Yeast Gram Stain

7/27/2019 Yeast Gram Stain

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THE STAINING OF YEASTS BY GRAM'S METHOD.*ARTHUR T . H E N R I C I , M.D.

( I n s t r u c t o r i n B a c t e r i o l o g y , U n i v e r s i t y o f M i n n e s o t a . )S i n c e t h e i n t r o d u c t i o n o f G r a m ' s s t a i n a s a means o f d i f -f e r e n t i a t i n g b a c t e r i a , a c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f w o r k h a s b e e n

d o n e t o w a r d s e x p l a i n i n g t h e n a t u r e o f t h i s r e a c t i o n . I t i sn o t m y i n t e n t i o n t o r e v i e w t h e l i t e r a t u r e , w h i c h h a s b e e nw e l l d o n e e l s e w h e r e , b u t i t m ay b e s t a t e d b r i e f l y t h a t t h et h e o r i e s a d v a n c e d d i v i d e t h e m s e l v e s i n t o t w o g r o u p s , ac h e m i c a l e x p l a n a t i o n a n d a p h y s i c a l o n e . A c c o r d i n g t o t h ec h e m i c a l t h e o r y , a d v a n c e d b y U n n a , l d y e s o f t h e p a r a r o s -a n i l i n g r o u p c a n b e b o u n d b y t h e i o d i n e t o c e r t a i n s u b -s t a n c e s i n t h e b a c t e r i a l b o d y i n s u c h a way a s t o r e n d e r t h e mi n s o l u b l e i n a l c o h o l . The m e c h a n i c a l t h e o r y s u p p o r t e d b yB r u d n y 2 a s s u m e s a d i f f e r e n c e i n t h e t e x t u r e o f v a r i o u s b a c -t e r i a l c e l l s , t h e G r a m - p o s i t i v e o r g a n i s m s b e i n g r e a d i l y p e r -m e a t e d b y t h e i o d i n e s o l u t i o n w h i c h p r e c i p i t a t e s t h e s t a i n i nt h e m e s h e s o f t h e i r p r o t o p l a s m s o t h a t i t i s n o t r e a d i l y w a s h e do u t ; w h i l e t h e G r a m - n e g a t i v e o r g a n i s m s a r e o f s o f i n e at e x t u r e t h a t t h e i o d i n e d o e s n o t p e n e t r a t e t h e m . R e c e n t l yT . H . C . B e n i a n s 3 h a s b e e n a b l e t o d e m o n s t r a t e t h a t b yc r u s h i n g t h e c e l l s o f b a c t e r i a a n d y e a s t s t h e a m o r p h o u sm a t e r i a l r e m a i n i n g l o s e s i t s p o w e r o f r e t a i n i n g t h e G r a m ' ss t a i n . I h a v e b e e n a b l e t o c o n f i r m h i s w o r k w i t h y e a s t c e l l s .H e c o n c l u d e s f r o m h i s e x p e r i m e n t s t h a t t h e p o w e r o f G r a m -p o s i t i v e n e s s r e s i d e s i n t h e b a c t e r i a l e n v e l o p e , w h i c h t h ei o d i n e somehow r e n d e r s i m p e r m e a b l e t o a l c o h o l a f t e r t h es t a i n h a s p e n e t r a t e d .

The G r a m - s t a i n i n g p r o p e r t y i s n o t a t a l l g e n e r a l l y d i s -t r i b u t e d t h r o u g h o u t l i v i n g p r o t o p l a s m , o n l y a l i m i t e d g r o u po f o r g a n i s m s s h o w i n g t h i s p r o p e r t y . O f a n i m a l t i s s u e s i tm a y b e s a i d t h a t t h e n u c l e u s r e t a i n s t h e s t a i n l o n g e r t h a n t h ec y t o p l a s m , b u t a l l t h e t i s s u e e l e m e n t s m a y b e u l t i m a t e l y

