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MULTIPLICACIÓN DE HONGOS MICORRIZICOS ARBUSCULARES

MA NATIVOS DE CULTIVO DE CACAO ( Theobroma cacao) EN

MAIZ (Zea mays) BAJO DISTINTOS TRATAMIENTOS

AGRONÓMICOS

LILIANA DAVILA ROCHA

CARLOS JULIO RAMOS FRAGOZO

CINDY MANUELA ROSALES MAESTRE

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS Y EDUCACION

LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES Y EDUCACION

AMBIENTAL

VALLEDUPAR

2009

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MULTIPLICACIÓN DE HONGOS MICORRIZICOS ARBUSCULARES

MA NATIVOS DE CULTIVO DE CACAO ( Theobroma cacao) EN

MAIZ (Zea mays) BAJO DISTINTOS TRATAMIENTOS

AGRONÓMICOS

LILIANA DAVILA ROCHA

CARLOS JULIO RAMOS FRAGOZO

CINDY MANUELA ROSALES MAESTRE

Trabajo presentado como requisito para obtener el t itulo de Licenciados en Ciencias Naturales y Educación Ambie ntal

Tutor Laura Esther Rojas Martinez

Bióloga

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS Y EDUCACION

LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES Y EDUCACION

AMBIENTAL

VALLEDUPAR

2009

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Valledupar, Mayo 15 de 2009

Nota de Aceptación

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Firma del Presidente del Jurado

Firma del Jurado

Firma del Jurado

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A Dios

Por darme vida, salud, fortaleza y perseverancia en el transcurso de mi carrera.

A mis padres Atanasio Dávila y Celia Rocha

por haberme brindado su apoyo incondicional durante todo este tiempo.

A mi Tía Sebastiana Dávila

Mil gracias porque sin su apoyo, su tolerancia y su bondad no hubiera llegado a

ser lo que soy.

A la profesora Laura Rojas Martínez

Que dedicó parte de su tiempo a la realización de este trabajo. Gracias a todos los

que confiaron en mí y que de una u otra forma siempre estuvieron a mi lado

ayudándome.

Liliana Dávila Rocha

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A Dios

Por siempre iluminar el camino que he recorrido toda mi vida, gracias por ser mi

guía.

A mis padres

Saudy Maestre Morales Y Orlando Rosales Castro, a quienes les debo todo lo que

soy, son mi admiración porque me han demostrado que nunca se debe uno de

rendir y buscar siempre nuevas oportunidades para salir adelante y las

adversidades tomarlas como un proceso de aprendizaje de la vida cotidiana.

Los amo y gracias por estar siempre conmigo en las buenas y en las malas, son la

bendición más grande que me ha dado Dios

A mis hermanos y familiares

Adriana, Andrés Felipe Y Joaquín quienes juntos crecimos y compartimos muchas

vivencias, alegrías y tristezas. Espero seguir compartiendo la dicha y la felicidad

que nos mantiene unidos.

A la Bióloga Laura Rojas Martínez

A quien admiro y respeto, gracias por tu guía en este difícil campo de la

investigación micorrizica, además de brindarme su amistad. Que Dios la bendiga

siempre.

A Carlos Julio Ramos Fragozo

Por su amor, compañía y ayuda en este proceso.

Cindy Rosales Maestre

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A Dios, a mis padres y a los sueños que se hicieron realidad

Carlos Julio Ramos Fragozo

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AGRADECIMIENTOS

Los autores de este proyecto expresan su agradecimiento a:

Al propietario de la Finca Monte grande de Pueblo bello Cesar por habernos

permitido obtener las muestras del suelo de los cultivos de cacao.

A los trabajadores del almacén del laboratorio de Ciencias Naturales Freddy

Pérez Domínguez y Luis Gonzales Fernández por habernos facilitado las

herramientas necesarias durante la realización de este proyecto.

A la Universidad Popular del Cesar, por brindarnos la oportunidad de superarnos,

capacitarnos y crecer intelectualmente, para poder convertirnos en los próximos

profesionales del futuro.

Las diferentes personas que intervinieron para la recolección de las muestras, la

cual fue de gran ayuda para llevar a cabo los diferentes estudios y procesos

necesarios para la realización de este trabajo.

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RESUMEN

En Colombia, los estudios del efecto de los sustratos y el tipo de cultivo trampa

adecuado para la multiplicación de micorrizas arbusculares MA son escasos,

debido a ello, el objetivo del presente trabajo consistió en multiplicar hongos

micorrizógenos nativos y así obtener un inóculo con una diversidad de

microorganismos fúngico endófitos nativos adaptados a nuestro sistema

agroecológico que pueda evaluarse posteriormente en cultivos de cacao bajo las

condiciones edáficas y climáticas de la región y aumente la productividad de una

manera sostenible.

En los sistemas de cacao de la región, la baja productividad ha generado el

planteamiento de estrategias como es el uso de microorganismos para estimular

su crecimiento, donde se destacan los hongos micorrizógenos. Estos organismos

pueden ser obtenidos, seleccionados, multiplicados e incorporados al suelo en

forma de inóculos. El proceso de inoculación es complejo, por una parte, implica

diseñar métodos de aislamiento, selección, multiplicación e incorporación

adecuados para cada especie o propósito. En este trabajo se evaluó la

multiplicación de esporas de hongos micorrízicos arbusculares MA nativos

obtenidos de cultivo de cacao (Theobroma cacao) en plantas trampas de maíz

(Zea mays) fertilizadas y no fertilizada. El ensayo se mantuvo en vivero durante

cuatro meses con condiciones de riego controladas. En cada una de las unidades

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experimentales se evaluó número de esporas/g de suelo seco, porcentaje de

colonización y las variables agronómicas como peso seco y altura de las plantas.

Dentro de los resultados se obtuvo que las plantas trampas de maíz (Sea mays)

inoculadas respondieron significativamente a la infección y esporulación por los

hongos MA nativos, mostrando mayores niveles de infección de micorriza.

El mayor rendimiento en la tasa de crecimiento y porcentaje de materia seca fue

alcanzado por el tratamiento de las plantas inoculadas no fertilizadas.

El género micorrízico predominante con mayor abundancia relativa dentro de la

población de esporas aisladas en los tratamientos fue Glomus

Palabras claves: micorriza, inóculo, cacao, fertilización, infectividad, esporas.

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CONTENIDO

DEDICATORIA

RESUMEN

INTRODUCCION 17

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 19

2. JUSTIFICACION 21

3. OBJETIVOS 24

3.1 Objetivo General 24

3.2 Objetivos Específicos 24

4. MARCO TEORICO 25

4.1 Antecedentes de la Investigación 25

4.2 Bases Teóricas 30

4.2.1 la micorriza 30

4.2.2 Tipos de micorrizas 31

4.2.2.1 Ectomicorriza 31

4.2.2.2 Endomicorriza 32

5. MATERIALES Y METODOS 46

5.1Obtencion de esporas nativas MA de cultivo de cacao. 46

5.1.1 Toma de muestras de suelo. 46

5.1.2 Preparación de l pre-Inoculo 47

5.1.2.1 Tamizaje-Flotación-Filtración 47

5.2.2.2 Secado de las muestras 48

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5.2 Multiplicación de esporas nativas en plantas trampas 50

5.2.1 Material vegetal 50

5.2.2 Preparación de sustratos 51

5.2.3 Siembra 52

5.2.4 Aplicación del pre- inóculos 53

5.2.5 Manejo de los tratamientos 53

5.3.5 Evaluación de la infectividad y efectividad de la multiplicación de

los hongos MA nativos 55

5.3.1 Numero de esporas por gramo de suelo 56

5.3.2 Determinación de porcentaje de infección 58

5.3.2.1 Tinción de las Raíces 58

5.3.2.2 Evaluación de la colonización micorrizica por el método de

intercepto de McGonigle 59

5.4. Identificación de esporas de hongos MA multiplicados en el

cultivo trampa 64

6. RESULTADOS Y DISCUSIONES 65

6.1 Porcentaje de infección micorrizal 65

6.2 Altura de las plantas 72

6.3 Determinación de biomasa 76

6.4 Análisis de diversidad de hongos micorrízicos 78

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7. CONCLUSIONES 82

RECOMENDACIONES

BIBLIOGRAFÍA

ANEXOS

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Proceso de formación de micorriza arbuscular (MA) 35

Figura 2: Diversidad en forma de esporas de todos los géneros de

Hongos micorrízicos arbusculares MA 43

Figura 3: Toma de las muestras de suelo en el municipio de

Pueblo Bello- Cesar 46

Figura 4: Tamizado de las diferentes muestras 44

Figura 5: Semillas de maíz (Zea mays)

