Upload
odeckmyn
View
451
Download
4
Tags:
Embed Size (px)
Citation preview
Hépatite CVirus & Marqueurs
Stéphane Chevaliez
Centre National de Référencedes Hépatites Virales B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955Hôpital Henri Mondor
Université Paris-EstCréteil
Découverte du Virus de l’Hépatite C
From New England Journal of Medicine, 1975
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Identification du Virus de l’Hépatite C
From Science 21 April 1989
Hépatite C : Virus et Marqueurs
The Global Burden of HCV Infection
• Approximately 170 million people are chronically infected with HCV
• HCV is responsible for >350,000 deaths per year worldwide- 60,000 in Europe- >7,500 in the US
• Up to 85% of HCV-infected patients are unaware of their status- 50.3% in the US- 42.6% in France (i.e., 100,000 persons)
• Less than 10% of the HCV-infected population has received treatment in the US
Hépatite C : Virus et Marqueurs
SVR Rates in the Past 25 Years
Heim M. Nat Rev Immunol 2013;13(7):535-42.
Hépatite C : Structure et Virologie Moléculaire
2014-2015
OutlineHépatite C : Virus et Marqueurs
I. TAXONOMIE
Virus de l’Hépatite C
• Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
Phylogénie de la région codant la protéine NS5BAdapted from Simmonds et al., 1999; 2001.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
• Hôte naturel : Homme
• Tropisme : Hépatocyte
Virus de l’Hépatite CHépatite C : virus et marqueurs
Identification d’Homologues du VHC chez les Non Primates
Kapoor et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108(28):11608-13; Kapoor et al., Mbio 2013;4(2):e00216-13.
Phylogénie de la région codant RdRp (7711-8550 HCV g1a) CHV: canine hepacivirusRHV: rodent hepacivirus
Hépatite C : Virus et Marqueurs
II. MODÈLES EXPERIMENTAUX
Les Différents Modèles d’Etude in vitro
• cDNA développés en 1997
• Réplicons subgénomiques (1999)
• Pseudoparticules rétrovirales (HCVpp) (2003)
• Système de culture permettant le production de particules virales infectieuses (HCVcc) (2005)
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Les Modèles Animaux
Tawar et al., Cell Res. 2014;24(10):1153-4.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
III. ORGANISATIONS STRUCTURALE & GENOMIQUE
Organisation StructuraleHépatite C : Virus et Marqueurs
Catanese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(23):9505-10.
Densité des Particules Circulantes
Lindenbach BD. Curr Top Microbiol Immunol 2013;369:199-218.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
The “Lipidome“ of HCVcc Particles
Merz et al., J Biol Chem 2011;286(4):3018-32.
LPC: lysophosphotidylserineCE: cholestery esterChol: cholesterolPI: phosphatidylinositolPS: phosphatidylserinePE: phosphatidylethanolamineSM: shingomyelinPC: phospahtidylcholinePG: phosphatidylglycerol
Total lipid profile Phospholipid profile
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Organisation StructuraleHépatite C : Virus et Marqueurs
Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700; Catanese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(23):9505-10.
Organisation Génomique des Flaviviridae
Hépatite C : Virus et Marqueurs
0 1800 3600 5400 7200 9000 10800
C 4Ap7 NS5BNS5ANS4BNS3NS2E2E15’UTR 3’UTR
Hepatitis C virus
Npr
o
C E1 E2E0 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B4Ap7
5’UTR 3’UTR
Pestivirus
C prM E NS1 2A 2B NS3 NS5NS4A 4BCap5’UTR 3’UTR
Yellow fever virus
Organisation GénomiqueHépatite C : Virus et Marqueurs
Scheel TK, Rice CM. Nat Med 2013;19(7):837-49.
Structure de l’IRESHépatite C : Virus et Marqueurs
“Pseudoknot domain“
Berry et al., Structure 2011;19(10):1456-66.
Crystal Structure of the Full HCV IRES
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Berry et al., Structure 2011;19(10):1456-66.
MicroRNA (miR)-122 et Infection VHCHépatite C : Virus et Marqueurs
• Expression abondante et spécifique du foie
• Interaction avec la région 5’NC du génome viral
– 2 sites au niveau du domaine I
• Favorise la stabilité de l’ARNm viral
miR-122 : Cible Thérapeutique ?Hépatite C : Virus et Marqueurs
Janssen et al., N Engl J Med. 2013;368(18):1685-94.
Efficacité Antivirale du Miravirsen
Janssen et al., N Engl J Med 2013;368(18):1685-94.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Pros & Cons des Antagonistes de miR-122
• Activité pangénotypique• Barrière à la résistance élevée (HTA)
• Administration parentérale• Faible taux de miR-122 dans les hépatocytes a
été associé au développement d’HCC
Tsai et al., J Clin Invest 2012;122(8):2884-97; Wilson et al., Curr Opin Virol 2014;7C:11-18.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
IV. LES DIFFÉRENTES PROTÉINES VIRALES
Protéines du VHC
Bartenschlager et al., Nature Reviews Microbiology 2013; 11, 482–496.
Assembly module Replication module
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Réseaux d’InteractionsHépatite C : Virus et Marqueurs
Park et al, BMC Bioinformatics 2010, 11(Suppl 1): S23.
