12 Ramiro Jover 4-3 - AEEHaeeh.es/wp-content/uploads/2018/03/12-Ramiro-Jover-4-3.pdfPatients Biopsy+ proven Approach UpJregulatedmiRNAs DownJregulated miRNAs Predict Reference 19CONT’/’34’NAFLD

microRNAs circulantes como biomarcadores diagnósticos en NAFLD/NASH

Ramiro JoverDep. Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Medicina. Universitat de València

Unidad Mixta en Hepatología Experimental. IIS Hospital La Fe. CIBERehd.

CURSO DE POSTGRADONuevos aspectos diagnósticos y terapéuticosen la enfermedad hepática crónica avanzada

43º Congreso anual AEEHMadrid, 21-23 Febrero 2018

RNA de interferencia -‐ Silenciamiento de la expresión génica

• El double-‐stranded RNA (dsRNA) es RNA con dos cadenas complementarias.

• El dsRNA constituye el material genético de algunos virus.

• También puede formarse dsRNA cuando el RNA de cadena simple se pliega y forma horquillas (stem-‐loops):

Los dsRNAs desencadenan un mecanismo de silenciamiento de la expresión génica.

La interferencia del RNA es un mecanismo para el silenciamiento génico que se inicia a partir de un dsRNA y termina con la degradación de un mRNAcomplementario

• En el citoplasma es fragmentado por la enzima Dicerpara generar un miRNA dúplex de ~22 nt.

• Sólo una de las dos cadenas del dúplex, la hebra guía o miRNAmaduro, se quedará en el complejo RISC.

• El componente activo del complejo RISC es una endonucleasa de la familia Argonauta (Ago).

Microprocessor

Biogénesis de microRNAs

• En nuestras células hay genes NO codifi-‐cantes que, cuando se transcriben, generan mRNAs con stem-‐loop(s) (pri-‐miRNA).

• Estos son procesados por un enzima nuclear llamado Drosha.

• El pre-‐miRNAresultante, más corto (la horquilla), es transportado al citoplasma por la exportina 5.

Dependiendo del tipo de proteína Ago que forma el complejo RISC los efectos desencadenados son distintos

Other interfering RNAs:

siRNAs come from exogenous dsRNAs (Exo-dsRNA;; viral infection) or endogenous dsRNA (Endo-dsRNA;; retrovirus or transposons). They are incorporated into the RISC complex mainly composed of Ago2.

piRNAs are different from miRNAs and siRNAs mainly because of their

origin and their maturation;; they are not processed by Dicer and are longer than miRNAs and siRNAs.

They are mainly present in germinal cells, and contribute to maintaining the genome integrity

targeting transposons.

Mechanisms of regulation of mRNA target translation by miRNA.

(A) Regulation by repression at translation initiation.

(B) Regulation by repression at translation post-initiation.

(C) Regulation by mRNA degradation.

Los miRNAs regulan los niveles de expresión de 2/3 de los

genes humanos

También encontramos miRNAs circulantes en cuerpos apoptóticos, asociados con Ago o en HDL.

miRNAs como biomarcadores

Los exosomas y las microvesículas contienen proteínas, mRNAs y miRNAs.

Estos viajan desde células donantes hasta receptoras, participando así en la comunicación intercelular.

miRNAs circulantes

• La biopsia hepática es actualmente el único método de diagnóstico capaz de discriminar entre NAFL y NASH.

• Pero es invasiva, cara, propensa al error de muestreo y asociada, en ocasiones, a complicaciones graves.

El NASH tiene una prevalencia entre los pacientes NAFLD del 59% (Younossi2018), y se asocia con riesgo de evolución a fibrosis, cirrosis y carcinoma hepatocelular, y aumento de la mortalidad relacionada con el hígado (Chalasani 2018; Goldberg 2017).

La identificación no invasiva de pacientes con NASH es un reto clínico muy relevante.

El NASH y la fibrosis avanzada están fuertemente implicadas en el pronóstico a largo plazo de los pacientes con NAFLD

