- Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of...

Randall Jiménez Q. (PhD candidate)Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics,

Ulm University, Germany

Estudio del microbioma

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- Introducción general -

“Vivimos en la Era de la Microbiota”

Contenido

• Conceptos generales

• Microbioma en animales silvestres

• Proyecto microbioma en la rana Lithobates vibicarius

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Contenido

• Conceptos generales

• Microbioma en animales silvestres

• Proyecto microbioma en la rana Lithobates vibicarius

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Conceptos generales

• Secuenciación de nueva generación (NGS)

• Secuenciación del gen 16S• Gen 16S rRNA

• Metagenómica (Secuenciación por escopeta)

• Microbioma

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Conceptos generales

• Secuenciación de nueva generación (NGS)

• Secuenciación del gen 16S• Gen 16S rRNA

• Metagenómica (Secuenciación por Escopeta)

• Microbioma

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“NGS engloba todas las tecnologías destinadas a llevar a cabo la secuenciación

masiva a gran escala de cualquier ácido nucleico”

Secuenciación de nueva generación (NGS)

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Secuenciación de nueva generación (NGS)

• También llamada "secuenciación de alto rendimiento”, es una colección de técnicas

de secuenciación genética que mejoran el proceso de secuenciación original de

Sanger.

• Ejemplos: La secuenciación Illumina y la secuenciación Roche 454

• Estos modos de secuenciación de ADN y ARN utilizan procesos paralelos masivos

para trabajar de manera rápida, lo que permite obtener millones de secuencias de

ADN a una velocidad sin precedentes y a un bajo costo

• Está permitiendo logros científicos trascendentales (e.g., diagnóstico postnatal y

prenatal de enfermedades genéticas)

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Conceptos generales

• Secuenciación de nueva generación (NGS)

• Secuenciación del gen 16S• Gen 16S rRNA

• Metagenómica (Secuenciación por Escopeta)

• Microbioma

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Gen 16S ARN ribosomal (16S rRNA gene)

El gen 16S rRNA posee secciones altamente conservadas e hipervariables

El gen 16S rRNA es un componente de la subunidad

pequeña (SSU) de los ribosomas procarióticos (e.g.,

bacterias), así como las mitocondrias y los cloroplastos

Es la macromolécula más ampliamente utilizada en

estudios de filogenia y taxonomía bacterianas

• Existen 9 regiones hipervariabales en bacterias (V1 – V9)

• Regiones hipervariables permiten diferenciar-separar “especies” e inclusive conocer relaciones filogenéticas

9

• Existen cebadores (primers) universales para seleccionar áreas conservadas del

16S, haciendo posible amplificar el gen de una sola muestra que contiene miles de

especies diferentes de microorganismos

• La región conservada hace posible la amplificación universal con los cebadores

• La secuenciación de la región hipervariable permite discriminar entre organismos,

bacterias (16S) y hongos (18S, ITS)

Gen 16S ARN ribosomal (16S rRNA gene)

16S rRNA

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Gen 16S ARN ribosomal (16S rRNA gene)

Streptococcus Escherichia

© Illumina 11

• “Secuenciación por Amplicones”

• Método utilizado para identificar, clasificar y cuantificar microorganismos en muestrasbiológicas complejas:

• Muestras ambientales (suelo y agua de mar)

• Muestras de intestino (microbioma intestinal humano)

• Técnica que no precisa de cultivos para conocer la comunidad microbiana de una muestra

• La especificidad del gen 16S en algunas regiones variables hace posible la identificación de las bacterias a un nivel taxonómico informativo

Secuenciación del gen 16S

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Secuenciación del gen 16S

Amplicon sequence structure

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3120705/

Amplicón: Fragmento de ADN o ARN que es el producto de los eventos de amplificación o

replicación (PCR)

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Secuenciación del gen 16S

PASOS para la secuenciación del gen 16S:

Extracción de ADN

Preparación de librería

SecuenciaciónAnálisis

bioinformáticos

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Secuenciación del gen 16S

Swabs con muestra Preparación de muestras Secuenciación

© Illumina 15

Obtiene una imagen completa que microorganismos

se encuentran en el ambiente del estudio (e.g.,

intestino, piel, suelo, agua)

Bioinformática:

• Herramientas de bioinformática para procesamiento de secuencias genéticas 16S (Pipelines)

