Respuesta Inmune Innata

Avances Recientes en elConocimiento

PÉPTIDOS NATURALESANTIMICROBIANOSEscudo esencial de la

Respuesta Inmune Innata

7 de Febrero de 2007

Burnet & Medawar

Bretscher & Cohn

Lafferty & Cunninham

Janeway / Swchartz & Jenkins

Matzinger

The Danger Model: A Renewed Sense of Self. Polly Matzinger. Science. 296: 301-305. 2002.

Immunity and the Invertebrates. Gregory Beck and Gail S. Habicht. Scientific American November 1996.

INMUNIDAD INNATA

¿Respuesta Primitiva?

Ha Tenido Más Tiempo Para Evolucionar

Respuesta Inducible, Rápida y Vigorosa

Refinada, Compleja,

Más Importante Para la Sobreviviencia

La Vida Es Posible Sin RIA

Pero No Es Posible Sin La RIIThe Toll-Like Receptors as the Primary Sensors of the Immune System. Bruce Beutler. The Immunologist 8/6 2000.

The Danger Model: A Renewed Sense of Self. Polly Matzinger. Science. 296: 301-305. 2002.

NATURE REVIEWS | IMMUNOLOGY. 6 | NOVEMBER 2006 | 849-851. 2006

The Toll-Like Receptors as the Prymary Sensors of The Immune System. Bruce Beutler. The Immunologist. 8/6. 123-130. 2000

Capa 1Capa 1Intertegumento (epitelio queratinizado)

Capa 2Capa 2Peptidos Antimicrobianos

Capa 3Capa 3Células Defensivas Especializadas

Hospedero

Histiocito

MonocitoGranulocito

kuppfer

NKMicroglia

TOLL-LIKE RECEPTORS. Kiyoshi Takeda, Tsuneyasu Kaisho and Shizuo Akira. Annu. Rev. Immunol: 21:335–76. 2003.


Science. 291. 1544-1547. 2001..

Induction of Direct Antimicrobial ActivityThrough Mammalian Toll-Like Receptors

Sybille Thoma-Uszynski,1* Steffen Stenger,2* Osamu Takeuchi,3 Maria Teresa Ochoa,1 Matthias Engele,2 Peter A. Sieling,1 Peter F.Barnes,4 Martin Röllinghoff,2 Pal L. Bölcskei,5 Manfred Wagner,5 Shizuo Akira,3 Michael V. Norgard,6 John T. Belisle,7 Paul J.

Godowski,8 Barry R. Bloom,9 Robert L. Modlin1

Transcription of genes encoding antimicrobial proteins (1-3)

Transcription of genes that regulate the adaptive response,including cytokines and costimulatory molecules (4-10)

1. B. Lemaitre, E. Nicolas, L. Michaut, J. M. Reichhart, J. A. Hoffmann, Cell 86, 973 (1996) .2. B. Lemaitre, J. M. Reichhart, J. A. Hoffmann, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14614 (1997) .3. J. A. Hoffmann, F. C. Kafatos, C. A. Janeway, R. A. B. Ezekowitz, Science 284, 1313 (1999).4. R. Medzhitov, P. Preston-Hurlburt, C. A. Janeway, Nature 388, 394 (1997).5. R. B. Yang, et al., Nature 395, 284 (1998) .6. C. J. Kirschning, H. Wesche, T. M. Ayres, M. Rothe, J. Exp. Med. 188, 2091 (1998)7. A. Poltorak, et al., Science 282, 2085 (1998).8. H. D. Brightbill, et al., Science 285, 732 (1999) .9. A. O. Aliprantis, et al., Science 285, 736 (1999).10. D. M. Underhill, et al., Nature 401, 811 (1999)


Fungicida34 residuos. Forma alfa héliceanfipática

Phyllomedusa sauvagiiDermaseptina

Antibacteriana, hemolítica27-34 residuos.D-isoleucina. No forma héliceanftipáticasí.

Especies de Bombina yRana

Bombinina H3-H5

G+ y G – Protozoarios

y Hongos

23 residuosPiel y estómago deXenopus

Magaininas

PGLa

Hemolítica. E. coliFALL-3947 residuos. Péptido FALL-39expresado en médula ósea ytestículos

Semen de toroSeminalplasmina

Antibacteriana y hemolíticasimilar a cecropina y toxinamelittina del veneno de abeja

Cerratitis capitataCeratotoxinas

Antibacteriana y hemolíticaligado al cluster dececropina

péptidos de doble hélice con32 residuos

DrosophilaAndropinas

Bact. G- : S. typhimurium,Acinetobacter calcoaceticus, P.aeruginosa.