Protéine de Capside
• Forme mature formée de ~177 amino acides (21-kDa)
• Capacité de lier les lipides et l’ARN
• Structure tridimensionnelle non résolue
– Conformation en hélices alpha (~ 50%)
– Constituée de 2 domaines (D1 & D2)
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Protéine de CapsideHépatite C : Virus et Marqueurs
Boulant et al, J Virol 2005, 79(17): 11353-11365.
Domaine d’interaction avec l’ARN viral Domaine d’interaction avec LD
Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.
VHC G1b
Glycoprotéine E2
Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
• Protéine de fusion classe II– Hétérodimères avec E1
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Kong et al,Science. 2013 Nov 29;342(6162):1090-4; Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Topologie de la Protéine E2 : Domaine “Ig-like“
Structure de E2
Purple and red: Ig ß sandwichBlue: CD81 receptor binding loop
Kong et al,Science 2013;342(6162):1090-4; Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Glycoprotéine E2
Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
• Protéine de fusion classe II– Hétérodimères avec E1
• Interaction avec récepteurs membranaires– CD81– SRB-I
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Étape Précoce : Entrée du VHCHépatite C : Virus et Marqueurs
Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700.
E2 : Trois Domaines Variables
• E2 contient 3 domaines très variables– HVR1– VR2– VR3
• Délétion HVR1 est non létale mais augmente la sensibilité du virus aux anticorps neutralisants
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Variabilité du VHC
Magiorkinis et al., PLoS Med. 2009;6(12):e1000198.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
HVR1
Région HVR1 (27 amino-acides) 80% de divergence nucléotidique entre génotypes Epitope majeur de neutralisation
Timm et al., World J Gastroenterol 2007; 13(36)4808-4817.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Transmission du VHCHépatite C : Virus et Marqueurs
6a_332b_JFH1Patient 1 (7/04)
5a_SA131b_HVR3812
S5 (7/05)Patient 3 (7/05)Patient 3 (9/05)Patient 2 (7/04)Patient 2 (9/04)Patient 3 (7/04)S4 (6/05)S3 (6/05)S2 (6/05)Patient 3 (01/05)S1 (6/05)
1a_HCT27X52a_Q2B
3a_CB1a_HCT18X5
Patient 61b_AWV2C33
Patient 8Patient 4
Patient 74a_ED43
0.2
100
Surfaces inertes
Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.
Patients VHC chroniquesSéroconversion VHC
Analyse Phylogénique
Région HVR1 (81 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningBootstraping : 1000 replicatesNJPlot
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Protéine p7Hépatite C : Virus et Marqueurs
• Viroporine dont la
structure 3D a été
récemment déterminée par
ME
• Rôle(s) in vivo ?
• Cible thérapeutique
potentielle
Luik et al., Proc Natl Acad Sci 2009, 4;106(31): 12712-6; Griffin S, Proc Natl Acad Sci 2009, 106(31): 12567-68.
Rôle in vivo ?Hépatite C : Virus et Marqueurs
Scheel TK, Rice CM. Nat Med 2013;19(7):837-49.
Activité Antivirale du BIT225Hépatite C : Virus et Marqueurs
• IC50 de 314 nM dans le modèle du BVDV
• Activité synergique
Luscombe et al., Antiviral Res 2010;86(2):144-53.
Activité Antivirale in vivo• Phase II
- Patients VHC (G1a, G1b, G3)- Patients VIH (inhibiteur de Vpu)- Patients coinfectés
• Activité antivirale chez les patients G1 naïfs de traitement- 200 à 400 mg en combinaison avec SOC pendant 4
semaines suivi de la bithérapie pendant 44 semaines
Tanwandee et al., AASLD 2012 LB abstract.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Taux de Réponses Virologiques
• Futurs développements– Génotypes 1 & 3– 3 mois de traitement en association à pegIFN/RBV– Evaluation de l’efficacité en association à d’autres
DAA
Treatment EVR (%) SVR % (n/N)
200 mg BIT225+ pegIFN/RBV 88 88
400 mg BIT225+ pegIFN/RBV 86 100 (7/7)
pegIFN/RBV 63 75 (6/8)
Tanwandee et al., AASLD 2012 LB abstract.
Hépatite C : Structure et Virologie Moléculaire
Protéine NS2Hépatite C : Virus et Marqueurs
• NS2 (région N-ter)– Rôle dans l’organisation
de la formation des
nucléocapsides
• NS2pro (région C-ter)
Jirasko et al., PLoS pathog 2010;6(12): e1001233; Ivo et al., Nature 2006, 442: 831-835.
Protéine NS3-4AHépatite C : Virus et Marqueurs
Raney et al., J Biol Chem 2010, 285(30): 22725-731.
Inhibition de la Production d’IFN par NS3
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Rehermann B., J Clin Invest 2009;119(7):1745-54.
Cycle Viral du VHC & Cibles des DAAsHépatite C : Virus et Marqueurs
Lange et al., EMBO Mol Med 2014;6(1):4-15.
Protéase NS3Hépatite C : Virus et Marqueurs
Raney et al., J Biol Chem 2010, 285(30): 22725-731.
TelaprevirHépatite C : Virus et Marqueurs
Kieffer et al. Hepatology 2007;46:631-639.
