(19) 한민 특허청(KR)

(12) 등 특허공보(B1)

(45) 공고 2014 08월12

(11) 등 10-1428873

(24) 등 2014 08월04

(51) 특허 (Int. Cl.)

A61K 8/97 (2006.01) A61Q 19/02 (2006.01)

A61Q 19/00 (2006.01)(21) 원 10-2012-0136038

(22) 원 2012 11월28

심사청 2012 11월28

(65) 공개 10-2014-0068487

(43) 공개 2014 06월09

(56) 행 사 헌

JP4033808 B2*

JP04033808 B2

* 심사 에 하여 헌

망 : 양도, 실시 허여, 지도

(73) 특허

강원 학 산학 단

강원도 천시 강원 학 1 ( 동)

(72)

창진

울특별시 산 88 15, 2동 410 (동, 아 트)

경훈

강원도 천시 실 261, 605동 511 (후평동,경6차아 트)

(74) 리

병갑

체 청 항 : 8 항 심사 :

(54) 리 포함하 피 미 주 개 료 .

(57) 약

본 리 료 에 한 것 , 하게 리 포

함하 피 미 피 주 개 료 에 한 것 다. 본 리 피 에

키지 않 안 한 특징 고, 티 시나아 해하 통하여 라닌 생 억 함

미 과 가지 , 알루 니다아 해함 피 주 생 지할 므 ,

포함하 본 피 에 극 키지 않 피 미 주 개 한

재 사 것 다.

도 - 도1

등록특허 10-1428873

- 1 -

지원한 가연 개 사업

과 고 A103017

처 보건복지

연 사업 틱연 개 사업

연 과 삼 래 항 진 사 드 규 연

여 1/1

주 강원 학

연 간 2011.11.01 ~ 2012.10.31

등록특허 10-1428873

- 2 -

특허청

청 항 1

리 포함하 피 미 료 .

청 항 2

리 포함하 피 주 개 료 .

청 항 3

1항 2항에 어 ,

상 리 건 리 뿌리 70% 에탄 것 특징 하 .

청 항 4

1항에 어 ,

상 리 티 시나아 억 해하여 라닌 생 억 하 것 특징 하

피 미 료 .

청 항 5

2항에 어 ,

상 리 알루 니다아 억 해하고, 항산 통해 피 억 하

것 특징 하 피 주 개 료 .

청 항 6

1항 2항에 어 ,

상 리 량 비 0.0001 내지 20 량% 포함 것 특징 하 료

.

청 항 7

1항 2항에 어 ,

상 킨 , 킨 프 , 킨 , 아 트린 트, , 크 , 처 , 양 , 맛

사지크림, 양크림, 처 크림, 핸드크림, 에 , 양에 , , 비 , 샴 , 클 징폼, 클 징 ,

클 징크림, , 클 , 액, 립 틱, 컵 , 운 , 프 우 루 우

루어진 택 1 것 특징 하 료 .

청 항 8

1항 2항 료 간 피 에 하여 피 지, 피 주 개 피 미 과

갖 것 특징 하 .

야

본 리 포함하 료 에 한 것 , 보다 체 [0001]

리 포함하 피 미 주 개 갖 료 에 한 것 다.

등록특허 10-1428873

- 3 -

경

피 극 우리 몸 보 해주 체 어 , 미 에 도 그 심[0002]

아지고 다. 에 라 다양한 에 한 연 가 한 , 그 에 도 주 미

에 한 다양한 들 시 고 실 다.

피 그 원 에 라 크게 내 가지 , 내 (intrinsic agin[0003]

g) 연 가함에 라 생체 생리 하 어 연 상(aging process)

고, (extrinsic aging) (UV), 건 한 공 (dry air), 산 (reactive oxygen

species) 트 등 에 해 생하 상 다. 런 들에 해 피 가 진행

, 피 에 주 생 다.

주 생 원 여러 가지가 보고 고 , 우 피 가 과다한 에 피 [0004]

라겐(Collagen) 해가 진 어 피 가 탄 고 주 생 다. 한, 피 가 과도한 도변

습도 하나 람 등에 해 지나 게 건 해지 에 한 어벽 피 하 어 주

생 도 한다. 그리고, 피 가 산 나 라 에 산 에 해 과산 지질 생

고 그 해 라겐 등 피 단 질 변 어 주 생 다.

한편, 피 가 어나 피 각질 가 어나고, 피 포 합 도가 차 지 , 피 포[0005]

얇게 고, 각질 껍게 , 진피 과 경계 직 다. 진피에 아 포(human skin

fibroblast)가 질과 질 생산 하 고, 포내 과산 가 격 가하 , 각

염 질과 트 등에 향 게 어 포 원 행할 없게 고 포 사

하 , 그 결과 , 상 주 생 게 고 해 피 가 진 다. 라 러

한 과 내 에 한 피 나 주 생 억 하고 다양한 연 고

실 다.