Bact. G+: Bacillus megaterium.

No tóxico a hongos y otroseucariontes

Genes de cecropina,controlados por el factor detranscripción Cif

35-39 AA, 2 hélices anfipáticas

Residuos conservados: Trp,Lis y Argl

Drosophila

Cerdo

Bombyx

Cecropia

Sarcophaga

Cecropinas I, A, B, D, P1

ACT. ANTIMICROBIANAGENESTRUCTURAORIGENNOMBRE

PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOSGRUPO I

lineales, helicoidales, sin Cis, con o sin bisagra

Afectan células en crecimiento.Bloqueo de transcripción ompen superificie bacteriana

Proteínas 14-20 kDa. Ricos enprolina y glicina

InsectosAtacinas y gloverinas

7-8 kDa, glicina 12%, prolina10%

EscarabajoColeoptericina

Holotricina 2

E. coli, S. aureus13 residuos y 5 son Triftofano.Neutrófilos de bovinoIndolicidina

Gram - al bloquear la síntesisde DNA

39 residuos, rico en prolina yarginina

Intestino porcino, síntesis enmédula ósea

PR-39

Gram -43-59 residuos, prolina 45-49% y 24-29 % arginina

Neutrófilos de bovino

Precursores fam. catelicidina

Bac 5

Bac 7

19 residuos, ricos en prolinaDrosophilaDrosocina

Inducida por infeccionesbacterianas en la abeja.

Contra Gram -

18 residuos de longitud

34 residuos, prolina 29%

93 residuos, glicina 18%

51 residuos, 6 medias cistinas

Miel de abejaApidecinas

AbaecinaHymenoptaecina

Defensina

ACT. ANTIMICROBIANAESTRUCTURAORIGENNOMBRE

PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOSGRUPO II

lineales, sin Cis, con o sin alta proporción de ciertos residuos

G + y G -Similar a polimixina

20 aa

RanaRanalexina

E. coli, S. aureus, P.aeruginosa, hongos

7 residuos forman una asaen el extremo C y una colalarga

Rana esculentaEsculentina

Antibióticos potentes

Brevinina 2: hemolíticofuerte

7 residuos forman una asaen el extremo C y una colalarga

Piel de rana:

Rana japonesa

Rana europea

Brevinina 1

Brevinina 2

Brevinina 1E

Brevinina 2E

E. coli, S. aureus,toxicidad vs célulasneuronales y gliales

12 residuos, 4 sonarginina

Neutrófilos bovinosBactenecina


PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOSGRUPO III

antibacterianos, con un puente disulfuro

lisis baterias.E. hystolyticaAmibaporos

Semejante a β defensinasNeutrófilos de pollosGalanicinas

Inducidas comorespuesta a infecc.bacteriana. Gram +

No fungicidas

Semejante a α defensinasPhormia sarcophaga, nocontenidos en fagocitos

Defensinas deinsectos

Algunas bacterias,antitumoral, no lisaeritrocitos.

78 residuos. Similares aproteína 519 y NK65 enhumano.

Intestino porcinoNK lisina

Cromosoma 8en humanos yratones

GEN

En gránulos- fusión confagosomas de contenidomicrobiano

En gránulos

ALMACENAMIENTO yLIBERACIÓN

Se inactiva con ionesen moco traqueal –fibrosis quística

38 – 42 residuos.En hojaβ. Familia de 13 diferentesdefensinas

Neutrófilos de bovino

Células epiteliales

Células Paneth-ratón

β defensinas

6 cistrinas unidasFagocitos de humano, conejo,rata y cobayos, tráquea bovina(TAP)

α defensinas

Citotóxica, lítica, antibact.G+ y G-. Fungicida porconcentración decationes divalentes

3 puentes S-S-, 29-34 aa,ricos en cisteina y arginina(no Lisina). Preproteínasde 95 residuos

PMN de conejo, fagocitos demamíferos y humanos, célulasde Paneth (criptidinas) deratones

Defensinas


PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOSGRUPO IV

con dos o más puentes disulfuro, con Cis, estructura en hoja beta

3.1 kDaLeche maternaLactoferricinas*

G -Secuencia presente enpreproencefalina A

KRFAE

AntibacterianaLineales, sin cisteina.3910

Desplaza el inhibidor deunión al diazepam delreceptor GABA en cerebro

Lineales, sin cisteina.

Secuencia idéntica a laproteína de unión al acil-CoA en hígado de rata.

