FUNDAMENTOS DE ESPECTROMETRA ULTRAVIOLETA-VISIBLE Y CURVAS DE CALIBRADO

instituto tecnolgico de la pazFUNDAMENTOS DE ESPECTROMETRA ULTRAVIOLETA-VISIBLE Y CURVAS DE CALIBRADOTcnicas Bsicas Experimentales

Alumnas:Arciga Plascencia MarisolCalixto Heredia Lidda Mariam

Ingeniera BioqumicaProfesor: M.D. Francisco Nieto NavarroLa Paz, Baja California Sur a 06 de Mayo del 2015

1. INTRODUCCIN

La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que nos permite determinar la concentracin de un compuesto presente en una solucin, como la cantidad de protenas. Est basada en que las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentracin. La relacin entre la absorbancia de la muestra y su concentracin puede representarse grficamente en lo que denominamos Curva de calibracin, que son construidas para, mediante interpolacin, poder obtener la concentracin de muestras problemas que se adapten a la curva. Para hacer este tipo de anlisis se emplea un espectrofotmetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma [1]. 2. 2. ESPECTROMETRA ULTRAVIOLETA-VISIBLE

2.1 El espectro electromagntico

La radiacin ultravioleta (UV) y visible comprende slo una pequea parte del espectro electromagntico, que incluye otras formas de radiacin como radio, infrarrojo (IR), csmica y rayos X (Ilustracin 1). La regin UV del espectro electromagntico se encuentra entre 0.6 y 380 nm y la regin visible, se localiza entre los 380 y 780 nm[2].

El fundamento de la espectroscopa se debe a la capacidad de las molculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV- visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molcula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atmica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza inica, constante dielctrica), por lo que dicha tcnica constituye un valioso instrumento para la determinacin y caracterizacin de biomolculas [1].

La energa asociada con la radiacin electromagntica se define por la siguiente ecuacin:

E = h

Donde E es la energa (en julios), h es la constante de Planck (6.62 10-34 Js) y es la frecuencia (en segundos) [2].

2.2 Fenmenos de interaccin entre luz y materia: Origen de los espectros UV-Visible

Cuando la radiacin interacciona con la materia, pueden ocurrir varios procesos como reflexin, dispersin, absorbancia, fluorescencia/fosforescencia (absorcin y reemisin) y una reaccin fotoqumica (absorbancia y rotura de enlaces). En general, cuando se miden espectros UV-visible, slo es deseable que ocurra absorbancia[2].

2.2.1 Fenmeno de absorcinLas molculas pueden absorber energa luminosa y almacenarla en forma de energa interna. Cuando la luz es absorbida por una molcula se origina un salto desde un estado energtico basal o fundamenta, a un estado de mayor energa o excitacin. Slo se absorbe la energa que permita el salto al estado excitado. Cada molcula tiene una serie de estados excitados que la distingue del resto de molculas. Como consecuencia, la absorcin que a distintas longitudes de onda presenta una molcula (espectro de absorcin), constituye una sea de identidad de la misma. Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia estudiada absorbe la mayor cantidad de luz[3].

2.2.1 Fenmeno de emisin

Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental produciendo la emisin de energa radiante. Fenmeno en el que se basa la fluorescencia.

2.3 Longitud de onda y frecuencia

La radiacin electromagntica puede considerarse una combinacin de campos elctricos y magnticos alternos que viajan por el espacio con un movimiento de onda. Como la radiacin acta como una onda, puede clasificarse segn la longitud de sta o la frecuencia, relacionadas por:

= c

Donde es la frecuencia (en segundos), c es la velocidad de la luz (3 108 ms-1) y es la longitud de onda (en metros). En espectroscopa UV-visible, la longitud de onda normalmente se expresa en nanmetros (1 nm = 10-9 m). En espectroscopa UV-visible, la luz UV de longitud de onda ms pequea tiene la energa ms alta. En algunos casos, esta energa es suficiente para causar reacciones fotoqumicas no deseadas al medir los espectros (recuerde, es el componente UV de la luz el que causa las quemaduras solares) [4].

2.4 Transmitancia y Absorbancia

Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide perpendicularmente sobre una disolucin de un compuesto qumico que absorbe luz o cromforo, el compuesto absorber una parte de la radiacin incidente (Ia) y dejar pasar el resto (It), de forma que se cumple[2]:

Io = Ia + It

2.4.1 TransmitanciaEs la relacin entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz que incidi sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: x100

La Transmitancia nos da una medida fsica de la relacin de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relacin entre %T y la concentracin no es lineal, pero asume una relacin logartmica inversa [1].

2.4.2 Absorbancia

Es un concepto ms relacionado con la muestra, puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en consecuencia:

A = log 1/T = -log T = -log It/ Io.

Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0. La cantidad de luz absorbida depender de la distancia que atraviesa la luz a travs de la solucin del cromforo y de la concentracin de ste.

