Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de
Pleurotus spp., sobre los nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus spp. asociados a los cultivos de tomate y
plátano.
Janeth Alexandra Sierra Monroy
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias Agrarias
Escuela de Posgrados
Palmira, Colombia
2014
Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de
Pleurotus spp., sobre los nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus spp. asociados a los cultivos de tomate y
plátano.
Janeth Alexandra Sierra Monroy
Tesis de investigación presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias Agrarias
Director:
Ph.D., Carlos Germán Muñoz Perea.
Codirector:
M.Sc., José Fernando Restrepo Henao
Línea de Investigación:
Protección de Cultivos
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias Agrarias
Escuela de Posgrados
Palmira, Colombia
2014
La ignorancia afirma o niega rotundamente;
la ciencia duda
Voltaire
Agradecimientos
A la Dra. Patricia Velez- Soluciones Microbianas del Trópico, por incluirme dentro
del macroproyecto “Desarrollo de inóculos microbianos con acción nematicida,
bactericida y descomponedora de residuos de cultivo de café y plátano in situ”
A la Dra. María José Boteo y Nathali López Cardona - ICA, por compartir sus
conocimientos, experiencias de vida y apoyo incondicional en este proceso
Al Dr. José Fernando Restrepo- Soluciones Microbianas del Trópico, por su
apoyo en campo y compartir sus conocimientos
Al Dr. Carlos Germán Muñoz-Universidad Nacional de Colombia. Sede Palmira,
por el apoyo incondicional en este proceso.
Al Dr. Nelson Ceballos- Universidad de Caldas, por su apoyo estadístico y moral.
Al Dr. Oscar Guzmán- Universidad de Caldas, por su guía en el proceso de la
tesis.
A Luis Bernardo Gutiérrez auxiliar de Fitopatología- Universidad de Caldas, por
su guía en la realización de trabajo de laboratorio.
A todos los miembros del laboratorio de Veterinaria ICA, por su ayuda y ánimo en
este proceso.
A Josué Ramos Ingeniero Agrónomo ICA, Rocío Alexandra Ortiz estudiante de
Maestría Universidad de Caldas y Jenifer Galeano, por ser incondicionales,
apoyarme y compartir sus conocimientos. A todas y cada una de las personas
que colaboraron en este trabajo.
Resumen y Abstract IX
Resumen
Como alternativa al control químico de nematodos existen hongos nematófagos
productores de toxinas. Se evaluó la acción nemostática y nematicida in vitro e in vivo
con especies de Pleurotus spp. sobre Radopholus sp. y Meloidogyne spp. En el primer
estudio se utilizó P. ostreatus, P. pulmonarius, P. sajor-caju y una mezcla de los tres en
concentraciones de 20, 50 y 75 g en 200 mL agua destilada estéril (ADE), sobre 25
nematodos, incluido un tratamiento químico 330 ppm y uno biológico comercial 2g/L,
durante 24, 48 y 72h de exposición. Se obtuvo diferencias significativas entre los
tratamientos; tanto para P. ostreatus en Meloidogyne spp como para P. sajor-caju en
Radopholus demostraron su eficiencia a las 72h con 75g. En el segundo estudio se
utilizó P. ostreatus para Meloidogyne en plántulas de tomate y P. sajor-caju para
Radopholus en plátano en concentraciones de 75 y 150 g en 200 ml. En almacigo se
estableció que los hongos fueron efectivos para el control de Meloidogyne spp y
Radopholus sp con 64% y 53% de reducción respectivamente, con 150 g en 200 mL
comparados con los testigos.
Palabras clave: Fitonematodos, nematicida, nematostático, Biocontrol, tomate rutgers,
plátano dominico hartón, Basidiomycota.
X Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
Abstract
As an alternative to chemical control of nematodes there are nematophagous fungi that
produce toxins. The nemostatic and nematicide action in vitro and in vivo with Pleurotus
spp. on Radopholus sp. and Meloidogyne spp. was evaluated. In a first study, P.
ostreatus, P. pulmonarius, P. sajor-caju and a mixture of the three, in concentrations of
20, 50 and 75 g in 200 mL (sterile distilled water: SDW), were used on 25 nematodes,
together with a chemical treatment 330 ppm and a biological commercial treatment 2g / L.
All the treatments were applied for 24, 48 and 72 hours. A significant difference between
treatments was obtained; both P. ostreatus on Meloidogyne spp., and P. sajor-caju on
Radopholus showed its efficiency after 72 h with 75g. In the second study, P. ostreatus
was used on Meloidogyne in tomato seedlings, and P. sajor -caju on Radopholus in
banana at concentrations of 75 and 150 g in 200 ml (SDW). In plant nurseries was
established that the fungi were effective for the control of Meloidogyne spp and
Radopholus sp with 64% and 53 % reduction respectively, with 150 g in 200 mL
compared to controls.
Keywords: Phytonematodes, nematicide, nematostatic, biological control, Rutgers
tomato, Dominico hartón banana, Basidiomycota.
Contenido XI
Contenido
Pág.
Resumen ......................................................................................................................... IX
Abstract............................................................................................................................ X
Lista de figuras ............................................................................................................ XIV
Lista de tablas ............................................................................................................. XVI
Lista de Símbolos y abreviaturas .............................................................................. XVII
Introducción .................................................................................................................... 1
1. Capítulo 1: Objetivos y Marco teórico .................................................................... 5
1.1 Objetivo ........................................................................................................... 5 1.1.1 Objetivos específicos ............................................................................ 5
1.2 Marco teórico ................................................................................................... 5 1.2.1 Taxonomía y fenología del Plátano ....................................................... 5
1.2.2 Importancia del plátano en Colombia .................................................... 6
1.2.3 Principales plagas y enfermedades del plátano..................................... 7
1.2.4 Taxonomía y fenología del cultivo de tomate ........................................ 7
1.2.5 Importancia del tomate en Colombia ..................................................... 8
1.2.6 Principales plagas y enfermedades ....................................................... 8
1.2.7 Clasificación taxonómica Radopholus similis (Cobb) Thorne (nematodo
Barrenador) ......................................................................................................... 9
1.2.8 Ciclo biológico y patológico R. similis .................................................... 9
1.2.9 Síntomas y daño causado por R. similis .............................................. 10
1.2.10 Clasificación taxonómica Meloidogyne spp. Chitwood (nematodo del
Nudo de la raíz) ................................................................................................. 11
1.2.11 Ciclo biológico y patológico de Meloidogyne spp. ................................ 11
XII Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
1.2.12 Síntomas y daños causado por Meloidogyne spp. ...............................12
1.2.13 Taxonomía y morfología del género Pleurotus .....................................13
1.2.14 Ciclo biológico de los Basidiomycetes .................................................14
1.2.15 Importancia de los hongos del género Pleurotus .................................15
1.2.16 Acción nematicida del género Pleurotus ..............................................15
2. Capítulo 2: Evaluación de la acción nematicida in vitro de especies de
Pleurotus spp., sobre los nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. .............17
2.1 Materiales y Métodos .....................................................................................17 2.1.1 Localización .........................................................................................17
2.1.2 Método de extracción ...........................................................................17
2.1.3 Identificación de especies de Meloidogyne en tomate .........................19
2.1.4 Identificación de especies de Radopholus en plátano ..........................21
2.1.5 Determinación in vitro de la concentración nematostática y/o
nematicida. ........................................................................................................22
2.2 Resultados .....................................................................................................25 2.2.1 Identificación de las especies del género Meloidogyne spp .................25
2.2.2 Nematodos del género Radopholus sp ................................................26
2.2.3 Nematodos del género Meloidogyne spp .............................................27
2.2.4 Nematodos del género Radopholus sp ................................................31
2.3 Discusión ........................................................................................................36
3. Capítulo 3: Evaluación in vivo la acción nematicida de P. sajor-caju y P.
ostreatus sobre los nematodos Radopholus sp. y Meloidogyne spp. en plátano y
tomate respectivamente. ...............................................................................................41
3.1 Materiales y Métodos .....................................................................................41 3.1.1 Localización .........................................................................................41
3.1.2 Evaluación in vivo de la acción nematicida de Pleurotus spp sobre los
nematodos Radopholus sp. y Meloidogyne spp. ................................................41
3.2 Resultados .....................................................................................................44 3.2.1 Meloidogyne: Altura de plántulas (cm) y peso seco .............................44
3.2.2 Meloidogyne: Número de nematodos fitoparásitos en 100 g de raíces e
índice de nudosidad ...........................................................................................46
3.2.3 Radopholus: Altura de plántulas (cm) y peso seco ..............................50
3.2.4 Radopholus: Número de nematodos fitoparásitos en 100 g de raíces .51
3.3 Discusión ........................................................................................................53
Contenido XIII
4. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................ 57
4.1 Conclusiones ................................................................................................. 57 4.2 Recomendaciones ......................................................................................... 57
A. Anexo: Análisis de varianza para el efecto nematostatico y nematicida a las 24
horas sobre Meloidogyne spp. ..................................................................................... 59
B. Anexo: Análisis de varianza para efecto nematostatico y nematicida a las 48
horas sobre Meloidogyne spp. ..................................................................................... 61
C. Anexo: Interacción tratamiento*concentración*tiempo de exposición sobre la
mortalidad de Meloidogyne spp ................................................................................... 63
D. Anexo: Análisis de varianza del efecto nematostatico y nematicida a las 24
horas sobre Radopholus sp ......................................................................................... 65
E. Anexo: Análisis de varianza para efecto nematostatico y nematicida a las 48
horas sobre Radopholus sp ......................................................................................... 66
F. Anexo: Interacción tratamiento*concentración*tiempo de exposición sobre la
mortalidad de Radopholus sp ...................................................................................... 67
Bibliografía .................................................................................................................. 69
Contenido XIV
Lista de figuras
Pág.
Figura 1-1: Volcamiento de plantas de plátano y necrosamiento de raíz debido al ataque
de nematodos (Gonzáles 2012). ..................................................................................... 11
Figura 1-2: Marchitez plantas de tomate y nudosidades de raíz debido al ataque de
nematodos. ..................................................................................................................... 13
Figura 1-3: Pleurotus ostreatus cultivado en arroz. ......................................................... 14
Figura 1-4: Hifa de Pleurotus ostreatus produciendo gotas de toxina y parasitación del
nematodo Meloidogyne (Heydari et al. 2006). ................................................................. 16
Figura 2-1: Esquema del método de extracción. A. Licuado de raíces. B. Tamices. C.
Sobrenadante. D. Centrifugado del sobrenadante. E. Solución de sacarosa. F.
Centrifugación con sacarosa. G. Sobrenadante lavado con agua. .................................. 18
Figura 2-2: Hembras adultas de Meloidogyne spp. extraídas de raíces de tomate. ......... 19
Figura 2-3: Morfología generalizada de un patrón perineal (Eisenback et al. 1981). ....... 20
Figura 2-4: Corte de un patrón perineal. (A, B). Corte de la hembra en la región de la
cabeza y remoción del contenido del cuerpo. (C) Corte de la hembra en la mitad de
cuerpo donde se remueve la parte anterior de la hembra y se deja la parte posterior. (D)
Corte de la región perineal (E) patrón perineal listo para el montaje (Hartman y Sasser
1985). ............................................................................................................................. 20
Figura 2-5: Radopholus similis (A) Macho. (B)Hembra. (C, D) cabeza de la hembra. (E, F)
cabeza del macho (Hunt et al. 2005) ............................................................................... 21
Figura 2-6: Individuos móviles e inmóviles ...................................................................... 24
Figura 2-7: Corte perineal de Meloidogyne incognita ...................................................... 25
Figura 2-8: Corte perineal de Meloidogyne javanica ....................................................... 26
Figura 2-9: Radopholus similis (A) cabeza de la hembra. (B) cola de la hembra (C)
cabeza del macho (D) cola del macho ............................................................................ 27
Figura 2-10: Efecto nematostático in vitro Meloidogyne a diferentes concentraciones y
tiempos de exposición ..................................................................................................... 29
Contenido XV
Figura 2-11: Efecto nematicida in vitro Meloidogyne a diferentes concentraciones y
tiempos de exposición .................................................................................................... 30
Figura 2-12: Efecto nemostatico sobre Meloidogyne a las 72 horas con tratamientos a
base de las especies de Pleurotus ................................................................................. 30
Figura 2-13: Efecto nematicida sobre Meloidogyne a las 72 horas con tratamientos a
base de las especies de Pleurotus. ................................................................................ 31
Figura 2-14: Efecto nematostático in vitro Radopholus a diferentes concentraciones y
tiempos de exposición. ................................................................................................... 33
Figura 2-15: Efecto nematicida in vitro Radopholus a diferentes concentraciones y
tiempos de exposición .................................................................................................... 34
Figura 2-16: Efecto nemostático sobre Radopholus a las 72 horas con tratamientos a
base de las especie de Pleurotus. .................................................................................. 35
Figura 2-17: Efecto nematicida sobre Radopholus a las 72horas con tratamientos a base
de las especie de Pleurotus............................................................................................ 36
Figura 3-1: Pelado de cormo de plátano y desinfestación del suelo. .............................. 42
Figura 3-2: Plantas de tomate y plátano en almacigo. .................................................... 43
Figura 3-3: Índice de nudosidad del nematodo Meloidogyne sp. 1: Ausencia de
nudosidad; 3: 1-2 nudosidad por planta; 5: 3-10 nudosidad por planta; 7: 11-30 nudosidad
por planta; 9 más de 30 nudosidad por planta (Castaño 1990). ...................................... 43
Figura 3-4: Altura (cm) de plántulas de tomate Rutgers en cuatro mediciones de altura 45
Figura 3-5: Peso seco del tallo y peso seco de la raíz en tomate Rutgers ...................... 46
Figura 3-6: Peso seco de la raíz en tomate Rutgers ....................................................... 46
Figura 3-7: Número de nematodos en 100 g de raíces en plántulas de tomate Rutgers. 47
Figura 3-8: Índice de nudosidad de raíces en plántulas de tomate Rutgers .................... 48
Figura 3-9: Raíces con nudosidad en plántulas de tomate Rutgers para los tratamientos,
T1 (Agua sin nematodos), T2 (Agua + nematodos), T3 (TROPIMEZCLA® WP), T4
(Carbofuran), T5 (P. ostreatus 75 g/200 mL), T6 (P. ostreatus 150 g/200 mL) ............... 49
Figura 3-10: Peso seco de la raíz en Plátano Dominico Hartón. ..................................... 50
Figura 3-11: Número de nematodos en 100 g de raíces en plántulas de plátano Dominico
Hartón. ........................................................................................................................... 51
Figura 3-12: Raíces de Plátano para los tratamientos: T1 (Agua sin nematodos), T2
(Agua + nematodos), T3 (TROPIMEZCLA® WP), T4 (Carbofuran), T5 (P. sajor-caju 75
g/200 mL), T6 (P. sajor-caju 150 g/200 mL) ................................................................... 52
Contenido XVI
Lista de tablas
Pág.