32-86 residuos

Cerebro humano y bovinoDBI

Lineales, sin cisteina.

Hormona de 42 residuos,familia secretina/glucagon

GIP (polipéptido gástricoinhibitorio)

ACTIVIDADGENESTRUCTURAORIGENNOMBRE

PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOSGRUPO V

antibacterianos, derivados de grandes polipéptidos con otras funciones

A

C

B ionslipids

++ + + + +

+

_ _ _ _ _ _ _

Volume 2 No 12 - December 2001 ArticlesNature Immunology 2, 1133 - 1137 (2001)doi:10.1038/ni732Published online: 5 November 2001© Nature America, Inc.

Dermcidin: a novel human antibioticpeptide secreted by sweat glands

Birgit Schittek1, Rainer Hipfel1, Birgit Sauer1, Jürgen Bauer1, Hubert Kalbacher2, StefanStevanovic3, Markus Schirle4, Kristina Schroeder5, Nikolaus Blin5, Friedegund Meier1,

Gernot Rassner1 & Claus Garbe11 Department of Dermatology, Eberhard-Karls-University Tübingen, Germany.

2 Medical and Natural Sciences Research Center, Eberhard-Karls-University Tübingen, Germany.3 Institute for Cell Biology, Department of Immunology, University of Tübingen, Tübingen, Germany.

4 Institute for Cell Biology, Department of Molecular Biology, University of Tübingen, Tübingen, Germany.5 Institute of Anthropology and Human Genetics, Eberhard-Karls-University Tübingen, Germany.

Correspondence should be addressed to B Schittek [email protected]

CONACyT / SIMORELOSConvocatoria 2000

Proyecto No 20000302014

Aislamiento y Purificación de Péptidos Naturales Antimicrobianos dela Piel de la Rana Catesbeiana

Para su Aplicación Como Nuevos Antibióticos en el Tratamiento deEnfermedades Infecciosas Bacterianas y Micóticas

DIRECTOR: DR. ALFONSO E ISLAS RODRÍGUEZ

OBJETIVO GENERAL

Aislar, purificar y probar péptidos naturales antimicrobianosde la piel de la Rana catesbeiana y utilizarlos como nuevos

antibióticos.

PEPTIDOS NATURALES ANTIMICROBIANOS

TEJIDO AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN

LPLC

BIOENSAYOS In vitro, In Vivo

IEF, E2D, MASASWESTERN BLOTIEF, E2D

SECUENCIA Y SINTESIS

CARACTERIZACIÓNPAGE SDS


TEJIDO 2 pieles (40 g.) trozos pequeños

10 volúmenes 60% Acetonitrilo N2 líquido, trituración 1% TFA

39% H20 bidestilada

Agitar Centrifugar a 13000 rpm Liofilizar 4°C x 24 hrs 4°C x 30 min sobrenadante


Resuspender 10 ml de TFA 0.1% Centrifugar liofilizado 1X104 rpm 2 min

Sobrenadante Bradford

LPLC

Colecta 150 fracciones

Medir D. O. 280 nm Liofilizar


Bioensayos in vitro

Incubar cepas Resuspender fracciónCaldo de soya tripticasa (ST) 4 ml Tris-SAF (neutralizar) 18 hrs a 37°C

Esterilizar Dilución 1:10 Caldo de ST Placa de 96 pozos Diluciones

seriadas

Medir D.O. 620 nm Controles Incubar 2 hrs. 37 °C Bacitracina, SAF

Calcular UFC 1X103 UFC x pozo Plaquear Incubar 4 hrs Conteo de UFC


Determinación de UFC

Incubar cepas Caldo de ST 24 hrs a 37°C

Dilución 1:1000 Caldo de ST

Medir D.O. 620 nm cada 15 min, plaquear


Preparación muestras Preparar gel(Desnaturalizar) poliacrilamida

Cargar muestras y marcadores

Corrimiento 100V

Tinción Azul Coomassie Ag NO3

CARACTERIZACIÓNPAGE- SDS


PAGE-SDS Transferencia Bloquear sin teñir Membrana Nitrocelulosa Membrana

0.4 ampers toda la noche ASB 3%

Ac Secundario Ac primario Anti-rabbit/HRP rabbit Anti-HDEFA1

Agregar TMB Desarrollo color

WESTERN BLOT

Figure 4-45. Two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis. All the proteins in an E. colibacterial cell are separated in this gel, in which each spot corresponds to a different polypeptide chain.The proteins were first separated according to their isoelectric points by isoelectric focusing from leftto right. They were then further fractionated according to their molecular weights by electrophoresisfrom top to bottom in the presence of SDS. Note that different proteins are present invery different

amounts. The bacteria were fed with a mixture of radioisotope-labeled amino acids so that all of theirproteins were radioactive and could be readily detected by auto-radiography (see p. 180). (Courtesy of

Patrick O'Farrell.)