Telaprevir Dosing Telaprevir Dosing
0
2
4
6
8
0
2
4
6
8
Log 10
HCV
RN
A (I
U/m
L)
Log 10
HCV
RN
A (I
U/m
L)
HCV RNA (>100 IU/mL)Wild typeT54AV36A/M
R155K/T36/155A156V/T36/156
Days Days
Patient 1002Patient 1018
LODLOD
1 14 1 14
Schinazi et al., Liver Int 2014;34 Suppl 1:69-78.
Caractéristiques des IP
DAA
PI 1st generation
PI 2nd generation
NS5A Inh. 1st generation
NS5A Inh. 2nd generation
NS5Bnucleos(t)ide
inh.
NS5B non nucleos(t)ide
inh.
Efficacy
Resistance profile
Pangenotypic efficacy
Adverse events
Drug-drug interaction
Good profile Average profile least favorable profile
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Telaprevir Approved First generation
Boceprevir Approved First generation
Simeprevir Approved Second wave
Faldaprevir (BI1335) Phase 3 Second wave
Asunaprevir Phase 3 Second wave
ABT450/r Phase 3 Second wave
Sovaprevir Clinical hold Second wave
Vedroprevir Phase 2 Second wave
IDX-320 Phase 2 Second wave
Vaniprevir Phase 3 (Japan) Second wave
Danoprevir Phase 2 Second wave
MK-5172 Phase 3 Second generation
ACH-2684 Phase 2 Second generation
Inhibiteurs de Protéase
Pawlotsky JM., Gastroenterology 2014;146(5):1176-92.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• Protéine essentielle à la formation des complexes de réplication
• Phosphoprotéine régulée par PI4KIII alpha (enzyme localisé au niveau du RE)– P56 et p58 (forme hyperphosphoryléee)
• Formée de 3 domaines
• Cible d’inhibiteurs spécifiques
Protéine NS5AHépatite C : Virus et Marqueurs
Reiss et al., PLoS Pathog. 2013 May;9(5):e1003359.
Protéine NS5AHépatite C : Virus et Marqueurs
RNA binding groove
Tellinghuisen et al., Nature 2005;435(7040):374-9.
Cycle Viral du VHC & Cibles des DAAsHépatite C : virus et marqueurs
Lange et al., EMBO Mol Med 2014;6(1):4-15.
Schinazi et al., Liver Int 2014;34 Suppl 1:69-78.
Caractéristiques des anti-NS5A
DAA
PI 1st generation
PI 2nd generation
NS5A Inh. 1st generation
NS5A Inh. 2nd generation
NS5Bnucleos(t)ide
inh.
NS5B non nucleos(t)ide
inh.
Efficacy
Resistance profile
Pangenotypic efficacy
Adverse events
Drug-drug interaction
Good profile Average profile least favorable profile
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Daclatasvir Phase 3 First generation
Ledipasvir (GS-5885) Phase 3 First generation
Ombitasvir (ABT-267) Phase 3 First generation
ACH-2928 Phase 2 First generation
PPI-668 Phase 2 First generation
GSK 2336805 Phase 2 First generation
BMS 824393 Phase 2 First generation
Samatasvir Phase 2 First generation
AD4025 Phase 1b ?
MK-8742 Phase 2 Second generation
ACH-3102 Phase 2 Second generation
GS-5816 Phase 2 Second generation
Inhibiteurs de NS5A
Link et al,. J Med Chem. 2014;57(5):2033-46; Degoey et al., J Med Chem 2014;57(5):2047-57; Ivachtchenko et al., J Med Chem 2014 Sep 9. Pawlotsky JM., Gastroenterology 2014;146(5):1176-92.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Mécanismes d’Action des anti-NS5AHépatite C : Virus et Marqueurs
Eyre NS, Beard MR. Gastroenterology. 2014;147(5):959-62.
Lesburg et al., Nat struct Biol 1999, 6: 937-943; Bressanelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 13034-13039; Ago et al., Srructure Fold Des 1999, 7: 1417-1426.
Protéine NS5B: RdRpHépatite C : Virus et Marqueurs
Réplication
– Modèle du poliovirus. Virus à ARN monocaténaire de polarité positive
De Clercq., Nature Review Drug Discovery 2007; 6: 1001-18.
Réplication ViraleHépatite C : Virus et Marqueurs
Variabilité Génétique
• Erreurs au cours de la réplication– Fréquentes
. 10-4-10-5 mutations par nucléotide copié au cours de la réplication du VHC
– Spontanées– Au hasard
• Absence d’activité exonucléasique 3’⇒5’ ("proofreading")– Accumulation de mutations
• A l’origine de : – La diversification des types et des sous-types– La distribution en quasi-espèces
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Diversification des Génotypes
Smith et al., Hepatology 2014;59(1):318-27.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
4
1
5a
3
2
6
7a
Distribution des Génotypes
Manns and von Hahn., Nat Rev Drug Discov 2013;12(8):595-610.
Hépatite C : Virus et Structure
Répartition des Génotypes en France
61%9%
19%
9% 2%
Génotype 1 (n=961)
Génotype 5 (n=29)
Génotype 4 (n=144)
Génotype 2 (n=137)
Génotype 3 (n=293)
Génotypes6 (n=10)
0,6%
Brouard et al., J Hepatol 2009, 50(Supl. 1): S148 (abstract 390).