Tabla 2-1: Tratamientos para la evaluación del efecto nematicida y/o nematostático sobre
Radopholus sp. y Meloidogyne spp, (in vitro). ................................................................. 24
Tabla 2-2: Análisis de varianza del efecto nematostatico y nematicida a las 72 horas
sobre Meloidogyne. ......................................................................................................... 28
Tabla 2-3: Análisis de varianza del efecto nematostatico y nematicida a las 72 horas
sobre Radopholus. .......................................................................................................... 32
Tabla 3-1: Tratamientos para la evaluación del efecto de las especies de Pleurotus con
mayor efecto nematicida sobre Radopholus sp. y Meloidogyne spp (in vivo). ................. 44
Tabla 3-2: Población en 100 g de raíces (juveniles de segundo estadio (J2)), índice de
nudosidad y porcentaje de reducción. ............................................................................. 48
Contenido XVII
Lista de Símbolos y abreviaturas
Símbolos con letras latinas
Símbolo Término Unidad SI Definición
P Peso g
V Volumen ml
T Temperatura C° DF
Símbolos con letras griegas
Abreviaturas
Abreviatura Término
AA Agar agua
ADE Agua destilada estéril
Agu Agua
Biol Biológico
Carb Carbofuran
J2 Juveniles Meloidogyne spp.
Mez Mezcla de Pleurotus spp.
PO Pleurotus ostreatus
PSC Pleurotus sajor-caju
PP Pleurotus pulmonarius
UFC Unidades Formadoras de Colonias
Introducción
Diferentes cultivos conforman la base de la alimentación de la población colombiana y
mundial, por tal razón la canasta familiar demanda diariamente productos tales como el
plátano y tomate.
El plátano es una fruta tropical originada en el suroeste asiático, perteneciente a la familia
de las musáceas. Las dos especies más conocidas en nuestro medio son: Musa
paradisíaca y M. sapientum. En conjunto es la fruta tropical más cultivada y una de los
cuatro productos vegetales más importantes en términos globales, después del arroz, el
trigo y el maíz. Según la FAO, para 2012, se registraron en el mundo 5´407.361
hectáreas de plátano, siendo el mayor productor Uganda, con el 31.4% del área
cosechada en el mundo, seguido de Nigeria con 8.4%, Costa de Marfil con 7.7% y
Colombia por su parte participa en un cuarto puesto con el 6.7% del área mundial
cosechada (FAOSTAT 2013).
En Colombia, hay aproximadamente 197.144 hectáreas sembradas de plátano para el
2013 (DANE 2013). Se estima que, del área cultivada en plátano en Colombia, un 89.7%
es cultivo tradicional asociado con café, cacao, yuca y frutales, y el restante 10.3% es
monocultivo tecnificado (Martínez et al. 2006). Los departamentos exportadores de
plátano son Arauca y Antioquia, con participaciones en la producción nacional del 12.1%
y 9% respectivamente (Agronet 2013). En cuanto a su papel en la canasta familiar, el
plátano ocupa el tercer puesto después de la papa y la leche (Belalcázar et al. 1991).
Por otra parte, el tomate es una de las hortalizas de mayor importancia en el mundo
después de la papa, tanto por su área sembrada como por su alto nivel de consumo. Se
cultiva en todas las latitudes y climas variados (Blancard 2011). A nivel mundial se
encuentran sembradas 4´4803.680 ha siendo los principales países productores China
con el 20.8% del área cosechada en el mundo; India con 18.1%; Turquía con 6.2%,
2 Introducción
Nigeria con 5.6% y por último Colombia con el 0.4% de la producción mundial (FAOSTAT
2013).
La producción de tomate en Colombia está concentrada en los departamentos de
Cundinamarca, Norte de Santander con 60.791,4 ton/ha, Antioquia 30.750,6 ton/ha,
Boyacá 30.845,4 y Santander con 25.207,2 ton/ha (Agronet 2013). Para el año 2012 se
sembraron 6.867 hectáreas, lo cual representó el 8.1% del área hortícola del país, con un
volumen de producción de 175.706 toneladas y un rendimiento aproximado de 28 ton/ha
(Agronet 2013; DANE 2013).
En los sistemas de cultivo intensivo, de los que forman parte el plátano y tomate, uno de
los mayores limitantes es el daño ocasionado por nematodos en las raíces, esto afecta el
crecimiento y el desarrollo de las plantas (Araya 2003; Gil et al. 2003; Guzmán 2011). El
fitonematodo Radopholus, es el más abundante y la principal especie fitoparásita en
plátano, representa el 82 y 97% de la población de nematodos en raíces y cormos (Araya
y Moens 2003). Por su parte Meloidigyne, o nematodo del nudo radical, es uno de los
patógenos más estudiados en el mundo en virtud a su amplia distribución geográfica y
los altos daños económicos causados particularmente en tomate (Hincapié y Leguizamón
1999).
Dentro de las medidas de manejo de nematodos, en estos cultivos se realiza mediante la
aplicación de nematicidas al suelo; sin embargo, estudios como el de Hincapié y
leguizamón (1999), han demostrado que los químicos de acción sistémica no son
absorbidos ni trasportados por un sistema radical dañado por acción del nematodo, y los
productos de contacto, reducen las poblaciones de manera provisional; lo que obliga al
agricultor a realizar contantes aplicaciones, generándole altos costos en químicos, que
además, presentan altos niveles de toxicidad extremadamente nocivas para el medio
ambiente y la salud humana (Rosales et al. 1998; Sarah 1998; Araya 2003; Gil et al.
2003).
Como alternativa al control químico existe, la posibilidad de usar herramientas biológicas
como hongos nematófagos en el marco de programas de manejo integrado (Alzate et al.
2012). Algunas especies de hongos basidiomicetos pueden atacar y consumir nematodos
(Luo et al. 2004). Aparte de su habilidad nematófaga muchos de estos hongos pueden
Introducción 3
también vivir saprofíticamente en materia orgánica, atacar otros hongos (micoparásitos) y
colonizar raíces de plantas como endófitos (Hibbett y Thorn 1994). El hongo
descomponedor de madera Pleurotus ostreatus y otras especies del género Pleurotus
producen toxinas tales como el ácido trans-2 decenodioico, que al entrar en contacto con
los nematodos causan inmovilización de estos en cuestión de 30 segundos,
posteriormente las hifas penetran a través de los orificios del nematodo colonizando y
digiriendo completamente al huésped, utilizando su contenido como fuente de nitrógeno
(Barron y Thorn 1987; Hibbett y Thorn 1994; Heydari et al. 2006), En pruebas in vitro,
Mamiya et al. (2005) reportan hongos como Pleurotus ostreatus, P. pulmonarius, P.
eryngii, que tienen la habilidad de inmovilizar y matar rápidamente al nemátodo
Bursaphelenchus xylophilus, que ataca pino. Por su parte Heydari et al. (2006), evaluaron
el efecto antagonista de 5 especies de Pleurotus en estados juveniles (j2) de
Meloidogyne javanica en pruebas in vitro. Todas las especies produjeron pequeñas gotas
de toxina que inmovilizaban rápidamente a los nematodos que posteriormente eran
colonizados por el hongo.
Dada la necesidad de estrategias de Manejo Integrado de Plagas (MIP), que no generen
desequilibro en los agroecosistemas, y con base en estudios anteriores (Barron y Thorn
1987; Hibbett y Thorn 1994; Heydari et al. 2006), el presente trabajo propone evaluar la
acción nematicida in vitro e in vivo de tres especies del género Pleurotus por separado y
en conjunto, sobre los nematodos Radopholus sp. y Meloidogyne spp.
1. Capítulo 1: Objetivos y Marco teórico
1.1 Objetivo
Evaluar la acción nematicida in vitro e in vivo de especies del género Pleurotus, sobre los
nematodos Radopholus sp. y Meloidogyne spp. asociados a los cultivos de plátano y
tomate respectivamente.
1.1.1 Objetivos específicos
Determinar in vitro la concentración nematostática y/o nematicida de los inóculos de
tres especies del género Pleurotus. y su mezcla, para el control de Radopholus sp. y
Meloidogyne spp.
Estimar in vivo la acción nematicida de la concentración seleccionada de una de las
tres especies del género Pleurotus. sobre los nematodos Radopholus sp. y
Meloidogyne spp. en plátano y tomate respectivamente.
1.2 Marco teórico
1.2.1 Taxonomía y fenología del Plátano
El plátano es una planta monocotiledónea herbácea perteneciente a la familia de las
Musáceas. Es originaria del sudeste Asiático y fue traída a nuestro país por los
españoles en el siglo XVl. Las especies más importantes en la familia Musaceae son
Musa acuminata y Musa balbisiana, de cuyos cruzamientos interespecíficos se ha
originado la mayoría de los cultivares de plátano comestibles más importantes del mundo
(Stover y Simmonds 1987).
El plátano, consta de un tallo subterráneo (cormo ó rizoma) del cual brota un Pseudotallo
aéreo; el Cormo emite raíces y yemas laterales que formaran los hijos o retoños.
6 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos
Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
Morfológicamente, el desarrollo de una planta de plátano comprende tres fases:
vegetativa, floral y de fructificación (Guerrero 2010).
a) Fase Vegetativa. Tiene una duración de 6 meses y al comienzo de esta ocurre la
formación de raíces principales y secundarias, desarrollo de pseudotallo e hijos.
b) Fase Floral. Tiene una duración aproximada de tres meses a partir de los seis meses
de la fase vegetativa. El tallo floral se eleva del Cormo a través del pseudotallo y es
visible hasta el momento de la aparición de la inflorescencia.
c) Fase de Fructificación. Tiene una duración aproximada de tres meses y ocurre
después de la fase floral. En esta fase se diferencia las flores masculinas y las flores
femeninas (dedos) y hay una disminución gradual del área foliar y finaliza con la cosecha,
el tiempo desde inicio de la floración a la cosecha del racimo es de 81 a 90 días.
1.2.2 Importancia del plátano en Colombia
El plátano es uno de los productos básicos de la dieta alimentaria de los países en
desarrollo, ya que junto con las raíces y los tubérculos, aportan el 40% del total de la
oferta de alimentos en términos de calorías (Meek y Navarrete 2001; Espinel et al. 2006).
Es utilizado en la agroindustria para la producción de harina y de alimentos concentrados
para alimentación animal, así como para la producción de plátano procesado. Este
producto es básico en la dieta de los colombianos, tiene un consumo per capita de 61, 9
kg/año. Las variedades de plátano que más se cultivan, son la variedad dominico hartón
(Musa AAB), Dominico además de otros como el guayabo y guineo etc, distribuidos en
monocultivo e intercalados con otros cultivos (Meek y Navarrete 2001; Espinel et al.
2006).
En Colombia, el plátano es un sector tradicional de la económica campesina, debido a la
seguridad alimentaria, generación de empleo, mejorando el nivel de vida de los
agricultores. Representa el 9,69% del valor de la producción agrícola y su producción
anual se estima en tres millones de toneladas en un área de 380.000 hectáreas,
ocupando el quinto lugar después del café, la caña de azúcar, la papa y las flores
(Corporación Colombia Internacional 2000; Meek y Navarrete 2001; Espinel et al. 2006).
Capítulo 1: Objetivos y Marco teórico 7
1.2.3 Principales plagas y enfermedades del plátano
Algunos de los problemas fitosanitarios más importantes en el cultivo del plátano son las
sigatokas negra y amarilla (Mycosphaerella spp.) que afectan el follaje, el Picudo negro
(Cosmopolites sordidus) que afecta el cormo y los nematodos fitoparásitos que afectan
las raíces y el cormo (Guzmán y Castaño 2004; Guzmán 2011). Los nemátodos en
particular han obligado el desarrollo de varios métodos de manejo, desde químicos hasta
biológicos, que permiten disminuir los daños que ocasionan (Montiel et al. 1997; Buriticá
1999; Guzmán y Castaño 2004).
La problemática con los nematodos se agrava por la falta de prácticas adecuadas de
cultivo por parte de los agricultores, por la siembra de variedades susceptibles y por el
desconocimiento técnico sobre el manejo agronómico de los mismos; pero
principalmente por la utilización de semilla de plátano de baja calidad, la cual propicia la
propagación y generalización de plagas, enfermedades Moko (Ralstonia solanacearum) y
los nematodos fitoparásitos como Radopholus similis (Sarah et al. 1996; Palencia et al.
2006).
1.2.4 Taxonomía y fenología del cultivo de tomate
El tomate es una es una hortaliza perteneciente a la familia de las Solanáceas. Es
originario de Sudamérica, domesticado en México y se ha convertido en una de las
hortaliza más importantes del siglo XX (Noreña et al. 2006; Jaramillo et al. 2007;
Blancard 2011).
La duración del ciclo tomate está determinada por la variedad, manejo agronómico y las
condiciones climáticas El ciclo total del cultivo es de aproximadamente siete meses
(Jaramillo et al. 2007). El desarrollo del cultivo comprende dos fases: Una fase vegetativa
y otra reproductiva de la planta.
a) fase vegetativa: Comienza con la siembra en semillero, seguida de la germinación;
formación de hojas verdaderas y finalmente el trasplante a campo, con una duración
aproximada de 30 a 35 días (Jaramillo et al. 2007).
8 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos
Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
b) fase reproductiva: que incluye las etapas de floración (que se inicia a los 25 – 28
días después del trasplante), de formación del fruto y de llenado de fruto, hasta la
madurez para su cosecha, la cual se inicia en el primer racimo entre los 85 a 90 días
después del trasplante (Jaramillo et al. 2007).
1.2.5 Importancia del tomate en Colombia
El tomate es un cultivo económica y socialmente importante para el país por su amplia
dispersión de área cosechada y como generador de empleo (Espinal et al. 2005;
Jaramillo et al. 2007).
En Colombia la zona tomatera abarca una extensión 19 departamentos, con más del
80% de la producción en Cundinamarca, Norte de Santander, Huila, Valle, Santander,
Antioquia, Boyacá, Cesar, Nariño, Atlántico y Guajira (Jaramillo et al. 2007). El
componente agrícola, es altamente generador de empleo, una hectárea requiere
alrededor de 160 jornales por ciclo de producción, lo cual representa alrededor de
2.309.440 jornales utilizados en el país anualmente en este cultivo (Jaramillo et al. 2007).
1.2.6 Principales plagas y enfermedades
El cultivo del tomate se presenta como una activad de alto riesgo económico debido
principalmente a los altos costos de producción, pérdidas en la poscosecha por ser un
producto altamente perecedero y los problemas fitosanitarios (Jaramillo et al. 2007).