* R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n M a y 4 , 1 9 1 4 .( 4 0 9 )


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HENRICI.

d e c o l o r i z e d w i t h t h e e x c e p t i o n o f k e r a t o h y a l i n , w h i c h , a ss h o w n b y E r n s t , 4 r e m a i n s d e e p l y s t a i n e d . P r o b a b l y t h es a m e i s t r u e o f t h e h i g h e r members o f t h e p l a n t k i n g d o m ;I h a v e e x a m i n e d s e c t i o n s o f a b l a d e o f g r a s s , a l e t t u c e l e a f ,a n d a n o n i o n s t a l k w i t h o u t f i n d i n g a n y G r a m - s t a i n i n ge l e m e n t s . M o u l d s s t a i n i r r e g u l a r l y , i s o l a t e d g r a n u l e s i n t h em y c e l i a r e t a i n i n g t h e s t a i n w h i l e l a r g e a r e a s d o n o t s t a i n a ta l l . O f p r o t o z o a , I h a v e e x a m i n e d P a r a m e c i u m a n d f o u n dt h a t i t d e c o l o r i z e d , a l t h o u g h r a t h e r s l o w l y . The s p i r o c h e t e sa n d m a l a r i a p a r a s i t e s a r e G r a m - n e g a t i v e .

T h e y e a s t s a n d b a c t e r i a , t h e n , a r e t h e o n l y c l a s s e s o f c e l l si n w h i c h t h i s p r o p e r t y i s f r e q u e n t l y f o u n d . S o f a r a s I k n o w ,a l l o f t h e y e a s t s a r e G r a m - p o s i t i v e , a n d t h e y s t a i n s o d e e pa n d s o l i d a b l a c k t h a t i t s e e m e d t o m e n o t u n l i k e l y t h a t t h e yw o u l d r e t a i n t h e s t a i n e v e n m o r e f i r m l y t h a n t h e o r d i n a r yG r a m - p o s i t i v e b a c t e r i a . I n o r d e r t o d e m o n s t r a t e t h i s t h ef o l l o w i n g e x p e r i m e n t w a s p e r f o r m e d : S m e a r s w e r e made i nt h e u s u a l m a n n e r a n d f i x e d b y h e a t . T h e y w e r e s t a i n e d f o ro n e m i n u t e i n a n i l i n m e t h y l v i o l e t ( a p r e l i m i n a r y t e s t w i t ha n i l i n g e n t i a n v i o l e t s h o w e d n o d i f f e r e n c e i n t h e r e s u l t s a n dt h e m o r e s t a b l e m e t h y l v i o l e t w a s u s e d d u r i n g t h e r e s t o f t h ew o r k ) f o l l o w e d b y G r a m ' s i o d i n e s o l u t i o n f o r o n e m i n u t e .D e c o l o r i z a t i o n w a s a c c o m p l i s h e d b y a g i t a t i n g i n n i n e t y - s i xp e r c e n t a l c o h o l f o r o n e m i n u t e ; i n a d d i t i o n s m e a r s o f e a c ho r g a n i s m w e r e d e c o l o r i z e d i n f i v e p e r c e n t , t e n p e r c e n t ,f i f t e e n p e r c e n t , t w e n t y p e r c e n t , t w e n t y - f i v e p e r - c e n t a n dt h i r t y p e r c e n t o f h y d r o c h l o r i c a c i d i n n i n e t y - s i x p e r c e n ta l c o h o l . A w a t e r y s o l u t i o n o f s a f r a n i n w a s u s e d a s a c o u n t e r -s t a i n . T h e f o l l o w i n g o r g a n i s m s w e r e u s e d : S t a p h y l o c o c c u sp y o g e n e s a u r e u s , S t r e p t o c o c c u s p y o g e n e s ( h e m o l y t i c u s )B a c i l l u s d i p h t h e r i a , B a c i l l u s a n t h r a c i s , b a k e r ' s y e a s t ( S a c -c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) a n d a c h r o m o g e n i c " t o r u l a " ( S a c -c h a r o m y c e s g l u t i n i s ) o b t a i n e d f r o m t h e a i r . T w e n t y - f o u r -h o u r a g a r s l a n t c u l t u r e s w e r e u s e d ; f i v e p e r c e n t o f d e x t r o s ew e r e a d d e d t o t h e a g a r o n w h i c h t h e y e a s t s w e r e g r o w n .

