r e p a r e d b y F i c o l l - H y p a q u e d e n s i t y z o n e c e n t r i f u g a -t i o n a n d t h e n i n c u b a t e d b r i e f l y i n s u p p l e m e n t e d R PMI 1 6 4 0a t 2 x 1 0 6 c e l l s p e r m l i n 5% C 0 2 / 9 5 % a i r a t 3 7 0 C p r i o r t ol a b e l i n g a n d e x t r a c t i o n .

M e t a b o l i c L a b e l i n g a n d I m m u n o p r e c i p i t a t i o n s . E x p o n e n -t i a l l y g r o w i n g c e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h 3 2 p ; ( 1 m C i p e r 1 0 6c e l l s p e r m l ) f o r 3 h r a t 3 7 0 C a n d t h e n e x t r a c t e d a t 0C w i t h1% T r i t o n X - 1 0 0 i n a b u f f e r c o n t a i n i n g p r o t e i n a s e , k i n a s e ,a n d p h o s p h a t a s e i n h i b i t o r s ( 2 9 , 3 3 ) . T y r o s i n e - p h o s p h o r y l a t -e d p r o t e i n s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e e x t r a c t s b y m i c r o - b a t c ha f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y , a s d e s c r i b e d ( 2 9 , 3 3 ) , e x c e p t t h a t ad i f f e r e n t m o r e s p e c i f i c a n t i - p h o s p h o t y r o s i n e a n t i b o d y ( a n t i -b o d y 1 G 2 ) w a s e m p l o y e d ( A . R . F . , u n p u b l i s h e d d a t a ) . T h i sm o n o c l o n a l a n t i b o d y h a s h i g h a f f i n i t y a n d s p e c i f i c i t y f o rp h o s p h o t y r o s i n e ; p h o s p h o s e r i n e , p h o s p h o t h r e o n i n e , p h o s -p h o h i s t i d i n e , o r m o n o - o r t r i p h o s p h o n u c l e o t i d e s a r e n o tr e c o g n i z e d ( u n p u b l i s h e d d a t a ) . P h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n gp r o t e i n s w e r e e l u t e d s p e c i f i c a l l y f r o m t h e i m m u n o s o r b e n tw i t h t h e h a p t e n p h e n y l p h o s p h a t e ( 2 9 , 3 3 ) , r e s o l v e d b yNaDodSO4/PAGE ( 7 . 5 % g e l s ) u n d e r r e d u c i n g c o n d i t i o n s( 4 4 ) , a n d v i s u a l i z e d b y a u t o r a d i o g r a p h y .F o r i m m u n o p r e c i p i t a t i o n o f A BL p r o t e i n s , c e l l e x t r a c t s o rh a p t e n e l u a t e s ( d i l u t e d t o 1 m l w i t h t h e e x t r a c t i o n b u f f e r )w e r e p r e c l e a r e d o f n o n s p e c i f i c a l l y a d s o r b i n g p r o t e i n s b y t w o3 0 - m i n i n c u b a t i o n s w i t h 5 A l o f n o n i m m u n i z e d r a b b i t s e r u ma n d w i t h 5 0 l u l o f p r o t e i n A - S e p h a r o s e CL4B b e a d s . T h es u p e r n a t a n t a f t e r c e n t r i f u g a t i o n w a s r e t a i n e d , a n d S , u l o fs p e c i f i c a n t i - A B L , a n t i - M o l o n e y GAG, o r c o n t r o l n o n i m -mune r a b b i t s e r u m w a s a d d e d . T h e a n t i - A B L a n t i s e r u m w a sr a i s e d b y i m m u n i z a t i o n o f r a b b i t s w i t h a p e p t i d e h o m o l o g o u st o t h e v - a b l s e q u e n c e , T y r - l l e - S e r - A s p - G l u - V a l - G l u - L y s -G l u - L e u - G l y - L y s ( c o r r e s p o n d i n g t o p e p t i d e 4 i n r e f . 4 5 ) .A f t e r a 2 - h r i n c u b a t i o n , i m m u n e c o m p l e x e s w e r e p r e c i p i t a t e db y 5 0 , u l o f p r o t e i n A - S e p h a r o s e C L 4 B . T h e b e a d s w e r ew a s h e d f o u r t i m e s i n p r o t e i n - f r e e e x t r a c t i o n b u f f e r , a n d t h eR W L e u 4 K 5 6 2 BV 1 7 3 H L 6 01 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 - 3 kDa

00a ' - * 9 7

3i ~ ~ ~ - 6 6

- * 4 4>t R - 24 U r 1 1 1A

i m m u n e c o m p l e x e s w e r e s o l u b i l i z e d b y b o i l i n g i n N a D o d -S 0 4 / g e l s a m p l e b u f f e r .P h o s p h o a m i n o A c i d A n a l y s i s . P h o s p h o p r o t e i n s e x t r a c t e df r o m i n d i v i d u a l b a n d s w e r e a n a l y z e d b y p a r t i a l a c i d h y d r o l -y s i s a n d t h i n l a y e r e l e c t r o p h o r e s i s ( 3 0 , 3 3 ) . L a b e l e d p h o s -p h o a m i n o a c i d s w e r e d e t e c t e d b y a u t o r a d i o g r a p h y a n d q u a n -t i t a t e d b y v i d e o d e ns i t o me t r y ( 4 6 ) .S t a p h y l o c o c c a l V8 P r o t e a s e P e p t i d e M a p p i n g . P r o t e i n s w e r ee x t r a c t e d f r o m i n d i v i d u a l g e l b a n d s a n d p r e c i p i t a t e d w i t ht r i c h l o r o a c e t i c a c i d a s f o r p h o s p h o a m i n o a c i d a n a l y s i s . T h ep r e c i p i t a t e d p r o t e i n s w e r e d i g e s t e d w i t h s t a p h y l o c o c c a l V8p r o t e a s e ( t y p e X V I I I , S i g m a ) ( 4 7 ) , a n d t h e r e s u l t i n g p e p t i d ef r a g m e n t s w e r e r e s o l v e d b y NaDodSO4/PAGE ( 1 5 % a c r y l -a m i d e ) a n d v i s u a l i z e d b y a u t o r a d i o g r a p h y .I n V i t r o K i n a s e R e a c t i o n s . T h e A BL p r o t e i n w a s i m -m u n o p r e c i p i t a t e d b y e i t h e r a n t i - p h o s p h o t y r o s i n e o r a n t i -A BL a n t i b o d i e s a s d e s c r i b e d a b o v e ( u s i n g e x t r a c t e d o rp u r i f i e d p r o t e i n s d e r i v e d f r o m 1 0 6 c e l l s ) a n d w a s h e d f o u rt i m e s i n k i n a s e b u f f e r ( 0 . 0 1 5 % B r i j 3 5 / 5 0 mM H e p e s / 0 . 1 mMEDTA, pH 7 . 5 ) . T h e b e a d s w e r e r e s u s p e n d e d d i r e c t l y i n 2 0, u l o f k i n a s e b u f f e r a n d a c i d - d e n a t u r e d r a b b i t m u s c l e e n o l a s e( 4 8 ) ( 5 A l a t 1 u g / / l ) w a s a d d e d t o s e r v e a s e x o g e n o u ss u b s t r a t e . T h e r e a c t i o n w a s i n i t i a t e d b y t h e a d d i t i o n o f 5 u lo f 5 0 mM M g C l 2 a n d 5 A l o f 1 mM ATP c o n t a i n i n g 2 , C i o f[ y - 3 2 P ] A T P p e r , u ( 3 0 0 0 C i / m m o l ; 1 C i = 3 7 G B q ; Ne wE n g l a n d N u c l e a r ) a n d c o n t i n u e d f o r 3 0 m i n a t 3 0 C .