• Bases de datos de 16S rRNA (Blast para identificación y clasificación taxonómica de las

secuencias de ADN)

• Análisis estadísticos

Bioinformática - Secuenciación del gen 16S

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• Unidades de clasificación utilizadas para individualizar los objetos del estudio

• Unidad atómica de análisis / “especie”

• ASV han demostrado mejor sensibilidad y especificidad en relación al OTU

• Discriminan mejor los patrones ecológicos

17`https://www.nature.com/articles/ismej2017119 (2017)

Kueneman et al. (2013)

Bioinformática - Secuenciación del gen 16S

(OTU)

Unidad taxonómica operacional

(ASV)

Amplicon sequence variant

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867414008642 (Conducting a Microbiome Study) 18

Bioinformática - Secuenciación del gen 16S

• Generar perfiles microbianos

Ejm. QIIME en combinación con una base

de datos (SILVA) se usa para definir

unidades taxonómicas operacionales

(OTUs) y para asignar a cada OTU a

una entidad taxonómica en los diferentes

niveles taxonómicos

19

Bioinformática - Secuenciación del gen 16S

20

• α-Diversidad: Chao1, Shannon, Simpson, PD

• β-diversidad: Overview cualitativo o cuantitativo de la diversidad entre las muestras

obtenido a partir de una medida de análisis (Bray-Curtis, Unweigthed y Weighted UniFrac)

Bioinformática - Secuenciación del gen 16S

Conceptos generales

• Secuenciación de nueva generación (NGS)

• Secuenciación del gen 16S• Gen 16S rRNA

• Metagenómica (Secuenciación por Escopeta)

• Microbioma

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Secuenciación por Escopeta

• Hierarchical shotgun approach

• Se enfoca en el genoma completo y lecturas de secuencias aleatorias

• El ADN bacteriano aleatoriamente se fragmenta en pequeñas secciones

• Se necesitan muchas lecturas para cada segmento del ADN original para ensamblar la secuencia con precisión.

• Proceso de ensamble computacional es intensivo.

• Provee información para análisis funcional de los genes, e identificación de taxones bacterianos y abundancia relativa

• Generalmente se considera el método superior para caracterizar comunidades microbianas (.vs secuenciación por amplicones)

https://youtu.be/vg7Y5EeZsjk22

La Secuenciación por Escopeta es superada por la

Secuenciación por Amplicones?

• Secuenciación del gen 16S y Secuenciación por Escopeta dan resultados diferentes cuando

se aplican a comunidades microbianas poco estudiadas (vs. microbioma intestinal)

https://www.nature.com/articles/s41598-017-06665-3 (2017)

• Diversidad mucho menor

• Omitió phyla (50% menos) y familias (27% menos)Secuenciación por Escopeta

• Bajo rendimiento de la secuenciación shotgun se debe a la debilidad de la base de datos

utilizada en el estudio, en comparación con las bases de datos para el gen 16S rRNA.

“La disponibilidad de genomas para consultar es bastante

limitada para estos entornos únicos y remotos”

• Shotgun sequencing ventajas complementarias Funcionalidad

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Secuenciación por Amplicones vs. Secuenciación por Escopeta

Secuenciación

del gen 16S

• Se basa en una sola secuencia: la del

gen altamente conservado del ARNr 16S

bacteriano

• Identifica, clasifica y cuantifica la

microbiota de una muestra

• Se caracteriza por su alta velocidad y alta

precisión.

Secuenciación

por Escopeta

• Enfoque de genoma completo: Brinda

toda la información genética de la

comunidad microbiana

• Provee información funcional de los

genes

• Identifica, clasifica y cuantifica la

microbiota de una muestra

• Computacionalmente intensivo

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Conceptos generales

• Secuenciación de nueva generación (NGS)

• Secuenciación del gen 16S• Gen 16S rRNA

• Metagenómica (Secuenciación por Escopeta)

• Microbioma

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Microbioma

Comunidad de microorganismos con su material genético que

está presente en un ambiente particular

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¿Qué es el microbioma?

• Dominancia de grupos taxonómicos (phyla, orden, familia, género)

• Diversidad alfa

• Diversidad beta • Composición y estructura de la

comunidad microbiana

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Microbioma

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Microbioma en el ser humano

Segundo Genoma

Cuerpo humano tiene 10 veces más células

microbianas que células humanas

NIH Human Microbiome Project defines normal bacterial makeup of the body.