Patients Biopsy proven

Approach Up-‐regulated miRNAs Down-‐regulated miRNAs Predict Reference

19 CONT / 34 NAFLD Yes RT-‐PCR -‐122, -‐34a, -‐16 NAFLNASH

Cermelli, 2011 #13

311 CONT / 92 NAFLD No RT-‐PCR -‐21, -‐34a, -‐122, -‐451 NAFLD Yamada, 2013 #12

90+80 CONT152+103 NAFLD Yes Illumina sequencing /

RT-‐PCR-‐122-‐5p, -‐1290, -‐27b-‐

3p, -‐192-‐5p NAFLD Tan, 2014 #10

20 CONT / 20 NAFLD Yes RT-‐PCR -‐181d, -‐99a, -‐197, -‐146b

NAFLDNASH

Celikbilek, 2014 #17

52 NAFLD Yes RT-‐PCR miR-‐122 -‐122 in severe steatosis

-‐122 in severe fibrosis

Fibrosis Miyaaki, 2014 #19

16+19 CONT16+30 NAFL16+47 NASH

Yes miRNAs PCR-‐based array(n=84) / RT-‐PCR

-‐122, -‐192, -‐375 in NASH

-‐122 in sever fibrosis

NASHFibrosis Pirola, 2015 #8


Yes RT-‐PCR -‐122, -‐192, -‐21 NASH Becker, 2015 #16

12 CONT / 25 NAFLD No RT-‐PCR miR-‐21 -‐21 NAFLD Sun, 2015 #21

37 CONT17 NAFL31 NASH

Yes RT-‐PCR -‐122, -‐192, -‐34a, -‐16NASHFibrosis Liu, 2016 #14

62 CONT18 NAFLD(40 twins)

NoOpenArray RT-‐PCR System (n=818) -‐122, -‐34a* -‐331-‐3p, -‐30c NAFLD Zarrinpar, 2016 #22

28 CONT / 36 NAFLD Yes RT-‐PCR -‐122, -‐34a NAFLDNASH /Fibrosis

Salvoza, 2016 #11

305 NAFLD (139 NAS>5) Yes RT-‐PCR miR-‐122 -‐122 NAFLD/ NASH Akuta, 2016 #32


Yes RT-‐PCR -‐122 NASH Auguet, 2016 #18

10 CONT / 43 NAFLD Yes RT-‐PCR -‐22, -‐29a, -‐663a NAFLD/ NASH Lopez-‐Riera, 2017 #1

Summary of clinical studies evaluating SERUM miRNAs as predictive biomarkers for NAFLD/NASH

microRNAs circulantes y diagnóstico en NAFLD/NASH : estudios previos

What are the new findings?

miR-‐122 (which constitutes more than 70% of the total liver miRNA pool), miR-‐192 and miR-‐375 were significantly elevated in NASH.

NASH patients showed a systematic down-‐regulation in the liver expression of those miRNAs that were upregulated in serum.

Combination score of miR-‐122, -‐192 and -‐21: AUROC: 0.81 / CI 95%:

0.725–0.888 / p: <0.001

NASH vs NAFL

Prediction: NASH

Non-‐invasive prediction of NAFLD severity:A comprehensive validation of previously postulated serum miRNA

biomarkers in a Spanish independent cohort.

López-‐Riera M, Conde I, Zaragoza A, Benlloch S, Jover R

Analysis of the 14 previous studies revealed a total of 18 miRNAs that were significantly altered in NAFLD patients à NASH and sever fibrosis groups.

Ø 5 miRNAs were present in more than 1 study:-‐122 (n=11), -‐34a (n=5), -‐192 (n=4), -‐21 (n=3) and -‐16 (n=2)

Ø 13 miRNAs were described in only 1 study:-‐197, -‐27b, -‐29a, -‐22, -‐331, -‐30c, -‐375, -‐181c, -‐146b, -‐451a, -‐663a, -‐99a, -‐1290

COHORT (N=81)NL (n=15)

NAFL (n=16)NASH (n=50)

SAF Activity (Ballooning+ Inflamm.) > 1 (n=50)

NAS > 4 (n=35)Fibrosis > 1 (n=28)

miR-25

miR-15a-5p

miR-16-5p

miR-451a

miR-21-5p

miR-122-5p

miR-197-3p

miR-27b-3p

miR-29a-3p

miR-192-5p

miR-663a

miR-22-3p

miR-34a-5p

miR-331-3p

miR-30c-5p

miR-375

miR-181c-5p

miR-146b-5p

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40

42

44

↓ ↑↑↑ ↑↑↑ ↓ ↓↓↓ ↓

PCR threshold cycle (Ct)

Niveles absolutos de miRNAs en suero (n=81)

Medida niveles expresión miRNAs en hígado

miR-192-5p

miR-122

miR-21-5p

miR-22-3p

miR-27b-3p

miR-146b-5p

miR-16-5p

miR-451a

miR-29a-3p

miR-375

miR-30c-5p

miR-181c-5p

miR-34a-5p

miR-197-3p

miR-331-3p

miR-663a

24

26

28

210

212

214

216

218

220Yang et al. Nat Commun 8:14421. 2017.

GEO: GSE76903

↑↑↑ ↑↑↑ ↓↓↓ ↓↓↓

Mean reads in 20 human livers

• 16 de los 18 miRNAs se detectaron fiablemente en suero. • La mayoría entre 28 y 37 ciclos (Ct -‐ qRT-‐PCR).• En la mayoría se observó concordancia entre niveles de

expresión en hígado y en suero.• Excepción: -‐16 y -‐451a, muy abundantes

en eritrocitos. -‐663a, no se expresa en hígado.