RESULTSA f f i n i t y - P u r i f i c a t i o n o f P r o t e i n s P h o s p h o r y l a t e d o n T y r o s i n eR e s i d u e s f r o m CML C e l l L i n e s . T o i d e n t i f y c a n d i d a t e s u b -s t r a t e s o f t h e a b e r r a n t A B L p r o t e i n - t y r o s i n e k i n a s e , p h o s -p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s w e r e i s o l a t e d f r o m t h r e e[ 3 2 P j j - l a b e l e d CML c e l l l i n e s b y a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o nm o n o c l o n a l a n t i - p h o s p h o t y r o s i n e a n t i b o d y - S e p h a r o s e . T h en i n e m a j o r p r o t e i n s i s o l a t e d w e r e 2 1 0 , 1 8 5 , 1 5 0 , 1 2 0 , 1 0 5 , 6 3 ,5 6 , 3 6 , a n d 3 2 kDa ( F i g . 1 A , l a n e s 1 ) . Fe w o f t h e p h o s p h o -t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s i s o l a t e d f r o m CML c e l l l i n e s

w e r e p r o m i n e n t i n e i t h e r t h e P h ' - n e g a t i v e p r o m y e l o c y t i c c e l lp 2 1 0

p 1 5 0

p 1 0 5

p 5 6

% - s- t-y

% -s- t

% -S-t_ y

- S-t, -Y

p 1 8 5

p 1 2 0

p 6 3

p 3 6

t -S-t-y

% - s- t% . -y

* -sN - t-Y

-s-y

BF I G . 1 . P h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s i s o l a t e d f r o m CM L c e l l l i n e s . ( A ) NaDodSO4/PAGE o f p r o t e i n s i s o l a t e d b y a n t i -p h o s p h o t y r o s i n e a n t i b o d y a n d b y a n t i - A B L a n t i b o d y . C e l l s f r o m t h e CM L c e l l l i n e s RWLeu4 ( 1 0 6 c e l l s ) , K 5 6 2 ( 2 x 1 0 6 c e l l s ) , a n d B V 1 7 3 ( 2 . 4x 1 0 6 c e l l s ) a n d t h e a c u t e p r o m y e l o c y t i c l e u k e m i a c e l l l i n e H L - 6 0 ( 2 x 1 0 6 c e l l s ) w e r e i n c u b a t e d f o r 3 h r w i t h 3 2 p , a n d e x t r a c t e d w i t h T r i t o nX - 1 0 0 i n a b u f f e r c o n t a i n i n g k i n a s e , p h o s p h a t a s e , a n d p r o t e i n a s e i n h i b i t o r s . S p e c i f i c p r o t e i n s w e r e i m m u n o p u r i f i e d a s i n d i c a t e d b e l o w , r e s o l v e db y N a D o d S O 4 / P A G E ( 7 . 5 % a c r y l a m i d e ) , a n d v i s u a l i z e d b y a u t o r a d i o g r a p h y . L a n e s : 1 , p r o t e i n s p u r i f i e d w i t h t h e a n t i - p h o s p h o t y r o s i n ei m m u n o s o r b e n t ; 2 , p r o t e i n s p u r i f i e d w i t h a n t i - A B L a n t i b o d y ; 3 , p r o t e i n s p u r i f i e d f i r s t w i t h t h e a n t i - p h o s p h o t y r o s i n e i m m u n o s o r b e n t a n d t h e nw i t h a n t i - A B L a n t i b o d y . ( B ) P h o s p h o a m i n o a c i d a n a l y s i s o f p h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s f r o m RWLeu4 c e l l s . P r o t e i n s w e r e e l u t e d f r o me x c i s e d g e l b a n d s ( a r r o w h e a d s i n A , l a n e s 1 ) a n d s u b j e c t e d t o p a r t i a l a c i d h y d r o l y s i s a n d t w o - d i m e n s i o n a l t h i n l a y e r e l e c t r o p h o r e s i s .

P h o s p h o a m i n o a c i d s w e r e v i s u a l i z e d b y a u t o r a d i o g r a p h y ( y , p h o s p h o t y r o s i n e ; t , p h o s p h o t h r e o n i n e ; s , p h o s p h o s e r i n e ) .

B i o c h e m i s t r y : Huhn e t a l .

8/2/2019 4408.full

3/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 4 ( 1 9 8 7 )l i n e H L - 6 0 ( F i g . 1 A ) o r o t h e r P h ' - n e g a t i v e c e l l l i n e s , i n c l u d i n gq u i e s c e n t m o u s e f i b r o b l a s t s a n d c e l l s f r o m B u r k i t t l y m p h o -m a , f r o m T - c e l l l e u k e m i a , f r o m a c u t e m y e l o g e n o u s l e u k e m i a ,a n d f r o m h u m a n e r y t h r o l e u k e m i a ( H E L ) ( d a t a n o t s h o w n ) .T h e m o s t i n t e n s e l a b e l i n g w a s s e e n i n a 2 1 0 - k D ap r o t e i n t h a t we s u s p e c t e d w a s t h e a b e r r a n t A BL p r o t e i n( p 2 1 O B C R - A B L ) c h a r a c t e r i s t i c o f P h ' - p o s i t i v e c e l l s ( 1 2 , 1 3 ) . Ap h o s p h o r y l a t e d p r o t e i n o f i d e n t i c a l e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t yw a s i m m u n o p r e c i p i t a t e d b y t h e a f f i n i t y - p u r i f i e d a n t i - A B La n t i b o d y ( F i g . L 4 , l a n e s 2 ) . T h i s p r o t e i n w a s a b s e n t i nt h e P h ' - n e g a t i v e a c u t e p r o m y e l o c y t i c l e u k e m i a c e l l l i n eH L - 6 0 ( F i g . 1 A ) . A n t i - A B L a n t i b o d y a l s o i m m u n o p r e c i p i -t a t e d t h e l a b e l e d 2 1 0 - k D a p r o t e i n f r o m a n t i - p h o s p h o t y r o s i n e -p u r i f i e d p r o t e i n s o f C M L c e l l l i n e s , i n d i c a t i n g i t s i d e n t i t y a sp 2 1 0 $ C R - A B L ( F i g . l A , l a n e s 3 ) . C o n f i r m i n g t h i s c o n c l u s i o n ,s t a p h y l o c o c c a l V8 p r o t e a s e - p e p t i d e m a p p i n g ( 4 7 ) o f t h e3 2 P - l a b e l e d 2 1 0 - k D a p r o t e i n s i s o l a t e d b y a n t i - A B L a n d b ya n t i - p h o s p h o t y r o s i n e a n t i b o d y w e r e i n d i s t i n g u i s h a b l e ( d a t an o t s h o w n ) .S p e c i f i c i t y o f t h e p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e w a s d e m o n s t r a t e db y t h e a b i l i t y o f t h e p h o s p h o t y r o s i n e a n a l o g p h e n y l p h o s -p h a t e t o i n h i b i t i s o l a t i o n o f a l l o f t h e 3 2 P - l a b e l e d b a n d s s h o w ni n F i g . 1 , l a n e s 1 ( d a t a n o t s h o w n ) , a n d b y p h o s p h o a m i n o a c i da n a l y s i s o f t h e g e l b a n d s . T h e n i n e m o s t p r o m i n e n t 3 2 p _l a b e l e d p r o t e i n s , a s w e l l a s s i x l e s s - p r o m i n e n t p r o t e i n s o f 1 9 5 ,1 5 5 , 9 4 , 5 3 , 4 0 , a n d < 2 9 kDa f r o m RWLeu4 c e l l s c o n t a i n e d2 0 - o 6 0 % p h o s p h o t y r o s i n e r e l a t i v e t o t h e t o t a l a c i d - s t a b l ep h o s p h o a m i n o a c i d s ( F i g . 1 B a n d d a t a n o t s h o w n ) .T h e s p e c i f i c i t y o f t h e a n t i - A B L a n t i b o d y w a s a s c e r t a i n e db y d e t e r m i n i n g i t s a b i l i t y t o r e a c t w i t h v a r i o u s ABL p r o t e i ns p e c i e s i n e x t r a c t s o f 3 2 P - l a b e l e d c e l l s . T h i s a n t i b o d y i m -m u n o p r e c i p i t a t e d t h e p 1 2 0 v - a b I a n d p 1 6 0 v - a b 1 f r o m A b e l s o nm u r i n e l e u k e m i a v i r u s - t r a n s f o r m e d ANN-1 c e l l s ( F i g . 2 A )a n d 2 9 8 - 1 8 c e l l s ( d a t a n o t s h o w n ) , r e s p e c t i v e l y , a s d i d a na n t i b o d y d i r e c t e d a g a i n s t v - g a g d e t e r m i n a n t s . T h e v - g a gs e q u e n c e s a r e e x p r e s s e d o n t h e c h i m e r i c v - a b l p r o t e i n s b u tn o t o n t h e p 2 1 0 B C R L . T h u s o n l y t h e a n t i - A B L a n t i b o d yw a s a b l e t o i m m u n o p r e c i p i t a t e p 2 1 0 B C R - A B L f r o m RWLeu4c e l l s ( F i g . 2 B a n d d a t a n o t s h o w n ) . I m m u n o p r e c i p i t a t i o n o fp 2 1 0 B C R - A B L f r o m RWLeu4 c e l l s b y a n t i - A B L a n t i b o d y w a sb l o c k e d b y 1 mM p e p t i d e 4 ( F i g . 2 B ) , a g a i n c o n f i r m i n g t h es p e c i f i c i t y o f t h i s a n t i b o d y .D e s p i t e b o t h t h e e x p e c t e d g e n e t i c d i v e r s i t y o f t h e p a t i e n t sf r o m whom t h e c e l l l i n e s w e r e d e v e l o p e d a n d t h e d i v e r g e n th e m a t o p o i e t i c l i n e a g e s o f t h e s e c e l l s ( s e e D i s c u s s i o n ) , t h ee l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s o f t h e p h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n gp r o t e i n s f r o m t h e v a r i o u s c e l l l i n e s a r e s t r i k i n g l y s i m i l a r ( F i g .1 ) . S t a p h y l o c o c c a l V8 p r o t e a s e - p e p t i d e m a p p i n g o f e a c h o ft h e m a j o r p h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s w a s p e r -f o r m e d t o e x a m i n e t h e e x t e n t o f t h e i r r e l a t e d n e s s . B o t hANN - 1