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Distribution en Quasi-espèceHépatite C : Virus et Marqueurs
Domingo E., Cell 1978, 13 (4):735-744.
Quasi-espèces
• Décrites pour la première fois en 1978 par Domingo et coll– Bactériophage Qβ
• Evolution Darwinienne– Génération de mutants compétition
avantages aux variants les plus “fit“
Domingo et al., Cell 1978;13(4):735-44; Domingo et al., Microbiol Mol Biol Rev 2012;76(2):159-216.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
“Last but not Least“Hépatite C : Virus et Marqueurs
Consequence of Genetic Bottleneck
Domingo et al., Microbiol Mol Biol Rev 2012;76(2):159-216.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Inhibitors of RdRp
Copyright © 2006 Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA
Site A (Thumb/fingertips)
Site B (Thumb)
Site C (Palm)
Site ActifSite D (Palm)
AA
BBCC
DD
EE
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Caractéristiques des anti-NS5B
Schinazi et al., Liver Int 2014;34 Suppl 1:69-78.
DAA
PI 1st generation
PI 2nd generation
NS5A Inh. 1st generation
NS5A Inh. 2nd generation
NS5Bnucleos(t)ide
inh.
NS5B non nucleos(t)ide
inh.
Efficacy
Resistance profile
Pangenotypic efficacy
Adverse events
Drug-drug interaction
Good profile Average profile least favorable profile
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Sofosbuvir Approved Nuc
VX-135 Partial clinical hold Nuc
Deleobuvir Phase 2 NNuc
BMS-791325 Phase 2 NNuc
TMC-647055 Phase 2 NNuc
Lomibuvir Phase 2 NNuc
GS-9669 Phase 2 NNuc
ABT-333 Phase 3 NNuc
ABT-072 Phase 2 NNuc
Setrobuvir Phase 2 NNuc
Inhibiteurs de NS5B
Pawlotsky et al., Seminars in Liver Disease, in press.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
0
1
2
3
4
5
6
7
-15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Days
HCV
RN
A (L
og IU
/mL)
TMA + + + + - - - - - - - - + +
LOQ (20 IU/mL)
MK-0608 at 1mg.kg-1 orally
- 4,6 - 4,1
wt S282R/T/I wt S282
Activité Antivirale du MK-0608Hépatite C : Virus et Marqueurs
Efficacité de la Combinaison Paritaprevir/r (ABT-450/r), Ombitasvir (ABT-267) et Dasabuvir (ABT-333) ±RBV
Population Treatment groups SVR12 rates (n/N)
PEARL-IIG1b
Treatment-exp.AbbVie regimen+RBV 12 wks
AbbVie regimen 12 wks97% (85/88)
100% (91/91)
PEARL-IIIG1b
Treatment-naïveAbbVie regimen+RBV 12 wks
AbbVie regimen 12 wks99% (209/210)99% (207/209)
PEARL-IVG1a
Treatment-naïveAbbVie regimen+RBV 12 wks
AbbVie regimen 12 wks97% (97/100)
90% (185/205)
TURQUOISE-IIG1
Treatment-naïve & -exp. with cirrhosis
AbbVie regimen+RBV 12 wksAbbVie regimen 24 wks
92% (191/208)96% (165/172)
SAPPHIRE-IG1
Treatment-naïveAbbVie regimen+RBV 12 wks 96% (455/473)
SAPPHIRE-IIG1
Treatment-exp.AbbVie regimen+RBV 12 wks 96% (286/297)
Andreone et al., Gastroenterology 2014 May 9; Ferenci et al., N Engl J Med 2014 May 22;370(21):1983-92; Poordad et al., N Engl J Med 2014;370(21):1973-82; Feld et al., N Engl J Med 2014;370(17):1594-603; Zeuzem et al., N Engl J Med 2014;370(17):1604-14.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Efficacité du SOF-LDV (FDC) ±RBV
Population Treatment groups SVR12 rates (n/N)
ION-1G1
Treatment-naive
SOF+LDV 12 wksSOF+LDV+RBV 12 wks
SOF+LDV 24 wksSOF+LDV+RBV 24 wks
99% (211/214)97% (211/217)98% (212/217)99% (215/217)
ION-2G1
Treatment experienced
SOF+LDV 12 wksSOF+LDV+RBV 12 wks
SOF+LDV 24 wksSOF+LDV+RBV 24 wks
94% (102/109)96% (107/111)99% (108/109)99% (110/111)
ION-3G1
Treatment-naive
SSOF+LDV 8 wksSOF+LDV+RBV 8 wks
SOF+LDV 12 wks
94% (202/215)93% (201/216)95% (206/216)
Afdhal et al., N Engl J Med 2014;370(20):1889-98; Afdhal et al., N Engl J Med 2014;370(16):1483-93; Kowdley et al. N Engl J Med 2014;370(20):1879-88.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
V. CYCLE VIRAL
Cycle Viral
deLemos & Chung., Trends Mol Med 2014;20(6):315-21.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
HCV Entry
Lindenbach & Rice. Nature Reviews Microbiology 2013;11, 688–700.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Réplication du VHC
• Mécanismes moléculaires encore mal connus
• Localisation cytoplasmique au sein de complexes de réplication (membranous web)– NS4B, NS5A, NS34A et NS5B (RdRp)– Association étroite avec des facteurs cellulaires
Hépatite C : Virus et Marqueurs
"Membranous Web"