Entre los problemas fitosanitarios más conocidos, se encuentra Phytophthora infestans,
la mosca blanca (Trialeurodes vaporariorum, Trialeurodes variabilis, Bemisia tabaci), los
nematodos, entre otros. El Mildeo causado por el hongo P. infestans es una enfermedad
destructiva que afecta al tomate y la papa, puede ser una enfermedad muy seria en
tomate, generando grandes pérdidas. La antracnosis es una enfermedad de frutos
maduros o con exceso de maduración. Es causada por varios hongos fitopatogenos del
género Colletotrichum. Esta enfermedad, si no es controlada adecuadamente, puede
generar pérdidas de rendimiento y de la calidad del fruto (Borrego et al. 2008).
Los adultos e inmaduros de moscas blancas como Trialeurodes vaporariorum y Bemisia
tabaci, producen deshidratación, debilitamiento y disminución del rendimiento de las
Capítulo 1: Objetivos y Marco teórico 9
plantas al chupar la savia de las hojas y la excreción de sustancias azucaradas que
favorecen el crecimiento de hongos sobre las plantas (CATIE. 1990; Cuellar y Morales
2006). Su importancia económica se incrementa debido a que pueden ser posibles
trasmisores de virus que generan pérdidas económicas considerables en los cultivo
(CATIE. 1990).
En el caso de los nematodos, cuando la población es muy alta pueden llegar a
constituirse en plaga. Atacan plantas de tomate en semillero, almácigo y plantación
adulta y bajo ciertas condiciones pueden causar pérdidas económicas importantes. El
género de nemátodos que afecta con mayor frecuencia la producción de tomate es
Meloidogyne (Borrego et al. 2008).
1.2.7 Clasificación taxonómica Radopholus similis (Cobb) Thorne (nematodo Barrenador)
Filum: Nematoda
Clase: Secernentea
Orden: Tylenchida
Suborden: Tylenchina
Superfamilia: Tylenchoidea
Familia: Pratylenchidae
Género: Radopholus
Especie: similis (Thorne, 1961).
1.2.8 Ciclo biológico y patológico R. similis
El ciclo biológico del nematodo barrenador se lleva a cabo dentro y alrededor de las
raíces de las plantas. Penetran en las raíces, rompiendo las paredes de las células y se
alimentan de su contenido (Liceras y Wong 1964), donde la hembra pone numerosos
huevos. Después de iniciar su alimentación, R. similis completa su ciclo de vida entre 20
y 25 días en los tejidos de las raíces y cormos a una temperatura entre 24 y 32°C; siendo
óptima su reproducción entre 25 y 28°C (Sarah et al. 1996; Cocom 2005; Guzmán 2011)
Como la mayoría de nematodos, los estados de desarrollo de R. similis son vermiformes
o con forma de lombriz y tienen cuatro estados juveniles (J1, J2, J3 y J4) y el adulto. El
10 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos
Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
estado J1 se desarrolla dentro del huevo, muda la cutícula y luego de 8 a 10 días emerge
el J2. Los estados J2, J3 y J4 también mudan la cutícula hasta llegar al estado adulto
entre 10 y 13 días (Guzmán 2011).
R. similis tiene dimorfismo sexual entre machos y hembras. Los machos miden 500 a 700
µm, exhiben un estilete poco desarrollado con perillas básales apenas visibles. En la
región posterior (cola), los machos poseen una espícula de función reproductiva, cubierta
por una membrana hialina llamada bursa (Guzmán 2011). Las hembras por su parte,
miden entre 500 y 880 µm y cerca de 24 µm de diámetro, con un estilete bien
desarrollado de 16 a 21 µm de largo. R. similis usualmente se reproducen sexualmente,
pero pueden reproducirse por partenogénesis (Guzmán 2011).
1.2.9 Síntomas y daño causado por R. similis
El nematodo fitoparásito R. similis es el más abundante y de mayor importancia
económica en la mayoría de las regiones donde se cultivan banano y plátano,
constituyendo entre el 82 y 97% de la población de nematodos en raíces y cormos (Araya
y Moens 2003). Los síntomas en las raíces, son lesiones de aproximadamente 10cm de
longitud, rojizas al principio y luego negras, después que el tamaño de la lesión aumenta
y se forman cavidades en la corteza. Haciendo un corte transversal del rizoma se
encuentra gran cantidad de bolsas de color negro, que avanzan de la parte externa a la
interna, esto se debe a que los nematodos a medida que van destruyendo las capas más
externas del rizoma van introduciéndose a las zonas más internas (Liceras y Wong 1964;
Guzmán y Castaño 2004).
El tejido vascular queda expuesto a la invasión de microorganismos secundarios que
ocasionan la muerte de la raíz en la parte posterior de la lesión. En una plantación
afectada, el primer síntoma del ataque del "nematodo barrenador" se manifiesta por la
aparición de focos de plantas caídas (figura 1-1), poco desarrolladas y vigorosas, en
general la plantación no tiene un aspecto uniforme (Liceras y Wong 1964). Infecciones
severas generan necrosis en el rizoma (figura 1-1), por lo que se denomina la
enfermedad de la “cabeza negra”. Como consecuencia, las raíces destruidas retardan el
crecimiento de la planta, disminuyen el tamaño, numero de hojas, desarrollo de las
plantas y en estados muy avanzados pueden causar la muerte (Liceras y Wong 1964;
Guzmán y Castaño 2004; Guzmán 2011).
Capítulo 1: Objetivos y Marco teórico 11
Figura 1-1: Volcamiento de plantas de plátano y necrosamiento de raíz debido al ataque
de nematodos 1 (Gonzáles 2012).
1.2.10 Clasificación taxonómica Meloidogyne spp. Chitwood (nematodo del Nudo de la raíz)
Phylum: Nematoda
Clase: Secernentea
Orden: Tylenchida
Suborden: Tylenchina
Superfamilia: Tylenchoidea
Familia: Heteroderidae
Género: Meloidogyne
Especie: incognita, arenaria, javanica, hapla (Thorne,1961).
1.2.11 Ciclo biológico y patológico de Meloidogyne spp.
El género Meloidogyne es endoparásito sedentario. Su ciclo de vida dura entre 27 y 40
días. El primer estadio juvenil no es muy activo y la primera muda tiene lugar en el huevo.
Los especímenes jóvenes móviles en la segunda etapa (J2) emergen de los huevos, se
mueven hacia las raíces y penetran en ellas a través de la punta o donde se encuentran
pequeñas heridas. En la raíz, los J2 invaden la endodermis, se alimentan e inducen la
1 La foto de necrosamiento fue tomada por el autor en una visita de reconocimiento del daño de nematodos en cultivos de plátano en la zona de San peregrino - Caldas.
12 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos
Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
producción de células gigantes y aumentan la tasa de la división celular. La formación de
estas células bloquea los vasos de xilema que las rodean. También se induce la
multiplicación de las células corticales, lo que resulta en la formación de llagas (Taylor y
Sasser 1983; De Waele y Davide 1998).
Los especímenes jóvenes J2 se alimentan de las células gigantes y mudan tres veces
para convertirse en hembras adultas. Cuando las hembras maduran, forman sacos
donde se depositan los huevos dentro de una matriz gelatinosa para que se forme una
masa de huevos. Una sola masa de huevos puede contener un promedio de 100 por
cada hembra llegándose a reportar hasta 1.000 huevos en una masa que puede llegar a
ser más grande que el cuerpo de la hembra. La reproducción puede ser sexual o por
partenogénesis (De Waele y Davide 1998; Hernández et al. 2012).
1.2.12 Síntomas y daños causado por Meloidogyne spp.
El primer síntoma del ataque de M. incognita en una plantación de tomate es la presencia
de nudosidades, localizadas indistintamente en las raíces laterales y pivotantes. Con
relación a ello se sabe que los nematodos formadores de nudosidad inducen la re
diferenciación de las células del parénquima en las raíces, en células de alimentación
multinucleadas e hipertrofiadas. Estas zonas de células hipertrofiadas interfieren en los
flujos de nutrientes y agua, provocando en la planta síntomas de marchitamiento y
clorosis entre otros (Baeza 1979; Hernández et al. 2012). Las nudosidad pueden medir
desde 1 o 2 milímetros de diámetro en las raíces pequeñas y hasta 1 cm o más en las
raíces grandes (Arias et al. 2009) (Figura 1-2).
En plantas de tres o más meses de edad, se observan cuarteamientos longitudinales
necróticos en las raíces laterales y pivotantes. Este aspecto pude hacerse visible por
encima del nivel del suelo en ataques muy severos. En conjunto las platas presentan
poca cantidad de raíces laterales; la raíz pivotante se deforma, engrosa y el sistema
radical se torna total o parcialmente oscuro (Baeza 1979; De Waele y Davide 1998).
Los síntomas secundarios incluyen la reducción en la altura y desarrollo, inhibición de la
brotación, y deficiencias nutricionales que se manifiestan como clorosis del follaje con la
consecuente defoliación. Otro síntoma característico es la aparición de marchitez
temporal a pesar de haber humedad adecuada en el suelo, debido al menor tamaño del
Capítulo 1: Objetivos y Marco teórico 13
sistema radical y a que los elementos vasculares se rompen y se deforman,
interrumpiendo mecánicamente el flujo normal de agua y nutrientes. Como resultado,
aparecen síntomas de deficiencia, los cuales conllevan a la disminución de los
rendimientos, en dependencia de la severidad de la infestación del suelo (Baeza 1979;
Arias et al. 2009).
Figura 1-2: Marchitez plantas de tomate y nudosidades de raíz debido al ataque de
nematodos2.
1.2.13 Taxonomía y morfología del género Pleurotus
Género Pleurotus, pertenece al Phylum Basidiomycetes, orden Agaricales, familia
Pleurotaceae (Figura 1-3) y consta de aproximadamente 39 especies. Este género forma
parte del grupo de hongos comestibles más populares y es conocido como hongos ostra
en Estados Unidos, Europa y Asia y como orellanas en Colombia. Alcanzaron gran
importancia en la producción mundial, con cerca de 14,2% de la producción total de
hongos comestibles en el mundo en el año de 1997, siendo China el principal productor
con el 86,8% de la producción mundial y con cerca de 800.000 toneladas producidas al
año (Chang y Miles 2004).
2 Fotos tomadas por el autor en una visita de reconocimiento del daño de nematodos en cultivos de tomate en la zona de Chinchina Caldas.
14 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos
Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
Figura 1-3: Pleurotus ostreatus cultivado en arroz3.
El género se caracteriza por tener un carpóforo redondeado con la superficie lisa,
abombada y convexa cuando es joven, aplanándose en su proceso de maduración. Su
coloración puede variar de acuerdo con las condiciones ambientales, siendo oscura en
condiciones frías y clara en condiciones de luz y calor; la gama de colores incluye azul
oscuro, crema, blanco, café, gris, amarillo y rosado. Su tamaño puede variar de 5 a 30
cm de diámetro. El cuerpo fructífero generalmente es pequeño cuando crece en troncos y
es más grande cuando se cultiva en tubulares sintéticos con otros substratos. El pie es
excéntrico o lateral, sin embargo cuando llega al sombrero, es central (Chang y Miles
2004).
1.2.14 Ciclo biológico de los Basidiomycetes
La forma de reproducción de los hongos es a través de las esporas, los hongos
superiores poseen en el himenio unas células madres que son las encargadas de
producir los esclerocios, en el caso de los Basidiomycetes, estas son llamadas basidios
(Suárez 2010).
Las esporas son lanzados por el himenio al exterior, si se depositan en lugares húmedos
y de condiciones favorables, darán origen al micelio, éste crecerá bajo tierra o leños
3 Foto tomada por el autor de cultivos realizados por la Bióloga Jenifer Andrea Galeano en el programa de gestión de recursos naturales -Cenicafé.
Capítulo 1: Objetivos y Marco teórico 15
dando lugar a una seta con basidios en su himenio y se producirán las esporas para que
sean nuevamente liberadas al exterior y se complete el ciclo de reproducción (Suárez
2010).
1.2.15 Importancia de los hongos del género Pleurotus
Los hongos del género Pleurotus, constituyen un verdadero sistema de producción-
consumo, el cual ha adquirido gran relevancia social, económica y ecológica en el
mundo. Son potentes agentes biológicos que utilizan los residuos agrícolas no
comestibles como sustratos, para producir alimentos para el consumo humano
(Rodríguez y Zuluaga 1994; Rodríguez V. N y Gómez C. F 2001). Estos hongos son de
buena calidad nutritiva y con propiedades medicinales (anticancerígena, antibiótica,
reductora del nivel de colesterol e hipertensión, antitrombótica, antidiabética);
suplementos dietéticos; enzimas y productos metabólicos con amplio potencial de
utilización en la industria (Chang y Miles 2004).
El sustrato degradado residual, compuesto principalmente por materiales lignocelulósicos
utilizados para la producción de hongos comestibles, es un subproducto que puede tener
diversas aplicaciones como, abono orgánico para la industria hortícola y de floricultura,
sustrato nematicida, sustrato bactericida y sustrato para la bioremediación in situ de agua
y suelo en regiones contaminadas por hidrocarburos o residuos orgánicos similares a la
lignina, tales como el pentaclorofenol, PCP. Este sustrato parcialmente degradado
contiene una gran variedad de enzimas extracelulares y sustancias nutritivas, las cuales
al aplicarse directamente en zonas contaminadas permiten la degradación de
compuestos contaminantes y favorecen el desarrollo de otros microorganismos
(Rodríguez V. N y Gómez C. F 2001; Chang y Miles 2004).
1.2.16 Acción nematicida del género Pleurotus
La mayoría de las especies del género Pleurotus consumen nematodos. Las especies
que más se han investigado son P. ostreatus, P. florida, P. sajor-caju P. eryngii, y P.
cornucopiae (Hibbett y Thorn 1994; Heydari et al. 2006; Okorie et al. 2011). Estos hongos
producen hifas vegetativas las cuales generan gotas de potentes toxinas. Al hacer
contacto con éstas, los nematodos quedan inactivos rápidamente y contraen la cabeza;
subsecuentemente las hifas del hongo invaden al nematodo por los orificios del cuerpo,
16 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos
Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
principalmente colonizando la boca al cabo de 24 a 48 h y los digiere de 2 a 3 días,
utilizando los nematodos como un suplemento importante de nitrógeno (Barron y Thorn
1987). Sin embargo, reportan que la capacidad nematicida de estas toxinas y la
expresión de los síntomas varía dependiendo de la especie de hongo y del tiempo de
exposición (Hibbett y Thorn 1994; Heydari et al. 2006) (Figura 1-4).
Figura 1-4: Hifa de Pleurotus ostreatus produciendo gotas de toxina y parasitación del
nematodo Meloidogyne (Heydari et al. 2006).
