Розмарин и рак

Rosmarinus officinalis & cancer

Научные исследования

Carnosol: фенольные дитерпены с раком химические потенциал.Рак - это беспроигрышная проблему для здоровья человечества. После стремится на протяжении

десятилетий, чтобы найти рак вылечить, внимание теперь переключилось снижения заболеваемости и смертности от рака , путем прекращения курса развития опухоли. Многочисленные биологически активных фитохимических веществ, особенно тех, которые присутствуют в съедобных и несъедобных видов растений, были зарегистрированы, чтобы снизить риск возникновения многих видов рака. Многочисленные научные данные показывают, что carnosol, фенольные дитерпены присутствуют в розмарин (Rosmarinus officinalis L.), обещает предотвращении некоторых видов рака. Значительный прогресс был достигнут в разграничении биохимические механизмы, лежащие в основе химические эффекты carnosol. Результаты in vitro клеточной культуры, исследований, а также модельных экспериментах на животных показали, что carnosol тормозит экспериментально индуцированного канцерогенеза и экспонатов мощным антиоксидантным, противовоспалительным, антипролиферативным и апоптоз индуцирующего свойства. Кроме того, carnosol повышает чувствительность chemoresistant раковых клеток к химиотерапевтическим агентам. Цель настоящего обзора заключается, чтобы пролить свет на подробное механистические аспекты рака проведение химиопрофилактики с carnosol.

J Cancer Prev. 2014 Jun;19(2):103-10. doi: 10.15430/JCP.2014.19.2.103.Carnosol: a phenolic diterpene with cancer chemopreventive potential.Chun KS1, Kundu J1, Chae IG1, Kundu JK1.Author information 1College of Pharmacy, Keimyung University, Daegu, Korea.AbstractCancer is an unbeaten health challenge for the humankind. After striving for decades to find a cancer

cure, attention has now been shifted to reduce the morbidity and mortality from cancer by halting the course of tumor development. Numerous bioactive phytochemicals, especially those present in edible and non-edible plant species, have been reported to reduce the risk of many cancers. Multiple lines of evidence suggest that carnosol, a phenolic diterpene present in rosemary (Rosmarinus officinalis L.), holds the promise of preventing certain types of cancer. A remarkable progress has been made in delineating the biochemical mechanisms underlying the chemopreventive effects of carnosol. Results from in vitro cell culture studies as well as animal model experiments have revealed that carnosol inhibits experimentally

1

induced carcinogenesis and exhibits potent anti-oxidative, anti-inflammatory, antiproliferative and apoptosis inducing properties. Moreover, carnosol enhances the sensitivity of chemoresistant cancer cells to chemotherapeutic agents. The purpose of this review is to shed light on the detailed mechanistic aspects of cancer chemoprevention with carnosol

ВведениеПроведение химиопрофилактики рака с натуральными продуктами, особенно в фитохимических

веществ, присутствующих в различных съедобных и несъедобных лекарственных растений, получил значительный интерес за последние несколько лет.1,2 открытие и развитие нескольких клинически используемых противоопухолевых препаратов (например,винкристин и паклитаксел) были созданы из растительных источников.1 Большое исследование по выявлению химические вещества растительного изучил большое количество растительных вторичных метаболитов, таких как каротиноиды, алкалоиды, флавоноиды, chalcones, ксантоны, кумарины и терпеноидов, с противораковыми свойствами.1 большое количество лабораторных и эпидемиологических исследований показали, рак химические эффекты розмарина (R. officinalis Л.),3 средиземноморское растение, которое принято употреблять в качестве диеты. По данным случай-контроль исследование, потребление диетические, содержащие розмарин может снизить риск рака легких.4 Доклинических исследований, экстракт розмарина показали, антиоксидантное, антимутагенное, противовоспалительные и противораковые свойства этого растения.3 Администрация экстракт розмарина, желудочный зонд, как сообщается, тормозят 7,12-dimethylbenz(в)антрацена (DMBA)-индуцированной мышь коже папилломы формирования5 и крыса молочных канцерогенеза.6 эти противораковые свойства розмарина обусловлены его основные полифенольных составляющих, таких как carnosol, carnosic кислоты, rosmanol, розмариновая кислота, урсоловая кислота. Carnosol (Рис.), орто-diphenolic dipterpene, был впервые выделен в 1942 году от завода Salvia carnosa (sage) и его химическое строение, были раскрыты в 1964 году.7 впоследствии, carnosol была извлечена из многих других видов растений, в том числе и розмарин.8-10 этот мини-обзор посвящен биохимические основы химиопрофилактики рака с carnosol.

IN VIVO ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ЭФФЕКТЫ CARNOSOLНесколько исследований продемонстрировали потенциал carnosol ингибировать

экспериментально индуцированного канцерогенеза у животных моделей. Местное применение carnosol (3 или 10 мкмоль) до администрации из 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-ацетата (тра) два раза в неделю в течение 20 недель значительно ингибирует множество папиллом в ДГМА по инициативе кожи мыши. Это рак кожи профилактический эффект carnosol в мышь кожи было обусловлено его ингибирующим влиянием на ДТС-индуцированной активации орнитин декарбоксилазы фермента, который является отличительной чертой опухолевых акции.5 Когда carnosol (200 мг/кг массы тела) вводили внутрибрюшинно в течение 5 дней крысам оспорены DMBA, соединение ингибирует DMBA-ДНК-аддукт формирования и сократилась кратность аденокарцином молочной железы. Однако, диетическое администрации carnosol (1%) не смогли повлиять на DMBA-ДНК-аддукт формирования.6 Хотя причина такого расхождения в биоактивности carnosol между пероральном и внутрибрюшинном путях введения не понятно, можно предположить, что биодоступность carnosol на диетическое администрации не могут быть достаточными, чтобы повлиять на молочной DMBA-ДНК-аддукт формирования. Лечение аденоматозный полипоз coli (APC)мин+ mice, которая разрабатывает спонтанных опухолей толстой кишки и напоминает человека аденоматозный полипоз, при диете, не содержащей carnosol (0.1%) ослабляется множественность опухолей кишечника.11 это исследование также продемонстрировало, что carnosol уменьшила фосфорилирования β-катенина, который обычно размещается в клеточные мембраны, взаимодействуя с adherens junction белка Е-кадгерина, и увеличение локализации как β-катенина и Е-кадгерина при кишечной enterocyte мембраны.11 Пероральное введение carnosol (30 мг/кг массы тела) в течение 5 дней в неделю в течение 4 недель подавляет рост человеческого рака предстательной железы (22Rv1) клеток ксенотрансплантат опухоли у бестимусных мышей и снижение сывороточного уровня простат-специфического антигена в опухоли-подшипник мышей.12 защитные эффекты carnosol против HCl/этанол-индуцированной мышь поражений желудка,13 и

2

четыреххлористый углерод-индуцированного повреждения печени крыс14 показывают потенциал этого соединения, чтобы предотвратить желудка и гепатоцеллюлярной канцерогенеза.

БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХИМИОПРОФИЛАКТИКИ РАКА С CARNOSOLВ настоящее время в доступной литературе На механистической основе противораковые

химические эффекты carnosol указывает на то, что соединение может вмешиваться в разнообразных внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в развитии опухолей (Рис.). Окислительный стресс и воспаление, через производство активных форм кислорода (АФК) и широкого спектра медиаторов воспаления, способствуют опухолевой трансформации клеток путем окислительного и/или ковалентной модификации важных клеточных макромолекул, например белков, липидов и нуклеиновых кислот.15 Воздействия генотоксичных канцерогенов инициирует трансформацию клеток, которые затем подвергаются клональной экспансии развиваются доброкачественные опухоли, и впоследствии прогресс для полного злокачественности. Весь ход развития опухоли включает в измененных биохимических событий, таких как потеря плотности-зависимое ингибирование роста, независимость от внешних стимулов роста для пролиферации клеток, дефектных клеточного цикла управления, уклонение от апоптоза, расширенные ангиогенеза, ткани хозяина инвазии и метастазирования, нарушен обмен веществ, и способность защитить иммунные реакции хозяина. В совокупности, эти особенности являются отличительными чертами рака.16 Carnosol было показано, чтобы вызвать химические эффекты (1) Блокировка bioactivation канцерогенов, (2) повышение антиоксидантной и/или активности ферментов детоксикации, (3) подавление опухоли-содействие воспаление, (4) ингибирование пролиферации клеток и селективно индуцирует апоптоз в раковых клетках, и (5) блокирование опухолевого ангиогенеза и инвазии. В таблице приведены биохимические основы противоопухолевой эффект carnosol.

1. Модуляция метаболизма канцерогеновОпухоль инициации-это первый и необратимый процесс, который начинается с повреждения

клеточной ДНК при воздействии генотоксичных канцерогенов. Однако многие канцерогены неактивны в см. и активируются, образуя ultimate канцерогенов через процесс биотрансформации. Метаболически активации канцерогенов может вызвать повреждение ДНК, положив тем самым начало развития опухоли за счет активации онкогенов и инактивации генов-супрессоров опухолей. В то время как в печеночной системы цитохрома Р450 (CYP) ферменты катализируют I фазы биотрансформации pro-канцерогены, чтобы генерировать активные канцерогены, ряд ферментов детоксикации, такие как глутатион-S-трансферазы (GST), NAD(P)H: хинин оксидоредуктазы (NQO), NAD(P)H: хинин-редуктазы (QR), и глюкуронилтрансферазой и др. быстро устраняет метаболически активации канцерогенов через II фазы биотрансформации процесса.17 Таким образом, блокада деятельности CYP ферментов и индукции фазы II детоксикации ферментов может предотвратить канцерогенеза. При транскрипционной активации ферментов CYP в основном регламентируется arylhydrocarbon рецептора (AhR), дезинтоксикационных ферментов являются транскрипционно активирован в основном за счет редокс-чувствительных транскрипционных факторов, ядерный фактор эритроидных, связанных с фактором-2 (регулируемый белком nrf2). Carnosol сообщалось тормозят бензо[α]пирена (Б[α]P)-индуцированных ДНК-аддукт образования путем ингибирования экспрессии генов и активности CYP1A1, и индукция мРНК уровни GST-пи и NQO человека в бронхиальных эпителиальных клеток.18 аналогично, carnosol ослабляется B[α]P-индуцированной CYP1A1 и CYP1B1 деятельности через экспрессирован AhR в человеческих кератиноцитов (HaCaT) клеток.19 это исследование также продемонстрировало, что carnosol ингибирует активацию Ар, который является клиентом белка шаперона белка теплового шока 90 (Hsp90), блокируя Атфазная активность Hsp90. Таким образом, рак кожи химические эффекты carnosol может быть, отнесенных к его модуляции B[α]P метаболизм. Индукция GST и QR фермента деятельности carnosol20 может за счет его ингибирующее влияние DMBA-ДНК-аддукт формирования и молочных канцерогенеза. В другом исследовании, carnosol увеличение белка и мРНК экспрессии NQO1 и ее ферментативную активность клеток печени крыс.21

Афлатоксин В1 (AFB1), потенциальный hepatocarcinogen, преобразуется в генотоксического метаболит, AFB1-8, 9-эпоксида, CYPlA2 и ферментов CYP3A4.22,23 активный метаболит AFB1-8, 9-эпоксида может быть обезвреживаются через glutathionylation, катализируемой GST ферментов.

3

Таким образом, ингибирующее влияние carnosol-богатый экстракт розмарина на CYP1A2 и CYP3A4 деятельности увековечен в печени человека эпителиальных клеток,24 и индукции печеночного фермента GST активность carnosol20 показывают, что соединение может помешать hepatocarcinogenesis через метаболической инактивации потенциальных канцерогенов.

2. Антиоксидантные эффекты carnosolГенерация АФК и истощение внутриклеточных антиоксидантов привести к окислительному

повреждению клеточных макромолекул. Carnosol и его структурный аналог carnosic кислоты счета для 90% антиоксидантные свойства розмарина. Aruoma et al.8 сообщили, что carnosol обладает перекисные радикалы очистки собственности и было показано, подавляют кр2+-индуцированного окисления липопротеинов низкой плотности и генерации липидов свободными радикалами в микросомах печени мышей. Однако, carnosol не смог повлиять на супероксид-анион производства от ксантин/ксантин оксидазы системы.25 Еще один возможный механизм ингибирующего воздействия carnosol на перекисное окисление липидов является то, что соединение может изменить мембранных фосфолипидов заказ. По сравнению с фосфолипидной мембраной-бесплатная анализа, примерно в 4-6 раз более мощной антиоксидантной активностью препарата наблюдалась при анализе в фосфолипидных мембран на основе анализа. Исследование также показало, что соединение уменьшилось количество и/или подвижности молекул воды, находящихся в заполярном руководитель группы регион мембранного фосфолипида.26

Carnosol сообщалось активации различных клеточных антиоксидантных/дезинтоксикационных ферментов, которые в совокупности называются цитопротективных белков. Лечение carnosol индуцированной экспрессии антиоксидант фермент гемоксигеназа-1 (HO-1) в BV2 клетки микроглии27 и феохромоцитомы крысы (PC12) клетки,28 и охраняемых эти клетки от интерферона-γ (ИФН-γ)-индуцированной воспалительной реакции с пероксидом водорода (H2O2)-индуцированного окислительного стресса, соответственно. По данным последнего исследования, carnosol активации регулируемый белком nrf2 через фосфорилирование вверх по течению киназы Akt. Трансфекция клеток с доминирующим негативным регулируемый белком nrf2 или лечение Фармакологические ингибиторы Akt отменен carnosol-индуцированную экспрессию и промоутер активности HO-1.28 генов, кодирующих цитопротективных белков гавани antioxidant response element (), также известный как электрофил response element. Транскрипционной активации цитопротекторных белков в основном регулируется посредством Nrf-2-опосредованная активация.17 Carnosol увеличил регулируемый белком nrf2 связывания с хо-1-являются, таким образом, в результате чего хо-1 выражение. Инкубация человека HepG2 клеток с carnosol привело к увеличению внутриклеточного уровня глутатиона (GSH) и выражение ГШ синтеза фермента глутамат, цистеин лигазы каталитической субъединицы (курс gclc) и модификатор субъединицы (GCLM) через ядерное накопление регулируемый белком nrf2 и усиленной деятельности, и защищающего клетки от H2O2-индуцированной гибели клеток. Трансфекция клеток с регулируемый белком nrf2 siRNA отменен carnosol-индуцированной экспрессии курс gclc и GCLM.29

3. Затухание воспалительной реакцииХроническое воспаление является предрасполагающим фактором для развития опухоли. В то

время как воспаление индуцирует окислительный стресс, чрезмерное накопление АФК в дальнейшем усиливает воспалительные повреждения тканей. ROS или различных воспалительных медиаторов, таких как простагландины (ПГ), оксида азота (NO), интерлейкины (IL) и хемокинов содействовать опухолей. В действительности, тесной связи и сигнализации cross-talk между воспалительные иммунные клетки и опухолевые клетки создают воспалительного микроокружения в растущей опухоли. Поэтому, подавляя опухоль-ассоциированного воспаления-это прагматичный подход для химиопрофилактики рака.30 представитель провоспалительных ферментов, таких как индуцибельной синтазы окиси азота (iNOS) и циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2), надэкспрессироанных во многих раковых заболеваний.31 в то время как ЦОГ-2 является скорость-лимитирующим ферментом в синтезе PGs, iNOS катализирует окислительное дезаминирование L-аргинина к не производят. Как PGs, так и не опухоль продвижение ролей.15 Аберрантной экспрессии COX-2 и iNOS, и последующего производства различных воспалительных медиаторов включают ненадлежащего усиления клеточных сигнальных путей, включающая в себя различные вышестоящие киназ, таких как mitogen-

4

activated protein (MAP) киназы, phosphatidylisonositol-3-киназы (PI3K), Akt, ингибитор каппа B (IκB) киназы (IKK) и Янус-активированной киназы (JAK), и их последующее транскрипционных факторов, таких как ядерный фактор-каппа B (NF-b), активатора протеина-1 (AP-1), и преобразователь сигналов и активатора транскрипции (STAT).15,31 Блокада активации этих воспалительных сигнальных молекул составляет биохимические основы профилактики рака с различными противовоспалительными средствами.30

Предварительная обработка мышиных макрофагов RAW264.7 клеток с carnosol значительно ослабляется липополисахарид-индуцированной мРНК и белков, экспрессия iNOS, и производства нет. Это исследование также продемонстрировало, что carnosol ослабило IKK деятельности и фосфорилирования и деградации IκBα, и последующие NF-b связывания ДНК, блокируя фосфорилирования р38 MAP киназы и внеклеточной сигнал-регулируемой киназы (ERK).32 инкубации мышиных перитонеальных клеток с carnosol уменьшилась липополисахарид-индуцированной продукции нитритов, не влияя на жизнеспособность клеток.33 Carnosol угнетал phorbol эфира-индуцированного белка и мРНК экспрессии COX-2 и производства металлов платиновой группы2 в эпителиальных клетках молочной железы человека (184B5/ее), клеточной линии neoplastically трансформируется с neu онкогена. В исследовании также сообщается, что соединение отрицается связывание ДНК AP-1 путем ингибирования активности протеинкиназы С и фосфорилирования ERK, p38 MAP киназы, и c-Jun-N-terminal kinase. Гиперэкспрессия c-Jun отменен ингибиторный эффект carnosol на ДТС-индуцированная экспрессия ЦОГ-2.34 Местное применение carnosol ослабляется ДТС-индуцированной уха мыши образование отеков как показал снижение лейкоцитарной инфильтрации и уменьшение экспрессии мРНК COX-2, IL-1β и фактор некроза опухолей-α.35 лечение человеческих полиморфно-ядерных лейкоцитов с carnosol снизил производство воспалительных лейкотриенов через блокаду 5-липоксигеназы деятельности.36

4. Ингибирование клеточной пролиферации и индукции апоптозаCarnosol ингибирует пролиферацию и индуцированного апоптоза в несколько человеческих

раковых клеток. Составной индуцированной фазе G2/M клеточного цикла и снижение митотической выход человеческого рака толстой кишки (Caco-2) клеток с помощью регуляция циклин B выражение.37 аналогично, carnosol индуцированной G2/M фазе клеточного цикла в человеческой предстательной железы (PC3) клеток в концентрации-зависимым способом.38 В антипролиферативный эффекты carnosol в PC3 клеток опосредованно через подавление различных cyclins (A, D1 и D2) и циклин-зависимых киназ (Cdk)-2, -4, -6, и регуляция Cdk ингибиторы, р21 и р27. Кроме того, carnosol-индуцированного апоптоза в PC3 клеток опосредуется через активацию каспаз-8 и -9, индукция Bax и ингибирование B-клеточная лимфома-2 (Bcl-2) выражение. В антипролиферативное и апоптозиндуцирующего действия carnosol в эти клетки были связаны с увеличением фосфорилирования 5'-AMP-активированной киназы-α и фактора инициации трансляции 4е-связывающий белок-1, и снижение фосфорилирования mammalian target of rapamycin, рибосомного белка p70S6 киназы и Akt.38 С антипролиферативным эффектами carnosol в лейкоза человека (HL-60) клеток были связаны с subG1 ареста, активация каспазы-3 и индукции апоптоза.39

Активация рецептора андрогенов (AR) - это ключевой молекулярный переключатель в канцерогенез простаты. Компьютерное моделирование исследование и последующее time-resolved fluorescence resonance energy transfer анализа показали, что carnosol можно связать с лиганд-связывающим доменом AR и экспонатов антагонизма рецептора, но не агонистического, собственности.12 Лечение человеческого рака простаты LNCaP и 22Rv1 клеток с carnosol снизилась экспрессия AR. Это исследование также сообщило, что carnosol взаимодействовали с лиганд-связывающим доменом рецептора эстрогена-α (ERα), которые вовлечены в канцерогенез молочной. Инкубация рака молочной железы человека (MCF-7) клетки с carnosol снизилась экспрессия ERα. Эти результаты показывают, что carnosol может выступать в качестве двойной ингибитор AR и ERα, и могут быть эффективными в профилактике канцерогенеза простаты и груди.12

Индукция цитотоксичности в pro-B-и пре-B-острый лимфобластный лейкоз клеточных линий, carnosol был связан с деполяризация митохондриальной мембраны и снижение экспрессии антиапоптозных белков Bcl-2.40 Лечение взрослых Т-клеточный лейкоз/лимфома (ATL) клеток с carnosol индуцированной клеточной гибели через истощение клеточного уровня GSH, которое было

5

отменено путем предварительной обработки с ГШ прекурсоров N-ацетил цистеин. Эти находки позволили предположить, что carnosol измененного клеточного редокс-статуса. Протеомный анализ также показал заметное увеличение экспрессии редуктаз, собравшиеся ферментов гликолитического пути и пентозофосфатного пути, пути в carnosol-лечение ATL клеток.41 В нашем недавнем исследовании мы обнаружили, что carnosol значительно снижается жизнеспособность человеческого рака толстой кишки (HCT116) клеток и индуцированного апоптоза через поколение ROS, активация р53, Вах, каспазы-9 и каспазы-3, расщепление поли-(ADP-рибоза) полимеразы (PARP), и ингибирование Bcl-2 и Bcl-xl выражение. Кроме того, carnosol ослабляется активации STAT3 посредством модуляции вверх по течению киназы JAK2 и Src, и снижение экспрессии маркеров клеточной пролиферации, таких как survivin, циклин D1, -D2,- D3.42

Другое правдоподобное молекулярной мишенью carnosol является пероксисом proliferator activated receptor-γ (PPARγ), который, как известно, оказывают противоопухолевое действие. Лечение COS-7 клеток, трансфицированных с Gal4-driven PPARγ Гена люциферазы построить с carnosol побудило PPARγ активностью.43

5. Подавление ангиогенеза, клеточной миграции и инвазииУвеличение ангиогенеза опухоли и способность опухолевых клеток к миграции и вторжения через

хост стромальных тканей являются критически важных биохимических реакций в опухолевой промоции и прогрессии. В химические эффекты carnosol отчасти можно отнести за счет его антиангиогенных свойств. Carnosol ингибирует миграцию человека бронхиальная эндотелиальных клеток аорты (BAEC) и эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC) и притупляется трубки формирования этих клеток в Матригеля plug анализа, который был связан со снижением активности матриксной металлопротеиназы-2 (MMP-2). Кроме того, хориоаллантоисной мембране анализа показали in vivo антиангиогенных эффект препарата.39 в другом исследовании, carnosol снизилась экспрессия ММП-9 и угнетал миграции сосудистых гладкомышечных клеток.44 Huang et al.45 показали, что carnosol значительно ослабило миграции и инвазии меланомы мыши В16/F10 клеток путем снижения экспрессии и активности ММП-9 через снижение экспрессии NF-b и AP-1, и эти эффекты опосредованы через ингибиторный эффект соединения по фосфорилирования MAP киназы и Akt.

6. Химио - и радио-сенсибилизирующим действиемРаковые клетки часто приобретают устойчивость к химио-и лучевой терапии. Многие химические

фитохимических веществ, как было показано, чтобы облегчить хемостойкость и радиорезистентности, тем самым подавляя рост опухоли в сочетании с химиотерапией или лучевой терапии. Carnosol было показано, индуцируют апоптоз в человеческих яичников (A2780), а также его резистентных к цисплатину (A2780CP70) дочь клеточных линий.46 Одним из механизмов хемостойкость является регуляция лекарства, измеряем transporter белка p-гликопротеина (P-gp). При множественной лекарственной устойчивостью человеческой эпидермоидной карциномы KB (KB-C2) клетки инкубировали с carnosol в присутствии даунорубицин, составной усилению клеточного накопления даунорубицин. Согласно этому исследованию, carnosol стимулировало P-gp Атфазная активность, что позволяет предположить, что соединение может функционировать в качестве субстрата P-gp Атфазы по конкурентоспособным занимая препарата сайта связывания фермента.47 Carnosol также выставлены radiosensitizing эффекты, как показано увеличение апоптоза В16/F10 клеток меланомы при облучении х-излучения, в то время как соединения предотвратить радиационно-индуцированной цитотоксичности в нормальных эпителиальных клеток простаты.48

ВыводыНаше нынешнее понимание, что рак-это системное мультифакторная болезнь привела нас

считают, что таргетирование одного Гена может быть не эффективна в уничтожении раковых заболеваний. Это было доказательство от наших многолетних усилий в разработке противоопухолевых препаратов, что многие single gene targeting химиотерапия показал ограниченный клинический успех. Во всем мире, распространенность рака по-прежнему на подъеме и требует соответствующей стратегии, направленной на снижение заболеваемости и смертности от рака. За последние несколько десятилетий, много исследований показали, что рак можно предотвратить, изменив стиль жизни факторы, такие как потребление пищи, богатой фруктами и

6

овощами, регулярные физические упражнения и отказ от курения и т.д. Растения содержат различные биологически активных фитохимических веществ, которые, как известно, предотвращают канцерогенез путем модуляции различных биохимических путей. Систематические исследования по естественным дитерпены, carnosol, открыл его мульти-таргетинга-воздействия на различные признаки рака. Несмотря на прогресс в понимании механизмов химиопрофилактики рака с carnosol, существует недостаток знаний о влиянии препарата на метастазов и иммунной побега опухолевых клеток, и его фармакокинетические свойства. Тем не менее, доказательства из текущей доклинические исследования свидетельствуют о том, carnosol как перспективные противораковые химические агента.