W i t h t h e u s u a l t e c h n i c a l l o f t h e s e o r g a n i s m s w e r e G r a m -p o s i t i v e . Wh e n f i v e p e r c e n t a c i d a l c o h o l w a s u s e d a s a

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STAINING O F YEASTS BY GRAM'S M E T H O D .d e c o l o r i z i n g a g e n t , t h e d i p h t h e r i a b a c i l l u s w a s c o m p l e t e l yd e c o l o r i z e d ; t h e a n t h r a x b a c i l l u s w a s d e c o l o r i z e d e x c e p t f o rt h e s p o r e s , w h i c h r e m a i n e d v i o l e t ; a b o u t o n e - t e n t h o f t h es t r e p t o c o c c i r e t a i n e d t h e d y e ; t h e s t a p h y l o c o c c i a n d t h ey e a s t s a l o n e r e t a i n e d t h e s t a i n c o m p l e t e l y . W i t h t e n p e rc e n t a c i d a l c o h o l t h e b a c t e r i a w e r e a l l c o m p l e t e l y d e c o l o r -i z e d , w h i l e t h e y e a s t c e l l s s t i l l r e m a i n e d a d e e p v i o l e t c o l o r .

I n a l l o f t h e b a c t e r i a l s m e a r s e x a m i n e d , e a c h c e l l w a ss t a i n e d e i t h e r e n t i r e l y r e d o r e n t i r e l y v i o l e t ; t h a t i s , w i t h t h ee x c e p t i o n o f t h e s p o r e s i n t h e a n t h r a x b a c i l l i t h e r e w a sn e v e r n o t e d a c e l l w h i c h s h o w e d p a r t i c l e s o r g r a n u l e s t h a tr e t a i n e d t h e s t a i n m o r e f i r m l y t h a n t h e r e s t o f t h e c e l l .T h i s m o r e o r l e s s s u d d e n a n d c o m p l e t e d e c o l o r i z a t i o n s e e m st o b e c h a r a c t e r i s t i c o f t h e b a c t e r i a l c e l l . I t i s t r u e , I h a v es e e n f u s i f o r m - l i k e b a c i l l i i n s m e a r s f r o m d e c a y e d t e e t h w h i c hs h o w e d G r a m - p o s i t i v e g r a n u l e s i n a G r a m - n e g a t i v e g r o u n ds u b s t a n c e , b u t s u c h a p i c t u r e i s q u i t e t h e e x c e p t i o n i n b a c -t e r i a . As w i l l b e s e e n , t h e p r o c e s s o f d e c o l o r i z a t i o n i se n t i r e l y d i f f e r e n t i n t h e y e a s t c e l l s .

