52
Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma 1 - Introducción general - “Vivimos en la Era de la Microbiota”

- Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

  • Upload
    others

  • View
    0

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Randall Jiménez Q. (PhD candidate)Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics,

Ulm University, Germany

Estudio del microbioma

1

- Introducción general -

“Vivimos en la Era de la Microbiota”

Page 2: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Contenido

• Conceptos generales

• Microbioma en animales silvestres

• Proyecto microbioma en la rana Lithobates vibicarius

2

Page 3: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Contenido

• Conceptos generales

• Microbioma en animales silvestres

• Proyecto microbioma en la rana Lithobates vibicarius

3

Page 4: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Conceptos generales

• Secuenciación de nueva generación (NGS)

• Secuenciación del gen 16S• Gen 16S rRNA

• Metagenómica (Secuenciación por escopeta)

• Microbioma

4

Page 5: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Conceptos generales

• Secuenciación de nueva generación (NGS)

• Secuenciación del gen 16S• Gen 16S rRNA

• Metagenómica (Secuenciación por Escopeta)

• Microbioma

5

Page 6: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

“NGS engloba todas las tecnologías destinadas a llevar a cabo la secuenciación

masiva a gran escala de cualquier ácido nucleico”

Secuenciación de nueva generación (NGS)

6

Page 7: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Secuenciación de nueva generación (NGS)

• También llamada "secuenciación de alto rendimiento”, es una colección de técnicas

de secuenciación genética que mejoran el proceso de secuenciación original de

Sanger.

• Ejemplos: La secuenciación Illumina y la secuenciación Roche 454

• Estos modos de secuenciación de ADN y ARN utilizan procesos paralelos masivos

para trabajar de manera rápida, lo que permite obtener millones de secuencias de

ADN a una velocidad sin precedentes y a un bajo costo

• Está permitiendo logros científicos trascendentales (e.g., diagnóstico postnatal y

prenatal de enfermedades genéticas)

7

Page 8: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Conceptos generales

• Secuenciación de nueva generación (NGS)

• Secuenciación del gen 16S• Gen 16S rRNA

• Metagenómica (Secuenciación por Escopeta)

• Microbioma

8

Page 9: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Gen 16S ARN ribosomal (16S rRNA gene)

El gen 16S rRNA posee secciones altamente conservadas e hipervariables

El gen 16S rRNA es un componente de la subunidad

pequeña (SSU) de los ribosomas procarióticos (e.g.,

bacterias), así como las mitocondrias y los cloroplastos

Es la macromolécula más ampliamente utilizada en

estudios de filogenia y taxonomía bacterianas

• Existen 9 regiones hipervariabales en bacterias (V1 – V9)

• Regiones hipervariables permiten diferenciar-separar “especies” e inclusive conocer relaciones filogenéticas

9

Page 10: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

• Existen cebadores (primers) universales para seleccionar áreas conservadas del

16S, haciendo posible amplificar el gen de una sola muestra que contiene miles de

especies diferentes de microorganismos

• La región conservada hace posible la amplificación universal con los cebadores

• La secuenciación de la región hipervariable permite discriminar entre organismos,

bacterias (16S) y hongos (18S, ITS)

Gen 16S ARN ribosomal (16S rRNA gene)

16S rRNA

10

Page 11: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Gen 16S ARN ribosomal (16S rRNA gene)

Streptococcus Escherichia

© Illumina 11

Page 12: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

• “Secuenciación por Amplicones”

• Método utilizado para identificar, clasificar y cuantificar microorganismos en muestrasbiológicas complejas:

• Muestras ambientales (suelo y agua de mar)

• Muestras de intestino (microbioma intestinal humano)

• Técnica que no precisa de cultivos para conocer la comunidad microbiana de una muestra

• La especificidad del gen 16S en algunas regiones variables hace posible la identificación de las bacterias a un nivel taxonómico informativo

Secuenciación del gen 16S

12

Page 13: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Secuenciación del gen 16S

Amplicon sequence structure

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3120705/

Amplicón: Fragmento de ADN o ARN que es el producto de los eventos de amplificación o

replicación (PCR)

13

Page 14: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Secuenciación del gen 16S

PASOS para la secuenciación del gen 16S:

Extracción de ADN

Preparación de librería

SecuenciaciónAnálisis

bioinformáticos

14

Page 15: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Secuenciación del gen 16S

Swabs con muestra Preparación de muestras Secuenciación

© Illumina 15

Obtiene una imagen completa que microorganismos

se encuentran en el ambiente del estudio (e.g.,

intestino, piel, suelo, agua)

Bioinformática:

Page 16: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

• Herramientas de bioinformática para procesamiento de secuencias genéticas 16S (Pipelines)

• Bases de datos de 16S rRNA (Blast para identificación y clasificación taxonómica de las

secuencias de ADN)