INTRODUCTIONCancer chemoprevention with natural products, especially the phytochemicals present in various edible

and non-edible medicinal plants, has received significant interest over the last several years. 1,2 The discovery and development of several clinically used anticancer drugs (e.g.,vincristine and paclitaxel) have been originated from plant sources.1 A great deal of research on identifying chemopreventive phytochemicals has explored a large number of plant secondary metabolites, such as carotenoids, alkaloids, flavonoids, chalcones, xanthones, coumarins and terpenoids, with anticancer properties.1 A large number of laboratory-based as well as epidemiological studies have demonstrated the cancer chemopreventive effects of rosemary (R. officinalis L.),3 a Mediterranean herb that is commonly consumed as diet. According to a case-control study, intake of diet containing rosemary can reduce the risk of lung cancer.4 Preclinical studies with rosemary extract have shown the antioxidant, antimutagenic, anti-inflammatory and anticancer effects of this plant.3 Administration of rosemary extract by gavage has been reported to inhibit 7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA)-induced mouse skin papilloma formation5 and rat mammary carcinogenesis.6 These anticancer properties of rosemary are attributable to its major polyphenolic constituents, such as carnosol, carnosic acid, rosmanol, rosmarinic acid, and ursolic acid. Carnosol (Figure), an ortho-diphenolic dipterpene, has been first isolated in 1942 from the plant Salvia carnosa (sage) and its chemical structure has been elucidated in 1964.7 Subsequently, carnosol has been extracted from many other plant species including rosemary.8–10 This mini review addresses the biochemical basis of cancer chemoprevention with carnosol.

IN VIVO ANTITUMOR EFFECTS OF CARNOSOLSeveral studies have demonstrated the potential of carnosol to inhibit experimentally induced

carcinogenesis in animal models. Topical application of carnosol (3 or 10 μmol) prior to administration of 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) twice a week for 20 weeks significantly inhibited the multiplicity of papillomas in DMBA-initiated mouse skin. This skin cancer preventive effect of carnosol in mouse skin was attributable to its inhibitory effect on TPA-induced activation of ornithine decarboxylase enzyme, which is a hallmark of tumor promotion.5 When carnosol (200 mg/kg body weight) was administered intraperitoneally for 5 days to rats challenged with DMBA, the compound inhibited DMBA-DNA adduct formation and reduced the multiplicity of mammary adenocarcinomas. However, dietary administration of carnosol (1%) failed to affect DMBA-DNA adduct formation.6 Although the reason for this discrepancy in bioactivity of carnosol between oral and intraperitoneal routes of administration is not clear, it can be presumed that the bioavailability of carnosol upon dietary administration may not be adequate to affect mammary DMBA-DNA adduct formation. Treatment of adenomatous polyposis coli (APC)min+ mice, which develops spontaneous colon tumors and resembles human familial adenomatous polyposis, with a diet containing carnosol (0.1%) attenuated the multiplicity of intestinal tumors.11 This study also demonstrated that carnosol diminished the phosphorylation of β-catenin, which normally resides in cell membrane by interacting with an adherens junction protein E-cadherin, and increased the localization of both β-catenin and E-cadherin at the intestinal enterocyte membrane.11 Oral administration of carnosol (30 mg/kg body weight) for 5 days in a week for 4 weeks suppressed the growth of human prostate cancer (22Rv1) cells xenograft tumors in nude mice and decreased the serum level of prostate-specific antigen in tumor-bearing mice.12 The protective effects of carnosol against HCl/ethanol-induced mouse gastric lesions13 and carbon tetrachloride-induced rat liver damage14 suggest the potential of this compound to prevent gastric and hepatocellular carcinogenesis.

7

BIOCHEMICAL BASIS OF CANCER CHEMOPREVENTION WITH CARNOSOLCurrently available literature on the mechanistic basis of cancer chemopreventive effects of carnosol

indicates that the compound can interfere with diverse intracellular signaling pathways involved in the development of tumors (Figure). Oxidative stress and inflammation, through production of reactive oxygen species (ROS) and a wide variety of inflammatory mediators, contribute to neoplastic transformation of cells by oxidative and/or covalent modifications of important cellular macromolecules, such as proteins, lipid and nucleic acids.15 Exposure to genotoxic carcinogens initiates transformation of cells, which then undergo clonal expansion to develop benign tumors, and subsequently progress to complete malignancy. The entire course of tumor development involves altered biochemical events, such as loss of density-dependent inhibition of growth, independence of external growth stimuli for cell proliferation, defective cell cycle control, evasion from apoptosis, enhanced angiogenesis, host tissue invasion and metastasis, altered metabolism, and the ability to escape host immune responses. Collectively, these features constitute the hallmarks of cancer.16 Carnosol has been shown to elicit chemopreventive effects by (1) blocking the bioactivation of carcinogens, (2) enhancing antioxidant and/or detoxification enzyme activities, (3) suppressing tumor-promoting inflammation, (4) inhibiting cell proliferation and inducing apoptosis selectively in cancer cells, and (5) blocking tumor angiogenesis and

1. Modulation of carcinogen metabolismTumor initiation is a first and irreversible process that begins with the damage of cellular DNA upon

exposure to genotoxic carcinogens. However, many carcinogens are inactive per see, and are activated to form ultimate carcinogens through biotransformation process. The metabolically activated carcinogens can cause DNA damage, thereby initiating tumor development through activation of oncogenes and inactivation of tumor suppressor genes. While the hepatic cytochrome p450 (CYP) enzymes catalyze the phase I biotransformation of pro-carcinogens to generate active carcinogens, a series of detoxification enzymes, such as glutathione-S-transferase (GST), NAD(P)H: quinine oxidoreductase (NQO), NAD(P)H: quinine reductase (QR), and glucuronyltransferase, etc. rapidly eliminates metabolically activated carcinogens through phase II biotransformation process.17 Thus, the blockade of the activities of CYP enzymes and the induction of Phase II detoxification enzymes can prevent carcinogenesis. While the transcriptional activation of CYP enzymes is mainly regulated by arylhydrocarbon receptor (AhR), the detoxification enzymes are transcriptionally activated largely by a redox-sensitive transcription factor, nuclear factor erythroid-related factor-2 (Nrf2). Carnosol has been reported to inhibit benzo[α]pyrene (B[α]P)-induced DNA-adduct formation through inhibition of gene expression and activity of CYP1A1, and induction of mRNA levels of GST-pi and NQO in human bronchial epithelial cells.18 Likewise, carnosol attenuated B[α]P-induced CYP1A1 and CYP1B1 activity through downregulation of AhR in human keratinocyte (HaCaT) cells.19 This study also demonstrated that carnosol inhibited the activation of AhR, which is a client protein of a chaperone heat shock protein 90 (Hsp90), by blocking Hsp90 ATPase activity. Thus, the skin cancer chemopreventive effects of carnosol may be attributed to its modulation of B[α]P metabolism. The induction of GST and QR enzyme activities by carnosol20 may account for its inhibitory effects of DMBA-DNA adduct formation and mammary carcinogenesis. In another study, carnosol increased the protein and mRNA expression of NQO1 and its enzyme activity in rat liver cells.21

Aflatoxin B1 (AFB1), a potential hepatocarcinogen, is converted to its genotoxic metabolite, AFB1-8, 9-epoxide by CYPlA2 and CYP3A4 enzymes.22,23 The active metabolite AFB1-8, 9-epoxide may be detoxified through glutathionylation catalyzed by GST enzymes. Thus, the inhibitory effects of carnosol-rich rosemary extract on CYP1A2 and CYP3A4 activities in immortalized human liver epithelial cells,24 and the induction of hepatic GST enzyme activity by carnosol20 suggest that the compound may prevent hepatocarcinogenesis through metabolic inactivation of potential carcinogens.

2. Antioxidant effects of carnosolThe generation of ROS and depletion of intracellular antioxidants cause oxidative damage to cellular

macromolecules. Carnosol and its structural analog carnosic acid account for the 90% of antioxidant effects of rosemary. Aruoma et al.8 have reported that carnosol possesses peroxyl radical scavenging property and has been shown to inhibit Cu2+-induced oxidation of low density lipoproteins and the generation of lipid free radicals in mouse liver microsomes. However, carnosol failed to affect superoxide anion production from xanthine/xanthine oxidase system.25 Another plausible mechanism of the inhibitory effects of

8

carnosol on lipid peroxidation is that the compound can alter the membrane phospholipid order. As compared to phospholipid membrane-free assay, about 4 to 6 times more potent antioxidant activity of the compound was observed when analyzed in a phospholipid membrane-based assay. The study also revealed that the compound decreased the number and/or the mobility of water molecules located at the polar head group region of the membrane phospholipid.26

Carnosol has been reported to activate a variety of cellular antioxidant/detoxification enzymes, collectively known as cytoprotective proteins. Treatment with carnosol induced the expression of an antioxidant enzyme heme oxygenase-1 (HO-1) in BV2 microglial cells27 and rat pheochromocytoma (PC12) cells,28 and protected these cells from interferon-γ (IFN-γ)-induced inflammatory responses and hydrogen peroxide (H2O2)-induced oxidative stress, respectively. According to the latter study, carnosol activated Nrf2 via phosphorylation of upstream kinase Akt. Transfection of cells with dominant negative Nrf2 or treatment with pharmacological inhibitor of Akt abrogated carnosol-induced expression and the promoter activity of HO-1.28 Genes encoding cytoprotective proteins harbor antioxidant response element (ARE), alternatively known as electrophile response element. The transcriptional activation of cytoprotective proteins is mainly regulated through Nrf-2-mediated ARE activation.17 Carnosol increased the Nrf2 binding with ho-1-ARE, thereby resulting in HO-1 expression. Incubation of human HepG2 cells with carnosol resulted in increased intracellular level of glutathione (GSH) and the expression of GSH synthesizing enzyme glutamate cysteine ligase catalytic subunit (GCLC) and modifier subunit (GCLM) through nuclear accumulation of Nrf2 and the enhanced ARE activity, and protected cells from H2O2-induced cell death. Transfection of cells with Nrf2 siRNA abrogated carnosol-induced expression of GCLC and GCLM.29

3. Attenuation of inflammatory responsesChronic inflammation is a predisposing factor for tumor development. While inflammation induces

oxidative stress, excessive accumulation of ROS further amplifies inflammatory tissue damage. ROS or a variety of inflammatory mediators, such as prostaglandins (PGs), nitric oxide (NO), interleukins (IL) and chemokines promote tumorigenesis. In fact, the close association and signaling cross-talk between inflammatory immune cells and tumor cells create an inflammatory microenvironment within the growing tumor. Therefore, suppressing tumor-associated inflammation is a pragmatic approach for cancer chemoprevention.30 Representative pro-inflammatory enzymes, such as inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) are overexpressed in many cancers.31 While COX-2 is a rate-limiting enzyme in the synthesis of PGs, iNOS catalyzes the oxidative deamination of L-arginine to produce NO. Both PGs and NO have tumor promoting roles.15 The aberrant expression of COX-2 and iNOS, and subsequent production of various inflammatory mediators involve inappropriate amplification of cell signaling pathways comprising various upstream kinases, such as mitogen-activated protein (MAP) kinases, phosphatidylisonositol-3-kinase (PI3K), Akt, inhibitor kappa B (IκB) kinase (IKK) and Janus-activated kinase (JAK), and their downstream transcription factors, such as nuclear factor-kappa B (NF-κB), activator protein-1 (AP-1), and signal transducer and activator of transcription (STAT).15,31 Blockade of the activation of these inflammatory signaling molecules constitutes the biochemical basis of cancer prevention with various anti-inflammatory agents.30

Pretreatment of murine macrophage RAW264.7 cells with carnosol significantly attenuated lipopolysaccharide-induced mRNA and protein expression of iNOS, and the production of NO. This study also demonstrated that carnosol attenuated the IKK activity and the phosphorylation and degradation of IκBα, and subsequent NF-κB DNA binding by blocking the phosphorylation of p38 MAP kinase and extracellular signal-regulated protein kinase (ERK).32 Incubation of mouse peritoneal cells with carnosol diminished lipopolysaccharide-induced nitrite production without affecting cell viability.33 Carnosol inhibited phorbol ester-induced protein and mRNA expression of COX-2 and the production of PGE 2 in human mammary epithelial cells (184B5/HER), a cell line neoplastically transformed with neu oncogene. The study also reported that the compound negated the DNA binding of AP-1 through inhibition of the protein kinase C activity and phosphorylation of ERK, p38 MAP kinase, and c-Jun-N-terminal kinase. The overexpression of c-Jun abrogated the inhibitory effect of carnosol on TPA-induced COX-2 expression.34 Topical application carnosol attenuated TPA-induced mouse ear edema formation as revealed by reduced leukocyte infiltration and diminished mRNA expression of COX-2, IL-1β, and tumor necrosis factor-α.35

9

Treatment of human polymorphonuclear leukocytes with carnosol reduced the production of inflammatory leukotrienes via blockade of 5-lipoxygenase activity.36

4. Inhibition of cell proliferation and induction of apoptosisCarnosol inhibited proliferation and induced apoptosis in several human cancer cells. The compound

induced G2/M phase cell cycle arrest and reduced mitotic exit of human colon cancer (Caco-2) cells via upregulation of cyclin B expression.37 Likewise, carnosol induced G2/M phase cell cycle arrest in human prostate cancer (PC3) cells in a concentration-dependent manner.38 The antiproliferative effects of carnosol in PC3 cells were mediated through the downregulation of various cyclins (A, D1, and D2), and cyclin-dependent kinases (Cdk)-2, -4, -6, and upregulation of Cdk inhibitors, p21 and p27. Furthermore, carnosol-induced apoptosis in PC3 cells was mediated through the activation of caspase-8 and -9, induction of Bax and inhibition of B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) expression. The antiproliferative and apoptosis inducing effects of carnosol in these cells were associated with increased phosphorylation of 5 -AMP activated′ kinase-α and translation initiation factor 4E-binding protein-1, and the decreased phosphorylation of mammalian target of rapamycin, ribosomal protein p70S6 kinase and Akt.38 The antiproliferative effects of carnosol in human leukemia (HL-60) cells were associated with subG1 arrest, activation of caspase-3 and induction of apoptosis.39

The activation of androgen receptor (AR) is a key molecular switch in prostate carcinogenesis. Computer modeling study and subsequent time-resolved fluorescence resonance energy transfer assay have shown that carnosol can bind with the ligand binding domain of AR and exhibits receptor antagonistic, but not agonistic, property.12 Treatment of human prostate cancer LNCaP and 22Rv1 cells with carnosol decreased the expression of AR. This study also reported that carnosol interacted with the ligand binding domain of estrogen receptor-α (ERα), which is implicated in mammary carcinogenesis. Incubation of human mammary cancer (MCF-7) cells with carnosol decreased the expression of ERα. These findings suggest that carnosol can act as a dual inhibitor of AR and ERα, and can be effective in preventing prostate and breast carcinogenesis.12

The induction of cytotoxicity in pro-B and pre-B acute lymphoblastic leukemia cell lines by carnosol was associated with the depolarization of mitochondrial membrane and decrease in the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2.40 Treatment of adult T-cell leukemia/lymphoma (ATL) cells with carnosol induced cell death through depletion of cellular GSH level, which was reversed by pretreatment with a GSH precursor N-acetyl cysteine. These findings suggested that carnosol altered cellular redox status. Proteomic analysis also revealed a marked increase in the expression of reductases, enzymes of the glycolytic pathway and pentose phosphate pathways in carnosol-treated ATL cells.41 In our recent study, we found that carnosol significantly reduced the viability of human colon cancer (HCT116) cells and induced apoptosis via generation of ROS, activation of p53, Bax, caspase-9 and caspase-3, the cleavage of poly-(ADP-ribose) polymerase (PARP), and inhibition of Bcl-2 and Bcl-xl expression. Moreover, carnosol attenuated STAT3 activation through modulation of upstream kinases JAK2 and Src, and diminished the expression of cell proliferation markers, such as survivin, cyclin-D1, -D2, and -D3.42

Another plausible molecular target of carnosol is peroxisome proliferator activated receptor-γ (PPARγ), which is known to exert antitumor effects. Treatment of COS-7 cells transfected with a Gal4-driven PPARγ luciferase gene construct with carnosol induced the PPARγ activity.43

5. Suppression of angiogenesis, cell migration, and invasionThe increased tumor angiogenesis and the ability of tumor cells to migrate and invade through host

stromal tissue are the critical biochemical events in tumor promotion and progression. The chemopreventive effects of carnosol can partly be ascribed to its antiangiogenic property. Carnosol inhibited migration of human bronchial aortic endothelial cells (BAEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and blunted the tube formation by these cells in Matrigel plug assay, which was associated with decreased activity of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2). Moreover, chorioallantoic membrane assay showed the in vivo antiangiogenic effect of the compound.39 In another study, carnosol decreased the expression of MMP-9 and inhibited the migration of vascular smooth muscle cells.44 Huang et al.45 demonstrated that carnosol significantly attenuated the migration and invasion of mouse melanoma B16/F10 cells by reducing the expression and activity of MMP-9 through downregulation of NF-

10

κB and AP-1, and these effects were mediated through the inhibitory effect of the compound on the phosphorylation of MAP kinases and Akt.

6. Chemo- and radio-sensitizing effectsCancer cells often acquire resistance to chemotherapy and radiotherapy. Many chemopreventive

phytochemicals have been shown to alleviate chemoresistance and radioresistance, thereby suppressing tumor growth when combined with chemotherapy or radiation therapy. Carnosol has been shown to induce apoptosis in human ovarian cancer (A2780) as well as its cisplatin-resistant (A2780CP70) daughter cell lines.46 One of the mechanisms of chemoresistance is the upregulation of a drug efflux transporter protein, p-glycoprotein (P-gp). When multidrug-resistant human KB epidermoid carcinoma (KB-C2) cells were incubated with carnosol in presence of daunorubicin, the compound increased cellular accumulation of daunorubicin. According to this study, carnosol stimulated the P-gp ATPase activity, suggesting that the compound may function as a substrate of P-gp ATPase by competitively occupying the drug binding site of the enzyme.47 Carnosol also exhibited radiosensitizing effects as shown by the increased apoptosis of B16/F10 melanoma cells upon irradiation with X-radiation, while the compound prevented radiation-induced cytotoxicity in normal prostate epithelial cells.48

CONCLUSIONSOur current understanding that cancer is a systemic multifactorial disease has led us to consider that

targeting a single gene may not be effective in eradicating cancer. This has been evidence from our decades-long effort in developing anticancer drugs that many single gene targeting chemotherapeutics showed limited clinical success. Worldwide, the prevalence of cancer is still on rise and requires an appropriate strategy to reduce the morbidity and mortality from cancer. Over the last several decades, a great deal of research has demonstrated that cancer can be prevented by changing life-style factors, such as consumption of diet rich in fruits and vegetables, regular exercise, and cessation of smoking etc. Plants contain a wide variety of bioactive phytochemicals, which are known to prevent carcinogenesis through the modulation of diverse biochemical pathways. Systematic research on a natural diterpene, carnosol, has revealed its multi-targeting effects on various cancer hallmarks. Despite the progress in understanding the mechanisms of cancer chemoprevention with carnosol, there is dearth of knowledge about the effect of the compound on the metastasis and immune escape by tumor cells, and its pharmacokinetic properties. None-the-less, evidence from current preclinical studies suggests carnosol as a promising cancer chemopreventive agent.

Является розмариновая кислота недооценивать в качестве экспериментальной сердечно-сосудистых препаратов?

В обоснование настоящего обзора является анализ деятельности Rosmarinus officinalis в сердечно-сосудистой системе

Методы: А поиск в базе данных MEDLINE (с января 1970 по декабрь 2011 года), используя только

розмариновой кислоты как искали перспективе.Результаты: Ссылок поиск выявлено 509 упоминаний о розмариновой кислоты в 40 лет (первая ссылка с 1970).

Есть мощный распространенность антиоксидант и онкологических исследований. Другие заболевания, мало цитируются, как воспаление головного мозга (болезни Альцгеймера и Паркинсона) и, памяти; аллергия; сахарный диабет; атеросклероз; гипертония. Необходимо учитывать полное отсутствие исследований по ишемической болезни сердца, ишемии миокарда, сердечной недостаточности или ишемии/реперфузии.

Вывод: Розмариновая кислота недооценивается в качестве экспериментальной сердечно-сосудистых

препаратов и заслуживает большего внимания.Acta Cir Bras. 2013;28 Suppl 1:83-7.Is rosmarinic acid underestimated as an experimental cardiovascular drug?

11

Ferreira LG1, Celotto AC, Capellini VK, Albuquerque AA, Nadai TR, Carvalho MT, Evora PR.Author information 1Postgraduate Program in Medical Surgical Clinic, Department of Surgery and Anatomy, Ribeirão

Preto Faculty of Medicine, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil.The rationale of the present review is to analize the activity of Rosmarinus officinalis in the the

cardiovascular systemMETHODS: A MEDLINE database search (from January 1970 to December 2011) using only rosmarinic acid as

searched term.RESULTS: The references search revealed 509 references about rosmarinic acid in 40 years (the first reference is

from 1970). There is a powerful prevalence of antioxidant and cancer studies. Other diseases are few cited, as inflammation, brain (Alzheimer and Parkinson disease) and, memory; allergy; diabetes; atherosclerosis, and; hypertension. It is necessary to consider the complete absence of studies on coronary artery disease, myocardial ischemia, heart failure or ischemia/reperfusion injury.

CONCLUSION: Rosmarinic acid is underestimated as an experimental cardiovascular drug and deserves more attention.ОбсуждениеРозмариновая кислота Фармакологические свойстваЭкстракт розмарина расслабляет гладкую мускулатуру трахеи и кишечника и обладает

желчегонным, гепатопротекторным и antitumerogenic деятельности. RA, C18Ч16O8наиболее известные составляющие розмарина (рис. 3). Конструктивно РА эфира кофейной кислоты и молочной кислоты 3.4 dihidroxifenil. Эти кислоты широко распространены в растительном царстве. Биогенетических исследований из видов Mentha (мята) показал, что два ароматических аминокислот фенилаланина и тирозина включены в РА. Часть кофейной кислоты, интересно, образована частью фенилаланина и 3.4 dihidroxifenil образуется молочная кислота, тирозин. Эти соединения оказывают антиоксидантный эффект. РА легко всасывается из желудочно-кишечного тракта и кожи. Он повышает выработку простагландина Е2, снижает продукцию лейкотриена В4 в человеческих полиморфно-ядерных лейкоцитов, и тормозит систему комплемента. Делается вывод, что Розмари и ее трехсторонних участников, особенно производные кофейной кислоты, такие как розмариновая кислота, иметь терапевтический потенциал в лечении или профилактике бронхиальной астмы, спазмогенную расстройств, язвенной болезни, воспалительных заболеваний, токсического гепатита, атеросклероза, ишемической болезни сердца, катаракты, рака и снижение подвижности сперматозоидов2,5,14,15.

Розмариновая кислота и сердечно-сосудистые заболевания1. КардиомиопатияВ исследовании использованы melaton индуцировать крыса cardiopathology. Администрация

лютеолин и echinochrome при условии 100% животных вероятность выживания. В то же время, митохондриального аппарата кардиомиоцитов характеризуется обычный параметр, таким образом, данные препараты имеют условии, что защитный эффект на уровне кардиомиоцитов. Однако, подобные мероприятия для розмариновой кислоты не показали16.

