Genetic characterization of German Mycobacterium avium strains isolated from different hosts and

specimens by multilocus sequence typing

By: Juan Pablo Ospina

Andrea Múnera López

OBJECTIVE

The aim of this study was to asses the feasibility of MLST and its applicability to distinguish diferent M. Avium strains from Germany. Thereby, the emphasis was on strains isolated from children suffering from Lymphadenitis

Mycobacterium

Mycobacterium is a genus within the order Actinomycetales (Actinobacteria) that groups a large number of species, that are associated with human and animal diseases.

Mycobacterium Avium

• Mycobacterium avium complex (MAC) is a type of non-tuberculous mycobacterial (NTM) infection.

• Its entire genome consists of one DNA molecule (one chromosome) of 5,475,491 nucleotides long, with a GC (guanine cytosine) content of 68% and 32% for AT (adenine thymine)

Mycobacterium Avium

HIV INFECTION

PULMONARY DISEASE

INMUNOSUPRESSED

CERVICAL LINPHADENITIS

They are found in water, soil, dust, and food.

M. Avium

Avium Silvaticum Paratuberculosis Hominissuis

Multilocus sequence typing

Is a technique that identify isolates of microbial species using DNA sequences from housekeeping genes.

There are used 450 or 500 bp of each genes, that are incorpored to the strands with a automatic DNA sequencer.

• Each strand has a different allele sequence and thats how it is recognized.

The relation of the MLST with the Mycobacterium avium is that this technique is helpful to identify the localization of the bacteria in different locus, plus the results are not the same if the hosts are changed.

Now a days, scientists can make the diference between the M. Avium and other species of mycobacterium but they can not easily identificate the different subspecies of the M. Avium

Materiales y métodosCEPAS

Niños: 43 cepas36 gánglios linfáticos

2 pulmones1 bazo

4 desconocidas

Cerdos: 21 CepasGánglios Linfáticos

Ambiente: 6 cepasPolvoTierra

Adultos: 6 CepasEsputo

Pájaros: 22 Cepas

*M.A. AVIUM 104 Referencia*M.A. AVIUM ATCC 25291T y M.A. Silvaticum ATCC 49884T

Control

La identificación de las cepas fue con el Genotype Mycobacterium CM Assay

PCR

Tras aislar el DNA de la célula, para estudiarlo se necesitan miles o millones de copias, sea de un fragmento de DNA o de un gen determinado. Está técnica se puede hacer in vitro utilizando la reacción en cadena polimerasa.

Fundamento

• Desnaturalización del DNA• Hibridación de una pareja de cebadores que

cortan por los extremos el fragmento de interés

• Elongación de las cadenas • El ciclo se puede repetir

¿Cómo se usó?

• La identificación de las subespecies fue hecha por la presencia de IS900 e IS901

• La secuenciación de ambas cadenas fue hecha con los mismos primers que se usan en una PCR

• M.A Paratuberculosis

IS900

• M.A Avium• M.A Silvaticum

IS901 • M.A Hominissuis

-

MLST

• Cada muestra se caracteriza por una secuencia única de alelos.

• Se usan 450 a 500 pb de cada gen, los cuales se incorporan a las cadenas con secuenciadores de DNA automáticos.

• Para cada grupo los alelos de cada locis define un perfil alélico o tipo de secuencia (ST).

• Cada cadena tiene una secuencia de alelos diferente y así es como es reconocido.

Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción

Son los cambios en las bases nitrogenadas en el sitio donde una enzima de restricción corta un segmento de DNA, lo cual, afecta el tamaño de los fragmentos que resultan del corte.

¿Cómo se obtiene?

Los fragmentos restantes de la PCR, son separados de los cebadores con electroforesis en una solución de

agarosa, así, se posicionan en diferentes espacios (Masa, carga eléctrica).

Se da un patrón diferente debido a las secuencias de DNA de las muestras.

En este caso se uso un IS1245 RFLP

• NEGATIVO para IS900 • POSITIVO en 22 cepas de aves y una muestra humana para

IS901• Ausencia de estos se presentaron en 5 adultos, 43 niños, 21

cerdos, 6 muestras ambientales, 2 pájaros y la muestra referencia M.A. Avium 104.