1 2 . ! 3AS N

RW~eu 4 F I G . 2 . S p e c i f i c i t y o f a n t i -kDWLeu 4 A B L i m m u n o p r e c i p i t a t i o n s .kIa C e l l s w e r e i n c u b a t e d f o r 3 h rw i t h 3 2 P i a n d t h e n e x t r a c t e d w i t h2 0 5 - d e t e r g e n t . T h e e x t r a c t s w e r e i n -c u b a t e d w i t h 5 , u l o f s p e c i f i c

1 1 6 - ~ a n t i b o d i e s ( a s i n d i c a t e d ) a n d97 t h e n c o p r e c i p i t a t e d w i t h p r o t e i nA - S e p h a r o s e . ( A ) C e l l l i n e66 - ANN-1 ( A b e l s o n m u r i n e l e u k e -m i a v i r u s - t r a n s f o r m e d f i b r o -b l a s t s ) . L a n e s : 1 , n o n i m m u n er a b b i t s e r u m ; 2 , a n t i - M o l o n e y44 GA G s e r u m ; 3 , a n t i - A B L a n t i -b o d y . ( B ) C e l l l i n e RWLeu4( a c u t e p h a s e C M L ) . L a n e s : 1 ,2 9 - n o n i m m u n e r a b b i t s e r u m ; 2 , a n -

1 2 3 t i - A B L a n t i b o d y ; 3 , a n t i - A B La n t i b o d y i n c u b a t e d w i t h 1 mMB A B L p e p t i d e 4 .

3 2 P - l a b e l e d a n d 3 5 S - l a b e l e d p e p t i d e m a p s o f t h e 2 1 0 - , 1 8 5 - ,1 2 0 - , 1 0 5 - , 5 6 - , a n d 3 2 - k D a p r o t e i n s f r o m RWLeu4 c e l l s w e r ei n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m t h o s e o f p r o t e i n s o f c o r r e s p o nd i ngm o l e c u l a r s i z e s f r o m B V 1 7 3 a n d K 5 6 2 ( d a t a n o t s h o w n ) . T h em a p s o f t h e 6 3 - k D a p r o t e i n o f RWLeu4 a n d B V 1 7 3 c e l l s w e r ea l s o i d e n t i c a l b u t d i s s i m i l a r t o t h e map o f t h e 6 3 - k D a p r o t e i no f K 5 6 2 . P r o t e i n s o f d i s s i m i l a r m o l e c u l a r s i z e s d i s p l a y e dd i s s i m i l a r m a p s ( F i g . 3 ) . T h e r e f o r e , n o n e o f t h e s e p r o t e i n sa p p e a r t o b e p r o t e o l y t i c p r o d u c t s o f e i t h e r p 2 1 0 B C R A B L o re a c h o t h e r , n o r d o t h e y a p p e a r t o b e a r a n y p r e c u r s o r / p r o d u c tr e l a t i o n s h i p .I n V i t r o K i n a s e A c t i v i t y o f t h e A n t i - A B L - a n d A n t i - P h o s -p h o t y r o s i n e - I s o l a t e d P r o t e i n s . p 2 1 0 B C R - A B L i m m u n o p r e c i p i -t a t e d b y a t l e a s t c e r t a i n a n t i b o d i e s i s a n a c t i v e p r o t e i n -t y r o s i n e k i n a s e i n v i t r o , c a p a b l e o f p h o s p h o r y l a t i n g b o t hi t s e l f a n d e xo g e n o u s s u b s t r a t e s s u c h a s e n o l a s e ( 4 9 , 5 0 ) .T o e s t a b l i s h c l e a r l y t h e i d e n t i t y o f t h e 2 1 0 - k D a p r o t e i ni s o l a t e d b y t h e a n t i - A B L a n d a n t i - p h o s p h o t y r o s i n e p r o c e -d u r e s , we a s s e s s e d t h e i r a c t i v i t i e s a s p r o t e i n - t y r o s i n e k i -n a s e s . I n v i t r o k i n a s e r e a c t i o n s w e r e p e r f o r m e d d i r e c t l y o nt h e a n t i - A B L - o r a n t i - p h o s p h o t y r o s i n e - S e p h a r o s e c o m p l e x -e s , i n w h i c h p 2 1 0 B C R - A B L a n d t h e e x o g e n o u s s u b s t r a t ee n o l a s e w e r e b o t h p h o s p h o r y l a t e d . P h o s p h o a m i n o a c i d a n a l -y s i s r e v e a l e d t h a t e n o l a s e w a s p h o s p h o r y l a t e d p r e d o m i n a n t -l y o n t y r o s i n e .P h o s p h o t y r o s i n e - C o n t a i n i n g P r o t e i n s I s o l a t e d D i r e c t l y f r o mP e r i p h e r a l B l o o d L e u k o c y t e s o f P a t i e n t s w i t h A c u t e P h a s eCML. T h e CM L c e l l l i n e s e x a m i n e d i n t h i s s t u d y h a v e b e e np a s s a g e d r e p e a t e d l y i n c u l t u r e . We w e r e c o n c e r n e d , t h e r e -f o r e , a b o u t t h e r e l e v a n c e o f t h e i r p h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n gp r o t e i n s t o t h e n a t u r a l p a t h o g e n e s i s o f n e o p l a s t i c t r a n s f o r -m a t i o n . T o e xt e n d o u r o b s e r v a t i o n s , t h e r e f o r e , CM L c e l l sw e r e o b t a i n e d d i r e c t l y f r o m p a t i e n t s . P e r i p h e r a l b l o o d m o n o -n u c l e a r l e u k o c y t e s ( b l a s t c e l l s a n d l y m p h o c y t e s ) f r o m C M Lp a t i e n t s w e r e s e p a r a t e d b y F i c o l l - H y p a q u e d e n s i t y z o n ec e n t r i f u g a t i o n , i n c u b a t e d w i t h 3 2 P i , a n d e x t r a c t e d a s d e -s c r i b e d f o r t h e c u l t u r e d c e l l s . Many p h o s p h o t y r o s i n e - c o n -t a i n i n g p r o t e i n s w e r e a f f i n i t y p u r i f i e d f r o m t h e s e l e u k o c y t e s ,i n c l u d i n g p 2 1 0 B C R - A B L ( a s c e r t a i n e d b y i m m u n o p r e c i p i t a t i o nw i t h a n t i - A B L ) a n d h e a v i l y l a b e l e d p r o t e i n s o f 1 5 0 , 1 0 5 , 6 3 ,5 6 , a n d 5 3 k D a ( F i g . 4 ) . T h e m a j o r p h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n -i n g p r o t e i n s a l l c o r r e s p o n d e d t o s i m i l a r p r o t e i n s i n t h ec u l t u r e d CM L c e l l l i n e s a l t h o u g h n o t a l l w e r e r e p r e s e n t e d