Figura 6: Preparación de los sustratos y tratamiento 49

Figura 7: Siembra y aplicación del inóculo en los diferentes tratamientos 52

Figura 8: Aplicación del fertilizante a los diferentes tratamientos 55

Figura 9: Flotación- filtración de las muestras de suelo 56

Figura 10: Papel filtro con los sedimentos después del filtrado y corte

de la misma para observar al microscopio 57

Figura 11: Método para la tinción de las raíces 59

Figura 12: Raíces de las diferentes plantas en laminas portaobjetos 60

Figura 13: Corte de la raíz y parte aérea de la planta 57

Figura 14: Peso de las raíces y parte aérea de las plantas 62

Figura 15: Vesícula 65

Figura 16: Arbúsculos 66

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Figura 17: Hifas 66

Figura 18: Comparación de la altura de plantas del tratamiento 2

y tratamiento 3 73

Figura 19: Crecimiento de parte foliar y raíz de las plantas con micorriza y

sin micorrizas 74

Figura 20: Entrophospora 79

Figura 21: Acaulospora 79

Figura 22: Glomus 79

Figura 23: Archaeospora 79

Figura 24: Scutellospora 80

Figura 25: Gigaspora 80

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LISTA DE GRAFICAS

Grafica 1: Porcentaje de infeccion por hifas 67

Grafica 2: Porcentaje de infección por arbúsculos 64

Grafica 3: Porcentaje de infección por vesículas 69

Grafica 4: Altura de las plantas en los tratamientos 1, 2 y 3. 73

Grafica 5: Porcentaje peso seco parte aérea 76

Grafica 6: Porcentaje peso seco de la raíz 76

Grafica 7: Porcentaje de esporas por género en cada uno de los

tratamientos 78

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LISTA DE CUADROS

Cuadro 1: Ubicación taxonómica y géneros de hongos formadores de

micorriza arbuscular 42

Cuadro 2: Proporciones del fertilizante Nutrifoliar por g/L 54

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ANEXOS

Anexo 1: Resultados del peso seco de la parte aérea de las plantas en los

diferentes tratamientos 91

Anexo 2: Resultados del peso seco de la raíz de las plantas en gramos 91

Anexo 3: Altura de las plantas a los 45 días de edad 92

Anexo 4: Altura de las plantas a los 60 días de edad 92

Anexo 5: Altura de las plantas a los 75 días de edad 93

Anexo 6: Altura de las plantas a los 90 días de edad 93

Anexo 7: Número de esporas en 10 gr de suelo 94

Anexo 8: Infección por hifas 94

Anexo 9: Infección por arbúsculos 95

Anexo 10: Infección por vesículas 95

Anexo 11: Número de vesículas por laminas 96

Anexo 12: Porcentaje de esporas por genero 96

Anexo 13: Análisis fisicoquímico del suelo 97

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INTRODUCCION

En la actualidad en los países europeos y de América latina, existe una alta

demanda por los productos orgánicos (Fraire, 2002). Colombia ha mostrado

interés para producir productos agropecuarios con insumos económicos e inóculos

para el bienestar de la población consumidora y de la familia de la población más

vulnerable.

El cultivo de cacao es un producto agroindustrial que presenta buena aceptación

y demanda. En los últimos años los productores han sufrido pérdidas en las

plantaciones debido a los elevados costos de insumos, bajo nivel tecnológico,

deficiencia de nutrimento en las plantaciones, altas incidencias de plagas y

enfermedades dañinas como moniliasis (Barreras, 2007). En la actualidad es

necesario buscar tecnologías alternativas que estén al alcance de los productores,

que permitan minimizar costos de producción e incrementar la productividad del

cultivo mediante la agricultura alternativa y reactivar las plantaciones mediante la

reconversión de cacao tradicional a la producción orgánica competitiva.

Una de estas alternativas, es la aplicación de microorganismos con alto potencial

biofertilizantes que puedan mantener la sostenibilidad de los cultivos. Las

micorrizas son una de las principales asociaciones simbióticas de la naturaleza ya

que las raíces de la mayoría de las plantas vasculares son colonizadas

extensivamente por hongos micorrícicos vesículo arbuscular (MA). Estos son

organismos biotróficos obligados que pueden estimular el crecimiento y desarrollo

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de las plantas al mejorar la nutrición de éstas, determinando un incremento

importante en la absorción de nutrimentos inmóviles (Stribley, 1990; Bethlenfalvay

et al., 1991).

El reconocimiento, establecimiento y eficiencia de una asociación micorrizica

dependen de factores como: a) tipo de hongo (su tasa de crecimiento interior y

exterior en la raíz), b) planta hospedante (como genotipo, exudados radicales,

geometría radical, presencia de pelos radicales y de raíces laterales) y c) los

factores biofisicoquímicos del suelo (pH, humedad, textura, fertilidad, tipo de

microorganismos) (Graham et al., 1981; Estañol, 1987; Tester et al., 1987; Smith y

Giaginazzi, 1988; Varela y Estrada, 1991).

Debido a la gran variedad de especies MA es importante, determinar cual de estas

MA sera más idónea para un cultivo especifico, todo esto con el fin de poder llegar

a la obtención de una planta que presente ciertas características que le permita

adaptarse de mejor manera a las condiciones en el momento de su trasplante a

terreno definitivo con una disminución en la aplicación de fertilizantes inorgánicos.

Teniendo en cuenta esta problemática, el objetivo del presente trabajo consistió

en multiplicar hongos micorrizógenos nativos, útiles para el posterior

establecimiento de un inóculo potencial de uso regional en plantaciones de cacao.

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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La producción de cacao en Colombia se desarrolla en unidades productivas

pequeñas en donde el cacao constituye una de las fuentes alternativas de

ingresos. En el Cesar, específicamente en la zona de Pueblo Bello, no es la

excepción. Las plantaciones cacaoteras están establecidas en fincas familiares,

donde la tecnología empleada es baja, no se llevan a cabo labores de fertilización,

riego, drenaje y siembras (renovaciones). La fertilización se realiza solo en el

momento de la siembra, pero durante el desarrollo del árbol esta es casi nula. La

Corporación Colombiana De Investigación Agropecuaria (CORPOICA)

recomienda, fertilizar dos o tres veces al año, actividad poco difundida en estas

fincas cacaoteras, lo que se constituye en una ventaja a la hora de aplicar

tecnologías limpias, como biofertilizantes que mejoren la productividad y

sostenimiento de los cultivos sin dañar los ecosistemas.

Adicionalmente, las labores culturales realizadas por los agricultores son

precarias dando vía libre para la propagación de enfermedades como la

moniliasis, que ya ha sido diagnosticada en Pueblo Bello- Cesar y que se

constituye como la principal limitante para la producción de cacao (Barreras,

2007). Esta enfermedad es causada por el hongo Moniliophthora roreri, que

ataca exclusivamente frutos; se estima que ocasiona pérdidas superiores al 40%

Page 21: Tesis cacao

en la producción nacional que, estimada en valor comercial de $120.000 millones

al año.

Todos estos factores contribuyen a la disminución de la producción en las

plantaciones de cacao. Departamentos como Nariño, Tolima, Cundinamarca,

Meta y Cesar registran tasas decrecientes en la producción de cacao. El

departamento del Cesar produjo; 633 toneladas en el año 2000 y 513 toneladas

en el 2004 con un crecimiento de producción de -3.7% (Barreras, 2007).

Debido a los precarios manejos agronómicos y la proliferación de enfermedades

podemos identificar que la disminución de la productividad de las plantaciones de

cacao es un problema de importancia económica a nivel departamental y nacional,

teniendo en cuenta que el consumo de este producto es mucho mayor que la tasa

de producción, las micorrizas se constituyen como una herramienta útil para la

sostenibilidad y aumento de producción de los cultivos de cacao.

Page 22: Tesis cacao

2. JUSTIFICACIÓN

Los fertilizantes químicos son sustancias que enriquecen el suelo y promueven el

desarrollo vegetal, son de gran ayuda si, se quiere lograr un mejor rendimiento y

producción en los cultivos. Muchos agricultores no realizan la aplicación de estos

productos debido a los altos precios que en muchas ocasiones registran.

En los suelos naturales todas las especies forestales incluyendo el cacao forman

asociaciones simbióticas y mutuamente benéficas entre sus raíces y hongos

endófitos especializados (Guerrero et al, 1996). Esta formación raíz-hongo es

llamada micorriza y cuenta con un alto potencial biofertilizante. El 95% de las

plantas dependen de las micorrizas para crecer y sobrevivir, lo que es evidenciado

por la baja supervivencia de plantas no micorrizadas cuando son plantadas en

suelos con carencia de hongos micorrízicos (Alarcón, 2007).

En la actualidad hay una gama de productos biofertilizantes internacionales y

algunos nacionales a base de MA, la efectividad de la inoculación dependerá del

balance de factores ecofisiológicos en el sistema planta-suelo, lo cual significa

que un mismo inóculo puede desencadenar efectos muy variados sobre un cultivo,

dependiendo del tipo de manejo agronómico que se realice. Por lo tanto, no se

puede generalizar el efecto de un tipo de micorrizas sobre todos los árboles ni

sobre todos los ecosistemas. (Molina L. y Col.2005).

Page 23: Tesis cacao

Sieverding (1990) afirman que existe un desconocimiento acerca de la efectividad

de las especies nativas frente a las introducidas. Aunque la efectividad de la

inoculación para la mejora y mantenimiento de la salud y fertilidad del suelo, así

como su efecto benéfico en la producción y el crecimiento de plantas de interés

han sido extensivamente demostrados para diferentes sistemas a nivel de

investigación (Jeffries et al., 2003; Koide & Mosse, 2004), los reportes de

efectividad derivados de aplicación masiva en campo de inóculo producidos para

tal fin son más escasos.

Read (1991) hace un planteamiento biogeográfico según el cual cada tipo de

micorriza, tendría un juego particular de atributos y funciones adaptados a un

ecosistema y ambiente edáfico particular la cual hace un uso eficiente del fósforo

del suelo y de los fertilizantes fosfóricos, optimizar la productividad de los suelos y

cultivos con niveles bajos de insumos, hace posible y rentable la producción

vegetal en condiciones adversas (de fertilización, presencia de metales pesados,

desertificación), ayudar a establecer cultivos en suelos erosionados o degradados.