2. Capítulo 2: Evaluación de la acción nematicida in vitro de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp.
2.1 Materiales y Métodos
2.1.1 Localización
El presente estudio está enmarcado en el macroproyecto “Desarrollo de inóculos
microbianos con acción nematicida, bactericida y descomponedora de residuos de cultivo
de café y plátano in situ”, que se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la
disciplina Gestión de Recursos Naturales y Conservación del Centro Nacional de
Investigación de Café y en la empresa Soluciones Microbianas del Trópico Ltda
(ubicadas en La Granja, Cenicafé), del Municipio de Chinchiná, Departamento de Caldas,
con una altitud de 1.378 msnm, temperatura promedio de 21°C, precipitación anual de
2.000 y 4.000 mm, humedad relativa de 80 % y radiación solar de 1189 hrs cal/cm2.
Los inóculos de las especies debidamente certificadas y codificadas de Pleurotus
ostreatus (184), Pleurotus pulmonarius (PO4) y Pleurotus sajor-caju (161), utilizados en
este proyecto fueron suministrados por la bióloga Jenifer Galeano de Cenicafé.
2.1.2 Método de extracción
Para la fase de laboratorio se emplearon los nematodos fitoparásitos de los géneros
Radopholus y Meloidogyne de raíces de plátano variedad Dominico- Hartón y de las
raíces de tomate respectivamente, extraídos por el método de flotación y centrifugación
en azúcar descrito por Meredith (1973), Araya (1995) y Castaño (1998) (Figura 2-1).
18 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
Figura 2-1: Esquema del método de extracción. A. Licuado de raíces. B. Tamices. C.
Sobrenadante. D. Centrifugado del sobrenadante. E. Solución de sacarosa. F.
Centrifugación con sacarosa. G. Sobrenadante lavado con agua.
Las raíces se lavaron con agua corriente, después de dejarlas secar a temperatura
ambiente, se pesaron 20 g en una balanza y se cortaron transversalmente trozos de
raíces de 1 cm y luego se homogenizaron. Se colocaron los trozos dentro de una
licuadora, con 100 mL de agua corriente y luego se licuaron en la revolución más baja,
por 10 segundos, tres veces, y cada vez se dejaron reposar por 10 segundos. Se filtró la
mezcla obtenida en una columna de tamices con mallas de 250, 106, 75, 38 y 25 μm,
ubicados en esta secuencia, las muestras se lavaron con agua a presión en cada tamiz
para el desprendimiento de los nematodos, el material que quedo en el tamiz de 25 μm,
fue recolectado en tubos de centrifuga. Posteriormente, se sometieron a 3.500 rpm en
una centrífuga, durante 5 min (Figura 2-1).
Capítulo 2: Evaluación de la acción nematicida in vitro de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp.
19
Después de la centrifugación se presentó sedimentación de las partículas pesadas en el
fondo del tubo y se procedió a eliminar el sobrenadante. Seguidamente, se llenaron los
tubos con una solución de sacarosa al 50% y se sometieron nuevamente a centrifugación
a 3.800 rpm durante 5 min, con el propósito que los nematodos flotarán en la solución de
sacarosa y se separan de las partículas más pesadas. Luego el sobrenadante se
depositó en el tamiz de 25μm y se lavó con agua corriente a baja presión, para eliminar
la sacarosa y evitar el deterioro físico de los nematodos. Finalmente, se recolectaron 20
mL de agua con nematodos en una caja Petri (Figura 2-1). Para las identificaciones a
nivel de especies si realizaron con la colaboración de las Doctoras Nathali López y Maria
Jose Botero del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA).
2.1.3 Identificación de especies de Meloidogyne en tomate
La extracción de las hembras se realizó de raíces con nudos abundantes, fueron
observadas al estereoscopio y por medio de una aguja, 60 hembras se separaron del
tejido y fueron transferidas a una caja petri con agua para evitar su desecación (Figura 2-
2).
Figura 2-2: Hembras adultas de Meloidogyne spp. extraídas de raíces de tomate.
Posteriormente se preparó el patrón perineal, el cual está localizado en la parte posterior
de la región del cuerpo de las hembras adultas. Esta área comprende la región entre el
ano y la vulva (perineo), la terminación de la cola, fasmídios, las líneas laterales y las
20 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
estrías cuticulares circulares (Figura 2-3). Los montajes fueron realizados siguiendo la
metodología descrita por Hartman y Sasser (1985) (Figura 2-4).
Figura 2-3: Morfología generalizada de un patrón perineal (Eisenback et al. 1981).
Las hembras fueron diseccionadas y dispuestas en ácido láctico al 45%, para limpiar y
extraer todo el contenido del cuerpo, posteriormente, por medio de una aguja, los
patrones perineales fueron dispuestos en un portaobjetos con una gota de azul de
lactofenol, se cubrieron con el cubreobjetos y fueron observados al microscopio para su
identificación por comparación con las descripciones de Perry et al. (2009).
Figura 2-4: Corte de un patrón perineal. (A, B). Corte de la hembra en la región de la
cabeza y remoción del contenido del cuerpo. (C) Corte de la hembra en la mitad de
Terminación de la cola
Fasmídio
Ala
Estrías
Arco dorsal
Línea lateral Puntuaciones
Ano
Vulva
Capítulo 2: Evaluación de la acción nematicida in vitro de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp.
21
cuerpo donde se remueve la parte anterior de la hembra y se deja la parte posterior. (D)
Corte de la región perineal (E) patrón perineal listo para el montaje (Hartman y Sasser
1985).
2.1.4 Identificación de especies de Radopholus en plátano
Raíces de plantas de plátano fueron lavadas con agua corriente y posteriormente
procesadas mediante el método de licuado, centrifugación y flotación en azúcar para la
separación de nematodos de tejidos vegetales, como se mencionó anteriormente.
Las muestras procesadas fueron dispuestas en cajas Petri. Los nematodos fueron
separados individualmente de las cajas petri con la ayuda de micropipeta y colocados en
placas portaobjetos, para su posterior identificación con ayuda del microscopio. La
identificación pudo ser llevada hasta género y especie, con base en la clave pictórica y
morfometrica para géneros de nematodos fitoparásitos, descrita por Mai y Mullin, (1996),
tanto para hembras como para machos que presentan marcado dimorfismo sexual en la
región anterior (Figura 2-5)
Figura 2-5: Radopholus similis (A) Macho. (B)Hembra. (C, D) cabeza de la hembra. (E,
F) cabeza del macho (Hunt et al. 2005)
22 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
2.1.5 Determinación in vitro de la concentración nematostática y/o nematicida.
El inoculo formulado y estandarizado, fue incrementado en bolsas con granos de arroz
del hongo Pleurotus spp. (ostreatus, pulmonarius y sajor caju) suministrado por la Bióloga
Jenifer Andrea Galeano de la disciplina de Gestión de Recursos Naturales y
Conservación del Centro Nacional de Investigación del Café –Cenicafé; como parte del
objetivo del macroproyecto “Desarrollo de inóculos microbianos con acción nematicida,
bactericida y descomponedora de residuos de cultivo de café y plátano in situ”
Para las pruebas de antagonismos, las especies del género Pleurotus empleadas en los
diferentes experimentos se cuantificaron a través de la medición de la variable gramos de
peso seco del micelio. Una vez verificado el registro de esta variable, se procedió a
criopreservar suspensiones de concentración de 20 g, 50 g y 75 g en 200 mL de Agua
destilada estéril (ADE) de cada especie del género Pleurotus (ostreatus, pulmonarius y
sajor caju y su mezcla) en glicerol al 10% a temperaturas bajo cero (Valdés 1996).
En la evaluación in vitro se utilizó un producto químico (Carbofuran 330 ppm) (Arboleda
et al. 2010), una mezcla biológica comercial que contiene tres de los hongos que han
obtenido los mejores resultados en el control de nematodos (TROPIMEZCLA® WP =
Paecilomyces lilacinus, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Trichoderma
(especies harzianum y koningii) y Sacharomyces cerevisiae) y los hongos del género
Pleurotus spp. y su mezcla criopreservados. Estos últimos fueron sometidos a choque
térmico en baño maría a 30°C durante 10 minutos, previo a su empleo en las pruebas de
antagonismo sobre los nematodos de los géneros Radopholus sp. hembras en estado
adulto y Meloidogyne spp, juveniles móviles (J2).
Se tomaron 25 nematodos con ayuda de un capilar y se colocaron en 0.5 ml de ADE para
hacer la suspensión acuosa de nematodos y se mezcló con 1mL de cada especie del
género Pleurotus, con concentraciones 20 g, 50 g y 75 g en 200 mL (ADE), incluido un
tratamiento químico (Carbofuran 330 ppm) y uno biológico comercial (TROPIMEZCLA®
WP) junto con un testigo absoluto (nematodos + ADE) en cajas Petri con Agar-Agua
(AA), el cual sirvió de sustrato para los nematodos y los hongos. Las cajas se incubaron
a 25ºC, en condiciones de oscuridad. La evaluación de la movilidad de los nematodos se
Capítulo 2: Evaluación de la acción nematicida in vitro de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp.
23
realizó al cabo de diferentes tiempos de contacto con el producto (24, 48 y 72h). Para
este propósito, antes de cada evaluación, las cajas Petri fueron agitadas suavemente
para dispersar los individuos en las diferentes suspensiones de concentración conocida
del hongo, posteriormente se realizó observaciones al estereoscopio.
Se registró el número de nematodos que mostraron movimiento propio; los nematodos
que no mostraron movimiento se tocaron suavemente con una aguja y si reaccionaron
con movimientos se anotaron como nematodos activos, mientras que los nematodos que
no mostraron movilidad fueron individualmente extraídos de esta solución y dejados en
agua destilada estéril en cajas Petri por 24h, en condiciones de oscuridad. Una vez
transcurrido este tiempo, se realizó nuevamente la evaluación de movilidad como se
describió anteriormente, los nematodos que finalmente no mostraron movilidad se
registraron como individuos muertos (Pinkerton y Kitner 2006). Las variables a evaluar
fueron: número de nematodos móviles, número de nematodos inmóviles, afectados
muertos y afectados vivos (Figura 2-6). Cada tratamiento (Tabla 2-1) tuvo diez replicas
por tratamiento en cada tiempo de exposición (Dong et al. 2006; Heydari et al. 2006),
para un total de 30 cajas Petri por tratamiento.
Para analizar los datos se empleó un diseño completamente al azar, los datos obtenidos
se sometieron a análisis de varianza (ANAVA) y prueba de diferenciación de medias de
Duncan a un nivel de probabilidad del 5%, mediante el empleo del programa Statistical
Analysis System (SAS, 2009) (Xiao et al. 2008; Garrido et al. 2014 ).
24 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
Figura 2-6: Individuos móviles e inmóviles
Tabla 2-1: Tratamientos para la evaluación del efecto nematicida y/o nematostático sobre
Radopholus sp. y Meloidogyne spp, (in vitro).
TRATAMIENTOS
T1 Testigo absoluto (Agua estéril)
T2 Carbofuran 330 ppm
T3 Mezcla biológica 2g/L (TROPIMEZCLA®
WP)
T4 P. ostreatus 20g
T5 P. ostreatus 50g
T6 P. ostreatus 75g
T7 P. pulmonarius 20g
T8 P. pulmonarius 50g
T9 P. pulmonarius 75g
T10 P. sajor-caju 20g
T11 P. sajor-caju 50g
T12 P. sajor-caju 75g
T13 Mezcla Pleurotus 20g
T14 Mezcla Pleurotus 50g
T15 Mezcla Pleurotus 75g
Capítulo 2: Evaluación de la acción nematicida in vitro de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp.
25
2.2 Resultados
2.2.1 Identificación de las especies del género Meloidogyne spp
Se pudo reconocer la especie Meloidogyne incognita, encontrando dos tipos de patrones
perineales, de forma oval a redondeada con un típico arco dorsal cuadrado, estrías
gruesas, con campo laterales ausentes o débilmente demarcado, lo cual concuerda con
Perry et al. (2009) y Eisenback et al. (1981) (Figura 2-7)
Figura 2-7: Corte perineal de Meloidogyne incognita
Se encontró también la especie Meloidogyne javanica aunque en menor proporción que
M. incognita. La especie M. javanica presentó patrón perineal redondeado, arco dorsal
bajo, estrías suaves, campo lateral demarcado claramente con una línea paralela,
caracteres que coinciden con los reportados por Eisenback et al. (1981) y Perry et al.
(2009) (Figura 2-8)
26 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
Figura 2-8: Corte perineal de Meloidogyne javanica
2.2.2 Identificación de las especie del género Radopholus sp
Se reconoció la especie de nematodo parasitando tejido radical de plátano (Musa AAB)
que corresponde a Radopholis similis. Se observó en la hembra presencia del estilete,
con promedio de 19 µm, largo del cuerpo con un promedio de 581 µm, diámetro medido
a la altura del ano 19 µm, cabeza aplanada o redondeada, glándulas esofágicas
usualmente desiguales en longitud, cola en forma de cono, con la parte posterior
alargada, respectivamente, diámetro del poro excretor a la cabeza de 60 µm. Macho,
largo del cuerpo con un promedio de 560 µm, diámetro del cuerpo al ano de 12 µm,
estilete poco desarrollado de largo 14 µm y prolongación de los labios; y detalle de la
parte terminal con la presencia de espícula 15 µm protegida por bursa, cola conoide y
proyectada al final (Figura 2-9) caracteres que concuerdan con Brooks (2008) y
OEPP/EPPO (2008).
Capítulo 2: Evaluación de la acción nematicida in vitro de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp.
27
Figura 2-9: Radopholus similis (A) cabeza de la hembra. (B) cola de la hembra (C)
cabeza del macho (D) cola del macho
2.2.3 Efecto nomatostático y/o menaticida de Nematodos del género Meloidogyne spp
Para la prueba in vitro, se realizó el análisis de varianza para el efecto nematostático
(individuos inmóviles) y nematicida (individuos muertos) de los tratamientos sometido a
tres tiempos de exposición, indicó diferencias altamente significativas entre los
tratamientos; los coeficientes de variación con valores altos, pueden deberse a método
utilizado para la evaluación y al número de repeticiones. En cuanto a los tiempos de
exposición se observa un aumento en el porcentaje en cada una de las variables
evaluadas (móvil, inmóvil, afectado inmóvil y afectado muerto), lo que indica que la
acción nematostática y nematicida de los productos empleados depende de la
composición de la toxina y del tiempo de exposición (Tabla 2- 2, Anexo A, B y C).
Además, se realizó un análisis de correlación de Pearson a las 72 horas en el que se
encontró una correlación positiva de 0.82360 <.0001 entre el porcentaje de inmóviles con
28 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
respecto a el porcentaje de muertos, esto muestra que a mayor porcentaje de inmóviles
mayor porcentaje de individuos muertos generados por los tratamientos evaluados.
Tabla 2-2: Análisis de varianza del efecto nematostatico y nematicida a las 72 horas
sobre Meloidogyne.
