Processo Symbios The Knowledge of nature The Knowledge of nature Conceição Oliveira, IST, 22...

Processo SymbiosProcesso Symbios

““The Knowledge of natureThe Knowledge of nature””

Conceição Oliveira, IST, 22 Março de 2006Conceição Oliveira, IST, 22 Março de 2006

Objectivo

Prevenir a formação de TCA em cortiça

Abordagem Científica

Problema: Formação de 2,4,6-tricloroanisole na cortiça

Compilação e análise crítica do conhecimento científico e empírico reportado ao problema;

Enquadrar o problema no domínio dos processos biológicos da natureza.

Direccionar o foco de atenção, não para o composto em si, mas para os mecanismos que conduzem à sua formação na matriz cortiça;

Perspectivando uma solução de cariz preventivo

Abordagem Científica

De um modo abrangente,

A acção dos microorganismos é um facto incontornável no mundo que nos rodeia;

A sua acção revela-se não só necessária como essencial ao equilíbrio e manutenção dos ecossistemas;

Sendo uma organização biológica, os microrganismos necessitam de determinados nutrientes por forma a obter a energia necessário ao seu metabolismo celular;

Abordagem Científica

Especificamente na matriz cortiça,

A estabilização pós-cozedura é etapa de maior actividade microbiológica na matriz cortiça;

Os mecanismos, as espécies e as condições potenciadoras da formação de cloroanisóis na cortiça, encontram-se suficientemente estudadas;

Durante a estabilização pós-cozedura, a combinação de diversos factores potenciam a formação de cloroanisóis como produtos intermediários de reacções biológicas;

Abordagem Científica

Como inibir a formação de cloroanisóis em cortiça ?

Hipótese 1: Esterilização completa da cortiça, asseptização das instalações fabris e manuseamento da cortiça em condições de assepsia.

ou

Hipótese 2: Alteração das características do meio, possibilitando o desenvolvimento dos microorganismos “ benéficos” em condições controladas

Abordagem Metodológica

Hipótese 2: Alteração das características do meio-cortiça.

Como? Actuar directamente na etapa de cozedura da cortiça.

Enriquecimento da água com determinados aditivos, os quais, por difusão em meio aquoso fervente, irão fixar-se nas estruturas ricas em compostos lenhino-polissacáridos, nomeadamente paredes interiores dos canais lenticulares e raspa (ou costa) da cortiça.

Abordagem MetodológicaPlaneou-se experiencias a nível laboratorial, na fase decozedura:

Combinação de aditivos

Cozimento aditivado

Estabilização “forçada”

Análise de cloroanisóis

Aditivação eficaz?

sim

não

Escalonamento industrial

Resultados preliminares

Após várias combinações de aditivos… formulação X

Determinação de 2,4,6-TCA em cortiça

Obs: n.d. - não detectado; L.D.: 0,7 ng/l

Fracção Inferior Superior

Mato n.d. 2,6 ng/l

Cozedura normal e após ; estabilização “forçada”

31,0 ng/l 118,2 ng/l

Cozedura com aditivos X; estabilização “forçada”

n.d. 3,4 ng/l

Superior

Inferior

Costa

Barriga

Resultados preliminares

... (!?) ...repetição…

Determinação de 2,4,6-TCA em cortiça

Obs: n.d. - não detectado; L.D.: 0,7 ng/l

Fracção Inferior Superior

Mato n.d. 2,6 ng/l

Cozedura normal; estabilização “forçada”

12,2 ng/l 66,8 ng/l

Cozedura com aditivos X; estabilização “forçada”

n.d. n.d.

Superior

Inferior

Costa

Barriga

Resultados preliminares

Observação visual: Todos os provetes “aditivados” evidenciavam um acentuado desenvolvimento microbiano;

Forma de fixação, desenvolvimento e esporulação das espécies?

• Preparação de meios de cultura microbiológica (WLN) com e sem aditivos X;• Inoculação com espécies microbiológicas características da cortiça (espalhamento de solução de extracção de pedaços de cortiça);• Incubação durante 5 dias a 27ºC;• Seccionamento tangencial do meio de cultura; obtenção de perfis para análise de microscopia óptica.

Ilustração do corte:

Resultados preliminares

Perfis tangenciais dos meios de cultura sem aditivação: Observação por microscopia óptica

Resultados preliminares

Perfis tangenciais dos meios de cultura sem aditivação: Observação por microscopia óptica

Resultados preliminares

Perfis tangenciais dos meios de cultura com aditivação: Observação por microscopia óptica

Resultados preliminares

Perfis tangenciais dos meios de cultura com aditivação: Observação por microscopia óptica

Resultados preliminares

Com a adição da formulação X…

A actividade das espécies microbiológicas é marcadamente reduzida na matriz de suporte;

Manutenção das características cromáticas e morfológicas do meio de cultura, indiciando que o efeito degradativo da acção enzimática foi francamente reduzido;

Ausência de formas esporuladas no interior do meio de cultura.