M.A Paratuberculosis

M.A. Avium M.A Silvaticum

M.A. Hominissuis

RESULTADOS: Identificación de las subespecies

MLST

• Usa la diferencia de las secuencias de DNA que permiten evidenciar diferentes perfiles de cada cepa.

Genes blanco:

RecF

lipT

pepB

Gnd1

est

450-500 pb

• Sólo los loci 4 y 5 mostraron variación.• Loci recF, lipT, pepB y gnd1 fueron obtenidas

de todas las muestras de MA 101• Todas las pruebas positivas para IS901 fueron

analizadas con est

• Secuencias diferentes basadas en polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) fueron asignados para cada secuencia de locis. La designación de alelos fue hecha por Turenne.

• El número de secuencias diferentes para los alelos encontrados en cada locus fue:

8: est12: gnd1

10: recF y pepB

11: lipT

• Juntando las secuencias de todos los loci, un perfil de MLST fue obtenido, el ST.

• Un total de 40 STs diferentes fue identificado en las cepas analizadas de 101 M.A

• Se encontraron muchas diferencias entre el M.A Silvaticum/M.A Avium y el M.A Hominissuis

• 30 STs se identificaron como M.A Hominissuis• 23 STs se identificaron como M.A Avium/M.A

Silvaticum• Se encontraron grupos de cepas idénticos en

adultos, niños, cerdos y el ambiente• Hubo grupos en los que se encontraron

diferentes STs en cerdos de la misma granja

• 48 Cepas aisladas de diferentes especímenes y huéspedes.

• 10 grupos mostraron diferencia en las cepas con el MLST.

• 5 grupos mostraron alta relación con el MLST.

A A C A A N C

RFLP Kb21.2

5.1

5.0

4.3

3.5

2.0

1.9

• Para dos grupos de MSLT (ST46-ST53) los grupos 3 y 2 mostraron grupos idénticos

• RFLP fueron identicos en niños y ambiente, los cerdos mostraron resultados muy diferentes

Las muestras de niño fueron idénticas en ambas pruebas (MSLT y RFLP)

Kb21.2

5.1

5.0

4.3

3.5

2.0

1.9

DISCUSSION

Recently, MLST analysis has been developed as a rapid, easy, but highly reliable molecular technique for typing of M. avium strains (Turenne et al., 2008).

The detection of ‘M. avium subsp. hominissuis’ in soil and dust in our study might indicate a source of infection for children. All of our analyzed slaughter pigs were infected with strains of the subspecies ‘M. avium hominissuis’ which is in contrast to Möbius et al. (2006) who found M. avium subsp. avium/M. avium subsp. silvaticum infections in pigs originating from Germany.

Since both strains clustered together with strains isolated from children and pigs this finding could suggest the possibility that ‘M. avium subsp. hominissuis’ strains might be transmitted from birds to children as it has been hypothesized earlier (Bruijnesteijn van Coppenraet et al., 2008).

One advantage of the MLST method is its applicability to ‘M. avium subsp. hominissuis’ strains without IS1245 elements (Ritacco et al., 1998; Komijn et al., 1999; Álvarez et al., 2008; Ichikawa et al., 2009)

CONCLUSIONS

• Not only a technique can give a reliable result, you need to perform multiple tests to start talking about data significant

• Electrophoresis is a good method to separate molecules by their physical compositions and it´s used to identify genetic polymorphisms among samples.

• PCR for detection of IS901 is not a definitive proof of M. avium subsp. avium/M. avium subsp. silvaticum. That´s why they use the MLST method. But PCR is the first step for RFLP technique, because is the one that amplifies the DNA to make electrophoresis.

• Germany, tuberculous lesions in slaughtered pigs due to infection with members of the Mycobacterium avium complex are increasingly reported.

Webgrafía

Consultado en:

• http://www.mlst.net/ • http://www.jcvi.org/• http://www.fao.org/• http://www.javeriana.edu.co/Genetica/

PDFDOC/POLIMORFISMO%20GENETICO.pdf