Departamentos como Bolívar y Cesar son zonas que se han caracterizado en los

últimos años (1990-2006) por presentar especialidades de cacao en grano único

reconocidas por empresa internacionales como producto con característica únicas

y que por lo tanto puede ser transado a precios más altos en los mercados

internacionales. Sin embargo uno de los principales problemas que afecta la

Page 24: Tesis cacao

producción de estos departamentos es la enfermedad fungosa conocida

tradicionalmente como la moniliasis, que es el factor más limitante para la

producción de cacao en todo el país, causando graves pérdidas representadas en

más del 40% de la cosecha anual (Barreras, 2007)

Ante todas estas dificultades presentadas en la región del Cesar específicamente

en Pueblo Bello, reconocida como zona potencial de alta producción de cacao. El

proyecto en cuestión se propone obtener un inoculo como biofertilizante,

compuesto de hongos nativos (MA), con el objeto de mejorar las condiciones

edáficas de las plantaciones y proporcionar muchos beneficios a las plántulas y a

los árboles adultos, especialmente en la obtención del agua y los nutrientes que

mejoren la productividad del cultivo y mayor tolerancia a patógenos que

actualmente afectan a estos cultivos en el Cesar.

Page 25: Tesis cacao

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo General

Evaluar la producción de esporas de hongos Micorrizicos Arbusculares (MA)

nativos obtenidos de cultivo de cacao (Theobroma cacao) en plantas trampas de

maíz (Zea mays) fertilizadas y no fertilizadas.

3.2 Objetivos Específicos

• Obtener esporas de hongos MA nativos del cultivo de Cacao del municipio de

Pueblo Bello- Cesar.

• Multiplicar las esporas nativas utilizando plantas trampa de maíz (Zea mays).

• Evaluar la infectividad y la efectividad de los hongos MA nativos obtenidos

del cultivo trampa de maíz (Zea mays). Fertilizadas y no fertilizadas.

• Identificar las esporas de los hongos MA nativos obtenidos y multiplicados en el

cultivo trampa de maíz (Zea mays).

Page 26: Tesis cacao

4. MARCO TEÓRICO

4.1 Antecedentes de la Investigación

La producción a gran escala de inóculos de hongos MA se inició en los años 80 –

90s, habiendo en la actualidad un amplio número de compañías registradas para

este fin en todo el mundo (Dalpe & Monreal, 2003). Los sistemas de producción

han evolucionado considerablemente en los últimos años, de tecnologías

relativamente simples a otras más complejas, como los métodos in vitro.

Actualmente, el inóculo es producido para propósitos comerciales de diversas

maneras.

En general, la investigación en el área de microbiología en Colombia ha tenido un

buen desarrollo en campos biotecnológicos orientados a la solución de

necesidades particulares relacionadas con las condiciones tropicales del país, la

caracterización de microflora de plantas nativas de nuestros ecosistemas con

aplicación en la producción de biofertilizantes. Se puede decir que se han obtenido

desarrollos con impacto a nivel económico en diferentes campos.

En el estudio de los hongos que forman endomicorrizas, principalmente de tipo

arbuscular MA, la Universidad Nacional – Palmira ha estado comprometida desde

el año1983 y en 1984, los estudios se enfocan hacia el conocimiento de MA en

agroecosistemas de importancia estratégica como es el caso del café, yuca,

Page 27: Tesis cacao

gramíneas, hortalizas y frutales, indagando en primera instancia sobre especies

nativas y también sobre respuestas a inoculaciones con estos hongos. En esta

sede existe como programa de investigación el estudio de endomicorrizas en

agroecosistemas y ecosistemas, con varias líneas de trabajo; sin embargo, el

trabajo en el campo ha mostrado que los MA son un componente del sistema y

que sólo en la medida que se integra su manejo a los otros componentes, es

posible hacer un uso de sus potencialidades.

Existen instituciones en donde se están adelantando procesos de obtención de

patentes a nivel nacional como es el caso del Instituto de Biotecnología de la

Universidad Nacional de Colombia - IBUN.

El segundo caso de estudio está representado por CENICAFÉ quien ha

establecido un modelo para la producción de diferentes microorganismos

biocontroladores de plagas y enfermedades en el cultivo de café, además de

adelantar investigaciones relacionadas con el empleo de microorganismos como

biofertilizantes con miras a establecer una caficultura biológica. El modelo de

convenio internacional con la Comunidad Europea (proyecto INCO) firmado entre

varios países tiene como fin la caracterización y producción de inóculo micorrízico

allí se observa que a partir de la obtención y caracterización de micorrizas vesículo

arbusculares (MA) se establece una colección cuyo manejo tecnológico (cultivo

Page 28: Tesis cacao

monoaxénico), inoculación y formulación favorece el establecimiento de musáceas

(plátano y banano) micropropagadas.

En Colombia, el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) inició trabajos

de investigación con micorrizas MA desde la década de los 80, donde se evaluó

su importancia agronómica en cultivos tropicales como yuca y algunas pasturas.

Se iniciaron trabajos de recolección de hongos nativos, aislamiento e identificación

de micorrizas originarias del Valle de Cauca, Llanos Orientales, entre otras. Como

resultado de estas investigaciones se formó un Banco de Germoplasma, y algunas

recomendaciones relacionadas con su biodiversidad potencial de uso en la

agricultura. Existen también experiencias positivas con la aplicación de inóculos de

micorrizas (Glomus, Scutellospora y Entrophospora) en frutales tropicales.

La Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (CORPOICA) es una

entidad con gran trayectoria y reconocimiento en el país. Mediante convenio con el

Ministerio de Agricultura y el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), administra

el banco de germoplasma de microorganismos (4.500 cepas) que son de interés

en biofertilización y fotoprotección, han obtenido biofertilizantes (Rhizobium,

Bradyrhizobium, micorrizas).

Ejemplo de este trabajo es el realizado por los técnicos de la Regional Siete de

CORPOICA, quienes realizaron aislamientos de micorrizas en muestras de suelo

Page 29: Tesis cacao

de la rizósfera de plantas de cacao, tomadas a diferentes altitudes de las zonas de

Río negro, Landazurí, El Carmen y San Vicente de Chucurí. Las micorrizas fueron

analizadas en el laboratorio de microbiología del Centro Internacional de

Agricultura Tropical (CIAT), concluyendo que para la multiplicación e inoculación

de estos microorganismos benéficos en el cultivo de cacao, es aconsejable la

utilización de micorrizas nativas, ya que tienen mejor capacidad de adaptación al

medio; si se aplican micorrizas foráneas se corre el riesgo de que ocurra

competencia entre ellas.

En Colombia, la diversidad de climas y ecosistemas hace que la multiplicación de

los cultivos varíe por las diversas condiciones agroecológicas, y estos factores

son las mayores limitantes para la producción sostenible y eficiente. Los

microorganismos tienen un gran potencial para contribuir a la solución de múltiples

problemas de la agricultura, dentro de los cuales, los biofertilizantes con base en

Micorrizas Arbusculares MA son una alternativa para reducir pérdidas en los

procesos de multiplicación de especies. Estas tecnologías tienen aplicación de

fácil transferencia para los pequeños productores ya que son de bajo costos.

En la costa atlántica se está incursionando en el estudio microbiológico y la

aplicabilidad que tienen estos sobre el suelo, CORPOICA ha financiados estudios

microbiológicos con énfasis en micorrizas, especialmente con el objeto de

aumentar la producción de especies de importancia económica en la Costa

Page 30: Tesis cacao

Atlántica como plátano, algodón, yuca y ñame, mediante el desarrollo e

implementación de metodologías de manejo y producción, que incluyan las

micorrizas arbusculares.

Sin embargo en el departamento del Cesar hay mucho por hacer acerca de la

multiplicación y obtención de especies nativas de hongos MA que sirva para

mejorar la producción y sostenibilidad de un cultivo específico. Estudios

financiados por la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria

(CORPOICA) ha incursionado en el estudio de las micorrizas sobre suelos

algodoneros deteriorados en Codazzi y san Juan del cesar, obteniendo respuestas

positivas en las plantas tratadas.

Las micorrizas tienen gran potencial para contribuir a una producción sostenible.

Sin embargo, se resalta la importancia de profundizar en la investigación sobre el

uso de micorrizas nativas o del sitio, lo que implica conocer más sobre la relación

hongo-planta, buscando aislar cepas específicas que permitan potencializar el

crecimiento y productividad de los árboles en determinados agroecosistemas y

evaluar las interacciones de estas con otros microorganismos de dicho suelo.

El estudio de microorganismos en un cultivo con producción sostenible y sin

aplicación de agroquímicos como ocurren en las plantaciones de cacao de Pueblo

Bello - Cesar. Se pueden detectar actividades rizosférica importantes y reconocer

Page 31: Tesis cacao

microorganismos promisorios para mejorar el estatus de nutrientes en el suelo y la

productividad en los cultivos, información que se divulgaría en la zona estimulando

más la incursión en el establecimiento de más hectárea cultivable con este

sistema agroecológico con menos costos de insumos para mantener la

producción.

En la evaluación del proceso de multiplicación de hongos MA, se han usado

diferentes tipos de inóculos, entre ellos nativos de agroecosistemas bananeros del

Urabá (Antioquia-Colombia),con diferentes plantas hospedadoras para determinar

la infectividad y efectividad sobre plantas de banano (Musa AAA cv. Gran Enano).

La colonización micorrizal promedio general de los MA a las plantas trampa fue de

37,76. Se ha observado que las plantas micorrizadas se benefician en diferente

magnitud. (Usuga Osorio; Castañeda Sánchez 1999)

4.2 Bases Teóricas

4.2.1 La micorriza

Las micorriza debe entenderse como una estructura especializadas con diversas

funciones, la cual se origina al asociarse, en forma mutualista, diversos grupos de

hongos específicos con el sistema radical de la planta.