Only 6 of the 16 miRNAs analyzed were significantly different in NAFLD patients with SAF Activity >1.

Four of them were induced (-‐34a, -‐192, -‐27b and -‐122) and two were repressed (-‐197 and -‐30c)

miR-34a-5p

A 0-1 A 2-3-40

2

4

6

8

10161820

***

Normalized miRNA serum level miR-192-5p

A 0-1 A 2-3-40

2

4

6101214

**

Normalized miRNA serum level

miR-27b-3p

A 0-1 A 2-3-40123456

7**


A 0-1 A 2-3-40123456121416

*


miR-197-3p

A 0-1 A 2-3-40.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 **

Normalized miRNA serum level miR-30c-5p

A 0-1 A 2-3-40.0

0.5

1.0

1.5

2.0 *


NASH : SAF ACTIVITY

Only 6 of the 16 miRNAs analyzed were significantly different in NAFLD patients with NAS >4

Five of them were induced(-‐34a, -‐192, -‐27b, -‐122, and -‐22)and one was repressed (-‐16)

miR-34a-5p

NAS <5 NAS ≥50

2

4

6

8

121416

**


NAS <5 NAS ≥5012345681012

**


miR-27b-3p

NAS <5 NAS ≥501234567 **

Normalized miRNA serum level miR-122

NAS <5 NAS ≥50123456101214

*


miR-22-3p

NAS <5 NAS ≥50

1

2

3

4

*


NAS <5 NAS ≥50.0

0.5

1.0

1.5

2.0

*


NASH : NAS score

Only 6 of the 16 miRNAs analyzed were significantly different in NAFLD patients with Fibrosis >1

Three of them were induced (-‐34a, -‐192, and -‐27b) and three were repressed (-‐16, -‐197 and -‐30c )

miR-34a-5p

F 0-1 F 2-3-40

2

4

6

81012

*


F 0-1 F 2-3-40

1

2

3

4

58910

*


miR-27b-3p

F 0-1 F 2-3-40

1

2

3

4

5**


F 0-1 F 2-3-40.0

0.5

1.0

1.5

2.0

*


miR-197-3p

F 0-1 F 2-3-40.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5*

Normalized miRNA serum level miR-30c-5p

F 0-1 F 2-3-40.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5*


FIBROSIS in NAFLD

miR-192 miR-122 miR-27b miR-34a miR-22 miR-29a miR-21 miR-30c miR-197 miR-331 miR-146b miR-16 miR-451a

ALT 0,858 0,831 0,698 0,210 0,279 0,376 0,339 0,040 -0,039 -0,103 0,048 -0,151 -0,206

AST 0,727 0,680 0,670 0,350 0,302 0,345 0,280 -0,086 -0,077 -0,090 -0,009 -0,257 -0,235

Ferritin 0,305 0,331 0,351 0,285 0,214 0,136 0,227 -0,036 -0,012 0,016 0,138 -0,124 -0,109

Bilirrubin 0,252 0,313 0,252 0,164 0,125 0,223 0,196 0,133 0,190 -0,101 0,095 -0,117 -0,202

Transferrin sat.

0,153 0,208 0,196 0,171 0,135 0,157 0,183 0,115 0,099 -0,063 0,082 -0,046 -0,102

Albumin 0,164 0,192 0,194 0,147 0,201 0,049 -0,032 0,073 -0,020 0,019 0,110 -0,142 0,005

Prothrombin 0,270 0,216 0,215 -0,209 -0,207 0,231 0,263 0,009 0,205 -0,052 0,156 -0,046 -0,303

HDL 0,054 0,168 -0,019 -0,110 0,007 0,115 0,058 0,105 0,171 0,158 0,035 0,015 -0,070

Insulin 0,221 0,043 0,145 0,044 0,049 0,019 -0,012 0,033 -0,107 -0,121 -0,085 0,200 0,034

Glucose 0,103 0,006 0,191 0,211 0,175 0,115 0,040 -0,167 -0,121 -0,148 -0,235 0,035 -0,013

LDL 0,064 0,014 -0,031 -0,024 -0,025 -0,013 0,084 0,198 0,076 0,180 -0,052 -0,008 -0,081

Hb 0,129 0,174 0,113 0,136 0,109 0,058 -0,077 -0,127 -0,087 -0,199 -0,020 -0,095 0,008