Fuentes de
variación
G.L
Primera
observación
Observación en H2O
Móviles Inmóviles Afectados
vivos
Afectados
Muertos
Tratamiento 14 403.40** 377.15** 116.87** 126.26**
Error 135 5.09 5.64 3.61 5.86
Total 149 6335.33 6041.57 2124.06 2559.39
R2 0.89 0.87 0.77 0.69
C.V. 18.60 18.83 30.96 37.41
Ft 79.29 66.17 32.34 21.53
Media 12.13 12.61 6.14 6.47
**/ Denotan diferencias o efectos altamente significativos (< P 0.0001)
En las Figura 2-10 y 2-11 y Anexo C se puede observar la cantidad en promedio de
nematodos que fueron encontrados con y sin movimiento después de 24, 48 y 72 horas
de exposición a las diferentes concentraciones de los diversos tratamientos, a su vez se
puede observar la cantidad de nematodos que después de ser clasificados como
inmóviles y ser expuestos durante 24h en agua destilada estéril, recuperaron o no
recuperaron su movimiento, clasificados como vivos y muertos. Este primer parámetro,
se asume como la acción nematostática, mientras el último indica la cantidad de
nematodos que murieron por efecto de los tratamientos, con base en una población
inicial de 25 individuos por cada género.
En cuanto a las concentraciones se observó que en general, al aumentar éstas y el
tiempo, la inmovilidad y la mortalidad se incrementaron. En las concentraciones inferiores
a 75 g en los mismos tiempos de exposición, la cantidad de nematodos muertos no
superó los 10 individuos. De igual manera, cuando los nematodos fueron tratados con
Carbofurán, la mortalidad no superó los ocho individuos (Figura 2-10 y 2-11). Lo que
Capítulo 2: Evaluación de la acción nematicida in vitro de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp.
29
indica que este nematodo es más sensible a la acción nematicida de PO a 75 g que a los
demás hongos y el Carbofurán tiene poco control al igual que la mezcla biológica
comercial evaluada.
Figura 2-10: Efecto nematostático in vitro Meloidogyne a diferentes concentraciones y
tiempos de exposición
Agua
Biolo
Carbof
MEZ20
MEZ50
MEZ75
PO20
PO50
PO75
PP20
PP50
PP75
PSC20
PSC50
PSC75
24h 1,61 13,6 2,8 9,2 28 20,4 7,6 25,2 27,2 6,4 9,6 12,4 6,4 19,2 17,2
48h 1,6 32 9,6 15,2 32,4 43,6 25,6 47,6 59,2 4,4 38,4 29,2 13,6 43,6 49,2
72h 0,53 56,8 38,4 27,2 56,8 86 66,4 70,8 82,8 11,2 36,8 39,6 61,6 59,2 62,8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% d
e n
em
ato
do
s in
mo
vile
s
Agua BioloCarb
ofMEZ20
MEZ50
MEZ75
PO20
PO50
PO75
PP20
PP50
PP75
PSC20
PSC50
PSC75
24h 0 6,4 1,6 5,2 4 14,4 3,2 4 20,4 1,6 2,8 8 4 4,8 14,4
48h 0 11,2 6,4 3,6 14,8 40,4 7,2 26,4 34,4 0,4 9,6 26 2,8 10 17,6
72h 0 25,2 34,8 14 38 42 41,2 32,8 46,8 0 16,4 21,6 22 29,6 24
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
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mu
ert
os
30 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
Figura 2-11: Efecto nematicida in vitro Meloidogyne a diferentes concentraciones y
tiempos de exposición
En general, para P. ostreatus el aumento en el tiempo de exposición (72h) en todas las
concentraciones empleadas (20,50, y 75 g en 200mL) significó incrementos en la
cantidad de nematodos inmóviles y muertos. Esa tendencia fue particularmente
mantenida con la concentración 75 g en 200mL.
En cuanto a los tiempos, los mayores porcentajes de individuos inmóviles de
Meloidogyne spp. lo presento el tiempo de contacto de 72 horas que varió entre 0,5 a
86%, en contraste con el tiempo de contacto 24 horas varió entre 1,6 a 28% con los
menores porcentajes. El tratamiento que corresponde a la mezcla de los hongos del
género Pleurotus spp. a las 72 horas con una dosis de 75 gramos, presentó el mayor
porcentaje de individuos inactivos, éste tratamiento no presenta diferencias significativas
al tratamiento P. ostreatus (p>0,05), pero si diferencias significativas con los demás
tratamientos (Figura 2-12 y Anexo C ).
* Letras diferentes indican diferencias estadísticas según prueba de Duncan.
Figura 2-12: Efecto nemostatico sobre Meloidogyne a las 72 horas con tratamientos a
base de las especies de Pleurotus
MEZ75
PO75
PO50
PO20
PSC75
PSC20
PSC50
BioloMEZ50
PP75
Carbof
PP50
MEZ20
PP20
Agua
Media 86 82,8 70,8 66,4 62,8 61,6 59,2 56,8 56,8 39,6 38,4 36,8 27,2 11,2 0,53
A A
BBC
BCD CD CD D D
E E E
F
G
H0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% d
e In
div
idu
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inm
ovi
les
Capítulo 2: Evaluación de la acción nematicida in vitro de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp.
31
Los individuos muertos de Meloidogyne sp. en el tiempo de contacto de 24 horas oscilan
entre el 0 a 20% en contraste con las 72 horas que varían entre 0 a 46%. El tratamiento
de P. ostreatus a las 72 horas en la dosis de 75 gramos, la que presentó el mayor
porcentaje de individuos muertos (p>0,05), éste tratamiento no presento diferencias
significativas con el tratamiento de la mezcla con las tres especies de Pleurotus spp, P.
ostreatus 20 gramos y la mezcla 50 gramos; el porcentaje de individuos muertos en el
tratamiento de agua no presento diferencias significativas con el tratamiento de P.
pulmonarius 20 gramos (Figura 2-13 y Anexo C).
* Letras diferentes indican diferencias estadísticas según prueba de Duncan.
Figura 2-13: Efecto nematicida sobre Meloidogyne a las 72 horas con tratamientos a
base de las especies de Pleurotus.
2.2.4 Nematodos del género Radopholus sp
La prueba in vitro para Radopholus mostró diferencias altamente significativas entre los
tratamientos y se observa un aumento de individuos inmóviles y muertos entre tiempos,
PO 75MEZ75
PO 20MEZ50
Carbof
PO 50PSC50
BioloPSC75
PSC20
PP 75 PP 50MEZ20
Agua PP 20
Media 46,8 42 41,2 38 34,8 32,8 29,6 25,2 24 22 21,6 16,4 14 0 0
A
AB AB
ABC
BCBCD
CDE
DEFDEF
EFG EFG
FGG
H H0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
% d
e In
div
idu
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Mu
erto
s
32 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
lo que indica que la acción nematostática y nematicida de los productos empleados
dependió del tiempo de exposición (Tabla 2-3 y Anexos D y E). Se realizó el análisis de
correlación de Pearson a las 72 horas encontrando una correlación positiva de
0.90733<.0001 entre el porcentaje de inmóviles con respecto al porcentaje de muertos.
Tabla 2-3: Análisis de varianza del efecto nematostatico y nematicida a las 72 horas
sobre Radopholus.
Fuente de
variación
G.L
Primera
observación
Observación en H2O
Móviles Inmóviles Afectados
vivos
Afectados
Muertos
Tratamiento 14 221.61** 217.74** 40.345** 82.20**
Error 135 2.06 1.95 1.844 1.51
Total (C) 149 3381.87 3312.24 813.84 1355.07
R2 0.92 0.92 0.69 0.85
C.V. 7.95 20.80 64.06 27.02
Ft 107.12 111.43 21.87 54.32
Media 18.09 6.72 2.12 4.55
**/ Denotan diferencias o efectos altamente significativos (< P 0.0001)
En general, para P. sajor -caju la inmovilidad para en el tiempo de exposición (72h) en
todas las concentraciones empleadas (20, 50, y 75 g en 200 mL) además, significó
incremento en la cantidad de nematodos muertos. Esa tendencia fue particularmente
mantenida con la concentración 75 g en 200 mL. No obstante, ninguno de los tres
tiempos de exposición (24,48, y 72h) y concentraciones empleadas, la mortalidad lograda
con P. sajor -caju fue superior a 11 individuos (Figura 2-14 y 2-15; Anexo F).
El mayor porcentaje de inmovilidad y mortalidad en los nematodos fue generado por la
exposición durante 72h a la especie del hongo P. sajor-caju con la mayor concentración
(75g) seguido por la mezcla de especies a las 72 h. El hongo que presento menor efecto
nematostatico y nematicida fue P. pulmonarius. De otro lado, se observa que los
individuos inmóviles y móviles aumentan su porcentaje a medida que aumenta el tiempo
Capítulo 2: Evaluación de la acción nematicida in vitro de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp.
33
y la concentración (Figura 2-14 y 2-15), lo cual indica que la acción nematostática y
nematicida de los productos empleados depende de la concentración y del tiempo de
exposición. Por su parte, el Carbofuran y el biológico presentaron un porcentaje de
mortalidad de 21% y 24% respectivamente, el cual aumentó a las a las 72 horas sin
lograr superar los hongos evaluados en este trabajo.
Figura 2-14: Efecto nematostático in vitro Radopholus a diferentes concentraciones y
tiempos de exposición.
Agua BioloCarb
ofMEZ20
MEZ50
MEZ75
PO20 PO50 PO75 PP20 PP50 PP75PSC2
0PSC5
0PSC7
5
24h 1,6 12 10,8 2,8 12 22,8 7,2 12,8 20 3,2 9,2 18 4,4 14 18,4
48h 1,6 22,8 20 11,6 26 27,2 8,4 28,8 30,4 9,2 18,8 24,4 6 21,2 30
72h 0,4 32,4 23,6 12 35,6 48 12 29,2 45,2 7,2 18 24,4 10,8 32 72,4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
% d
e n
emat
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les
34 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
Figura 2-15: Efecto nematicida in vitro Radopholus a diferentes concentraciones y
tiempos de exposición
Según la prueba de comparación múltiple de Duncan, el menor porcentaje de individuos
inmóviles de Radopholus sp. fue en el tiempo de contacto de 24 horas entre 2 a 23%
(Anexos D, y F), el porcentaje de inmóviles de Radopholus sp. en el tiempo de contacto
de 72 horas estuvo entre 2 a 73%. El tratamiento de P. sajorcajude de 75 gramos a las
72 horas, presentó el mayor porcentaje de individuos inactivos. Éste tratamiento es
estadísticamente significativo (p>0,05) a los demás tratamientos (figura 2-16).
Agua BioloCarb
ofMEZ20
MEZ50
MEZ75
PO20 PO50 PO75 PP20 PP50 PP75PSC2
0PSC5
0PSC7
5
24h 0 9 8 2 10 16 6 10 13 2 5 10 4 11 12
48h 0 17 18 5 16 20 7 16 19 5 14 17 4 12 19
72h 0 24 21 7 21 31 10 18 26 5 13 18 7 29 43
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50%
de
nem
ato
do
s m
uer
tos
Capítulo 2: Evaluación de la acción nematicida in vitro de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp.
35
* Letras diferentes indican diferencias estadísticas según prueba de Duncan
Figura 2-16: Efecto nemostático sobre Radopholus a las 72 horas con tratamientos a
base de las especie de Pleurotus.
El porcentaje de individuos muertos de Radopholus sp. en el tiempo de contacto de 24
horas varió entre 0 a 16% (Anexos F), para el tiempo 72 horas oscilo entre 0 a 43%. El
tratamiento de P. sajorcajude de 75 gramos, el que presentó el mayor porcentaje de
individuos muertos estadísticamente significativo (p>0,05) a los demás tratamientos. Con
la mezcla de Pleurotus se alcanzó una mortalidad superior al 31% cuando los nematodos
fueron expuestos a una concentración de 75 g en 200 mL durante 72h. La máxima
mortalidad alcanzada con este tratamiento fue de 8 individuos (figura 2-17).
PSC75
MEZ75
PO75
MEZ50
BioloPSC5
0PO5
0PP75
Carbof PP50
MEZ20
PO20
PSC20
PP20 Agua
Media 72 48 45 36 32 32 29 24 24 18 12 12 11 7 0,4
A
BB
CCD CD
DEEF F
G
H H HH
I0
10
20
30
40
50
60
70
80
% d
e In
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inm
ovi
les
36 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
* Letras diferentes indican diferencias estadísticas según prueba de Duncan
Figura 2-17: Efecto nematicida sobre Radopholus a las 72horas con tratamientos a base
de las especie de Pleurotus.
2.3 Discusión
Los hongos Basidiomycetos poseen la capacidad de tomar ventaja de la microfauna para
obtener de esta suplementos nutricionales, especialmente nitrógeno, que suele ser el
factor limitante para el desarrollo en su hábitat natural (Luo et al. 2006). Especies del
género Pleurotus se han propuesto como controladores biológicos por su actividad
nematicida. Esta observación es consistente con los resultados obtenidos en el presente
estudio, los cuales confirman la acción nematicida de los hongos evaluados P. ostreatus,
P. pulmonarius y P. sajor-caju sobre los juveniles (j2) de Meloidogyne. y hembras adultas
de Radopholus. Estos resultados son similares a los obtenidos por (Barron y Thorn 1987;
Hibbett y Thorn 1994; Heydari et al. 2006), quienes resaltan la capacidad del hongo de
paralizar los nematodos por medio de gotas de toxina secretadas por sus hifas, que al
entrar en contacto con los nematodos causan inmovilización y su muerte posterior.
En los tratamientos realizados, se observó que el mayor porcentaje de inmovilidad y
mortalidad para el fitonematodo Meloidogyne, fue generado por la especie del hongo P.
ostreatus, mientras que en Radopholus el mayor porcentaje correspondió al efecto del
PSC75
MEZ75
PSC50
PO75D
BioloMEZ5
0Carb
ofPO50
PP75 PP50PO20
MEZ20
PSC20
PP20 Agua
Media 43 31 29 26 24 21 21 18 18 13 10 7 7 5 0
A
BCB
CDDE
EF EFF F
GHG
HI HII
J0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50%
de
ind
ivid
uo
s m
uer
tos
Capítulo 2: Evaluación de la acción nematicida in vitro de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp.
37
hongo P. sajor-caju. Ambos hongos han sido reportados con la mayor actividad
nematicida en el control de Meloidogyne, destacándose la efectividad de P. ostreatus
(Barron y Thorn 1987; Hibbett y Thorn 1994; Heydari et al. 2006; Okorie et al. 2011). En
el caso de Radopholus este es el primer trabajo en el cual se reporta un efecto
nemostatico de P. sajor-caju sobre este género de nematodo.
