8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
1/32
Plasmid, vektor, enzim
restriksi, kloning gen
Dalam bioteknologi, teknik yang digunakan sering
disebut dengan Teknologi DNA rekombinan
Teknologi DNA rekombinan merupakan teknologiuntuk memasukkan fragmen DNA asing ke dalam
suatu jasad hidup (sel mikroba, sel tumbuhan danhewan)
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
2/32
Teknologi rekombinan DNA memerlukan
bahan dan teknik, sbb.:
. !umber DNA: berasal dari jasad donor (DNA hasil ekstraksi),DNA hasil sintesa (diantaranya dengan tehnik "#$), dan atau%DNA (yg berasal dari m$NA yg diisolasi dari jaringan organ
tertentu)
&. en'im : restriksi endonuklease dan ligase
. ektor : plasmid, *irus dan bakteriofag
+. Teknik pemasukan hibrid DNA serta teknik seleksi keberadaanhibrid di dalam sel inang
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
3/32
1. Sumber DNA
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
4/32
1. Sintesa DNA dapat terjadi se%ara alami di dalam tubuh mahluk hidup atau
dilakukan se%ara sintetis (molekul DNA buatan).
Di dalam tubuh mahluk hidup, molekul DNA disintesa melalui proses
replikasi DNA
&. DNA juga bisa dibuat dengan menggunakan tehnik
polymerase %hain rea%tion ("#$). Dengan tehnik ini DNA disintesis se%ara
en'imatik menggunakan mesin thermocycler yang dapat mengubah suhureaksi pemanasan (heating ) dan pendinginan (cooling ) se%ara %epat untuk
memungkinkan terjadinya denaturasi dan renaturasi DNA untuk terjadinya
proses replikasi DNA.
. DNA juga bisa dibuat dengan menggunakan $NA sebagai template.$eaksi en'imatik dengan template $NA dan menggunakan tehnik "#$
menghasilkan DNA yang disebut %omplementary DNA (%DNA)
http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_replicationhttp://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reactionhttp://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reactionhttp://en.wikipedia.org/wiki/DNA_replication
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
5/32
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
6/32
2. ENZYE
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
7/32
T!"e ## restri$tion
endonu$lease%#lea*es DNA at a spe%ifi% base
seuen%e
DNA ligase%
-inds two DNA mole%ules orfragments
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
8/32
DNA "ol!merase #%
ills single/stranded gaps in duple0
DNA by stepwise addition ofnu%leotides to 1 ends
2remo*es $NA primer
&everse Trans$ri"tase%
3akes a DNA %opy of an $NAmole%ule
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
9/32
Pol!nu$leotide 'inase%
Adds a phosphate to the 41/56 endof a polynu%leotide, to label it or
permit ligation.
Terminal trans(erase%
Adds homopolymer tails to the 1/
56 ends of a linear duple0
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
10/32
Alkaline ")os")atase%
$emo*es terminal phosphates
from the 41 end, the 1 end, orboth.
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
11/32
E*onu$lease ###%
$emo*es nu%leotide residues fromthe 1 ends of a DNA strand
+a$terio")age lamda-e*onu$lease%
$emo*es nu%leotides from the 41
ends of a duple0 to e0pose 1
single/stranded ends
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
12/32
&estri$tion enz!mes
$estri%tion en'ymes are DNA$uttingenz!mes found in ba%teria (and
har*ested from them for use). -e%ausethey %ut within the mole%ule, they are
often %alled restri$tion endonu$leases.
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
13/32
$estri%tion en'ymes are en'ymes isolatedfrom ba%teria that re%ogni'e spe%ifi%seuen%es in DNA and then %ut the DNA toprodu%e fragments, %alled restri%tion
fragments. $estri%tion en'ymes play a *eryimportant role in the %onstru%tion ofre%ombinant DNA mole%ules, as is done ingene %loning e0periments. Another
appli%ation of restri%tion en'ymes is to mapthe lo%ations of restri%tion sites in DNA.
