Characterization of Crude Extract Cellulase System Potential from

Bacillus subtilis Local Strain

Yoni Rina BintariEvi Susanti

Chemistry DepartmentFaculty of Mathematic and ScienceState University of Malang.

Pendahuluan• “Cellulase system (1,4-D-

glucan glucanohydrolase, EC 3.2.1.4) are multienzyme complexes, comprising three main components; endo-glucanase ( EC 3.2.1.4), exoglucanase (EC 3.2.1.9.1) and glucosidase (EC 3.2.1.21), which have been shown to act synergistically in the hydrolysis of cellulose” (Ekperigin, M.M., 2006)

Bacillus subtilis = Mikroba selulolitik

sistem selulase

ekstrak kasar sistem selulase dari Bacillus circulans B6 memiliki aktivitas karboksimetilselulase (CMCase), aviselase, selobiohidrolase, β-glukosidase dan β-xilosidase (Waenokul, et.al, 2006)

Bacillus subtilis strain lokal memiliki aktivitas CMCase dan aviselase yang lebih tinggi dibanding dengan selulase dari Bacillus coagulan dan Bacillus circulans strain lokal , (Suhardi, 2009)

Sistem selulase = Enzim Indusibel

Dipengaruhi oleh banyak sedikitnya

Induser

Produksi sistem selulase oleh B.

Subtilis

Avisel diketahui mampu menginduksi produksii sistem selulase dari Bacillus subtilis (Suhardi, 2009)

Belum diketahui jumlah konsentrasi optimum avisel

Bacillus subtilis strain lokal

konsentrasi avisel optimum

karakteristik ekstrak kasar sistem selulase Bacillus subtilis.

• 1. Berapa konsentrasi avisel optimum dalam media produksi?

• 2. Bagaimana karakteristik ekstrak kasar sistem selulase Bacillus subtilis sebagai dasar produksi selulase komersial untuk mendukung teknologi produksi bioetanol berbahan baku selulosa?

Tujuan Penelitian

Alat Dan Bahan

Bahan:

amonium molibdat, asam sulfat, besi(II) sulfat-7-hidrat, garam Rochelle, glukosa, kalium hidrogen posfat, kalsium klorida-2-hidrat, karboksimetil selulosa (CMC), avisel, magnesium sulfat-7-hidrat, mangan sulfat monohidrat, natrium hidroksida, natrium karbonat, natrium karbonat anhidrat, natrium nitrat, natrium dihidrogen fosfat-12-hidrat, dinatrium hidrogen fosfat-7-hidrat, dinatrium hidrogen arsenat-7-hidrat, natrium sulfat anhidrat, dan tembaga(II) sulfat-5-hidrat, aquades, etanol teknis dan serbuk nutrien agar, Biakan murni bakteri Bacillus subtilis yang diperoleh dari laboratorium mikrobiologi Universitas Brawijaya.

Alat:

Peralatan gelas yang terdiri dari cawan petri, gelas arloji, batang pengaduk, pipet tetes, pipet volume 20 mL, corong, beaker glass 50 mL dan 250 mL, erlenmeyer 250 mL, labu takar 50 mL, labu takar 100 mL, dan labu takar 500 mL. b). Peralatan khusus yang terdiri dari jarum ose, neraca analitik, laminar flow (enkase), autoklaf, inkubator, shaker water bath, sentrifugator, pH meter, dan spektronik 20

Diagram Alir Penelitian

Gambar; Shaker Water Bath Gambar: CMCase sebelum ditambahkan dengan pereagen Samogyi-nelson

Gambar: Avicelase sebelum ditambahkan dengan pereagen Samogyi-nelson

Gambar: Avicelase setelah diuji dengan samogyi-nelson

Hasil Diskusi dan Pembahasan

1. Optimasi Konsentrasi Avisel untuk Produksi Sistem Selulase Bacillus subtilis Strain Lokal

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.90

20

40

60

80

100

120

140

117,54

93.36

CMCase Avicelase

konsentrasi avisel (%)

aktiv

itas

enzi

m (μ

mol

/jam

)

produksi sistem selulase optimum pada penggunaan avisel sebagai induser sekaligus sumber karbon sebesar 0,5% dengan aktivitas CMCase dan aviselase rata-rata yang dihasilkan masing-masing sebesar 93,36 μmol/jam, dan 117,54 μmol/jam.

Hasil penelitian ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Immanuel, et al., (2005) bahwa enzim endoglukanase yang diisolasi dari Bacillus sp. memiliki aktivitas optimum pada konsentrasi substrat sebesar 0,5%

Karakterisasi Ekstrak Kasar Sistem Selulase

1. Penentuan pH optimum

5 6 6.2 6.4 6.6 6.8 7 80

50

100

150

200

250

180.18

197.07

180.18 180.18 174.55

157.65

191.44 197.07

213.96 213.96 213.96225.23

pH

CMCase Avicelase

aktiv

itas

enzi

m (μ

mol

/jam

)

aktivitas CMCase dan aviselase bekerja pada range pH optimum 6-7.