En las evaluaciones, para los dos géneros de nematodos, el hongo que presentó menor
actividad nematicida fue P. pulmonarius. Esto concuerda con lo expuesto por Heydari et
al. (2006) quienes notaron que la toxicidad varía entre especies y afirman puede deberse
a la temperatura, el medio, el pH, a la susceptibilidad del nematodo a determinada toxina,
o a la composición de la toxina. Por ejemplo, para P. ostreatus la toxina identificada es
ácido trans-2-decanoico; en P. pulmonarius se han aislado varios componentes que
tienen efectos nematicidas como son ácido s-coriolico, ácido linoleico, p- anisaldehido,
alcohol p-anisílico, 1-(4- metoxifenil)1, 2- propanediol y 2-hydroxy-(4-methoxy)-
propiofenona; finalmente, para P. sajor-caju se ha identificado el alcaloide L-muscarina
(Kwok et al. 1992; Stadler et al. 1994; Nath et al. 1999; Li et al. 2007). Estos compuestos
tienen mayor especificidad para el control de algunas especies de fitonematodos que de
otras, lo cual se observa con las altas diferencias entre tratamientos.
Habria que resaltar que en diversos trabajos donde se enfrenta P. ostreatus con
Meloidogyne (Barron y Thorn 1987; Hibbett y Thorn 1994; Heydari et al. 2006; Okorie et
al. 2011) los resultados son mejores con respecto a otras especies de Pleurotus
evaluadas. Esto demuestra que Meloidogyne es susceptible a ser controlado por la toxina
denominada ácido trans-2-decanoico generada por P. ostreatus, en contraste con
Radopholus, que mostró cierta resistencia a los compuestos de las toxinas de P.
ostreatus, P. pulmonarius y P. sajor-caju. La aplicación de estos hongos para el
biocontrol de los fitonematodos puede estar limitada a ciertos géneros o especies (Tzean
y Liou 1993). Un caso semejante encontró Li et al. (2005) quienes aislaron tres
compuestos del hongo Poria cocos y solo uno de los tres compuestos aislados tenían
actividad hacia los nematodos Panagrellus redivivus y Meloidogyne arenaria, pero sin
actividad nematicida hacia Bursaphelenchus xylophilus. Esto sugiere que la afectación en
ciertas especies de nemátodos puede estar relacionada con los diferentes compuestos
activos presentes en las toxinas de los hongos.
38 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
La mezcla de los hongos tuvo un buen sinergismo para el control de los nematodos, sin
embargo el hongo P. ostreatus tuvo el mismo control de Meloidogyne y Radopholus a las
72 horas fue superado por P. sajor-caju. Datos similares fueron reportados por Okorie et
al.(2011) quienes encontraron que la efectividad de la mezcla de P. ostreatus y P.
tuberreguim sobre Meloidogyne resulto eficiente, pero siempre siendo superado por el
tratamiento de P. ostreatus en solitario, el cual generó mayor mortalidad de las larvas, lo
que resultó en aumento de crecimiento de las plantas y una disminución evidente de las
nudosidades.
En lo referente a la metodología utilizada, se encontró una relación directa entre la
concentración de micelio de Pleurotus respecto a la mortalidad de Meloidogyne y
Radopholus. Esto concuerda con trabajos obtenidos por Heydari et al. (2006) donde se
encontró que la mayor concentración tanto para P. ostreatus como para P. sajor-caju
paralizó el 78% y el 62%; de los nematodos, respectivamente. De modo similar, Khan et
al. (2014), encontraron que el extracto de la toxina de P. ostreatus fue más efectiva con
la mayor concentración, alcanzando mortalidad en el 77% de nematodos.
En cuanto al tiempo, se encontró que una exposición más prolongada de los nematodos
a la toxina, aumenta el número de nematodos inmovilizados y muertos, ya que la
exposición de 72 horas a la suspensión de micelio mostro mejor control que la de 24
horas en ambos nemátodos y con todos los hongos evaluados. Los resultados
concuerdan con los obtenidos por (Barron y Thorn 1987; Hibbett y Thorn 1994; Heydari et
al. 2006), quienes encontraron que el número de nematodos afectados aumenta a
medida que se incrementa el tiempo de exposición.
Las toxinas generadas por Pleurotus y por otros hongos nematicidas, pueden inmovilizar
en las primeras horas, permitiendo parasitar los nematodos entre las 24 – 48 h de
exposición Heydari et al., (2006); sin embargo, la afectación de los nematodos por el
hongo depende también del medio de crecimiento del hongo. En medios pobres como el
agar agua, los nematodos son parasitados rápidamente y en medios ricos como el PDA
son paralizados pero no invadidos por el hongo (Truong et al. 2007). Cabe mencionar
que para este trabajo, los hongos produjeron inmovilidad pero no se observó micelio
Capítulo 2: Evaluación de la acción nematicida in vitro de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp.
39
parasitando los nematodos, a pesar de ser enfrentados en medio AA; esto puede
deberse a que el hongo estaba en una suspensión de agua cuando se enfrentó y el
crecimiento estaba retardado a causa del medio, en adición a el tiempo necesario para el
crecimiento de las hifas del hongo en un medio tan adverso.
Esto conlleva a pensar que a pesar de no observarse micelio en los individuos muertos
de las evaluaciones realizadas, es evidente el efecto nemostático generado por el micelio
fragmentado, que en un tiempo prolongado o con una mayor concentración se verá
potencializado y permitirá obtener el efecto nematicida deseado. Ching y Wang (2014)
reportaron resultados similares con un extracto de compost champiñón, donde el extracto
de agua de 50% obtuvo los mejores resultados paralizando nematodos dos días después
de la incubación, para el extracto de agua 25% suprimía la actividad de los nematodos en
un 40% de M. incognita. Este mostró el potencial del uso de extracto de compost de
champiñón como un supresor de la actividad de M. incognita si la toxina no se elimina por
lavado durante 2 días.
De otro lado, el producto químico Carbofurán presentó un porcentaje menor a lo
esperado con una concentración de 330 ppm en las evaluaciones realizadas en ambos
nematodos. Este resultado contrasta con lo reportado por Arboleda et al., (2010) quienes
utilizaron dosis 330 ppm para obtener mortalidades del 98%, sobre R. similis a las 48h
después de ser aplicado. Los hongos P. ostreatus y P. sajor-caju evaluados en este
trabajo resultaron más eficaces que el Carbofurán en concentración de 75g en 200 mL
para reducir las poblaciones de nematodos fitoparásitos. Los ensayos realizados
mostraron que para incrementar la acción nematicida del Carbofurán se debe utilizar
dosis más altas que la recomendada a nivel comercial de 240 ppm y esto aumenta el
efecto tóxico para los humanos y el medio ambiente, pues este producto está catalogado
en la categoría toxicológica I (Arboleda et al. 2010).
En cuanto al producto biológico, se han registrado buenos resultados en trabajos como el
de Anastasiadis et al. (2008) quienes probaron la eficacia de un producto formulado que
contiene esporas de P. lilacinus, las cuales fueron eficaces en la disminución de la
eclosión de huevos y aumento en la mortalidad de nematodos juveniles; sin embargo, se
registró también una disminución adicional de huevos y estados juveniles sólo con el
40 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
aumento de la concentración del inóculo. Un estudio similar de Meloidogyne spp en
tomate demuestra que una sola aplicación del producto al suelo antes de la siembra, a
una concentración de 1x106 UFC/g, es suficiente para un óptimo control (Kiewnick y
Sikora 2006). En este trabajo no se obtuvo resultados tan eficaces en el control de los
nematodos con el producto biológico comercial (TROPIMEZCLA® WP). Esto, puede
deberse a un efecto antagónico entre las especies que componen TROPIMEZCLA® WP
en el control de los fitonematodos trabajados, ya que estudios in vitro e in vivo como el de
Leguizamón y Padilla (2001) y Lora y Betancourt (2010) utilizando B. bassiana para el
control de fitonematodos ha sido bajo.
3. Capítulo 3: Evaluación in vivo la acción nematicida de P. sajor-caju y P. ostreatus sobre los nematodos Radopholus sp. y Meloidogyne spp. en plátano y tomate respectivamente.
3.1 Materiales y Métodos
3.1.1 Localización
El estudio se llevó a cabo en la finca Las Camelias vereda la cabaña, ubicada en el
municipio de Manizales, a una altura de 1.400 m.s.n.m, con una temperatura promedio
de 21,6 °C, una humedad relativa del 81, 2 % y una precipitación anual de 2.495 mm
promedio.
3.1.2 Evaluación in vivo de la acción nematicida de Pleurotus spp sobre los nematodos Radopholus sp. y Meloidogyne spp.
Al finalizar la evaluación in vitro se seleccionó el hongo y la concentración con mayor
acción nematostática con una correlación positiva respecto a la acción nematicida. Se
llevó almacigo los hongos P. sajor-caju con 75g/200mL sobre Radopholus sp en plátano.
Dominico-Hartón y P. ostreatus 75g/200mL sobre Meloidogyne sp. en plántulas de
tomate variedad Rutgers. Ambos tratamientos fueron comparados con una concentración
duplicada (150g/200mL) de los hongos más un producto químico (Carbofuran 330 ppm)
(Arboleda et al. 2010) y una mezcla biológica comercial (TROPIMEZCLA® WP =
Paecilomyces lilacinus, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Trichoderma (
especies harzianum y koningii) y Sacharomyces cerevisiae).
42 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos
Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
Se utilizarón cormos de plátano con un peso promedio de 1.000 gramos, a los cuales se
les realizó limpieza sanitaria o “pelado” (Guzmán et al. 2012) (Figura 3-1). Los cormos de
plátano se sembraron en bolsas plásticas 5 Kg de capacidad y el tomate en bolsas
negras perforadas de 3kg. El llenado de las bolsas se realizó con suelo solarizado por
dos meses y desinfestado con Basamid®G, con el fin de tener suelo libre de nematodos
(Figura 3-1). Se aplicaron los tratamientos, seis semanas en plátano y tres en tomate
después de la siembra. La inoculación de los hongos se realizó de manera preventiva
antes de la inoculación de los nematodos usando 50 mL para plátano y 20 mL en tomate
del producto. Diez días después de la aplicación se inocularon 8.000 adultos de
Radopholus sp en plátano y 5.000 juveniles (J2) de Meloidogyne sp. en tomate alrededor
de la base de cada planta. A los 30 días de aplicar el producto se realizó una segunda
aplicación en ambos cultivares (Okorie et al. 2011).
Figura 3-1: Pelado de cormo de plátano y desinfestación del suelo.
Para la evaluación del efecto de los tratamientos, se empleó un diseño de bloques
completos al azar, con 6 tratamientos (Tabla 3-1) y 20 plantas por tratamiento, como
testigo negativo se tuvo plantas sin nematodos y como testigo positivo plántulas con
nematodos (Figura 3-2). Se realizaron lecturas quincenales de altura de planta (cm) y al
final del experimento a los 90 días de inocular los nematodos en plátano y 45 días en
tomate. Se realizó un muestreo destructivo en el cual, se registró la población de
nematodos en 15 muestras de raíces por tratamiento, extraídos por el método de
Capítulo 3: Evaluación in vivo la acción nematicida de P. sajor-caju y P. ostreatus sobre los
nematodos Radopholus sp. y Meloidogyne spp. en plátano y tomate respectivamente.
43
flotación y centrifugación en azúcar descrito por Meredith (1973), Araya (1995) y Castaño
(1998); peso seco en 5 muestras por tratamiento (tallo- follaje y raíz en tomate; raíz en
plátano) estas se secaron en un horno por 48 h a 80 °C, después de que las muestras
estaban deshidratadas se procedió a pesarlas para así obtener el peso seco; e índice de
nudosidad en el caso del tomate. Para este último, se utilizó la escala de evaluación de
infección de raíces con nudosidad causadas por Meloidogyne spp., propuesta por
Castaño (1990) (Figura 3-3). Los resultados fueron analizados con el programa Statistical
Analysis System (SAS, 2009). Las medias de los tratamientos fueron comparadas
mediante la prueba de Duncan, con una probabilidad del 5% (Okorie et al. 2011).
Figura 3-2: Plantas de tomate y plátano en almacigo.
Figura 3-3: Índice de nudosidad del nematodo Meloidogyne sp. 1: Ausencia de
nudosidad; 3: 1-2 nudosidad por planta; 5: 3-10 nudosidad por planta; 7: 11-30 nudosidad
por planta; 9 más de 30 nudosidad por planta (Castaño 1990).
44 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos
Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
Tabla 3-1: Tratamientos para la evaluación del efecto de las especies de Pleurotus con
mayor efecto nematicida sobre Radopholus sp. y Meloidogyne spp (in vivo).
Tratamiento Meloidogyne Radopholus
T1 Agua sin nematodos Agua sin nematodos
T2 Testigo negativo (Agua + nematodos) Testigo negativo (Agua +
nematodos)
T3 Mezcla Biológica (TROPIMEZCLA®
WP 2g/L)
Mezcla Biológica (TROPIMEZCLA®
WP 2g/L)
T4 Químico (Carbofuran 330 ppm) Químico (Carbofuran 330 ppm)
T5 P. ostreatus 75 g/200 mL P. sajor-caju 75 g/200 mL
T6 P. ostreatus 150 g/200 mL P. sajor-caju 150 g/200 mL
3.2 Resultados
3.2.1 Meloidogyne: Altura de plántulas (cm) y peso seco
En el análisis de varianza para la altura de las plantas, se encontró diferencias
significativas entre los tratamientos. El tratamiento que tuvo una altura promedio mayor
fue el tratamiento P. ostreatus 150 g/200 mL, que al final del periodo de medición obtuvo
una altura de 59. 4 cm, seguido del agua con 57.5 cm de altura. El tratamiento que
presentó menor promedio fue el testigo relativo Agua con nematodos, seguido de la
mezcla biológica comercial (TROPIMEZCLA® WP) (figura 3-4).
Capítulo 3: Evaluación in vivo la acción nematicida de P. sajor-caju y P. ostreatus sobre los
nematodos Radopholus sp. y Meloidogyne spp. en plátano y tomate respectivamente.
45
* Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según prueba de Duncan
Figura 3-4: Altura (cm) de plántulas de tomate Rutgers en cuatro mediciones de altura
Se encontraron diferencias estadísticas entre tratamientos para el peso seco del tallo-
hoja. El mejor promedio de la variable peso seco comparado con el testigo sin
nematodos y con nematodos, lo presentó el tratamiento de P. ostreatus 150 g/200 mL
con 6.21 g (p>0,05), siendo estadísticamente similar a P. ostreatus 75 g/200 mL. El
menor promedio lo presentó Carbofuran (figura 3-5).
El tratamiento que presento mayor peso seco de raíz comparado con los testigos fue
carbofuran y el menor fue P. ostreatus 150 g/200 mL. Cabe notar que el tratamiento de P.
ostreatus 150 g/200 mL fue el que presentó mejores resultados en el control de
Meloidogyne. (figura 3-6).
