Annals of Microbiology

September 2012, Volume 62,Issue 3, pp 1199-1205

Production and characterization of polygalacturonase from thermophilicThermoascus aurantiacus on submerged

fermentation

Eduardo da Silva Martins, Rodrigo Simões Ribeiro Leite, Roberto da Silva, Eleni Gomes

Produção e caracterização de poligalacturonase a partir do fungo termófilo Thermoascus aurantiacus

em fermentação submersa

Apresentação: Mauren Silveira

OBJETIVO

AVALIAR ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA ENZIMA TERMOESTÁVEL

POLIGALACTURONASE PRODUZIDA PELO FUNGO

THERMOASCUS AURANTIACUS

A PARTIR DE MEIOS DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS

Polímeros lineares compostos de resíduos de ácido 1,4 β-d-galacturônico esterificado, unidos mediante ligações glicosídicas do tipo α 1-4

PECTINA• Protopectina: insolúvel em água e tem cátions

divalentes. Frutas imaturas.• Pectina: solúvel em água, formamida e

glicerol. 75% dos grupos carboxílicos são metilados.

• Ác. Pectínico: ác. Poligalacturônico com alta % de metoxila. Forma gel com açúcar, ácidos e íons metálicos.

• Ác. Péctico: ác. Poligalacturônico coloidal, sem metoxila.

As exo-poligalacturonases catalisam a hidrólise das

ligações terminais α1-4 da cadeia de ác.

poliGalacturônico por hidrólise

INTERESSE INDUSTRIAL

CLARIFICAÇÃO

DIMINUIÇÃO DA VISCOSIDADE

EXTRAÇÃO DE ÓLEOS A FRIO E A QUENTE

AROMATIZAÇÃO

MODIFICAÇÃO DA INTENSIDADE DA COR

À MEDIDA EM QUE OS SUBSTRATOS SÃO HIDROLISADOS PELAS EXO-PG OBSERVA-

SE UM CONSIDERÁVEL AUMENTO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES

REDUTORES CAUSADA PELA LIBERAÇÃO DE MONÔMEROS DE ÁC. GALACTURÔNICO

E CONSEQUENTE DECRÉSCIMO DA VISCOSIDADE DAS SOLUÇÕES.

Thermoascus aurantiacus CBMI756

CELOLÍTICA: CELOBIOHIDROLASE, ENDOGLUCANASE E β-GLUCOSIDASE DEGRADAÇÃO DA HEMICELULOSE: ALPHA-D-

GLUCURONIDASE, XILANASE, β-XILOSIDASE, β-MANNOSIDASE E ARABINOFURANOSIDASE.

DEGRADAÇÃO DA PECTINA: HIDRÓLISE:PECTINA LIASE, POLIGALACTURONASE,

AMILASE E α-GLUCOSIDASE.

Ascomycota; Eurotiomycetes; Eurotiales; Trichocomaceae; Thermoascus

Crescimento de hifas: 45-52,5°C

Formação de ascósporos: 47.5-60°C

TERMOESTABILIDADE

• QUANTO À MEMBRANA• Bacteria e Eukarya: Bicamada Lipídica de ác. Graxos saturados gerando

hidrofobia• Archaea: Monocamada Lipídica: Glicerol-Éter-Hidrocarboneto(5 C Isopreno)

> 100°C• QUANTO AO DNA• Bacteria e Eukarya: Purina (Adenina)-Protege RNA Citosina Timina-Estabilidade no pareamento

Codon-Anticodon• Archaea: 2,3difosfoglicerato cíclico de potássio-Impede despurinação DNA Girase Reversa (DNA topoisomerase)-Superenovelamento

Positivo Proteína Sac7d –sulco menor do DNA- aumenta temperatura de

desnaturaturação em 40°C Histonas de Archaea-Compacta o DNA em dupla-fita,mesmo em

temperatura elevada

METODOLOGIA

COMPARAR ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA ENZIMA PRODUZIDA EM MEIOS SINTÉTICOS COM PECTINA SINTÉTICA

» KHANNA» VOGEL» CZAPEC» SR

EM RELAÇÃO A ENZIMA PRODUZIDA EM MEIOS DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAS CONTENDO PECTINA NATURAL

» CASCA DE LARANJA» CASCA DE MARACUJÁ» FARELO DE SOJA» ÁGUA AMARELA

MÉTODO

MEIOS SINTÉTICOS X PRODUÇÃO DA ENZIMA

• CZAPECK (Sais + Amido + Sucrose)• KHANNA (Muitos sais + Amido)• SR (Poucos Sais + Peptona + Amido)• VOGEL (Poucos sais + Triptona + Glicina)

• PECTINA CÍTRICA (BRASPECTINA)

25 ml de meio + 2.0 ml de micélio (0,6mg de micélio/ml de meio)