k D a9 7 -6 6 -

p 2 1 0 p 1 5 0 p 1 2 0 p 1 0 5 p 6 3 p 5 6m m m mm1I1_. . . ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ! . .w - s _ _44 - I

2 9 - :*2 2 -1 4 -

F I G . 3 . P e p t i d e m a p p i n g o f m a j o r p h o s p h o t y r o s i n e p r o t e i n si s o l a t e d f r o m 3 2 P i - l a b e l e d RWLeu4 CML c e l l s . RWLeu4 p r o t e i n sw e r e e x t r a c t e d f r o m g e l b a n d s a n d s u b j e c t e d t o p a r t i a l p r o t e o l y s i sw i t h 1 , 7 , a n d 3 0 , g o f V8 p r o t e a s e p e r m l ( l a n e s f r o m l e f t t o r i g h t ,r e s p e c t i v e l y , f o r e a c h p r o t e i n ) . T h e r e s u l t i n g p r o t e o l y t i c f r a g m e n t sw e r e r e s o l v e d o n 1 5 % N a D o d S O 4 g e l s a n d v i s u a l i z e d b y a u t o r a d i -o g r a p h y .

4 4 1 0 B i o c h e m i s t r y : H u h n e t a l .

8/2/2019 4408.full

4/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA 8 4 ( 1 9 8 7 ) 4 4 1 1

IN IE . .

kDa5- ..%

-116 i-- 9 7 -- 66 -

I* * AW

- 44 -

- 29 -RWLeu4 123

F I G . 4 . P h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s i s o l a t e d d i r e c t l yf r o m p e r i p h e r a l b l o o d l e u k o c y t e s o f a CML p a t i e n t . P e r i p h e r a l b l o o dm o n o n u c l e a r c e l l s ( 2 x 1 0 6 c e l l s ) f r o m a p a t i e n t ( A . G . ) i n t h e a c u t ep h a s e o f CML were l a b e l e d w i t h 3 2 P i a n d e xt r a c t ed w i t h d e t e r g e n t .L a n e s : 1 , p r o t e i n s i s o l a t e d f r o m t h e d e t e r g e n t e x t r a c t b y a n t i -p h o s p h o t y r o s i n e a n t i b o d y ; 2 , 4 0 mM p h e n y l p h o s p h a t e c o m p e t i t i v e -l y i n h i b i t e d t h e p u r i f i c a t i o n o f t h e p h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o ,t e i n s ; 3 , 2 1 0 - k D a p r o t e i n i m m u n o p r e c i p i t a t e d f r o m t h e d e t e r g e n te x t r a c t b y a n t i - A B L . P r o t e i n s p h o s p h o r y l a t e d o n t y r o s i n e r e s i d u e sf r o m RW L e u 4 c e l l s are shown f o r c o m p a r i s o n .e q u a l l y . V i r t u a l l y i d e nt i c al r e s u lt s w e r e o b t a i n e d w i t h a c u t ep h a s e c e l l s f r o m a s e p a r a t e i n d i v i d u a l ( p a t i e n t C . C . ) . S t a p h -y l o c o c c a l V8 p r o t e a s e p e p t i d e m a p s o f t h e 1 0 5 - , 6 3 - , a n d5 6 - k D a p r o t e i n s from l e u k o c y t e s o f p a t i e n t s w e r e i d e n t i c a l t ot h o s e o f RWLeu4 c e l l s ( d a t a n o t s h o w n ) .

DISCUSSIONI n t h i s s t u d y , n u m e r o u s p h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n sw e r e a f f i n i t y p u r i f i e d f r o m b o t h CML c e l l l i n e s a n d f r o mp e r i p h e r a l b l o o d l e u k o c y t e s o f p a t i e n t s i n t h e a c u t e p h a s e o fC M L . Most p r o m i n e n t was a 2 1 0 - k D a p r o t e i n t h a t d i s p l a y e dp r o t e i n - t y r o s i n e k i n a s e a c t i v i t y i n v i t r o , was i m m u n o p r e c i p i -t a t e d f r o m t h e h a p t e n e l u a t e b y a n t i - A B L a n t i b o d i e s , a n d w a si n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m p 2 l Q B C R - A B L b y p e p t i d e m a p p i n g . Ont h i s b a s i s , we i d e n t i f y t h i s p r o t e i n as p 2 1 0 B C R - B LI n a d d i t i o n t o p 2 1 0 B C R - A B L , 1 5 o t h e r p r o t e i n s p h o s p h o r y l -a t e d o n t y r o s i n e r e s i d u e s w e r e i s o l a t e d f r o m CML c e l l l i n e sa n d p e r i p h e r a l b l o o d l e u k o c y t e s o f CML p a t i e n t s . M o s t o ft h e p h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s f r o m p e r i p h e r a lb l o o d l e u k o c y t e s c o r r e s p o n d t o p r o t e i n s i n t h e c u l t u r e d CMLc e l l l i n e s , b o t h i n t e r m s o f m o l e c u l a r s i z e ( F i g . 4 ) a n d V8p e p t i d e maps, d e m o n s t r a t i n g t h a t t h e t y r o s i n e - p h o s p h o r y l -a t e d p r o t e i n s i n t h e s e c e l l l i n e s are n o t a r t i f a c t s i n d u c e d b yl o n g passage i n t i s s u e c u l t u r e . F u r t h e r m o r e , e l e c t r o p h o r e t i c