Paul et al., J Virol 2013;87(19):10612-27.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Modèle de Réplication du VHC
• Selon modèle des virus à ARN ss polarité positive (exemple du PV)
Ding., Nature Reviews Immunolog, 2010; 10: 632-644.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Assemblage & Sécrétion du VHC
Lindenbach & Rice. Nature Reviews Microbiology 2013;11, 688–700.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Hépatite CStratégie Diagnostique & Suivi
Virologique
Stéphane Chevaliez
Centre National de Référencedes Hépatites Virales B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955Hôpital Henri Mondor
Université Paris-EstCréteil
Marqueurs indirects
Anticorps anti-VHC totaux
Marqueurs directs
Ag de capside (AgC)
ARN VHC
Génotype VHC
Profil de résistance
Marqueurs VirologiquesStratégie diagnostique & suivi virologique
Tests Sérologiques
• Détection of des anticorps anti-VHC par EIA de 3ème génération
• Tests “Combo”– Détection simultanée de l’AgC et des anticorps anti-VHC
• TROD (test rapide d’orientation diagnostique)
• Détection et quantification de l’antigène de capside (AgC)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détection des Anticorps Anti-VHC
• Diagnostic de l’infection par le VHC– Trousses commerciales– Faciles à utiliser, automatisées– A l’aide d’un test de 3ème génération
. ADVIA Centaur (Siemens)
. VITROS ECi (Ortho-Clinical Diagnostic)
. AXSYM HCV 3.0 (Abbott)
. Cobas Elecsys Modular HCV (Roche)
. INNOTEST HCV Ab IV (Innogenetics)
. Monolisa anti-HCV Plus version 2 (Bio-Rad)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Test “Combo“ (AgC/Anti-VHC)
• Diagnostic de l’infection par le VHC– Trousses commerciales (2 trousues disponibles)– Faciles à utiliser– Non automatisées– Diminution de la fenêtre sérologique d’environ
20-30 jours– Moins sensibles que les tests de 3ème génération
pour la détection des anticorps anti-VHC
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Tests rapides Disposant d’un Marquage CE/IVD ou OMS pour la Détection des Ab anti-VHC
Oraquick® HCV
Toyo® HCV
Labmen® HCV
Multisure HCV
Signal HCV v2.0
HCV TriDot 4th
Manufacturer Orasure Turklab Turklab MP Diagnostics
Span Diagnostics
J Mitra & Co
Specimen type
oral fluid,whole blood, serum, plasma
whole blood, serum, plasma
whole blood, serum, plasma
whole blood, serum, plasma
serum, plasma
serum, plasma
Volume required (µL)
40 (oral fluid)20
30 10 25 100One drop (35 µL)
Time to read (min)
20 15 15 15 10 3
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Tests rapides “en cours de Marquage CE/IVD“ pour la Détection des Ab anti-VHC
Assure® HCVFirst Response®
HCV
Manufacturer MP DiagnosticsPremier Medical Corporation Ltd
Specimen typewhole blood, serum, plasma
whole blood,serum, plasma
Volume required (µL) 50 One drop (35 µL)
Time to read (min) 15 20
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Performances des Tests rapides pour la Détection des Ab anti-VHC
Spécificité Sensibilité VPP VPN
Sang total capillaire
OraQuick® HCV Rapid Ab Test
100% 99,4% 100% 98,4%
TOYO® anti-HCV test 98,2% 96,2% 99,0% 93,1%
Labmen® HCV test 100% 62,7% 100% 49,6%
Liquide craviculaire
OraQuick® HCV Rapid Ab Test
100% 98,2% 100% 96,6%
Chevaliez S, et al., article soumis.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Performances des Tests rapides pour la Détection des Ab anti-VHC
Spécificité Sensibilité VPP VPN
Sang total veineux
OraQuick® HCV Rapid Ab Test
100 98,7 100 98,1
Assure® anti-HCV 100 94,9 100 93,0
First Response HCV 100 96,2 100 94,6
Multisure HCV 100 96,2 100 94,6
Chevaliez S, et al., unpublished results.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Antigène de Capside : un Marqueur de la Réplication
0 2 4 6 80
2
4
6
8
HCVRNAlevelm2000 (LogIU/mL)
HCV
coreAglevel(Logfmol/L)
r=0.89;p<0.0001
0 2 4 6 80
2
4
6
8
HCVRNAlevel CAP/CTM v2.0 (LogIU/mL)
HCV
coreAglevel(Logfmol/L)
r=0.88;p<0.0001
Chevaliez et al., J Clin Virol. 2014;61(1):145-8.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Antigène de Capside en Fonction des Génotypes
Chevaliez et al., J Clin Virol. 2014;61(1):145-8.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Quantification de l’AgC à partir de Sang Total Déposé sur DBS
Stratégie diagnostique & suivi virologique
0 2 4 60
2
4
6
Core antigen level in serum withthe Architect HCV Ag assay (Log fmol/L)
