WHO Workshop on Laboratory Diagnosis of Diptheria
Balai Besar Laboratorium Kesehatan Surabaya 13 – 15 Juli 2011
Corynebacterium diphtheriae• Bakteri gram positif, batang lurus atau sedikit
bengkok, diujungnya membesar• Anaerob fakultatif• Sel-sel tersusun tunggal atau berpasangan,
sering membentuk formasi V, L atau palisade (spt huruf Cina )
• Non motil, spora negatif, granulametakromatik positif
Alur Diagnosa Laboratorium
Diphteria(WHO manual)
Media kultur yang digunakan
• Columbia blood agar plate• Tellurite blood agar plate ( CTBA ; Hoyle’s)• Media Tinsdale (tes cystinase) → screening test
Tes Biokimia• Reduksi nitrat (Rosco)• Hidrolisis Urea (Rosco)• Tes Pyrazinamidase (Rosco)• Fermentasi gula (Glukosa, Sukrosa, Maltosa, Starch) →
Hiss Serum Water Sugar• Tes Katalase• Biotyping (API CORYNE)
Tes Toxigenitas → Elek Test
Swab tenggorok ↓
Colombia blood agar plate + Hoyle’s agar plate(inkubasi 18 – 48 jam)
↓ CBA = abu2, kecil ↓ Hoyle’s = hitam, kering, kecil
Colombia blood agar + Hoyle’s agar plateDiambil 4 koloni tersangka
(inkubasi 18 – 48 jam) ↓ (koloni murni)
• Media Tinsdale (24 jam)• tes nitrat + tes urea + tes pyz (4 jam) → rapid test
• Hiis serum water sugar (24 jam)• tes biotyping (24 jam)• elek test (24 – 48 jam)
Colombia blood agar plate
Hoyle’s agar plate
Media Tinsdale (cystinase test)
Media Tinsdale (cystinase test)
NEGATIF POSITIFC. diphtheriae
C. ulceransC.
pseudotuberculosis
Tes Nitrat• Dibuat suspensi kuman Mc Farland No.8• Dipipet 0,25 ml suspensi kuman ke dalam tabung steril• Ditambahkan 1 tablet Rosco Nitrate Reduction
Diagnostic• Di inkubasi selama 4 jam pada suhu 37 derajat Celcius• Ditambahkan 1 tetes dimethylnaphthylamine solution +
1 tetes sulfanilic acid solution
Positif = merah/pinkNegatif = tidak berwarna
Tes Nitrat
Tes Urease• Dibuat suspensi kuman Mc Farland No.8• Dipipet 0,25 ml suspensi kuman ke dalam tabung
steril• Ditambahkan 1 tablet Rosco Urease Reduction
Diagnostic• Di inkubasi selama 4 jam pada suhu 37 derajat
Celcius
Positif = merah/unguNegatif = kuning/oranye
Tes Urease
Tes Pyrazinamidase
• Dipipet 0,25 ml aquades steril ke dalam tabung steril• Ditambahkan koloni kuman hingga tersuspensi (Mc
Farland No.8)• Ditambahkan 1 tablet PYZ• Di inkubasi selama 4 jam pada suhu 37 derajat
Celcius
Positif = merah/oranyeNegatif = tidak berwarna
Tes Pyrazinamidase
Hiss serum water sugar
API Coryne kit
Tes Negatif
Tes Positif
• Typical “gravis” 1010326
• Typical “mitis” 1010324
• Typical ”ulcerans” 0111326
BIOCHEMICAL IDENTIFICATION OF PATHOGENIC CORYNEBACTERIA
CYS
PYZ
Alkaline Phosphatase
Nitrate
Urease
Acid produced from Gelatin Liquification
Glucose
Ribose
Maltose
Sucrose
Glycogen
Trehalose
C. diphtheriae
Var gravis + - - + - + + + - + N/A N/A
Var mitis + - - + - + + + - - N/A N/A
Var intermedius + - - + - + + + - - N/A N/A
Var belfanti + - - - - + + + - - N/A N/A
C. ulcerans + - + - + + + + - + + + at 25OC
C. pseudotuberculosis + - + - + + + + - - - - at 25OC
C. pseudodiphtheriticum - + V + + - - - - - N/A N/A
C. xerosis - + + + - + + + + - N/A N/A
C. striatum - + + + - + V - V - N/A N/A
C. amycolatum - + + V V + V V V - N/A N/A
Elek test
Elek Test
NCTC 10648++
test
NCTC 10356-
NCTC 3984±
NCTC 10648++
test
NCTC 10356-
Modifikasi Elek test
Sample preparation • Pipet 0.5 ml aquades steril ke dalam sterile Eppendorf
tubes (tutup ulir/screw tube)• Masukan koloni dari media Colombia/Hoyle (lakukan
hal yang sama pada kontrol)• Tabung2 diletakan pada dry heating block dan
dipanaskan pd suhu 100 derajat Celcius selama 15 menit
• di sentrifuge dgn kecepatan tinggi (13000 rpm) slm 1 menit
PCR for the detection of diphtheria toxin
Persiapan PCR Reaction Mixture misalnya untuk 9 reaksi (6 template DNA, water control, internal positive control (IPC), plus 1 extra to allow for pipette
error).
• 1. 10 x Reaction buffer 45 l • 2. MgCl2 (1.5 mM) 18 l
• 3. Nucleotides:(10mM, containing, 9 l
dATP, dCTP, dGTP and dTTP) • 4. Taq polymerase 2.5 units 4.5 l
• 5. Primer 1 (15pmol/l) 9 l • 6. Primer 2 (15pmol/l) 9 l • 7. Water (PCR grade) 337.5 l
TOTAL 432 l Vortex the PCR reaction mixture and proceed to the second stage.
Masing2 tabung ditambahkan : a. PCR reaction mixture 48 l
b. Internal control 1 l-add to all tubes except water control
c. Crude DNA sample 1 l-add to all tubes except water control
d. Water 2 -add to water control only
*Masing2 tabung ditambahkan mineral oil *Sentrifuge selama beberapa detik dalam micro centrifuge
• Cycling times :1 cycle 96 derajat celcius 2 menit30 cycles 94 derajat celcius 15 detik
50 derajat celcius 15 detik
72 derajat celcius 30 detik1 cycle 72 derajat celcius 10 menit
Electrophoresis
• 20 µl produk + 4 µl loading dye• Sampel di elektroforesa pada 2 % agarose gel
dalam buffer Tris Borate EDTA pH 8 (150 v)• Gel diwarnai dengan Ethidium bromide dan di
lihat hasilnya pada UV transilluminator
• 1 Marker• 2-5 Test isolate • 6 Positive control• 7 Weak positive
control• 8 Negative control• 9 IPC control• 10 water control• 11 Marker
buffer Tris Borate EDTA pH 8
DR. ANDROULLA EFSTRATIOU
(Androu)
DR. ARUNI DE ZOYSA(RU)
SekianDan
Terima kasih
Recommended