A type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa
Targets a Toxin to Bacteria
Rachel D. Hood, P. Singh, F. Hsu, T. Günever, M. A. Carl, R. R. S. Trinidad, J. M. Silverman, B. B. Ohlson, K. G. Hicks, R. L. Plemel,
M. Li, S. Schwarz, W. Y. Wang, A. J. Merz, D. R. Goodlett and Joseph D. Mougous
Publié en janvier 2010
Hadj-Saïd Jessica
Pseudomonas aeruginosa
G -
Pathogène opportuniste à large spectre d’hôtes
patients brulés
patients immunodéprimés
mucoviscidose
Infections aiguës
Infections chroniques Système de sécrétion de type VI
(Potvin et al. 2009)
Hcp Secretion Island-I (II ou III) encoded type VI secretion system
HSI-I : pathogénicité de P.aeruginosa (Potvin et al. 2009;Morgous et al. 2006)
Système de sécrétion de type VI
PpkA-Ƥ Fha1-Ƥ H1-SST6 activéphosphoryle
PppA
P
(Filloux et al. 2008)
HCP: Hémolysin Coregulated Protein
hexamère
nanotubes (Ballister, Mougous 2008)
VgrG: Valine glycine rich G
gp5 gp27 (queue du bactériophage)
trimère perforation des membranes bactériennes
(Leiman et al. 2009)
déphosphoryle
Fha1 H1-SST6 inactivé
Objectifs
Trouver de nouvelles protéines sécrétées par le H1-T6SS
Comparer le sécrétome
H1-T6SS fonctionnel (état ouvert)
H1-T6SS non fonctionnel (état fermé)
Et de les étudier (pathogénicité, cible)
∆pppA a le H1-T6SS actif (état ON)
∆clpV1 a le H1-T6SS inactif (état OFF)
Comment caractériser l’état ouvert et l’état fermé de H1-T6SS?
Western Blot révélant Hcp1-Vhcp1vsv-g
Fusion traductionnelle:
P
Comparaison des sécrétomes des mutants de P.aeruginosa
∆pppA
H1-T6SSON
VgrG1
VgrG4
Tse1
Tse2
Tse3
∆clpV1
H1-T6SSOFF
Spectrométrie de masseSécrétomes
ON
OF
F
Deux protéines VgrG sont sécrétées par H1-T6SS
VgrG sont bien exportées par H1-T6SS
Pour une raison inconnue on a plusieurs formes de VgrG4
Western Blot révélant VgrG1-V et VgrG4-V
vgrGvsv-gFusion traductionnelle:
ON
OF
F
Tse1-3: pas de sécrétion sans Hcp (composants)
Western Blot révélant Tse1-V, Tse2-V, Tse3-V
tse vsv-gFusion traductionnelle:
ON
OF
F
OF
F
ON
ON
OF
F
Trois protéines Tse1, Tse2, et Tse3 sont sécrétées par H1-T6SS
Tse1-3 sont bien exportées par H1-T6SS
Sécrétion de Hcp en absence de Tse1-3
ON
OF
F
Western Blot révélant Hcp1-V
Pas de sécrétion de Hcp en absence de VgrG
Tse1-3 sont des substrats
Tse1-3 et VgrG: substrats ou composants du H1-T6SS ?
VgrG1 et VgrG4 sont des composants du H1-T6SS
RetS
Synthèse de RsmZ (ARN non codant)
La voie Gac/Rsm est-elle impliquée dans la sécrétion des Tse?
Western Blot révélant Tse1-V, Tse2-V, Tse3-V
P H
Nterm
Cterm
D
Senseur: GacS
P
(GDR Pseudomonas 2008-2011, Patrick Plesiat )
Régulateur de réponse: GacC
RsmASST3
L’activation de la voie Gac/Rsm augmente la production et la sécrétion des Tse1-3
Tse1-3 toujours sécrétées par le H1-T6SSBiofilm
ON
ON
ON
ON
ON
ON
OF
F
OF
F
OF
F
Caractérisation des protéines Tse2 et Tsi2
∆tsi2
Hyp: locus tse2 tsi2 essentiel pour la viabilité de l’organisme
(+) Vecteur avec tse2
(-) Vecteur contrôleInductible à l’IPTG
protéine toxique
tse2
Inhibition de la croissance P.aeruginosa
tsi2protéine d’immunité
Type VI Secretion Immunity protein 2
Tse2Tsi2
Tse2 seul
Tse2Tsi2
Interaction des protéines Tse2 et Tsi2
Interaction des protéines Tse2 et Tsi2
Lyse (sonication)
Bactérie (culot)
Fraction solubles (SN) Cytoplasme + périplasme
Fraction membranaire
(culot)
ultra
tsi2 tse2-GSK
tsi2-V tse2-GSK
Western Blot révélant Tse2-GSK et Tsi2-V
tsi2
ts
e2-G
SK
tsi2
-V
tse2
-GSK
Interaction directe entre Tsi2 et Tse2
Caractérisation des protéines Tse2 et Tsi2
Interaction des protéines Tse2 et Tsi2
Coimmunoprécipitaion de Tsi2-V et Tse2-GSK
tsi2 tse2-GSK
tsi2-V tse2-GSK
Tsi2
Tsi2-V
Tse2-GSK
Bille d’agarose couplé à l’Ac anti-VSV-G
Autres protéines
tsi2
ts
e2-G
SK
tsi2
-V
tse2
-GSK
Western Blot révélant Tse2-GSK et Tsi2-V
Tse2 agit-elle sur les cellules eucaryotes?