p a t t e r n s o f t h e s e p h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s a rer e m a r k a b l y s i m i l a r a cross t h e c e l l l i n e s , d e s p i t e t h e e x p e c t e dg e n e t i c h e t e r o g e n e i t y o f t h e p a t i e n t s f r o m whom t h e y w e r ed e r i v e d a n d t h e d i v e r s e h e m a t o p o e t i c l i n e a g e s o f t h e s e c e l l s .Of t h e t h re e CML c e l l l i n e s s t u d i e d i n t h i s p a p e r , BV173 i st h e most p r i m i t i v e , p r o b a b l y r e p r e s e n t i n g a p l u r i p o t e n t s t e mc e l l ( 3 9 ) . BV173 c e l l s d o n o t r e a c t w i t h m o n o c l o n a l a n t i b o d i e ss p e c i f i c f o r m y e l o i d or m o n o c y t i c c e l l s , n or d o t h e y d i f f e r -e n t i a t e t o m a c r o p h a g e s or g r a n u l o c y t e s i n response t op h o r b o l e s t e r s or r e t i n o i c a c i d . A l t h o u g h t h e y l a c k m a r k e r sf o r m a t u r e B or T c e l l s ( e . g . , s u r f a c e i m m u n o g l o b u l i n , OKT3a n t i g e n , or s h e e p e r y t h r o c y t e r o s e t t e - f o r m i n g a n t i g e n ) , t h e yd i s p l a y I a ( D R ) a n t i g e n c h a r a c t e r i s t i c o f B c e l l s a n d p r o g e n -i t o r m y e l o i d c e l l s , a s w e l l a s t h e common a c u t e l y m p h o b l a s t i cl e u k e m i a a n t i g e n s a n d o t h e r a n t i g e n s c h a r a c t e r i s t i c o f l y m -p h o p o i e t i c p r o g e n i t o r c e l l s .

I n c o n t r a s t , K 5 6 2 c e l l s a r e w e l l a l o n g t h e p a t h t o w a r de r y t h r o i d d i f f e r e n t i a t i o n ( 3 8 , 3 9 ) . T h e s e c e l l s h a v e g l y c o p h o -r i n A , s p e c t r i n , a n d t h e " i " s u r f a c e a n t i g e n c h a r a c t e r i s t i c o fe r y t h r o c y t e s ( 5 1 - 5 4 ) a n d a r e r e a d i l y i n d u c e d b y h e m i n a n do t h e r c h e m i c a l a g e n t s t o d i f f e r e n t i a t e i n t o e r y t h r o i d c e l l s t h a ts y n t h e s i z e h e m o g l o b i n ( 5 1 , 5 5 ) .RWLeu4 c e l l s , o n t h e o t h e r h a n d , a r e q u i t e d i f f e r e n t . T h i sCML c e l l l i n e c l e a r l y l i e s o n t h e m y e l o m o n o c y t i c p a t h w a y :i t l a c k s F c r e c e p t o r s , h a s a b a s o p h i l i c c y t o p l a s m w i t hp r o m i n e n t c y t o p l a s m i c g r a n u l e s , h a s i r r e g u l a r l y s h a p e d n u -c l e i , b e a r s / 2 - m i c r o g l o b u l i n o n i t s s u r f a c e , l a c k s i m m u n o -g l o b u l i n , a n d h i s t o c y t o c h e m i c a l l y d i s p l a y s b o t h p e r o x i d a s ea n d e s t e r a s e a c t i v i t y . F u r t h e r m o r e , t h e s e c e l l s a r e i n d u c e d t od i f f e r e n t i a t e a l o n g t h e m y e l o i d p a t h w a y i n t o g r a n u l o c y t e s b yp o l a r s o l v e n t s a n d a l o n g t h e m o n o c y t i c p a t h w a y i n t o m a c -r o p h a g e s b y p h o r b o l e s t e r s ( 4 0 ) .T h e s i m i l a r i t y o f p h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s d i s -p l a y e d b y a l l o f t h e CML c e l l s i s f u r t h e r s u r p r i s i n g i n t h a tv a r i a b l e e x p r e s s i o n o f t y r o s i n e - p h o s p h o r y l a t e d s u b s t r a t e sh a s b e e n r e p o r t e d i n o t h e r s y s t e m s i n w h i c h p r o t e i n - t y r o s i n ek i n a s e s h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n c e l l t r a n s f o r m a t i o n a n dr e g u l a t i o n o f c e l l g r o w t h ( 3 1 , 5 6 - 5 9 ) . P a r t i c u l a r l y r e l e v a n t i sa r e p o r t t h a t p r e - T c e l l s a n d p r e - B c e l l s t h a t h a v e b e e nt r a n s f o r m e d b y v - a b l s h a r e o n l y t h r e e o u t o f e i g h t p h o s p h o -t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s ( 5 8 ) . F u r t h e r m o r e , v - a b l - t r a n s -f o r m e d p r e - B c e l l s a n d f i b r o b l a s t s c o n t a i n many d i v e r s e ,u n s h a r e d p r o t e i n s p h o s p h o r y l a t e d o n t y r o s i n e r e s i d u e s , e v e nt h o u g h t h e y d o d i s p l a y t h e A B L - t r a n s f o r m i n g p r o t e i n a n ds h a r e i n common p h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s o f 6 3a n d 5 6 kDa ( 5 9 ) .C l e a r l y , p h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s t h a t a r e e s -s e n t i a l f o r t h e m a i n t e n a n c e o f t h e CML p h e n o t y p e s h o u l d b ep r e s e n t i n a l l CML c e l l s . By t h i s c r i t e r i o n , v i r t u a l l y a l l o f t h e1 5 c e l l u l a r s u b s t r a t e s r e m a i n c a n d i d a t es e x c e p t o n e o f t h eb a n d s a t 6 3 kDa ( t h i s b a n d i s a c t u a l l y a d o u b l e t ) , w h i c ha p p e a r s t o b e d i f f e r e n t i n K 5 6 2 . O f p a r t i c u l a r i n t e r e s t i s t h eo t h e r b a n d a t 6 3 kDa a n d t h e b a n d a t 5 6 k D a , w h i c h may b er e l a t e d t o s i m i l a r - s i z e p r o t e i n s f o u n d i n c e l l s t r a n s f o r m e d b y