한편, 피 에 사 피 라 사 트가 어 티 시나 TRP1, TRP2 에[0006]

해 라닌 생 진 다. 생 라닌 피 에 착 어 "검 ", "주근 " 하 , 것

지하 하여 다양한 함 미 사 고 다. 한, 피지, 포막

등 산 진하여 각 피 애 키 것 지고 , 특 근 에

가 보다 과 피 산 지책 실 다.

래 알 진 미 과 나타내 아 브산 산에 염, 하 드 퀴 도체, 태 , [0007]

지산, 엘라그산 등 , 들 합한 다. 특 근래에 태

한 미 각 고 나, 런 태 그 공 량 한 고 리 결합하여

그 사 한 다. 라 , 신규하고 과 미 개 에 한 심 집 고 다.

근에 식 에 함 폴리 등에 미 과가 것 보고 어 , 사 하 [0008]

안 고 다. 한, 플라 , 하 드 시플라본 미 과에 해 도 미 개시 어 다.

그러나, 들 미 그 과가 다 미비하고 보 시 , 미 과 에 주 지 과

지 과 하지 못하 실 다. 특 학 함 경우 피

극 하여 민감 피 에 합하지 않 , 피 에 극 고 경 천연 식 래

에 한 심 집 고 다.

한편, 리 (Phryma leptostachya var. asiatica Hara) 리 과 여러해살 우리나라 각처 산과[0009]

들에 나 다 생 본 다. 생 경 그 양지 양 비 한 곳에 라 키 약 70 고,

가 7~9, 폭 4~7 루가 양 특 맥 에 많고 가 리에 톱니가 난

고 마주난다. 독식 뿌리 에 여 리 죽 에 리 라고 하 , 뿌리

포 체 짓찧어 린 등에 해독하 다. 한 , 본, , 말라야 산

맥, 동시 리아 등지에 포한다.

러한 리 래에 거 , 살 , 해독 사 어 다. 한 리 에 리[0010]

리그난 (phrymarolins Ⅰ, Ⅱ, haedoxan A) 천연 살 과가 것 알 , 우 릭산

과 간 암 포에 포독 갖 다 도가 보고 고 뿐 다.

에 본 들 생체에 없 피 미 주 개 과가 우 한 한 새[0011]

등록특허 10-1428873

- 4 -

운 재 천연 질 색하 , 리 에 주 하여 그 실험해 본 결과, 리 에탄

티 시나아 시험 내 과 억 하여 미 과 나타내고, 알우 니다아

도 억 하여 주 개 견함 본 하 다.

행 헌

특허 헌

(특허 헌 0001) 1. 본 공개특허공보 (평)6-16531 [0012]

(특허 헌 0002) 2. 본 공개특허공보 (평)10-101543

내

해결하 과

라 본 생체에 없 피 미 주 개 료 [0013]

공하 것 다.

과 해결 단

상 같 본 달 하 해 , 본 리 포함하 피 미[0014]

료 공한다.

한, 본 리 포함하 피 주 개 료 공한다.[0015]

본 실시 에 어 , 상 리 건 리 뿌리 70% 에탄 다. [0016]

본 실시 에 어 , 상 리 티 시나아 억 해하여 라닌 생[0017]

억 할 다.

본 실시 에 어 , 상 리 알루 니다아 억 해하고, 항산[0018]

통해 피 억 할 다.

본 실시 에 어 , 상 리 량 비 0.0001 내지 20 량% 포함 [0019]

다.

본 실시 에 어 , 상 킨 , 킨 프 , 킨 , 아 트린 트, ,[0020]

크 , 처 , 양 , 맛사지 크림, 양크림, 처 크림, 핸드크림, 에 , 양에 ,

, 비 , 샴 , 클 징폼, 클 징 , 클 징크림, , 클 , 액, 립 틱, 컵 ,

운 , 프 우 루 우 루어진 택 1 다.

한, 본 상 본 에 료 간 피 에 하여 피 지, 피 주 개 [0021]

피 미 과 갖 것 특징 하 공한다.

과

본 리 료 에 한 것 , 하게 리 포[0022]

함하 피 미 피 주 개 료 에 한 것 다. 본 리 피 에

키지 않 안 한 특징 고, 티 시나아 해하 통하여 라닌 생 억 함

미 과 가지 , 알루 니다아 해함 피 주 생 지할 므

, 포함하 본 피 에 극 키지 않 피 미 주 개

한 재 사 것 다.

도 간단한

도 1 본 리 (PLE) 도에 티 시나아 에 한 시 나아 (A) 시다아[0023]

(B) 억 보여주 그래프 다.

등록특허 10-1428873

- 5 -

도 2 본 리 (PLE) 도에 알루 니다아 억 보여주 그래프 다.

도 3 본 리 (PLE) 도에 DPPH 라 거 보여주 그래프 다.

도 4 본 리 (PLE) 도에 라 마우 식 포(RAW264.7 포)에 산 (ROS) 거

보여주 그래프 다(Cont: LPS 리 처리하지 않 처리 , 200: 본 리

200ug/ml 처리한 후 LPS 처리하지 않 실험 ).

