CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA...

CARRERA DE ESPECIALIZACION EN

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyN-INTI

Materia de Articulación CEBI_E3

Cultivos Celulares

Docente: Erina Petrera

CEBI_E3_2 : Métodos de cultivo de células animales

EL SUSTRATO/SOPORTE

LA FASE GASEOSA

CONDICIONES FÍSICO-QUÍMICAS, NUTRICIONALES Y

FISIOLÓGICAS

LAS CONDICIONES DE CULTIVO

SOPORTE

CÉLULAS

COMPONENTES DE UN CULTIVO

EL SUSTRATO

• Brinda a las células, tejidos u órganos en cultivo el soporte físico

necesario para realizar sus reacciones metabólicas, desarrollar su

metabolismo y desarrollar sus procesos morfogénicos.

Vidrio

Plástico (poliestireno)

Microsoportes

Sustratos metálicos

Recipiente o soporte Superficies tratadas

‘Feeder layers’

Matrices tridimensionales

Interfases

Haces microcapilares permeables

Nuevos dispositivos (p. Ej. Opticell)

CULTIVOS ADHERIDOS A UN SOPORTE

POLICUBETAS PLACAS DE PETRI

Línea celular BHK-21 Línea celular MDCK

CÉLULAS FBHE CRECIDAS

DURANTE 5 DÍAS SOBRE

SOPORTE PLÁSTICO

DESNUDO

CÉLULAS FBHE CRECIDAS

DURANTE 5 DÍAS SOBRE

SOPORTE PLÁSTICO CON

COBERTURA DE COLÁGENO

Superficies cubiertas con sustancias que

favorecen el crecimiento celular

TITULACIÓN DE VIRUS EN POLICUBETAS CON COLORACIÓN FINAL

CULTIVOS EN SUSPENSIÓN

CULTIVOS EN SUSPENSIÓN

FRASCOS ESTÁTICOS

BOTELLAS RODANTES (ROLLERS)

CULTIVO EN MICROCARRIERS

BAJA DENSIDAD ALTA DENSIDAD

CULTIVOS EN MICROCARRIERS

SOPORTE

CÉLULAS

COMPONENTES DE UN CULTIVO

FASE GASEOSA

LA FASE GASEOSA

•La concentración de oxígeno necesaria

depende de los requisitos de las células

•La concentración de dióxido de carbono

depende de la capacidad buffer del medio de

Cultivo

•Usualmente el equilibrio dióxido de carbono (en la fase

gaseosa) - bicarbonato (en la fase líquida) actúa como buffer

del cultivo

LAS CONDICIONES DE CULTIVO

pH 7,4

Piruvato: aumenta el CO2 endógeno haciendo a la célula

independiente del CO2 externo

SOPORTE

CÉLULAS

COMPONENTES DE UN CULTIVO

FASE GASEOSA

MEDIOS DE

CULTIVO

CONDICIONES FÍSICO-QUÍMICAS, NUTRICIONALES Y

FISIOLÓGICAS DEL MEDIO DE CULTIVO

pH 7,4 fibroblastos normales 7,4- 7,7

células transformadas 7,0-7,4

células epidérmicas 5,5

Osmolaridad 260-320 mOsm/kg

Temperatura 37°C

Viscosidad

Tensión superficial

MEDIOS PARA EL CULTIVO DE CELULAS

1900-1932 ……extractos de tejidos, suero, plasma,

peptonas

1932……………importancia de los aminoácidos

1940……………plasma dializado + aminoácidos

1948……………medios definidos: V605

1950……………medios definidos: 199

1955……………medios definidos: Eagle (BEM; MEM)

MEDIOS: solución salina balanceada + nutrientes

Solución salina equilibrada

Aminoácidos esenciales

Vitaminas

Trazas de: Mg, Cu, Fe, Zn, etc.

Indicador de pH

Suero: aporta proteínas como fuente de nutrientes y

adhesión (fibronectina, fetuína)

inhibidores de proteasas

factores de crecimiento (EGF, FGF, PDGF)

hormonas (insulina, hormona de crecimiento)

Agua

COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE

CULTIVO

CaCl2 0,02 ------- 0,14

KCl 0,04 0,20 0,40

KH2PO4 ---------- 0,20 0,06

MgCl2 x 6 H20 ---------- --------- 0,10

MgSO4 x 7 H20 0,20 --------- 0,10

NaCl 6,68 8,00 8,00

NaHCO3 2,20 --------- 0,35

Na2HPO4 x 7 H2O ----------- 2,16 0,09

NaH2PO4 x H2O 0,14 -------- --------

D-Glucosa 1,00 -------- 1,00

Rojo Fenol 0,01 -------- 0,01

Soluciones salinas (g/l)

Earle Dulbecco Hanks

Solución salina equilibrada

Aminoácidos esenciales

Vitaminas

Trazas de: Mg, Cu, Fe, Zn, etc.

