ESTUDIO DE REGULACIÓN DE ESTUDIO DE REGULACIÓN DE LIGANDOS DE NKG2D POR INTERLEUQUINA 10 LIGANDOS DE NKG2D POR INTERLEUQUINA 10

Y SU ASOCIACIÓN CON CALRETICULINA Y SU ASOCIACIÓN CON CALRETICULINA EN TROFOBLASTO Y MELANOMA HUMANO EN TROFOBLASTO Y MELANOMA HUMANO

Tutores: Dra. Mª Carmen Molina Dr. Juan Carlos

Aguillón Programa de

Inmunología ICBM . Fac de Medicina

T.M. Antonio E. Serrano G.Escuela de GraduadosFac. Cs Qcas. y FarmacéuticasU. de Chile

Examen publico para optar al grado de Doctor en Bioquímica

Características de Cáncer y Tolerancia FetalCaracterísticas de Cáncer y Tolerancia Fetal

Evasión inmuneEvasión inmune

Adaptado De Zwirner Et Al 2007

SinciciotrofoblastoEndometrio

TGF-

IL-10FAS/FASL

VEGF

TUMOR PLACENTA

-Inmunovigilancia-Equilibrio entre activación e inhibición-8 diferentes ligandos-Células estresadas-Mecanismos de Evasión

SistemaSistema NKG2D/NKG2DL NKG2D/NKG2DL

Mecanismos de inducción de la expresión de NKG2DLMecanismos de inducción de la expresión de NKG2DL

Adaptado de Mistry et al , 2008

Mecanismos de inhibición en la expresión Mecanismos de inhibición en la expresión de NKG2DLde NKG2DL

Adaptado de Mistry et al , 2008

IL-10 en Embarazo y CáncerIL-10 en Embarazo y Cáncer

Hanna, Journal of Immunology, 2000

Embarazo Cáncer

Mocellin et al 2005

Prim

er T

rime

stre

Seg

undo

Tri

mes

tre

Tér

min

o

CRT como regulador de la expresión de proteínasCRT como regulador de la expresión de proteínas

Control Ad-CRT

1

2 La sobre expresión de Vasostatina, fragmento de Calreticulina, reduce la expresión de MICA (Liu et al 2006)

Calreticulina regula la expresión en superficie de receptores de membrana Harada et al 2005

Racional Racional

•Se desconocen las proteínas chaperonas asociadas a MIC en su plegamiento y retención

•Se ha descrito regulación de la expresión de MIC por parte de citoquinas. Se desconoce el efecto de IL-10, sobre la expresión de este ligando.

HipótesisHipótesis

Calreticulina se asocia con MICA en células de trofoblasto y de melanoma maligno e IL-

10 disminuye la expresión de MICA en melanoma maligno, reduciendo la

capacidad efectora de las células NK medida en un ensayo citotóxico

ObjetivoObjetivo

Determinar nuevos mecanismos de regulación negativa de los ligandos del receptor NKG2D

relacionados con la evasión inmune

Objetivos EspecíficosObjetivos Específicos

• O.E.1: Localizar MIC en compartimentos intracelulares de células de trofoblasto y melanoma, colocalizando con proteínas chaperonas

• O.E.2: Obtener la proteína MIC de células de trofoblasto por inmunoprecipitación en conjunto con las proteínas asociadas

• O.E.3: Estudiar unión directa entre MIC y Calreticulina mediante análisis de interacción de proteínas recombinantes

• O.E.4: Estudiar en un modelo de cultivo de melanoma maligno la modulación de la expresión de MIC por IL-10

Objetivos EspecíficosObjetivos Específicos

• O.E.1: Localizar MIC en compartimentos intracelulares de células de trofoblasto y melanoma, colocalizando con proteínas chaperonas

• O.E.2: Obtener la proteína MIC de células de trofoblasto por inmunoprecipitación en conjunto con las proteínas asociadas

• O.E.3: Estudiar unión directa entre MIC y Calreticulina mediante análisis de interacción de proteínas recombinantes

• O.E.4: Estudiar en un modelo de cultivo de melanoma maligno la modulación de la expresión de MIC por IL-10

HistopatologiaHistopatologia

Firma Consentimiento

Informado

Ficha de Ingreso

•Multiparidad•Patología asociada•Infecciones asociadas•Fiebre•Tipo de pérdida

Mujeres con pérdida Diagnosticada¡

Tejido Melanoma

Inmunohistoquimica

Microscopia Confocal

MICA y MICB se expresan en trofoblasto de 1er trimestre

MICA y MICB se expresan en melanoma maligno MICA y MICB se expresan en melanoma maligno

MICA y MICB se expresan en citoplasma de células MICA y MICB se expresan en citoplasma de células sinciciotrofoblasto y se superponen con moléculas sinciciotrofoblasto y se superponen con moléculas

chaperonas en placenta de primer trimestrechaperonas en placenta de primer trimestre

MICA y MICB se expresan en citoplasma de células MICA y MICB se expresan en citoplasma de células de melanoma y se superponen con moléculas de melanoma y se superponen con moléculas

chaperonaschaperonas

Resumen Resumen O.E.1.O.E.1.