t h e A b e l s o n m u r in e l e u k e m i a v i r u s ( 5 9 ) .H o w e v e r , o n e m i g h t a l s o e x p e c t t h a t a c a n d i d a t e s u b -s t r a t e ( s ) w o u l d n o t b e p h o s p h o r y l a t e d i n q u i e s c e n t , n o n -n e o p l a s t i c c e l l s . T h u s we w o u l d e l m i n i a t e t h e 1 0 5 - k D ap r o t e i n , w h i c h w a s f o u n d i n a l l c e l l s e x a m i n e d , i n c l u d i n gn o n m i t o t i c f i b r o b l a s t s ( u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) .B e c a u s e s o m e o f t h e t y r o s i n e - p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i n s i nCML c e l l s m i g h t b e p h o s p h o r y l a t e d b y t y r o s i n e k i n a s e s t h a ta r e n o r m a l l y e xp r e s s e d i n c e l l s s u s c e p t i b l e t o t h e P h ' t r a n s -l o c a t i o n , i t w a s i m p o r t a n t t o e x a m i n e c e l l s a t a s i m i l a r s t a t eo f d i f f e r e n t i a t i o n t h a t l a c k e d t h e P h ' . A l t h o u g h n o r m a l c e l l so f t h i s d e s c r i p t i o n a r e n o t a v a i l a b l e , t w o P h ' - n e g a t i v e humanl e u k e m i a s p r o v i d e d c l o s e a l t e r n a t i v e s . T h e p r o m y e l o c y t i cl e u k e m i a c e l l l i n e H L - 6 0 l a c k s t h e a b e r r a n t A b e l s o n t y r o s i n ek i n a s e b u t i s a n t i g e n i c a l l y a n d d e v e l o p m e n t a l l y n e a r l y i d e n -t i c a l t o t h e CML c e l l l i n e RWLeu4. H L - 6 0 a n d RWL eu4 c e l l sd i f f e r e n t i a t e t o g r a n u l o c y t e s a n d t o m a c r o p h a g e s i n r e s p o n s et o p o l a r s o l v e n t s a n d t o p h o r b o l e s t e r s , r e s p e c t i v e l y ( 4 0 , 6 0 ) .H EL c e l l s l a c k t h e a b e r r a n t A b e l s o n k i n a s e y e t a r e d e v e l -o p m e n t a l l y n e a r l y i d e n t i c a l t o t h e CML c e l l l i n e K 5 6 2 ( 6 1 ) .H L - 6 0 a n d H EL c e l l s c o n t a i n e d a n t i - p h o s p h o t y r o s i n e - i s o -l a t e d p r o t e i n s o f 9 4 , 6 3 , 3 6 , a n d 3 2 k Da . B u t w h i l e t h e 3 6 - a n d3 2 - k D a p r o t e i n s i n t h e s e c e l l s w e r e p h o s p h o r y l a t e d w i t hn e a r l y a s g r e a t a n i n t e n s i t y a s t h e c o r r e s p o n d i n g p r o t e i n s i nt h e CML c e l l s , t h e o t h e r p r o t e i n s w e r e c o n s i d e r a b l y l e s sp r o n o u n c e d . T h e s e may b e r e l a t e d t o t h e 5 6 - k D a p r o t e i nd e s c r i b e d i n LSTRA ( a m o u s e T - c e l l l y m p h o m a c e l l l i n e ) o rt h e 3 8 - a n d 5 5 - t o 6 8 - k D a p r o t e i n s d e s c r i b e d i n c e l l s o fh e m o p o i e t i c o r i g i n ( 6 2 - 6 7 ) a n d may r e p r e s e n t t a r g e t s f o ra n o t h e r p r o t e i n - t y r o s i n e k i n a s e ( s ) . O f c o u r s e , s o m e o f t h e s e

t a r g e t s may a l s o r e f l e c t p h y s i o l o g i c a l l y i r r e l e v a n t p h o s -

B i o c h e m i s t r y : Huhn e t a l .

8/2/2019 4408.full

5/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 4 ( 1 9 8 7 )p h o r y l a t i o n s b y k i n a s e s w i t h r e l a x e d s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y( 1 4 , 1 5 , 3 1 ) .N a l d i n i e t a l . ( 6 8 ) a n d Ogawa e t a l . ( 6 9 ) u s e d a n t i -p h o s p h o t y r o s i n e a n t i b o d i e s t o d e t e c t t y r o s i n e - p h o s p h o r y l a t -e d p r o t e i n s i n t h e CML l i n e K 5 6 2 . E a c h g r o u p d e t e c t e dd i f f e r e n t p r o t e i n s p h o s p h o r y l a t e d o n t y r o s i n e s , a n d b o t hg r o u p s f a i l e d t o d e t e c t s e v e r a l o f t h e p h o s p h o t y r o s i n e -c o n t a i n i n g p r o t e i n s t h a t we o b s e r v e d i n t h i s s t u d y . T h er e a s o n s f o r t h e s e d i s c r e p a n c i e s a r e u n c l e a r , a l t h o u g h we h a v ef o u n d t h a t r e p r o d u c i b l e i s o l a t i o n o f l a r g e n u m b e r s o f p h o s -p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s r e q u i r e s c r i t i c a l a t t e n t i o n t ot h e i n h i b i t i o n o f p r o t e i n p h o s p h a t a s e s a n d p r o t e a s e s .I t w i l l b e i m p o r t a nt t o e s t a b l i s h w h e t h e r t h e CML c e l lp h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s a r e s p e c i f i c ABL s u b -s t r a t e s a n d w h e t h e r t h e i r p h o s p h o r y l a t i o n i s c o r r e l a t e d w i t ht h e t r a n s i t i o n f r o m t h e c h r o n i c t o t h e a c u t e p h a s e o f t h i sd i s e a s e .We t h a n k D r . M i c h a e l W i e m a n n ( R o g e r W i l l i a m s G e n e r a l H o s p i -t a l ) f o r m a k i n g a v a i l a b l e t h e CM L c e l l l i n e R W L e u 4 . T h i s w o r k w a ss u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m t h e R h o d e I s l a n d F o u n d a t i o n a n d t h eB r o w n U n i v e r s i t y R e s e a r c h S u p p o r t F u n d t o A . R . F . , a n d f r o m t h eN a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h ( R O 1 - C A 3 9 2 3 5 t o A . R . F . a n d C A 1 3 9 4 3t o t h e C a n c e r R e s e a r c h C e n t e r a t R o g e r W i l l i a m s G e n e r a l H o s p i t a l ) .R . D . H . i s a f e l l o w o f t h e P h a r m a c e u t i c a l M a n u f a c t u r e r s ' A s s o c i a t i o nF o u n d a t i o n . T h i s w o r k w a s a l s o s u p p o r t e d b y t h e M e d i c a l R e s e a r c hC o u n c i l , U n i t e d K i n g d o m ( J . G . F . a n d S . I . R . ) .

1 . C h a m p l i n , R . E . & G o l d e , D . W . ( 1 9 8 5 ) B l o o d 6 5 , 1 0 3 9 - 1 0 4 7 .2 . N o w e l l , P . C . & H u n g e r f o r d , D . A . ( 1 9 6 0 ) J . N a t l . C a n c e r I n s t . 2 5 ,8 5 - 1 0 9 .3 . R o w l e y , J . D . ( 1 9 7 3 ) N a tu r e ( L o nd o n ) 2 4 3 , 2 9 0 - 2 9 3 .4 . d e K l e i n , A . , v a n K e s s e l , A . G . , G r o s v e l d , G . , B a r t r a m , C . R . , H a g e -m e i j e r , A . , B o o t s m a , D . , S p u r r , N . K . , H e i s t e r k a m p , N . , G r o f f e n , J . &S t e p h e n s o n , J . R . ( 1 9 8 2 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 0 0 , 7 6 5 - 7 6 7 .5 . B a r t r a m , C . R . , d e K l e i n , A . , H a g e m e i j e r , A . , v a n A g t h o v e n , T . , v a nK e s s e l , A . G . , B o o t s m a , D . , G r o s v e l d , G . , F e r g u s o n - S m i t h , M . A . ,D a v i e s , T . , S t o n e , M . , H e i s t e r k a m p , N . , S t e p h e n s o n , J . R . & G r o f f e n ,J . ( 1 9 8 3 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 0 6 , 2 7 7 - 2 8 0 .6 , H e i s t e r k a m p , N . , S t e p h e n s o n , J . R . , G r o f f e n , J . , H a n s e n , P . F . , d eK l e i n , A . , B a r t r a m , C . R . & G r o s ve l d, G . ( 1 9 8 3 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 0 6 ,2 3 9 - 2 4 2 .7 . G r o f f e n , J . , S t e p h e n s o n , J . R . , H e i s t e r k a m p , N . , d e K l e i n , A . , B a r t r a m ,C . R . & G r o s v e l d , G . ( 1 9 8 4 ) C e l l 3 6 , 9 3 - 9 9 .8 . C a n a a n i , E . , G a l e , R . P . , S t e i n e r - S a l t z , D . , B e r r e b i , A . , A g h a i , E . &J a n u s z e w i c z , E . ( 1 9 8 4 ) L a n c e t i , 5 9 3 - 5 9 5 .9 . C o l l i n s , S . J . , K u b o n i s h i , I . , M y o s h i , I . & G r o u d i n e , M . T . ( 1 9 8 4 )S c i e n c e 2 2 5 , 7 2 - 7 4 .1 0 . S h t i v e l m a n , E . , L i f s h i t z , B . , G a l e , R . P . & C a n a a n i , E . ( 1 9 8 5 ) N a t u r e( L o n d o n ) 3 1 5 , 5 5 0 - 5 5 4 .1 1 . S t a m , K . , H e i s t e r k a m p , N . , G r o s v e l d , G . , d e K l e i n , A . , V e r m a , R . S . ,C o l e m a n , M . , D o s i k , H . & G r o f f e n , J . ( 1 9 8 5 ) N . E n g l . J . M e d . 3 1 3 ,1 4 2 9 - 1 4 3 3 .1 2 . K o n o p k a , J . B . , W a t a n a b e , S . M . & W i t t e , 0 . N . ( 1 9 8 4 ) C e l l 3 7 ,1 0 3 5 - 1 0 4 2 .1 3 . D a v i s , R . L . , K o n o p k a , J . B . & W i t t e , 0 . N . ( 1 9 8 5 ) M o l . C e l l . B i o l . 5 ,2 0 4 - 2 1 3 .1 4 . F o u l k e s , J . G . & R i c h - R o s n e r , M . ( 1 9 8 5 ) M o l . A s p e c t s C e l l . R e g u l . 4 ,2 1 7 - 2 5 2 .1 5 . H u n t e r , T . & C o o p e r , J . A . ( 1 9 8 5 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 5 4 , 8 9 7 - 9 3 0 .1 6 . W i t t e , 0 . N . , D a s g u p t a , A . & B a l t i m o r e , D . ( 1 9 8 0 ) N a t u r e ( L o n d o n )2 8 3 , 8 2 6 - 8 3 1 .