I n t h e s m e a r s o f b a k e r ' s y e a s t s t a i n e d b y G r a m ' s m e t h o dt h e r e w e r e n o t e d o c c a s i o n a l c e l l s t h a t w e r e p a r t i a l l y d e c o l o r -i z e d , i . e . , t h e y s h o w e d a number o f f i n e b l a c k p a r t i c l e sc l o s e l y p a c k e d t o g e t h e r i n a r e d m a t r i x . S u c h c e l l s f o r m e do n l y a v e r y s m a l l p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l number i n t h ef i e l d a n d w e r e c o n s i d e r e d t o b e a g e d o r d y i n g c e l l s . I ns m e a r s d e c o l o r i z e d w i t h f i v e p e r c e n t a n d t e n p e r c e n t a c i da l c o h o l t h e s e c e l l s b e c a m e more n u m e r o u s , a l t h o u g h s t i l lr e l a t i v e l y f e w i n n u m b e r , t h e v a s t m a j o r i t y o f t h e c e l l sr e m a i n i n g a s o l i d v i o l e t o r b l a c k . W i t h f i f t e e n p e r c e n t a c i da l c o h o l , t h e m a j o r i t y o f t h e c e l l s s h o w e d a f i n e l y g r a n u l a ra p p e a r a n c e . I n m o s t o f t h e s e c e l l s t h e g r a n u l e s w e r e u n i -f o r m l y d i s t r i b u t e d t h r o u g h t h e c y t o p l a s m . I n s o m e , h o w -e v e r , t h e g r a n u l e s w e r e c o n f i n e d t o o n e e n d o f t h e c e l l ,l e a v i n g a b o u t o n e - t h i r d o f t h e c y t o p l a s m a s o l i d r e d . S t i l lo t h e r c e l l s s h o w e d a r e d c a p a t e i t h e r p o l e o f t h e c e l l , w i t ha b l a c k g r a n u l a r m a s s i n t h e c e n t e r . I n m a ny o f t h e c e l l st h e g r a n u l e s w e r e f e w e r i n number a n d m o r e w i d e l y s e p a -r a t e d , o c c a s i o n a l c e l l s s h o w i n g o n l y a f e w g r a n u l e s . V e r y

4 I I


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HENRICI.

r a r e l y a c e l l c o u l d b e f o u n d w h i c h s h o w e d c o m p l e t ed e c o l o r i z a t i o n .Whe n t w e n t y p e r c e n t a c i d a l c o h o l w a s u s e d a s a d e c o l o r i z -

i n g a g e n t o n l y a f e w c e l l s r e m a i n e d w h i c h s t a i n e d a s o l i db l a c k . A l m o s t a l l s h o w e d t h e g r a n u l a r a p p e a r a n c e n o t e da b o v e , a n d i n t h e m a j o r i t y o f t h e c e l l s t h e s e g r a n u l e s w e r ef e w e r i n number a n d l e s s c l o s e l y p a c k e d t o g e t h e r . C e l l ss h o w i n g g r a n u l e - f r e e p o l e s w e r e s t i l l o c c a s i o n a l l y n o t e d .Some o f t h e y e a s t - c e l l s w e r e c o m p l e t e l y d e c o l o r i z e d s a v ef o r o n e o r t w o l a r g e r , c e n t r a l l y l o c a t e d , b l a c k g r a n u l e s . Then u m b e r o f c o m p l e t e l y d e c o l o r i z e d c e l l s h a d p e r c e p t i b l yi n c r e a s e d . W i t h t w e n t y - f i v e p e r c e n t a c i d a b o u t o n e - t e n t ho f t h e c e l l s s t i l l s h o w e d a n u m b e r o f s m a l l b l a c k g r a n u l e s ;t h e r e s t w e r e c o m p l e t e l y d e c o l o r i z e d . Wh e n t h i r t y p e r c e n ta c i d a l c o h o l w a s u s e d a l l t h e c e l l s s t a i n e d a s o l i d r e d .

S m e a r s o f S . g l u t i n i s s h o w e d i n g e n e r a l t h e samep h e n o m e n a e x c e p t t h a t t h e s e o c c u r r e d w i t h i n n a r r o w e rl i m i t s , t h a t i s g r a n u l a r f o r m s d i d n o t a p p e a r u n t i l f i f t e e n p e rc e n t a c i d w a s u s e d , a n d d e c o l o r i z a t i o n w a s c o m p l e t e w i t ht w e n t y - f i v e p e r c e n t a c i d . S m e a r s d e c o l o r i z e d w i t h s e v e n -t e e n a n d o n e - h a l f p e r c e n t a c i d a l c o h o l c o r r e s p o n d e d i na p p e a r a n c e w i t h s m e a r s o f S . c e r e v i s i x d e c o l o r i z e d w i t ht w e n t y p e r c e n t a c i d .