Другое исследование было предпринято для изучения ингибирующего влияния ра на адриамицин (ADR)-индуцированного апоптоза в H9c2 клетки сердечной мышцы на механистическом уровне. In vitro, ADR существенно снизило viabilities из H9c2 клеток, и это сопровождалось апоптоза функции, такие как изменение в ядерной морфологии и каспазы активации протеазы. РА было обнаружено, ингибируют эти характеристики апоптоза путем снижения внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) поколения и восстановление мембранного потенциала митохондрий. Результаты этого исчерпывающее исследование показало, что РА может препятствовать ADR-индуцированного апоптоза, предложив, что РА должно рассматриваться в качестве потенциальных химиотерапевтических, что тормозит кардиотоксичности в ADR-инфицированными пациентами17.

Внутри этой же исследовательской программы, кардиопротективный эффект Prunella vulgaris этилацетат фракции (PVEF) и ее составных РА оценивали на изолированных кардиомиоцитов крыс,

12

подвергнутых доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса. В cytoprotectivities эффект PVEF и ра были зависящей от концентрации в диапазоне 0,005-0,05 мг/мл и эффект PVEF коррелирует с РА содержание. Как найти механизм кардиопротекторный эффекты экстракта скорее всего связано с антиоксидантной способностью, благодаря высокому содержанию фенольных кислот, в основном РА. Это связано с нейтрализации свободных радикалов, образующихся при применении доксорубицина и ингибирования перекисного окисления липидов мембранных систем митохондрий, что положительно влияет на энергетический потенциал кардиомиоцитов. Dexrazoxan, используемый в качестве положительного контроля был менее эффективен, чем PVEF или РА18. Кроме того, chemoprotective действие растительных фенольных смол (кофеиновой, хлорогеновой и розмариновой кислот) против антрациклиновых-индуцированной токсичности на кардиомиоцитов крыс были зарегистрированы19.

2. Розмариновая кислота, дислипидемии и атеросклерозЭкзогенные молекулы из пищевых источников, таких как полифенолы являются весьма

эффективными в предотвращении изменения липидных мембран при окислительном стрессе. Среди полифенолов, РА является важной составной учился. Одного полного исследования свидетельствуют об эффективности ра в предотвращении перекисного окисления липидов и во взаимодействии с липидами. Изучение переданных липидов/РА монослоев методом атомно-силовой микроскопии показало, что 1 моль% ра, в мембране, было недостаточно, чтобы изменить мембранной структуры на наноуровне. С помощью флуоресценции, исследователи не наблюдали никаких существенных изменений мембранной проницаемости и текучести, причиненный в результате взаимодействия с РА. Они подготовили 1,2-dilinoleoyl-sn-глицеро-3-фосфохолин (DLPC)/РА пузырьков, что свидетельствует, в первый раз, до 1 мол.% РА вставляет спонтанно в мембране, которая является достаточно сильным, чтобы предотвратить перекисное окисление липидов без заметного изменения структуры мембраны из-за вставки РА13.

Есть наводящий доказательств, подвергающихся окислительному модифицированных липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) атерогенности, и, что атеросклерозом могут быть ослаблены посредством природных антиоксидантов, которые тормозят окисление ЛНП. Природные антиоксиданты комбинации существуют в природе, направленные одно исследование, чтобы определить in vitro и in vivo эффекты томатный ликопин, отдельно или в сочетании с другими природными антиоксидантами, на окисление ЛНП. Полифенолы glabridin (образовано от солодки), розмариновой кислоты или carnosic кислота (производное от розмарина), а также чеснок (который содержит смесь природных антиоксидантов), подавляет окисление ЛНП в зависимости от дозы образом. Когда ликопин был добавлен к ЛПНП, в связи с эти полифенолы, синергический антиоксидантный эффекты были получены в отношении окисление ЛНП-индуцированной либо ионы меди, или радикальный генератора 2',2'-Azobis 2-amidino пропан гидрохлорид (AAPH). После приема жирной пищи, содержащей ликопин в виде томатного живицы, постпрандиальной ЛПНП, изолированных 5 часа после еды потребление отмечалось значительное снижение восприимчивости к окислению на 21%. В исследовании сделан вывод о том, что ликопин действует синергически, как эффективный антиоксидант против окисления ЛПНП, с некоторых природных антиоксидантов, таких как витамин Е, флавоноидов glabridin, фенольных смол, розмариновой кислоты и carnosic кислота, чеснок. Эти наблюдения позволяют предположить большую антиатерогенные свойства, сочетание различных природных антиоксидантов, за что человека одного3.

3. Розмариновая кислота и метаболический синдромОдно исследование исследовали, может ли РА добавок предотвращает нарушения сердечной

деятельности и гипертонической болезни в фруктозо-кормили крыс (FFR), в качестве РА инсулин-сенсибилизирующим и антиоксидантный эффекты с высоким содержанием фруктозы-fed модели резистентности к инсулину. РА добавок к FFR значительно улучшилась чувствительность к инсулину, снижение уровня липидов, окислительное повреждение, и экспрессия субъединицы p22phox никотинамид аденин динуклеотид фосфата снижается оксидазы, и предотвратить гипертрофию сердца. Кровяное давление также была снижена на РА через снижение эндотелина-1 и ангиотензин-превращающего фермента активности и увеличение оксида азота уровнях. Гистология выявила уменьшение повреждения миокарда, в РА-дополнить FFR. От этих выводов, предполагается, что РА

13

выступает в качестве вазоактивных веществ и cardioprotector через его антиоксидантные свойства. Таким образом, РА может быть полезным в снижении риска сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с ИК20.

4. Розмариновая кислота и гипертонияХотя в настоящее время существует большой выбор антигипертензивных препаратов для лечения

артериальной гипертензии, сердечно-сосудистых проблем, связанных с этим заболеванием продолжать оказывать влияние на миллионы людей во всем мире. В настоящее время использование лекарственных растений в качестве терапевтического метода при различных заболеваниях, среди них сердечно-сосудистые заболевания, приобрел землю. Это обусловлено несколькими факторами, включая высокую стоимость производимых лекарственных средств, хотя правительство оказывает некоторое гипотензивное, отсутствие публичного доступа к услугам здравоохранения и фармацевтической промышленности, возможность сделать соединений с фармакологической активности часто превосходит текущие лекарства и склонность потребителей к использованию натуральных продуктов. Таким образом, открытие новых веществ с Анти-гипертензивных препаратов, низкая стоимость и редкие побочные эффекты все еще привлекательный и выгодный аспект для клинического использования. Однако, встречаются трудности для этой цели, включая возможность экспериментальной модели, получение стандартизированных экстрактов и сложность получения, изоляции и идентификации активных веществ.

Повышенное кровяное давление (артериальная гипертония) - это распространенное сердечно-сосудистое заболевание, которое затрагивает миллионы людей во всем мире. Существует несколько способов лечения гипертонической болезни, такие, как использование ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента (АПФ). В последние годы было продемонстрировано in vitro ингибирующее влияние некоторых видов растений на ACE и ра-выдающийся составляющая этих видов21. Однако, литературе, отчеты о своей деятельности в сердечно-сосудистой системе не хватает.

РА эффект на ВР можно отнести к торможению и/или модуляции ACE, как показали Li et al.21 и Karthik et al. (2011)20 или эндотелий-зависимое сосудорасширяющее действие РА как сообщили Эрсой et al. (2008)22. Механизмы, вовлеченные в этот расслабляющий эффект, остаются неизвестными. Тем не менее, этот эффект был объяснен тем, что RA представляет собой полифенольные соединения и, согласно последним исследованиям, эти соединения будут иметь сосудорасширяющее деятельности, через активацию NO pathway, эндотелий-зависимая гиперполяризует фактор (EDHF) и простациклина (PGI2)22,23. Кроме того, другие возможные механизмы могут быть вовлечены в этот ответ, как и в эндотелиальных клетках, что повышение уровня Ca+2 и активация PI3-киназы/Akt привести к быстрой и устойчивой активации фермента синтазы окиси азота (NOS) и гиперполяризацию22. Третий предложенный механизм является РА антиоксидантный эффект. РА представляет собой сильнодействующий ингибитор •O2

- и эффективный протектор повреждения тканей, вызванные пероксинитрита20.

ВыводыКак РА, сегодня, исследованных в нашей лаборатории мы провели представленные поиска в

MEDLINE, и это был сюрприз количество упоминаний о сердечно-сосудистых заболеваниях. Мы решили поделиться нашим неопределенности иллюстрируется на текст название: не розмариновой кислоты недооценивать, как сердечно-сосудистые лекарства? Мы верим, что это потому, что мы получаем удовлетворительные результаты на модели крыс с гипертонией. В обзор, мы предполагаем, что AR заслуживает больше экспериментальных и клинических исследований в сердечно-сосудистой среде.

DiscussionRosmarinic acid pharmacological propertiesExtract of rosemary relaxes smooth muscles of the trachea and intestine and has choleretic,

hepatoprotective and antitumerogenic activity. RA, C18H16O8, is the most prominent constituents of rosemary (Figure 3). Structurally, the RA is an ester of caffeic acid and lactic acid 3.4 dihidroxifenil. These acids are widely distributed in the vegetable kingdom. Biogenetic studies from Mentha species (mint) showed that two aromatic amino acids, phenylalanine and tyrosine are incorporated into the RA. Part of

14

caffeic acid, interestingly, is formed by part of the phenylalanine and 3.4 dihidroxifenil lactic acid is formed by tyrosine. These compounds have an antioxidant effect. RA is easily absorbed from the gastrointestinal tract and skin. It increases the production of prostaglandin E2, reduces the production of leukotriene B4 in human polymorphonuclear leucocytes, and inhibits the complement system. It is concluded that rosemary and its constituents, especially caffeic acid derivatives such as rosmarinic acid, have a therapeutic potential in treatment or prevention of bronchial asthma, spasmogenic disorders, peptic ulcer, inflammatory diseases, hepatotoxicity, atherosclerosis, ischaemic heart disease, cataract, cancer and reduced sperm motility2,5,14,15.

1. CardiomyopathyThe study used melaton to induce rat cardiopathology. The administration of luteolin and echinochrome

provided to 100% animal probability of survival. At the same time, mitochondrial apparatus of cardiomyocytes was characterized by the normal parameter, therefore, given preparations have provided of a protective effect at cardiomyocytes level. However, similar activities for rosmarinic acid have not shown16.

Other study was undertaken to investigate the inhibitory effect of RA on adriamycin (ADR)-induced apoptosis in H9c2 cardiac muscle cells at a mechanistic level. In vitro, ADR significantly decreased the viabilities of H9c2 cells, and this was accompanied by apoptotic features, such as a change in nuclear morphology and caspase protease activation. RA was found to inhibit these apoptotic characteristics by reducing intracellular reactive oxygen species (ROS) generation and by recovering the mitochondria membrane potential. Results of this exhaustive study suggested that RA can inhibit ADR-induced apoptosis, proposing that RA should be viewed as a potential chemotherapeutic that inhibits cardiotoxicity in ADR-exposed patients17.

Inside this same research program, the cardioprotective effect of Prunella vulgaris ethylacetate fraction (PVEF) and its constituent RA was evaluated on isolated rat cardiomyocytes subjected to doxorubicin-induced oxidative stress. The cytoprotectivities effect of PVEF and RA were concentration-dependent in the range of 0.005 to 0.05 mg/ml and the effect of PVEF correlated with the RA content. As found, the mechanism of the cardioprotective effects of the extract is most probably linked with the antioxidant capacity due to its high content of phenolic acids, mainly RA. It's associated with scavenging of free radicals formed during application of doxorubicin and inhibition of lipid peroxidation of membrane systems as mitochondria, which positively influences the energy capacity of cardiomyocytes. Dexrazoxan, used as a positive control, was less effective than PVEF or RA18. In addition, chemoprotective effect of plant phenolics (caffeic, chlorogenic and rosmarinic acids) against anthracycline-induced toxicity on rat cardiomyocytes were reported19.

2. Rosmarinic acid, dislipidemia and atherosclerosisExogenous molecules from dietary sources such as polyphenols are highly effective in preventing the

alteration of lipid membranes by oxidative stress. Among the polyphenols, the RA is an important compound studied. One full investigation attested the effectiveness of RA in preventing lipid peroxidation and in interacting with lipids. The study of transferred lipid/RA monolayers by atomic force microscopy revealed that 1 mol% of RA, in the membrane, was not sufficient to alter the membrane structure at the nanoscale. By fluorescence, the investigators observed no significant modification of membrane permeability and fluidity caused by the interaction with RA. They prepared 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)/RA vesicles that evidenced, for the first time that up to 1 mol% of RA inserts spontaneously in the membrane, which is strong enough to prevent lipid peroxidation without any noticeable alteration of the membrane structure due to RA insertion13.

There are suggestive evidences that oxidatively modified low-density lipoprotein (LDL) is atherogenic, and that atherosclerosis can be attenuated by natural antioxidants, which inhibit LDL oxidation. Natural antioxidants combinations exist in nature aimed one study to determine the in vitro and in vivo effects of tomato lycopene, alone or in combination with other natural antioxidants, on LDL oxidation. The polyphenols glabridin (derived from licorice), rosmarinic acid or carnosic acid (derived from rosemary), as well as garlic (which contains a blend of natural antioxidants) inhibited LDL oxidation in a dose-dependent manner. When lycopene was added to LDL in association with these polyphenols, synergistic antioxidative effects were obtained against LDL oxidation induced either by copper ions or the radical generator 2',2'-

15

Azobis 2-amidino propane hydrochloride (AAPH). After administering a fatty meal containing lycopene in the form of tomato oleoresin, postprandial LDL isolated 5 hour after meal consumption exhibited a significant reduced susceptibility to oxidation by 21%. The study concluded that lycopene acts synergistically, as an effective antioxidant against LDL oxidation, with some natural antioxidants such as vitamin E, the flavonoid glabridin, the phenolics rosmarinic acid and carnosic acid, and garlic. These observations suggest a greater antiatherogenic property to a combination of different natural antioxidants over that of an individual one3.

3. Rosmarinic acid and metabolic syndromeOne study investigated whether RA supplementation prevents cardiac abnormalities and hypertension in

fructose-fed rats (FFR), as the RA has insulin-sensitizing and antioxidant effects in high fructose-fed model of insulin resistance. RA supplementation to FFR significantly improved insulin sensitivity, reduced lipid levels, oxidative damage, and the expression of p22phox subunit of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced oxidase, and prevented cardiac hypertrophy. The blood pressure was also lowered by RA through a decrease in endothelin-1 and angiotensin-converting enzyme activity and increase in nitric oxide levels. Histology revealed a decrease in myocardial damage, in RA-supplemented FFR. From these findings, it is suggested that RA acts as a vasoactive substance and a cardioprotector through its antioxidant effects. Thus, RA may be useful in reducing the cardiovascular risk associated with IR20.

4. Rosmarinic acid and hypertensionAlthough there are currently large selections of antihypertensive agents available for the treatment of

hypertension, cardiovascular problems related to this disease continue to affect millions of people worldwide. Currently, the use of medicinal plants as a therapeutic option in various diseases, among them cardiovascular diseases, has gained ground. This is due to several factors, including the high cost of manufactured drugs, although the government is providing some anti-hypertensive, lack of public access to healthcare and pharmaceutical industries, the opportunity to make compounds with pharmacological activities often superior to current medications and a tendency for consumers to use natural products. Thus, the discovery of new substances with anti-hypertensive medication, low cost and rare adverse effects is still an attractive and beneficial aspect for clinical use. However, difficulties are encountered for this purpose including the possibility of an experimental model, obtaining standardized extracts and the difficulty of obtaining, isolation and identification of active substances.

High-blood pressure (HBP) is a common cardiovascular disease that affects millions of people worldwide. There are several ways to treat hypertension, such as the use of inhibitors of angiotensin-converting enzyme (ACE). In recent years, it has been demonstrated in vitro the inhibitory effect of some plant species on ACE and RA is a prominent constituent of these species21. However, literature reports about its activity in the cardiovascular system are scarce.

The RA effect on BP could be related to inhibition and/or modulation of ACE, as shown by Li et al.21 and Karthik et al. (2011)20, or the endothelium-dependent vasodilator effect of RA as reported by Ersoy et al. (2008)22. The mechanisms involved in this relaxing effect remain unknown. Nevertheless, this effect was attributed to the fact that RA is a polyphenolic compound and, according to recent studies, these compounds would have vasodilator activity, through activation of NO pathway, endothelium-dependent hyperpolarizing factor (EDHF) and prostacyclin (PGI2)22,23. In addition, other possible mechanisms may be involved in this response, as in endothelial cells, which increased levels of Ca+2 and activation of the PI3-kinase/Akt lead to a rapid and sustained activation of the enzyme nitric oxide synthase (NOS) and hyperpolarization22. A third suggested mechanism is the RA antioxidant effect. The RA presents itself as a potent inhibitor of •O2

- and an effective protector of tissue damage caused by peroxynitrite20. ConclusionsAs RA is, nowadays, investigated in our laboratory, we carried out the presented MEDLINE search, and, it

was a surprise the number of references about cardiovascular diseases. So we planned to share our uncertainty illustrated on the text title: does rosmarinic acid underestimate as a cardiovascular current drug? We trust that it is because we are getting satisfactory results on rat models of hypertension. In an overview, we hypothesize that AR deserves more experimental and clinical research in the cardiovascular milieu.

16

Молекулярные подходы к целенаправленным рака профилактика с некоторых пищевых продуктов, растений и их продуктов: воспалительные и других сигнальных путей.

В последние годы наблюдается растущий интерес в рак профилактики пищевых растений и их продуктов. Хотя некоторые части растений имеют потенциал для химиопрофилактики и других терапевтического использования, их молекулярные механизмы действия не всегда понятны. Обширные исследования выявили несколько молекулярных мишеней, которые потенциально могут быть использованы для профилактики и/или лечения рака. В этом обзоре мы накапливаются доказательства модулирующих способности некоторых пищевых растений и их продуктов на несколько сигнальных путей, в том числе воспалительного и апоптоза, которая может быть направлена для рака терапии. Мы были в основном сосредоточены на нескольких фитохимические вещества, как ресвератрол (красный виноград и арахис), аллицин (чеснок), ликопен (томаты), индол-3-карбинол (крестоцветных овощей), витамин С (цитрусовые), [6]-гингеролов (имбирь), эмодин (алоэ), смесь натуральных антиоксидантов (шпинат), бета-каротиноиды (морковь), sulphoraphane (горчица), эллаговая кислота (гранат), myrecitin (клюква), carnosol (розмарин), ванилин (ваниль) и эвгенол (гвоздики). Они действуют через один или несколько сигнальных путей, как ядерный фактор каппа B, циклооксигеназы-2, преобразователь сигналов и активатора транскрипции 3, Akt, митоген активированной протеинкиназы/внеклеточной регулируемой киназы, Bcl-2, каспаз, поли (ADP-рибоза) полимеразы, матриксная металлопротеиназа 2/9, и циклин D1. Критическое знание об этих соединений и их сигнальных путей может помочь в разработке эффективных противоопухолевых препаратов.

Nutr Cancer. 2014;66(2):194-205. doi: 10.1080/01635581.2014.864420. Epub 2013 Dec 30.Molecular approaches toward targeted cancer prevention with some food plants and their products:

inflammatory and other signal pathways.Khuda-Bukhsh AR1, Das S, Saha SK. 1a Cytogenetics and Molecular Biology Laboratory, Department of Zoology , University of Kalyani ,

Kalyani , India.AbstractIn recent years, there has been growing interest in cancer prevention by food plants and their products.

Although several plant parts have potentials for chemoprevention and other therapeutic use, their molecular mechanisms of action are not always well understood. Extensive research has identified several molecular targets that can potentially be used for the prevention and/or treatment of cancer. In this review, we accumulate evidences of modulating abilities of some dietary plants and their products on several signaling pathways, including the inflammatory and apoptotic ones, which may be targeted for cancer therapy. We have mainly focused on several phytochemicals like resveratrol (red grapes and peanuts), allicin (garlic), lycopene (tomato), indole-3-carbinol (cruciferous vegetables), vitamin C (citrus fruits), [6]-gingerol (ginger), emodin (aloe), natural antioxidant mixture (spinach), beta carotenoids (carrots), sulphoraphane (mustard), ellagic acid (pomegranate), myrecitin (cranberry), carnosol (rosemary), vanillin (vanilla) and eugenol (cloves). They act through one or more signaling pathways like nuclear factor kappa B, cyclooxygenase-2, signal transducer and activator of transcription 3, Akt, mitogen activated protein kinase/extracellular regulated kinase, Bcl-2, caspases, poly (ADP-ribose) polymerase, matrix metalloproteinase 2/9, and cyclin D1. Critical knowledge on these compounds and their signaling pathways may help in formulation of effective anticancer drugs.

Розмарин и рак профилактика: доклинические перспективы.Колоректальный рак является второй ведущей причиной рака смерти в Австралии. Питание,

особенно потребление овощей и некоторых растительных компонентов, было отмечено, что важную роль в рак снижения риска. В последнее время, наблюдается рост исследовательского интереса в розмарине, общее хозяйство растение выращивается во многих частях мира. Целью данного исследования является обзор научных данных от всех исследований, опубликованных с 1996 по март 2010 года, в котором изучались защитные эффекты розмарин на колоректального рака и других

17

типов рака. Литература доказательств от животных и культуры клеток исследованиях показано, противоопухолевый потенциал экстракт розмарина, carnosol, carnosic кислота, урсоловая кислота, розмариновая кислота. Никаких доказательств для других розмарина составляющих был найден. Сообщалось противораковые свойства были обнаружены возникают через молекулярные изменения в несколько этапов рака развитие, дозы и не ткани или конкретных видов. Об этом свидетельствует способность розмарина подавлять развитие опухолей в несколько органов, в том числе толстой кишки, молочной железы, печени, желудка, а также меланомы и лейкемии клетки. Результаты свидетельствуют, что различные молекулярные мишени модулированных Розмари и ее активными составляющими являются полезными индикаторами успеха в клинических рака химио-профилактических испытаниях.

Crit Rev Food Sci Nutr. 2011 Dec;51(10):946-54. doi: 10.1080/10408398.2010.490883.Rosemary and cancer prevention: preclinical perspectives.Ngo SN1, Williams DB, Head RJ.Author information 1School of Animal and Veterinary Sciences, University of Adelaide, Roseworthy, SA, Australia.

suong.ngo@adelaide.edu.auAbstractColorectal cancer is the second leading cause of cancer death in Australia. Nutrition, particularly intake of

vegetables and certain plant components, has been reported to have a major role in cancer risk reduction. Recently, there has been a growing research interest in rosemary, a common household plant grown in many parts of the world. This study aims to review scientific evidence from all studies, published from 1996 to March 2010 that examined the protective effects of rosemary on colorectal cancer and other types of cancer. Literature evidence from animal and cell culture studies demonstrates the anticancer potential of rosemary extract, carnosol, carnosic acid, ursolic acid, and rosmarinic acid. No evidence for other rosemary constituents was found. The reported anticancer properties were found to arise through the molecular changes in the multiple-stage process of cancer development, which are dose related and not tissue or species specific. This is evidenced by the ability of rosemary to suppress the development of tumors in several organs including the colon, breast, liver, stomach, as well as melanoma and leukemia cells. The results suggested that the different molecular targets modulated by rosemary and its active constituents are useful indicators of success in clinical cancer chemo-prevention trials.

Carnosol: перспективный анти-рак и противовоспалительное средство.Средиземноморская диета и, более конкретно, определенные виды мяса, фрукты, овощи и

оливковое масло, найденные в некоторых частях средиземноморского региона, были связаны с уменьшением сердечно-сосудистых и диабета риск. Совсем недавно, несколько популяционных исследованиях наблюдали с этими образа жизни сообщили, общее снижение риска развития некоторых форм рака. В одном исследовании, в частности, наблюдается обратное соотношение между потреблением средиземноморских трав, таких как розмарин, шалфей, петрушка и орегано с легких рак. В свете этих выводов необходимо изучить и определить анти-раковые свойства этих лекарственных трав и выявить фитохимические вещества в нем. Один агент, в частности, carnosol, была оценена для анти-раковые свойства в простаты, молочной железы, кожи, лейкоз, и толстой кишки рак с многообещающими результатами. Эти исследования предоставили доказательства того, что carnosol цели несколько нерегулируемых путей, связанные с воспалением и раком что включают в себя ядерный фактор каппа в (NFκB), апоптотических белков, связанных, фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3-K)/Akt, андрогенов и эстрогенов, рецепторов, а также молекулярные мишени. Кроме того, carnosol - видимому, хорошо переносится, что она имеет селективную токсичность по отношению раковых клеток по сравнению с опухолевой клетки и хорошо переносится при приеме внутрь для животных. Этот мини-обзор отчетов о доклинических исследованиях, выполненных до даты, с carnosol механистического описания, эффективности и безопасности/переносимости исследования как рак химиопрофилактики и анти-рак агента.