1 7 . S h e r r , C . J . , R e t t e n m i e r , C . W . , S a c c a , R . , R o u s s e l , M . F . , L o o k , A . T .& S t a n l e y , E . R . ( 1 9 8 5 ) C e l l 4 1 , 6 6 5 - 6 7 6 .1 8 . H u n t e r , T . & S e f t o n , B . M . ( 1 9 8 0 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 7 ,1 3 1 1 - 1 3 1 5 .1 9 . B a r b a c i d , M . , B e e m a n , K . & D e v a r e , S . G . ( 1 9 8 0 ) P r o c . N a t l . A c a d .S c i . USA 7 7 , 5 1 5 8 - 5 1 6 2 .2 0 . G i l m o r e , T . , D e C l u e , J . E . & M a r t i n , G . S . ( 1 9 8 5 ) C a n c e r C e l l s 3 , 2 5 - 3 2 .2 1 . P r y w e s , R . , F o u l k e s , J . G . & B a l t i m o r e , D . ( 1 9 8 5 ) J . V i r o l . 5 4 , 1 1 4 - 1 2 2 .2 2 . S n y d e r , M . A . , B i s h o p , J . M . , M c G r a t h , J . P . & L e v i n s o n , A . D. ( 1 9 8 5 )M o l . C e l l . B i o l . 5 , 1 7 7 2 - 1 7 7 9 .2 3 . H u n t e r , T . & C o o p e r , J . A . ( 1 9 8 6 ) E n z y m e s 1 7 , 1 9 1 - 2 4 6 .2 4 . H a n a f u s a , T . , M a t h e y - P r e v o t , B . , F e l d m a n , R . A . & Ha na fu s a, H .( 1 9 8 1 ) J . V i r o l . 3 8 , 3 4 7 - 3 5 5 .2 5 . U s h i r o , H . & C o h e n , S . ( 1 9 8 0 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 5 , 8 3 6 3 - 8 3 6 5 .2 6 . K a s u g a , M . , Z i c k , Y . , B l i t h e , D . L . , C r e t t a z , M . & K a h n , C . R . ( 1 9 8 2 )N a t u r e ( L o n d o n ) 2 9 8 , 6 6 7 - 6 6 9 .2 7 . E k , B . , W e s t e r m a r k , B . , W a s t e s o n , A . & H e l d i n , C . - H . ( 1 9 8 2 ) N a t u r e( L o n d o n ) 2 9 5 , 4 1 9 - 4 2 0 .