Hasil penelitian ini sejalan dengan penelitian Alam, et al., (2004) melaporkan bahwa selulase yang diisolasi dari Streptomyces omiyaensis memiliki aktivitas optimum untuk CMCase dan aviselase pada pH 6,5; Shailendra, et al., (1991) juga melaporkan bahwa aktivitas selulase optimum pada pH 6,5-7,5

2. Penentuan Suhu optimum

25 30 35 40 45 50 550

20

40

60

80

100

120

80.13

101.49

suhu inkubasi (°C)

CMCase Avicelase

aktiv

itas e

nzim

(μm

ol/ja

m) Aktivitas CMCase optimum

pada suhu 45°C dengan aktivitas 80,13 μmol/jam, dan aviselase optimum pada suhu 50°C dengan aktivitas 101,49 μmol/jam

Hasil penelitian ini sejalan dengan penelitian Shabeb, et al., [2010] menyatakan selulase yang diisolasi dari Bacillus subtilis strain KO memiliki aktivitas optimum pada suhu 45°C. Immanuel, et al., [2005], melaporkan bahwa enzim selulase yang diisolasi dari Cellulomonas, Bacillus, and Micrococcus spp., memilki aktivitas optimum untuk menghidrolisis selulosa pada rentang suhu (20-50°C) dengan suhu optimum 40°C.

3. Penentuan Waktu Inkubasi Optimum

0 1 2 3 4 5 60

20

40

60

80

100

120

106.98

90.08

CMCase Avicelase

waktu inkubasi (jam)

aktiv

itas

enzi

m (μ

mol

/jam

) waktu inkubasi optimum yakni selama 2 jam, dengan aktivitas CMCase rata-rata sebesar 90,08 μmol/jam dan aktivitas aviselase rata-rata 106,98 μmol/jam

Penelitian ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Susanti, (2011) melaporkan bahwa waktu inkubasi optimum ekstrak kasar sistem selulase dari Bacillus circulans selama 2 jam

4. Penentuan nilai Vmaks dan KM CMCase dan Aviselase dalam sistem selulase dari Bacillus subtilis

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.50

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0.04

1/[S]

1/Vo

Gambar : Kurva Hubungan 1/[S] terhadap 1/[Vo] aktivitas aviselase

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.50

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0.04

0.045

0.05

1/[S]

1/Vo

Gambar: Kurva Hubungan 1/[S] terhadap 1/[Vo] aktivitas CMCase

Berdasarkan gambar tersebut maka untuk aktivitas aviselase diperoleh Vmaks = 625 µg/jam, KM = 4,16%, aktivitas CMCase diperoleh Vmaks = 1047,12 µg/jam, sedangkan KM = 9,09%.

Menggunakan Lineawever-Burk

Hasil ini mengindikasikan bahwa B. subtilis menghasilkan selulase dengan karakter afinitas aviselase terhadap substrat lebih tinggi dibandingkan CMCase, tetapi kecepatan reaksi CMCasenya lebih cepat daripada aviselase.

Nilai Vmaks dan KM merupakan parameter kinetika enzim, Vmaks digunakan untuk mengetahui konsentrasi substrat maksimum yang terikat pada enzim, sedangkan KM bermanfaat untuk mengetahui ukuran afinitas enzim-substrat (E-S)

0 1 2 3 4 5 60

20

40

60

80

100

120

140

CMCase Avicelase

lama penyimpanan (hari)

Akt

ivita

s en

zim

(μm

ol/ja

m)

5. Stabilitas Ekstrak Kasar Sistem Selulase Terhadap Lama Penyimpanan pada suhu 4 ͦ C

Gambar: Kurva lama penyimpanan waktu(hari) pada suhu 4ºC terhadap aktivitas enzim

Kesimpulan1. Konsentrasi optimum avisel sebagai induser dalam media pertumbuhan

untuk menghasilkan sistem selulase Bacillus subtilis adalah 0,5% dengan aktivitas CMCase sebesar 93,36 μmol/jam dan aktivitas aviselase sebesar 117,54 μmol/jam.

2. Sistem selulase dari Bacillus subtilis memiliki kondisi reaksi enzimatis optimum pada pH = 6,0-7,0, suhu 50oC dan waktu inkubasi 2 jam dengan aktivitas CMCase 90,08 μmol/jam dan aviselase 106,98 μmol/jam. CMCase dalam sistem selulase Bacillus subtilis memiliki nilai VMaks = 1047,12 μg/jam dan KM= 9,09%. Aviselase dalam sistem selulase Bacillus subtilis memiliki nilai VMaks= 625 μg/jam dan KM= 4,16%. CMCase dalam sistem selulase selama masa penyimpanan pada suhu 4°C mengalami % penurunan aktivitas mulai hari ke-1 hingga ke-5, yaitu 13,63%; 18,17%; 36,36%; 100%; 100%. Aviselase dalam sistem selulase mengalami % penurunan aktivitas mulai hari ke-1 hingga ke-5 yaitu 13,40%; 30,43%; 80,30%; 95,65%; 100%.

TERIMA KASIH