Entendiendo la deconstrucción de celulosa desde una perspectiva molecular y de proceso

Monica Santa-Maria

Cultivo para bioenergía

Célula vegetal

Pared celular vegetal

LigninaHemicelulosaCelulosa

Microfibrade Celulosa Monica Santa-Maria

Tina Jeoh

Biological and Agricultural Engineering Department

aCelulosade Celulosa

Moléculas de azúcar

Glucosa The evolutionary road to biofuels, JBEI (http://www.lbl.gov/Publications/YOS/Feb/)

Biocombustiblescombustibles líquidos renovables

• Alternativa sostenible a combustibles fósiles

• Biocombustibles de 1a

generación: cultivos de azúcar y almidón

Energía solar + CO2

pre-procesamiento

cosecha

biomasa

• Biocombustibles de siguiente

generación: biomasa celulósica(residuos agrícolas y forestales, desechos municipales sólidos, cultivos para energía)

– Materia prima más barata y abundante

http://www.jgi.doe.gov/education/bioenergy/co2cycle.jpg

CO2

CO2

CO2Biocombustiblesazúcares

Microbios fermentan azúcares hacia etanol

Enzymas rompen celulosa hacia azúcares

celulosa

pre-procesamiento

Biocombustibles de biomasa celulósica

• COSTO

– Conversión de polisacáridos estructurales a azúcares fermentables

– Costo de la enzima

• Se requieren mejoras en:

La compleja y heterogénea estructura de las lignocelulosas limita el acceso a enzimas y químicos

Limitante para su utilización masiva:

• Se requieren mejoras en:

– La enzima

– El proceso

Necesitamos entender la deconstrucción de biomasa a nivel molecular para optimizar enzimas y procesos

Pared cellular primaria tipo II (Carpita et al., 1993)

Hidrólisis enzimática de la celulosa

Reacción compleja y heterogénea con diferentes actividades enzimáticas que actúan sinérgicamente

Mecanismo de hidrólisis enzimática de lacelulosa

E + Sk−1

k+1

↔ES

k2

→E + αP

d[E]

dt= −k1 E[ ] S[ ]+ k−1 ES[ ]+ k2[ES]

d[S] = −k E[ ] S[ ]+ k ES[ ]

Hidrólisis de PASC por T. reesei Cel7A

d[S]

dt= −k1 E[ ] S[ ]+ k−1 ES[ ]

d[ES]

dt= k1 E[ ] S[ ]− k−1 ES[ ]− k2[ES]

d[P]

dt= k2[ES]

Reto: Definir “S” y medir [S]

Factores que impactan la actividad enzimática

• Acceso a sitios reactivos

– Topografía de la superficie

La velocidad de reacción disminuye prematuramente. ¿Posibles causas?

• Cristalinidad de la celulosa

• Grado de polimerización

• Sinergía enzimática

• Cambios en el sustrato durante la reacción

Impedimento stérico entre enzima unida productiva y no-productivamente como posible mecanismo de disminución de la velocidad de reacción (Väljamäe et al. 1998)

Estrategia: Monitorear cambios en el sustrato durante las reacciones enzimáticas

Solución tampón

Microfibras de celulosaMicroscopía de fuerza atómica (MFA)

Enzimas

Donde en la reacción se hicieron

Medimos azúcaresliberados

50nm

25

0

Área =10x10μm

Microscopía confocal láser cuantitativa

Donde en la reacción se hicieron

las observaciones?

Cuantificamos la enzima unida vía

intensidad de fluorescencia

Muestras de celulosa usadas en nuestros experimentos

Microfibra de celulosa, Cladophora sp

0.5x0.5 μm scan

20

0

5

10

15

nm

Cladophora aegagrophila 0.5x0.5 μm scan

1x1 μm scanImáges FESEM de células de A. xylinum incrustadas en y produciendo fibras de celulosa

Cladophora aegagrophila

Microfibra de celulosa bacteriana, Acetobacter xylinum

6

10

14 nm

-2

2

T. reesei Cel7A se agregó durante el scanning

Spectral Imaging Facility (http://neat.ucdavis.edu/pages/affiliate/ccoafm_main.htm)