AguaAgua +
NematodosCarbofurán PO 75g Biologico PO 150g
Altura 4 57,85 45,35 48,6 50,25 55,3 59,4
Altura 3 49,3 48,05 39,6 40,2 43,7 46,2
Altura 2 42,25 32,45 34,1 37,1 38,55 39,75
Altura1 25,85 19,45 21,95 23,15 21,35 26,6
AB C ABC ABC BC A
AC ABC ABC BC AB
ABC AB BC BC A
A
C B A BCA
Alt
ura
(cm
)
46 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos
Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
* Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según prueba de Duncan
Figura 3-5: Peso seco del tallo y peso seco de la raíz en tomate Rutgers
* Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según prueba de Duncan
Figura 3-6: Peso seco de la raíz en tomate Rutgers
3.2.2 Meloidogyne: Número de nematodos fitoparásitos en 100 g de raíces e índice de nudosidad
El análisis de varianza mostro diferencias altamente significativas entre los tratamientos,
revelando que las plántulas de tomate tratadas con el hongo P. ostreatus redujeron de
AguaAgua +
nematodos
BiológicoCarbofura
nPO 75 g PO 150 g
Peso seco t- h 7,08 3,66 4,93 4,04 6,01 6,21
A
C
ABC
BC
AB AB
Pe
so s
eco
g
AguaAgua +
nematodosBiológico Carbofuran PO 75 g PO 150 g
Peso seco raíz 1,88 4,65 2,36 4,13 3,89 1,92
C
A
BC
ABABC
C
Pe
so s
eco
g
Capítulo 3: Evaluación in vivo la acción nematicida de P. sajor-caju y P. ostreatus sobre los
nematodos Radopholus sp. y Meloidogyne spp. en plátano y tomate respectivamente.
47
manera significativa las poblaciones de Meloigogyne en las raíces con respecto a ambos
testigos. (Figura 3-7).
Para tomate el número de nematodos J2 en 100g de raíces después de 45 días de la
aplicación de los tratamientos osciló entre 34.865 y 21.345, con respecto a 0 y 59.530 del
testigo absoluto y relativo respectivamente. La mayor reducción en el número de
nematodos en las raíces de tomate al final del período evaluado con respeto a los
testigos con nematodos y sin nematodos lo obtuvo el tratamiento a base de P. ostreatus
con una concentración de 150 g/ 200 mL con un número de nematodos de 21.345. Por
su parte el tratamiento que obtuvo el menor control de nematodos fue el Carbofuran con
un valor de 40.150 nematodos en 100g de raíces.
* Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según prueba de Duncan
Figura 3-7: Número de nematodos en 100 g de raíces en plántulas de tomate Rutgers.
El análisis de la reducción porcentual de los nematodos fitoparásitos, se realizó tomando
como referencia el testigo relativo. Este reveló que las aplicaciones P. ostreatus 150
g/200 mL redujeron las poblaciones de nematodos fitoparásitos en raíces en un 64%,
seguido por P. ostreatus 75 g/200 mL con una reducción de 55%. El tratamiento que
presentó menor porcentaje de reducción fue Carbofuran con un 33%, lo que demuestra
que este producto no tiene mayores efectos sobre los nematodos del género
Meloidogyne (Tabla 3-2).
AguaAgua +
NematodosBiologico Carbofurán PO 75g PO 150 g
Media 0 59.530 34.865 40.150 26.727 21.345
F
A
CB
DE
# d
e n
em
ato
do
s
48 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos
Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
Tabla 3-2: Población en 100 g de raíces (juveniles de segundo estadio (J2)), índice de
nudosidad y porcentaje de reducción.
Tratamientos
Población/gr
de raíces
Índice de
nudosidad
Porcentaje de
reducción (%)
T1- Agua sin nematodos 0.000 1.4 -
T2- Agua + nematodos 59.530 8.2 -
T3- TROPIMEZCLA® WP 34.865 7.7 41
T4- Carbofuran 40.150 7.9 33
T5- P. ostreatus 75 g/200 mL 26.727 8.1 55
T6- P. ostreatus 150 g/200 mL 21.345 5.7 64
En cuanto el índice de nudosidad, el análisis de varianza indicó diferencias estadísticas
altamente significativas entre los tratamientos, lo cual indica que la concentración de
inóculo de Meloidogyne spp. afectó severamente el sistema radical de tomate. Los altos
coeficientes de determinación (R2 > 0,74) dan alta confiabilidad a los resultados
obtenidos. El menor índice de nudosidad con respecto al testigo sin nematodos fue el
tratamiento P. ostreatus 150 g/200 mL con un índice de 5.7 (p>0,05) y diferente
estadísticamente de los demás tratamientos mostrando un control mayor de nematodos
(Figura 3-8, Figura 3-9 y Tabla 3-2 ).
* Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según prueba de Duncan
Figura 3-8: Índice de nudosidad de raíces en plántulas de tomate Rutgers
AguaAgua +
NematodosBiologico Carbofurán PO 75g PO 150 g
Media 1,4 8,2 7,7 7,9 8,1 5,7
C
AA A A
B
Ind
ice
de
nu
do
sid
ad
Capítulo 3: Evaluación in vivo la acción nematicida de P. sajor-caju y P. ostreatus sobre los
nematodos Radopholus sp. y Meloidogyne spp. en plátano y tomate respectivamente.
49
Figura 3-9: Raíces con nudosidad en plántulas de tomate Rutgers para los tratamientos,
T1 (Agua sin nematodos), T2 (Agua + nematodos), T3 (TROPIMEZCLA® WP), T4
(Carbofuran), T5 (P. ostreatus 75 g/200 mL), T6 (P. ostreatus 150 g/200 mL)
50 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos
Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
3.2.3 Radopholus: Altura de plántulas (cm) y peso seco
Las variables altura y peso seco están directamente relacionadas con las condiciones
nutricionales de las plántulas, condiciones climáticas y fitosanitarias. En el análisis de
varianza no se encontraron diferencias significativas entre la altura de las plántulas en
cada tratamiento comparadas con el testigo absoluto y el testigo con nematodos.
La aplicación de tratamientos estuvo sujeta a variaciones en el porcentaje de peso seco
en cada caso. Los tratamientos fueron estadísticamente diferentes (p>0,05). El
tratamiento que presentó un mayor porcentaje de materia seca fue el tratamiento P.
sajor-caju 150 g/200 mL con un valor de 19.72 g seguido de P. sajor-caju 75 g/200 mL
con 18.93 g, con respecto al testigo absoluto con 24.96 g y el testigo relativo con 9.03 g.
El tratamiento que presentó menor porcentaje de peso seco fue el tratamiento
Carbofuran, con un peso de 11.85 g (Figura 3-10).
* Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según prueba de Duncan
Figura 3-10: Peso seco de la raíz en Plátano Dominico Hartón.
AguaAgua +
NematodosBiologico Carbofurán PSC 75g PSC 150 g
Peso seco raíz 24,96 9,03 16,33 11,85 18,93 19,71
A
C
ABC
BC
ABAB
Pe
so s
eco
g
Capítulo 3: Evaluación in vivo la acción nematicida de P. sajor-caju y P. ostreatus sobre los
nematodos Radopholus sp. y Meloidogyne spp. en plátano y tomate respectivamente.
51
3.2.4 Radopholus similis: Número de nematodos fitoparásitos en 100 g de raíces
Al realizar el análisis estadístico a la variable población de Radopholus similis en raíces,
mostro diferencias altamente significativas (p ≤ 0,01) sobre las poblaciones de
nematodos fitoparásitos. Para el caso del tratamiento sin nematodos se registró una
población de 0 nematodos, mostrando la efectividad de la metodología aplicada para la
esterilización del suelo (Figura 3-11 y Figura 3-12).
Se encontró que el mejor tratamiento comparado con los testigos en cuanto a la
disminución de población de nematodos fitoparásitos en 100g de raíces fue el P. sajor-
caju 150 g/200 mL, con una media poblacional de 5.1473 nematodos, seguido por el P.
sajor-caju 75 g/200 mL, con una media poblacional de 6. 7717 nematodos. Estos
resultados muestras una disminución significativa con respeto al el testigo relativo con
10.8864 nematodos (Figura 3-11). El tratamiento que presentó menor control sobre la
población de nematodos fue Carbofuran, con una población de 8.3252.
* Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según prueba de Dunca
Figura 3-11: Número de nematodos en 100 g de raíces en plántulas de plátano Dominico
Hartón.
AguaAgua +
NematodosBiologico Carbofurán PSC 75g PSC 150 g
Media 0 10,8864 7,5768 8,3252 6,7717 5,1473
F
A
CB
D
E
# d
e n
em
ato
do
s
52 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos
Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
El porcentaje de reducción comparado con el testigo con nematodos osciló entre un 24 y
un 53%, siendo el tratamiento químico (Carbofuran) el que presento menor porcentaje,
seguido de la mezcla biológica (TROPIMEZCLA® WP) con 30 %. El tratamiento que
presento mayor porcentaje de reducción fue P. sajor-caju 150 g/200 mL seguido de P.
sajor-caju 75 g/200 mL con 38%
Figura 3-12: Raíces de Plátano para los tratamientos: T1 (Agua sin nematodos), T2
(Agua + nematodos), T3 (TROPIMEZCLA® WP), T4 (Carbofuran), T5 (P. sajor-caju 75
g/200 mL), T6 (P. sajor-caju 150 g/200 mL)
Capítulo 3: Evaluación in vivo la acción nematicida de P. sajor-caju y P. ostreatus sobre los
nematodos Radopholus sp. y Meloidogyne spp. en plátano y tomate respectivamente.
53
3.3 Discusión
El estudio reveló que los hongos del género Pleurotus, registraron una respuesta
significativa con respecto a los parámetros medidos en este trabajo. En el caso de la
variable altura en tomate, se observaron diferencias entre los tratamientos desde el
comienzo del experimento. Esto difiere en parte con los reportes de Silva (1994), quien
solo después de 90 días de inoculación con huevos de M. hapla en pompón, encontró un
efecto estadísticamente significativo sobre la altura de las plantas. Caso similar reportan
Niño et al. (2008), quienes no observaron diferencias significativas durante los primeros
meses en J2 de Meloidogyne sobre uchuva, reportando efectos negativos para la
variable altura solo al final del experimento. En este trabajo la diferencia temprana en la
altura, pudo deberse a que la variedad (Rutgers) utilizada en el experimento, que es
altamente susceptible al ataque del nematodo.
En el caso del plátano, en la variable altura no se encontraron diferencias entre
tratamientos. Datos similares, en la evaluación de fitonematodos en plátano fueron
obtenidos por Becerra et al. (2010) y Valencia et al. (2014); estos últimos argumentan
que la igualdad de medias en la altura de las plantas puede deberse a que los cormos
utilizados y sembrados en el experimento fueron del mismo peso aproximado y fueron
evaluados bajo las mismas condiciones nutricionales. Sin embargo, esta explicación es
poco probable, puesto que es ideal tener homogeneidad al inicio del experimento para
así poder medir el efecto del nematodo sobre las variables de respuesta. Por su parte,
Fogain (2000) menciona que los parámetros vegetativos no deberían ser usados como
indicadores de la infestación de los nematodos, ya que no se muestran efectos del
nematodo R. similis en los parámetros de crecimiento durante los dos primeros ciclos del
cultivo.
De igual manera, se puede atribuir a efectos en la fisiología de las plantas, puesto que
absorben mayor cantidad de agua y aumentan su elongación como respuesta inicial al
ataque de los nematodos y en contraste posterior a la infestación tiene efectos negativos
afectando la tasa fotosintética, toma de nutrientes y normal crecimiento, entre otras
(Melakeberhan y Ferris 1989; Fadul et al. 1998; Gaviria 1999).
54 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos
Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
En cuanto al peso seco de tomate, la población de nematodos del nudo radical se
relaciona de manera negativa con el peso seco de la raíz, lo que indica que a mayor peso
seco de raíz mayor densidad poblacional de este fitonematodo. Singh (2013) reporta
resultados similares con este trabajo, encontrando que M. incognita causa aumento
significativo en el incremento del peso en raíz y disminución de la longitud debida a las
altas poblaciones del nematodo. Hincapié y Leguizamón (1999), en el control de
Meloidogyne en almácigos de café con el hongo Verticillium chlamydosporium, reportaron
que en el tratamiento inoculado con 1,5g de arroz colonizado por el hongo y el
tratamiento químico presentaron los más bajos pesos en promedio para esta variable,
resultando estadísticamente similar con el tratamiento testigo. Esta relación fue positiva
para Radopholus; es decir, a menor peso seco de la raíz menor densidad poblacional.
Esto concuerda con los resultados de Becerra et al. (2010) y Valencia et al. (2014), en el
que los menores pesos seco de la raíz datos los obtuvieron de los tratamientos con mejor
resultados para el control de R. similis. Es de esperar entonces que en plátano a mayor
cantidad de raíces exista un mejor desarrollo de la planta y absorción de nutrientes (Villa
et al. (2008).
El índice de nudosidad, que solo se evalúo para Meloidogyne, es una medida del daño
de la población de nematodos. En su proceso alimenticio, las larvas inducen la
sintomatología característica de los nemátodos del nudo radical (Parada y Guzman 1997;
Fadul et al. 1998). En este trabajo, el uso de P. ostreatus 150 gr/200 ml resulto en la
reducción significativa de nudosidad, estos resultados concuerdan con otros estudios de
nematodos en vegetales (Freitas et al. 1999; Dávila y Hío 2005; Anwar y McKenry 2010).
Caso similar reportan Okorie et al. (2011), quienes encontraron que el número de
nudosidad estuvo de 0 y 5 en las accesiones de tomate evaluadas con P. ostreatus,
teniendo la accesión TGX 1440-11E un control completo.
Al final del experimento, P. ostreatus 150 g/200 mL redujo un 64% la población de
Meloidogyne. Dicho resultado es comparable con lo reportado en otros hongos que han
venido siendo aplicados para el control de nematodos, como lo muestran Fadul et
al.(1998) en su estudio donde reportan que para el análisis de números de nematodos J2
recuperados en café tratados con el hongo Paecilomyces lilacinus mostro efectos sobre
el incremento de la población del nematodos, haciendo una reducción de un 52% con las
Capítulo 3: Evaluación in vivo la acción nematicida de P. sajor-caju y P. ostreatus sobre los
nematodos Radopholus sp. y Meloidogyne spp. en plátano y tomate respectivamente.
55
dosis más altas. Por su parte, en plátano las poblaciones de Radopholus se redujeron
por el hongo P. sajor-caju 150 g/200 m en un 53 %, esto constituye un buen resultado si
se compara con trabajos como el de Felde et al. (2006), en el cual han aplicado hongos
biocontroladores, obteniendo porcentajes entre 44% a 65 %. Se puede asumir que
siendo este el primer trabajo en el que se prueba el hongo P. sajor-caju, se encuentra un
buen resultado. Teniendo en cuenta que en el presente trabajo se prueba por primera
vez el hongo P. sajor-caju, resulta factible que en un futuro se pueda incluir en un manejo
integrado exitoso para el control del fitonematodo Radopholus similis.