I h a v e a l r e a d y m e n t i o n e d t h e o c c u r r e n c e o f l a r g e , c e n t r a l l yl o c a t e d g r a n u l e s i n o c c a s i o n a l c e l l s o f S . c e r e v i s i x whent w e n t y p e r c e n t a c i d w a s u s e d . S u c h a n a p p e a r a n c e w a s m o s ti n c o n s t a n t , some s m e a r s s h o w i n g o n l y a f e w o f t h e s e c e l l s ,w h i l e s m e a r s f r o m a n o t h e r c u l t u r e o f t h e same s t r a i n w o u l ds h o w a g r e a t m a ny o f t h e m . S . g l u t i n i s s h o w e d t h e samep h e n o m e n o n s a v e t h a t h e r e n e v e r more t h a n o n e s u c h l a r g eg r a n u l e w a s p r e s e n t i n a c e l l . M o s t i n t e r e s t i n g w a s t h e p i c t -u r e s h o w n w h e n s u c h g r a n u l e s o c c u r r e d i n b u d d i n g c e l l s .H e r e t h e g r a n u l e moved t o t h e p e r i p h e r y o f t h e c e l l o p p o -s i t e t h e b u d ; a s i m i l a r g r a n u l e o c c u r r e d i n t h e b u d a t t h ep o i n t n e a r e s t t h e m o t h e r c e l l ; a n d a f i n e b l a c k l i n e c o u l d b es e e n i n t h e s t a l k j o i n i n g t h e t w o g r a n u l e s . I a m a t a l o s s t oe x p l a i n t h e n a t u r e o f t h e s e l a r g e g r a n u l e s a s I h a v e n e v e r

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STAINING O F YEASTS BY GRAM'S M E T H O D .b e e n a b l e t o r e p r o d u c e t h e m a t w i l l . I t m ay b e b r i e f l ys t a t e d , h o w e v e r , t h a t t h e y c o r r e s p o n d i n s i z e a n d p o s i t i o n t ot h e g r a n u l e s w h i c h R a u m 6 w a s a b l e t o d e m o n s t r a t e i n s m e a r ss t a i n e d w i t h m e t h y l e n e b l u e a n d B i s m a r c k b r o w n ; a n d s i m i -l a r l y t h e y c o r r e s p o n d t o b o d i e s w h i c h c a n b e s t a i n e d i n t r av i t a m w i t h n e u t r a l r e d , a s f i r s t p o i n t e d o u t b y E r n s t 6 a n dw h i c h K o h l 7 c o n s i d e r s t o b e m e t a c h r o m a t i c g r a n u l e s .T h e i r p o s i t i o n i n t h e b u d d i n g c e l l s u g g e s t s t h a t t h e y a r e o fa n u c l e a r n a t u r e ; a n d f i n a l l y t h e p o s s i b i l i t y a l s o s u g g e s t si t s e l f t h a t t h e y a r e s p o r o g e n i c g r a n u l e s .