Para la mayora de las aplicaciones se utilizan valores de absorbancia, ya que la relacin entre sta y tanto la concentracin como el paso ptico es como ya se mencion, normalmente lineal [2].

A diferencia de la transmitancia, la absorbancia de una solucin aumenta a medida que aumenta la atenuacin del haz de luz [6].

2.5 Leyes de Absorcin

De manera independiente, Pierre Bougueren 1729 y Johann Heinrich Lamberten 1760 establecieron unarelacin empricaque relaciona laabsorcindeluzcon las propiedades del material atravesado[1,5].T= I/Io = e kbDonde Io es la intensidad incidente, I es la intensidad transmitida, e es la base de los logaritmos naturales, k es una constante y b es el paso ptico (normalmente en centmetros).La ley de Beer es idntica a la ley de Bouguer y Lambert, excepto porque est expresada en trminos de la concentracin. La cantidad de luz absorbida es proporcional al nmero de molculas absorbentes por las que pasa la luz[4,5].Combinando las dos leyes se obtiene la ley Beer-Bouguer-Lambert:T= I/Io = e kbcDonde c es la concentracin de las especies absorbentes (normalmente expresada en gramos por litro o miligramos por litro). Esta ecuacin puede transformarse en una expresin lineal tomando el logaritmo y, normalmente, se expresa en la forma decdica:A = log T = - log (I/Io) = log (I0/I) = bcDonde es la absorcin molar o coeficiente de extincin. El coeficiente de extincin () es caracterstico de una sustancia en condiciones definidas de longitud de onda, disolvente y temperatura [1,2,4,5].2.6 InstrumentacinLa medicin de absorbancia de la luz por las molculas se realiza en unos aparatos llamados espectrofotmetros. Aunque pueden variar en diseo, en especial con la incorporacin de ordenadores para el anlisis de datos, todos los espectrofotmetros constan, segn se indica en la figura, de [2]:Una fuente de energa radiante: lmpara de deuterio.Un monocromador para la seleccin de radiaciones de una determinada longitud de onda: filtros, prismas, redes de difraccin.Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que contenga la muestra. Pueden ser de vidrio, cuarzo o plstico transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o slice fundido, porque el vidrio no transmite la radiacin UV.Un detector de luz y un amplificador convertidor de las seales luminosas en seales elctricas.Un registrador o sistema de lectura de datos.

Ilustracin 2. Espectrofotmetro convencional

3. Construccin de curvas de calibracinUn procedimiento analtico muy utilizado en anlisis cuantitativo es el llamado de calibracin que implica la construccin de una curva de calibracin. Se trata de una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una sustancia que se utiliza para determinar la cantidad de esta sustancia presente en una muestra incgnita. Una curva de calibracin es la representacin grfica de una seal que se mide en funcin de la concentracin de un analito. La calibracin incluye la seleccin de un modelo para estimar los parmetros que permitan determinar la linealidad de esa curva, y en consecuencia, la capacidad de un mtodo analtico para obtener resultados que sean directamente proporcionales a la concentracin de un compuesto en una muestra, dentro de un determinado intervalo de trabajo. En el procedimiento se compara una propiedad del analito con la de estndares de concentracin conocida del mismo analito (o de algn otro con propiedades muy similares a ste). Para realizar la comparacin se requiere utilizar mtodos y equipos apropiados para la resolucin del problema de acuerdo al analito que se desee determinar.La etapa de calibracin analtica se realiza mediante un modelo de lnea recta que consiste en encontrar la recta de calibrado que mejor ajuste a una serie de n puntos experimentales, donde cada punto se encuentra definido por una variable x(variable independiente, generalmente concentracin del analito de inters) y una variable y (variable dependiente, generalmente respuesta instrumental). La recta de calibrado se encuentra definida por una ordenada al origen (b) y una pendiente (m), mediante la ecuacin .A partir de la curva de calibracin (conjunto de concentraciones que describen el intervalo en el cual se deber cuantificar el compuesto por analizar) y a fin de asegurar que la recta encontrada con los puntos experimentales se ajuste correctamente al modelo matemtico de la ecuacin se calculan los valores de la ordenada al origen, la pendiente y el coeficiente de determinacin ().Por tener una buena exactitud y confiabilidad estadstica, el mtodo ms empleado para encontrar los parmetros de la curva de calibrado es el mtodo de los mnimos cuadrados Este mtodo busca la recta del calibrado que haga que la suma de los cuadrados de las distancias verticales entre cada punto experimental y la recta de calibrado sea mnima o tienda a cero. A la distancia vertical entre cada punto experimental y la recta de calibrado se le conoce como residual. En forma grfica se representa como:

Ilustracin 4. Curva de calibracin con n= 5En la prctica para construir la curva de calibracin se utilizan disoluciones que contienen concentraciones conocidas de analito, llamadas disoluciones patrn o estndar. Los estndares o disoluciones patrn para construir la recta de calibrado deben ser preparadas en forma independiente, a partir de una o varias soluciones madre; el nmero de puntos a escoger depender del uso que se d a la recta de calibrado. Si bien con dos puntos se puede construir una curva, estadsticamente se requieren por los menos tres para que la curva sea confiable; este nmero se suele aplicar a mtodos de rutina perfectamente establecidos y validados (proceso por el cual se demuestra, por estudios de laboratorio, que la capacidad del mtodo satisface los requisitos para la aplicacin analtica deseada).Sin embargo, si el mtodo est en una etapa de desarrollo, el nmero de puntos mnimo ser de cinco o seis para que la variabilidad sea mnima y el intervalo lineal sea suficiente. Hay que considerar que un aumento en el nmero de puntos experimentales implicara mayor fiabilidad en la recta de calibrado. La verificacin del comportamiento de un analito mediante una curva de calibracin requiere un mnimo de cinco puntos para un intervalo de confianza del 95 % y de ocho puntos para uno del 99 %.Cabe mencionar que en la prctica es muy importante efectuar la medida del blanco. Se llaman disoluciones blanco o simplemente blancos a las disoluciones que contienen todos los reactivos y disolventes usados en el anlisis, pero sin el analito. Los blancos miden la respuesta del procedimiento analtico a las impurezas o especies interferentes que existan en los reactivos o, simplemente, a las especiales caractersticas del instrumento de medida.

La medida de la seal del blanco puede realizarse: a) registrando directamente la seal del blanco e incluir este punto experimental en la recta de calibrado con x=0 como seal del blanco; o b) restar a la seal medida con el analito, la seal media de varias lecturas del blanco (seal observada blanco).

Es importante sealar que los mtodos analticos son establecido por instituciones nacionales o internacionales que proporcionan procedimientos y caractersticas del mtodo y que concluyen con indicadores de calidad (denominados caractersticas del desempeo analtico) que suelen incluir: exactitud, precisin, especificidad, adems de los parmetros que se determinan a partir de los curvas de calibracin.Independientemente de la tcnica instrumental responsable de la seal analtica (cuyas caractersticas se estudian en forma particular) los parmetros que se determinan a partir de las curvas de calibracin obtenidas con cualquiera de ellas son:La linealidad: para demostrar la linealidad se requieren cumplir ciertos criterios de aceptacin en la que estadsticamente se puede justificar esa linealidad; para ello es necesario calcular: la pendiente (m), la ordenada al origen (b) y el coeficiente de determinacin (r^2). Como criterio de aceptacin de la linealidad a partir de la curva de calibracin (conjunto de concentraciones que describen el intervalo en el cual se deber cuantificar el compuesto por analizar) se considera r2>0.98La sensibilidad: La sensibilidad de mtodo mide su capacidad para discriminar entre pequeas diferencias en la concentracin del analito. Dos factores limitan la sensibilidad.la pendiente de la curva de calibracin y la precisin del sistema de medida. Para dos mtodos que tengan igual precisin, el que tenga la mayor pendiente ser el ms sensible; es importante sealar que para determinar la pendiente de la curva se considera nicamente el intervalo lineal de la misma puesto que cuando la curva pierde su linealidad la pendiente tambin es diferente.El lmite de deteccin: En general este trmino se define como la mnima concentracin del analito detectable por el mtodo.

Lmite de cuantificacin: Llamado tambin lmite de determinacin, se define como la ms pequea concentracin del analito que puede ser determinada con un nivel de exactitud y precisin aceptables. Intervalo analtico: Est definido como el intervalo de concentracin en que el analito puede ser determinado mediante la utilizacin de la curva de calibracin; se considera que es el comprendido entre el lmite de cuantificacin hasta la concentracin en la cual se pierde la linealidad de la curva.

REFERENCIAS

[1] Daz Nieves A. et al. (2010). Espectrofotometra: Espectros de absorcin y cuantificacin colorimtrica de biomolculas. Extrado de http://www.uco.es Fecha de consulta: 05/05/15

[2] Owen Tony (2000). Fundamentos de la espectroscopa UV- visible moderna: Conceptos bsicos. 1ra Edicin. Agilent Technologies. Alemania.

[3] Harris Daniel C. (2003). Anlisis qumico cuantitativo. 3ra Edicin. Editorial Revert. Barcelona, Espaa.

[4] Requena Rodrguez Alberto, Zuiga Romn Jos (2004). Espectroscopa. Editorial Pearson Educacin. 732 pp.

[5] Primo Yfera Eduardo (1995) .Qumica Orgnica Bsica y Aplicada: Tomo II. Editorial Revert. Espaa.

[6] Espectrofotometra ultravioleta visible. Extrado de: http://www.espectrometria.com/ Fecha de consulta: 05/05/15

[7] Introduccin a la metrologa qumica. Extrado de: http://depa.fquim.unam.mx/ Fecha de consulta: 05/05/15