Observaciones estructurales en microfibras de celulosa

0

10

20

30

40

50nm

Control sin digerir

Periodicidades topográficas observadas en microfibras de celulosa bacteriana

0

20

40

60

80nm

Agregados esféricos de celulosa observados en muestras de celulosa dispersada por sonicación

Celulosa de Cladophora sp

0

5x5 μm scan

20

0

5

10

15

nm

13.44% conversión con TrCel7A

1x1 μm scan

0

Celulosa de A. xylinum

1x1 μm scan 1x1 μm scan

1x1 μm scan 1x1 μm scan

0

20

40

60

80nm20

0

5

10

15

nm

M Santa-Maria and T Jeoh (2010) Biomacromolecules.11(8): 2000 - 2007

Cambios en la microestructura de la celulosa observados durante reacciones enzimáticas

20

0

5

10

15

nm

0

5

10

15

20

25nmReacciones en el MFA

Reacciones en lote

Cel

7A u

nida

(pm

oles

)

0

5

10

15

20

25nm

5.45.86.2

nm

Con

vers

ión

de c

ellu

losa

(%)

Tiempo (h)

Tiempo (h)

M Santa-Maria and T Jeoh (2010) Biomacromolecules.11(8): 2000 - 2007

Cambios en la microestructura de la celulosa observados durante reacciones enzimáticas

Reacciones en lote 20 min después de añadir TrCel7AReaccione

s en el MFA

Se necesita incorporar estas observaciones en modelos de mecanismo de reacción actuales

Cel

7A u

nida

(pm

oles

)

0

5

10

1520

25nm

13 h después de añadir TrCel7A

M Santa-Maria and T Jeoh (2010) Biomacromolecules.11(8): 2000 - 2007

Con

vers

ión

de c

ellu

losa

(%)

Tiempo (h)

Tiempo (h)

Hidrólisis de la celulosa en la naturaleza vs en un reactor

• En la naturaleza:– Mínima humedad

– Las enzimas son secretadas por hongos o bacterias en el punto de crecimiento

– Las mezclas sinérgicas de enzimas son secretadas en proporciones óptimas

Pila de compostaje

secretadas en proporciones óptimas

• En un reactor:– Las enzimas son adicionadas en

formulaciones líquidas

– Limitaciones de transferencia de masa

– Las enzimas tienen diferente afinidad y estabilidad

– Las mezclas no son óptimas en el lugar de reacción

SEM, superficie de una pila de compostajehttp://www.organicmattersmag.com/features/313-an-introduction-to-soil-biology-part-2-compost-and-compost-tea

Estrategia: Encapsular mezclas sinérgicas de enzimas

Secado por pulverización. Formulación de solución de enzimas: Patente pendiente

Enzimas (Novozymes Corp.):Celluclast ®, Novo 188 ®, NS 5003Proporción: 2:1:1.8 (v/v)

Propiedades de las partículas secadas por pulverización

Partículas secadas por pulverización conteniendo

mezclas sinérgicas de enzimas

�Enzima encapsulada �Enzima líquida

Alginatos sin entrecruzarAlginatos entrecruzados en la toberaAlginatos entrecruzados en la tobera, con enzimaAlginatos entrecruzados antes de la tobera

Vol

umen

(%)

Tamaño de partícula (µm)

La enzima encapsulada supera a la enzima líquida en sacarificaciones de biomasa

SDE: Enzima encapsulada (rojo), LE: Enzima líquida (azul)

4% sólidos 15% sólidos

‘Switchgrass’ pre-tratado:

Incubación, 50°C

Comentarios Finales

• Nivel molecular:

– La plataforma desarrollada permite investigar cambios en la microestructura de la celulosa durante la hidrólisis enzimática

– Las observaciones hechas se correlacionan con el grado de conversión de la celulosa

– Las observaciones hechas conducen a un mayor entendimiento – Las observaciones hechas conducen a un mayor entendimiento del proceso de deconstrucción de la celulosa

• Nivel de proceso:

– Sacarificación a escala de laboratorio

– Las enzimas encapsuladas superan a las enzimas líquidas

– Posibles causas: mejor distribución en el reactor, efecto protector

Jeoh Laboratory, Biological & Agricultural Engineering, UC Davis (October 2010)

Gracias por su atención¿Preguntas?