도 5 본 리 (PLE) 도에 라 마우 식 포(RAW264.7 포)에 산 질 (NO) 생 억

도 나타내 그래프 다(Cont: LPS 리 처리하지 않 처리 , 200: 본 리

200ug/ml 처리한 후 LPS 처리하지 않 실험 ).

도 6 본 리 (PLE) 도에 라 마우 식 포(RAW264.7 포)에 iNOS COX-2 억

도 나타내 웨 블랏 결과 다.

도 7 본 리 (PLE) 도에 라 마우 식 포(RAW264.7 포)에 MMP-2 MMP-9

도 그래피(zymorgraphy) 통해 한 것 다.

실시하 한 체 내

본 들 피 지하고, 피 주 개 하 피 미 과 진시킬 새 운 [0024]

재 연 하 , 리 러한 갖고 하 다.

라 본 본 리 에 한 리 포함하 료 [0025]

공함에 그 특징 다.

특 본 들 천연 질 래 어 체에 안 하 도, 탁월한 미 과 항 과 나타낼[0026]

재 찾고 색하 , 리 에 주 하 리 미 과 주 개

과 가지고 지 실험 통해 하 다.

, 본 실시 에 , 본 리 티 시나아 도 해하 [0027]

것 나타났다(도 1 참 ).

한편, 라닌 피 에 재하 색 등 극 신체 보 하 한 한다.[0028]

하지만 것 과 생 어 착 미나 주근 등 시 피 상 야 할 나

아가 피 진시키고 피 암 할 에 라닌 과 생 억 할 질 경우

미 사 가 하다.

피 색 착 나 염 등 극에 해 야 나 몬, 식 등과 학[0029]

질 등 에 해 도 생 다고 알 다. 라닌 생합 과 피 라닌 포 (melanocyte)가

여한다. , 라닌 생합 라 (melanosome) 라고 리 특 한 태 라닌 포 내 에

어나 라 내에 라닌 생 에 티 시나 (tyrosinase)라 가 가 한 역할

한다. 에 해 티 신(tyrosine) 도 (dopa) 것 산 과 통해 도

퀴 (dopaquinone) 생 고 다시 도 크 (dopachrome) 변 갈색 라닌

하게 다. 라닌 색 에 여하 단 질 티 시나 (tyrosinase), TRP-1(tyrosinase

related protein-1), TRP-2, ERK(Extracellular signal-regulated kinases) 러한 라닌 합

하 주 사 MITF(Microphthalmia-associated transcription factor) 한 라닌 합

과 역할 한다.

라 티 시나 억 하 본 리 경우 피 색 착 하고 피 미[0030]

과 한 도 사 다.

한, 본 다 실시 에 , 본 리 알루 니다아 도 [0031]

해하 것 사 었다.(도 2 참 ).

참고 알루 니다아 (Hyaluronidase) 알루 산(hyaluronic acid) 가 해하 알루 산[0032]

피 보습 에 어 한 하 질 다량 함 할 가지고 어

피 에 알루 산 감 피 가 건 해지 원 주 래하 원 다.

라 상 같 결과 통해, 본 리 알루 니다아 (Hyaluronidase) 억 하 [0033]

등록특허 10-1428873

- 6 -

가지고 어 피 보습 지시킬 게 하 , 나아가 피 주 생 억 시킬 다.

한, 본 다 실시 에 본 리 DPPH 라 거하 가지 , 포[0034]

내 산 도 과 감 시 강 한 항산 가지 것 나타났다. 뿐만 아니라, 본

리 산 질 (NO) 생산 억 , iNOS COX-2 도 억 MMP-9 억

통하여 항염 가지 것 었다.

같 결과 통해, 본 들 본 리 피 미 과, 항주 과, 항 과,[0035]

항산 과 항염 과 가지고 다 것 실험 하 다.

그러므 본 리 포함하 료 , 피 미 료 [0036]

, 피 주 개 료 , 항 료 피 보습 료 공할

다.

본 에 리 당업계에 공지 리하 사 하여 천연 [0037]

리하여 득한 것 사 할 , 본 에 ‘ ’ 한 매 하여 리

한 것 , 들어, 리 , 극 매 가 비극 매 가 포

함한다. 람직하게 리 뿌리에 한 다.

상 리 하 한 한 매 약학 허 매라 어 것 사[0038]

해도 하 , 매 사 할 , 에 한 지 않 나, 들어, , 탄

(methanol), 에탄 (ethanol), 프 (propanol), 프 (isopropanol), 탄 (butanol) 등 포함하

탄 1 내지 4 알 , 아 (acetone), 에 (ether), (benzene), 클 포 (chloroform), 에

틸아 트(ethyl acetate), 틸 클 라 드(methylene chloride), 헥산(hexane) 시클 헥산

(cyclohexane) 등 각 매 단독 합하여 사 할 다. 람직하게 에탄 (주 ) 사 할

, 보다 람직하게 70% 에탄 사 하 것 다.

열 , 냉 , 냉각 , 매 , , , ,[0039]

압착 등 어 하나 택하여 사 할 다. 한, 하 가 통상 공

행할 도 , 통상 하여 도 다. 본 리

에 한 없 , 공지 어 어 한 도 다.