Cancer Lett. 2011 Jun 1;305(1):1-7. doi: 10.1016/j.canlet.2011.02.005. Epub 2011 Mar 5.18

Carnosol: a promising anti-cancer and anti-inflammatory agent.Johnson JJ1.Author information 1University of Illinois at Chicago, College of Pharmacy, Department of Pharmacy Practice, USA.

jjjohn@uic.eduAbstractThe Mediterranean diet and more specifically certain meats, fruits, vegetables, and olive oil found in

certain parts of the Mediterranean region have been associated with a decreased cardiovascular and diabetes risk. More recently, several population based studies have observed with these lifestyle choices have reported an overall reduced risk for several cancers. One study in particular observed an inverse relationship between consumption of Mediterranean herbs such as rosemary, sage, parsley, and oregano with lung cancer. In light of these findings there is a need to explore and identify the anti-cancer properties of these medicinal herbs and to identify the phytochemicals therein. One agent in particular, carnosol, has been evaluated for anti-cancer property in prostate, breast, skin, leukemia, and colon cancer with promising results. These studies have provided evidence that carnosol targets multiple deregulated pathways associated with inflammation and cancer that include nuclear factor kappa B (NFκB), apoptotic related proteins, phosphatidylinositol-3-kinase (PI3 K)/Akt, androgen and estrogen receptors, as well as molecular targets. In addition, carnosol appears to be well tolerated in that it has a selective toxicity towards cancer cells versus non-tumorigenic cells and is well tolerated when administered to animals. This mini-review reports on the pre-clinical studies that have been performed to date with carnosol describing mechanistic, efficacy, and safety/tolerability studies as a cancer chemoprevention and anti-cancer agent.

1. ВведениеИдентификация и характеристика анти-раковые свойства натуральных продуктов, особенно в

области химиопрофилактики рака, получила значительный интерес в течение многих лет [1-4]. Класс соединений, известных как дитерпены, уделяется все большее внимание на различные свойства, способствующие укреплению здоровья, такие как анти-микробный [5], противовоспалительной [6], нейропротекторное [7], антиоксидантная [8], и антиканцерогенными свойствами [9]. Один агент, в частности, является carnosol который, как сообщается, имеют широкие анти-раковые свойства в несколько клеточной линии моделей, в том числе простаты, молочной железы, лейкемия, а также другие. Эти исследования начали идентифицировать pro-apoptotic свойства и адресность нескольких нерегулируемых пути с carnosol, однако, Комплексная оценка carnosol в качестве противоракового агента не хватает. В этом мини-обзоре представлены современные знания carnosol как он применяется по отношению к нескольким в том числе рака простаты, молочной железы, кожи, лейкемия, рак толстой кишки.

2. Средиземноморская диета и образ жизниСредиземноморская диета получила значительное внимание своей сердечно-сосудистые и

метаболические свойства, способствующие укреплению здоровья [10]. Эта диета лучше всего понимается пищевая структуры Крита, Греции и южной части Италии, которая имеет высокий уровень потребления свежих фруктов и овощей, оливкового масла, нерафинированные крупы, и низкое потребление мясных продуктов. Внимание теперь уделяется, как средиземноморская диета влияет на другие заболевания, такие как рак, где несколько популяционных исследований свидетельствуют о снижении риска рака груди, толстой кишки, желудка, предстательной железы этого типа питания и образа жизни [11-16]. Большинство этих исследований фокусируются на потребление различных видов мяса, фруктов, овощей и оливкового масла.

То, что недостаточно изучено влияние средиземноморских трав, таких как розмарин, шалфей, базилик, орегано, и другие, которые часто включаются в различные виды пищевых продуктов и масел. Каждый из этих трав имеют различные фитохимические вещества, такие как дитерпены, в том числе carnosol и carnosic кислоты. По этой причине мы сосредоточены на понимании текущих знаний carnosol в качестве противоопухолевого агента.

В исследование случай-контроль у больных с диагнозом рак легких оценивали взаимосвязь между компонентами средиземноморской диеты и рака легких [15]. Допущенные участники жили в регионе Лацио, который включает в себя город Рим, были в возрасте между 35 и 90 лет. Контроль участников

19

были сопоставимы по полу (1:1 Для мужчин и 1:2 для женщин) и возрасту. Как часть анкеты участников были оценены для потребления травы, в том числе петрушка, розмарин, базилик и шалфей. Все четыре из этих трав тенденция к снижению общего риска с наиболее значительный риск снижения наблюдается с шалфеем [OR = 0,43, 95% CI = 0.29-0.65]. Петрушка также связаны со снижением общего риска [или = 0.31, 95% CI = 0.11-0.84] в то время как тенденция к снижение риска наблюдалось с розмарином [или = 0.66, 95% CI = 0.37-1.15] и базиликом [или = 0.63; 95% CI = 0.31-1.30]. Эти результаты, как минимум наводят на размышления, что фитохимических веществ, изолированных из этих кулинарных трав должен быть исследован их свойства, способствующие укреплению здоровья.

3. Carnosol: источники, химии и синтезаСредиземноморские травы, в том числе розмарина и шалфея используются для кулинарных целей

и своими целебными свойствами на протяжении тысячелетий. Carnosol был впервые выделен из шалфея (Salvia carnosa) в 1942 году и химическая структура была создана в 1964 году Брискорн et al [17]. Розмарин и шалфей известно, содержат разнообразные полифенолы, такие как carnosol, carnosic кислоты, rosmanol, розмариновой кислоты, а также другие [18]. Было подсчитано, что около 5% сухого веса листьев розмарина содержит carnosol и carnosic кислоты, однако, эта доля приходится > 90% антиоксидантной активности [19].

Carnosol является орто-diphenolic дитерпены с abietane углеродного скелета (рис. 1) гидроксильных групп в положениях с-11 и с-12 и лактон радикал, через кольцо B [20]. Carnosol-продукта окислительной деградации carnosic кислоты (Рис. 2) [21]. Самый популярный и дорогой способ приобрести высоко очищенном виде carnosol через экстракции и очистки из природных источников, таких, как розмарин. Недавно, полу-синтетический процесс был описан с помощью pisiferic кислоты (Рис. 2) извлеченные из Sawara (Chamaecyparis pisifera) листья, кипарис дерево родом из Японии, синтезировать carnosic кислоты и затем carnosol [22]. Carnosic кислоты был приготовлен путем окисления pisfiric кислоты с использованием трех различных методов: a) mCBPO, b) CAMCBP в CH2CL2или c) IBX в CHCl2-CH3Ох. Третий полусинтетическое реакции была разработана общая доходность 72% в то время как первые два были значительно ниже урожайность низкая (10%). Carnosol был подготовлен от carnosic кислоты в присутствии оксида серебра в CH 2CL2 с очищенной выход 67%. Кроме того, carnosic кислотой в присутствии метанола в течение 1 недели при комнатной температуре окисляется carnosic кислоты carnosol [23,24].

4. Антиоксидантная активность CarnosolЗдоровье укрепляющие свойства розмарина и шалфея обусловлено антиоксидантной активности

полифенолов, присутствующих в этих экстрактов [25-28]. Активные формы кислорода и истощение антиоксидантных ферментов были предложены для продвижения различных биологических реакций, в том числе nueurogenerative, воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний и канцерогенеза различных тканей [29]. Экстракты розмарина были подготовлены и показаны по DPPH (2,2-дифенил-1-pycrilhydrazil гидрат) антирадикальное деятельности пробирной иметь антирадикальное деятельности до 95,1% [25] около 90% антиоксидантная активность отнести к дитерпены carnosol и carnosic кислоты [19]. Carnosol было показано, подавляют кр2+ индуцированное LDL окисления липидов и свободных радикалов в микросомах печени мышей [30] и хорошие поглотители пероксильными радикалами (CCl302) [19]. Антиоксидантные реакции элемент считается активированной через катехол-гидроксильных групп carnosol и преобразуется в carnosol хинон [8]. Это производные хинона является главным анти-окисления продукт carnosol, по сути, отмена каких-либо антиоксидантной активностью [31] и в соответствующих условиях антиоксидантной активности могут быть восстановлены [32].

На глутатион-S-трансферазы (GST) семейство фазы II детоксикации ферментов катализируют реакции глутатиона с электрофильными и были объектом интереса для рака [33]. Carnosol при внутрибрюшинном введении было показано, что для повышения in vivo активность GST и хинон-редуктазы в печени самок крыс [34]. Carnosol (100-400 мг/кг) увеличение активности GST в 1,6-1,9 раза.

20

5. Противовоспалительная активность CarnosolДерегулируемых воспалительных сигнализации, в том числе избыток окиси азота (NO)

производства NO-синтазы (iNOS) возникает при воспалении и многоэтапный процесс канцерогенеза, которая привела к поискам агентов, уменьшение воспалительных сигнальных путей. Raw 264.7 клеток, обработанных carnosol снижение ЛПС-стимулированной продукции NO с IC50 9,4 мкм [35]. Это привело к ингибированию NF-kB, p38 и р44/42 митоген активированной протеинкиназы (MAPK). В другом исследовании, carnosol был показан для активации пероксисом пролифератор-активирующие рецепторы гамма. Carnosol также было показано, чтобы уменьшить провоспалительных лейкотриенов в интактных полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ), ингибируют 5-липоксигеназы, отталкивает внутриклеточного ca2+ мобилизация, и ингибируют секрецию лейкоцитарной эластазы [6]. Кроме того, carnosol блоков протеинкиназы с сигнализации и ингибирует связывание AP-1 (ЦОГ-2 промоутера, который следует отметить, является принципиально иной, чем синтетические ингибиторы ЦОГ-2 (например, целекоксиб), которые действуют как прямые ингибиторы ЦОГ-2 [36].

6. Анти-раковые свойства Carnosol6.1 Carnosol и рака предстательной железыВ нашей лаборатории, мы в настоящее время расследуют потенциальную роль carnosol для

профилактики и лечения рака предстательной железы (PCa). Ранее мы предоставили доказательства того, что carnosol способствует G2 арест клеточного цикла в PC3 клеток, снижение жизнеспособности клеток [37]. Анти-раковые свойства carnosol были связаны с потенциальным модулировать несколько сигнальных путей, таких как клеточный цикл родственных белков, PI3K/AKT, и апоптотических белков, связанных [38]. Чтобы понять последствия carnosol в PC3 клеток мы провели антитела массив, 36 идентифицированных белков downregulated не менее 50% белков и 24, которые были до-регулируемые по крайней мере, 200%, в том числе цели в радиусе 5’-AMP-активированной протеинкиназы (AMPK) белковых субъединиц. AMPK было показано, регулирует рост и выживание раковых клеток. Мы наблюдали зависит от дозы увеличение фосфорилированных форм AMPK-α (Thr172), которая была показана выше по течению mammalian target of rapamycin (mTOR). Мы также смогли показать снижение фосфорилирования mTOR (Ser2448) и соответствующих нижестоящих мишеней.

Недавно мы показали, что carnosol имеет уникальные свойства, когда его функции, как dual disruptor как андроген и эстроген рецептор α в PCa [9]. С помощью TR-FRET анализа мы смогли показать, что carnosol является антагонистом как на AR и ERα без агонист свойства. В нашем понимании-это уникальное свойство, как несколько синтетических агентов, в том числе фулвестрант, торемифен, тамоксифен были исследованы в качестве двойной разрушителями, однако, через эскалации дозы это не редкость для этих синтетических препаратов для отображения свойства агониста на AR [39-42]. Carnosol отображается минимальное воздействие на курение онкогенными эпителиальных клеток простаты при лечении с увеличением концентрации, а так же, эффект с тем, что наблюдалось с флутамид и тамоксифен. Интересно, что мы наблюдали увеличение белковой экспрессии рецепторов андрогенов тамоксифеном и флутамид, который был обратимым с совместного лечения с carnosol. В ксенотрансплантат исследования, бестимусных мышей были имплантированы с 22Rv1 клеток и лечатся с carnosol устно пять дней в неделю. В заключение исследования мышей, получавших carnosol оказала значительное подавление роста опухоли на 36% (P = 0.028) и циркулирующих PSA на 26% (Р = 0.0042).

6.2 Carnosol и рака молочной железыCarnosol и carnosic кислоты были изучены для их антимикробных и противоопухолевых свойств

при раке молочной железы [43]. Как carnosol и carnosic кислоты было показано, обладают цитотоксической активностью в отношении MCF-7 клеток с IC50 82 и 96 мкм. Мы наблюдали аналогичные результаты с carnosol снижение жизнеспособности клеток MCF-7 клеток [9], AU565, и MDA-MB-231 (неопубликованные результаты). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, если carnosol преимущественно цели ER+ клеток рака молочной железы по сравнению с ER - клетки рака молочной железы.

21

Carnosol была оценена, чтобы определить способность carnosol ингибировать формирование DMBA-ДНК-аддукт формирования и DMBA-индуцированных опухолей молочной в самок крыс [44]. Внутрибрюшинное введение розмарина и carnosol было показано, существенно тормозят молочных формирование аддукта на 44% и 40%, соответственно. На 20-ой неделе пост DMBA лечения carnosol (100 и 200 мг/кг) администрации привело к значительному ингибированию опухолевого образования наблюдается с понижением на 33% (P < 0,001) и 30% (p < 0,005), соответственно. Роль carnosol в предотвращении DMBA-индуцированных опухолей молочной может быть частично объяснено carnosol индуцирование ферментов детоксикации включая GST и хинон-редуктазы, которая carnosol было показано, модулируют в других исследованиях [34,45]. Другим аспектом является микросомального метаболизма эндогенных эстрогенов. CD-1 мышей вводили розмарина (2%) в рационе привело к увеличению окисления и глюкуронирования эстрадиола и эстрона, ингибируя их uterotropic действий [46].

С помощью эпителиальных клеток молочной carnosol была показана блок повышенного связывания AP-1 (ЦОГ-2 промоутера [36]. Кроме того, carnosol было показано, подавляют активацию PKC, ERK1/2, p38 и c-jun NH2-терминальной киназы митоген активированной протеинкиназы. Гиперэкспрессия c-jun угнетал угнетающее воздействие carnosol.

6.3 Carnosol и рак кожиМетаноловый экстракт розмарина был оценен по его ингибирование опухолевого инициирование

и продвижение в кожи мыши [23]. Несколько составляющих были характеризуют с помощью ВЭЖХ в экстракт розмарина и содержат урсоловую кислоты (16.5-19.2%), carnosol (3.8-4.6%) и carnosic кислоты (0.1-0.5%). В экстракт розмарина было обнаружено, ингибируют ковалентное связывание бензо(а)пирен кожи эпидермис ДНК. У мышей, получавших B(a)P И tetradecanoylphorbol-13-ацетата (тра) мышей, получавших с розмарином (1,2 или 3,6 мг) пять минут до применения B(a)P привело к уменьшению опухоли на 54 или 64%, соответственно. Местное применение розмарина также было установлено снижение Т-индуцированной орнитин декарбоксилазы (ODC) деятельности, ДТС индуцированного воспаления, arachadonic кислота-индуцированного воспаления, ДТС-индуцированной гиперплазии и ДТС-индуцированной опухоли акции. У мышей возбуждено DMBA последующим ТПА для продвижения розмарин, (0.4, 1.2, или 3,6 мг) было обнаружено уменьшение количества опухолей кожи, 40, 68 или 99%, соответственно. Местное применение carnosol также ингибирует TPA индуцированного воспаления среднего уха, ODC деятельности, и опухоль акции. Carnosol на 1, 3 или 10 мкм ингибирует ряд опухолей кожи за мышью, 38, 63, или 78%, соответственно.

Миграции и вторжения В16/F10 клетках меланомы мыши было показано, что препятствует carnosol [47]. Carnosol лечение привело к снижению ММП-9 мРНК и белка выражение с IC50 значение для ММП-9 мРНК в 5 мкм, предлагая регулирования на транскрипционном уровне. Несколько выше по течению регуляторы ММП-9 в том числе AKT, p38 и JNK и в меньшей степени-Erk1/2 фосфорилирования деятельность была смодулирована carnosol. Активность NF-kB также препятствует carnosol (10 мкм).

6.4 Carnosol и лейкозCarnosol было показано, что они индуцируют апоптоз путем нарушения митохондриального

мембранного потенциала в трех острого лейкоза клеточных линий, которые включены SEM, RS4:11, и MV4:11 [48]. В 18 мкм carnosol не индуцируют гибель клеток из мононуклеарных клеток периферической крови (Рвмс), изолированных от здоровых добровольцев при той же дозе в линии клеток в результате апоптоза. Апоптоз и изменения митохондриального мембранного потенциала в результате carnosol лечения. Есть основания полагать, что carnosol целей анти-апоптотических члены Bcl-2 семейство белков. Снижение Bcl-2 белка выражения колебалась от 33 до 53% в трех клеточных линий. Несколько фитохимических веществ, как сообщается, имеют сенсибилизирующие свойства при использовании в сочетании с химиотерапии в различных клеточных линий рака. Интересно, co-лечение carnosol и AraC, или Метотрексат, или винкристин приводит к задержкам в химиотерапии индуцированной фрагментации ДНК [49]. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять, как co-лечение carnosol с химиотерапевтическими агентами задержки фрагментации ДНК.

6.5 Carnosol и рак толстой кишки22

Использование модели для опухолей толстой кишки диетическое администрации carnosol наблюдалось снижение кишечной кратности на 46% в C57BL/6J/мин./+ (Min/+) мышь [50]. Мышам вводили диету с или без carnosol (0.1%). Carnosol было показано, что восстановление E-кадгерина и β-катенина в enterocyte мембран производства фенотип, подобный APC+/+ дикого типа (WT) littermate. Наследуемые мутации в АРС Гена супрессора опухоли в результате генерации аденоматозный полипоз coli при соматических мутаций в >80% спорадического рака толстой кишки [51]. Эти результаты позволяют предположить, что carnosol предотвращает Apc-ассоциированных опухолей в мышиной модели, однако, необходимы дальнейшие исследования.

7. Carnosol безопасности и токсичностиВ Эймс тест-штамм Salmonella TA102 carnosol обнаружили значительную антиоксидантную

активность анти-мутагенные деятельности, аналогичной аскорбиновой кислоты [52]. Несколько исследований предположили, что carnosol является защитным против токсинов окружающей среды в экспериментальных животных моделях токсического гепатита [53-55], бронхиальной клеток [56], и может помочь в стимулировании фазы II детоксикации ферментов [57]. В микроядерном тесте для мутагенеза carnosol был найден, чтобы быть более эффективны, чем L-аскорбиновая кислота гамма-радиационной защиты емкости до и после радиационного воздействия [58].

Несколько исследований на животных показали, что ежедневное пероральное введение carnosol хорошо переносится. В нашем исследовании, мы обнаружили, что пероральное введение carnosol в 30 мг/кг хорошо переносится при приеме внутрь пять дней в неделю в течение 28-дневного периода, о чем свидетельствуют ежедневные измерения веса тела, которые не различаются между carnosol или автомобиля мышей [9]. В другом исследовании, Sprague-Dawley крыс вводили в AIN-76A диете-до 1% carnosol в течение двух недель без заметных воздействие на массу тела [44]. В отдельном эксперименте с одной и той же группы carnosol в 200 мг/кг внутрибрюшинно в течение пяти дней подряд был хорошо переносится, о чем свидетельствуют измерения веса печени. C57BL/6J/мин./+ (Min/+) мышь вводили carnosol до 0,1% в их ежедневный рацион был хорошо переносится в течение десяти недель [50].

В качестве альтернативного подхода, будущие исследования должны оценить высоко характеризуются экстракты розмарина, которые стандартизированы для carnosol. Эта стратегия была использована для изучения EGCG (эпигаллокатехин-3-галлат) в клинических испытаниях с помощью высоко характеризуется зеленого чая экстракт, стандартизированный для EGCG и другие полифенолы зеленого чая [1]. Этот подход был признан FDA как видно в их руководство под названием “Руководство для промышленности - Ботанический лекарственных препаратов” и Ботанический получения продукции investigational new drug (IND) состояния, такие как Polyphenon Е. преимущество использования высоко характеризуется экстракт бы стоимость закупки carnosol будет дешевле, потому что меньше очищения потребуется. Второе преимущество может быть в том, что дополнительные компоненты, которые находятся в розмарине бы иметь возможность работать синергически с carnosol. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы оценить высоко характеризуются экстракты розмарина стандартизированные для carnosol. Недавно Европейский Союз одобрил стандартизированный экстракт розмарина, чтобы carnosol для его применения в направлении сохранения пищевых продуктов и была принята в ЕС пищевых добавок законодательства [59]. Этот экстракт хорошо переносится при коротких и долгосрочных исследований токсичности. В 13-недельного перорального исследования в самцов и самок крыс в NOAEL (no observable adverse event уровне) различных экстрактов розмарина был от 180 до 400 мг/кг веса тела/день, что было эквивалентно 20-60 мг/кг /день carnosol и carnosic кислоты в день. Взрослый среднее потребление этого экстракта составил между 500 и 1500 мг carnosol и carnosic кислоты в день. Необходимы дальнейшие исследования для определения анти-раковые свойства этих экстрактов розмарина кроме оценки отдельных компонентов из розмарина.

7. Заключительные ЗамечанияБиодоступность и метаболизм carnosol либо животных или людей не исследована. Биодоступность

carnosic кислоты, которая разделяет структурные сходства carnosol кратко резюмируются [60]. CМакс

из carnosic кислота была 128 мкм (42.52 мг/л), когда его вводили внутрижелудочно в 90 мг/кг и абсолютная биодоступность carnosic кислота была 65.09%. Эти результаты являются перспективными

23

предполагая, что дитерпены хорошо всасывается, однако, необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, если carnosol имеет схожие фармакокинетические параметры carnosic кислоты. Фармакокинетические исследования carnosol будет иметь решающее значение при определении возможности использования carnosol для применения в качестве противовоспалительных и противораковых агентов. Несколько доклинические исследования показали, что carnosol выборочно цели опухолевой клетки, как противоположность не-опухолевой клетки и является безопасным и терпимым в животных. Необходимы дальнейшие исследования для понимания молекулярных взаимодействий carnosol с нерегулируемыми путей, связанные с воспалением и раком. Чтобы понять весь потенциал carnosol как химические или химиотерапевтического агента более механистические исследования необходимы.

1. IntroductionThe identification and characterization of the anti-cancer properties of natural products, especially in the

area of cancer chemoprevention, has received significant interest over the years [1–4]. A class of compounds known as diterpenes, is receiving increasing attention for a variety of health promoting properties such as anti-microbial [5], anti-inflammatory [6], neuroprotective [7], anti-oxidant [8], and anti-cancer properties [9]. One agent in particular is carnosol which has been reported to have broad anti-cancer properties in several cell line models including prostate, breast, leukemia as well as others. These studies have begun to identify the pro-apoptotic properties and targeting of multiple deregulated pathways with carnosol, however, a comprehensive evaluation of carnosol as an anti-cancer agent is lacking. This mini-review presents the current knowledge of carnosol as it applies towards several cancers including prostate, breast, skin, leukemia, and colon cancer.

2. Mediterranean Diet and LifestyleThe Mediterranean diet has received significant attention for its cardiovascular and metabolic health

promoting properties [10]. This diet is best understood by the food patterns in Crete, Greece and the southern part of Italy which has high intakes of fresh fruit and vegetables, olive oil, unrefined cereals, and low consumption of meat products. Attention is now being given to how the Mediterranean diet impacts other disease states such as cancer where several population based studies are suggestive of a reduced risk of breast, colon, stomach, and prostate cancers with this type of diet and lifestyle [11–16]. The majority of these studies focus on the consumption of various meats, fruits, vegetables and olive oil.

What is less understood is the impact of Mediterranean herbs such as rosemary, sage, basil, oregano, and others that are often incorporated into various foods and oils. Each of these herbs have a variety of phytochemicals such as diterpenes including carnosol and carnosic acid. For this reason we are focusing on understanding the current knowledge of carnosol as an anticancer agent.