TG 0,069 -0,053 0,091 0,145 0,084 -0,136 -0,094 0,094 -0,170 -0,028 -0,153 0,062 0,010

AP -0,112 -0,085 -0,077 0,110 0,017 0,068 0,003 -0,030 0,089 0,124 0,062 -0,231 -0,172

HbA1C 0,054 0,014 0,154 0,225 0,219 -0,009 -0,037 -0,227 -0,283 -0,082 -0,210 -0,195 -0,101

Platelets -0,178 -0,130 -0,180 -0,101 0,054 -0,115 -0,144 0,150 -0,027 0,204 -0,100 0,037 0,168

GGT 0,017 0,007 0,061 0,100 0,015 0,008 -0,092 -0,033 -0,126 0,000 -0,060 -0,200 -0,053

Chol 0,035 0,036 -0,084 -0,140 -0,119 -0,023 -0,022 0,068 0,126 0,098 -0,027 -0,182 -0,133

Los miRNAs que aumentan en el suero de pacientes con NAFLD severa correlacionan con las transaminasas AST y ALT

Ratios between increased and decreased serum miRNAs demonstrate more significant differences

miR-27b-3p

F 0-1 F 2-3-40

1

2

3

4

5

**Normalized miRNA serum level

miR-197-3p

F 0-1 F 2-3-40.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

*


miR-27b/197

F 0-1 F 2-3-40

2

4

6

8

10

12

14

***

Ratio of serum miRNAs

Diagnostic performance of circulating miRNAs: SAF-‐Activity 0-‐1 vs 2-‐4

SAF-‐Activity

miR-‐192/197 miR-‐27b/197 ASTAUC 0,77 0,76 0,76

Optimal cut-‐off 2,51 2,28 34Sensitivity 0,72 0,76 0,66Specificity 0,81 0,74 0,84

PPV 0,86 0,83 0,87NPV 0,64 0,66 0,61

miR-192/197

SAF 0-1 SAF 2-40.25

0.5

1

2

4

8

16

32

miRNA serum level

Diagnostic performance of circulating miRNAs. NAS <5 vs ≥5

NAS score

miR-‐192/197 miR-‐27b/197 ASTAUC 0,77 0,78 0,79

Optimal cut-‐off 2,51 3,09 34Sensitivity 0,80 0,69 0,74Specificity 0,70 0,78 0,74

PPV 0,67 0,71 0,68NPV 0,82 0,77 0,79

miR-27b/197

NAS <5 NAS ≥50.25

0.5

1

2

4

8

16

miRNA serum level

Diagnostic performance of circulating miRNAs: Fibrosis 0-‐1 vs 2-‐4

FIbrosis

miR-‐192/197 miR-‐27b/197 FIB-‐4AUC 0,78 0,82 0,82

Optimal cut-‐off 2,53 2,06 1,68Sensitivity 0,86 1,00 0,61Specificity 0,68 0,62 0,93

PPV 0,59 0,58 0,81NPV 0,90 1,00 0,82

miR-27b/197

F 0-1 F 2-3-40.25

0.5

1

2

4

8

16


miR-27b/197 + FIB-4

F 0-1 F 2-3-41

2

4

8

16

32


AUC 0,87Optimal cut-‐off 4,12

Sensitivity 0,93Specificity 0,77

Positive Likelihood Ratio 4,10Negative Likelihood Ratio 0,09Positive Predicitive Value 68%Negative Predicitive Value 95%

Accuracy 83%

La suma de miR-‐27b/197 + FIB-‐4 muestra una de las mejores exactitudes predictivas para la fibrosis severa en pacientes con NAFLD

CONCLUSIONES1. Los microRNAs son liberados al torrente circulatorio donde pueden ser

medidos como biomarcadores no invasivos. En el ser humano hay más de 1800 miRNAs.

2. Los 14 estudios previos de miRNAs circulantes y NAFLD son heterogéneos y discrepantes. El motivo principal: la preselección de los miRNAs a medir y la heterogeneidad en el diseño.

3. Se han postulado 18 miRNAs asociados con NAFLD avanzado (NASH y fibrosis severa). Sólo 5 miRNAs coinciden en más de un estudio: -‐122, -‐34a, -‐192, -‐21 y -‐16.

4. La validación de estos resultados en una cohorte independiente (HospLa Fe n=81) ha permitido confirmar tan sólo 6-‐7 de los 18 miRNAspostulados hasta la fecha: -‐122, -‐34a, -‐192, -‐27b, -‐22, -‐197 y -‐30c.

5. La capacidad de estos miRNAs para predecir NASH es buena, pero no mejor que la de algunos marcadores clínicos clásicos como la AST.

6. La capacidad de miRNAs (27b/197) para predecir fibrosis avanzada es excelente y en combinación con algoritmos previos (FIB4) demuestra una de las mejores exactitudes predictivas (necesita validación).

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