T h e g r a n u l a r a p p e a r a n c e o f t h e d e c o l o r i z i n g y e a s t c e l lh a s b e e n n o t e d b e f o r e b y M o e l l e r , 8 who h e a v i l y o v e r s t a i n e dh i s p r e p a r a t i o n s w i t h v a r i o u s a n i l i n d y e s a n d w i t h G r a m ' ss t a i n a n d t h e n d e c o l o r i z e d s t r o n g l y i n t w o p e r c e n t a c e t i ca c i d . K o h l 9 c o n s i d e r s t h e s e g r a n u l e s t o b e o f t h e n a t u r e o fa l b u m i n o u s c r y s t a l l o i d s . Some l i g h t i s t h r o w n o n t h i s s u b -j e c t b y t h e v e r y i n t e r e s t i n g e x p e r i m e n t s o f R . a n d W.A l b e r t . ' 0 T h e s e a u t h o r s w o r k e d w i t h y e a s t c e l l s k i l l e d b y am i x t u r e o f a l c o h o l a n d e t h e r . S u c h d e a d c e l l s w e r e s t r o n g l yG r a m - p o s i t i v e , a n d s t i l l r e t a i n e d t h e i r a b i l i t y t o f e r m e n t d e x -t r o s e . By t a k i n g s a m p l e s o f t h e s e d e a d y e a s t c e l l s f r o m t h ef e r m e n t i n g s u g a r s o l u t i o n f r o m t i m e t o t i m e , a n d s t a i n i n g t h e mb y G r a m ' s m e t h o d , t h e y w e r e a b l e t o d e m o n s t r a t e t h a t t h ec e l l s g r a d u a l l y l o s t t h e i r p o w e r t o r e t a i n t h e d y e , s o t h a t a tt h e e n d o f f e r m e n t a t i o n a l l t h e c e l l s h a d b e c o m e c o m p l e t e l yG r a m - n e g a t i v e . S m e a r s i n t h e i n t e r m e d i a t e s t a g e s , h o w e v e r ,s h o w e d a s e r i e s o f p h e n o m e n a q u i t e s i m i l a r t o t h o s e w h i c hI h a v e d e s c r i b e d a b o v e , i . e . , t h e c e l l s t o o k o n a g r a n u l a ra p p e a r a n c e a n d t h e s e g r a n u l e s t h e n b e c a m e g r a d u a l l y f e w e ri n n u m b e r . A s i m i l a r e x p e r i m e n t i n w h i c h t h e s u g a r s o l u -t i o n w a s r e p l a c e d b y w a t e r s h o w e d t h a t t h e p h e n o m e n o n h a dn o r e l a t i o n t o f e r m e n t a t i o n , a s t h e same p r o c e s s o c c u r r e d .T h e y w e r e a b l e t o d e m o n s t r a t e f u r t h e r t h a t t h e s e c h a n g e si n t h e s t a i n i n g r e a c t i o n o f t h e c e l l s w e n t h a n d i n h a n d w i t ha p r o c e s s o f a u t o l y s i s ; t h a t , a s t h e G r a m - s t a i n i n g m a t e r i a lb e c a m e g r a d u a l l y l e s s e n e d , t h e a m o u n t o f c o a g u l a b l e a l b u -m e n a n d o f p r e c i p i t a t e w i t h M i l l o n ' s r e a g e n t i n t h e s u p e r n a -t e n t f l u i d b e c a m e g r e a t e r a n d g r e a t e r . T h e s e e x p e r i m e n t s

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HENRICI.

w e r e c o n f i r m e d i n t h e f o l l o w i n g y e a r b y T r o m m s d o r f f , " w how a s a b l e t o s h o w t h a t t h e p h e n o m e n o n b o r e n o r e l a t i o n t ot h e c o n t e n t o f g l y c o g e n o r z y m a s e i n t h e c e l l s . H e f u r t h e rd e m o n s t r a t e d t h a t t h e l o s s o f t h e G r a m - s t a i n i n g p r o p e r t yw a s n o t d u e t o a s i m p l e s o l u t i o n o f some o f t h e c e l l s u b -s t a n c e i n w a t e r a s t h e p h e n o m e n o n f a i l e d t o a p p e a r i f t h es u s p e n s i o n w e r e p l a c e d i n t h e i c e - b o x . F i n a l l y h e s h o w e dt h a t i f t h e c e l l s w e r e c o o k e d f o r a s h o r t t i m e , t h e i n t r a c e l l u l a rp r o t e o l y t i c e n z y m e s b e i n g d e s t r o y e d , n o d e c o l o r i z a t i o n t o o kp l a c e .