A case-control study in patients diagnosed with lung cancer evaluated the relationship between components of the Mediterranean diet and lung cancer [15]. Eligible participants were living in the Lazio region, which includes the city of Rome, were between the ages of 35 and 90 years of age. Control participants were matched by gender (1:1 for males and 1:2 for females) and age. As a part of the questionnaire participants were evaluated for consumption of herbs including parsley, rosemary, basil, and sage. All of four of these herbs trended towards a decreased overall risk with the most significant overall risk reduction observed with sage [OR = 0.43, 95% CI = 0.29–0.65]. Parsley was also associated with a reduced overall risk [OR = 0.31, 95% CI = 0.11–0.84] while a trend towards a reduced risk was observed with rosemary [OR = 0.66, 95% CI = 0.37–1.15] and basil [OR = 0.63, 95% CI = 0.31–1.30]. These results at a minimum are suggestive that the phytochemicals isolated from these culinary herbs should be investigated for their health promoting properties.

3. Carnosol: Sources, Chemistry, and SynthesisMediterranean herbs including rosemary and sage have been used for culinary purposes and for their

medicinal properties for millennia. Carnosol was first isolated from sage (Salvia carnosa) in 1942 and the chemical structure was first established in 1964 by Brieskorn et al [17]. Rosemary and sage have been known to contain a variety of polyphenols such as carnosol, carnosic acid, rosmanol, rosmarinic acid as well as others [18]. It has been estimated that approximately 5% of the dry weight of rosemary leaves contains carnosol and carnosic acid, however, this fraction is estimated to account for > 90% of the antioxidant activity [19].

24

Carnosol is an ortho-diphenolic diterpene with an abietane carbon skeleton (Figure 1) with hydroxyl groups at positions C-11 and C-12 and a lactone moiety across the B ring [20]. Carnosol is the product of oxidative degradation of carnosic acid (Figure 2) [21]. The most popular and expensive way to procure a highly purified form of carnosol is through extraction and purification from natural sources such as rosemary. Recently, a semi-synthetic process has been described using pisiferic acid (Figure 2) extracted from Sawara (Chamaecyparis pisifera) leaves, a cypress tree native to Japan, to synthesize carnosic acid and then to carnosol [22]. Carnosic acid was prepared through oxidation of pisfiric acid using three different methods: a) mCBPO, b) CAMCBP in CH2CL2, or c) IBX in CHCl2-CH3OH. The third semi-synthetic reaction developed had an overall yield of 72% while the first two had considerably lower yields as low as 10%. Carnosol was prepared from carnosic acid in the presence of silver oxide in CH2CL2 with a purified yield of 67%. Alternatively, carnosic acid in the presence of methanol for 1 week at room temperature will oxidize carnosic acid to carnosol [23,24].

4. Anti-oxidant Activity of CarnosolThe health promoting properties of rosemary and sage have been attributed to the antioxidant activity of

polyphenols present in these extracts [25–28]. Reactive oxygen species and depletion of antioxidant enzymes have been suggested to promote a variety of biological responses including nueurogenerative, inflammatory conditions, cardiovascular disease, and carcinogenesis of various tissues [29]. Rosemary extracts were prepared and shown by the DPPH (2,2-diphenyl-1-pycrilhydrazil hydrate) radical scavenging activity assay to have a radical scavenging activity up to 95.1% [25] with approximately 90% of the antioxidant activity attributed to the diterpenes carnosol and carnosic acid [19]. Carnosol has been shown to inhibit Cu2+ induced LDL oxidation and lipid free radicals in mouse liver microsomes [30] and are good scavengers of peroxyl radicals (CCl302) [19]. The antioxidant response element is believed to be activated through the catechol-hydroxyl groups of carnosol and is converted to a carnosol quinone [8]. This quinone derivative is the main anti-oxidation product of carnosol essentially voiding it of any antioxidant activity [31] and under appropriate conditions the antioxidant activity can be recovered [32].

The glutathione-S-transferase (GST) family of phase II detoxification enzymes catalyze the reaction of glutathione with electrophiles and have been a target of interest for cancer [33]. Carnosol by intraperitoneal administration has been shown to enhance the in vivo activity of GST and quinone reductase in the liver of the female rat [34]. Carnosol (100–400 mg/kg) increased GST activity by 1.6 to 1.9 fold increase.

5. Anti-inflammatory Activity of CarnosolDeregulated inflammatory signaling including excess nitric oxide (NO) produced by NO synthase (iNOS)

occurs during inflammation and the multi-step process of carcinogenesis which has led to the search for agents that decrease inflammatory signaling pathways. Raw 264.7 cells treated with carnosol reduced LPS stimulated NO production with an IC50 of 9.4 uM [35]. This led to an inhibition of the NF-kB, p38 and p44/42 mitogen activated protein kinase (MAPK). In another study, carnosol was shown to activate the peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Carnosol has also been shown to reduce the pro-inflammatory leukotrienes in intact polymorphonuclear leukocytes (PMNL), inhibit 5-lipoxygenase, antagonize the intracellular ca2+ mobilization, and inhibit the secretion of leukocyte elastase [6]. In addition, carnosol blocks protein kinase C signaling and inhibits the binding of AP-1 to the COX-2 promoter which should be noted is fundamentally different than the synthetic COX-2 inhibitors (e.g. celecoxib) that function as direct inhibitors of Cox-2 [36].

6. Anti-Cancer properties of Carnosol6.1 Carnosol and Prostate CancerIn our laboratory, we are currently investigating the potential role of carnosol for the prevention and

treatment of prostate cancer (PCa). Earlier we provided evidence that carnosol promotes G2 cell cycle arrest in PC3 cells decreasing cell viability [37]. The anti-cancer properties of carnosol were associated with a potential to modulate multiple signaling pathways such as the cell cycle related proteins, PI3K/AKT, and apoptotic related proteins [38]. To understand the effects of carnosol in PC3 cells we performed an antibody array that identified 36 proteins downregulated at least 50% and 24 proteins that were up-regulated at least 200% including a target within the 5’-AMP-activated protein kinase (AMPK) protein subunit. AMPK has been shown to regulate the growth and survival of cancer cells. We observed a dose

25

dependent increase in the phosphorylated forms of AMPK-α (Thr172) which has been shown to be upstream of the mammalian target of rapamycin (mTOR). We were also able to show a decrease in the phosphorylation of mTOR (Ser2448) and related downstream targets.

Recently, we have shown that carnosol has a unique property where it functions as a dual disruptor of both androgen and estrogen receptor α in PCa [9]. Using a TR-FRET assay we were able to show that carnosol is an antagonist at both the AR and ERα with no agonist properties. To our knowledge this is a unique property as several synthetic agents including fulvestrant, toremifene, and tamoxifen have been investigated as dual disruptors, however, through dose escalation it is not uncommon for these synthetic agents to display agonist properties at the AR [39–42]. Carnosol displayed minimal effects on non-tumorigenic prostate epithelial cells when treated with increasing concentrations and was similar in effect with what was observed with flutamide and tamoxifen. Interestingly, we observed an increase in protein expression of androgen receptor with tamoxifen and flutamide which was reversible with co-treatment with carnosol. In a xenograft study, athymic nude mice were implanted with 22Rv1 cells and treated with carnosol orally five days weekly. At the conclusion of the study mice treated with carnosol had a significant suppression in tumor growth by 36% (P = 0.028) and circulating PSA by 26% (P = 0.0042).

6.2 Carnosol and Breast CancerCarnosol and carnosic acid were investigated for their antimicrobial and anti-cancer properties in breast

cancer [43]. Both carnosol and carnosic acid were shown to have cytotoxic activity against MCF-7 cells with an IC50 of 82 and 96 µM. We have observed similar results with carnosol decreasing the cell viability of MCF-7 cells [9], AU565, and MDA-MB-231 (unpublished results). Further studies are needed to determine if carnosol preferentially targets ER+ breast cancer cells versus ER− breast cancer cells.

Carnosol was evaluated to determine the ability of carnosol to inhibit the formation of DMBA-DNA adduct formation and DMBA-induced mammary tumorigenesis in the female rat [44]. Intraperitoneal administration of rosemary and carnosol were shown to significantly inhibit mammary adduct formation by 44% and 40%, respectively. At week 20 post DMBA treatment carnosol (100 and 200 mg/kg) administration resulted in a significant inhibition of tumor formation was observed with decreases of 33% (P < 0.001) and 30% (p < 0.005), respectively. The role of carnosol in preventing DMBA-induced mammary tumorigenesis may be partially explained by carnosol inducing detoxification enzymes including GST and quinone reductase which carnosol has been shown to modulate in other studies [34,45]. Another consideration is the microsomal metabolism of endogenous estrogens. CD-1 mice were administered rosemary (2%) in their diet led to an increase in the oxidation and glucuronidation of estradiol and estrone inhibiting their uterotropic action [46].

Using mammary epithelial cells carnosol was shown to block the increased binding of AP-1 to the COX-2 promoter [36]. In addition, carnosol was shown to inhibit the activation of PKC, ERK1/2, p38, and c-jun NH2-terminal kinase mitogen activated protein kinase. Overexpression of c-jun inhibited the suppressive effects of carnosol.

6.3 Carnosol and Skin CancerA methanol extract of rosemary was evaluated for its inhibition on tumor initiation and promotion in

mouse skin [23]. Several constituents were characterize by HPLC in the rosemary extract and found to contain ursolic acid (16.5–19.2%), carnosol (3.8–4.6%) and carnosic acid (0.1–0.5%). The rosemary extract was found to inhibit the covalent binding of benzo(a)pyrene to skin epidermis DNA. In mice treated with B(a)P and tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) mice treated with rosemary (1.2 or 3.6 mg) five minutes prior to application of B(a)P led to a reduction in tumors by 54 or 64%, respectively. Topical application of rosemary was also found to decrease TPA induced ornithine decarboxylase (ODC) activity, TPA induced inflammation, arachadonic acid-induced inflammation, TPA induced hyperplasia, and TPA induced tumor promotion. In mice initiated with DMBA followed by TPA for promotion rosemary, (0.4, 1.2, or 3.6 mg) was found to decrease the number of skin tumors by 40, 68 or 99%, respectively. The topical application of carnosol also inhibited TPA induced ear inflammation, ODC activity, and tumor promotion. Carnosol at 1, 3, or 10 µM inhibited the number of skin tumors per mouse by 38, 63, or 78%, respectively.

The migration and invasion of B16/F10 mouse melanoma cells was shown to be inhibited by carnosol [47]. Carnosol treatment resulted in the decrease of MMP-9 mRNA and protein expression with an IC50

value for MMP-9 mRNA at 5 µM suggesting regulation at the transcriptional level. Several upstream 26

regulators of MMP-9 including AKT, p38, and JNK and to a lesser extent Erk1/2 phosphorylation activities were modulated by carnosol. The activity of NF-kB was also inhibited by carnosol (10 µM).

6.4 Carnosol and LeukemiaCarnosol was shown to induce apoptosis by disrupting the mitochondrial membrane potential in three

acute leukemia cell lines which included SEM, RS4:11, and MV4:11 [48]. At 18 µM carnosol did not induce cell death of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from healthy volunteers while the same dose in cell lines resulted in apoptosis. Apoptosis and alterations in mitochondrial membrane potential resulted from carnosol treatment. There is evidence to suggest that carnosol targets the anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins. A reduction in Bcl-2 protein expression ranged from 33 to 53% in the three cell lines. Several phytochemicals have been reported to have sensitizing properties when used in combination with chemotherapies in a variety of cancer cell lines. Interestingly, co-treatments of carnosol and AraC, or methotrexate, or vincristine resulted in a delay in chemotherapy induced DNA fragmentation [49]. Further studies are needed to understand how co-treatment of carnosol with chemotherapeutic agents delays DNA fragmentation.

6.5 Carnosol and Colon CancerUsing a model for colon tumorigenesis dietary administration of carnosol was observed to decrease

intestinal multiplicity by 46% in the C57BL/6J/Min/+ (Min/+) mouse [50]. Mice were administered a diet with or without carnosol (0.1%). Carnosol was shown to restore E-cadherin and β-catenin to the enterocyte membranes producing a phenotype similar to the APC+/+ wild-type (WT) littermate. Inherited mutations in the APC tumor suppressor gene result in the generation of familial adenomatous polyposis coli with somatic mutations in >80% of sporadic colon cancers [51]. These results suggest that carnosol prevents Apc-associated tumorigenesis in a mouse model, however, further studies are needed.

7. Carnosol Safety and ToxicityIn the Ames Salmonella tester strain TA102 carnosol was found to have significant antioxidant activity

with anti-mutagenic activity similar to ascorbic acid [52]. Several studies have suggested that carnosol is protective against environmental toxins in experimental animal models of hepatotoxicity [53–55], bronchial cells [56], and may assist in inducing phase II detoxification enzymes [57]. In the micronucleus test for mutagenesis carnosol was found to be more effective than L-ascorbic acid for gamma-ray radioprotection capacity both before and after radiation exposure [58].

Several animal studies have suggested that daily oral administration of carnosol is well tolerated. In our study, we observed that oral administration of carnosol at 30 mg/kg was well tolerated when administered five days weekly over a 28 day period as evidenced by daily body weight measurements which did not vary between carnosol or vehicle treated mice [9]. In another study, Sprague-Dawley rats were administered an AIN-76A diet with up to 1% carnosol for two weeks with no observable effects on body weight [44]. In a separate experiment with the same group carnosol at 200 mg/kg administered intraperitoneally for five consecutive days was well tolerated as evidenced by measuring liver weight. C57BL/6J/Min/+ (Min/+) Mouse were administered carnosol up to 0.1% in their daily diet was well tolerated over a ten week period [50].

As an alternative approach, future studies should consider evaluating highly characterized rosemary extracts that are standardized to carnosol. This strategy has been employed for studying EGCG (epigallocatechin-3-gallate) in clinical trials through the use of a highly characterized green tea extract standardized to EGCG and other green tea polyphenols [1]. This approach has been recognized by the FDA as seen in their guidance titled, “Guidance for Industry – Botanical Drug Products” and by botanical products receiving investigational new drug (IND) status such as Polyphenon E. The benefit of using a highly characterized extract would be cost to procure carnosol would be cheaper because less purification would be required. A second benefit could be that additional constituents that are found in rosemary would have the opportunity to work synergistically with carnosol. Further studies are needed to evaluate highly characterized rosemary extracts standardized to carnosol. Recently, the European Union has approved a rosemary extract standardized to carnosol for its application towards food preservation and has been adopted into the EU food additive legislation [59]. This extract was well tolerated in short and long term toxicity studies. In a 13 week oral study in male and female rats the NOAEL (no observable adverse event level) of different rosemary extracts was between 180 to 400 mg/kg/bw/day which was equivalent to 20–

27

60 mg/kg /day of carnosol and carnosic acid per day. The adult mean intake of this extract was estimated to be between 500 and 1500 mg of carnosol and carnosic acid per day. Further studies are needed to determine the anti-cancer properties of these rosemary extracts in addition to evaluating isolated constituents from rosemary.

7. Concluding RemarksThe bioavailability and metabolism of carnosol in either animals or humans has not been investigated.

The bioavailability of carnosic acid, which shares structural similarities to carnosol are summarized briefly [60]. The Cmax of carnosic acid was 128 µM (42.52 mg/L) when administered intragastrically at 90 mg/kg and the absolute bioavailability of carnosic acid was 65.09%. These results are promising suggesting that diterpenes are well absorbed, however, further studies are needed to determine if carnosol has similar pharmacokinetic parameters to carnosic acid. Pharmacokinetic studies of carnosol will be critical in determining the potential use of carnosol for application as an anti-inflammatory and anti-cancer agent. Several pre-clinical studies have suggested that carnosol selectively targets tumorigenic cell as opposed to non-tumorigenic cells and is safe and tolerable in animals. Further studies are needed to understand molecular interactions of carnosol with deregulated pathways associated with inflammation and cancer. To understand the full potential of carnosol as a chemopreventive or chemotherapeutic agent more mechanistic studies are needed.

Фармакология розмарина (Rosmarinus officinalis Linn.) и его терапевтический потенциал.Использование растений так же стара, как человечество. Натуральные продукты дешевые и

утверждал, чтобы быть безопасным. Они также являются подходящим сырьем для производства новых синтетических препаратов. Розмарин (Rosmarinus officinalis Linn.) это обычные бытовые растение выращивается во многих частях мира. Он используется для ароматизатор пищевой, напиток, пить, а также в косметике; в народной.в медицине он используется как антиспазматическое в почечной колики, дисменорея, в освобождении дыхательных расстройств и стимулировать рост волос. Экстракт розмарина расслабляет гладкую мускулатуру трахеи и кишечника, оказывает желчегонное, гепатопротекторное и antitumerogenic деятельности. Самых важных составляющих розмарина являются кофейной кислоты и ее производные, такие как розмариновая кислота. Эти соединения обладают антиоксидантным действием. В фенольные соединения, розмариновой кислоты, получает один из его фенольных колец из фенилаланина с помощью кофейной кислоты, а другой-из тирозина через dihydroxyphenyl-молочная кислота. Относительно крупное производство розмариновой кислоты может быть получен из культуры клеток Coleus blumei Benth при поставке с экзогенно фенилаланин и тирозин. Розмариновая кислота хорошо всасывается из желудочно-кишечного тракта и кожи. Он повышает выработку простагландина Е2 и уменьшает выработку лейкотриенов B4 в человеческих полиморфно-ядерных лейкоцитов, и тормозит систему комплемента. Делается вывод, что Розмари и ее трехсторонних участников, особенно производные кофейной кислоты, такие как розмариновая кислота имеют терапевтический потенциал в лечении или профилактике бронхиальной астмы, спазмогенную расстройства, язвенная болезнь желудка, воспалительные заболевания, гепатотоксичность, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, катаракта, рак и плохой подвижности сперматозоидов.

Indian J Exp Biol. 1999 Feb;37(2):124-30.Pharmacology of rosemary (Rosmarinus officinalis Linn.) and its therapeutic potentials.al-Sereiti MR1, Abu-Amer KM, Sen P.Author information 1Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, Al-Fateh University of Medical Sciences, Tripoli,

Libya.AbstractThe use of plants is as old as the mankind. Natural products are cheap and claimed to be safe. They are

also suitable raw material for production of new synthetic agents. Rosemary (Rosmarinus officinalis Linn.) is a common household plant grown in many parts of the world. It is used for flavouring food, a beverage drink, as well as in cosmetics; in folk.medicine it is used as an antispasmodic in renal colic and

28

dysmenorrhoea, in relieving respiratory disorders and to stimulate growth of hair. Extract of rosemary relaxes smooth muscles of trachea and intestine, and has choleretic, hepatoprotective and antitumerogenic activity. The most important constituents of rosemary are caffeic acid and its derivatives such as rosmarinic acid. These compounds have antioxidant effect. The phenolic compound, rosmarinic acid, obtains one of its phenolic rings from phenylalanine via caffeic acid and the other from tyrosine via dihydroxyphenyl-lactic acid. Relatively large-scale production of rosmarinic acid can be obtained from the cell culture of Coleus blumei Benth when supplied exogenously with phenylalanine and tyrosine. Rosmarinic acid is well absorbed from gastrointestinal tract and from the skin. It increases the production of prostaglandin E2 and reduces the production of leukotriene B4 in human polymorphonuclear leucocytes, and inhibits the complement system. It is concluded that rosemary and its constituents especially caffeic acid derivatives such as rosmarinic acid have a therapeutic potential in treatment or prevention of bronchial asthma, spasmogenic disorders, peptic ulcer, inflammatory diseases, hepatotoxicity, atherosclerosis, ischaemic heart disease, cataract, cancer and poor sperm motility.

Экспрессия микрорнк-15b и гликозилтрансферазы GCNT3 коррелирует с противоопухолевой эффективности розмарина дитерпены в толстой кишки и поджелудочной железы.

Колоректального рака и рака поджелудочной железы остаются важными факторами рака смертности бремя и, следовательно, новых терапевтических подходов срочно необходимы. Розмарин (Rosmarinus officinalis L.), экстракты и ее компонентов " зарегистрировано в качестве естественных мощным антипролиферативным средств против раковых клеток. Однако, потенциально применять розмарин в качестве дополнительного подхода для рака терапии, дополнительной информации относительно наиболее эффективного состава, его противоопухолевое действие in vivo и его основных молекулярных медиаторов по-прежнему нужен. В этой работе, пять carnosic кислоты богатых сверхкритических экстрактов розмарина с разных химических составов были исследованы на их противоопухолевую активность как in vivo (in nude mice) и in vitro в отношении толстой кишки и поджелудочной железы ячеек. Мы обнаружили, что противоопухолевый эффект carnosic кислоты вместе с carnosol была выше, чем сумма их эффектов по отдельности, что поддерживает использование экстракт розмарина в целом. Кроме того, Гена и микрорнк выражение анализы были проведены для выяснения ее противоопухолевый механизм, показывая, что up-регуляции обменно-связанных генов GCNT3 и down-регуляции его потенциал эпигенетические модулятор мир-15b коррелируют с противоопухолевым действием розмарина. Кроме того, плазматических мир-15b вниз-регулирование было обнаружено после того, как in vivo лечение с розмарином. Наши результаты поддерживают использование carnosic богатой кислоты экстракт розмарина в качестве дополнительного подхода в толстой кишки и поджелудочной железы рак и указывают на то, что GCNT3 выражения могут быть вовлечены в его противоопухолевый механизм, и что мир-15b могут быть использованы в качестве неинвазивных биомаркеров для мониторинга розмарина противораковый эффект.

PLoS One. 2014 Jun 3;9(6):e98556. doi: 10.1371/journal.pone.0098556. eCollection 2014.Expression of microRNA-15b and the glycosyltransferase GCNT3 correlates with antitumor efficacy of

Rosemary diterpenes in colon and pancreatic cancer.González-Vallinas M1, Molina S1, Vicente G2, Zarza V1, Martín-Hernández R1, García-Risco MR2, Fornari T2,

Reglero G3, Ramírez de Molina A1.Author information 1Unit of Molecular Oncology and Nutritional Genomics of Cancer, Madrid Institute for Advanced

Studies on Food (IMDEA-Food), Campus of International Excellence UAM+CSIC, Madrid, Spain.AbstractColorectal and pancreatic cancers remain important contributors to cancer mortality burden and,

therefore, new therapeutic approaches are urgently needed. Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) extracts and its components have been reported as natural potent antiproliferative agents against cancer cells. However, to potentially apply rosemary as a complementary approach for cancer therapy, additional information regarding the most effective composition, its antitumor effect in vivo and its main molecular

29

mediators is still needed. In this work, five carnosic acid-rich supercritical rosemary extracts with different chemical compositions have been assayed for their antitumor activity both in vivo (in nude mice) and in vitro against colon and pancreatic cancer cells. We found that the antitumor effect of carnosic acid together with carnosol was higher than the sum of their effects separately, which supports the use of the rosemary extract as a whole. In addition, gene and microRNA expression analyses have been performed to ascertain its antitumor mechanism, revealing that up-regulation of the metabolic-related gene GCNT3 and down-regulation of its potential epigenetic modulator miR-15b correlate with the antitumor effect of rosemary. Moreover, plasmatic miR-15b down-regulation was detected after in vivo treatment with rosemary. Our results support the use of carnosic acid-rich rosemary extract as a complementary approach in colon and pancreatic cancer and indicate that GCNT3 expression may be involved in its antitumor mechanism and that miR-15b might be used as a non-invasive biomarker to monitor rosemary anticancer effect.

ВведениеКолоректальный рак является третьим наиболее диагностирован Тип рака у мужчин и второе у

женщин во всем мире, и заболеваемость растет даже в традиционно низкий риск таких странах, как Испания [1]. Более того, показатели смертности от колоректального рака остается высокой-четвертой и третьей причиной онкологической смертности, связанной с самцов и самок, соответственно [1]. С другой стороны, рак поджелудочной железы, влияет на 250 000 человек в мире ежегодно [2]. Хотя его падения цены не очень высокие, это один из самых смертоносных опухолей, представляющие пять и четвертой причиной рака смертность самцов и самок и, соответственно, в развитых странах [1]. Таким образом, новые дополняющие терапевтические подходы, в идеале, экономически эффективные и нетоксичные, необходимы, чтобы улучшить эффективность и качество жизни больных с этими видами рака.