Indicador de pH

Suero: aporta proteínas como fuente de nutrientes y

adhesión (fibronectina, fetuína)

inhibidores de proteasas

factores de crecimiento (EGF, FGF, PDGF)

hormonas (insulina, hormona de crecimiento)

Agua Inhibidores de crecimiento de contaminantes

COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE

CULTIVO

Inhibidores del crecimiento de los contaminantes

Penicilina 100 UI/mL/ Estreptomicina 100 mg/mL

Penicilina 100 UI/mL/ Estreptomicina 100 mg/mL/ Fungizona

Gentamicina 50 mg/mL

Anfotericina B 2,5 mg/mL

CULTIVOS CERRADOS CULTIVOS ABIERTOS

MEM con sales Hanks MEM con sales Earle

NaHCO3 4mM 26mM

CO2 Atmosférico y producido 4-5%

por el cultivo

MEDIOS DE CULTIVO

INDICADOR DE pH

Rojo fenol

Amarillo

Rojo

CALIDAD DE AGUA PARA CULTIVO

Ósmosis reciclado continuo

reversa

Rec. Intermedio…..carbón.....deionización…… microfiltración

Destilador agua semi-pura agua ultra-pura

de vidrio

lavado de material medios de cultivo

ESTERILIZACÍÓN POR FILTRACIÓN

CON PRESIÓN NEGATIVA

Proteínas: nutrientes

adhesión (fibronectina)

inhibidores de proteasas

transportadores de minerales, ácidos grasos

Polipéptidos: factores de crecimiento: epitelial (EGF),

fibroblástico (FGF), plaquetas (PDGF)

Hormonas: insulina, hormona de crecimiento, hidrocortisona

Aminoácidos, glucosa, cetoácidos, Fe, Cu, Zn, Se, etc.

FACTORES NUTRITIVOS DEL SUERO

Esterilidad: sin crecimiento en caldos controles para bacterias

y hongos a temperatura ambiente y 37 °C.

Mycoplasma y virus: ausentes

Eficiencia de crecimiento: comparado con el crecimiento de

cultivos con suero control

Valor de pH (7,2-7,8)

Osmolaridad (290-310 mosm/l)

Contenido de endotoxina: menos de 2 ng/ml

Contenido de hemoglobina: menos de 20 mg %

Medios sin suero: Medio mínimo + factores de crecimiento y hormonas

Ej: para la línea HeLa: F12 + DMEM + insulina, transferrina, hidrocortisona

EGF, FGF

CONTROL DE CALIDAD DEL SUERO

¿CÓMO SE REALIZAN LOS

SUBCULTIVOS?

Objetivos:

i. Propagación de la línea celular

ii. Producción de células para la experimentación

Usualmente se realizan al llegar a confluencia.

Evitar que el medio de cultivo esté agotado.

CURVA DE CRECIMIENTO

Número de pasajes:

es el número de veces que un cultivo ha sido

subcultivado.

Número generacional:

es el número de veces que la población celular se

duplicó

ORGANIZACIÓN DE UN SUBCULTIVO

• El objetivo de un subcultivo (pasaje) es mantener las células en condiciones de replicación normal.

• En el subcultivo se renueva el medio de cultivo y se lleva la relación células/medio/superficie de soporte a la inicial.

• Las células adheridas a soportes sólidos deben ser primero despegadas de este soporte y separadas enzimáticamente (tripsina). Luego se resuspenden, se tiñen con colorante vital (Azul Tripán) y se cuentan en cámara de Neubauer.

• Si se parte de un cultivo de células en suspensión directamente se procede a contar las células.

• Una vez conocida la concentración de células en el

material de origen, se definen las condiciones del

subcultivo deseado y se realiza el pasaje.

– Ejemplo

• Material de origen: 2x106 cél/ml

• Destino: tres botellas de 175 cm2 con una

concentración inicial de 35000 cél/cm2

• Necesidad: 3 x 175 x 35000 = 1,8x107 células

• 1,8x107 células / 2x106 cél/ml = 9 ml (3 ml/botella)

ORGANIZACIÓN DE UN SUBCULTIVO

Monocapa crecida

a confluencia

Remoción del medio

Tripsina

Remoción de

tripsina

Redondeamiento

celular

Resuspensión en

medio

Re-siembra en

nueva botella

Diseminación

celular

FACTORES CRÍTICOS

• Temperatura de cultivo: depende del origen de las células.

Mamíferos: 37ºC, peces e insectos: 18 – 22ºC, aves: 38,5ºC,

etc.

• Contaminaciones: gran complicación en los laboratorios de

cultivos celulares, principalmente a escala industrial. Pueden

deberse a levaduras, hongos, virus, bacterias, Mycoplasma,

otras células, etc.

• Orden

• Limpieza

• Higiene personal

• Vigilancia microscópica

• Estudio adecuado de los problemas

• Análisis de problemas potenciales

• Trazabilidad de los cultivos

• Protocolización exhaustiva

FACTORES CRÍTICOS

NO BIOLÓGICOS

POR LO TANTO...

Los cultivos celulares pueden ser una

herramienta poderosa si se conducen

apropiadamente o una gran pérdida de

tiempo y dinero cuando se trabajan

desordenadamente