I t s e e m s t o m e p r o b a b l e t h a t t h o s e g r a n u l e s w h i c h a p p e a ri n t h e f r e s h l y f i x e d y e a s t c e l l w h e n a c i d a l c o h o l i s u s e d a s ad e c o l o r i z i n g a g e n t a r e i d e n t i c a l w i t h t h o s e w h i c h a p p e a r i nt h e a u t o l y z i n g c e l l s w h e n t h e o r d i n a r y G r a m ' s s t a i n i s u s e d .I f t h i s i s s o , t h e s e g r a n u l e s a r e t r u l y o f a n a l b u m i n o u sn a t u r e . I t s e e m s f u r t h e r p r o b a b l e t h a t t h e a b i l i t y o f c e r t a i np a r t i c l e s o f t h e c e l l p r o t o p l a s m t o r e s i s t d e c o l o r i z a t i o n g o e sh a n d i n h a n d w i t h t h e i r a b i l i t y t o r e s i s t a u t o l y s i s ; i . e . , i t i sn o t u n l i k e l y t h a t t h o s e g r a n u l e s w h i c h r e t a i n t h e s t a i n l o n g -e s t i n i n c r e a s i n g s t r e n g t h s o f a c i d a l c o h o l a r e i d e n t i c a l w i t ht h o s e g r a n u l e s w h i c h a r e s t i l l G r a m - p o s i t i v e a f t e r s o m e h o u r so f a u t o l y s i s .

The b e a r i n g w h i c h t h e s e f a c t s h a v e o n t h e p r o b l e m o f t h em e c h a n i s m o f G r a m ' s s t a i n i s n o t c l e a r . T h e y seem t os u p p o r t t h e c h e m i c a l t h e o r y , f o r i t i s u n r e a s o n a b l e t o s u p -p o s e t h a t t h e t e x t u r e o f t h e y e a s t c y t o p l a s m i s s u c h t h a tt w e n t y p e r c e n t a c i d a l c o h o l c a n e n t e r m e s h e s w h i c h a r ei m p e r v i o u s t o w e a k e r s t r e n g t h s . A l s o t h e s e d a t a w i l l n o ts u p p o r t t h e t h e o r y o f B e n i a n s , s i n c e t h e a c i d a l c o h o l c a np e n e t r a t e t h e c e l l w a l l a n d d i s s o l v e o u t t h e s t a i n f r o m p o r -t i o n s o f t h e c y t o p l a s m , l e a v i n g o t h e r p o r t i o n s s t a i n e d . AsB e n i a n s h a s s t a t e d , i n s m e a r s o f t h e c r u s h e d y e a s t c e l l s o n en o t i n f r e q u e n t l y s e e s s m a l l G r a m - p o s i t i v e g r a n u l e s i n t h ep i n k - s t a i n i n g a m o r p h o u s m a t e r i a l , b u t t h e s e a r e f e w i n n u m -b e r a n d a r e d e c o l o r i z e d b y a m o r e p r o l o n g e d a c t i o n o f t h ea l c o h o l , s o t h a t t h e c r u s h e d y e a s t c e l l m ay b e c o n s i d e r e d t ob e e n t i r e l y G r a m - n e g a t i v e . I a m u n a b l e a t t h i s t i m e t o o f f e r

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STAINING O F YEASTS BY GRAM'S M E T H O D . 415a n e x p l a n a t i o n w h i c h w i l l h a r m o n i z e t h e s e a p p a r e n t l yd i s c o r d a n t d a t a .