Розмарин (Rosmarinus officinalis L.) и многие его компоненты были зарегистрированы обладать химические свойства в коже [3] и молочной железы [4] раки in vivo в основном за счет ингибирования 7,12-dimethylbenz(а)антрацена (DMBA)-ДНК-аддукт формирования. Кроме того, они оказывают антиоксидантную активность обоих in vitro [5], [6] и in vivo [7], таким образом ингибируя генотоксичности, что является существенным способствующей причиной рака, а также защита от канцерогенов и токсичных агентов. Они также были отмечены для отображения антипролиферативное деятельности in vitro против груди [8]-[10], лейкоз [8], [9], [11], a [9], [11]-[13], двоеточие [11], [14]-[16], легких [9], предстательной железы [9], яичников [13], [17], и мочевого пузыря [10] раковые клетки. Однако влияние розмарина на клетки карциномы поджелудочной железы не сообщается, Дата. О прогрессии опухоли in vivoэффект экстракт розмарина в сочетании с аналог 1,25-дигидроксивитамин D3 был оценен в сингенных мышь лейкоз опухоли модель, и показал сильную кооператива противоопухолевый эффект [18].

Несколько розмарина компоненты, такие как carnosic кислоты [9], [11], carnosol [3], [11], [17], урсоловая кислота [3], а также некоторые эфирные масла составляющих [13], были предложены, чтобы быть ответственны за противоопухолевый эффекты экстрактов розмарина. Хотя концентрация соотношения carnosol и carnosic кислоты сообщалось влияние антиоксидантной и антимикробной деятельности [19], возможный синергизм розмарина компонентов в отношении противоопухолевой активности экстрактов розмарина не сообщается пока.

Розмари и ее компонентов, сообщили модулировать несколько путей, таких как те, что связаны с антиоксидантной ответ (например, метаболизм глутатиона [20] и Nfr2-зависимого механизма [21]), AMPK и PPAR путей [22], а также апоптоз генов, связанных с [17], но молекулярный механизм, ответственный за ее противоопухолевое действие не полностью понято. Для того, чтобы правильно применять розмарин в качестве пищевой добавки для лечения рака, дополнительную информацию относительно наиболее эффективного состава, его противоопухолевый эффект in vivo и его основных молекулярных медиаторов по-прежнему нужен. В этом смысле мы ранее сообщали синергетический эффект сочетания сверхкритической флюидной экстракт розмарина и 5-фторурацил, наиболее часто используемый препарат в терапии рака толстой кишки, посредством модуляции TK1 и TYMS, ферменты, связанные с механизмом действия этого препарата [16].

30

В этой работе, противоопухолевое пять carnosic-кислоты богатый сверхкритических экстрактов розмарина (RE) с разным химическим составом были проанализированы в толстой кишки и поджелудочной железы раковые клетки с целью определения наиболее мощным RE и различной чувствительностью среди клеточных линий, а также вклад изолированных компонентов противоопухолевого эффекта повторно и возможные кооперативный эффект их сочетания. Кроме того, влияние RE на прогрессии опухоли in vivo было оценено в рак толстой кишки мыши ксенотрансплантатов. Кроме того, Гена и экспрессии miRNA анализа были изучены после повторного лечения с целью выяснения молекулярных механизмов, ответственных за противоопухолевую активность как in vitro и in vivo.

IntroductionColorectal cancer is the third most diagnosed cancer type in males and the second in females worldwide,

and its incidence is increasing even in traditionally low-risk countries such as Spain [1]. Moreover, mortality rates caused by colorectal cancer remain high, being the fourth and third cause of cancer-related mortality in males and females, respectively [1]. On the other hand, pancreatic cancer affects 250 000 individuals worldwide annually [2]. Although its incidence rates are not very high, it is one of the most lethal tumors, representing the five and fourth cause of cancer-related mortality in males and females, respectively, in developed countries [1]. Therefore, new complementary therapeutic approaches, ideally cost-effective and non-toxic, are needed to improve efficacy and quality of life of patients with these cancer types.

Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) and many of its components were reported to possess chemopreventive properties in skin [3] and breast [4] cancers in vivo, mostly by inhibiting 7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA)-DNA adduct formation. Moreover, they exert antioxidant activity both in vitro [5], [6] and in vivo [7], thus inhibiting genotoxicity, which is a significant contributory cause of cancer, and protecting from carcinogens or toxic agents. They also were reported to display antiproliferative activity in vitro against breast [8]–[10], leukemia [8], [9], [11], hepatoma [9], [11]–[13], colon [11], [14]–[16], lung [9], prostate [9], ovarian [13], [17], and urinary bladder [10] cancer cells. However, the effect of rosemary on pancreatic carcinoma cells has not been reported to date. Regarding the tumor progression in vivo, the effect of rosemary extract in combination with an analogue of 1,25-dihydroxyvitamin D3 was assessed in a syngeneic mouse leukemia tumor model, and showed a strong cooperative antitumor effect [18].

Several rosemary components, such as carnosic acid [9], [11], carnosol [3], [11], [17], ursolic acid [3], as well as some of its essential oil constituents [13], have been proposed to be responsible for the anticancer effects of rosemary extracts. Although the concentration ratios of carnosol and carnosic acid were reported to influence the antioxidant and antimicrobial activities [19], the possible synergism of the rosemary components regarding the antitumor activity of rosemary extracts has not been reported yet.

Rosemary and its components were reported to modulate several pathways, such as those related to antioxidant response (e.g. glutathione metabolism [20] and Nfr2-dependent pathway [21]), AMPK and PPAR pathways [22], as well as apoptosis-related genes [17], but the molecular mechanism responsible for its antitumor effects is not completely understood yet. In order to properly apply rosemary as a nutritional supplement for cancer therapy, additional information regarding the most effective composition, its antitumor effect in vivo and its main molecular mediators is still needed. In this sense, we have previously reported the synergistic effect of the combination of supercritical fluid rosemary extract and 5-fluorouracil, the most commonly used drug in colon cancer therapy, through the modulation of TK1 and TYMS, which are enzymes related to the mechanism of action of this drug [16].

In this work, the antitumor activities of five carnosic-acid rich supercritical rosemary extracts (RE's) with different chemical composition have been assayed in colon and pancreatic cancer cells with the aim of determining the most potent RE and the different sensitivity among the cell lines, as well as the contribution of isolated components to the antitumor effect of the RE and the possible cooperative effect of their combination. Moreover, the effect of RE's on tumor progression in vivo has been assessed in colon cancer mouse xenografts. Furthermore, gene and miRNA expression analysis were studied after RE treatment in order to elucidate the molecular mechanism responsible for its antitumor activity both in vitro and in vivo.

31

ОбсуждениеНаучная литература отражает противоопухолевое действие нескольких экстракты розмарина, в

основном, на коже [3], молочной железы [4], двоеточие [16] и лейкемии [18], среди других типов рака. Кроме того, некоторые компоненты, такие как розмарин carnosic кислоты и carnosol, как сообщается, обеспечивают антиоксидантную [19] и противоопухолевой [11] эффекты экстрактов розмарина. Однако, возможен синергетический эффект сочетания розмарина компоненты не решена. В данной работе проанализированы противоопухолевого эффекта несколько сверхкритических RE с различным составом на толстой кишки и поджелудочной железы, клеток, с точки зрения жизнеспособности клеток и клеточной смерти. По нашим сведениям, ни повторно, ни их основные компоненты были проанализированы для определения их противоопухолевую активность в поджелудочной железы, Дата. Результаты на жизнеспособность клеток показывают, что чувствительность опухолевых клеток к различным RE: (от менее чувствительны к более чувствительны): PANC-1 (поджелудочной железы), MIA-PaCa-2 (поджелудочной железы), SW620 (двоеточие) и DLD-1 (двоеточие). Результаты по индукции апоптоза также предполагают, что клетки рака кишечника могут быть более чувствительны, чем панкреатических раковых клеток к противоопухолевым эффектами экстрактов. Таким образом, различные потенции RE наблюдавшиеся ранее в жизнеспособность клеток с помощью МТТ-теста коррелирует с их потенции в индукции гибели клеток оценивали с помощью вестерн-блот анализ PARP1 декольте. Необходима дальнейшая работа для того, чтобы найти клеточные или молекулярные характеристики, которые делают PANC-1 клеток, особенно устойчивые к противоопухолевым эффектами экстрактов розмарина.

Ряд преимуществ гарантирует использование экстрактов розмарина, и, в частности, сверхкритические экстракты, вместо того, чтобы их изолированные компоненты в лечении рака. С одной стороны, получение экстрактов розмарина намного дешевле, чем изоляции соединений. Кроме того, сверхкритических экстрактов розмарина, не содержат химических остатков, которые повлекут за собой вредные последствия. Действительно, сверхкритических флюидных экстракт розмарина была признана здоровой составляющей Европейского органа по безопасности пищевых продуктов (EFSA), и в настоящее время используется как антиоксидант пищевая добавка [28]. С другой стороны, как мы показали в данной работе сочетание carnosol и carnosic кислота оказывает больший эффект, чем сумма их эффектов по отдельности. Иордания et al. недавно сообщалось, отношения между carnosic кислоты и carnosol содержание RE с их антимикробной и антиоксидантной деятельности [19]. Они обнаружили, что два дитерпены в равной степени подвержены антиоксидантную активность, в то время как антимикробный эффект выше, когда carnosol carnosic кислоты коэффициент вырос. Будущие исследования оправданным в целях определения конкретных carnosol carnosic кислоты, соотношения, необходимые для достижения максимальный противоопухолевый эффект. Кроме того, дополнительные компоненты розмарина (например, летучих соединений) дальнейшее увеличение антипролиферативное действие повторно, тем самым способствуя более высокой противоопухолевой активности экстракта в сравнении с действием совокупности ее основных компонентов (carnosic кислоты и carnosol).

Для того, чтобы проверить эффективность ре in vivoнесколько повторно были перорально-мышь ксенотрансплантатов рака толстой кишки. Предыдущие исследования на животных обнаружили в литературе, показали профилактический эффект или экстракт розмарина in vivo в нескольких типов опухолей. В нашем эксперименте, поскольку опухолевые клетки уже есть в организме во время лечения, мы демонстрируем ингибиторный эффект экстракт розмарина на прогрессии опухоли in vivo. Деятельность трех RE проанализированы (RE-3, RE 4 и RE-5) результатом очень похожи в конце эксперимента, несмотря на жизнеспособность клеток in vitro эксперименты показали меньшую эффективность RE-3. Однако, эффект RE-3 началось позднее, чем в RE 4 и RE-5. Одним из объяснений может быть насыщение поглощения механизмы розмарина активных компонентов в кишечнике, но больше экспериментов, необходимых для решения данного вопроса.

Розмарин и их компонентов были зарегистрированы модулировать метаболизм глутатиона [20], Nfr2-зависимого механизма [21], AMPK и PPAR путей [22], среди прочего, а также апоптоз генов, связанных с [17]. Однако, противоопухолевый механизм действия не совсем понятны. В данном исследовании мы наблюдали вверх-регулирование GCNT3 повторно, и соотношение это-

32

регулирование с его противоопухолевой эффективности. Розмарин компонент, ответственный за этот модуляции carnosic кислоты. Так GCNT3 уже сообщалось ранее, к опухоли обладают супрессорной активности при раке толстой кишки [27], нет-регулируется несколькими химиотерапевтическими препаратами и его избыточная экспрессия коррелирует с лучшим исходом больных раком толстой кишки (Гонсалес-Vallinas М et al.., представленный для публикации), мы предлагаем GCNT3 может быть ключевой молекулой в противоопухолевым действием розмарина.

Вывод о том, что мир-15b, которые сообщили целевой GCNT3 по in silico анализ, корреляцию с противоопухолевым действием розмарина и могут быть найдены в мышь плазмы, обеспечивает потенциал подходящий биомаркеров для мониторинга in vivo ответ на RE. Кроме того, miR-15b недавно было предложено в качестве потенциальных биомаркеров колоректального рака, поскольку он был найден до регулируемых колоректального рака у пациентов, что свидетельствует о важной роли этого мирна в прогрессировании заболевания [29]. Определение циркулирующих мірнк является неинвазивным и относительно доступный метод, который может быть полезен для того, чтобы определить ответчика, а не ответчик лиц в ходе лечения. Будущая работа должна быть направлена как для анализа функциональной роли этих молекул в действие этого агента, и, чтобы исследовать их клиническое значение в качестве потенциальных молекулярных биомаркеров.

ВыводыВ целом, наши результаты показывают, что повторно оказывает противоопухолевое действие на

оба толстой кишки и поджелудочной железы, вероятно, через до-регулирование GCNT3 и вниз-регулирование miR-15b, и является перспективным терапевтическим средством в лечении больных, страдающих этими заболеваниями. Кроме того, вниз-регулирование плазматических мир-15b уровней предлагается в качестве потенциального неинвазивных биомаркеров для мониторинга противоопухолевый эффект, произведенный заново.

DiscussionScientific literature reflects antitumor effects of several rosemary extracts mainly on skin [3], breast [4],

colon [16] and leukemia [18], among other cancer types. Moreover, some rosemary components such as carnosic acid and carnosol have been reported to provide the antioxidant [19] and anticancer [11] effects to rosemary extracts. However, the possible synergistic effect of the combination of rosemary components has not been addressed yet. In this work, we assayed the antitumor effect of several supercritical RE's with different composition on colon and pancreatic cancer cells, in terms of cell viability and cell death. To our knowledge, neither RE's nor their main components have been assayed to determine their antitumor activities in pancreatic carcinoma to date. The results on cell viability show that the sensitivity of tumor cells to the different RE's is (from less sensitive to more sensitive): PANC-1 (pancreas), MIA-PaCa-2 (pancreas), SW620 (colon) and DLD-1 (colon). The results on apoptosis induction also suggest that colon cancer cells might be more sensitive than pancreatic cancer cells to the antitumor effects of the extracts. Thus, the different potency of the RE's previously observed in cell viability by MTT assay correlates with their potency in inducing cell death assessed by western blot analysis of PARP1 cleavage. Future work is needed in order to find the cellular or molecular characteristics that make PANC-1 cells especially resistant to the antitumor effects of rosemary extracts.

Several advantages warrant the use of rosemary extracts, and specifically supercritical extracts, instead of their isolated components in cancer treatment. On the one hand, the obtaining of rosemary extracts is much less expensive than the isolation of its compounds. Moreover, supercritical rosemary extracts do not contain chemical residues, which would entail harmful effects. Indeed, supercritical fluid rosemary extract has been recognized as a healthy component by the European Food Safety Authority (EFSA), and is currently used as an antioxidant food additive [28]. On the other hand, as we have demonstrated in this work the combination of carnosol and carnosic acid exerts a higher effect than the sum of their effects separately. Jordan et al. recently reported the relationship between the carnosic acid and carnosol content of RE's with their antimicrobial and antioxidant activities [19]. They found that the two diterpenes equally affected to the antioxidant activity, whereas antimicrobial effect was higher when the carnosol carnosic acid ratio increased. Future studies are warranted in order to determine the specific carnosol carnosic acid ratio needed to achieve the highest antitumor effect. Moreover, additional rosemary components (e.g. volatile compounds) further increase the antiproliferative effect of RE, thus contributing to the higher

33

antitumor activity of the extract in comparison to the effect of the combination of its main components (carnosic acid and carnosol).

In order to test the efficacy of RE in vivo, several RE's were orally administered to mouse colon cancer xenografts. Previous animal studies found in the literature showed the preventive effect or rosemary extract in vivo in several tumor types. In our experiment, since the tumor cells are already in the organism at the time of treatment, we demonstrate the inhibitory effect of rosemary extract on tumor progression in vivo. The activities of the three RE's assayed (RE-3, RE-4 and RE-5) resulted very similar at the end of the experiment despite cell viability in vitro experiments showed the lesser efficacy of RE-3. However, the effect of RE-3 began later than those of RE-4 and RE-5. One explanation could be the saturation of the absorption mechanisms of rosemary active components in the bowel, but more experiments are needed to address this issue.

Rosemary and their components were reported to modulate glutathione metabolism [20], Nfr2-dependent pathway [21], AMPK and PPAR pathways [22], among others, as well as apoptosis-related genes [17]. However, the antitumor mechanism of action is not completely understood. In this study, we observed the up-regulation of GCNT3 by RE, and the correlation of this up-regulation with its antitumor efficacy. The rosemary component responsible for this modulation is carnosic acid. Since GCNT3 has been previously reported to possess tumor suppressor activities in colon cancer [27], it is up-regulated by several chemotherapeutic drugs and its overexpression correlates with a better outcome of colon cancer patients (González-Vallinas M et al., submitted for publication) we propose that GCNT3 may be a key molecule in the antitumor action of rosemary.

The finding that miR-15b, which was reported to target GCNT3 by in silico analysis, correlated with the antitumor effect of rosemary and can be found in mouse plasma, provides a potential suitable biomarker to monitor the in vivo response to RE. In addition, miR-15b has been recently proposed as potential biomarker for colorectal cancer since it has been found up-regulated in colorectal cancer patients, which suggests a relevant role of this miRNA in the progression of the disease [29]. The determination of the circulating miRNAs is a non-invasive and relatively accessible method which could be useful in order to discriminate the responder and non-responder individuals during the treatment. Future work should be directed both to analyze the functional role of these molecules in the action of this agent, and to investigate their clinical value as potential molecular biomarkers.

ConclusionsIn summary, our results indicate that RE exerts antitumor activity on both colon and pancreatic cancers,

probably through the up-regulation of GCNT3 and the down-regulation of miR-15b, and constitutes a promising therapeutic tool in the treatment of patients suffering from these diseases. Moreover, down-regulation of plasmatic miR-15b levels is proposed as a potential non-invasive biomarker to monitor the anticancer effect produced by RE.

Модуляции эстрогена и эпидермального фактора роста рецепторов на экстракт розмарина в груди раковые клетки.

Рак молочной железы является ведущей причиной ракасмертность среди женщин во всем мире, поэтому разработка новых терапевтических подходов, по-прежнему нужен. Розмарин (Rosmarinus officinalis L.), экстракт обладает противоопухолевыми свойствами против опухолевых клеток от нескольких органов, в том числе молочной железы. Однако для того, чтобы применять его в качестве дополнительного терапевтического средства при раке молочной железы, необходимо больше информации о чувствительности различных подтипы опухоли молочной железы и ее влияние в сочетании с используемым в настоящее время химиотерапия. Здесь, мы проанализировали противоопухолевый деятельности сверхкритического флюида экстракт розмарина (SFRE) в разных молочной железы клеток, и использовали геномную подход, чтобы изучить его влияние на модуляцию ER-α и HER2 сигнальных путей, наиболее важные пути митоген, связанных молочной железы прогрессии. Мы обнаружили, что SFRE оказывает противоопухолевое действие против рака молочной железы клетки из разных подтипов опухоли и снижение экспрессии ER-α и HER2-рецепторы SFRE могут быть вовлечены в его противоопухолевый эффект в отношении эстроген-

34

зависимых (ER+) и HER2 overexpressing (HER2+) молочной железы подтипов. Кроме того, SFRE значительно усиливается эффект молочной железы химиотерапия (тамоксифен, трастузумаб, и паклитаксел). В целом, наши результаты подтверждают потенциальную полезность SFRE в качестве дополнительного подхода в груди рак терапии.

Electrophoresis. 2014 Jun;35(11):1719-27. doi: 10.1002/elps.201400011. Epub 2014 Mar 20.Modulation of estrogen and epidermal growth factor receptors by rosemary extract in breast cancer

cells.González-Vallinas M1, Molina S, Vicente G, Sánchez-Martínez R, Vargas T, García-Risco MR, Fornari T,

Reglero G, Ramírez de Molina A.Author information 1IMDEA-Food Institute, CEI UAM + CSIC, Madrid, Spain.AbstractBreast cancer is the leading cause of cancer-related mortality among females worldwide, and therefore

the development of new therapeutic approaches is still needed. Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) extract possesses antitumor properties against tumor cells from several organs, including breast. However, in order to apply it as a complementary therapeutic agent in breast cancer, more information is needed regarding the sensitivity of the different breast tumor subtypes and its effect in combination with the currently used chemotherapy. Here, we analyzed the antitumor activities of a supercritical fluid rosemary extract (SFRE) in different breast cancer cells, and used a genomic approach to explore its effect on the modulation of ER-α and HER2 signaling pathways, the most important mitogen pathways related to breast cancer progression. We found that SFRE exerts antitumor activity against breast cancer cells from different tumor subtypes and the downregulation of ER-α and HER2 receptors by SFRE might be involved in its antitumor effect against estrogen-dependent (ER+) and HER2 overexpressing (HER2+) breast cancer subtypes. Moreover, SFRE significantly enhanced the effect of breast cancer chemotherapy (tamoxifen, trastuzumab, and paclitaxel). Overall, our results support the potential utility of SFRE as a complementary approach in breast cancer therapy.

Розмарин (Rosmarinus officinalis), экстракт модулирует ЧОП/GADD153 способствовать деградации рецепторов андрогенов и уменьшает ксенотрансплантат опухоли.

Средиземноморская диета издавна приписывают предотвращения или отдаления наступления сердечно-сосудистые заболевания, сахарный диабет и различные твердые органов раков. В данном конкретном исследовании, розмарина экстракт, стандартизированный для carnosic кислота была оценка потенциала его в срыве эндоплазматический ретикулум техники к снижению жизнеспособности простаты раковых клеток и способствуют деградации рецепторов андрогенов. Два человека предстательной железы клеточные линии, 22Rv1 и LNCaP, и эпителиальных клеток предстательной закуплены у двух разных пациентов, подвергшихся радикальной простатэктомии были обработаны стандартизированный экстракт розмарина и оценивали методом проточной цитометрии, МТТ, BrdU, Вестерн-блот и люминесцентной микроскопии. Значительная модуляция эндоплазматический ретикулум стрессовых белков наблюдается в раковых клетках при нормальных эпителиальных клеток простаты не пройти стресс эндоплазматического ретикулума. Этот двухфазный ответ предполагает, что стандартизированный экстракт розмарина может преимущественно целевой рака клетки, в отличие от "нормальных" клеток. Кроме того, мы наблюдали стандартизированный экстракт розмарина снижение экспрессии рецепторов андрогенов, что, по-видимому, регулируется с помощью выражения ЧОП/GADD153. С помощью ксенотрансплантат опухоли модели мы наблюдали стандартизированный экстракт розмарина при орально значительно подавлять опухолевый рост на 46% по сравнению с мышами не получает стандартизированный экстракт розмарина. В последние несколько лет нормативно-руководящие органы (например, Европейского Союза) были утверждены стандартизированные экстракты розмарина в качестве пищевых консервантов. Эти результаты особенно значимы, как она становится все более вероятно, что люди будут получать стандартизированные экстракты розмарина, которые являются частью естественного консерванта системы в различные пищевые продукты. Дальнейшим

35

шагом вперед, возможно, что потенциальные выгоды, которые часто ассоциируются с "средиземноморской диеты" в будущем может начать выходить за пределы средиземноморской диеты как больше население потребляет стандартизированные экстракты розмарина.

PLoS One. 2014 Mar 5;9(3):e89772. doi: 10.1371/journal.pone.0089772. eCollection 2014.Rosemary (Rosmarinus officinalis) extract modulates CHOP/GADD153 to promote androgen receptor

degradation and decreases xenograft tumor growth.Petiwala SM1, Berhe S1, Li G1, Puthenveetil AG1, Rahman O1, Nonn L2, Johnson JJ3.Author information 1Department of Pharmacy Practice, College of Pharmacy, University of Illinois at Chicago, Chicago,

Illinois, United States of America.AbstractThe Mediterranean diet has long been attributed to preventing or delaying the onset of cardiovascular

disease, diabetes and various solid organ cancers. In this particular study, a rosemary extract standardized to carnosic acid was evaluated for its potential in disrupting the endoplasmic reticulum machinery to decrease the viability of prostate cancer cells and promote degradation of the androgen receptor. Two human prostate cancer cell lines, 22Rv1 and LNCaP, and prostate epithelial cells procured from two different patients undergoing radical prostatectomy were treated with standardized rosemary extract and evaluated by flow cytometry, MTT, BrdU, Western blot and fluorescent microscopy. A significant modulation of endoplasmic reticulum stress proteins was observed in cancer cells while normal prostate epithelial cells did not undergo endoplasmic reticulum stress. This biphasic response suggests that standardized rosemary extract may preferentially target cancer cells as opposed to "normal" cells. Furthermore, we observed standardized rosemary extract to decrease androgen receptor expression that appears to be regulated by the expression of CHOP/GADD153. Using a xenograft tumor model we observed standardized rosemary extract when given orally to significantly suppress tumor growth by 46% compared to mice not receiving standardized rosemary extract. In the last several years regulatory governing bodies (e.g. European Union) have approved standardized rosemary extracts as food preservatives. These results are especially significant as it is becoming more likely that individuals will be receiving standardized rosemary extracts that are a part of a natural preservative system in various food preparations. Taken a step further, it is possible that the potential benefits that are often associated with a "Mediterranean Diet" in the future may begin to extend beyond the Mediterranean diet as more of the population is consuming standardized rosemary extracts.

