1 Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica...

1

Fundamentos de Espectrometría de Masa

Biológica

Matías Möller

Lab. Fisicoquímica BiológicaInstituto de Química BiológicaFacultad de CienciasUniversidad de la República

8 de mayo de 2014

2

Bibliografía recomendada:

Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed.

Cap. 15.

J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122.

Introduction to proteomics, Liebler, 2002.

Mass spectrometry in structural biology and biophysics, 2nd Ed, Kaltashov & Eyles, Cap.

3

3

1- Generalidades

2- MALDI-TOF

3- ESI-Q

4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS

Espectrometría de masa

4

1- Generalidades

Espectrometría de masa

5

Técnica que permite laseparación y determinación de

la relación masa/carga de iones gaseosos

Espectrometría de masa

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Espectrometría de masa

Espectrometría ≠ Espectroscopía(Medición de un rango) (implica absorción o

emisión de energía radiante)

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Espectrometría de masa

Determinación de masa y/o composición:

Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares

Polisacáridos, oligosacáridos

Lípidos Lipidoma

Fragmentos de ácidos nucleicos

Técnica muy sensible:puede analizar mg-ng (y menos) de material

Espectrometría de masa de Biomoléculas

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Espectrometría de masa

Determinación de masa y/o composición

Identificación por comparación con bases de datos

(peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos

Modificaciones postraduccionales

Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínasInteracción con compuestos de bajo PM

Plegamiento

Niveles de expresión/modificación posttraduccional

Espectrometría de masa de Proteínas

9

Gel 2D de hígado humano

http://ca.expasy.org/swiss-2dpage/

Masa (definiciones)

• Se determina m/z

• q = ±ze , e = 1.6022 x 10-19 coulomb

• z siempre es un integral positivo

10

Masa• Todas las moléculas tienen una composición química

única, pero presentan una heterogeneidad “física” debido a la presencia de isótopos (mismo número de protones pero diferente número de neutrones)

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C13

6 C14

6C12

6C6

12.011

12

Elemento Masa %1H 1.0078 99.9852H 2.0141 0.01512C 12.0000 98.9013C 13.0034 1.1014N 14.0031 99.63415N 15.0001 0.36616O 15.9949 99.76217O 16.9991 0.03818O 17.9992 0.20031P 30.9738 100.0032S 31.9721 95.0233S 32.9715 0.7534S 33.9679 4.2136S 35.9671 0.02

79Br 78.9183 50.6981Br 80.9163 49.31

Carlos Cerveñansky

Masa

• La fracción de isótopos “pesados” en elementos abundantes en moléculas biológicas (CHONP) no sobrepasan el 1%

• Sin embargo, en moléculas grandes, las contribuciones de los elementos pesados se vuelven importantes

13

• Ejemplo:

12C (98.9%) y 13C (1.1%)

En Buckminsterfullereno (C60)

La probabilidad que todos los átomos sean 12C:

P = (0.989)60 = 0.515

14

Masa

15

Masa

16

Masa

Masa: definiciones• Masa molecular se mide en unidades de masa

atómica unificadas (u)• u = m(12C) /12 = 1.6605402 × 10-27 kg

(u es equivalente a 1 g/mol, y a Da, también se usaba a.m.u., considerado ahora -2009- arcaico)

• Peso atómico: promedio por composición isotópica → Peso molecular

• Masa nominal: masa calculada con los isótopos más livianos, redondeado al entero

• Masa más abundante• Masa promedio 17

18

Carlos Cerveñansky

Masa: definiciones

19

Masa: definiciones

20

Una sola carga:Delta = 1.0 amu

Delta = 1.0 amu

520 521 522 523 524 525 526 527 528 5290

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

524.3

525.3

526.2

Delta = 1.0 amu

Determinación del número de cargas (z)

m/z

21

Dos cargas:Delta = 0.5 amu

Delta = 0.5 amu

258 259 260 261 262 263 264 265 266 2670

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

262.6

263.1

263.6

Delta = 0.5 amu

m/z

Determinación del número de cargas (z)

22

Espectrometría de masa de proteínas

37 kDa

37136 amu

23

Los Iones son importantes

Espectrometría de masa

[M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]-

De la unión de iones especialmente a moléculas quecontienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da)

[M+H]+ o [M-H]-

De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos,fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+)

En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones cambios en m/z:

[M]*+, [M]*- (oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)

24

Espectrometría de masa

M(péptido) = 1162 Da

Modo positivo Modo negativo

m = +1 +23 +39 -1

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Espectrómetro de masa

Espectrometría de masa

Entrada:Volatilización/

Ionización

AltoVacío

Analizadorde masas

Detector

Muestra

MALDIESI

TOFCuadrupolo

Tampa de IonesFTICR

OrbitrapSector Magnético

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¿Cómo volatilizar una proteína?

Espectrometría de masa

Premio Nobel de Química 2002

Fenn (1988)- ESI: Electrospray IonizationTanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization

Sin Premio:Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI(como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)

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Espectrómetros de masa

(configuraciones para grandes biomoléculas)

Espectrometría de masa

MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight

ESI-Q: ElectroSpray Ionization-Quadrupole

ESI-IT: ElectroSpray Ionization-Ion Trap

FT-MS: ESI-Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance

Orbitrap: ESI-orbitrap

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2- MALDI-TOF

Espectrometría de masa

29

Ionización por MALDI:

Espectrometría de masa

(Matrix assisted Laser desorption/ionization)(Desorción/Ionización por Laser Asistida por Matriz)

Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbeenergía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra:

30

Ionización por MALDI:

Espectrometría de masa

La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando la proteína cargada hacia la entrada del analizador.

El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H+.

Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante un campo eléctrico

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MALDI-TOF

Espectrometría de masa

Matriz: acidos aromaticos

32

Espectrometría de masa

4HCCA

DHBA

SA

33

MALDI-TOF

Espectrometría de masa

Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdoa su “tiempo de vuelo”(t).

t (m/z)1/2

las partículas con menor m/z llegan antes al detector

No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)

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MALDI-TOF

Espectrometría de masa

Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte unaenergía cinética:

Ek = zeEs

donde s es la distancia de la región de la fuente.

Fuente Detector

+

E+ -

s D

+

35

MALDI-TOF

Espectrometría de masa

Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo.

Ek = zeEs = ½mv2 v = (2zeEs/m)½

Fuente Detector

Fig. Separación por TOF

+ + +

E+ -

s D

+

Sin E, iones a la deriva

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MALDI-TOF

Espectrometría de masa

Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. Los iones con igual carga tienen la misma Ek,

v = (2zeEs/m)½

t = D/v = (m/2zeEs)½D

m/z = 2eEs(t/D)2

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MALDI-TOF

Espectrometría de masa

½mv2 = zeEs v = (2zeEs/m)½

t = D/v = (m/2zeEs)½D m/z = 2eEs(t/D)2

Fuente

Sin E, iones a la deriva

Detector

Fig. Separación por TOF

+ + +

E+ -

s D

+

38

Tubo de vuelo

Detector

4-25 kV

Espectrometría de masa

Carlos Cerveñansky

39

Tubo de vuelo

Detector

4-25 kV

Espectrometría de masa

Carlos Cerveñansky

Los iones con mayor m/z se mueven más lento, mayor t

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MALDI-TOF

Espectrometría de masa

Generalmente se observa la especie monocargada (M+H)+

41

MALDI-TOF

Espectrometría de masa

Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF

Se pueden distinguir proteinas en una mezcla por su MM

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MALDI-TOF

Espectrometría de masa

Se pueden estudiar masas en un amplio rango

43

1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0

Mass (m/z )

0

3222.3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

yVoyager Spec #1=>BC=>RSM10000=>MC=>MC=>MC[BP = 1672.8, 3222]

1672.917

Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM)

1672.92

1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0

Mass (m/z )

0

1.6E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = 1672.9, 16255]

1672.918

Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM)

Resolución en MALDI-TOF

Carlos Cerveñansky

44

3- ESI-MS

Espectrometría de masa

N2

45

ESI

Espectrometría de masa

ElectroSpray Ionization

Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2

(gas secante).

El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray)

N2

46

ESI

Espectrometría de masa

ElectroSpray Ionization

Por acción del gas secante y del vacío, el solvente se va evaporando y generando gotas más pequeñas muy cargadas que estallan para formar gotas aún más pequeñas hasta que quedan sólo proteínas cargadas que son dirigidas hacia el analizador

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ESI-Q

Espectrometría de masa

Al analizador de masas de Cuadrupolo (Q) se le llama “Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones deun pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados.

Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de electrodos del filtro de masas

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ESI-Q

Espectrometría de masa

Variando las señales eléctricas del cuadrupolo es posible variar la m/z que tiene trayectoria estable y realizar un barrido espectral

Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, pero no tienen muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000

49

Espectrometría de masa

Trampa de iones

Analizador de masas muy utilizado con ESI, atrapa los iones mediante voltajes oscilantes en los electrodos, enfocando los iones en el centro de una “caja”.

50

ESI-MS

Espectrometría de masa

La ionización de proteínas por ESI generar iones con diferente número de cargas, por adición de diferente número de protones

m/z = (M+n)/n

Donde n es el número de protones (masa = 1.0078 u, ~ 1)

ESI y carga

Substance P

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300

Da/e0

100

%

674.7

666.1600.4462.8

685.7

693.6 1347.7

[M+2H]2 +

[M+H] +

52

ESI-MS

Espectrometría de masa

Deconvolución del espectro

FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

10+9+

11+

13+

12+

14+

10+9+

11+

53

ESI-MS

Espectrometría de masa

Deconvolución del espectro

FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

10+9+

11+

13+

12+

14+

10+9+

11+

54

ESI-MS

Espectrometría de masa

Deconvolución del espectro

x1 = (M+n)/n x2 = (M+n+1)/(n+1) n = (x2-1)/(x1-x2)

n = (1084.1-1) / 72.1 = 15M = (1156.2 x 15) -15 = 17328

n+

(n+1)+

55

ESI-MS

Espectrometría de masa

Deconvolución del espectro

Mioglobina de caballo

56

ESI-MS

Espectrometría de masa

Deconvolución del espectro

Bajo PM

Alto PM

57

ESI-MS

Espectrometría de masa

Resolución de varias especies

58

Espectrometría de masa

Comparación ESI-MS y MALDI-TOF

Cyt C

59

Comparación

Espectrometría de masa

MALDI-TOF ESI-(Q3 o IT)Cargas/ion Pocas, en general

1Muchas

Rango de m/z 50000 3000

Rango de masas

200.000 70.000

Interacciones no covalentes

No Si

MS/MS limitado, PSD Si, CID

Acoplar LC No Si

Tolerancia a contaminantes

Si No

60

Conclusión

Espectrometría de masa

Permite determinar la masa molecular con muy alta resolución

La espectrometría de masa es la técnica de elección para determinar la masa molecular de proteínas

Continuará…

61

62

Seroalbúmina humana

+45

+44

+47+46

+49+48

+51+50

+52+54+53

+56+55

Lucía Turell

63

66300 66400 66500 66600

0

2x106

4x106

6x106

8x106

66469

66453

Inte

nsid

ad r

elat

iva

Masa (Da)

66437

Seroalbúmina humana

Lucía Turell