Page 32: Tesis cacao

4.2.2 Tipos de micorrizas

4.2.2.1Ectomicorrizas

Las ectomicorrizas crecen en el exterior de las raíces formando una auténtica

capa que envuelve a aquellas y que se llama el manto creciendo hacia el interior

entre las células formando retícula que recibe el nombre de “red de Harting”.

Las ectomicorrizas en general son bastante específicas, lo que quiere decir que

una especie de hongo solo puede vivir con una o unas pocas especies de plantas.

Las esporas sólo germinan en contacto con una raíz y las esporas sin germinar

tienen un período de viabilidad también corto. Además los hongos de este grupo

son además específicos a la planta, en general específicos al medio (suelo, clima,

etc.) y en general mucho más sensibles a las agresiones externas que las

endomicorrizas.

Page 33: Tesis cacao

4.2.2.2 Endomicorrizas

Son poco específicas, lo que quiere decir que una especie puede infectar a un

gran número de especies vegetales. Son mucho menos sensibles a las agresiones

externas que las ectomicorrizas, sus esporas germinan con facilidad alejadas de

raíces vivas y pueden crecer considerablemente sin contacto con ninguna raíz, lo

que les permite localizar a éstas y pueden sobrevivir durante dilatados períodos de

tiempo (meses) sobre trozos de raíz si otras condiciones no son adversas. Como

su nombre indica viven en el interior de la raíz, en los espacios intercelulares y si

emiten hifas al interior de las células que se subdividen formando estructuras en

árbol (arbúsculo) dan origen al grupo de hongos micorrízicos más abundante que

se conoce.

Page 34: Tesis cacao

Proceso de infección de la micorriza

La infección o colonización de una raíz por parte de un hongo micorrizógeno es un

proceso que involucra una secuencia de etapas reguladas de una precisa

interacción entre endosimbionte y hospedero.

La pre-infección está asociada a la actividad de los propágulos infectivos

presentes en el suelo que circunda la raíz. Dichos propágulos pueden ser esporas

o micelios fúngicos. Este último, generalmente se encuentra vinculado a raicillas

de plantas vivas o segmentos de raíz infectada.

La penetración se inicia con la formación de un “punto de entrada” que se

caracteriza por el desarrollo de un abultamiento o apresorio en el punto de

contacto sobre la superficie de la raíz. Cada espora genera un solo punto de

entrada, mientras que un segmento de raíz puede eventualmente generar más de

uno. No es del todo claro si el mecanismo de penetración esta mediado por un

evento enzimático, por un evento mecánico o por una combinación de ambos.

Una vez que penetre el hongo se asegura un proceso proliferativo que conduce

al establecimiento de una unidad de colonización que se puede extender hasta un

centímetro de distancia a partir del punto de penetración. El avance de la infección

está restringido a la epidermis y el parénquima cortical. La unidad de colonización

avanza mediante el crecimiento de hifas aseptadas que se extienden por entre las

Page 35: Tesis cacao

células corticales y que generan estructuras características como los arbúsculos y

las vesículas

Algunas semanas después iniciada la infección, el hongo está en condiciones de

esporular, lo cual supeditado a las condiciones ambientales del suelo en particular

la humedad parece ser un factor regulador de importancia, ya que se ha visto

que le estrés hídrico en el suelo dispara la esporulación (Guerrero, et, al 1996).

Las hifas externas están en capacidad de reinfectar el mismo sistema de raíz del

cual se origina. Algunas de estas hifas generan “puntos de entrada” que provocan

nuevas unidades de colonización, lo cual supone la infección avanza a lo largo de

la raíz a través de unidades de colonización discontinuas. Este proceso de

proliferación se puede trasladar a otros sistemas de raíz vecinos de la misma o

diferente especie de planta. Se ha establecido que los hongos micorrizógenos se

pueden mover en el suelo a razón de 0.6 -3.2 m/año, lo cual da una idea de las

posibilidades de expansión de la infección micorrizica (Powell, 1970, citado por

guerrero, 1996). Figura 1

Page 36: Tesis cacao

Figura 1: Proceso de formación de micorriza arbuscular (Guerrero, et, al 1996)

Page 37: Tesis cacao

Las ventajas de la aplicación de micorrizas en un sistema agroecológico son:

• Mayor crecimiento y desarrollo de las plantas en beneficio de la adaptación

y eficiencia de éstas al facilitar una mayor absorción de nutrientes minerales del

suelo.

La capacidad de la raíz para absorber nutrientes del suelo unido al movimiento de

estos en el suelo, permiten su absorción por la planta. La tasa de absorción de

iones de alta movilidad en el suelo (como el nitrato) está determinada por la

especie vegetal o la variedad, y la de iones poco móviles, como el P, Zn, Mo y en

menor grado el K, S y NH4, dependen más de la densidad de las raíces por

volumen de suelo.

En este caso, la absorción de los nutrientes la determina la morfología de la raíz y

el crecimiento del hongo micorrícico en el suelo. Las hifas del hongo no son

capaces de absorber del suelo nutrientes diferentes a aquellos que están

disponibles para la raíz, bien sea en la solución del suelo o las rápidamente

intercambiables. La micorriza solamente aumenta la eficacia de la absorción de

nutrientes por la planta; así, las plantas cultivadas y asociadas con hongos

eficientes pueden usar el abono aplicado entre 2 y 10 veces más que las plantas

micorrizadas y abonadas (Mosse y col., 1986).

La solución del suelo contiene una concentración relativamente baja de P y

alrededor de la raíz se forma rápidamente una zona carente de este elemento.

Como la hifa de los hongos formadores de la micorriza vesículo-arbuscular (MA)

Page 38: Tesis cacao

crecen mas allá de la zona agotada de la raíz, permiten que el suelo sea mas

intensivamente explorado. El P, una vez absorbido por la hifa en forma de

ortofosfato, es transportado por polifosfato hacia el interior de la raíz donde es

liberado (Herrera y col., 1984).

• Mejora el reciclado de nutrientes en el suelo.

La micorriza interactúa significativamente en los reciclajes de nutriente por la

intensiva exploración del suelo a través de las hifas de los hongos MA,

incluyéndose la perdida de nutrientes por la fijación química o la lixiviación,

después de la mineralización de la materia orgánica.

• Aumenta la eficiencia de otros microorganismos que tienden a asociarse

con ellas, tales como Rizhobium, Azospirillum, Azotobacter, que a su vez

incrementan la captación de nutrientes para las plantas.

(Fitter, 1998), encontró que las micorrizas interactúan con otros organismos del

suelo y estas interacciones pueden inhibir (crean competencia entre ellos) o

estimular (forman asociaciones mutualistas). Sin embargo, en muchos casos no

ha sido posible definir completamente dichas interacciones. Entre los organismos

mencionados pueden estar hongos patógenos (a nivel del micelio interno),

protozoarios, nemátodos y artrópodos.

Page 39: Tesis cacao

• Mejora el control de enfermedades y la disminución en gasto de insecticidas

y funguicidas, con el uso de plantas micorrizadas.

En investigaciones realizadas, se encontró que la mezcla de bacterias del genero

Rhizobium con micorrizas, dan mayor vigor a la planta, lo cual la hace más

resistente al ataque de patógenos, porque las micorrizas forman una barrera física

impenetrable en la superficie de las raíces, variando en grosor y densidad

(INGHAM, 2003). Además se encontró que especies de micorrizas parasitan a

otros hongos como es el caso del Trichoderma y lo destruyen. Sin embargo

existen interacciones donde las micorrizas pueden sobrecolonizar la planta y

convertirse en parásitos ( FITTER AH, GARBAYE J, 1994 ).

• Produce plantas más resistentes al ataque de patógenos.

Varios autores concuerdan en que las micorrizas pueden contribuir a la salud de la

planta y a su productividad al aumentar el desarrollo de tolerancia a enfermedades

y parásitos (READ D. J. 1991). Las ectomorrizas protegen la raíz ya que reciclan

los carbohidratos, aminoácidos y otros compuestos producidos por las raíces,

capaces de atraer agentes patógenos. Además proveen una barrera física a

patógenos debido a la formación del manto, en el cual las hifas individuales o

cordones de hifas crecen hacia afuera, introduciéndose en el suelo, y hacia

adentro, intercalándose entre las células del córtex de la raíz a través de la lámina

media, formando un entramado denominado red de Harting.

Page 40: Tesis cacao

En esta red el micelio deja de estar tabicado, es xenofitico, lo que se interpreta

como ventaja para acelerar los procesos de intercambio. La red de Harting puede

sintetizar compuestos como el diatretinenitrilo, con efecto de tipo antibiótico. Así

mismo, (RADDATTZ E. 2002) reporta tolerancia contra ataques de nemátodos.

• Facilitan la adaptación a suelos salinos.

La salinidad es un factor limitante de la producción agrícola, los estudios sobre

micorrizas y tolerancia de las plantas a este estrés es relativamente reciente.

Resultados reportados por Barea, 2003, demuestran el efecto inducido por la

micorrización en la disminución de la deficiencia nutritiva provocada por

antagonismos iónicos, efecto secundario del estrés salino, lo que permite

crecimiento mayor de las plantas micorrizadas.

Concretamente, las micorrizas mejoran diversos procesos fisiológicos (incremento

del ritmo de intercambio de CO2, transpiración, cambios en la

conductancia estomática, eficacia en el uso de agua), aparte del derivado de la

captación de nutrientes. Adicionalmente, (Corredor 2003) y( Barea, 2003),

sugieren otros mecanismos para justificar el papel de las micorrizas en relación

con la tolerancia a salinidad, tales como la inducción de cambios hormonales o la

mejora en la capacidad de agua.