Cuadra et al.(1999) evaluaron el efecto de Nemacur, Terracur y Carbofuran, durante los
tres primeros años de desarrollo del cafeto infestado con Meloidogyne, encontrando que
ninguno de los productos fue eficaz en el control de los nematodos. González (2012),
realizó ensayos con Fluensulfone y Carbofuran sobre Meolidogyne, Helicotylenchus y R.
similis, en plátano dominico hartón., reportando que el Fluensulfone tuvo una mayor
eficacia para el control de estos fitonematodos que el Carbofuran, con este último
necesitando altas concentraciones para tener efecto sobre la población de nematodos.
Esto concuerda con los resultados obtenidos en este trabajo, donde el tratamiento
químico (Carbofuran) no fue eficaz en el control de Meloidogyne spp y R. similis. A pesar
de que no se obtuvo el mejor resultado con la mezcla biológica, los resultados
concuerdan con lo reportado para guayabo por Mosquera y Murcia (1997), quienes
encontraron una reducción del 38% de la población de Meloidogine con el hongo B.
bassiana.
Finalmente, el presente trabajo reveló que el tratamiento de P. ostreatus 150 g/200 mL,
mostraron los mejores valores en las variables avaluadas. Esto demuestra que P.
ostreatus contiene características nematicidas en almacigo para el control de
Meloidogyne spp, Lo cual concuerda con los resultados obtenidos por Okorie et al.
(2011), quienes realizaron la evaluación de los hongos P. ostreatus, P. tuberregium, y su
mezcla utilizando basidios, encontrando que las especies de Pleurotus son un recurso
nematicida importante, aunque que reportan que la acción de P. ostreatus es más
efectiva para la mortalidad de los juveniles J2, resultado en un incremento del
crecimiento de la planta y disminución de las nudosidades. En el caso del plátano, el
56 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos
Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
tratamiento que presento mejores valores fue P. sajor-caju 150 g/200 mL, por lo que se
puede explicar que la toxina generada por P. sajor-caju tiene efecto para control el de R.
similis.
En síntesis, los resultados del presente trabajo revelan un control preventivo de M.
incognita, M. javanica y R. similis con el uso de los hongos P. ostreatus y P. sajor-caju
ambos en concentraciones de 150 gr/200 ml en condiciones de almacigo. Estos dos
hongos podrían sumarse como un complemento del manejo integrado en tomate y
plátano.
4. Conclusiones y recomendaciones
4.1 Conclusiones
Se demostró que los hongos P. ostreatus y P. sajor-caju tienen efecto tanto
nematostático como nematicida.
Los hongos P. ostreatus y P. sajor-caju presentaron un control preventivo
favorable para la disminución de los nematodos M. incognita, M. javanica y R.
similis, lo cual los propone como controladores biológicos de estos fitonematodos.
Entre mayor tiempo de exposición y mayor concentración a los hongos del género
Pleurotus, estos muestran mejores resultados para control de los nematodos M.
incognita, M. javanica y R. similis
El hongo P. pulmonarius, el producto químico comercial (carbofuran) y la
mezcla biológica comercial (TROPIMEZCLA® WP) puede considerarse un
producto poco eficaz para reducir las poblaciones de M. incognita, M. javanica y
R. similis
Los resultados de campo indicaron que es necesario aumentar las
concentraciones de los hongos P. ostreatus y P. sajor-caju, para obtener datos
similares a la evaluación in vitro.
4.2 Recomendaciones
Se recomienda evaluar la utilización de concentraciones superiores del
tratamiento 6 (Pleurotus ostreatus) para el género Meloidogyne spp y (Pleurotus
sajor-caju) para el género Radopholus sp; dentro de un programa de manejo
integrado de nematodos fitoparásitos.
Se recomienda utilizar una mezcla de los hongos de Pleurotus que obtuvieron
los mejores resultados con los productos químicos, para ver si tiene algún
58 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los
nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp. asociados a cultivos de tomate y plátano
efecto de sinergia, potencializando el producto en campo. Puesto que en la
evaluación realizada tanto el producto químico como la mezcla biológica
comercial tuvieron efectos sobre los fitonematos estudiados.
Es necesario indicar que sería conveniente realizar nuevos estudios con las
especies que resultaron más efectivas en la reducción del nematodo en otras
presentaciones del hongo como extracción de la toxina, con el fin de utilizar
menos inoculo del hongo.
A. Anexo: Análisis de varianza para el efecto nematostatico y nematicida a las 24 horas sobre Meloidogyne spp.
Fuente de
variación
G.L
Primera
observación
Observación en H2O
Móviles Inmóviles Afectados
vivos
Afectados
Muertos
Tratamiento 14 46.69** 46.63 ** 29.8** 20.45**
Error 135 1.83 1.87 1.40 1.04
Total (C) 149 901.39 905.17 606.59 426.54
R2 0.73 0.72 0.69 0.67
C.V. 6.31 39.59 63.21 64.52
Ft 25.45 24.94 21.26 19.67
Media 21.47 3.45 1.87 1.58
**/ Denotan diferencias o efectos altamente significativos (< P 0.0001).
B. Anexo: Análisis de varianza para efecto nematostatico y nematicida a las 48 horas sobre Meloidogyne spp.
Fuente de
variación
G.L
Primera
observación
Observación en H2O
Móviles Inmóviles Afectados
vivos
Afectados
Muertos
Tratamiento 14 197.80** 194.9** 77.68** 97.60**
Error 135 4.25 4.33 2.50 3.93
Total 149 3343.47 3312.54 1424.69 1897.47
R2 0.83 0.82 0.76 0.72
C.V. 11.79 28.03 40.45 56.45
Ft 46.50 45.06 31.10 24.81
Media 17.49 7.42 3.91 3.51
**/ Denotan diferencias o efectos altamente significativos (< P 0.0001).
C. Anexo: Interacción tratamiento*concentración*tiempo de exposición sobre la mortalidad de Meloidogyne spp
Producto
Tiempo
(h)
Concentración
gr/200ml
Comportamiento con el producto
% Inmoviles
Comportamiento con ADE 24 (h)
%muertos Moviles (n°) Inmoviles (n°) Afectados vivos
(n°)
Afectados
muertos (n°)
Testigo absoluto
24 0 24.5 0.5 1.6 0.5 0 0
48 0 24.6 0.4 1.6 0.4 0 0
72 0 24.9 0.1 0.53 0.1 0 0
Carbofuran
24 300* 24.2 0.7 2.8 0.3 0.4 1.6
48 300* 22.6 2.4 19.6 0.8 1.6 6.4
72 300* 15.4 9.6 38.4 0.9 8.7 34.8
Mezcla biológica
24 2* 21.6 3.4 13.6 1.8 1.6 6.4
48 2* 17.0 8.0 32.0 5.2 2.8 11.2
72 2* 10.8 14.2 59.8 7.9 6.3 25.2
P. ostreatus
24
20 23.1 1.9 7.6 1.1 0.8 3.2
50 18.6 6.5 25.2 5.3 1.0 4.0
75 18.2 6.8 27.2 1.7 5.1 20.4
48
20 18.5 6.4 25.6 4.6 1.8 7.2
50 12.8 11.9 47.6 5.3 6.6 26.4
75 10.2 14.8 59.2 6.2 8.6 34.4
72
20 6.1 16.6 66.4 6.3 10.3 41.2
50 6.0 17.7 70.8 9.5 8.2 32.8
75 4.3 20.7 82.8 9.0 11.7 46.8
64 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp.
asociados a cultivos de tomate y plátano
P. pulmonarius
24
20 23.2 1.6 6.4 1.2 0.4 1.6
50 22.6 2.4 9.6 1.7 0.7 2.8
75 21.6 3.1 12.4 1.1 2.0 8.0
48
20 23.7 1.1 4.4 1.0 0.1 0.4
50 15.3 9.6 38.4 7.2 2.4 9.6
75 17.5 7.3 29.2 0.8 6.5 26.0
72
20 22.2 2.8 11.2 2.8 0.0 0.0
50 15.8 9.2 36.8 5.1 4.1 16.4
75 15.1 9.9 39.6 4.5 5.4 21.6
P. sajor-caju
24
20 23.4 1.6 6.4 0.6 1.0 4.0
50 20.1 4.8 19.2 3.6 1.2 4.8
75 20.6 4.3 17.2 0.7 3.6 14.4
48
20 21.6 3.4 13.6 2.7 0.7 2.8
50 14.0 10.9 43.6 8.4 2.5 10.0
75 12.7 12.3 49.2 7.9 4.4 17.6
72
20 19.6 15.4 61.6 9.9 5.5 22.0
50 10.2 14.8 59.2 7.4 7.4 29.6
75 9.3 15.7 62.8 9.7 6.0 24.0
Mezcla Pleurotus
24
20 22.6 2.3 9.2 1.0 1.4 5.2
50 17.9 7.0 28.0 6.0 1.0 4.0
75 19.9 5.1 20.4 1.5 3.6 14.4
48
20 21.2 3.8 15.2 2.9 0.9 3.6
50 16.9 8.1 32.4 4.4 3.7 14.8
75 13.7 10.9 43.6 0.8 10.1 40.4
72
20 18.1 6.8 27.2 3.3 3.5 14.0
50 10.7 14.2 56.8 4.7 9.5 38.0
75 3.5 21.5 86.0 11.0 10.5 42.0
*La concentración para Carbofuran está dada en ppm, la mezcla biológica está dada en g/L.
D. Anexo: Análisis de varianza del efecto nematostatico y nematicida a las 24 horas sobre Radopholus sp
Fuente de
variación
G.L
Primera
observación
Observación en H2O
Móviles Inmóviles Afectados
vivos
Afectados
Muertos
Tratamiento 14 28.65** 27.44** 4.03** 12.85**
Error 135 0.88 0.918 0.51 0.70
Total 149 520.29 508.14 124.77 274.67
R2 0.77 0.76 0.45 0.65
C.V. 4.25 33.97 83.41 42.88
Ft 32.45 29.90 7.95 18.33
Media 22.1 2.82 0.85 1.95
**/ Denotan diferencias o efectos altamente significativos a (P<0.0001).
E. Anexo: Análisis de varianza para efecto nematostatico y nematicida a las 48 horas sobre Radopholus sp
Fuente de
variación
G.L
Primera
observación
Observación en
H2O
Móviles Inmóviles A.vivos A.Muertos
Tratamiento 14 54.54** 55.69** 8.17** 27.77**
Error 135 1.94 1.76 1.25 0.77
Total 149 1025.07 1018.29 283.07 492.77
R2 0.74 0.76 0.40 0.79
C.V. 6.92 27.85 71.96 27.54
Ft 28.16 31.51 6.54 36.05
Media 20.11 4.77 1.55 3.19
**/ Denotan diferencias o efectos altamente significativos a (P<0.0001).
F. Anexo: Interacción tratamiento*concentración*tiempo de exposición sobre la mortalidad de Radopholus sp
Producto
Tiempo (h)
Concentración
gr/200ml
Comportamiento con el producto
% Inmoviles
Comportamiento con ADE 24 (h)
%muertos Moviles (n°) Inmoviles (n°) Afectados vivos
(n°)
Afectados
muertos (n°)
Testigo absoluto
24 0 24,5 0.4 1.6 0.4 0 0
48 0 24.7 0.4 1.6 0.4 0 0
72 0 24.7 0.1 0.4 0.1 0 0
Carbofurandan
24 300* 22.3 2.7 10.8 0.7 2.0 8.0
48 300* 19.9 5.0 20.0 0.5 4.4 17.6
72 300* 19.0 5.9 23.6 0.6 5.2 20.8
Mezcla biológica
24 2* 22.0 3.0 12.0 0.8 2.2 8.8
48 2* 19.2 5.6 22.8 1.5 4.2 16.8
72 2* 16.8 8.1 32.4 2.1 6.0 24.0
P. ostreatus
24
20 23.2 1.8 7.2 0.3 1.5 6.0
50 21.8 3.2 18.2 0.7 2.5 10.0
75 19.5 5.0 20.0 1.7 3.3 13, 2
48
20 22.7 2.1 8.4 0.3 1.8 7.2
50 17.7 7.2 28.8 3.1 4.1 16.4
75 17.3 7.6 30.4 2.6 4.8 19.2
72
20 21.8 3.0 12.0 0.5 2.5 10.0
50 16.7 7.3 29.2 2.7 4.5 18.0
75 13.7 11.3 45.2 4.8 6.5 26.0
68 Evaluación de la acción nematicida in vitro e in vivo de especies de Pleurotus spp., sobre los nematodos Meloidogyne spp. y Radopholus sp.
asociados a cultivos de tomate y plátano
P. pulmonarius
24
20 24.1 0.8 3.2 0.3 0.5 2.0
50 22.7 2.3 9.2 1.0 1.3 5.2
75 20.5 4.5 18.0 2.1 2.4 9.6
48
20 22.5 2.3 9.2 1.0 1.3 5.2
50 20,2 4.7 18.8 1.1 3.6 14.4
75 18.9 6.1 24.4 1.8 4.3 17.6
72
20 23.0 1.8 7.2 0.5 1.3 5.2
50 20.5 4.5 18.0 1.2 3.3 13.2
75 18.9 6.1 24.4 1.5 4.4 17.6
P. sajor-caju
24
20 23.8 1.1 4.4 0.1 1.0 4.0
50 21.5 3.5 14.0 0.8 2.7 10.8
75 20.3 4.6 18.4 1.6 3.0 12.0
48
20 23.3 1.5 6.0 0.6 0.9 3.6
50 19.7 5.3 21.2 2.2 3.1 12.4
75 17.3 7.5 30.0 2.7 4.8 19.2
72
20 22.1 2.7 10.8 0.9 1.8 7.2
50 16.8 8.0 32.0 0.7 7.2 28.8
75 6.5 18.1 72.4 1.5 10.8 43.2
Mezcla Pleurotus
24
20 24.2 0.7 2.8 0.2 0.5 2.0
50 22.0 3.0 12.0 0.4 2.4 9.6
75 19.2 5.7 22.8 1.7 4.0 16.0
48
20 21.8 2.9 11.6 1.6 1.3 5.2
50 18.5 6.5 26.0 2.4 4.1 16.4
75 18.1 6.8 27.2 1.5 5.1 20.4
72
20 21.9 3.0 12.0 1.2 1.8 7.2
50 16.1 8.9 35.6 3.6 5.3 21.2
75 12.8 12.0 48.0 4.3 7.7 30.8
*La concentración para Carbofuran está dada en ppm, la mezcla biológica está dada en g/L
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