E2D MASAS

SECUENCIA Y SINTESIS

R E S U L T A D O S

FRACCIÓN

1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

CARACTERIZACIÓN EN GELES DE POLIACRILAMIDA PAGE-SDS

202KD

133KD

71 KD

41 KD

30 KD

17 KD

7 KD

Fracción 85 vs. E. coli 31/Oct/03

0

50

100

150

200

250

1 2 3 4 5 6 7 8 BAC TB SolaDiluciones/Controles

UFC

UFC

Fracción 101 vs. E. coli 31/Oct/03

020406080

100120


UFC

UFC

Fracción 60 vs. S. aureus31/Oct/03

02468

10


UFC

UFC

Fracción 75 vs. S. aureus 31/Oct/03

0

2

4

6

8

10


UFC

UFC

Fracción 80 vs. C. albicans01/Sep/03

050

100150200250300350400

1 2 3 4 5 6 7 8 TB SolaDiluciones/Controles

UFC

UFC

Fracción 88 vs. C. albicans 01/Sep/03

050

100150200250300350400

1 2 3 4 5 6 7 8 TB SolaDiluciones/Controles

UFC

UFC

E.T. Concentrado vs E. coli 20/Jul io/04

020406080

100120

1 2 3 4 5 6 7 BAC TBDiluciones/Controles

UFC UFC

E.T. Concentrado vs. S.aureus 22/Julio/04

0

2

4

6

8

10

1 2 3 4 5 6 7 BAC TB SolaDilusiones/Controles

UFC

UFC

Ranamicina vs. C.albicans 22/Julio/04

0

10

20

30

40

50

1 2 3 4 5 6 7 TB SolaDiluciones/Controles

UFC

UFC

INFORME TÉCNICO POR ETAPAClave de Registro / CLAVE: AVANCE–C2005 86

PROTOCOLO

Ultima ronda de prototipos y pruebas finales para laproducción de Péptidos Naturales Antimicrobianos de la piel

de la Rana catesbeiana, para su aplicación como nuevosantibióticos en el tratamiento de enfermedades infecciosas

bacterianas y micóticas

Informe Etapa 1Periodo del 1 de Junio al 30 de Septiembre de 2006

Responsable Técnico del proyecto: Dr. Alfonso Enrique Islas RodríguezSujeto de Apoyo (Institución o Empresa) Laboratorios LAVET SA de CV

Cepas (Dermatológicas) Antibióticos

Staphylococcus epidermidis Ac. Fucídico (crema)Silvadene, Argentafil (crema)

Staphylococcus aureus(resistente a meticilina)

Silvadene, Argentafil (crema)

Streptococcus sp. Silvadene, Argentafil (crema)

Propionibacterium acnes Eritromicina (suspension)Clindamicina (cápsulas)

Mupirocin (crema)

Tricophyton rubrum Ketoconazol (tabletas)Lamisil, Xilatril (crema)

Ranamicina vs. S. epidermidis 08/Feb/05

- 505

101520253035

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Concentración de proteínas totales en la Ranamicina y Controles

UFC

(µg/ ml)

256 128 64 32 16 8 4 2 T-PBS SOL BC AF

Controles: T-PBS (Tris-PBS), SOL (bacteria sola), BC (Bacitracina), AF(Ácido Fucídico).

Ranamicina vs. S. aureus 08/Feb/05

- 505

101520253035

1

Concentración de proteínas totales en la Ranamicina y Controles

UFC

256 128 64 32 16 8 4 2 T-PBS SOL BC AF

(µg/ ml)

S. aureus es resistente a meticilina. Controles: T-PBS (Tris-PBS), SOL(bacteria sola), BC (Bacitracina), AF (Ácido Fucídico).

a b

c d

Cepas (Mastitis) Antibióticos

Streptococcus disgalactea

Streptococcus agalactea

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Enterobacter

Klebsiella

Neomastil Especial

Lincocin Forte

Mastigen

Mastex

Mastofin AZ

Ubricina

Mastobac LA

Secador Loeffler

Ranamicina vs. E. coli 16/Feb/05

- 505

1015202530

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Concentración de proteínas totales en la ranamicina y Controles

UFC

256 128 64 32 16 8 4 2 T-PBS SOL BC MTX MTG

Controles: T-PBS (Tris-PBS), SOL (bacteria sola), BC (Bacitracina),MTX (Mastex), MTG (Mastigen-E).