Page 41: Tesis cacao

• Contribuyen con la disminución de la erosión. (Molina L. y Col 2005)

Se sabe que tanto el medio agrícola como los ecosistemas naturales pueden ser

afectados por procesos de degradación de diversa índole, en cuanto a su origen y

naturaleza, que inciden en la productividad y calidad de las cosechas y/o en la

estabilidad, diversidad y productividad de los ecosistemas. La utilización de

micorrizas no sólo ha facilitado mejor revegetalización en condiciones particulares,

como pueden ser la recuperación de suelos degradados por la minería y la

introducción de especies exóticas en distintas partes del mundo, sino también ha

mejorado la repoblación de especies vegetales en suelos forestales (3). Lo

anterior es confirmado por (LONDOÑO C, 2002), quien manifiestat que cuando se

aplican hongos edáficos, la pérdida por lixiviación, fijación y erosión se disminuye,

dado que la red de hifas captura y trasloca elementos nutritivos hacia la planta

desde sitios no explorados por la raíz; así en los sistemas selváticos de los

trópicos húmedos, el reciclaje de nutrientes de la materia orgánica descompuesta

hacia la planta, la hacen los hongos, principalmente por los sistemas micorrícico.

La falta de especificidad en la asociación micorrizal se ha mostrado con estudios

moleculares de DNA, al encontrar que una misma raíz puede albergar tres o más

especies de hongos micorrícicos (Clapp et al., 1995). Así mismo también se ha

comprobado la colonización de diferentes sistemas radicales por parte de un

mismo organismo fúngico (Chiariello et al., 1982; Francis & Read, 1984). La

Page 42: Tesis cacao

proporción de especies de hongos micorrícico-arbusculares MA y especies de

plantas descritos (150/ 225000) puede explicar la baja especificidad existente

entre planta y hongo en la asociación micorrícica (Zobel et al., 1997). Esta falta de

especificidad puede condicionar una considerable diversidad en los componentes

de la red de micelio extramatricial, como sistema captador de nutrientes.

La ubicuidad y biodiversidad que presenta la micorriza dan la idea de un

organismo multifuncional, cuyo beneficio no se limita solamente al aumento de

toma de nutrientes -Fósforo especialmente- debido a un volumen mayor de suelo

explorado con ayuda de las hifas del hongo (Newsham et al., 1995). También está

jugando un papel muy importante en la composición de una comunidad vegetal,

pues el micelio presente en el suelo puede gobernar el establecimiento de una

planta. Además, la colonización de material de origen vegetal -y posiblemente

animal- en descomposición, hace de la micorriza un posible puente directo entre

plantas cultivadas y enmiendas orgánicas.

Recientemente se ha propuesto un árbol filogenético (cuadro 1) donde se incluyen

siete familias ancestrales, Glomeraceae Paraglomeraceae, Archaeosporaceae,

Acaulosporaceae, Gigasporaceae, diversisporaceae y pacisporaceae. De estas

dos últimas familias están en estudio para su reaclasificacion. Asi mismo se

incluye el género sclerocystis como parte del genero Glomus. (Schubler et al,

Walter, 2004)

Page 43: Tesis cacao

Cuadro 1. Ubicación taxonómica y géneros de hongos formadores de micorriza arbuscular

(Schubler et al, Walter, 2004)

Taxonomía basada en la morfología de las esporas MA

Prácticamente, para la identificación taxonómica de las esporas MA se toman en

cuenta las características morfológicas de la hifa de sostén, el tamaño de la

espora, el cual es muy variable aun centro de la misma especie, sin embargo se

tienen algunos rangos de estas. Para Acaulospora entre 50-150 um siendo las

mas comunes entre 50 y 100 um, para Entrophospora entre 50- 150 um, para

Page 44: Tesis cacao

Gigaspora 250- 300 um y 300- 450 um, Scutellospora 150- 400 um, sclerocystis

50- 350 y Glomus 10- 250.

Morton (1988) resume 11 formas diferentes que las esporas de MA pueden tener

(figura 2). Las esporas tienen características altamente variables, probablemente

porque son afectadas por el medio ambiente físico en el cual ellas se forman. Con

excepción de sclerocystis, en la mayoría de los otros géneros las esporas son

globosas o subglobosas, se han reportado proporciones de 44, 27 y 36% en

Glomus, Acaulospora y Gigaspora respectivamente (Gonzalez- Chavez, 1989).

Figura 2: Diversidad en forma de esporas de todos los géneros de hongos micorrizicos

arbusculares. A: globosas, B: subglobosa, C: ovoboide, E: elipsoidal, F: piriforme, G:

irregular, H: oblonga, I: reniforme, J: fusiforme, K: clavada (González- Chávez, 1989).

Page 45: Tesis cacao

La diferencia del color de muchas especies, puede ser debido a pigmentos en la

pared de la espora o pigmentos del interior de esta. Tendencias significantes en el

grado de color de la espora son evidentes a nivel de género (Morton 1988).

Esporas de Glomus, Acaulospora y Scutellospora presentan un rango de color

hialino a negro, espora de Entrophospora exhiban variabilidad similar, pero cada

una de las tres especies descritas de este género, tienen un diferente color.

Esporas de Sclerocystis y Gigaspora tienen un rango más restringido en color,

siendo consistentemente café en la primera y hialinas y amarillo pálido en las

últimas.

El número de capas es una característica importante que se considera para

identificación de esporas, aunque varían aun dentro de géneros. Glomus,

sclerocystis y Gigaspora usualmente tienen 1-2 capas (80, 100 y 72%

respectivamente). Más de tres capas están presentes en esporas de Acaulospora,

Scutellospora y Entrophospora (75, 90 y 100% respectivamente, Morton 1986). A

esta observación, se adiciona la definición de Walker (1983) que es el grupo de

pared, entendido como la agregación de capas, las cuales pertenecen en

proximidad a otras a pesar de que la espora está rota.

Observaciones de la ornamentación de las capas ayuda de gran manera a la

identificación de las esporas. La ornamentación de la capa en general se presenta

en la capa laminada, única y membranosa. Las ornamentaciones no han sido

descritas en las capas de Gigaspora o sclerocystis. La ornamentación de la capa

Page 46: Tesis cacao

laminada puede ser: proyecciones reticulares, espinas agrupadas. Verrugas,

retículos, etc. En la capa única: espinas poligonales, pústulas, tubérculos, etc.

Page 47: Tesis cacao

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 Obtención de esporas nativas MA de cultivo de cacao.

5.1.1 Toma de muestras de suelo.

Para esta fase se seleccionó una plantación de cultivo de cacao (Theobroma

cacao) con árboles de diferentes edades (figura 3), se dividió el área de estudio

de la siguiente forma:

Zona A, árboles de 1-5 años

Zona B, árboles de 5-15 años

Zona C, árboles de15-30 años

Figura 3: Toma de las muestras de suelo en el municipio de Pueblo Bello- Cesar

Page 48: Tesis cacao

Se tomó de cada zona un promedio de 15 muestras de suelo y raíces que se

homogenizaron para cada zona, estas se guardaron en bolsas plásticas de ziploc

y se refrigeraron a -4 grados centígrados y posteriormente se secaron a

temperatura ambiente por tres días.

5.1.2 Preparación del pre- Inóculo

Para la obtención de las esporas del pre-inóculo se utilizó el método de tamizaje

flotación-filtración propuesto por Sieverding, (1983) Del Centro De Investigación

De Agricultura Tropical (CIAT) y el método de L-DRYING modificado de

Tommerup y Kidby, (1979) para el secado de las muestras cuyo procedimiento es

el siguiente

5.1.2.1 Tamizaje-flotación-filtración:

Se pesaron 100g de suelo y se le agregó 1 litro de agua, se agitó vigorosamente,

luego se dejó sedimentar por 5 minutos las partículas pesadas y se procedió a

decantar a una serie de tamices de 150 um, 250 um, 65 u.m y 45 u.m uno

colocado sobre el otro (figura 4). Después se lavó la muestra con un chorro fuerte

de agua para que las partículas pequeñas pasaran a los tamices de menor calibre.

Estas fracciones fueron lavadas en un Beaker de 500 mL y se llenó hasta ¾ partes

con agua, luego se agitó la suspensión fuertemente por 10-15 segundos,

posteriormente se dejó sedimentar el suelo durante 2 min, se decantó lentamente

en un embudo de Buhner (figura 9) al cual se le colocó un papel filtro y se

Page 49: Tesis cacao

complementó con una bomba de vacío, de manera que todo el material que se

encontró flotando en la superficie del agua quedó atrapado en el papel filtro, se

repitió el procedimiento con el suelo precipitado en el Beaker dos veces más.

Del papel filtro se realizó la posterior obtención, observación y cuantificación de las

esporas al microscopio con los objetivo de 4X, 10X Y 40X. Para su respectiva

multiplicación.

5.1.2.2 Secado de las muestras

El tamizado obtenido del suelo nativo se mezcló y se llevó a un recipiente de vidrio

para un posterior secado de las muestras, en esta etapa las muestras se llevaron

a una estufa de secado a una temperatura de 38º- 40º hasta que toda el agua se

evaporó. El suelo obtenido se maceró y fraccionó en porciones de 10g el cual se

utilizó como inóculo para las plantas trampa.

Page 50: Tesis cacao

Figura 4: Tamizado de las diferentes muestras

Page 51: Tesis cacao

5.2 Multiplicación de las esporas nativas de hongo s MA en plantas trampas

de maíz (Zea mays)

5.2.1 Material vegetal :

Se utilizaron semillas de maíz (Zea mays) variedad ICA-109. Las semillas

seleccionadas para la siembra se desinfectaron con 500 mL de una solución de

hipoclorito de sodio al 1% durante 1 minuto. (Figura 5).