들 , 본 에 포함 리 상 한 열 매 1차[0040]

, 감압 동결 건 건 등과 같 가 과 에 해 말 상태 할

다. 한 상 1차 실리 겔 컬럼 크 마 그래피(silica gel column chromatography), 크 마

그래피(thin layer chromatography), 고 액체 크 마 그래피(high performance liquid chromatography)

등과 같 다양한 크 마 그래피 하여 가 얻 도 다.

라 본 에 어 리 , 각 단계에 얻어지 든 액, [0041]

, 그들 액, 액 건 포함하 개 다.

본 실시 에 리 하 체 살펴보 다 과 같다.[0042]

본 에 건 리 뿌리 쇄하여 말 한 후, 상 말에 70% 에탄 첨가하여 실 에 주[0043]

동안 한 다 , 러한 에탄 진공에 시 건 우 하 과 거쳐 리

득할 다.

한편, 본 경우, 본 상 한 리 뿐만 아[0044]

니라, 료 에 통상 들 포함할 , 컨 항산 , 안 ,

해 , 비타민, 안료 향료 같 통상 보 , 그리고 담체 포함할 다.

한, 본 상 한 리 에, 리 과 하여 피 보 과 상시키[0045]

지 않 한도에 래 사 어 차단 합하여 사 할 도 다.

차단 리 릴 , 드 트리 트리실 산, 드 트리 , 갈 트리 리에 트, [0046]

듐 닐 미다 트라 포 트, 에 헥실 타미도트리아 , 에 아미 하 드 시 헥실 에

트, 에 - 시신나 트, 우 과 하 드 시아 합 , 비 - 트리아 릴 트라

틸 , 4- 질리 , 틸안트라닐 트, -3( 시 ), -4, -8( 시

등록특허 10-1428873

- 7 -

), 틸 시 탄, 비 에 헥실 시 시 닐트리아진, 시 트, 에 하 드 시프

필 , 크릴 , 에 헥실 , 에 헥실 시신나 트, 에 헥실살리실 트,

에 헥실트리아 , 아 -p- 시신나 트, 폴리실리 -15( 에 말 트), 프탈릴리

포닉애씨드 그 염 , 티 에 -살리실 트 아미 애씨드( ) 루어진

택 1 상 사 할 다.

한, 본 료 당업계에 통상 어 한 도 [0047]

, 들어, 액, 탁액, 탁액, 트, 겔, 크림, , 우 , 비 , 계 -함 클 징,

, 말 운 , 탁액 운 , 운 프 등 나, 에 한

것 아니다. 보다 상 하게 , 본 료 연 , 양 , 양 크림, 마사지

크림, 에 , 아 크림, 클 징 크림, 클 징 폼, 클 징 워 , , 프 우

다.

본 트, 크림 겔 경우에 담체 동 , 식 , , 라핀, [0048]

, 트라 트, 룰 도체, 폴리에틸 리 , 실리 , 나 트, 실리 , 탈크 산 아연 등

다.

본 액 탁액 경우에 담체 매, 해 탁 가 고, [0049]

컨 , 에탄 , 프 , 에틸 보 트, 에틸 아 트, 질 알 , 질 에 트, 프 필

리 , 1,3- 틸 리 , 리 지 에 , 폴리에틸 리 비탄 지 산 에

가 다.

본 탁액 경우에 담체 , 에탄 프 필 리 과 같 액상 ,[0050]

에 실 아릴 알 , 폴리 시에틸 비 에 폴리 시에틸 비탄 에 같

탁 , 미 결 룰 , 알루미 타 드 시드, 나 트, 아가 트라 트 등

다.

본 우 프 경우에 담체 락 , 탈크, 실리 , 알루미 드 시[0051]

드, 실리 트 폴리아미드 우 가 고, 특 프 경우에 가 클

플루 드 본, 프 / 탄 틸 에 같 진체 포함할 다.

본 계 함 클 징 경우에 담체 지 알 트, 지 알[0052]

에 트, 포 신산 에 , 티 트, 미다 리 도체, 틸타우 트, 사

시 트, 지 산 아미드 에 트, 알킬아미도 타 , 지 알 , 지 산 리 리드, 지 산

에탄 아미드, 식 , 라 린 도체 에 실 리 지 산 에 등 다.

한, 본 리 포함하 료 간 피 에 하여 피[0053]

지, 피 주 개 피 미 과 갖 것 특징 하 공할 다.

본 본 료 하 든 컫 다. , 료[0054]

하 당업계에 공지 든 본 에 한다.

본 료 단독 복하여 사 하거나, 본 다 료 과 복하여 사[0055]

할 다. 한 본 에 료 통상 사 에 라 사 , 사 피

상태 취향에 라 그 사 달리할 다.