S U M M A R Y .I t h a s b e e n s h o w n t h a t y e a s t c e l l s r e t a i n G r a m ' s s t a i n

m o r e f i r m l y t h a n t h e c o m m o n G r a m - p o s i t i v e b a c t e r i a . I th a s b e e n f u r t h e r s h o w n t h a t , u n l i k e t h e b a c t e r i a , t h e c y t o -p l a s m o f t h e y e a s t c e l l i s n o t h o m o g e n e o u s w i t h r e g a r d t oi t s a b i l i t y t o r e t a i n t h e s t a i n , c e r t a i n g r a n u l e s a p p e a r i n g i nt h e d e c o l o r i z i n g c e l l w h i c h h o l d t h e d y e l o n g e r t h a n o t h e r s .I t i s s u g g e s t e d t h a t t h e a b i l i t y o f t h e s e g r a n u l e s t o r e s i s td e c o l o r i z a t i o n i s i n d i r e c t p r o p o r t i o n t o t h e i r a b i l i t y t o r e s i s ta u t o l y s i s .

REFERENCES.I . U n n a . C e n t r a l b l . f . B a k t e r i o l . u . P a r a s i t e n k u n d e , I 8 8 8 , i i i , 2 1 8 .2 . B r u d n y . I b i d . , 1 9 0 8 , A b t h e i l u n g i i , x x i , 6 2 .3 . B e n i a n s . J o u r n . o f P a t h . and B a c t . , 1 9 1 2 , X V i i , 1 9 9 .4 . E r n s t . Z i e g l e r ' s B e i t r i i g e , x x , I 5 5 .5 . R a u m . Z e i t s c h r . f . H y g . u . I n f e k t i o n s k r a n k h . , x , i 8 9 1 , I .6 . E r n s t . C e n t r a l b l . f . B a k t . u . P a r a s i t e n k . , A b t h . i i , v i i i , I .7 . K o h l . D i e H e f e p i l z e , L e i p z i g , I 9 o 8 , 3 9 .8 . M o e l l e r . C e n t r a l b l . f . B a k t . , e t c . , x i i , 5 4 5 , 1 8 9 2 .9 . K o h l . D i e H e f e p i l z e , 3 4 .

I o . R . a n d W. A l b e r t . C e n t r a l b l . f . B a k t . , e t c . , A b t h . i i , v i i , 7 3 7 .i i . T r o m m s d o r f f . I b i d . , A b t h . i i , v i i i , 8 2 .

D ES C R IPTI O N OF PLATE XXXII.Th e i l l u s t r a t i o n s a r e a l l camera l u c i d a d r a w i n g s o f s e l e c t e d f i e l d s .F I G . I .-. c e r e v i s i e s t a i n e d b y G r a m ' s m e t h o d .F I G . 2 . -h e s a m e , d e c o l o r i z e d w i t h I S p e r c e n t a c i d a l c o h o l .F I G . 3.-The s a m e , d e c o l o r i z e d w i t h 2 0 p e r c e n t a c i d a l c o h o l . Thec e l l s marked A s h ow t h e l a r g e c e n t r a l g r a n u l e s m e n t i o n e d i n t h e t e x t .F I G . 4 . -The s a m e , d e c o l o r i z e d w i t h 2 5 p e r c e n t a c i d a l c o h o l .F I G . 5 .- S . g l u t i n i s s t a i n e d b y G r a m ' s method a n d d e c o l o r i z e d w i t h I S

p e r c e n t a c i d a l c o h o l .F I G . 6. - T h e s a m e , d e c o l o r i z e d w i t h I 7 i p e r c e n t a c i d a l c o h o l . C e l l s

m a r k e d A sho w t h e l a r g e c e n t r a l g r a n u l e s . B s h o w s an i r r e g u l a r l ys t e l l a t e g r a n u l e r e s e m b l i n g a m i t o t i c f i g u r e . C i s a b u d d i n g c e l l s h o w -i n g a d i v i d i n g g r a n u l e .


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JOURNAL OF M E D I C A L R E S E A R C H

4 )

H e n r i c t

V O L . XXX, P L A T E X X X I I .

Y o a a t s

. 4 9 AA& 4 0

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