• Análisis estadísticos

Bioinformática - Secuenciación del gen 16S

16

Page 17: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

• Unidades de clasificación utilizadas para individualizar los objetos del estudio

• Unidad atómica de análisis / “especie”

• ASV han demostrado mejor sensibilidad y especificidad en relación al OTU

• Discriminan mejor los patrones ecológicos

17`https://www.nature.com/articles/ismej2017119 (2017)

Kueneman et al. (2013)

Bioinformática - Secuenciación del gen 16S

(OTU)

Unidad taxonómica operacional

(ASV)

Amplicon sequence variant

Page 18: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867414008642 (Conducting a Microbiome Study) 18

Bioinformática - Secuenciación del gen 16S

Page 19: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

• Generar perfiles microbianos

Ejm. QIIME en combinación con una base

de datos (SILVA) se usa para definir

unidades taxonómicas operacionales

(OTUs) y para asignar a cada OTU a

una entidad taxonómica en los diferentes

niveles taxonómicos

19

Bioinformática - Secuenciación del gen 16S

Page 20: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

20

• α-Diversidad: Chao1, Shannon, Simpson, PD

• β-diversidad: Overview cualitativo o cuantitativo de la diversidad entre las muestras

obtenido a partir de una medida de análisis (Bray-Curtis, Unweigthed y Weighted UniFrac)

Bioinformática - Secuenciación del gen 16S

Page 21: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Conceptos generales

• Secuenciación de nueva generación (NGS)

• Secuenciación del gen 16S• Gen 16S rRNA

• Metagenómica (Secuenciación por Escopeta)

• Microbioma

21

Page 22: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Secuenciación por Escopeta

• Hierarchical shotgun approach

• Se enfoca en el genoma completo y lecturas de secuencias aleatorias

• El ADN bacteriano aleatoriamente se fragmenta en pequeñas secciones

• Se necesitan muchas lecturas para cada segmento del ADN original para ensamblar la secuencia con precisión.

• Proceso de ensamble computacional es intensivo.

• Provee información para análisis funcional de los genes, e identificación de taxones bacterianos y abundancia relativa

• Generalmente se considera el método superior para caracterizar comunidades microbianas (.vs secuenciación por amplicones)

https://youtu.be/vg7Y5EeZsjk22

Page 23: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

La Secuenciación por Escopeta es superada por la

Secuenciación por Amplicones?

• Secuenciación del gen 16S y Secuenciación por Escopeta dan resultados diferentes cuando

se aplican a comunidades microbianas poco estudiadas (vs. microbioma intestinal)

https://www.nature.com/articles/s41598-017-06665-3 (2017)

• Diversidad mucho menor

• Omitió phyla (50% menos) y familias (27% menos)Secuenciación por Escopeta

• Bajo rendimiento de la secuenciación shotgun se debe a la debilidad de la base de datos

utilizada en el estudio, en comparación con las bases de datos para el gen 16S rRNA.

“La disponibilidad de genomas para consultar es bastante

limitada para estos entornos únicos y remotos”

• Shotgun sequencing ventajas complementarias Funcionalidad

23

Page 24: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Secuenciación por Amplicones vs. Secuenciación por Escopeta

Secuenciación

del gen 16S

• Se basa en una sola secuencia: la del

gen altamente conservado del ARNr 16S

bacteriano

• Identifica, clasifica y cuantifica la

microbiota de una muestra

• Se caracteriza por su alta velocidad y alta

precisión.

Secuenciación

por Escopeta

• Enfoque de genoma completo: Brinda

toda la información genética de la

comunidad microbiana

• Provee información funcional de los

genes

• Identifica, clasifica y cuantifica la

microbiota de una muestra

• Computacionalmente intensivo

24

Page 25: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Conceptos generales

• Secuenciación de nueva generación (NGS)

• Secuenciación del gen 16S• Gen 16S rRNA

• Metagenómica (Secuenciación por Escopeta)

• Microbioma

25

Page 26: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Microbioma

Comunidad de microorganismos con su material genético que

está presente en un ambiente particular

26

Page 27: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

¿Qué es el microbioma?

• Dominancia de grupos taxonómicos (phyla, orden, familia, género)

• Diversidad alfa

• Diversidad beta • Composición y estructura de la

comunidad microbiana

27

Microbioma

Page 28: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

28

Microbioma en el ser humano

Segundo Genoma

Cuerpo humano tiene 10 veces más células

microbianas que células humanas

NIH Human Microbiome Project defines normal bacterial makeup of the body.