NIH News. 13 June 2012. (2008-2012)

29

Microbioma en el ser humano

Microbioma y su importancia funcional

Intestinal

• Mantener una buena salud

• Resistencia a enfermedades

• Adaptación y persistencia en el ambiente

30

https://www.nature.com/articles/nature11552

Microbioma y su importancia funcional

“A growing body of data, mostly from animals raised in sterile, germ-free conditions,

shows that microbes in the gut influence behaviour and can alter brain physiology and

neurochemistry.”31

Piel

• Regula procesos fisiológicos

• Regula respuesta inmune

• Previene colonización de patógenos

Microbioma y su importancia funcional

32

33

Disbiosis

• Alteración en la diversidad y composición del microbioma

• Desbalance en la comunidad de microorganismos

OcasionaDiscapacidades funcionales

Incremento en la susceptibilidad de infecciones

Desarrollo de

enfermedades

Turnbaugh et al. 2007; McKenna et al. 2008; Sommer & Bäckhed 2013; Lee & Hase 2014

34

Disbiosis

Contenido

• Conceptos generales

• Microbioma en animales silvestres

• Proyecto microbioma en la rana Lithobates vibicarius

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Redford et al. 2012; Bletz et al. 2013; Bahrndorff et al. 2016; Jimenez & Sommer 2016

Microbioma en animales silvestres

• Mantener una buena salud

• Resistencia a enfermedades

• Adaptación y persistencia en el ambiente

• Implicaciones en la conservación• Felinos, anfibios, monos, reptiles y

aves

36

37Jiménez & Sommer (2016)

Microbioma en animales silvestres

Microbioma en animales silvestres

38

“Gorillas exposed to persistent human

contact displayed unique microbiota

compositions, generally characterized

by an increased abundance of

Gammaproteobacteria and other taxa

usually associated with compromised

gut health.”

http://www.jcvi.org/cms/research/projects/gorilla-the-gastrointestinal-microbiota-

composition-and-function-of-free-range-wild-western-lowland-gorillas-gorilla-gorilla-

gorilla-mirrors-macro-ecological-patterns/overview/

39

Microbioma en animales silvestres

Procolobus gordonorum. “Gut microbiota α-diversity significantly higher in the

undisturbed forest. Functional analysis suggests that such variation may be

associated with food plant diversity in natural versus human-modified habitats.”

Barelli et al. 2015

40https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.02793/abstract

Microbioma en animales silvestres

Se encontró una microflora intestinal y genes

relacionados a enfermedades en pangolines

20 sp. bacterianas → + abundantes en sanos

7 sp. bacterianas → + abundantes en enfermos

Manis javanica

Microbioma en animales silvestres

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“Amphibian skin hosts one of the best-studied wildlife microbiotas

due to the role of these cutaneous microbial communities in

meditating defense against the lethal pathogen, Batrachochytrium

dendrobatidis (Bd) (Belden and Harris, 2007; Bletz et al., 2013;

Jiménez and Sommer, 2016)” citado por Bletz et al. (2017)

Microbioma en animales silvestres

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Microbioma en animales silvestres

Belden et al. (2015)

Abundancia relativa de bacterias presentes en la piel de ranas de Panamá y Virginia, USA.

Abundancia relativa de bacterias en la piel compartidas y únicas por especie de rana

Microbioma en animales silvestres

Rebollar et al. (2016)44

45

Microbioma en animales silvestres

Abundancia relativa de bacterias y microeukaryotes presentes en la piel de Colorado boreal toads (Anaxyrus boreas)

Kueneman et al. (2015)

Microbioma en animales silvestres

Aplicabilidad:

Terapias probióticas

(bioaugmentation)

46

47

Microbioma-Cortometraje-

Muchas gracias

48

• https://www.youtube.com/watch?v=1uZtCMY-yEw

• https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1198743X14610028

• https://www.youtube.com/watch?v=oLu6UdazPxM

• https://www.1010genome.com/shotgun-metagenomics/

• https://www.the-scientist.com/daily-news/shotgun-sequencing-outdone-by-amplicon-31113

• https://www.quora.com/Is-16s-rRNA-sequencing-a-sound-approach-to-studying-bacterial-communities

• https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.00466/full

Links

49

Bioinformática y análisis estadísticos para muestras de

secuenciación del gen 16S

50

Secuenciación por Escopeta

51

52

Microbioma en el ser humano