Эффект экстракт розмарина на прогрессирование рака простаты in vivoБестимусных мышей вводили либо оливковое масло в чистом виде или экстракт розмарина,

растворенного в оливковом масле, чтобы определить эффективность экстракт розмарина на прогрессирование рака простаты in vivo. Как видно из их веса тела, мышей переносится экстракт розмарина хорошо в течение 22 дней (Рис. 7А). Развитие опухоли наблюдалась на 14-й день в обеих группах мышей, с меньшего объема, наблюдаемые у мышей, получавших экстракт розмарина, как показано на рисунке. 7B. В день 21, опухоли в обработанной группе измеряемых 695 мм3 принимая во внимание, что опухоли от контрольных мышей измеряется 1295 мм3 с изображением 46% уменьшение размера опухоли в экстракт розмарина мышей по сравнению с контрольными животными (Рис. 7Б). Представитель образ управления и экстракт розмарина мышей вместе с фотографиями, на которых изображены различные размеры опухоли из каждой группы показана на рис. 7C. Мы также проанализировали мышь тканевых лизатов с помощью Вестерн-блоттинга для выражения AR, PSA и измельчить. Как показано на рис. 7D, выражение AR и PSA снизился и, что ЧОП увеличивается в экстракт розмарина обработанных тканей лизаты по сравнению лизаты от контрольной группы животных.

ОбсуждениеСредиземноморская диета получила внимание своей сердечно-сосудистые и метаболические

свойства, способствующие укреплению здоровья [16], [17]. В частности, свежие фрукты и овощи, бобовые, нерафинированные крупы, рыба, оливковое масло и красное вино получили наибольшее внимание на их свойства, способствующие укреплению здоровья [18]. Одна область, которая не получила достаточного внимания, является использование кулинарных трав, в том числе розмарин,

36

базилик, орегано, шалфей и другие [19]. В частности, розмарин (Rosmarinus officinalis) был связан с противовоспалительными и антиоксидантными свойствами. Ранее, мы уже сообщали carnosol, орто diphenolic дитерпены, стимулировать апоптоз в нескольких клеточных линиях рака предстательной железы при модуляции с 5' - аденозинмонофосфат-активируемой протеин киназы (AMPK) пути [20]. Совсем недавно мы сообщали уникальный атрибут carnosol содействие двойной срыв AR и ERα [15].

В данном исследовании мы оценивали стандартизированный экстракт розмарина, чтобы carnosic кислоты для уменьшения предстательной железы жизнеспособность клеток. Обоснование оценки сложная смесь розмарина полифенолы был в несколько раз [19]. Во-первых, несколько эпидемиологических исследований сообщили, что розмарин потребление связано с общим снижением заболеваемости раком [21]. Во-вторых, Европейский Союз одобрил использование экстрактов розмарина для сохранения пищевых продуктов и была принята в ЕС законодательство о пищевых продуктах [22]. В-третьих, в США Розмари были классифицированы по FDA как “общепризнанные как безопасные” или Гра (CFR 182.10; 182.20). В-четвертых, розмарин широко доступны как пищевая добавка в США. Наконец, как видно из наших исследований, а также других, которые в сложных смесей полифенолов при определенных обстоятельствах может предоставить multi-целенаправленное действие по сравнению с индивидуальными фитохимических веществ. На основе этих наблюдений, а также наши предыдущие оценки индивидуальных фитохимические вещества привело нас к расследованию стандартизированный экстракт розмарина, чтобы carnosic кислоты.

Изменения в среде, окружающей эндоплазматический ретикулум иметь прямое воздействие на целостность, структуру и функции этого органелл [7], [8]. Это особенно показательно в промоции и прогрессии рака как существует повышенный спрос на производство белков из эндоплазматического ретикулума с целью удовлетворения возросших метаболических потребностей клетки рака. Во время этого процесса очевидно, что существует повышенная вероятность неправильно свернутых белков, или даже развернулась. Если ничего не предпринять, эти клетки подвергаются апоптозу. В ответ, клетка имеет возможность адресу белка нестабильности через “unfolded protein response”, которая контролируется ПЕРК и измельчить, вместе с несколькими другими ER стрессовых белков [23]. Как раковая клетка компенсирует это установлено гомеостаза, белки могут сделать фолд, правильно или пройти контролируемой деградации, тем самым увеличивая выживаемость клеток. Доказательства других исследователей и самих себя, говорит о том, что использование малых молекул модулировать ER стресс может задержать развитие опухоли, роста, инвазии, тем самым обеспечивая роман терапевтические стратегии [24]. Как сообщалось выше мы наблюдали, экстракт розмарина модулировать ER стрессовых белков, в том числе ЧОП/GADD153. Эффекты модуляции ЧОП/GADD153 может рассматриваться как еще 20 мкг/мл экстракт розмарина (40% carnosic кислота), которая приблизительно равна 24 мкм из carnosic кислоты. На основе предыдущих докладах фармакокинетические параметры carnosic кислоты казалось бы, что эти достижимой концентрации после перорального приема [25], однако дальнейшие работы, необходимые для определения фармакокинетического профиля у мышей [26].

На другом фронте в рак простаты управления хорошо известно, что рецептор андрогена был мишенью для рака простаты в течение длительного времени. Становится все более очевидным, что есть существенный недостаток, с таргетингом андрогенными рецепторами с традиционными связывания лиганда рецепторов антагонисты. Во-первых, роль анти-андрогены часто ограничена, поскольку андрогенов антагонисты (например, флутамид и бикалютамид) используются для управления начального рака предстательной железы “блик” [27]. Это часто сопровождается возможного преобразования предстательной железы к кастрации устойчивые формы. Реакция раковых клеток, чтобы “противостоять” анти-андрогенов связано с мутациями рецептора андрогенов которые оказывают традиционные анти-андрогенов антагонисты неэффективными или даже контрпродуктивными.

Доказательств того, что андрогенных рецепторов является ценным объектом для рака предстательной железы, однако, в качестве альтернативы стратегии должны быть изучены, чтобы сорвать рецепторов андрогенов в отличие от традиционных антагонистов в лиганд-связывающим доменом. Один подход, который был предложен, является целенаправленной деградации

37

рецепторов андрогенов, однако в настоящее время эти вещества слишком токсичен для in vivo исследования. В нашем исследовании мы наблюдали экстракт розмарина снижение экспрессии белков рецепторов андрогенов в концентрациях ниже 20 мкг/мл (∼ 24 мкм из carnosic кислоты). Кроме того, мы наблюдали значительное снижение выделяется простатический специфический антиген в LNCaP клеток от 11,5 до 2 нг/мл экстракт розмарина лечения. Следующим шагом было определить, есть ли связь между ЧОП/GADD153 и снижение рецепторов андрогенов с экстракт розмарина лечения. В обоих 22Rv1 и LNCaP клеток мы наблюдали значительный рост в ЧОПЕ, однако, с помощью siRNA вместе с экстракт розмарина лечения мы наблюдали разворот экстракт розмарина, индуцированной деградации рецепторов андрогенов. Однако, учитывая, что ЧОП вообще считается ниже по течению событий в ER стресс-ответа, как он тщательно регулирует антиапоптозных и про-апоптотических белков мы хотели оценить белков ранее в ER стресс-ответа. Далее, мы провели siRNA с BiP, ER стресс компаньонки, с или без экстракт розмарина. Интересно, когда клетки были обработаны BiP siRNA и экстракт розмарина разворот AR деградация наблюдается. В связи с этим функции BiP она пройдет через несколько циклов связывания и освобождения субстрата белка через ATP-управляемый процесс, который позволит субстрата сложить правильно [28]. В тех условиях, протеин дисульфид изомеразы (PDI) набирается сократить, переставить, и окисления дисульфидных связей до тех пор, пока правильного экстерьера достигается. Интересно, что длительное связывание BiP, чтобы белка было показано, в результате proteasomal деградации [29]. Еще одно интересное наблюдение бип другие показали, что это ключевой регулятор translocon поры в эндоплазматический ретикулум [28]. Дальнейшей работы необходимо будет оценить, если экстракт розмарина ответственен за управление поры и/или вступил белков протеасом.

Два доброкачественных первичных предварительно клеточных линий были оценены понять, если bisphasic ответ в ER стресс модуляции будет соблюдаться. В этих клетках значительное увеличение ПЕРК наблюдалось, можно предположить, что эти клетки, хотя от доброкачественных регионов предстательной железы, в этот переломный момент в канцерогенный процесс возможен в результате возраста или области эффектов [13]. Эти клетки предварительно также не выражают рецепторов андрогенов, что может способствовать дифференциальной ответ на экстракт розмарина, результатом чего является снижение способности выражения. Этот двухфазный ответ еще раз показывает сложность ER стресс во время канцерогенеза предстательной железы. Понятно, что розмарин-это богатый источник различных полифенольных веществ, которые отличаются от других известных натуральных продуктов и потребует более детального понимания того, как эти химические составляющие могут способствовать ER стресса и деградации рецепторов андрогенов [20], [30].

Накопление мутаций в “нормальных” клеток приводит к неспособности преодолеть традиционные контрольно-пропускных пунктов является критической канцерогенеза предстательной железы. На основе результатов, описанных выше, необходима дальнейшая работа, чтобы понять, как отдельные фитохимические в розмарине модулировать важных целей, которые регулируют клеточный цикл и стресс эндоплазматического ретикулума. Особенно в пределах предстательной железы очевидно, что рецептор андрогена, который действует как фактор транскрипции, более 800 генов является важным компонентом этого процесса. По этой причине рецепторов андрогенов были мишенью посредством рецепторов андрогенов антагонисты, однако, новый подход может быть необходим, чтобы преодолеть традиционные препятствия, которые предстают перед нами вскоре после начала терапии. В наших исследованиях мы наблюдали экстракт розмарина избирательно индуцировать ER стресс-белков и предоставить доказательства того, что ЧОП/GADD153/BIP-критический путь деградации рецепторов андрогенов. Кроме того, эти результаты были также отмечены в 22Rv1 ксенотрансплантат мышь тканей после перорального приема экстракта розмарина. Интересно, что в нормальных эпителиальных клеток простаты закуплены у пациентов с высоким риском развития рака простаты экстракт розмарина стандартизированные для carnosic кислоты наблюдается снижение ER стресс. Дальнейшие работы будут необходимы для оценки индивидуальных дитерпены в модулирующего ER стресс-белки при раке предстательной железы для дальнейшего понимания, как экстракт розмарина способствует ER стресс.

38

Effect of Rosemary Extract on progression of prostate cancer in vivoAthymic nude mice were administered either olive oil alone or rosemary extract dissolved in olive oil to

determine the efficacy of rosemary extract on progression of prostate cancer in vivo. As evident from their body weight measurements, mice tolerated rosemary extract well for 22 days (Figure 7A). Development of tumors was observed at day 14 in both groups of mice, with a smaller volume observed in mice treated with rosemary extract as shown in Figure. 7B. At day 21, tumors in the treated group measured 695 mm3

whereas tumors from control mice measured 1295 mm3 depicting a 46% reduction in tumor size in rosemary extract treated mice compared to control animals (Figure. 7B). A representative image of control and rosemary extract treated mice along with pictures showing different dimension of tumors from each group is shown in Figure 7C. We also analyzed mouse tissue lysates using Western blotting for expression of AR, PSA and CHOP. As shown in Figure 7D, expression of AR and PSA is decreased and that of CHOP is increased in rosemary extract treated tissue lysates compared to lysates from control group animals.

DiscussionThe Mediterranean diet has been receiving attention for its cardiovascular and metabolic health

promoting properties [16], [17]. In particular, fresh fruits and vegetables, legumes, non-refined cereals, fish, olive oil, and red wine have received the most attention for their health promoting properties [18]. One area that has not received enough attention is the use of culinary herbs including rosemary, basil, oregano, sage, and others [19]. Specifically, rosemary (Rosmarinus officinalis) has been associated with anti-inflammatory and anti-oxidant properties. Previously, we have reported carnosol, an ortho diphenolic diterpene, to promote apoptosis in multiple prostate cancer cell lines while modulating 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) pathway [20]. More recently, we have reported a unique attribute of carnosol to promote dual disruption of AR and ERα [15].

In this particular study, we evaluated rosemary extract standardized to carnosic acid for decreasing prostate cancer cell viability. The rationale for evaluating a complex mixture of rosemary polyphenols was several fold [19]. First, several epidemiological studies have reported that rosemary consumption is associated with an overall reduction in cancer incidence [21]. Second, the European Union has approved the use of rosemary extracts for food preservation and has been adopted into the EU food legislation [22]. Third, in the United States rosemary has been categorized by the FDA as “generally recognized as safe” or GRAS (CFR 182.10; 182.20). Fourth, rosemary is widely available as a dietary supplement in the United States. Lastly, it is apparent from our studies as well as others that complex mixtures of polyphenols under certain circumstances can provide a multi-targeted effect compared to individual phytochemicals. Based on these observations as well as our previous evaluation of individual phytochemicals led us to investigate rosemary extract standardized to carnosic acid.

Alterations in the environment surrounding the endoplasmic reticulum have a direct effect on the integrity, structure and function of this organelle [7], [8]. This is especially significant during cancer promotion and progression as there is an increased demand on the protein production of the endoplasmic reticulum to meet the increased metabolic needs of cancer cells. During this process it is evident that there is an increased likelihood of proteins that are misfolded or even unfolded. If left unchecked, these cells will undergo apoptosis. In response, the cell has the capability to address protein instability via the “unfolded protein response” which is controlled by PERK and CHOP, along with several other ER stress proteins [23]. As the cancer cell compensates for this established homeostasis, proteins may fold properly or undergo a controlled degradation thereby increasing cell survival. Evidence by other investigators and ourselves suggests that the use of small molecules to modulate ER stress may delay tumor development, growth, invasion, thereby providing a novel therapeutic strategy [24]. As reported above we observed rosemary extract to modulate ER stress proteins, including CHOP/GADD153. The effects of modulating CHOP/GADD153 can be seen as early as 20 µg/ml of rosemary extract (40% carnosic acid) which approximates to 24 µM of carnosic acid. Based on previous reports of the pharmacokinetic parameters of carnosic acid it would appear that these concentrations are achievable following oral administration [25], however, further work would be required to determine the pharmacokinetic profile in mice [26].

On another front in prostate cancer control it is well known that the androgen receptor has been a target for prostate cancer for a long time. It is becoming increasingly clear that there is a significant shortcoming with targeting the androgen receptor with traditional ligand binding receptor antagonists.

39

First, the role of anti-androgens is often limited because androgen antagonists (e.g. flutamide and bicalutamide) are used to control the initial prostate cancer “flare” [27]. This is often followed by an eventual conversion of prostate cancer to a castration resistant form. The response of the cancer cell to “resist” anti-androgens is correlated with mutations in the androgen receptor that render traditional anti-androgen antagonists ineffective or even counter-productive.

The evidence is overwhelming that the androgen receptor is a valuable target for prostate cancer, however, an alternative strategy should be explored to disrupt the androgen receptor as opposed to traditional antagonists at the ligand binding domain. One approach that has been proposed is targeted degradation of the androgen receptor, however, at present these chemicals are too toxic for in vivo studies. In our study we observed rosemary extract to decrease androgen receptor protein expression at concentrations as low as 20 µg/mL (∼ 24 µM of carnosic acid). Furthermore we observed a significant decrease in secreted prostate specific antigen in LNCaP cells from 11.5 to 2 ng/ml with rosemary extract treatment. The next step was to determine if there was a link between CHOP/GADD153 and decreased androgen receptor with rosemary extract treatment. In both 22Rv1 and LNCaP cells we observed a significant increase in CHOP, however, using siRNA along with rosemary extract treatment we observed a reversal of rosemary extract induced androgen receptor degradation. However, given that CHOP is generally considered a downstream event in the ER stress response as it closely regulates the anti-apoptotic and pro-apoptotic proteins we wanted to evaluate proteins earlier in the ER stress response. Next, we performed siRNA with BiP, an ER stress chaperone, with or without rosemary extract. Interestingly, when cells were treated with BiP siRNA and rosemary extract a reversal of the AR degradation is observed. In regard, to the function of BiP it will go through multiple cycles of binding and releasing a substrate protein through an ATP driven process that will allow the substrate to fold properly [28]. Under those conditions protein disulfide isomerase (PDI) is recruited to reduce, rearrange, and oxidize disulfide bonds until the correct conformation is achieved. Interestingly, prolonged binding of BiP to a protein has been shown to result in proteasomal degradation [29]. Another interesting observation of BiP by others has shown it to be a key regulator of translocon pores in the endoplasmic reticulum [28]. Future work will need to evaluate if rosemary extract is responsible for governing the pore and/or ushering proteins to the proteasome.

Two benign primary PrE cell lines were evaluated to understand if a bisphasic response in ER stress modulation would be observed. In these cells significant upregulation of PERK was observed suggesting that these cells, although from benign regions of the prostate, are at a critical turning point in the carcinogenic process possible as a result of age or field effects [13]. These PrE cells also do not express androgen receptor, which may contribute to the differential response to rosemary extract, resulting in a decrease in PERK expression. This biphasic response further illustrates the complexity of ER stress during prostate carcinogenesis. It is clear that rosemary is an abundant source of a variety of different polyphenolic substances that are different than other well-known natural products and will require a more detailed understanding of how these chemical constituents can contribute to ER stress and androgen receptor degradation [20], [30].

The accumulation of mutations in “normal” cells results in an inability to overcome traditional checkpoints is critical in prostate carcinogenesis. Based on the results described above further work is needed to understand how the individual phytochemicals in rosemary modulate critical targets that regulate the cell cycle and endoplasmic reticulum stress. Especially within prostate cancer it is evident that the androgen receptor which acts as a transcription factor for over 800 genes is a critical component of this process. For this reason, the androgen receptor has been aggressively targeted through androgen receptor antagonists, however, a new approach may be needed to overcome the traditional obstacles that present themselves shortly after therapy initiation. In our studies, we observed rosemary extract to selectively induce ER stress proteins and provide evidence that CHOP/GADD153/BIP is a critical pathway of androgen receptor degradation. Furthermore, these results were also observed in 22Rv1 xenograft mouse tissues following oral administration of rosemary extract. Interestingly, in normal prostate epithelial cells procured from patients at high risk of developing prostate cancer rosemary extract standardized to carnosic acid is observed to decrease ER stress. Further work will be required to evaluate individual diterpenes in

40

modulating ER stress proteins in prostate cancer to further understand how rosemary extract promotes ER stress.

Carnosol, розмарин ингредиент, индуцирует апоптоз в взрослых Т-клеточный лейкоз/лимфома клеток через истощение глутатиона: протеомный подход с использованием флуоресцентных двумерных дифференциальных гель-электрофореза.

Взрослый Т-клеточный лейкоз/лимфома (ATL) является фатальной злокачественных новообразований, вызванных инфекцией с человека Т-лимфотропных вирусов типа 1 и не существует общепринятой лечебной терапии для ATL. Мы искали биологических активных веществ для профилактики и лечения ATL из нескольких видов трав. ATL клеточный рост-ингибирующей активности и апоптоза анализа показали, что carnosol, что это ингредиент, входящий в состав розмарина (Rosmarinus officinalis), индуцированного апоптоза в ATL клеток. Далее, чтобы исследовать апоптоз-индуцирующего механизм carnosol, мы применили протеомный анализ с использованием флуоресцентных двумерных дифференциальных гель-электрофореза и масс-спектрометрии. На протеомный анализ показал, что выражение редуктаз, собравшиеся ферментов гликолитического пути и ферментов пентозофосфатного пути, путь был увеличен в carnosol-обработанных клетках, по сравнению с необработанными клетками. Эти результаты позволяют предположить, что carnosol пострадавших окислительно-восстановительный статус клетки. Кроме того, количественный анализ глутатиона, который играет центральную роль для поддержания внутриклеточного редокс-статуса, указал, что carnosol вызвал снижение глутатиона в клетках. Далее, N-ацетил-L-цистеином, который является предшественником глутатиона, отменено эффективности carnosol. Исходя из этих результатов было высказано предположение, что апоптоз-индуцирующую активность carnosol в ATL клеток, вызванный истощением глутатиона.

Hum Cell. 2014 Apr;27(2):68-77. doi: 10.1007/s13577-013-0083-6. Epub 2013 Dec 10.Carnosol, rosemary ingredient, induces apoptosis in adult T-cell leukemia/lymphoma cells via

glutathione depletion: proteomic approach using fluorescent two-dimensional differential gel electrophoresis.

Ishida Y1, Yamasaki M, Yukizaki C, Nishiyama K, Tsubouchi H, Okayama A, Kataoka H.Author information 1Department of Biochemistry, Meiji Pharmaceutical University, 2-522-1 Noshio, Kiyose, Tokyo, 204-

8588, Japan, ishida@my-pharm.ac.jp.AbstractAdult T-cell leukemia/lymphoma (ATL) is a fatal malignancy caused by infection with human T-

lymphotropic virus type-1 and there is no accepted curative therapy for ATL. We searched for biological active substances for the prevention and treatment of ATL from several species of herbs. The ATL cell growth-inhibitory activity and apoptosis assay showed that carnosol, which is an ingredient contained in rosemary (Rosmarinus officinalis), induced apoptosis in ATL cells. Next, to investigate the apoptosis-inducing mechanism of carnosol, we applied proteomic analysis using fluorescent two-dimensional differential gel electrophoresis and mass spectrometry. The proteomic analysis showed that the expression of reductases, enzymes in glycolytic pathway, and enzymes in pentose phosphate pathway was increased in carnosol-treated cells, compared with untreated cells. These results suggested that carnosol affected the redox status in the cells. Further, the quantitative analysis of glutathione, which plays the central role for the maintenance of intracellular redox status, indicated that carnosol caused the decrease of glutathione in the cells. Further, N-acetyl-L-cystein, which is precursor of glutathione, canceled the efficiency of carnosol. From these results, it was suggested that the apoptosis-inducing activity of carnosol in ATL cells was caused by the depletion of glutathione.

Противоопухолевое действие 5-фторурацила усиливается экстракт розмарина в оба препарата чувствительные и резистентные толстой кишки раковые клетки.

41

5-Фторурацил (5-фу) является наиболее применяемым химиотерапевтическим агентом в колоректального рака. Однако, устойчивость к этому препарату относительно часто, и новые стратегии, чтобы преодолеть ее необходимо срочно. Целью данной работы было определить противоопухолевые свойства сверхкритического флюида экстракт розмарина (SFRE), самостоятельно и в комбинации с 5-фу, в качестве потенциального адъювантной терапии полезно для толстой кишки рак больным. Этот экстракт был признан здоровым компонентом Европейского органа по безопасности пищевых продуктов (EFSA). Последствия SFRE как в одиночку, так и в комбинации с 5-FU оценивались в различных Толстой кишке человека раковых клеток с точки зрения жизнеспособности клеток, цитотоксичность, и трансформации клеток. Кроме того, толстой кишки рак клетки, устойчивые к 5-фу были использованы для анализа влияния SFRE на лекарственную устойчивость. Наконец, кв-ПЦР было проведено с целью выяснения механизма, с помощью которого SFRE потенцирует действие 5-фу. Наши результаты показывают, что SFRE показывает Зависимое от дозы противоопухолевую активность и оказывает синергетический эффект в сочетании с 5-фу на ободочной рак ячеек. Кроме того, SFRE чувствительным 5-FU-резистентных клеток к терапевтическую активность этого препарата, составляющие благотворно агент против 5-FU чувствительных и резистентных опухолевых клеток. Анализ экспрессии генов указывает на то, что усиление эффекта 5-фу по SFRE может быть объяснено экспрессирован TYMS и ТК1, ферменты, относящиеся к 5-FU сопротивление.