L’expression de tse2 diminue dramatiquement le nombre de colonies
Coexpression de tsi2 et de tse2 restaure la viabilité à un niveau
similaire au contrôle
Cellules eucaryotes : Saccharomyces cerevisiae
DO=1↔ 4.108 cellules.mL-1
Tse2 intracellulaire a un effet délétère sur les cellules eucaryotes (S. cereviae, HeLa.)
DO
=1
DO
=0.
5
DO
=0.
25
DO
=0.
13
DO
=0.
06
DO
=0.
03
Escherichia coli
Tse2 agit-elle sur les cellules procaryotes?
Burkholderia thailendensis
L’expression de tse2 seul inhibe la croissance bactérienne
La protéine Tsi2 protège la bactérie de Tse2
P.aeruginosa peut-elle utiliser la toxine Tse2 contre les cellules eucaryotes via le
H1-T6SS?
Mesure de la cytotoxicité de différentes souches P.aeruginosa sur des HeLa
∆retS : Tse2 hypersécrétée
Pas de cytotoxicité provenant de la protéine Tse2 via le H1-T6SS
Hau
tecy
toto
xici
té
Basse
cyto
toxi
cité
∆retS ∆ClpV1 : Tse2 non sécrétée
PAO1 : Tse2 non sécrétée
Tse2 n’est pas injectée par le H1-T6SS
Tse2 extracellulaire non cytotoxique
Expérience de croissance compétitive entre ≠ souches de P.aeruginosa
Nécessité d’un contact cellulaire donneur-receveur
Tse2 requiert un H1-T6SS fonctionnel
Tse2 impacte la croissance de la souche receveuse
(dénuée de Tsi2)
P.aeruginosa peut-elle utiliser la toxine Tse2 contre les cellules procaryotes via le
H1-T6SS?
∆retS∆retS∆retS
∆retS
Milieu solide Milieu liquide
∆retS : Tse2 hypersécrétée
∆retS ∆clpV1
∆retS ∆clpV1+clpV1
∆retS ∆tse2
Conclusions
VgrG1, VgrG4 sont des composants H1-T6SS
L’activation de la voie Gac/Rsm, qui active la formation de biofilm, augmente la quantité des Tse.
Tsi2, la protéine d’immunité, permet à l’organisme de se protéger de Tse2
Tse2 intracellulaire inhibe la croissance de cellules eucaryotes et procaryotes
H1-T6SS est incapable d’injecter Tse2 dans les cellules eucaryotes
H1-T6SS est incapable d’injecter Tse2 dans les souches de Pseudomonas aeruginosa sans établir un contact
Biofilm
Tse1, Tse2 et Tse3 sont des substrats du H1-T6SS
Conclusions et Discussions
P.aeruginosa
Tse2
H1-T6SS : mode de communication entre P.aeruginosa
Mort: C’était une autre bactérie
Vie: C’est une P. aeruginosa
H1-T6SS : capacité d’adaptation (fitness) en présence d’autres bactéries.
(Russell & Mougous, juillet 2011)
Expression et activation du SST6 sont élevées dans les isolats de patients atteint de mucoviscidose (Yahr, 2006)
Tse3
Tse2
Tse1
Membrane interne
Membrane externe
Membrane interne
Membrane externe
Tsi2
Tsi3
Tsi1
Tse3
Tse1
Tse2
Pepdidoglycane
Pepdidoglycane
Cellule bactériennereceveuse
Cellule bactériennedonneuse
Tsi2-Tse2 VgrG
Cytoplasme
Cytoplasme
Hcp Modèle hypothétique
Merci de votre attention