Resultados preliminares

Com a adição da formulação X…

Efeito barreira: Inexistência de hifas em profusão no interior do meio de cultura, indiciando que os microorganismos (bolores) se deparam com um meio interno “pouco atractivo”.

Efeito simbiótico: Com a disponibilidade de nutrientes à superfície, os microorganismos tendem a fixar-se na interface, exibindo de forma “exuberante” a sua parte aérea visível (micélio exterior). Deste modo, a interface faculta um “terreno favorável” à disseminação dos microorganismos por dispersão superficial das suas formas esporuladas.

Acção imediata

Escalonamento industrial (scale-up) - Avaliar a eficácia da formulação X em condições reais de utilização

Processo Symbios

Scale-up industrial

Duas empresas rolheiras com processo industrial verticalizado:

Sercor – Sociedade Exportadora de Rolhas e Cortiça, S.A.

Norcor – Indústria de Cortiça, S.A.

Início da experiência: Agosto de 2004;

Lotes de cortiça de mato em processamento: campanha de 2003;

Experiências realizadas numa base comparativa, i.e.: processo Symbios vs processo Tradicional.

Scale-up industrial

Caracterização cortiça mato

Experiências unidade piloto - aferição da concentração de aditivos Symbios

Cozedura Tradicional (PT):Água limpa, fervura 1 ½ hora

2 cozeduras consecutivas1500 kg de cortiça /cozedura 12 000 litros de água

Cozedura Symbios (PS):Água limpa, fervura 1 ½ hora

4 cozeduras consecutivas1500 kg de cortiça/cozedura 12 000 litros de água

+ aditivos Symbios

Estabilização 2 a 4 semanasAvaliação

qualitativa

CTCOR

Fabricação

Acabamentos

Avaliação qualitativ

a

Empresas

Unidade piloto - ResultadosCozedura Symbios: Aumento notável da capacidade extractiva do meio de cozedura

0

10

20

30

40

50

60

70

SS

T (

mg

/L)

Ref. Conc 1 Conc 2 Conc 3 Conc 4

Concentração Symbios

Cozedura tradicional;água limpa

Cozedura Symbios;água limpa

Unidade piloto - ResultadosCozedura Symbios: Aumento de eficácia na extracção de compostos polifenólicos

0

50

100

150

200

250

Polife

nóis

(m

g/L)

Ref . Conc 1 Conc 2 Conc 3 Conc 4

Concentração Symbios

Cozedura tradicional;água limpa

Cozedura Symbios;água limpa

Unidade piloto - ResultadosCozedura Symbios: Aumento de eficácia na extracção de compostos polifenólicos

Cozedura tradicional;água limpa

Cozedura Symbios;água limpa

Cozedura Symbios;cozeduras consecutivas

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Polife

nóis

(m

g/L)

Concentração Symbios

Experiência industrial - ResultadosEstabilização pós cozedura: Tal como expectável, registou-se um elevado desenvolvimento micológico nas pranchas submetidas ao processo Symbios. Clara dominância de espécies dos géneros Monilia s.p. e Mucor s.p.

Experiência industrial - Resultados

Desenvolvimento microbiológico durante a estabilização pós cozedura:

Processo Tradicional vs Processo Symbios

Processo Tradicional

Processo Symbios

Experiência industrial - Resultados

Desenvolvimento microbiológico durante a estabilização pós cozedura:

Processo Tradicional vs Processo Symbios

Processo Tradicional

Experiência industrial - Resultados

Desenvolvimento microbiológico durante a estabilização pós cozedura:

Processo Tradicional vs Processo Symbios

Processo Symbios

Experiência industrial - ResultadosDesenvolvimento micológico durante a estabilização pós cozedura:Processo Tradicional (PT) vs Processo Symbios (PS)

Actividade de fungos filamentosos

Potencial de síntese da micotoxina OTA?

Determinação da Ocratoxina A (OTA) nas pranchas de cortiça pós-estabilização(Ensaios realizados pelo Centro de Engenharia Biológica da Universidade do Minho)

Restrições

regulamentares

Amostra OTA (gOTA/kg cortiça)

PT 0,376

PS 0,294

Experiência industrial - ResultadosDeterminação da Ocratoxina A (OTA) nas pranchas de cortiça pós-

estabilização(Ensaios realizados pelo Centro de Engenharia Biológica da Universidade do Minho)

Avaliação dos resultados:

Resultados idênticos entre as amostras PT e PS

Com base no limite proposto para o vinho de 2g/L (…) (…) assumindo que cada rolha pesa cerca de 3,5 g (…) (…) assumindo que toda a OTA de uma rolha passa para o vinho (!!!)

