Amino acid variants in tha human glucose-dependent
insulinotropic polypeptide (GIP) receptor The impact on the pancreatic ß cell response and functional expression
INTRODUCCIÓN
SUJETOS, MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
INTRODUCCIÓN INCRETINAS
Determinar la organización exon-intron del receptor GIP humano
Variabilidad genética del receptor GIP afecta la respuesta de las células ß pancreáticas
Receptores GIP alterados exhiben modificaciones en la respuesta a la producción de cAMP
SUJETOS, MATERIALES Y
MÉTODOS SUJETOS
RECEPTOR GIP ALTERACIONES EN LA ESTRUCTURA DE GIP
MATERIALES
Y MÉTODOS
Organización Exon-Intron en receptor GIP humano
Análisis de la conformación del polimorfismo de cadena sencilla
Ensayos de detección de mutaciones identificadas en receptor GIP
Ensayos para medición de variables en sangre
Construcción de receptor GIP
Análisis de cAMP
Análisis de acoplamiento
MATERIALES Y MÉTODOS
Organización Exon-Intron en receptor GIP humano
• Expand High Fidelity PCR System • Taq polimerasa
Análisis de la conformación del polimorfismo de cadena sencilla
• 100 ng DNA genómico- 25µl
MATERIALES Y MÉTODOS
Ensayos de detección de mutaciones identificadas en receptor GIP
• A207V (GcGGTG) 268 bp • E354Q (GAGCAG) 217 bp
Ensayos para medición de variables en sangre
• Glucosa, Insulina y Péptido C • GIP Detección Radioinmunológica
MATERIALES Y MÉTODOS Construcción de receptor GIP • Sitio de mutagénesis • Vector pcDNA-3
Análisis de cAMP • Las células fueron lisadas y el AMPc intracelular
fragmentado con tripsina se separó en Sephadex y columnas de alúmina.
Análisis de acoplamientos • No aumento la concentración competitiva de GIP
no radioactivo
SEPHADEX
Gel Dextrano utilizado para filtración y cromatografías
RESULTADOS
RESULTADOS
Caracterización del gen del receptor GIP
SSCP primarios de exploración de los receptores GIP
Estudios de asociación de las variantes de aminoácidos en el receptor GIP.
Características de sujetos tolerantes a la glucosa que poseen alteraciones en el receptor GIP
GIP estimula la producción de cAMP
Unión de GIP al receptor GIP
MATERIALES Y MÉTODOS
Caracterización del gen del receptor GIP
• 14 exones + exon 5´no traducido • 100 bp secuencias intronicas en ambos sitios de los exones
Análisis de la conformación del polimorfismo de cadena sencilla
• GCG heterocigotos GTG para la sustitución en el exón 7 en el codón 207 cambia una alanina a valina (A207V)
• Polimorfismo en el exón 12 en el codón 354 en el que GAG cambia a CAG provocando una sustitución de ácido glutámico por glutamina (E354Q).
MATERIALES Y MÉTODOS
Estudios de asociación de las variantes de aminoácidos en el receptor GIP.
• Grupo control: 23.2% • Pacientes DM II: 24.9%
Características de sujetos tolerantes a la glucosa que poseen alteraciones en el receptor GIP
• Homocigotos 25%+ en ayuno • Ambos grupos aumento después de la ingesta de glucosa
(75 grs.)
MATERIALES Y MÉTODOS
GIP estimula la producción de cAMP • Sujeto con alteración en codon 354 en receptor GIP
muestra disminución de 11% de niveles de GIP en comparación de receptores normales o variante A207V
• Aunque los niveles de GIP aumenten, receptores con mutación 354 reduce su efecto.
Unión de GIP al receptor GIP • La unión a receptores normales y mutados se mostro
similar.
DISCUSIÓN
Mutaciones en el receptor GIP no confiere mayor riesgo
25% + concentración de GIP en homocigotos 354
La producción de cAMP fue menor en sujetos con mutación 354
El efecto dosis-Respuesta no mostró alteración relevante.
No se evidencia alteraciones de la unión a receptor mutado 354