Se seleccionó como hospedero de reproducción de hongos MA, el maíz (Zea

mays) ya que la literatura recomienda, que para multiplicar organismos

micorrizicos la planta trampa debe ser una gramínea, para disminuir el peligro de

los patógenos que pueden ser iguales o muy parecidos (Sieverding, 1984).

Adicionalmente, el maíz es de rápido crecimiento, desarrolla una abundante raíz

que es rápidamente infectada (Hayman et al., 1976; Owusu-Bennoah y Mosse,

1979; Skipper y Smith, 1979).

Figura 5: Semillas de maíz (Zea mays)

Page 52: Tesis cacao

5.2.2 Preparación de sustratos:

la preparación del sustrato tuvo la siguiente relación 2:1; 2 de suelo y 1 de

cascarilla de arroz.

Se tomó suelo de la zona en estudio y junto con la cascarilla de arroz se procedió

a dividirse en fracciones de 1000g, cada una por separado se guardaron en

recipientes de aluminio tapados con papel del mismo material. Posteriormente los

recipientes fueron llevados a una estufa con una temperatura constante de 100ºC

durante 2 horas para su esterilización con el fin de eliminar microorganismos que

establecieran competencia y la posible presencia de propágulos de micorrizas ya

establecidas. Después de las 2 horas, los recipientes se retiraron de la estufa y se

dejaron en reposo por 48 horas. (Figura 6)

Figura 6: Preparación de los sustratos y tratamiento

Page 53: Tesis cacao

5.2.3 Siembra

Para el establecimiento del micro-cultivo se realizó la mezcla del sustrato teniendo

en cuenta la relación de 2:1; 2 de suelo y 1 de cascarilla de arroz. Se llevaron a

unos 20 recipientes de icopor con capacidad de 1000g que sirvieron como

macetas. Se plantaron 4 semillas de maíz (Zea mays) por cada maceta teniendo

un total de 80 semillas sembradas. (Figura 7)

Figura 7: Siembra y aplicación del inóculo en los diferentes tratamientos

5.2.4 Preparación de los Tratamientos

El experimento consta de tres tratamientos de los cuales, dos de ellos estuvieron

inoculados con el pre-inoculo nativo obtenido de cultivo de cacao. El otro

tratamiento no se vio afectado por ningún carácter externo y las plantas tuvieron la

Page 54: Tesis cacao

oportunidad de desarrollarse por sus propios medios constituyéndose en el

tratamiento control. Estos tratamientos se designaron de la siguiente manera:

Tratamiento 1: Inoculadas fertilizadas

Tratamiento 2: Inoculadas no fertilizadas

Tratamiento 3: Testigo o control

5.2.4.1 Aplicación de pre-inóculo:

Se tomaron 10 macetas con semillas y a cada una de ellas se les aplicó 10

gramos de pre-inóculo a 5 centímetros de profundidad. Luego las otras diez

macetas con sus respectivas semillas se dejaron sin inóculo como tratamiento

control.

Transcurridos 15 días después de la siembra se procedió a realizar el corte

(raleo) de las plantas mas pequeñas dejando las mas desarrolladas en cada

maceta con el fin de evitar competencia.

5.2.5 manejo de los tratamientos

Se aplicaron soluciones nutritivas o iniciadoras buscando ajustar el nivel de

nutrientes para el desarrollo de los hongos, ya que según Brundrett, et al (1996) el

Page 55: Tesis cacao

sustrato debe poseer un nivel moderado de nutrientes para estimular la asociación

entre el hongo y la planta. (Figura 8).

Para caracterizar al tratamiento 1 se preparo una solución del fertilizante

Nutrifoliar, al 40% de concentración. Que se le aplico al tratamiento 1 cada 15

días a partir de los 45 días de edad, hasta los 90 dias de edad. Las plantas tenían

una altura promedio de 23.5 cm . La composición del fertilizante nutrifoliar se

muestra en el cuadro 2.

Elemento g/L

Nitrógeno total 200,0 g/L

Fosforo asimilable 100,0 g/L

Potasio soluble 50,0 g/L

Magnesio 10,0 g/L

Azufre 14,0 g/L

Cobre 1,5 g/L

Hierro 2,5 g/L

Manganeso 1,0 g/L

Molibdeno 1,0 g/L

Zinc 0,03 g/L

Cuadro 2: Composición del fertilizante Nutrífoliar por g/L

Page 56: Tesis cacao

La duración del desarrollo de las plantas de maíz fue de tres meses, en condición

de vivero.

Figura 8: Aplicación de las soluciones nutritivas a los tratamientos

5.3 Evaluación de la infectividad y efectividad de la multiplicación de los

hongos MA nativos

Las variables respuesta a utilizar son los número de esporas por gramo de suelo,

porcentaje de infección y el desarrollo vegetativo (altura y peso seco) de las

plantas.

Page 57: Tesis cacao

5.3.1 Numero de esporas por gramo de suelo utlilizando el método de Flotación –

Filtración planteado por el CIAT.

Se pesó 10g de suelo tamizado y se llevó a un beaker de 500 ml, se le agregó 300

ml de agua y luego se agitó la suspensión fuertemente por 10-15 segundos,

posteriormente se dejó sedimentar el suelo durante 2 min. Se decantó lentamente

en un embudo de Buhner (figura 9) al cual se le colocó un papel filtro y se

complementó con una bomba de vacío, de manera que todo el material que se

encontraba flotando en la superficie del agua pasó al papel filtro (figura 10). Luego

se repitió el procedimiento con el suelo precipitado en el beaker unas dos veces

más.

Para cada fase de decantación se cambió el papel filtro, enumerándolos para una

posterior obtención, observación y cuantificación de las esporas al microscopio

con los objetivo de 4X, 10X Y 40X.

Figura 9: Método Flotación- filtración de las muestras de suelo

Page 58: Tesis cacao

Figura 10: Papel filtro con los sedimentos después del filtrado y corte del mismo para

observar al microscopio

Page 59: Tesis cacao

5.3.2 Determinación de porcentaje de infección

Para hallar el porcentaje de infección se dividió en dos etapas; la primera consistió

en la tinción de las raíces de los diferentes tratamientos y la segunda etapa en

calcular la infección mediante el método de interceptos de McGonigle et al (1990)

para determinar porcentaje de MA

5.3.2.1 Tinción de las Raíces

Se tomaron las raíces de las plantas trampas del tratamiento 1 y el tratamiento 2

por separado, las raíces se lavaron con abundante agua con la ayuda de un tamiz

convencional para eliminar todo el suelo, luego se introdujeron en un tubo de

ensayo al cual se agregó una solución de hidróxido de potasio (KOH) al 10%

hasta cubrir las raíces por completo y se llevó al baño de maría a una temperatura

de 97º C por un tiempo de una hora con el fin de despigmentar las las raíces.

Transcurrido este tiempo y con ayuda de unas pinzas se lavaron las raíces con

agua corriente, luego se adicionó acido clorhídrico (HCl) al 10% hasta taparlas

completamente. Se dejaron reposar 15 minutos, pasado este tiempo se escurrió el

exceso de ácido pero sin lavar las raíces. Se le adicionó el colorante (azul de

tripán en lactoglicerina) y se llevaron las raíces a baño de maría durante 5

minutos. Posteriormente se decantó el colorante y se filtró para reutilizarlo, las

raíces teñidas se conservaron en lactoglicerina limpia para su posterior

observación al microscopio. (Figura 11)

Page 60: Tesis cacao

Figura 11: Método para la tinción de las raíces

5.3.2.2 Evaluación de la colonización micorrizica por el Método de Interceptos de

McGonigle Etal (1990)

Se tomaron las raíces ya teñidas y se arreglaron los segmentos en las láminas

portaobjetos a lo largo (figura 12). Luego se le coloco un cubreobjeto suavemente

para evitar la formación de burbujas, y se llevó al microscopio. El campo óptico

del microscopio se movió a través de la lámina, se utilizó el indicador de ocular

como línea de intersección. En cada intersección se registró algunas de las

siguientes posibilidades.

Page 61: Tesis cacao

Figura 12: Raíces de las diferentes plantas en laminas portaobjetos

La línea puede interceptar:

• NI=sección no infectada

• A=arbúsculos

• V=vesículas

• H=hifas micorrizicas (exclusivamente)

Se debe tener en cuenta que:

1. Arbúsculos (A) y vesículas (V) pueden ser interceptados a la vez, en este

caso se sumó un registro para cada categoría, pero se sumó un solo

campo para el total de intersecciones observadas.

Page 62: Tesis cacao

2. Las hifas micorrizicas pueden también fueron interceptadas en A y V pero

no se sumaron a H ya que en esta categoría se registraron solo los casos

de presencia exclusiva de hifas en la intersección.

3. Las hifas que se registraron en H fueron solo las que se consideraron

micorrizicas basándose en características morfológicas.

4. Las intersecciones con hifas de las que no se tuvo la certeza de que eran

micorrizicas o bien con hifas claramente pertenecientes a otros hongos no

micorrizicos se registraron como NI.

Se examinaron 100 intersecciones para cada muestra de raíz asignando cada

intersección en una de las categorías mencionadas: NI, A, V y H.

El porcentaje de micorrización (%M.A) se calculó de la siguiente manera.

%M.A= (# Intersecciones – NI) x 100 / # Intersecciones observadas.