(…)

A concentração final no vinho seria de 0,0016 g/l

O que representa 0,08 % (!!!) do limite máximo admissível proposto para o vinho

Experiência industrial - Resultados

Determinação de 2,4,6-TCA (libertável) nas rabanadas de cortiça

Amostras PT (ng/l)

Costa 22,6 56,6 29,7 113,1

Costa

Amostras PS (ng/l)

Costa 2,4 4,8 9,7 5,4

Experiência industrial - Resultados

Determinação de 2,4,6-TCA (libertável) nas rabanadas de cortiça

Sub-costa

LD: 0,7 ng/l; LQ: 1,4 ng/l

Amostras PT (ng/l)

Sub -costa

1,8 4,1 3,1 2,8

Amostras PS (ng/l)

Sub -costa

n.d. n.d. n.q. n.d.

Experiência industrial - Resultados

Análise sensorial de rolhas lavadas:

Nas amostras procedentes de ambas as empresas verificou-se que:

A incidência de “mofo” nas referências PS é vestigiária (menor que 1/1000) e, quando ocorre, dá-se a níveis de intensidade “ligeiro”;

Nas amostras PT registou-se a ocorrência de “mofo” em 1 a 2% das rolhas analisadas, com níveis de intensidade “ligeiro” a “forte”;

“As amostras PS evidenciam um abaixamento notável da linha de base (i.e.: aumento da limpidez sensorial), quando comparadas com as referências PT”:

“As amostras PS evidenciam uma menor variabilidade da linha de base, quando comparadas com as referências PT”.

Experiência industrial - ResultadosAnálise sensorial de rolhas lavadas Simulador de contacto: água destilada/desodorizada(Nota: Amostras PT e PS de uma única empresa)

Amostras PT (ng/l)

Ausência de “mofo”

893

Detecção de “mofo”

12

Total de rolhas 905

Confirmação analítica

Quantificação de cloroanisóis “libertáveis” na rolha individual

29,1 ng /l4,0 ng/l8,9 ng/l 1,5 ng/l

28,4 ng /l 66,4 ng/l 5,0 ng/l 15,0 ng/l21,2 ng/l 9,7 ng /l 75,8 ng/l 6,2 ng/l

Limite de detecção sensorial em vinho: 4 ng/l

Taxa de incidência de “mofo” = 11/905 rolhas = 1,2%

2,4,6-TCA

Admitindo que a rolha cederia todo o TCA libertável (?!)

Experiência industrial - Resultados

Amostras PS (ng/l)

Ausência de “mofo”

1181

Detecção de “mofo”

3

Total de rolhas 1184

Confirmação analítica

Quantificação de cloroanisóis “libertáveis” na rolha individual

1,9 ng /l

1,6 ng/l

6,6 ng/l

Taxa de incidência de “mofo” = 1/1184 rolhas = 0,08% (!!!)

Análise sensorial de rolhas lavadas Simulador de contacto: água destilada/desodorizada(Nota: Amostras PT e PS de uma única empresa)

2,4,6-TCA

Limite de detecção sensorial em vinho: 4 ng/l

Admitindo que a rolha cederia todo o TCA libertável (?!)

Experiência industrial - Resultados

Determinação de 2,4,6-TCA (libertável) em triturados de aparas de broca; Tempo de stockagem das aparas: 2 meses

Amostras PT (ng/l)

83,5 55,8 217,7

Amostras PS (ng/l)

8,8 18,1 2,7

Experiência industrial - Resultados

Comportamento físico-mecânico das rolhas de cortiça: Massa volúmica; Compressão e Relaxação

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Fo

rça

de

re

lax

aç

ão

(d

aN

)

0

20

40

60

80

100

120

Fo

rça

de

co

mp

res

sã

o (

da

N)

PT1 PT2 PS1 PS2

Legenda:

0

50

100

150

200

250

Mas

sa v

olúm

ica

(kg/

m3)

Conclusões

O processo Symbios é um processo biológico, de cariz preventivo, que promove o desenvolvimento de microorganismos “benignos”, em detrimento de espécies com potencial de formação de metabolitos indesejados;

O processo Symbios promove a inibição da biosíntese de cloroanisóis durante a etapa de preparação da cortiça;

A cozedura Symbios assegura uma maior limpeza e extracção de matérias hidrossolúveis da cortiça (ex.: terras, polifenóis, etc.);

Conclusões

Com a obtenção de aparas “mais limpas” (física e organolépticamente), as vantagens do processo Symbios são repercutidas ao longo da cadeia de fabricação de rolhas técnicas;

O processo Symbios é inócuo e respeita as regulamentações comunitárias de materiais destinados a contacto com géneros alimentícios;

O processo Symbios não introduz quaisquer alterações às características físico-mecânicas da cortiça, salvaguardando a funcionalidade do produto - rolha de cortiça.

Condições p/ implementação

Implementação na fase da cozedura

Cumprimento do Código Internacional das práticas rolheiras: separação de calços e manchas amarela

Resultados optimizados com cortiça do mato

Processo SymbiosProcesso Symbios

““The Knowledge of natureThe Knowledge of nature””

Muito Obrigado pela Vossa AtençãoMuito Obrigado pela Vossa Atenção