Department of Biomedical Sciences University of Padua

Biologia e biochimica della macchina mitocondriale

Rosario Rizzuto

4° Convegno Malattie Mitocondriali Tivoli, 23 maggio 2014

Peter D. Mitchell (1920-1992)

Nobel Prize in Chemistry 1978

Il funzionamento

Le proteine (ed i geni) della respirazione mitocondriale

42 (7 mt) 5 11 (1) 13 (3)

14 (2)

1. Una molteplicità di geni, su due genomi diversi

2. Una presentazione variabile (per organo/i coinvolti ed età di insorgenza)

3. Un ampio spettro di gravità e decorso

Mitochondrial disorders are a group of heterogeneous diseases,

commonly defined by a lack of cellular energy due to OXPHOS defects

Zeviani_Brain_2004_review

Mitochondrial Respiratory Chain

MELAS (Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stoke-like episodes)

Leigh syndrome LHON (Leber’s hereditary optic neuropathy)

MERRF (Myoclonic epilepsy and ragged red fibers)

NARP (Neurophaty, ataxia and retinitis pigmentosa)

CPEO (Chronic progressive external ophtalmoplegia)

KSS (Keans-Sayre syndrome)

Perché i difetti mitocondriali provocano morte cellulare e

disfunzione d’organo? (Dove risiede la specificità delle

diverse mutazioni?)

La disfunzione mitocondriale induce morte cellulare per necrosi o apoptosi

Crisi energetica

Quali segnali ricevono i mitocondri, e come li traducono?

Il Ca2+ è il più comune secondo messaggero delle cellule

Il sistema di accumulo del Ca2+ nei mitocondri

∆Ψ = -180mV

I contatti RE/mitocondri: sedi previlegiate della segnalazione cellulare

Il Ca2+ mitocondriale stimola il rilascio di cofattori dell’apoptosi

APOPTOSI

Ill Ca2+ mitocondriale regola il metabolismo

Il ruolo del Ca2+ nei mitocondri

Rizzuto_Nature Reviews_2012

I mitocondri regolano l’autofagia

Ca2+ mitocondriale ed autofagia: Un nuovo elemento nella patogenesi

delle malattie mitocondriali

Subject Date of

birth Familiarity

Complex I residual activity

Affected gene

Mutation Hetero-plasmy

Reference

Patient 13-12-1975 MELAS 60% ND5 13514A>G (D393G)

25-30% (Corona et al., 2001)

MELAS (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes)

Experimental model: skin primary fibroblasts derived from patient with point mutation in complex I subunit

Zeviani_Brain_2004_review

Mitochondrial Respiratory Chain

Patient

Brandt_Annu.Rev.Biochem:_2006

45 subunits, 7 encoded by mtDNA Structure of Complex I

0

5

10

15

20

25

30

35

40

[Ca2+

] mt u

M

control

cont…

0

5

10

15

20

25

30

35

40

[Ca2+

] mt u

M

patient 2

patie…

0

5

10

15

20

25

30

35

40

[Ca2+

] mt u

M

patient 1

patie…

Mutazioni diverse nello stesso complesso hanno effetti diversi sui livelli di calcio mitocondriale

Ca2+

I fibroblasti di pazienti mutati in ND5 hanno aumentata autofagia a riposo • Immunofluorescenza di LC3

Ctrl Pat

BA

SAL

ST

AR

VAT

ION

** ** **

0

5

10

15

20

25

30

35

voxe

ls

autophagosome volume Ctrl

Pat

**

**

**

0

20

40

60

80

Aver

age

n.ob

ject

s/ce

ll

puncta per cell Ctrl

Pat

starvation - - + +

starvation - - + +

0

Ctr

l Pa

t

BASALE DIGIUNO BASALE +

CLOROCHINA DIGIUNO +

CLOROCHINA

**

**

**

** **

** **

0

20

40

60

80

100

120

140

Aver

age

n.ob

ject

s/ce

ll

puncta per cell

CtrlPat

starvation - - + + - + - + chloroquine - - - - + + + +

**

**

**

** **

** **

0

10

20

30

40

50

60

70

voxe

ls

autophagosome volume

Ctrl

Pat

starvation - - + + - + - + chloroquine - - - - + + + +

L’aumento degli autofagosomi non è dovuto a blocco del flusso

Chloroquine = 50 µM in DMEM or starvation’s saline for 1h

LC3

p-AMPK

β-tub

AMPK

starvation - - + +

Ctrl Pat

**

**

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

a.u.

p-AMPK

starvation - - + +

Il meccanismo dipende dalla deprivazione energetica (AMPK)

p-Akt

β-tub

Akt

p-mTOR

mTOR

p-S6

S6

Ctrl Pat starvation - - + +

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

a.u.

p-mTOR

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

a.u.

p-S6

starvation - - + + starvation - - + +

n. exp = 3 ** P< 0.001

n. exp = 3

Starvation = serum and glucose deprivation for 4h

Qual’è il segnale?