본 료 비 , 계 함 클 징 계 비함 클 징 [0056]

경우, 피 에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 씻어낼 도 다. 체 , 상 비 액상비 ,

가루비 , 고 비 비 , 상 계 함 클 징 클 징 폼, 클 징 워 , 클 징

건 클 징 , 상 계 비 함 클 징 클 징크림, 클 징 , 클 징 워 클

징 겔 , 에 한 것 아니다.

하 본 실시 에 하여 욱 상 하게 한다. 들 실시 단지 본 보다 체 [0057]

하 한 것 , 본 가 들 실시 에 한 지 않 다 것 당업계에 통상 지식 가진

에게 어 할 것 다.

등록특허 10-1428873

- 8 -

<실시 >[0058]

시약[0059]

비타민 C, 균 리포폴리사 라 드(LPS, natural, purify≥97%), 라틴 그리 시약 Sigma-Aldrich[0060]

Chemical Co.(St. Louis, MO, USA) 하 다. 듐 도 실 트(SDS: Sodium dodecyl sulfate),

틴(leupeptin), 닐 타 포닐 플 라 드(PMSF: phenylmethanosulfonyl fluoride), 1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazyl (DPPH), HEPES, 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) Sigma-Aldrich Chemical

Co.(St. Louis, MI, USA) 하 다. Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM), fetal bovine serum

(FBS) penicillin-streptomycin Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA) 하 다. 한, L-

tyrosine, L-DOPA, mushroom tyrosinase, Hyaluronic acid, agarose, hyaluronidase, aqueous

cetylpyridinium chloride 역시 Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO, USA) 한 것 사 하

다. 든 다 합 시약 등 상 것 사 하 , 든 실험 어도 3 복 행하

다.

통계처리[0061]

실험결과 평균± 편차 하 고, 그 결과들 통계 하 하여 unpaired Student's t-test [0062]

행하 다. p 값 0.05 미만 통계 하다고 단하 다. IC50 값 dose/response linear

regression plots 계산 었다.

<실시 1>[0063]

리 [0064]

리 하 하여, 건 리 뿌리 쇄하여 말 한 후, 상 리 뿌리 말에[0065]

70% 에탄 가하여 상 에 주 동안 하 다. 상 70% 에탄 리 진공에 시키

과 통해 감압 하여 건 우 한 후 하 실험에 리 70% 에탄 에 여 시

료 사 하 다. , 리 에탄 득 13.1% 었다.

참고 상 건 리 뿌리 2010 8월 주도 지역 마트에 하여 사 하 , 식 동 [0066]

천 강원 학 생 과학 , 억 았다. 본 상 리 시료 강원 학

연과학 학 생 과학과 식 본 에 보 하여 승 KWNU56570 여 았다.

<실시 2>[0067]

포 양[0068]

마우 식 포주 RAW264.7 포 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에 득하[0069]

, 10% 열 블 FBS, 25 mM HEPES (pH 7.5), 100 units/ml 니실린 100 μg/ml 트 마 신

포함하 DMEM 지에 양 었다. RAW264.7 포들 5×105 포 도 플 트에 주한 후 37℃에 24

시간 동안 양한 후, 5% CO2 포함하 항 에 양하여 실험에 하 다.

<실험 1>[0070]

리 (PLE) 타 시나 (Tyrosinase) 해 통한 피 미 과 [0071]

티 시나아 라닌 색 생 진하 , 그 억 하 라닌 색 생 해 어 피[0072]

미 과 나타낸다. 라 피 미 과 나타내 미 한 하나가 라닌 색

생 하 라 사 트에 티 시나아 억 하 것 다.

, 티 시나아 리 포함하고 주 라닌 색 생 에 여하 , 라닌 생합 과[0073]

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- 9 -

에 시 나아 에 해 L-tyrosine L-DOPA 드 실 하거나 산 에 해 L-DOPA

dopaquinone 산 시키 과 에 여한다.

에 본 들 상 <실시 1> 통해 본 리 in vitro에 피 미 과[0074]

나타내 지 하 하여 리 티 시나아 억 과 사하 다.

해 시 나아 (monooxygenase(cresolase)) 한 질 L-tyrosine 사 하 고,[0075]

시다아 (oxidase(catecholase)) 한 질 L-DOPA 사 하 다.

티 시나아 (Tyrosinase) monooxygenase(cresolase) 당업계에 공지 에 라 96 well plate[0076]

reader 한 도 크 (dopachrome) 하 다. 1.5mM L-tyrosine 100units/ml

mushroom tyrosinase 포함한 0.1M 산 (pH 6.7) 상에 37℃ 도 행하 다. 합 질

첨가하 15 간 처리 시 고, 도 변 490 nm에 하 다.

Tyrosinase L-DOPA 산 역시 당업계에 공지 에 라 도 에 라 행하 다. 0.04mM[0077]

산 (pH6.8), 0.5mM L-DOPA, 6units/ml mushroom tyrosinases 포함하 각 합 37℃에

시키고, 도 변 plate reader 하여 475nm에 하 다.

그 결과, 도 1에 나타낸 같 , 리 처리한 도에 티 시나아 시 나아[0078]

시다아 억 하 것 나타났다. 특 30ug/ml 도 리 처리한 경우

티 시나아 시 나아 약 26.9% 지 감 시 (도 1A), 시다아 약 45.2% 지

감 시 다.

