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Randall Jiménez Q. (PhD candidate)Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics,
Ulm University, Germany
Estudio del microbioma
1
- Introducción general -
“Vivimos en la Era de la Microbiota”
Contenido
• Conceptos generales
• Microbioma en animales silvestres
• Proyecto microbioma en la rana Lithobates vibicarius
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Contenido
• Conceptos generales
• Microbioma en animales silvestres
• Proyecto microbioma en la rana Lithobates vibicarius
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Conceptos generales
• Secuenciación de nueva generación (NGS)
• Secuenciación del gen 16S• Gen 16S rRNA
• Metagenómica (Secuenciación por escopeta)
• Microbioma
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Conceptos generales
• Secuenciación de nueva generación (NGS)
• Secuenciación del gen 16S• Gen 16S rRNA
• Metagenómica (Secuenciación por Escopeta)
• Microbioma
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“NGS engloba todas las tecnologías destinadas a llevar a cabo la secuenciación
masiva a gran escala de cualquier ácido nucleico”
Secuenciación de nueva generación (NGS)
6
Secuenciación de nueva generación (NGS)
• También llamada "secuenciación de alto rendimiento”, es una colección de técnicas
de secuenciación genética que mejoran el proceso de secuenciación original de
Sanger.
• Ejemplos: La secuenciación Illumina y la secuenciación Roche 454
• Estos modos de secuenciación de ADN y ARN utilizan procesos paralelos masivos
para trabajar de manera rápida, lo que permite obtener millones de secuencias de
ADN a una velocidad sin precedentes y a un bajo costo
• Está permitiendo logros científicos trascendentales (e.g., diagnóstico postnatal y
prenatal de enfermedades genéticas)
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Conceptos generales
• Secuenciación de nueva generación (NGS)
• Secuenciación del gen 16S• Gen 16S rRNA
• Metagenómica (Secuenciación por Escopeta)
• Microbioma
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Gen 16S ARN ribosomal (16S rRNA gene)
El gen 16S rRNA posee secciones altamente conservadas e hipervariables
El gen 16S rRNA es un componente de la subunidad
pequeña (SSU) de los ribosomas procarióticos (e.g.,
bacterias), así como las mitocondrias y los cloroplastos
Es la macromolécula más ampliamente utilizada en
estudios de filogenia y taxonomía bacterianas
• Existen 9 regiones hipervariabales en bacterias (V1 – V9)
• Regiones hipervariables permiten diferenciar-separar “especies” e inclusive conocer relaciones filogenéticas
9
• Existen cebadores (primers) universales para seleccionar áreas conservadas del
16S, haciendo posible amplificar el gen de una sola muestra que contiene miles de
especies diferentes de microorganismos
• La región conservada hace posible la amplificación universal con los cebadores
• La secuenciación de la región hipervariable permite discriminar entre organismos,
bacterias (16S) y hongos (18S, ITS)
Gen 16S ARN ribosomal (16S rRNA gene)
16S rRNA
10
Gen 16S ARN ribosomal (16S rRNA gene)
Streptococcus Escherichia
© Illumina 11
• “Secuenciación por Amplicones”
• Método utilizado para identificar, clasificar y cuantificar microorganismos en muestrasbiológicas complejas:
• Muestras ambientales (suelo y agua de mar)
• Muestras de intestino (microbioma intestinal humano)
• Técnica que no precisa de cultivos para conocer la comunidad microbiana de una muestra
• La especificidad del gen 16S en algunas regiones variables hace posible la identificación de las bacterias a un nivel taxonómico informativo
Secuenciación del gen 16S
12
Secuenciación del gen 16S
Amplicon sequence structure
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3120705/
Amplicón: Fragmento de ADN o ARN que es el producto de los eventos de amplificación o
replicación (PCR)
13
Secuenciación del gen 16S
PASOS para la secuenciación del gen 16S:
Extracción de ADN
Preparación de librería
SecuenciaciónAnálisis
bioinformáticos
14
Secuenciación del gen 16S
Swabs con muestra Preparación de muestras Secuenciación
© Illumina 15
Obtiene una imagen completa que microorganismos
se encuentran en el ambiente del estudio (e.g.,
intestino, piel, suelo, agua)
Bioinformática:
• Herramientas de bioinformática para procesamiento de secuencias genéticas 16S (Pipelines)
• Bases de datos de 16S rRNA (Blast para identificación y clasificación taxonómica de las
secuencias de ADN)
• Análisis estadísticos
Bioinformática - Secuenciación del gen 16S
16
• Unidades de clasificación utilizadas para individualizar los objetos del estudio
• Unidad atómica de análisis / “especie”
• ASV han demostrado mejor sensibilidad y especificidad en relación al OTU
• Discriminan mejor los patrones ecológicos
17`https://www.nature.com/articles/ismej2017119 (2017)
Kueneman et al. (2013)
Bioinformática - Secuenciación del gen 16S
(OTU)
Unidad taxonómica operacional
(ASV)
Amplicon sequence variant
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867414008642 (Conducting a Microbiome Study) 18
Bioinformática - Secuenciación del gen 16S
• Generar perfiles microbianos
Ejm. QIIME en combinación con una base
de datos (SILVA) se usa para definir
unidades taxonómicas operacionales
(OTUs) y para asignar a cada OTU a
una entidad taxonómica en los diferentes
niveles taxonómicos
19
Bioinformática - Secuenciación del gen 16S
20
• α-Diversidad: Chao1, Shannon, Simpson, PD
• β-diversidad: Overview cualitativo o cuantitativo de la diversidad entre las muestras
obtenido a partir de una medida de análisis (Bray-Curtis, Unweigthed y Weighted UniFrac)
Bioinformática - Secuenciación del gen 16S
Conceptos generales
• Secuenciación de nueva generación (NGS)
• Secuenciación del gen 16S• Gen 16S rRNA
• Metagenómica (Secuenciación por Escopeta)
• Microbioma
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Secuenciación por Escopeta
• Hierarchical shotgun approach
• Se enfoca en el genoma completo y lecturas de secuencias aleatorias
• El ADN bacteriano aleatoriamente se fragmenta en pequeñas secciones
• Se necesitan muchas lecturas para cada segmento del ADN original para ensamblar la secuencia con precisión.
• Proceso de ensamble computacional es intensivo.
• Provee información para análisis funcional de los genes, e identificación de taxones bacterianos y abundancia relativa
• Generalmente se considera el método superior para caracterizar comunidades microbianas (.vs secuenciación por amplicones)
https://youtu.be/vg7Y5EeZsjk22
La Secuenciación por Escopeta es superada por la
Secuenciación por Amplicones?
• Secuenciación del gen 16S y Secuenciación por Escopeta dan resultados diferentes cuando
se aplican a comunidades microbianas poco estudiadas (vs. microbioma intestinal)
https://www.nature.com/articles/s41598-017-06665-3 (2017)
• Diversidad mucho menor
• Omitió phyla (50% menos) y familias (27% menos)Secuenciación por Escopeta
• Bajo rendimiento de la secuenciación shotgun se debe a la debilidad de la base de datos
utilizada en el estudio, en comparación con las bases de datos para el gen 16S rRNA.
“La disponibilidad de genomas para consultar es bastante
limitada para estos entornos únicos y remotos”
• Shotgun sequencing ventajas complementarias Funcionalidad
23
Secuenciación por Amplicones vs. Secuenciación por Escopeta
Secuenciación
del gen 16S
• Se basa en una sola secuencia: la del
gen altamente conservado del ARNr 16S
bacteriano
• Identifica, clasifica y cuantifica la
microbiota de una muestra
• Se caracteriza por su alta velocidad y alta
precisión.
Secuenciación
por Escopeta
• Enfoque de genoma completo: Brinda
toda la información genética de la
comunidad microbiana
• Provee información funcional de los
genes
• Identifica, clasifica y cuantifica la
microbiota de una muestra
• Computacionalmente intensivo
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Conceptos generales
• Secuenciación de nueva generación (NGS)
• Secuenciación del gen 16S• Gen 16S rRNA
• Metagenómica (Secuenciación por Escopeta)
• Microbioma
25
Microbioma
Comunidad de microorganismos con su material genético que
está presente en un ambiente particular
26
¿Qué es el microbioma?
• Dominancia de grupos taxonómicos (phyla, orden, familia, género)
• Diversidad alfa
• Diversidad beta • Composición y estructura de la
comunidad microbiana
27
Microbioma
28
Microbioma en el ser humano
Segundo Genoma
Cuerpo humano tiene 10 veces más células
microbianas que células humanas
NIH Human Microbiome Project defines normal bacterial makeup of the body.