NIH News. 13 June 2012. (2008-2012)

Page 29: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

29

Microbioma en el ser humano

Page 30: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Microbioma y su importancia funcional

Intestinal

• Mantener una buena salud

• Resistencia a enfermedades

• Adaptación y persistencia en el ambiente

30

https://www.nature.com/articles/nature11552

Page 31: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Microbioma y su importancia funcional

“A growing body of data, mostly from animals raised in sterile, germ-free conditions,

shows that microbes in the gut influence behaviour and can alter brain physiology and

neurochemistry.”31

Page 32: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Piel

• Regula procesos fisiológicos

• Regula respuesta inmune

• Previene colonización de patógenos

Microbioma y su importancia funcional

32

Page 33: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

33

Disbiosis

• Alteración en la diversidad y composición del microbioma

• Desbalance en la comunidad de microorganismos

OcasionaDiscapacidades funcionales

Incremento en la susceptibilidad de infecciones

Desarrollo de

enfermedades

Turnbaugh et al. 2007; McKenna et al. 2008; Sommer & Bäckhed 2013; Lee & Hase 2014

Page 34: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

34

Disbiosis

Page 35: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Contenido

• Conceptos generales

• Microbioma en animales silvestres

• Proyecto microbioma en la rana Lithobates vibicarius

35

Page 36: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Redford et al. 2012; Bletz et al. 2013; Bahrndorff et al. 2016; Jimenez & Sommer 2016

Microbioma en animales silvestres

• Mantener una buena salud

• Resistencia a enfermedades

• Adaptación y persistencia en el ambiente

• Implicaciones en la conservación• Felinos, anfibios, monos, reptiles y

aves

36

Page 37: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

37Jiménez & Sommer (2016)

Microbioma en animales silvestres

Page 38: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Microbioma en animales silvestres

38

“Gorillas exposed to persistent human

contact displayed unique microbiota

compositions, generally characterized

by an increased abundance of

Gammaproteobacteria and other taxa

usually associated with compromised

gut health.”

http://www.jcvi.org/cms/research/projects/gorilla-the-gastrointestinal-microbiota-

composition-and-function-of-free-range-wild-western-lowland-gorillas-gorilla-gorilla-

gorilla-mirrors-macro-ecological-patterns/overview/

Page 39: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

39

Microbioma en animales silvestres

Procolobus gordonorum. “Gut microbiota α-diversity significantly higher in the

undisturbed forest. Functional analysis suggests that such variation may be

associated with food plant diversity in natural versus human-modified habitats.”

Barelli et al. 2015

Page 40: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

40https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.02793/abstract

Microbioma en animales silvestres

Se encontró una microflora intestinal y genes

relacionados a enfermedades en pangolines

20 sp. bacterianas → + abundantes en sanos

7 sp. bacterianas → + abundantes en enfermos

Manis javanica

Page 41: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Microbioma en animales silvestres

41

Page 42: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

“Amphibian skin hosts one of the best-studied wildlife microbiotas

due to the role of these cutaneous microbial communities in

meditating defense against the lethal pathogen, Batrachochytrium

dendrobatidis (Bd) (Belden and Harris, 2007; Bletz et al., 2013;

Jiménez and Sommer, 2016)” citado por Bletz et al. (2017)

Microbioma en animales silvestres

42

Page 43: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

43

Microbioma en animales silvestres

Belden et al. (2015)

Abundancia relativa de bacterias presentes en la piel de ranas de Panamá y Virginia, USA.

Page 44: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Abundancia relativa de bacterias en la piel compartidas y únicas por especie de rana

Microbioma en animales silvestres

Rebollar et al. (2016)44

Page 45: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

45

Microbioma en animales silvestres

Abundancia relativa de bacterias y microeukaryotes presentes en la piel de Colorado boreal toads (Anaxyrus boreas)

Kueneman et al. (2015)

Page 46: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Microbioma en animales silvestres

Aplicabilidad:

Terapias probióticas

(bioaugmentation)

46

Page 47: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

47

Microbioma-Cortometraje-

Page 48: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Muchas gracias

48

Page 49: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

• https://www.youtube.com/watch?v=1uZtCMY-yEw

• https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1198743X14610028

• https://www.youtube.com/watch?v=oLu6UdazPxM

• https://www.1010genome.com/shotgun-metagenomics/

• https://www.the-scientist.com/daily-news/shotgun-sequencing-outdone-by-amplicon-31113

• https://www.quora.com/Is-16s-rRNA-sequencing-a-sound-approach-to-studying-bacterial-communities

• https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.00466/full

Links

49

Page 50: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Bioinformática y análisis estadísticos para muestras de

secuenciación del gen 16S

50

Page 51: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

Secuenciación por Escopeta

51

Page 52: - Introducción general · 2018-11-05 · Randall Jiménez Q. (PhD candidate) Institute of Evolutionary Ecology and Conservation Genomics, Ulm University, Germany Estudio del microbioma

52

Microbioma en el ser humano