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
14/32
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
15/32
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
16/32
-erbagai endonuklease restriksi serta spesifitasnya
3ikrobe 7n'im !isi pemotongan
Bacillus amylotiquefaciens 6 Bam68 9 9AT####TA9 9
Brevibacterium albidium Bal 8 T99 ##A
A## 99T
Escherichia coli $ Eco$8 9 AATT#
#TTAA 9
Haemophillus algyptus Hal 88 "u 9#9# "y
"y #9#9 "u
Haemophillus aegyptius Hae 888 99 ##
## 99
Haemophillus influenzae Hind 88 9T"y "uA#
#A"u "yT9
Haemophillus paraingfluenza Hpa88 ## 99
99 ##
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
17/32
/. 0ET&
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
18/32
; ektor adalah replikon yang akan melakukan replikasi DNA didalam sel atau membawa gen asing ke dalam resipien, atau3olekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraanyang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalamsel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresifragmen DNA asing tersebut.
; ektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot :khususnya 7. %oli, adalah plasmid, bakteriofag, kosmid, dan
fasmid.
; ektor A#s dan 7ps dapat digunakan pada khamir.
; ektor yang dapat digunakan pada sel inang eukariot :
"lasmid Ti, ba%ulo*irus, !+<
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
19/32
!yarat/syarat ektor:
. 6arus mampu melakukan replikasi se%ara mandiridi dalam sel inang (plasmid, bakteriofag seperti faglamda E-coli dan *irus
&. 6arus ada %ara tertentu untuk masuknya *ektorDNA ke dalam sel
. 6arus dapat diketahui dg mudah keberadaanya di
dalam sel
+. 6arus aman untuk digunakan
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
20/32
"=A!38D3olekul DNA sirkuler untai ganda di luar kromosom yang dapat
melakukan replikasi sendiri."lasmid tersebar luas diantara organisme prokariot dengan
ukuran yang ber*ariasi dari sekitar kb hingga lebih
; !alah satu %ontoh plasmid buatan yang banyak digunakan
dalam kloning gen adalah p-$&&.>rutan basa lengkapnyatelah ditentukan sehingga baik tempat marker maupun
pengenalan restriksinya juga telah diketahui.
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
21/32
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
22/32
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
23/32
!ebagai *ektor kloning, plasmid harus memenuhi
!yarat
. 3empunyai ukuran relatif ke%il bila dibandingkan
dengan pori dinding sel inang sehingga dapatdengan mudah melintasinya,
&. 3empunyai sekurang/kurangnya dua gen markeryang dapat menandai masuk tidaknya plasmid kedalam sel inang,
. 3empunyai tempat pengenalan restriksi sekurang/kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat
digunakan sebagai tempat penyisipan fragmenDNA, dan
+. 3empunyai titik awal replikasi (ori) sehingga dapatmelakukan replikasi di dalam sel
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
24/32
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
25/32
$epli%ation of "lasmid
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
26/32
#loning
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
27/32
Plasmid Ti Agroba$terium tume(a$iens
; !uatu bakteri, yaitu Agroba%terium tumefa%iens, yangmembawa plasmid berukuran &
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
28/32
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
29/32
-akteriofag; Adalah *irus yang sel inangnya berupa bakteri.
;Dengan daur hidupnya yang bersifat litik atau lisogenikbakteriofag dapat digunakan sebagai *ektor %loning pada selinang bakteri
;-akteriofag merupakan *irus kompleks yang menginfeksi bakteri7. %oli.
;DNA yang diisolasi dari partikel fag ini mempunyai konformasilinier untai ganda dengan panjang +@,4 kb.
;3asing/masing ujung fosfatnya berupa untai tunggal sepanjang& pb yang komplementer satu sama lain sehingga
memungkinkan DNA untuk berubah konformasinya menjadisirkuler.
;Dalam bentuk sirkuler, tempat bergabungnya kedua untai tunggalsepanjang & pb tersebut dinamakan kos.
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
30/32
Trans(er 3en "ada +akteri
Trans(ormasi; "roses perpindahan genetik dimana sel resipien
membutuhkan molekul DNA bebas (DNA yg
berada di luar sel dan sudah dimurnikan).
; Transformasi dapat terjadi se%ara alami atau di
laboratorium.
; "ada prinsipnya transfer sel bakteri akan terjadi
apabila sel resipien mampu menerima DNAasing dari sel donor. ?eadaan ini disebut
kompeten
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
31/32
8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor
32/32
T&ANS4E& 3EN 'E TANAAN