Co
re a
nti
ge
n le
ve
l in
wh
ole
blo
od
fro
m D
BS
wit
h t
he
Arc
hit
ec
t H
CV
Ag
as
sa
y (
Lo
g f
mo
l/L)
r=0.56; p<0.0001
0 1 2 3 40
1
2
3
4
Mean of HCV core antigen level in serum and whole blood from DBS (Log fmol/L)
Dif
fre
nc
e b
etw
ee
n s
eru
m a
nd
wh
ole
blo
od
fro
m D
BS
(L
og
fm
ol/L
)
2.46
1.66
3.26
0 2 4 60
2
4
6
Core antigen level in serum withthe Architect HCV Ag assay (Log fmol/L)
Co
re a
nti
ge
n le
ve
l in
wh
ole
blo
od
fro
m D
BS
wit
h t
he
Arc
hit
ect
HC
V A
g a
ss
ay
(L
og
fm
ol/L
)
r=0.56; p<0.0001
0 1 2 3 40
1
2
3
4
Mean of HCV core antigen level in serum and whole blood from DBS (Log fmol/L)
Dif
fre
nc
e b
etw
ee
n s
eru
m a
nd
wh
ole
blo
od
fro
m D
BS
(L
og
fm
ol/L
)
2.46
1.66
3.26
Quantification de l’AgC à partir de Sang Total Déposé sur DBS
Stratégie diagnostique & suivi virologique
0 2 4 6 80
2
4
6
8
HCV RNA level in whole bloodfrom DBS with m2000 (Log IU/mL)
HC
V c
ore
Ag
lev
el in
wh
ole
blo
od
fro
m D
BS
(L
og
fm
ol/L
) r=0.65; p<0.0001
0 2 4 6 80
2
4
6
8
HC
V c
ore
Ag
leve
l in
wh
ole
blo
od
fro
m D
BS
(L
og
fm
ol/L
)
HCV RNA level in whole bloodfrom DBS with CAP/CTM96 v2.0 (Log IU/mL)
r=0.66; p<0.0001
0 2 4 6 80
2
4
6
8
HCV RNA level in whole bloodfrom DBS with m2000 (Log IU/mL)
HC
V c
ore
Ag
lev
el in
wh
ole
blo
od
fro
m D
BS
(L
og
fm
ol/L
) r=0.65; p<0.0001
0 2 4 6 80
2
4
6
8
HC
V c
ore
Ag
leve
l in
wh
ole
blo
od
fro
m D
BS
(L
og
fm
ol/L
)HCV RNA level in whole blood
from DBS with CAP/CTM96 v2.0 (Log IU/mL)
r=0.66; p<0.0001
Intérêts Cliniques de la Quantification de l’AgC
• Diagnostic de l’infection– Trousses commerciales– Facile à utiliser, automatisé, peu coûteux (30% par
rapport à une charge virale VHC)
• Décision de traiter et suivi de l’efficacité des traitements antiviraux– Quantitatif– Alternative aux techniques de détection-quantification
de l’ARN du VHC
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Performances Analytiques de la Trousse Architect (Abbott)
• Spécificité– 99,2% à 100%
• Sensibilité – 3 fmol/L (i.e ~ 500 to 3 000 UI/mL d’ARN VHC)– Tous les génotypes (excepté génotype 2)
• Intervalle de quantification– 3 à 20 000 fmol/L (≤ 7,8 Log10 UI/mL d’ARN VHC)
• Stable à 37°C pendant 96 heures
Ross et al., J Clin Microbiol 2010, 48(4): 1161-8; Mederacke et al., J Clin Virol 2009, 46(3): 210-5; Miedouge et al., J Clin Virol 2010, 48(1):18-21.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Trousse Architect : Monitorage des Cinétiques Virales
RVR (G1b) RVS (G1b)
Rechuteur (G1b) Non-répondeur (G1a)
Ross et al., J Clin Microbiol 2010, 48(4): 1161-8.
Core Ag
RNA
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Performances de la Trousse Architect chez Différentes Populations
Mederacke et al., J Clin Virol. 2012 Feb;53(2):110-5.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Tests Moléculaires
Détermination du Génotype
Quel est le génotype du VHC ?
Détection de la résistanceDétection de la résistance
Quel type de VHC est présent ?
Est-ce que le VHC est présent et en quelle quantité ?
Tests Qualitatifs-Quantitatifs
Stratégie diagnostique & suivi virologique
- Identify active viral replication
- Make appropriate decisions. Shorten or extend treatment duration
. Stop treatment due to futility
Identify treatment failure and the emergence of resistance. Virological failure is associated with selection of viral
variants with reduced susceptibility to DAAs
Clinical Utility of HCV RNA Assays
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Requirements for HCV RNA Assays
• Real-time-based assays with– A low lower limit of detection– A broader range of linear quantification– Identical lower limits of detection (LLOD) and
quantification (LLOQ)
• Satisfactory analytical performance, regardless of the HCV genotype
Stratégie diagnostique & suivi virologique
10 102 103 104 107 108
Cobas AmplicorHCV Monitor v2.0
SuperQuant
LCx HCV RNAAssay
Versant HCV RNA3.0 (bDNA)
CTM HCV test v2.0 CTM HCV test v2.0 (Roche)(Roche)
RealTiRealTimme™ HCVe™ HCV(Abbott)(Abbott)
Artus HCV QS-RGQArtus HCV QS-RGQ(Qiagen)(Qiagen)
CAP/CTM HCV test, CAP/CTM HCV test, v2.0 (Roche)v2.0 (Roche)
Versant HCV RNAVersant HCV RNA1.0 (kPCR, Siemens)1.0 (kPCR, Siemens)
105 106
Chevaliez et al., Gastroenterology 2012;142(6):1303-1313.