한, 리 티 시나아 에 한 시 나아 시다아 에 한 IC50 각각 9.0ug [0079]

11.6ug 었 , 양 사 한 β-Arbutin 티 시나아 에 한 시 나아

시다아 IC50 각각 0.9mg/ml과 18.5mg/ml 었다.

상 결과 통하여 본 들 본 리 라닌 생 과 에 티 시나아 [0080]

해함 라닌 생합 억 할 므 , 미 한 료 사 할 알

었다.

[0081]

<실험 2> [0082]

리 알루 니다아 억 통한 항 과 [0083]

알루 니다아 (Hyaluronidase) 알루 산(hyaluronic acid) 가 해하 다. 알루 산 피[0084]

보습 에 어 한 하 질 다량 함 할 가지고 어 피 에

알루 산 감 피 가 건 해지 원 다.

라 본 들 리 알루 니다아 에 미 향 사하 해 알루 산(HA,[0085]

Streptococcus equi) 에 해하여 그 도가 8mg/ml 도 하고, (sonication) 처리한 후 -20℃

에 보 하 다. 한, 아가 (agarose) 0.3M 산염 나트 (sodium phosphate buffer, pH 7)에

지에 해하고 사 도가 55℃ 지 도 하 다.

상 알루 산 미리 55℃ 열하고, 상 아가 (agarose) 합하여 알루 산 도[0086]

0.8mg/ml, 아가 도 0.8%(w/v) 도 하 다. 상 알루 산-아가 합액(100ul) 마

크 플 트에 주하고, 각 웰에 0.3M 산염 나트 (sodium phosphoate buffer, pH)에 해 알루

니다아 100ul 본 리 도별 첨가하여 합하고, 37℃에 1 시간 동안 시 다.

후, 샘플 거하고, 각 웰에 10%(w/v) aqueous cetylpyridinium chloride(100ul) 채운 후 상

에 30 간 시키고 plate reader 하여 595nm 도에 하 다.

그 결과, 리 도 억 것 나타났고, 특 10ug/ml 도에[0087]

60%에 달하 억 과 나타내었다. 통해 본 들 리 우 한 피 보습 과

가질 다 것 알 었다.

등록특허 10-1428873

- 10 -

<실험 3>[0088]

리 항산 과 [0089]

피 가 산 나 라 에 산 에 해 과산 지질 생 고 그 해 라겐[0090]

등 피 단 질 변 어 피 가 어난다.

라 , 본 들 상 <실시 1> 통해 본 리 항산 과 하 [0091]

하여, DPPH 라 거 , 포 내 산 (ROS) 거 하 다.

<3-1> DPPH 라 거 [0092]

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 항산 질 공여 해 향 합 향 아[0093]

민 에 해 원 어 색 탈색 도 지 하여 항산 하 다. 실험에 양

항산 알 진 비타민 C 사 하 다.

상 실시 1 통해 본 리 (시료) 에탄 에 여 도가 0, 10, 50,[0094]

200μg/ml 도 량하여 96 웰 플 트에 각 시료 100μL씩 주 하고, 동시에 0.04mM DPPH 액 100μL

어 량 200μL가 도 하 다. 상 합액 37℃에 30 간 시킨 후 490nm에 도

하 다.

그 결과 도 3에 나타낸 같 , 본 리 도 DPPH 라 거 갖 다[0095]

사실 알 었다. 특 본 DPPH 라 거 양 비타민 C 처리 과

사한 나타났 , 통해 본 리 강 한 항산 가지 것 할

었다.

<3-2> 포 내 산 (ROS) 거 [0096]

본 리 포 내에 생하 산 (ROS) 거하 지 하 하여,[0097]

마우 식 포(RAW264.7 포)에 본 처리한 후, LPS 처리하여 식 포 내 ROS

하 , 포 내 산 DCFH-DA(2',7'-dichlorodihydrofluorescin diacetate) assay

하 다. DCFH-DA 포 내 산 과 하여 질 DCF(dichlorofluorescein) 만들어 내 것

시약 포 에 어 생하 함 포 내 산 할 다.

하게 마우 식 포(RAW264.7 포) 5.0×105에 본 다양한 도별 (0, 10, 50, 200μ[0098]

g/ml) 처리하여 양한 후, 1μg/ml 도 LPS 24시간 동안 처리하 다. 그 다 5μM DCFH-DA 첨가하

여 37℃에 30 동안 시 다. 상 과 거 포들 득하여 포 내 산 지

DCF 포 하여 하 다. 산 arbitrary unit 나타내었다.

그 결과 도 4에 나타낸 같 , 식 포에 LPS만 처리한 실험 ( 포 내 산 8.2[0099]

가)과 비 하여 본 리 처리한 실험 에 도 산 감

것 알 었다. 하게 본 리 10, 50, 200ug/ml 각각 처리한 실험 에 99.6%,

79.1% 25.6% 지 산 감 것 나타났다. 통해 본 리 LPS

극 식 포에 산 과 감 시 강 한 항산 가지 것 할 었

다. 참고 도 4에 Cont LPS 리 처리하지 않 처리 , 200 본 리

200ug/ml 처리한 후 LPS 처리하지 않 실험 미한다.