2 8 . N i s h i m u r a , J . , H u a n g , J . S . & D e u e l , T . F . ( 1 9 8 2 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i .USA 7 9 , 4 3 0 3 - 4 3 0 7 .2 9 . F r a c k e l t o n , A . R . , J r . , T r e m b l e , P . M. & W i l l i a m s , L . T . ( 1 9 8 4 ) J . B i o l .C h e m . 2 5 9 , 7 9 0 9 - 7 9 1 5 .3 0 . C o o p e r , J . A . , S e f t o n , B . M . & H u n t e r , T . ( 1 9 8 3 ) M e t h o d s E n z y m o l . 9 9 ,3 8 7 - 4 0 2 .3 1 . C o o p e r , J . A . & H u n t e r , T . ( 1 9 8 3 ) C u r r . T o p . M i c r o b . I m m u n o l . 1 0 7 ,1 2 5 - 1 6 1 .3 2 . R o s s, A . H . , B a l t i m o r e , D . & E i s e n , H . N . ( 1 9 8 1 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 9 4 ,6 5 4 - 6 5 6 .3 3 . F r a c k e l t o n , A . R . , J r . , R o s s , A . H . & E i s e n , H . N . ( 1 9 8 3 ) M o l . C e l lB i o l . 3 , 1 3 4 3 - 1 3 5 2 .3 4 . F r i e d m a n , B . , F r a c k e l t o n , A . R . , J r . , R o ss , A . H . , C o n n o r s , J . M . ,F u j i k i , H . , S u g i m u r a , T . & R i c h - R o s n e r , M . ( 1 9 8 4 ) P r o c . N a t l . A c a d .S c i . USA 8 1 , 3 0 3 4 - 3 0 3 8 .3 5 . F o u l k e s , J . G . , C h o w , M . , G o r k a , C . , F r a c k e l t o n , A . R . , J r . , & B a l t i -m o r e , D . ( 1 9 8 5 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 0 , 8 0 7 0 - 8 0 7 7 .3 6 . P a n g , D . T . , S h a r m a , B . R . , S h a f e r , J . A . , W h i t e , M . F . & K a h n , C . R .( 1 9 8 5 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 0 , 7 1 3 1 - 7 1 3 6 .3 7 . C o m o g l i o , P . M . , D i R e n z o , M . F . , T a r o n e , G . , G i a n c o t t i , F . G . ,N a l d i n i , L . & M a r c h i s i o , P . C . ( 1 9 8 4 ) EMBO J . 3 , 4 8 3 - 4 8 9 .3 8 . L o z z i o , C . B . & L o z z i o , B . B . ( 1 9 7 5 ) B l o o d 4 5 , 3 2 1 - 3 3 4 .3 9 . P e g o r a r o , L . , M a t e r a , L . , R i t z , J . , L e v i s , A . , P a l u m b o , A . & B i a g i n i , G .( 1 9 8 3 ) J . N a t l . C a n c e r I n s t . 7 0 , 4 4 7 - 4 5 1 .4 0 . W i e m a n n , M . , H o l l m a n n , A . , P o s n e r , M . , A r l i n , Z . , F r i e d l a n d , M . &C a l a b r e s i , P . ( 1 9 8 5 ) C l i n . R e s . 3 3 , 4 6 0 ( a b s t r . ) .4 1 . C o l l i n s , S . J . , G a l l o , R. C . & G a l l a g h e r , R . E . ( 1 9 7 7 ) N a t u r e ( L o n d o n )2 7 0 , 3 4 7 - 3 4 9 .4 2 . S c h e r , C . D . & S i e g l e r , R . ( 1 9 7 5 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 5 3 , 7 2 9 - 7 3 1 .4 3 . G o f f , S . P . , W i t t e , 0 . N . , G i l b o a , E . , R o s e n b e r g , N . & B a l t i m o r e , D .( 1 9 8 1 ) J . V i r o l . 3 8 , 4 6 0 - 4 6 8 .4 4 . L a e m m l i , U . K . ( 1 9 7 0 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 2 7 , 6 8 0 - 6 8 5 .4 5 . K o n o p k a , J . B . , D a v i s , R . L . , W a t a n a b e , S . M . , P o n t i c e l l i , A . S . ,S c h i f f - M a k e r , L . , R o s e n b e r g , N . & W i t t e , 0 . N . ( 1 9 8 4 ) J . V i r o l . 5 1 ,2 2 3 - 2 3 2 .4 6 . M a r i a s h , C . N . , S e e l i g , S . & O p p e n h e i m e r , J . H . ( 1 9 8 2 ) A n a l . B i o c h e m .1 2 1 , 3 8 8 - 3 9 4 .4 7 . C l e v e l a n d , D . W . , F i s c h e r , S . G . , K i r s c h n e r , M . W . & L a e m m l i , U . K .( 1 9 7 7 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 2 , 1 1 0 2 - 1 1 0 6 .4 8 . C o o p e r , J . A . , E s c h , F . S . , T a y l o r , S . S . & H u n t e r , T . ( 1 9 8 4 ) J . B i o l .C h e m . 2 5 9 , 7 8 3 5 - 7 8 4 1 .4 9 . K o n o p k a , J . B . & W i t t e , 0 . N . ( 1 9 8 5 ) M o l . C e l l . B i o l . 5 , 3 1 1 6 - 3 1 2 3 .5 0 . K o n o p k a , J . B . , W a t a n a b e , S . M . , S i n g e r , J . W . , C o l l i n s , S . J . & W i t t e ,0 . N . ( 1 9 8 5 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 2 , 1 8 1 0 - 1 8 1 4 .5 1 . A n d e r s s o n , L . C . , J o k i n e n , M . & G a h m b e r g , C . G . ( 1 9 7 9 ) N a t u r e( L o n d o n ) 2 7 8 , 3 6 4 - 3 6 5 .5 2 . A n d e r s s o n , L . C . , N i l s s o n , K . & G a h m b e r g , C . G . ( 1 9 7 9 ) I n t . J . C a n c e r2 3 , 1 4 3 - 1 4 7 .5 3 . J o k i n e n , M . , G a h m b e r g , C . G . & A n d e r s s o n , L . C . ( 1 9 7 9 ) N a t u r e( L o n d o n ) 2 7 9 , 6 0 4 - 6 0 7 .5 4 . B e n z , E . J . , J r . , B e r m a n , B . W . , M a z u r , E . M . , C a v a l l e s c o , C . , J e n k o ,T . , S n y d e r , E . L . , F o r g e t , B . G . & H o f f m a n , R . ( 1 9 8 0 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . USA 7 7 , 3 5 0 9 - 3 5 1 3 .5 5 . R u t h e r f o r d , T . R . , C l e g g , J . B . & W e a t h e r a l l , D . J . ( 1 9 7 9 ) N a t u r e( L o n d o n ) 2 8 0 , 1 6 4 - 1 6 5 .5 6 . A n t l e r , A . M . , G r e e n b e r g , M . E . , E d e l m a n , G . M . & H a n a f u s a , H .( 1 9 8 5 ) M o l . C e l l . B i o l . 5 , 2 6 3 - 2 6 7 .5 7 . S e f t o n , B . M . , H u n t e r , T . & C o o p e r , J . A . ( 1 9 8 3 ) M o l . C e l l . B i o l . 3 ,5 6 - 6 3 .5 8 . S a g g i o r o , D . , F e r r a c i n i , R . , D i Re nz o , M . F . , N a l d i n i , L . , C h i e c o -B i a n c h i , L . & C o m o g l i o , P . M . ( 1 9 8 6 ) I n t . J . C a n c e r 3 7 , 6 2 3 - 6 2 8 .5 9 . F r a c k e l t o n , A . R . , J r . ( 1 9 8 5 ) i n C a n c e r C e l l s 3 : G r o w t h F a c t o r s a n dT r a n s f o r m a t i o n , e d s . F e r a m i s c o , J . , O z a n n e , B . & S t i l e s , C . ( C o l dS p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y ) , p p . 3 3 9 - 3 4 5 .6 0 . F e r r e r o , D . , P e s s a n o , S . , P a g l i a r d i , G . L . & R o v e r a , G . ( 1 9 8 3 ) B l o o d 6 1 ,1 7 1 - 1 7 9 .6 1 . M a r t i n , P . & P a p a g a n n o p o u l o u , T . H . ( 1 9 8 2 ) S c i e n c e 2 1 6 , 1 2 3 3 - 1 2 3 5 .6 2 . C a s n e l l i e , J . E . , H a r r i s o n , M . L . , P i k e , L . J . , H e l l s t r o m , K . E . &K r e b s , E . G . ( 1 9 8 2 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 9 , 2 8 2 - 2 8 6 .6 3 . H a r r i s o n , M . L . , L o w , P . S . & G e a h l e n , R . L . ( 1 9 8 4 ) J . B i o l . C h e m .2 5 9 , 9 3 4 8 - 9 3 5 0 .6 4 . E a r p , H . S . , A u s t i n , K . S . , B u e s s o w , S . C . , D y , R . & G i l l e s p i e , G . Y .( 1 9 8 4 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c d . USA 8 1 , 2 3 4 7 - 2 3 5 1 .6 5 . N e l , A . E . , L a n d r e t h , G . E . , G o l d s c h m i d t - C l e r m o n t , H . , T u n g , E . &G a l b r a i t h , R . M . ( 1 9 8 4 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 2 5 , 8 5 9 - 8 6 6 .6 6 . W i c k r e m a s i n g h e , R . G . , P i g a , A . , M i r e , A . R . , T a h e r i , M . R . , Y a x l e y ,J . C . & H o f f b r a n d , A . V . ( 1 9 8 5 ) L e u k e m i a R e s . 9 , 1 4 4 3 - 1 4 5 0 .6 7 . K u r a t s u n e , H . , O w a d a , K . , M a c h i i , T . , N i s h i m o r i , Y . , U e d a , E . ,T o k u m i n e , Y . , T a g a w a , S . , T a n i g u c h i , N . , F u j i o , H . & K i t a n i , T . ( 1 9 8 5 )B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 3 3 , 5 9 8 - 6 0 1 .6 8 . N a l d i n i , L . , S t a c c h i n i , A . , C i r i l l o , D. M . , A g l i e t t a , M . , G a v o s t o , F . &C o m o g l i o , P . M . ( 1 9 8 6 ) M o l . C e l l . B i o l . 6 , 1 8 0 3 - 1 8 1 1 .6 9 . O g a w a , R . , O h t s u k a , M . & W a t a n a b e , Y . ( 1 9 8 6 ) C a n c e r R e s . 4 6 ,2 5 0 7 - 2 5 1 0 .

4 4 1 2 B i o c h e m i s t r y : Huhn e t a l .