5.4 Identificación de esporas de hongos MA multiplicados en el

Page 63: Tesis cacao

cultivo trampa

Las plantas se midieron cada 15 días a partir de los 45 días hasta completar

los tres meses (90 días), realizándose en total 4 mediciones por tratamiento,

posterior a esto se eliminaron los riegos para inducir un estrés hídrico con el

objeto de estimular la esporulación de los hongos durante una semana. Mas

tarde se procedió a medir y a separar la planta en hojas, tallo (parte aérea) y

raíz. (Figura 13, 14). Este material vegetal fue pesado e introducido en bolsas

de papel previamente identificadas, luego se colocaron dentro de una estufa de

secado a una temperatura de 70ºC por un período de 48 horas hasta obtener

un peso constante, luego el material vegetal fue pesado nuevamente para

determinar los indicadores de peso seco.

Figura 13: Corte de la raíz y parte aérea de la planta

Page 64: Tesis cacao

Figura 14: Peso de las raíces y parte aérea de las plantas

5.4 identificación de los hongos nativos multi plicados en las plantas

trampas de Maíz.

Para la identificación taxonómica de las esporas de MA se tuvieron en cuenta las

características morfológicas de las hifas de sostén, el tamaño de las esporas, la

forma y el color de las mismas. Según el catalogo ilustrado de micorrizas

arbusculares de la amazonia colombiana (Peña-Venegas C. P., Cardona G. I.,

Mazorra A., Arguellez J. H., Arcos A. L. Catalogo Ilustrado. Instituto Amazónico de

Investigaciones Científicas SINCHI, 2006.).

(Schenck. Norman, the international culture collection of va mycorrhizal fungI

(INVAM), Florida, 1985)

Page 65: Tesis cacao

6. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1 Porcentaje de Infección Micorrizal:

Se obtuvieron segmentos radiculares con presencia de micelio y de estructuras

representativas de los hongos MA (arbúsculos y vesículas). (Figura 15, 16,17).

El análisis de varianza realizado a la variable del porcentaje de infección mostró

diferencias significativas entre porcentaje de infección del tratamiento 1 y el

tratamiento 2.

En los datos obtenidos se pudo observar que la infección de los hongos

micorrízicos se ve influenciado por la cantidad de nutrientes presentes en el

sustrato utilizado es decir, que el porcentaje de infección micorrizal es

inversamente proporcional a la cantidad de nutrientes presentes en el suelo, tal

como se observa en las graficas 14,15,16. El tratamiento con MA no fertilizado

alcanzó los valores mas altos en cada uno de los indicadores de infección

micorrizal (Hifas, Arbúsculos y vesículas).

En relación a este punto de vista algunos autores han señalado que el grado de

micorrización y colonización del sistema radical se ve influenciado por factores

como el grado de fertilidad del suelo y el pH (Barea, J. M. Y Azcon – Aguilar, C.

1982). Esto se corroboró con un análisis fisicoquímico realizado al sustrato de

cada uno de los tratamientos (Anexo 13). Con respecto a los nutrientes del suelo,

específicamente a la cantidad de fósforo se encontró que todos los tratamientos

Page 66: Tesis cacao

mostraron niveles altos de este elemento, pero numéricamente dentro de los

tratamiento inoculados con MA, el tratamiento 2 se mostró con valores de 133,6

ppm; mientras que el tratamiento 1 tuvo un porcentaje de fósforo de 138,6 ppm,

estos valores llamaron la atención ya que diversos autores señalan que a medida

que los niveles de fósforo en el suelo aumentan, se disminuye la infección

micorrizal, esto se refleja en una diminución del porcentaje de infección, tal como

se aprecia en las plantas de tratamiento 1 las cuales presentaron los niveles de

infección micorrizal más bajos.

Figura15: Vesícula observado en el objetivo 10X

Page 67: Tesis cacao

Figura 16: Arbúsculos observado en el objetivo 10X

Figura 17: Hifas observado en el objetivo 10X

Page 68: Tesis cacao

Grafica 1: Porcentaje de infeccion por hifas

Para el porcentaje de infección por hifa los valores más altos fueron alcanzados

por las plantas del tratamiento 2 con un nivel de infección de 30,5 %, frente al

tratamiento 1 con valores de 12,16% (Grafica 1)

Page 69: Tesis cacao

Para el porcentaje de infección por arbúsculos los valores más altos fueron

alcanzados por las plantas del tratamiento 2 con un porcentaje de infección de

2,333 %, mientras que en el tratamiento 1 no se encontraron dichas estructuras

(grafica 2).

Los arbúsculos son un conjunto de hifas intracelulares que forman un

enrollamiento con un alto potencial metabólico el cual sirve como centro de

intercambio bidireccional entre el hongo y la planta. Estos arbúsculos tienen un

período de vida muy corto que oscila entre 2 y 15 días, cuando un arbúsculos

muere o sucumbe es reemplazado por otro más joven, este relevo se repite

mientras el intercambio de nutrientes esta activo, cuando este intercambio cesa

todos los arbúsculos mueren y, de la colonización interna solo quedan las

vesículas que son estructuras de reserva de nutrientes del hongo. Este fenómeno

se pudo apreciar en el tratamiento 1 en el cual no se encontraron arbúsculos, pero

si se detectó la presencia de vesículas las cuales aparecen durante el periodo de

vida de los arbúsculos, evidenciando la presencia previa de arbúsculos en el

tratamiento 1 pero desaparecieron cuando cesó el intercambio de nutrientes,

debido a que el exceso de P, Mn, Fe, Cu y otros elementos, induce a una

disminución en la asociación simbiótica del hongo MA- Planta. Y la planta se ve

forzada a utilizar su propio sistema radical para la obtención de estos elementos

disminuyendo asi la infección micorrizal

Page 70: Tesis cacao

Grafica 2: Porcentaje de infección por arbúsculos

Para el porcentaje de infección por vesículas los valores más altos fueron

alcanzados por las plantas del tratamiento 2 con un porcentaje de 15.5,

mientras que en el tratamiento 1 fue de 4.66. (Figura 3).

Las vesículas son estructuras globosas cuya función es de almacenamiento o

de reserva, ya que en su interior se encuentra densas gotas de grasa (Hodge A.

2000). La formación de vesículas es posterior a la de los arbúsculos y tiene

lugar a partir del hinchamiento de una hifa generalmente terminal. Esta

Page 71: Tesis cacao

estructura es muy común en las especies del género Glomus Acaulospora,

Archaespora, Entrophospora excepto Gigaspora y Scutellospora (honrubia et al

1992). En el género Glomus las vesículas se caracterizan por que pueden

llegar a engrosar sus paredes y convertirse en esporas.

Debido a que la producción de vesículas depende de las actividades de los

arbúsculos, se puede afirmar que la cantidad de vesículas es directamente

proporcional a la cantidad de arbúsculos.

La disminución de vesículas en el tratamiento1 está corroborada por estudios

previos (Smith y Gianinazzi-Pearsson1989,Hetrick et tal 1989, Sieveverding

1991) observaron, que en ocasiones la fertilización con niveles altos de fosforo

reduce los porcentaje de infección y deprime el desarrollo de arbúsculos,

vesículas, hifas externas e internas y disminuye también el número de puntos

de penetración y de esporas (Figura 18)

Page 72: Tesis cacao

Grafica 3: Porcentaje de infección por vesículas

6.2 Altura de las plantas

Los análisis de varianza y la prueba de media de Dunnett realizados a los

tratamientos 1, tratamiento 2 y tratamiento 3 no mostró diferencias

significativas. Sin embargo numéricamente se notó una diferencia en las

plantas del tratamiento 2 (inoculadas no fertilizadas) en el incremento de la

tasa de crecimiento, superando a los otros dos tratamientos (Grafica 4, figuras

18 y 19 ).

Page 73: Tesis cacao

Cuando las plantas se asocian con el hongo para formar micorrizas

arbusculares (MA), se incrementa la absorción del fósforo y otros nutrientes

presentes en la solución del suelo por parte de estas plantas hospederas, esto

es debido a que las hifas del hongo se extienden y exploran un mayor volumen

de suelo, que sería imposible explorar con los pelos radiculares. Por esta razón,

las plantas micorrizicas alcanza un mejor desarrollo que las no micorrizadas en

suelos con bajos contenidos de fósforo disponible. Resultados similares fueron

reportados en muchos trabajos por autores como (Saif, 1977;Tinker, 1978;

Fortín et al., 2002).

Las estimulaciones de los hongos MA en el crecimiento de la planta están

normalmente acompañado de un incremento en el contenido y frecuentemente

la concentración de algunos nutrientes minerales en los tejidos de la planta.

En numerosos trabajos experimentales se ha puesto de manifiesto que como

consecuencia de la formación de la MA, tiene lugar normalmente una

considerable estimulación al ritmo de crecimiento de la planta. La causa de

tales acciones es fundamentalmente inducida por el hongo, aunque como

consecuencia de la formación de la MA se producen diversos cambios

fisiológicos que con mayor o menor grado pueden contribuir dicho incremento al

crecimiento (Smith y Read, 1997)

Page 74: Tesis cacao

Grafica 4: Altura de las plantas en los tratamientos 1, 2 y 3.