<실험 4>[0100]

본 리 항염 [0101]

상 실시 1 통해 본 리 항염 과 하 하여, 산 질 (NO) 생산[0102]

등록특허 10-1428873

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억 , iNOS COX-2 도 억 MMP-9 억 하 다.

<4-1> 산 질 (NO) 생산 억 [0103]

산 질 (NO) 한 포 내 염 매개 , 사 드라 과 하여 과산 아질산 [0104]

(peroxynitrite anion, ONOO-) 생산하 , 게 생산 과산 아질산 염 도하고 염,

양 염, 신 루 과 같 다양한 병리학 건 야 하 것 알 다. 라 산 질

(NO) 생산 억 통하여 염 억 할 다.

본 실험에 마우 식 포(RAW264.7 포)에 본 처리한 후, LPS 처리하여 아질산염[0105]

(산 질 지 ) 하 , 아질산염 지 내에 그리 시약 한 colorimetric

assay 하여 하 다. 산 질 (NO) 질 L-arginine L-citrulline과 산 질 변하 ,

빠 게 안 산 질 , 아질산염, 질산염 변한다. 그리 시약 아질산염과 학 하여 보라색

아 염 하고 것 산 질 도 하 에, 아 염 도 아질산염 도

하여 540 nm에 그 도 하여 할 다.

하게 마우 식 포(RAW264.7 포) 96 웰 플 트에 5.0×105 cells/well 주하여 양한 다 ,[0106]

본 리 도별(0, 10, 50, 200 ug/ml) 처리한 후, 1ug/ml 도 LPS 처리하여 37, 5%

CO2 큐 에 24시간 양하고, 산 질 (NO) 양 그리 시약 하 다. , 포 양액 100ul

6mg/ml 도 그리 시약 100ul 합하여 시킨 후, 아질산염(NO2-) 540 nm에 ELISA microplate

reader (Tecan, USA) 도 하 다. Sodium nitrite (NaNO2) 도 하여 곡 얻

후, NO 도 산 하 다.

그 결과 도 5에 나타낸 같 , 식 포에 LPS만 처리한 실험 (아질산염 함량 6.5 )과 비 하[0107]

여 본 리 처리한 실험 에 도 아질산염 감 것 알 었

다. 하게 본 리 10, 50, 200ug/ml 각각 처리한 실험 에 94.9%, 54.8%

25.7% 지 아질산염 감 것 나타났다. 통해 본 리 RAW264.7 식

포에 LPS에 해 도 산 질 (NO) 생 과 감 시 강 한 항염 가지 것 할

었다. 참고 도 4에 Cont LPS 리 처리하지 않 처리 , 200 본

리 200ug/ml 처리한 후 LPS 처리하지 않 실험 미한다.

<4-2> iNOS COX-2 도 억 [0108]

상 실시 <4-1>에 본 리 RAW264.7 식 포에 LPS에 해 도 산 질 (NO) 생[0109]

과 감 시킬 하 , 본 실험에 러한 NO 생 억 가 iNOS 도 억

통해 루어지 것 지 하 하여 웨 블랏 하 다. 한 본 실험에 리

염 매개 프 타 란 (prostaglandin) 합 하 COX-2 억 할 지 여

도 웨 블랏 통해 하 다.

iNOS inducible nitric oxide synthase 약어 도 NOS라고 리 , 병원균 포막 리포폴[0110]

리사 라 드 (lipopolysaccharide: LPS), IL-1, TNF-a 같 사 , 사 등 역 극 에 해

포가 에만 여러 포에 많 양 어 산 질 (NO) 생 도하고, 게 생 산

질 염 나 주 어 등에 하 것 알 다. 한 COX-2 내피 포

벽 하 평 근 포, 막하에 재하 포, 상피 포 등에 원암 하나 염 매

개 프 타 란 (prostaglandin) 합 하 , 아라키돈산 프 타 드 변 시

열, 피 , 상피 열, 염 여러 알러지 상 심 시키 것 알 다.

RAW264.7 포들 리 재(10, 50, 200ug/ml) 미 재 하에 24시간 동안 LPS(1ug/ml) 처[0111]

리하여 양한 후 차가운 산 식염 (PBS) 척하 다. 그 후 포들 20 mM HEPES (pH 7.9), 100

mM KCl, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% SDS, 1 mM PMSF, 1 ug/ml leupeptin and 1 1ug/ml pepstatin 포함하

해하 다. 역블 하여, 항-iNOS synthase(anti-iNOS; Transduction Laboratories,

Lexington, KY, USA), 항-cyclooxygenase-2 (anti-COX-2; Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA),

등록특허 10-1428873

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항- 타 엑틴 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 항체들 사 하 다.