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6[C

a2+] cy

t uM

Histamine

10 s 0

50

100

150

200

250

300

350

400

[Ca2+

] ER u

M

EGTA

Histamine Ca2+

5 s

0

10

20

30

40

50

60

[Ca2+

] mt u

M

Histamine

10 s

0

50

100

150

200

250

[Ca2+

] mt u

M

Ctrl

Pat

Ca2+ free

Ca2+

0.5 s

I mitocondri hanno un difetto nell’accumulo di calcio

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0

50

100

150

200

250

300

350

400

**

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

**

0

2

4

6

8

10

12

uM/s

speed

**

0

50

100

150

200

250

[Ca2+

] mt u

M

peak

Citoplasma Reticolo Endoplasmatico

Mitocondria

Mitocondri in cellule permeabilizzate

Difetto di accumulo mitocondriale del Ca2+

Morfologia

I contatti RE – mitocondri

Il canale (MCU)

I suoi regolatori

MICU1 MICU2 MCUR1 EMRE

∆Ψ = -180mV

Potenziale di membrana

Nessuna differenza nel potenziale o nella forma dei mitocondri

Ctrl Pat

O=oligomycin R=rotenone F=FCCP

Ctrl Pat

n. exp = 3

n. exp = 3 n.cells=60

MICU1

MCU

EMRE

MCUR1

MICU2

β-Tub

Ctrl Pat

n. exp = 3

Le proteine del complesso MCU

E’ cambiata la composizione molecolare dei sistemi di trasporto

Vi è una differente espressione dei regolatori di

MCU (MICU)

… ed una alterazione dei contatti con il RE

Probe costruito da Tito Calì

**

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Aver

age

n.pu

ncta

/cel

l

Ctrl Pat

- MFN

2 +

MFN

2

MFN

- - + +

MFN1

MFN2

SigmaR1

β-Tub

grp75

Ctrl Pat

PACS-2

C’è una relazione tra l’alterazione del segnale Ca2+ nei fibroblasti di paziente e l’aumento di autofagia?

La correzione molecolare dell’alterazione del segnale Ca2+ riduce l’autofagia

**

**

**

**

*

**

0

10

20

30

40

50

60

70

80

[Ca2+

] mt u

M

0

10

20

30

40

50

60

70

80

[Ca2+

] mt u

m

Ctrl

Ctrl STARV

Ctrl + MCU

Ctrl STARV + MCU

Pat

Pat STARV

Pat + MCU

Pat STARV + MCU

Histamine

10 s

Histamine

starvation - - + + - + - + MCU - - - - + + + +

p-AMPK

β-tub

AMPK

MCU

MCU - + + - starvation - - + +

- + + - - - + +

Ctrl Pat

Conclusioni

Gli studi cellulari su fibroblasti di pazienti rivelano differenti profili di segnalazione mitocondriale Si rilevano difetti nell’accumulo di Ca2+ in seguito a stimolazione cellulare, che possono essere attribuiti ad alterazioni del sistema di trasporto dello ione e dei contatti con il RE Queste alterazioni della segnalazione mitocondriale correlano con una stimolazione dell’autofagia La correzione molecolare (sovraespressione di MCU) ripristina i segnali Ca2+ e inibisce l’autofagia

Collaboratori Ildiko Szabo, Enrico Teardo (electrophysiology) Stefano Moro, Davide Sabbadin (protein modelling) Tullio Pozzan, Ilaria Drago, Marco Mongillo, Tania Zaglia, Fabio Di Lisa, Andrea Carpi (heart) Jim Surmeier, Marisa Brini (neurons) Giuseppe Zanotti, Laura Cendron (protein structure) Paolo Bonaldo, Paola Braghetta, Francesco Argenton, Enrico Moro (transgenics)

Dipartimento di Scienze Biomediche Università di Padova

Diego De Stefani Cristina Mammucari Giorgia Pallafacchina Anna Raffaello Alessandra Braga Gaia Gherardi Veronica Granatiero Angela Paggio Marco Pacifici Maria Patron Elisa Penna Anne Picard Anna Terrin Anna Tosatto Denis Vecellio Lauren Wright Ilaria Zamparo