Figura 18: Comparacion altura de plantas del tratamiento 2 y tratamiento 3

Page 75: Tesis cacao

Figura 19: Crecimiento de parte foliar y raíz de las plantas con micorriza y sin micorriza

Page 76: Tesis cacao

6.3 Determinación de biomasa (peso seco)

El análisis de varianza realizado a la variable peso seco mostró diferencias

significativas entre los tratamientos. En la prueba de medias por Dunnett

realizada a la parte aérea (hojas y tallos) se observó que el máximo valor fue

obtenido por el tratamiento 2 con un peso de 1,876 gr. (Grafica 5), de igual

manera el tratamiento 2 alcanzó un valor de 0,296 gr, siendo el más alto en la

variable peso seco de la raíz. (Grafica 6). Analizando las variaciones en el

tamaño de las plantas, no es extraño que las características morfométricas de

la variable en cuestión sean mayor en las plantas del tratamiento 2, ya que

según otros autores la presencia de MA hace aumentar la tasa de crecimiento y

un incremento en la producción de biomasa, y que este efecto es mayor en

suelos de baja fertilidad o desequilibrados nutrimentalmente, especialmente

cuando el contenido de fosforo asimilable es bajo (Smith y Read, 1997). El

aumento de la materia seca es debido a que las hifas de las MA exploran un

mayor volumen de suelo aumentando así la capacidad de absorción de

nutrientes en la planta. Se pudo observar que una de las plantas del

tratamiento 1 logro una altura de 35,6 cm y aun así el tratamiento 2 logró

superarlo en la cantidad de peso seco, teniendo plantas con alturas de 33,6 cm,

esto se debe a que la planta del tratamiento 1 a pesar de que eran altas

poseían tallos muy delgados, mientras que en las del tratamiento 2 tenían una

altura cercana 35,6 cm y poseían tallos con mayor diámetro.

Page 77: Tesis cacao

Grafica 5: Porcentaje peso seco parte aérea

Grafica 6 : Porcentaje peso seco de la raiz

Page 78: Tesis cacao

6.4 Análisis de la diversidad de hongos micorrizico s

En la grafica 7 se presentan los conteos totales de las esporas correspondientes a

10 gramos de suelo seco. Para esta variable según el Índice de margalef, que es

una medida utilizada en ecología para estimar la biodiversidad de una comunidad

con base a la distribución numérica de los individuos de las diferentes especies en

función del número de individuos existentes en la muestra analizada. Tiene la

siguiente expresión I=(s-1)/Ln N, donde I es la diversidad, s es el número de

especies presentes, y N es el número total de individuos encontrados

(pertenecientes a todas las especies). La notación Ln denota el logaritmo

neperiano de un número.

De acuerdo a este índice la diversidad es baja para cada tratamiento. Pero en

términos generales el porcentaje de esporas por 10 gramos de suelo no es bajo

para condiciones nativas, si tenemos en cuenta los datos reportados por Collins et

al (1991) quienes encontraron entre 0 y 49 esporas en 1 gramo de suelo en un

experimento en el que se evaluaron poblaciones MA asociadas en cultivos de

maíz y soya de cinco años. Igualmente Douds et al (1995) encontraron entre 1 y

43 esporas por 50 gramos de suelo en cultivo de maíz, soya y trigo en sistemas de

labranza convencional y mínima.

A partir del aislamiento de las esporas se encontraron seis de los géneros

conocidos: Glomus, Acaulospora, Entrophospora, Gigaspora, Archaeospora y

Page 79: Tesis cacao

Scutellospora (figuras 20, 21,22, 23, 24) siendo el más común el género Glomus

en cada uno de los tratamientos. Se logró incrementar el número total de esporas

del suelo muestreado, pero no en todos los géneros se obtuvo la misma tasa de

multiplicación. Esto coincide con lo señalado por Morton y Benny (1990), quien

observó que algunas especies presentes en los suelos pueden disminuir su

número o incluso desaparecer, cuando se les intenta multiplicar en macetas de

propagación, debido a factores ambientales desconocidos o a las condiciones del

invernadero, otras especies raras o aparentemente inexistentes pueden en cambio

incrementar su número.

Grafica 7: Numero de esporas por género en cada uno de los tratamientos

Page 80: Tesis cacao

Figura 20: Entrophospora (Dávila, Rosales, Ramos) Figura 21: Acaulospora (Rosales)

Figura 22: Glomus(Dávila, Ramos, Rosales) Figura 23: Archaeospora (Dávila, Rosales)

Page 81: Tesis cacao

Figura 24: Scutellospora (Dávila, Rosales) Figura 25: Gigaspora (Dávila, Ramos, Rosales)

Page 82: Tesis cacao

7. CONCLUSIONES

� El suelo del municipio de Pueblo Bello es rico en diversidad de esporas de

hongos MA.

� Las plantas trampas de maíz (Zea mays) inoculadas respondieron

significativamente a la infección y esporulación por los hongos MA nativos,

mostrando mayores niveles de infección micorrizal y producción de esporas

MA en las plantas inoculadas no fertilizadas.

� El mayor porcentaje de infección por hifas fue alcanzado por las plantas

inoculadas no fertilizadas.

� El mayor porcentaje de infección por Arbúsculos fue alcanzado por las

plantas inoculadas no fertilizadas

� El mayor porcentaje de infección por vesículas fue alcanzado por las

plantas inoculadas no fertilizadas

� El mayor rendimiento en la tasa de crecimiento fue alcanzado por el

tratamiento de las plantas inoculadas no fertilizadas

� Los mayores rendimientos de porcentaje de materia seca fueron

alcanzados por las plantas inoculadas no fertilizadas.

Page 83: Tesis cacao

� Existe una asociación inversamente proporcional entre el porcentaje de

infección y la cantidad de nutrientes presentes en el suelo.

� El género micorrizico predominante con mayor abundancia relativa dentro

de la población de esporas aisladas en los tratamientos fue Glomus.

� El tratamiento que mostró la mayor abundancia relativa de esporas fue el de

las plantas inoculadas no fertilizadas.

� Las plantas inoculadas sin fertilizante respondieron significativamente a la

infección por hongos micorrizicos arbusculares con un alto contenido de

fosforo, a pesar que la literatura dice que cuanto hay alto contenido de

fosforo se inhibe la infección.

Page 84: Tesis cacao

8. RECOMENDACIONES

� Utilizar varias tipos de plantas trampas en la multiplicación de estos hongos

ya que los hongos MA no son altamente específicos en el momento de

infectar a una planta determinada pero si existe afinidad o compatibilidad

con ciertas especies vegetales.

� Realizar nuevos aislamientos de hongos MA nativos en otras regiones

donde se cultiva cacao con el fin de caracterizarlas, identificarlas y evaluar

el comportamiento de las mismas, con el objeto de producir un pool de

estos individuos como inoculo potencial.

� Establecer cultivos monoesporicos con el fin de evaluar la multiplicación,

infectividad y efectividad de cada uno de los géneros individualmente.

� Evaluar los factores que afectan el proceso de micorrización en

condiciones naturales estableciendo la habilidad competitiva y estudiando

su infectividad en las plantas

� Continuar con este tipo de investigaciones con el fin de evaluar las

micorrizas nativas en los diferentes cultivos agroforestales

Page 85: Tesis cacao

� Realizar cultivos monoesporicos con cada uno de los géneros multiplicados

para evaluar la infectividad y efectividad de cada uno de ellos.

Page 86: Tesis cacao

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Page 92: Tesis cacao

ANEXOS

Peso seco de la parte aérea de las plantas (en gr)

Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 (control)

0,5 2,63 1,3

1 1,5 1,8

0,7 1,5 2,1

0 0 0

0 0 0

Anexo 1: Resultados del peso seco de la parte aérea de las plantas en los

diferentes tratamientos

Peso seco Raíz de las plantas (en gr)

Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 (control)

0,1 0,35 0,1

0,1 0,3 0,2

0,2 0,24 0,1

Gr gr gr

Gr gr gr

Anexo 2: Resultados del peso seco de la raíz de las plantas en gramos

Page 93: Tesis cacao

Altura 45 días

Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 (control)

19 37 35

25 32 34

27 34 34

20 36 32

25 31 21

Anexo 3: Altura de las plantas a los 45 días de edad

Altura 60 días

Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 (control)

24 45 40

31 34 38

33 37 37

24 42 38

30 0 25

Anexo 4: Altura de las plantas a los 60 días de edad

Page 94: Tesis cacao

Altura 75 días

Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 (control)

28 67 43

36 0 40

37 42 0

27 48 42

0 0 0

Anexo 5: Altura de las plantas a los 75 días de edad

Altura 90 días

Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 (control)

32 70 45

40 0 42

0 46 0

0 52 44

0 0 0

Anexo 6: Altura de las plantas a los 90 días de edad

Page 95: Tesis cacao

Número de esporas en 10 gr de suelo

Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento X (suelo nativo)

309 224 77

115 344 86

165 233 79

Anexo 7: Número de esporas en 10 gr de suelo

Infección por hifas

Tratamiento 1 Tratamiento 2

22 50

8 28

6 29

2 12

23 40

12 24

Anexo 8: Infección por hifas

Page 96: Tesis cacao

Anexo 9: Infección por arbúsculos

Infección por vesículas

Tratamiento 1 Tratamiento 2

0 14

1 16

0 17

1 10

15 15

11 21

Anexo 10: Infección por vesículas

Infección por arbúsculos

Tratamiento 1 Tratamiento 2

0 4

0 3

0 2

0 1

0 2

0 2

Page 97: Tesis cacao

Numero de vesículas por laminas

Tratamiento 1 Tratamiento 2

0 251

1 282

0 322

19 202

198 261

172 439

Anexo 11: Numero de vesículas por laminas

Anexo 12: Porcentaje de esporas por genero

Tabla 8: Numero de esporas por genero

Genero Tratamiento 1

Tratamiento 2

Tratamiento X (suelo nativo)

Glomus 154 364 144

Entrophospora 12 78 22

Acaulospora 205 61 10

Archaeospora 21 48 13

Paraglomus 0 0 0

Gigaspora 20 67 17

Scutellospora 108 92 25

total 520 710 231