그 결과 도 6에 나타낸 같 , 본 리 처리한 실험 에 iNOS 도 [0112]

억 것 알 었 , 특 리 처리 도가 50 200ug/ml 실험 에 , iNOS 도

가 억 것 나타났다. 라 통해 LPS 극 식 포에 NO 생산 억 iNOS

도 억 통해 루어지 것 할 었다. 한 본 리 처리한 실험 에 COX-

2 도 억 것 알 었다(상 iNOS 억 사 ).

라 통해 본 리 항염 iNOS COX-2 억 라 통하여 루[0113]

어지 것 할 었다.

<4-3> MMP 억 [0114]

포 질(extracellular matrix: ECM) 여러 가지 해하 한 역할 하 매트릭 탈 프[0115]

나아 (Matrix metalloproteinase: MMP) 염 , 신생 직 재 한다. MMPs

에 , 특 MMP-9 각질 포, 골 포, 산 , 식 포 같 다양한 포주에 92kDa

gelatinase B 타 IV 라겐에 특 하여 염 , 뇌 , 양생 같 질 에

한 역할 하 것 알 다.

본 실험에 리 MMP-2 MMP-9 에 미 향 알아보 해 그래피[0116]

(zymorgraphy) 실시하 다. 하게 RAW264.7 포들 본 리 재(10, 50,

200ug/ml) 미 재 하에 24시간 동안 LPS(1μg/ml) 처리하여 양한 후 산 액 하여 포

3 척하 다. 각각 실험 양 지 채취하여 포에 지 내 비 어진 MMP-2 MMP-9 단 질

하 다. 비한 포 해 (30μg 단 질)시료 standard laemmli acrylamide polymerization

mixture(8%)에 1mg/ml 라틴 첨가하여 만든 상에 비 원 건 하에 동하 다. 동 끝

난 detergent solution(2.5% Triton X-100) 15 간 씩 처리하여 상에 남아 SDS 거하

다. 그 후 substrate buffer(50mM Tris-HCl, 5mM CaCl2, NaN3) 37℃에 24시간 동안 시 다.

0.1% 마지 염색(Coomassie Brilliant Blue R-25 solution) 실시하여 MMP-2 MMP-9 하 다.

그 결과 도 7에 나타낸 같 , 본 리 처리한 실험 에 MMP2 라틴 해 [0117]

변 지 않 , MMP-9 라틴 해 억 것 알 었다. 통해 본 리

LPS 극 식 포에 MMP-9 특 하향 할 것 할 었다.

하, 본 본 리 함 하 , 에 , 클[0118]

린 등 시하고 한다. 그러나, 본 료 드시 상 에 한 것 아니다.

[ 1] 킨[0119]

하 같 함량 첨가하여 킨 통상 에 라 하 다.[0120]

리 - 2.0 량 %, 1,3- 틸 리 - 5.2 량 %, 알 - 1.5 량 %, 에탄 - 3.2 량[0121]

%, 폴리 트 20 - 3.2 량 %, 9 - 2.0 량 %, 복실비닐폴리 - 1.0 량 %, 리 린 -

3.5 량 %, 향 - 미량, - 미량, - 량 %

[ 2] 에[0122]

하 같 함량 첨가하여 에 통상 에 라 하 다.[0123]

리 - 2.0 량 %, 아릴 알 - 1.0 량 %, 리 릴 아 트 - 0.8 량 %, [0124]

비탄 아 트 - 0.3 량 %, 포 필 라 - 0.1 량 %, 폴리 트 60 - 1.0 량 %, 미 랄

- 5.0 량 %, 사 크 - 3.0 량 %, - 0.5 량 %, 알란 - 0.1 량 %, 리 린 - 5.0

량 %, 알 - 2 량 %, 프 필 리 - 3.0 량 %, 향 - 미량, - 미량, - 량 %

등록특허 10-1428873

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[ 3] 클린[0125]

하 같 함량 첨가하여 클린 통상 에 라 하 다.[0126]

리 - 2.0 량%, 알킬에 당산염 (30%) - 30.0 량%, 알킬에 포 신산염 (30%) - 20.0 량%,[0127]

알킬아미도 타 (30%) - 5.0 량%, 프 필 리 - 5.0 량%, 타 - 5.0 량%, 라우라미드 에 -

4.0 량%, 룰 검 - 0.05 량%, 가 해단 질 - 0.1 량%, 연산 - 미량, NaCl - 미량, 향 - 미량,

- 미량, - 량%

지 본 에 하여 그 람직한 실시 들 심 살펴보았다. 본 하 야에 통[0128]

상 지식 가진 본 본 본질 특 에 어나지 않 에 변 태

해할 것 다. 그러므 개시 실시 들 한 아니라 에 고

어야 한다. 본 한 아니라 특허청 에 나타나 , 그 동등한 내에

든 차 본 에 포함 것 해 어야 할 것 다.

도

도 1

등록특허 10-1428873

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도 2

도 3

등록특허 10-1428873

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도 4

도 5

등록특허 10-1428873

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도 6

도 7

등록특허 10-1428873

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