(µg/ ml)

Ranamicina vs. Klebsiella pneumoniae 16/Feb/05

0102030405060

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Concentración de proteínas totales en la ranamicina

y Controles

UFC

(µg/ ml)

256 128 64 32 16 8 4 2 TPBS SOL BC MTX MTG

S. aureus es resistente a meticilina. Controles: TPBS (Tris-PBS), SOL(bacteria sola), BC (Bacitracina), MTX (Mastex), MTG (Mastigen-E).

Ranamicina vs. S. agalactea

Ranamicina vs. E. coli

N0, corresponde a ausencia de mastitis, N1 subclínica tipo 1, N2 subclínica tipo 2, N3 subclínica tipo 3, L clínica leve,Lc clínica leve crónica, M clínica moderada, Mc clínica moderada crónica, S clínica severa, Sc clínica severa crónic

CMT.- California Mastitis Test, nivel 0, 1, 2 y 3 se asocian a ausencia de enfermedad clínica.

CMT.- California Mastitis Test, nivel 0, 1, 2 y 3 se asocian a ausencia de enfermedad clínica.

1.- Gel de Policrilamida al 15 % realizado el 24 de Agosto de 2006.- Se puede observar; en el carril 1marcadores de peso molecular, en los carriles 2 y 3 muestra de ranamicina (PS) elaborada el 19 de Julio de 2006,

cariles 4 y 5 PS del 19 de Junio, 6 y 7 ranamicina del 1 de Marzo de 2006.

2.- Gel de Policrilamida al 18 % realizado el 25 de Septiembre de 2006.- Se puede observar; en el carril 1marcadores de peso molecular en los carriles 2, 3 muestra de ranamicina (PS) elaborada el 23 de Enero de 2006,

cariles 4 y 5, PS del 17 de Febrero, 6 y 7 ranamicina del 29 de Mayo de 2006., carriles 8 y 9 del 6 de Junio y carril10 PS del 19 de Julio de 2006.

Ciclodextrinas

Nanotubo

Forma Farmaceutica Estable:Ungüento

CremaGotas

NOMBRE DE COMPAÑÍA NOMBRE DEL PEPTIDO ENFERMEDAD A TRATAR YDESARROLLO CLÍNICO

Magainin Pharmaceuticals Inc (PA, USA) Pexiganan Ulceras infectadas de pie diabético (faseIII, uso local) .

Micrologix Biotech Inc. (Vancouver, Canada) MBI-594AN Acné (fase III, uso local ), terminada. MBI-226 Sepsis causada por catéteres (fase III, usolocal) .

Intrabiotics (Mountain View, CA, USA) Iseganan Mucositis (fase II, uso topico-oral (fallido) (IB-367; protegerina)

Intrabiotics (Mountain View, CA, USA) Iseganan Infecciones pulmonares en fibrosis Quística (fase II, uso local inhalativo). (IB-367; protegerina)

Xoma Corp. (Berkeley, CA, USA) Neuprex Meningitis (fase III, uso sistémico) .

Demegen (Pittsburg, PA, USA) P-113 (análogo de histatina) Candidiasis oral, mucositis (fase II, usooral) D2AD21 Heridas de quemaduras, heridas infectadas(fase I uso local) .

Cubist Pharmaceutical (Lexington, MA, USA) Daptomicina Sepsis (fase III)

AM (Pharma, Bilthoven, Holanda) Lactoferricina-B Antimicótico (fase preclínica, usosistémico)

Entomed (Illkirch, Francia) Heliomicina Antibacteriano (fase preclínica, usosistémco)

Trimeris (Durham, NC, USA) Enfuvirtide Antiviral (HIV) (fase III completada)


DR. ALFONSO E ISLAS RODRÍGUEZDRA. ROSARIO HUIZAR LÓPEZ

BIOLOGO RODOLFO VILLARRUEL FRANCOBIOLOGA LUZ ALEJANDRA GARCÍA MADRID

BIOLOGA YERUSA MIROSLAVA MERCADO GARCÍABIOLOGO TEXCA MENDEZ

PASANTE ALFONSO EDGARDO ISLAS FIGUEROAESTUDIANTE JESÚS GUERRERO RODRÍGUEZ

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA

Education

Respuesta Inmune Innata