NIH News. 13 June 2012. (2008-2012)
29
Microbioma en el ser humano
Microbioma y su importancia funcional
Intestinal
• Mantener una buena salud
• Resistencia a enfermedades
• Adaptación y persistencia en el ambiente
30
https://www.nature.com/articles/nature11552
Microbioma y su importancia funcional
“A growing body of data, mostly from animals raised in sterile, germ-free conditions,
shows that microbes in the gut influence behaviour and can alter brain physiology and
neurochemistry.”31
Piel
• Regula procesos fisiológicos
• Regula respuesta inmune
• Previene colonización de patógenos
Microbioma y su importancia funcional
32
33
Disbiosis
• Alteración en la diversidad y composición del microbioma
• Desbalance en la comunidad de microorganismos
OcasionaDiscapacidades funcionales
Incremento en la susceptibilidad de infecciones
Desarrollo de
enfermedades
Turnbaugh et al. 2007; McKenna et al. 2008; Sommer & Bäckhed 2013; Lee & Hase 2014
34
Disbiosis
Contenido
• Conceptos generales
• Microbioma en animales silvestres
• Proyecto microbioma en la rana Lithobates vibicarius
35
Redford et al. 2012; Bletz et al. 2013; Bahrndorff et al. 2016; Jimenez & Sommer 2016
Microbioma en animales silvestres
• Mantener una buena salud
• Resistencia a enfermedades
• Adaptación y persistencia en el ambiente
• Implicaciones en la conservación• Felinos, anfibios, monos, reptiles y
aves
36
37Jiménez & Sommer (2016)
Microbioma en animales silvestres
Microbioma en animales silvestres
38
“Gorillas exposed to persistent human
contact displayed unique microbiota
compositions, generally characterized
by an increased abundance of
Gammaproteobacteria and other taxa
usually associated with compromised
gut health.”
http://www.jcvi.org/cms/research/projects/gorilla-the-gastrointestinal-microbiota-
composition-and-function-of-free-range-wild-western-lowland-gorillas-gorilla-gorilla-
gorilla-mirrors-macro-ecological-patterns/overview/
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Microbioma en animales silvestres
Procolobus gordonorum. “Gut microbiota α-diversity significantly higher in the
undisturbed forest. Functional analysis suggests that such variation may be
associated with food plant diversity in natural versus human-modified habitats.”
Barelli et al. 2015
40https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.02793/abstract
Microbioma en animales silvestres
Se encontró una microflora intestinal y genes
relacionados a enfermedades en pangolines
20 sp. bacterianas → + abundantes en sanos
7 sp. bacterianas → + abundantes en enfermos
Manis javanica
Microbioma en animales silvestres
41
“Amphibian skin hosts one of the best-studied wildlife microbiotas
due to the role of these cutaneous microbial communities in
meditating defense against the lethal pathogen, Batrachochytrium
dendrobatidis (Bd) (Belden and Harris, 2007; Bletz et al., 2013;
Jiménez and Sommer, 2016)” citado por Bletz et al. (2017)
Microbioma en animales silvestres
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Microbioma en animales silvestres
Belden et al. (2015)
Abundancia relativa de bacterias presentes en la piel de ranas de Panamá y Virginia, USA.
Abundancia relativa de bacterias en la piel compartidas y únicas por especie de rana
Microbioma en animales silvestres
Rebollar et al. (2016)44
45
Microbioma en animales silvestres
Abundancia relativa de bacterias y microeukaryotes presentes en la piel de Colorado boreal toads (Anaxyrus boreas)
Kueneman et al. (2015)
Microbioma en animales silvestres
Aplicabilidad:
Terapias probióticas
(bioaugmentation)
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47
Microbioma-Cortometraje-
Muchas gracias
48
• https://www.youtube.com/watch?v=1uZtCMY-yEw
• https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1198743X14610028
• https://www.youtube.com/watch?v=oLu6UdazPxM
• https://www.1010genome.com/shotgun-metagenomics/
• https://www.the-scientist.com/daily-news/shotgun-sequencing-outdone-by-amplicon-31113
• https://www.quora.com/Is-16s-rRNA-sequencing-a-sound-approach-to-studying-bacterial-communities
• https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.00466/full
Links
49
Bioinformática y análisis estadísticos para muestras de
secuenciación del gen 16S
50
Secuenciación por Escopeta
51
52
Microbioma en el ser humano