Intervalles de QuantificationStratégie diagnostique & suivi virologique
Quantification de l’ARN VHC (CTM v1.0)
Adapted from Chevaliez et al., Hepatology 2007;46(1): 22-31.
HCV
RN
A le
vel i
n CA
P/CT
M v
1.0
(Log
10 IU
/mL)
HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA(Log10 IU/mL)
8
7
6
5
4
3876543 876543
Mean of HCV RNA levels in CAP/CTM v1.0 and bDNA (Log10IU/mL)
Diff
eren
ce b
etw
een
CAP/
CTM
v1.
0 an
d bD
NA
(Log
10 IU
I/m
L)
+1.5
+1.0
+0.5
0.0
-0.5
-1.5
-1.0
-0.15
+0.48
+1.11
Genotype 3 (n=29)
Genotype 2 (n=27)
Genotype 1 (n=29) Genotype 4 (n=30)
Genotype 6 (n=2)
Genotype 5 (n=9)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Impact de Substitutions Nucléotidiques sur la Quantification de l’ARN du VHC
Chevaliez et al., Hepatology 2009;50(5):1681.
WT G4 or WT G1A165T or G145AG145A+A165T
HCV
RN
A le
vels
(Log
10 IU
/mL)
5.76.1
6.4
4.0
6.06.7
4.3
5.96.3
<1.2
6.06.6
0
2
4
6
8
CTM v1.0 m2000RT bDNA
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Quantification de l’ARN VHC G4(CAP/CTM v2.0)
HCV
RN
A le
vel i
n CA
P/CT
M v
2.0
(Log
10 IU
/mL)
HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA (Log10 IU/mL)
8
7
6
5
4
3876543 876543
Mean of HCV RNA levels in CAP/CTM v1.0 and bDNA (Log10IU/mL)
Diff
eren
ce b
etw
een
CAP/
CTM
v1.
0 an
d bD
NA
(Log
10 IU
I/m
L)
+1.5
+1.0
+0.5
0.0
-0.5
-1.5
-1.0
+0.08
+0.35
+0.62
Genotype 4 (n=122)
Chevaliez et al., J Clin Microbiol 2013;51(4):1078-82.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Chevaliez et al., J Clin Microbiol, 2009,47(6):1726-32.
HCV RNA Quantification(m2000, Abbott)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 2 (n=21)
Genotype 1 (n=55) Genotype 4 (n=24)
Genotype 6 (n=3)
Genotype 5 (n=9)
876543
Mean of HCV RNA levels in m2000 and bDNA (Log10IU/mL)
Dif
fere
nce
betw
een
m20
00 a
nd b
DN
A (L
og10
IUI/
mL)
+1.5
+1.0
+0.5
0.0
-0.5
-1.5
-1.0
-0.06
+0.26
+0.58
HCV
RN
A le
vel i
n m
2000
(Log
10 IU
/mL)
HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA(Log10 IU/mL)
8
7
6
5
4
3876543
Stratégie diagnostique & suivi virologique
HCV RNA Level Assessment in the Era of DAA
• HCV RNA quantification should be regularly assessed before, during and after treatment
• HCV RNA quantification should be based on a real-time PCR (or TMA) assay– With results expressed in IU/mL– With identical LLOD and LLOQ, of the order of 10-15 IU/mL
• In a given patient, HCV RNA level monitoring must be performed with the same real-time assay
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Europe or FDA Approval for HCV RNA Quantification Tests
• Only 2 tests are approved by the FDA and in Europe for HCV RNA quantification in clinical practice– m2000 since May 2011– New version of CAP/CTM since March 2013
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Monitorage de l’Efficacité des Traitements avec DAA
Avant traitement
Au cours du traitement Après traitementFin de traitement
S2 S4 S10 S12 S24 S48 SVR12 SVR24
SOF/PR X X X
SMV/PR X X X Xa Xa
DCV/PR X X X X
SANS IFNb X X Xc Xc X XaFin de traitement en fonction si en échec d’un traitement antérieur et si oui le type de réponsebSOF+RBV; SOF+SMV±RBV; SOF+DCV±RBVcS12 ou S24 : fin de traitement selon la combinaison thérapeutique utilisée
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Génotypes
Smith et al., Hepatology 2014;59(1):318-27.
4
1
5a
3
2
6
7a
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du Génotype
• Méthodes moléculaires (genotyping)– Analyse de la séquence après séquençage direct– Hybridation inverse des produits d’amplification sur des
supports solides comportant des sondes génotype spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV, Innogenetics)
– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes génotype spécifique
• Méthodes sérologiques (“serotyping”)– ELISA compétitif
Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Arens et al., J Clin Virol 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.