8 dias com agitação 110 RPMAmostras coletadas a cada 24 horas

Filtração a vácuo centrifugado a 10000 g por 10 min a 10°C

Cada amostra

Atividade enzimáticaProdução de biomassa

Concentração de açúcares redutorespH

ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Solução tampão acetato 0,4 ml (0.2 M) pH 5.0 com NaOH1% de pectina comercial esterificada (26 DE Sigma)

+

0,1 ml da enzima retirada da amostraINCUBAR 60°C por 10 min

TESTESDNS para determinar quantidade de açúcares redutores do ácido

D-galacturônico

UMA UNIDADE DE ATIVIDADE DE PG CORRESPONDE A QUANTIDADE DE ENZIMA QUE LIBEROU 1 MICRO-MOL DE AÇÚCAR REDUTOR DE

ÁCIDO POR ml DE SOLUÇÃO POR MINUTO

SR

CZAPEC KHANNA

VOGEL

1.3 U/ml0.5 U/ml

1.9 U/ml2.0 U/ml

MEIO SR

MEIOS DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAISA 2%

• Casca de Laranja • Casca de Maracujá• Farelo de Soja• Água Amarela

25 ml de meio + 2.0 ml de micélio (0,6mg de micélio/ml de meio)

8 dias com agitação 110 RPMAmostras coletadas a cada 24 horas

Filtração a vácuo centrifugado a 10000 g por 10 min a 10°C

Cada amostra

Atividade enzimáticaProdução de biomassa

Concentração de açúcares redutorespH

Casca da Laranja Casca de Maracujá

Farelo de Soja Água Amarela

MÉTODO 4X2 NO MEIO ÁGUA AMARELA

4 pH• 4.5• 5.0• 5.5• 6.0

2 TEMPERATURAS DETERMINADAS• 45°C• 50°C

TEMPERATURA E pH INICIAIS PARA PRODUÇÃO DE PG EM ÁGUA AMARELA

45°C 50°C

DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

TERMOESTABILIDADEDINÂMICA/CINÉTICA

• Tm 50% das enzimas desdobradas• T1/2 meia vida das enzimas a uma

determinada temperatura

Proteínas desnaturadas: desaminação da Asparagina (ASN) e da Glutamina (GLN) ou quebra da ligação peptídica

Temperatura ótima

Termoestabilidade

• pH ótimo a 55°C: 5.5

• Temperatura ótima: 60-65°C

Para determinar a temperatura ótima da enzima, foram feitos

experimentos incubando o extrato enzimático junto ao substrato, em

diferentes temperaturas, durante 10 minutos, tempo após o qual foi

determinada a atividade enzimática.

ATIVIDADE ENZIMÁTICA/DINÂMICA

ATIVIDADE ENZIMÁTICAMESOFÍLICOS/TERMOFÍLICOS

Temperatura ótima de atividade PG de fungos mesofílicos

Lentinus edodes 50°C

Moniliella sp SB9 55°C

Penicillium sp EGC5 40°C

Temperatura ótima de atividade PG de fungos termofílicos

Thermomyces lanuginosus 70°C

Thermomucor indicae-seudaticae N31 60°C

CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA/CINÉTICA

Enzima bruta

Enzima bruta

91%

60%

Para determinar a termoestabilidade, foram feitos experimentos incubando o extrato enzimático SEM substrato, em diferentes temperaturas, DURANTE 1 HORA. Após 1 hora, dosou-se a atividade enzimática, incubando no substrato, por 10 minutos, o extrato enzimático que ficou exposto por 1 hora nas diferentes temperaturas.

6%13%

Para determinar a estabilidade do pH, incubou-se a enzima sem substrato a 55°C em diferentes tampões:

Acetato de sódio (pH 3.0-5.5)

Fosfato Citrato (pH 6.0-7.0)

Tris-HCl (pH 7.5-8.5)

Glicina-NaOH (pH 9.0-11.0)depois inseriu-se em substrato a 25°C - 24 horas, tempo após

o qual foi feito o teste DNS.

CONCLUSÃO

A atividade enzimática de PG produzida por

T. aurantiacus na Água Amarela (3.2 U/ml) foi melhor que a produzida no meio sintético

SR (2.0 U/ml) suportando uma

temperatura de até 55°C por 1 hora e temperatura ótima no substrato de até

60°C por 10 minutos.

CONSIDERAÇÕES

• Aspergillus niger em casca de limão por FS é capaz de produzir 26.17 U/ml de POLIGALACTURONASE, porém, a uma temperatura de 30°C.

• Sugere-se a pesquisa de isolamento do gene responsável pela expressão da poligalacturonase, sua amplificação e clonagem no vetor de expressão de Aspergillus niger, esperando obter enzima termoestável em maior quantidade.

A CLARIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DE

SUCO DE LARANJA PODE

SER REALIZADA A 15°C DURANTE 12

HORAS OU A

54°C POR 1 HORA