Localizar MIC en compartimentos intracelulares de células Localizar MIC en compartimentos intracelulares de células de citotrofoblasto, colocalizando con proteínas chaperonasde citotrofoblasto, colocalizando con proteínas chaperonas

• MICA y MICB se ubican en citoplasma de sinciciotrofoblasto y melanoma.

• MICA y MICB se superponen con CRT, CNX y ERP57 en células de melanoma maligno y trofoblasto de primer trimestre

Objetivos EspecíficosObjetivos Específicos

• O.E.1: Localizar MIC en compartimentos intracelulares de células de trofoblasto y melanoma, colocalizando con proteínas chaperonas

• O.E.2: Estudiar la interacción de MIC y Calreticulina por inmunoprecipitación

• O.E.3: Estudiar unión directa entre MIC y Calreticulina mediante análisis de interacción de proteínas recombinantes

• O.E.4: Estudiar en un modelo de cultivo de melanoma maligno la modulación de la expresión de MIC por IL-10

MICA co-inmunoprecipita con la molécula chaperona MICA co-inmunoprecipita con la molécula chaperona Calreticulina en células de melanoma maligno humano y Calreticulina en células de melanoma maligno humano y

en trofoblasto temprano en trofoblasto temprano

A

B

MICA (42): Molécula relacionada a la cadena A de MHC

CRT (48): Calreticulina

SNC: Suero normal de conejo

Interacción MIC/CRT

BSA MICA recombinate E.coli

YY

AcPo anti CRT

Anti Conejo -HRP

Interacción MIC/CRT

• Ensayo de ELISA de interacción rCRT / rMICA . Placa de ELISA sensibilizada con rMICA y analizada con varias concentraciones de rCRT

BSA MICA recombinate E.coli

YY

AcPo anti CRT

Anti Conejo -HRP

Resumen Resumen O.E.2O.E.2 y O.E.3:

• CRT inmunoprecipita MICA en melanoma maligno y trofoblasto

• MICA inmunoprecipita CRT en melanoma maligno

• CRT y MICA recombinante de origen procarionte interactuan en un ensayo de ELISA

• Adicionalmente, En biacore MICA de origen eucarionte y CRT recombinante no interactuaron directamente.

Objetivos EspecíficosObjetivos Específicos

• O.E.1: Localizar MIC en compartimentos intracelulares de células de trofoblasto y melanoma, colocalizando con proteínas chaperonas

• O.E.2: Obtener la proteína MIC de células de trofoblasto por inmunoprecipitación en conjunto con las proteínas asociadas

• O.E.3: Estudiar unión directa entre MIC y Calreticulina mediante análisis de interacción de proteínas recombinantes

• O.E.4: Estudiar en un modelo de cultivo de melanoma maligno la modulación de la expresión de MIC por IL-10

Niveles de los Ligandos de NKG2D y analisis de la Lisis Niveles de los Ligandos de NKG2D y analisis de la Lisis por accion de LAK a tres líneas de melanoma incubadas por accion de LAK a tres líneas de melanoma incubadas

con IL-10con IL-10

Citometría de Flujo de la expresión de superficie de MICA, MICB ,MHC-1, ULBP1, ULBP2 y ULBP3

Sobreexpresión de IL-10 decrece localización de Sobreexpresión de IL-10 decrece localización de MICA en superficie celularMICA en superficie celular

*** P<0.001

* P<0.05** P<0.01

IL-10 cambia niveles de expresión de MICA y MICB en IL-10 cambia niveles de expresión de MICA y MICB en líneas de melanoma FMS. líneas de melanoma FMS.

* P<0.05

* P<0.05

* P<0.05** P<0.01

IL-10 modifica la lisis de celulas de melanoma mediada IL-10 modifica la lisis de celulas de melanoma mediada por NKG2Dpor NKG2D

* P<0.05

• IL-10 expresada endogenamente y agregada exógenamente disminuye la localización en superficie y la expresión de mRNA de MICA afectando la citotoxicidad medidada por células LAK

• rIL-10 aumenta localización en superficie y la expresión de mRNA de MICB

Resumen Resumen O.E.4.O.E.4.

ConclusionesConclusiones.

• MICA y MICB se expresan en melanoma maligno y en trofoblasto temprano y colocalizan intracelularmente con Calreticulina

• IL-10 expresada endogenamente y agregada exógenamente disminuye la localización en superficie y la expresión de mRNA de MICA afectando la citotoxicidad medidada por células LAK

Agradecimientos

• Realizado en:Programa de Inmunologia. ICBM

Facultad de Medicina. Universidad de Chile

• Dra. María Carmen Molina.• Dr. Juan Carlos Aguillón• Dr. Arturo Ferreira.• Dra. Carolina Ribeiro.• Dr. Flavio Salazar• Dra. Mercedes López

Division of Structural Biology . Nuffield Department of Clinical Medicine. University of Oxford.• Prof. Yvonne Jones• Dr. Max Crispin