• Méthodes moléculaires (genotyping)– Analyse de la séquence après séquençage direct– Hybridation inverse des produits d’amplification sur des
supports solides comportant des sondes génotype spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV, Innogenetics)
– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes génotype spécifique
• Méthodes sérologiques (“serotyping”)– ELISA compétitif
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du Génotype
Analyse Phylogénique après Séquençage Direct
Région NS5B (286 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningBootstraping : 1000 replicatesNJPlot
5aSA132aHCJ6
Patient 496aEUHK2 3aNLZ1
Patient 624aED431hFrSSD98
1h98CM13571h98CM1521
1cHCG91cSR0311cKhaja1
1aHCV11aHCVH
1aHCJ11jQC2
1jQC891kQC68
1kQC821eM4541N
1eCAM10781eQC172
1g13821g2152
1gEG0241lM5186N1l98CM1427
1l98CM14571fFR2Patient 59
Patient 46Patient 54Patient 2
Patient 28Patient 64Patient 16Patient 36
Patient 18Patient 17Patient 8
Patient 71bHCJ4
1bHCVBK1bHCP01
Patient 401iFR16
1iQC771iQC181Patient 48Patient 60Patient 52
Patient 261dFR17
1dHC1N161dBA107
1mGUI171mGUI11
1mGUI24
0.05
5999
96
34100
72
100
98
43
Génotype 2
Génotype 4
Génotype 3
Génotype 1
Génotype 6
Génotype 2Génotype 5
Génotype 1, sous-type b
Génotype 3, sous-type a
Génotype 1, sous-type i
Génotype 1, sous-type ?
100
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Versant® HCV Genotype 2.0 Assay (INNO-LiPA)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Résumé
• Détermination du génotype (sous-type) VHC– La détermination du génotype sur la seule
région 5’NC doit être proscrite– La 2nde génération de Line Probe Assay qui utilise
des sondes dirigées contre la région core en plus de la région 5’NC est la meilleure méthode permettant de distinguer les sous-types 1a et 1b
EASL CPG., J Hepatol. 2011 Aug;55(2):245-64.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêt de la Détermination du Sous-Type (1a vs 1b) ?
- Différence d’efficacité de la combinaison thérapeutique
- Profils de résistance différents en cas d’échec thérapeutique
- Influence sur la décision thérapeutique
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Impact du Sous-Type sur la Barrière Génétique à la Résistance aux IP
HCV-1a prototype ...PAGHAVGIFFRAAVCTRGVAKAVDFIP...HCV-1b prototype ...-S------------------------V-...
HCV-1a AGAAAA (R155K)AGAACA (R155T)
HCV-1b CGAAAA (R155K)CGAACA (R155T)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Résistance au SMV dans les Essais• 1254 patients G1 inclus dans les phases 2b/3
(C206,C208, C216, HPC3007)– 197/1254 (15,7%) étaient en échec
% patients with mutations at time of failure not achieving SVR
Emerging mutations at time of failure
Overall 91 (180/197)
GT1a* with Q80K 93 (49/53) 84% (41/49) R155K
12% (6/49) D168E
4% (2/49) Other
GT1a* without Q80K
97 (61/63) 41% (25/61) R155K
36% (22/61) R155K in combination with mutations at 80, 122 and/or 168
23 (14/61) Other
GT1b 86 (70/81) 60% (42/70) D168V
17% (12/70) D168A, E, H, T, A/V or E/V
22% (16/70) Other
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Impact du Sous-Type sur la Barrière Génétique à la Résistance aux anti-NS5A
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Gao et al., Nature 2010 6;465(7294):96-100.
SMV plus PegIFN/RBV: QUEST-1 − 24-48 Weeks in Treatment-naïve G1 patients
SMV group (n=261)
Placebo group (n=130)
Week 4
<25 IU/mL (RVR) 202/254 (80%) 15/127 (12%)
<25 IU/mL 230/254 (91%) 25/127 (20%)
SVR12 210/264 (80%) 65/130 (50%)
Breakthrough 24 (9%) 44 (34%)
Relapse 21/234 (9%) 18/84 (21%)
41%With Q80K
60/146
59%Without Q80K
At baseline86/146 SVR12
31/60
Jacobson et al., Lancet 2014;384(9941):403-13.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Impact du Polymorphisme Q80K sur la Réponse au SMV plus SOF ± Ribavirin
Cohorte 1 : répondeurs nuls à la bithérapie pégylée F0-F2 (N=74)
Cohorte 2 : naïfs de traitement et répondeurs nuls à la bithérapie pégylée F3-F4 (N=40)
Lawitz et al., Lancet 2014;384(9956):1756-65.
24/27 31/31 17/17 25/26 38/40 18/18
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Le Génotype du VHC Détermine l’Approche du Traitement VHC
• Siméprevir uniquement chez les patients de génotypes 1 et 4– Excepté les patients de génotype 1a avec la mutation Q80K
• Importance de la ribavirine chez les patients non cirrhotiques de génotype 1a avec la combinaison “3D“ Abbvie
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêt de la Détermination des Profils de Résistance ?
• Pas d’intérêt à la détermination systématique avant traitement des patients naïfs de traitement et en échec d’un traitement par bithérapie pégylée car taux de RVS élevés
• Pas d’intérêt à la détermination au moment de l’échec car la plupart des patients abritent des variants résistants
Hépatite C : Résistance au traitement
Intérêt de la Détermination des Profils de Résistance ?
• Intérêt à la détermination chez les patients en échec d’un traitement contenant un ou plusieurs DAA avant retraitement– Importance des études observationnelles
longitudinales
Hépatite C : Résistance au traitement