Pharmacol Res. 2013 Jun;72:61-8. doi: 10.1016/j.phrs.2013.03.010. Epub 2013 Apr 1.Antitumor effect of 5-fluorouracil is enhanced by rosemary extract in both drug sensitive and resistant

colon cancer cells.González-Vallinas M1, Molina S, Vicente G, de la Cueva A, Vargas T, Santoyo S, García-Risco MR, Fornari T,

Reglero G, Ramírez de Molina A. 1IMDEA-Food Institute, CEI UAM+CSIC, C/Faraday 7, 28049 Madrid, Spain.Abstract5-Fluorouracil (5-FU) is the most used chemotherapeutic agent in colorectal cancer. However, resistance

to this drug is relatively frequent, and new strategies to overcome it are urgently needed. The aim of this work was to determine the antitumor properties of a supercritical fluid rosemary extract (SFRE), alone and in combination with 5-FU, as a potential adjuvant therapy useful for colon cancer patients. This extract has been recognized as a healthy component by the European Food Safety Authority (EFSA). The effects of SFRE both alone and in combination with 5-FU were evaluated in different human colon cancer cells in terms of cell viability, cytotoxicity, and cell transformation. Additionally, colon cancer cells resistant to 5-FU were used to assay the effects of SFRE on drug resistance. Finally, qRT-PCR was performed to ascertain the mechanism by which SFRE potentiates the effect of 5-FU. Our results show that SFRE displays dose-dependent antitumor activities and exerts a synergistic effect in combination with 5-FU on colon cancer cells. Furthermore, SFRE sensitizes 5-FU-resistant cells to the therapeutic activity of this drug, constituting a beneficial agent against both 5-FU sensitive and resistant tumor cells. Gene expression analysis indicates that the enhancement of the effect of 5-FU by SFRE might be explained by the downregulation of TYMS and TK1, enzymes related to 5-FU resistance.

Фитохимическое профиль Rosmarinus officinalis и Salvia officinalis экстракты и корреляции их антиоксидантной и анти-пролиферативной активности.

Целью данного исследования было контролировать анти-пролиферативной активности Rosmarinus officinalis и Salvia officinalis экстрактов против рака клетки и соотносить эту деятельность с их фитохимических профилей с использованием жидкостной хроматографии/diode array detection/электрораспылительной ионная ловушка с тандемной масс-спектрометрией (LC/папа/ESI-MS(n)). Для количественной оценки тритерпеновые кислоты в сырой экстракты ЯМР на основе методики был использован и по сравнению с ВЭЖХ-измерений, как впервые применены, в случае betulinic кислоты. Оба экстракты оказывали цитотоксическое действие через дозозависимый обесценение жизнеспособность и митохондриальной активности инсулиномы крысы m5F (RINm5F) клеток. Снижение RINm5F жизнеспособность была опосредована оксида азота (NO)-индуцированного апоптоза. Важно, что эти экстракты потенцированные NO и TNF-α Релиз от

42

макрофагов, тем самым усиливая их cytocidal действий. В экстракт розмарина разработан более выраженной антиоксидантной, цитотоксических и immunomodifying деятельности, вероятно, из-за присутствия betulinic кислоты и высокой концентрации carnosic кислоты в ее фитохимических профиля.

Food Chem. 2013 Jan 1;136(1):120-9. doi: 10.1016/j.foodchem.2012.07.091. Epub 2012 Jul 31.Phytochemical profile of Rosmarinus officinalis and Salvia officinalis extracts and correlation to their

antioxidant and anti-proliferative activity.Kontogianni VG1, Tomic G, Nikolic I, Nerantzaki AA, Sayyad N, Stosic-Grujicic S, Stojanovic I,

Gerothanassis IP, Tzakos AG. 1Department of Chemistry, University of Ioannina, Ioannina GR-45110, Greece. me01375@cc.uoi.grAbstractThe goal of this study was to monitor the anti-proliferative activity of Rosmarinus officinalis and Salvia

officinalis extracts against cancer cells and to correlate this activity with their phytochemical profiles using liquid chromatography/diode array detection/electrospray ion trap tandem mass spectrometry (LC/DAD/ESI-MS(n)). For the quantitative estimation of triterpenic acids in the crude extracts an NMR based methodology was used and compared with the HPLC measurements, both applied for the first time, for the case of betulinic acid. Both extracts exerted cytotoxic activity through dose-dependent impairment of viability and mitochondrial activity of rat insulinoma m5F (RINm5F) cells. Decrease of RINm5F viability was mediated by nitric oxide (NO)-induced apoptosis. Importantly, these extracts potentiated NO and TNF-α release from macrophages therefore enhancing their cytocidal action. The rosemary extract developed more pronounced antioxidant, cytotoxic and immunomodifying activities, probably due to the presence of betulinic acid and a higher concentration of carnosic acid in its phytochemical profile.

Carnosic кислота подавляет рост ER-отрицательного человека рак молочной железы клетки и синергетический эффект с куркумой.

Исследования показывают, что очищенные экстракты и компоненты, в том числе carnosic кислоты, из травы розмарина показать значительный рост ингибирующей активности на различные виды рака.

В этом документе рассматривается возможность розмарин/carnosic кислота, подавляют рост молочной железы человека раковых клеток и взаимодействовать с куркумой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ: Для этого мы относились к человеческой молочной железы клетки с розмарином/carnosic кислоты

и оценены эффекты на пролиферацию клеток, клеточный цикл распределения, паттерны экспрессии генов, активность очищенного Na/K АТФ-азы и комбинации с куркумой.

Результаты: Розмари/carnosic кислоты мощно подавляет пролиферацию ER-отрицательного человека рак

молочной железы клетки и индуцирует G1 клеточного цикла. Далее, carnosic кислота является селективной для MCF7 клеток, трансфицированных для Her2, указывая, что Her2 может работать в своей деятельности. Выявить первичные эффекты, мы лечили ER-отрицательный рак молочной железы клетки с carnosic кислоты в течение 6ч. При низкой дозе 5 мкг/мл (15 мкм), carnosic кислота активируется экспрессия 3 генов, индуцированных посредством присутствия антиоксидантные элементы ответа, в том числе генов, участвующих в биосинтезе глутатиона (CYP4F3, курс gclc) и транспорта (SLC7A11). В более высокой дозе, 20 мкг/мл, carnosic кислоты активировал экспрессию антиоксидантных (AKR1C2, TNXRD1, HMOX1) и апоптоза (GDF15, PHLDA1, DDIT3) генов и подавил экспрессию ингибитора транскрипции (ID3) и клеточного цикла (CDKN2C) генов. Carnosic кислоты экспонатов синергии с куркумой/куркумин. Эти соединения ингибировали активность очищенного Na-K-Атфазы, которые могут способствовать этому "Синергия".

Вывод: Розмари/carnosic кислоты, в одиночку или в сочетании с куркумой, может быть полезен для

профилактики и лечения ER-отрицательный рак молочной железы.Fitoterapia. 2012 Oct;83(7):1160-8. doi: 10.1016/j.fitote.2012.07.006. Epub 2012 Jul 22.

43

Carnosic acid inhibits the growth of ER-negative human breast cancer cells and synergizes with curcumin.

Einbond LS1, Wu HA, Kashiwazaki R, He K, Roller M, Su T, Wang X, Goldsberry S. 1Columbia University College of Physicians and Surgeons, New York, NY 10032, USA.

lseinbond@gmail.comStudies indicate that extracts and purified components, including carnosic acid, from the herb rosemary

display significant growth inhibitory activity on a variety of cancers.PURPOSE: This paper examines the ability of rosemary/carnosic acid to inhibit the growth of human breast cancer

cells and to synergize with curcumin.MATERIALS AND METHODS: To do this, we treated human breast cancer cells with rosemary/carnosic acid and assessed effects on

cell proliferation, cell cycle distribution, gene expression patterns, activity of the purified Na/K ATPase and combinations with curcumin.

Rosemary/carnosic acid potently inhibits proliferation of ER-negative human breast cancer cells and induces G1 cell cycle arrest. Further, carnosic acid is selective for MCF7 cells transfected for Her2, indicating that Her2 may function in its action. To reveal primary effects, we treated ER-negative breast cancer cells with carnosic acid for 6h. At a low dose, 5 μg/ml (15 μM), carnosic acid activated the expression of 3 genes, induced through the presence of antioxidant response elements, including genes involved in glutathione biosynthesis (CYP4F3, GCLC) and transport (SLC7A11). At a higher dose, 20 μg/ml, carnosic acid activated the expression of antioxidant (AKR1C2, TNXRD1, HMOX1) and apoptosis (GDF15, PHLDA1, DDIT3) genes and suppressed the expression of inhibitor of transcription (ID3) and cell cycle (CDKN2C) genes. Carnosic acid exhibits synergy with turmeric/curcumin. These compounds inhibited the activity of the purified Na-K-ATPase which may contribute to this synergy.

CONCLUSION: Rosemary/carnosic acid, alone or combined with curcumin, may be useful to prevent and treat ER-

negative breast cancer.

Антибактериальная активность и противоопухолевой активности Rosmarinus officinalis L. эфирное масло, по сравнению с его основными компонентами.

В этом исследовании, Rosmarinus officinalis L. эфирное масло и трех его основных компонентов, 1,8-цинеол (27.23%), α-пинен (19.43%) и β-пинена (6.71%) были оценены для их in vitro антимикробной активности и токсикологические свойства. R. officinalis L. эфирное масло обладал похожими антибактериальная активность α-пинена, и немного лучше, чем β-пинена, в то время как 1,8-цинеол обладает низкой антимикробной активности. R. officinalis L. эфирное масло выставлены сильнейшие цитотоксичность в сторону три человека рак ячеек. Его ингибирующее концентрации 50% (IC₅₀) значения на SK-OV-3, HO-8910 и Bel-7402 были 0.025‰, 0.076‰ и 0,13‰ (v/v), соответственно. Цитотоксичность все тестовые образцы на SK-OV-3 был значительно сильнее, чем на хо-8910 и Bel-7402. В общем, R. officinalis L. эфирное масло проявили большую активность, чем его компоненты в обоих антибактериальной и противоопухолевой тест-систем, и мероприятия были в основном связаны с их концентраций.

Molecules. 2012 Mar 5;17(3):2704-13. doi: 10.3390/molecules17032704.Antibacterial activity and anticancer activity of Rosmarinus officinalis L. essential oil compared to that

of its main components.Wang W1, Li N, Luo M, Zu Y, Efferth T. 1Key Laboratory of Forest Plant Ecology, Ministry of Education, Northeast Forestry University,

Hexing Road 26, Harbin 150040, China.In this study, Rosmarinus officinalis L. essential oil and three of its main components 1,8-cineole

(27.23%), α-pinene (19.43%) and β-pinene (6.71%) were evaluated for their in vitro antibacterial activities and toxicology properties. R. officinalis L. essential oil possessed similar antibacterial activities to α-pinene, and a little bit better than β-pinene, while 1,8-cineole possessed the lowest antibacterial activities. R.

44

officinalis L. essential oil exhibited the strongest cytotoxicity towards three human cancer cells. Its inhibition concentration 50% (IC₅₀) values on SK-OV-3, HO-8910 and Bel-7402 were 0.025‰, 0.076‰ and 0.13‰ (v/v), respectively. The cytotoxicity of all the test samples on SK-OV-3 was significantly stronger than on HO-8910 and Bel-7402. In general, R. officinalis L. essential oil showed greater activity than its components in both antibacterial and anticancer test systems, and the activities were mostly related to their concentrations.

По своей сути лабильные α-спирали, примыкающей к BCL9-сайт связывания β-катенина требуется для ее торможения carnosic кислоты.

Wnt/β-катенин сигнального управления развития и тканевого гомеостаза. Кроме того, активированный β-катенин может быть онкогенным и, в частности, диски колоректального рака. Ингибируя онкогенных β-катенин имеет проверенные огромной проблемой. Здесь мы дизайн экрана для низкомолекулярных ингибиторов β-катенин привязки к его кофактора BCL9, и обнаружить пять родственных природных соединений, в том числе carnosic кислоты из розмарина, который ослабляет транскрипционной β-катенин выходы в колоректального рака ячеек. Доказательства от ЯМР и аналитическим ультрацентрифугированием показывает, что carnosic кислоты ответа требует, по сути, лабильные α-спирали (H1) амино-неизлечимо примыкая BCL9-сайт связывания на β-катенин. Аналогично, в колоректального рака клетки с гиперактивным β-катенин сигнального, carnosic кислоты целей преимущественно транскрипционно активных ('онкогенных') форма β-катенин для proteasomal деградации в H1-зависимым способом. Следовательно, H1-это "Ахиллесова пята" β-катенин, которые могут быть использованы для дестабилизации онкогенных β-катенин малых молекул, предоставляя данные, подтверждающие принцип новой стратегии развития прямых ингибиторов онкогенных β-катенин.

Nat Commun. 2012 Feb 21;3:680. doi: 10.1038/ncomms1680.An intrinsically labile α-helix abutting the BCL9-binding site of β-catenin is required for its inhibition by

carnosic acid.de la Roche M1, Rutherford TJ, Gupta D, Veprintsev DB, Saxty B, Freund SM, Bienz M. 1MRC Laboratory of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge CB2 0QH, UK.AbstractWnt/β-catenin signalling controls development and tissue homeostasis. Moreover, activated β-catenin

can be oncogenic and, notably, drives colorectal cancer. Inhibiting oncogenic β-catenin has proven a formidable challenge. Here we design a screen for small-molecule inhibitors of β-catenin's binding to its cofactor BCL9, and discover five related natural compounds, including carnosic acid from rosemary, which attenuates transcriptional β-catenin outputs in colorectal cancer cells. Evidence from NMR and analytical ultracentrifugation demonstrates that the carnosic acid response requires an intrinsically labile α-helix (H1) amino-terminally abutting the BCL9-binding site in β-catenin. Similarly, in colorectal cancer cells with hyperactive β-catenin signalling, carnosic acid targets predominantly the transcriptionally active ('oncogenic') form of β-catenin for proteasomal degradation in an H1-dependent manner. Hence, H1 is an 'Achilles' Heel' of β-catenin, which can be exploited for destabilization of oncogenic β-catenin by small molecules, providing proof-of-principle for a new strategy for developing direct inhibitors of oncogenic β-catenin.

Wnt сигнализации вызывает контекстно-специфических транскрипционных программа, которая контролирует множество процессов развития и взрослых стволовых клеток ниши1. В отсутствие Wnt, ключевые звенья этого пути, β-катенин, постоянно деградирует. Axin вместе с Аденоматозный polyposis coli (APC) опухолевых супрессоров способствует фосфорилирования β-катенина, гликоген синтазы киназы 3 (GSK3), которая выделяет его для proteasomal деградации. Если это не удается в кишечного эпителия, из-за инактивирующих мутаций APC, β-катенин стабилизируется ненадлежащим образом и, следовательно, инициирует tumourigenesis. Более того, мутации в сайты фосфорилирования β-катенина были найдены во многих других раковых заболеваний2. Unphosphorylated β-катенин накапливается и ассоциированные с ДНК-связывающих T-cell factor/lymphoid enhancer факторов (TCF/LEF), чтобы нанять ряд транскрипционных co-активаторы для

45

его карбокси terminus3. Транскрипционный выключатели, индуцированного β-катенин-ФТС ключевые выходы Wnt/β-катенин сигнального, и определить, как в нормальных, так и злокачественных клеток судьбы1. Ниже, мы используем 'activated' или 'онкогенных' как синонимы, имея в виду unphosphorylated транскрипционно активного β-катенина.

В случае β-катенин в качестве мишени для терапевтического вмешательства при раке является подавляющим. Однако, развитие прямых ингибиторов онкогенных β-катенин имеет проверенные сложная задача: не существует устоявшейся активаторы ферментативных β-катенин, который может быть запрещен, и его основной лиганд взаимодействия поверхности обширна и делились между позитивными и негативными регуляторами4. Тем не менее, было несколько успехов в развитии косвенных низкомолекулярных ингибиторов онкогенных β-катенин, которые снижают его активность или стабильность путем воздействия одним из его регуляторов5,6,7,8.

BCL9 белков и их молекулярно-взаимодействует с β-катенин и Pygo белки появились как новые перспективные мишени для вмешательства в рак. BCL9 белки-адаптеры между β-катенин и Pygo9, и помочь их Pygo кофакторов в признании модифицированных гистонов H3 хвосты их завод homeodomain (PHD) пальцы10. BCL9 и Pygo, таким образом, стимулировать β-катенин-опосредованной транскрипции в процессе нормального развития и при колоректальных раковых клеток,9,11,12,13,14. BCL9 может быть надэкспрессироанных в раков и экспонатов опухоли-содействие эффекты мышь в модели ксенотрансплантата15. Мыши с нокаутом исследования обнаружили ключевые роли Bcl9 и Pygo2 в борьбе с β-катенин-зависимой транскрипции маркеров стволовых клеток в нормальных кишечных крипт и неоплазии16, и в молочных клеток-предшественников отсек17. Действительно, Pygo-это одна из задач, дестабилизированное малых органических молекул киназы агониста6.

Здесь мы ориентируемся на BCL9 и его взаимодействия с β-катенин. Мы разработали ИФА на основе 'плюс-минус' анализа на экран для небольших соединений, которые избирательно нарушить связывание β-катенин, чтобы BCL9, не влияя на его привязку к ФТС. Таким образом, мы определили небольшой группы химически родственных природных соединений, одно из которых, carnosic кислоты (CA) с розмарином, действует в зависимости от дозы ингибирует BCL9-β-катенин привязки in vitro и β-катенин-зависимой транскрипции в колоректальных раковых клеток. Наши биофизического анализа, выделил ключевой элемент, необходимый для CA ответа, а именно структурно-неустойчивых α-спирали (H1) на амино-terminus β-катенин Armadillo повторить домена (ARD), примыкающие BCL9-связывающего сайта. Мы предоставляем доказательства того, что ЦС действует через H1 обострить внутреннюю тенденцию ARD-N-terminus в совокупности, таким образом ослабляя in vitro привязка к BCL9. In vivo CA способствует избирательно proteasomal деградации unphosphorylated β-катенин в H1-зависимым способом. H1 таким образом, Ахиллесова пята β-катенин, и наши обнаружение β-катенин-дестабилизирующий компаунд обеспечивает доказательство-принцип новых стратегий для выявления прямых низкомолекулярных ингибиторов онкогенных β-катенин.

Wnt signalling induces a context-specific transcriptional programme, which controls numerous developmental processes and adult stem cell niches1. In the absence of Wnt, the key effector of this pathway, β-catenin, is continuously degraded. Axin together with the Adenomatous polyposis coli (APC) tumour suppressor promotes the phosphorylation of β-catenin by glycogen synthase kinase 3 (GSK3), which earmarks it for proteasomal degradation. If this fails in the colonic epithelium, because of inactivating mutations of APC, β-catenin is stabilized inappropriately and thus initiates tumourigenesis. Moreover, mutations in the phosphorylation sites of β-catenin have been found in many other cancers2. Unphosphorylated β-catenin accumulates and associates with the DNA-binding T-cell factor/lymphoid enhancer factors (TCF/LEF), to recruit a range of transcriptional co-activators to its carboxy terminus3. The transcriptional switches induced by β-catenin-TCF are the key outputs of Wnt/β-catenin signalling, and determine both normal and malignant cell fates1. Below, we use 'activated' or 'oncogenic' interchangeably, referring to unphosphorylated transcriptionally active β-catenin.

The case for β-catenin as a target for therapeutic intervention in cancer is overwhelming. However, developing direct inhibitors of oncogenic β-catenin has proven a formidable challenge: there are no well-established enzymatic activators of β-catenin that could be inhibited, and its main ligand interaction

46

surface is extensive and shared between positive and negative regulators4. Nevertheless, there have been several successes in developing indirect small-molecule inhibitors of oncogenic β-catenin, which reduce its activity or stability by targeting one of its regulators5,6,7,8.

BCL9 proteins and their molecular interfaces with β-catenin and Pygo proteins have emerged as promising new targets for interference in cancer. BCL9 proteins are adaptors between β-catenin and Pygo9, and assist their Pygo cofactors in recognizing modified histone H3 tails by their plant homeodomain (PHD) fingers10. BCL9 and Pygo thus promote β-catenin-mediated transcription during normal development and in colorectal cancer cells9,11,12,13,14. BCL9 can be overexpressed in cancers and exhibits tumour-promoting effects in mouse xenograft models15. Mouse knockout studies have uncovered key roles of Bcl9 and Pygo2 in controlling β-catenin-dependent transcription of stem cell markers in normal intestinal crypts and neoplasias16, and in the mammary progenitor cell compartment17. Indeed, Pygo is one of the targets destabilized by a small-molecule kinase agonist6.

Here we focus on BCL9 and its interaction with β-catenin. We developed an ELISA-based 'plus–minus' assay to screen for small compounds that disrupt selectively the binding of β-catenin to BCL9 without affecting its binding to TCF. We thus identified a small group of chemically related natural compounds, one of which, carnosic acid (CA) from rosemary, acts in a dose-dependent manner to inhibit BCL9-β-catenin binding in vitro, and β-catenin-dependent transcription in colorectal cancer cells. Our biophysical analysis pinpointed a key element required for the CA response, namely a structurally labile α-helix (H1) at the amino terminus of the β-catenin Armadillo repeat domain (ARD), abutting the BCL9-binding site. We provide evidence that CA acts through H1 to exacerbate an intrinsic tendency of the ARD N-terminus to aggregate, thus attenuating in vitro binding to BCL9. In vivo, CA promotes selectively the proteasomal degradation of unphosphorylated β-catenin in an H1-dependent manner. H1 is thus an Achilles' Heel of β-catenin, and our discovery of a β-catenin-destabilizing compound provides proof-of-principle for new strategies to identify direct small-molecule inhibitors of oncogenic β-catenin.

ОбсуждениеМы описали "плюс-минус" экран, что привело к открытию розмарина соединения CA, который

ингибирует связывание β-катенин, чтобы BCL9 in vitroи что снижает уровень онкогенных β-катенин in vivo, таким образом ослабляя его транскрипционной выходы. Наш счетчик-экран позволил нам выделить общие chaotropic агентов из соединений, которые специфически влияют на HD2-ARD но не nTCF-ARD взаимодействия, которые оказались бесценными для отклонения неспецифические сетевиков, которые были распространены во всех трех экранов. Только три удара, которые пережили counter-экран вышел из Phytopure библиотека, предполагая, что натуральный продукт библиотек служить полезным источником соединений за нарушение белок-белковых взаимодействий. Эти Phytopure хиты привело нас к выявлению CA, основные фенольные дитерпены в листьев розмарина, экстракты (что составляет ~4% их сухого веса; см. также исх. 30). Вместе с CO, CA отвечает за антиоксидантную активность экстрактов розмарина31, который, по-видимому, объясняет их мощными противовоспалительными и анти-tumourigenic эффекты32, а также для нейропротективных эффектов CA в клеточной культуре и мозг мыши,33.

Наши ЯМР исследования определены β-катенин, как прямой молекулярной мишенью CA. Три линии доказательств, утверждают, что наблюдаемые in vitro влияние сертификации на R4 мог объяснить его in vivo воздействие на β-катенин. Во-первых, СА-индуцированного снижения клеточной β-катенин уровнях относительно быстрое и зависит от дозы, в соответствии с прямым ответом. Во-вторых, СК50s клеточной реакции CA перекрытия его Kя для вмешиваясь HD2-ARD привязки, его Kd для привязки к R4, и они находятся в пределах диапазона концентрации CA, которые способствуют in vitro агрегация R4. В-третьих, и самых важных, удаление H1 исключает CA реакции R4 in vitroи, что β-катенин in vivo. Эта превосходная корреляция между in vitro и in vivo эффекты CA согласуется с последним, отражая бывшего, который мы должны принять, чтобы быть ниже-учитывая, что ЦС может иметь дополнительные клеточные мишени, которые могут повлиять на β-катенин стабильности и выходы.

Наши биофизические данные позволяют предположить, что H1 содержит, или способствует, CA-связывающий участок R4, и, что ЦС действует через H1 обострить внутреннюю тенденцию ARD-N-terminus агрегировать. Учитывая, что H1 является внутренне неструктурированные19, и наши

47

доказательства от AUC для CA-индуцированной R4 изменение формы, возможно, что ЦС, на привязку к ARD-N-terminus, индуцирует конформационные изменения H1, который способствует агрегации. Действительно, CA может исправить H1 в конформации, что несовместимо с его складывания в спиральную структуру, необходимую для размещения HD2 (ref. 18; Доп. Фиг. S3), что бы объяснить, почему ЦС мешает HD2-ARD привязки. Напомним также, что ЦС не мешает ARD привязки к nTCF (преимущественно с участием остатков ниже R4 (ref. 34)), что также подтверждает тезис о том, что СА-индуцированного возмущения ограничены ARD-N-terminus.

В свете нашего in vitro замечания, мы предлагаем метастабильных H1 также предрасполагает β-катенин к низкой степени агрегации in vivo и что это усугубляется CA, которые могли бы выделить β-катенин для proteasomal деградации27,35 (фиг. 8). Эта модель может объяснить, почему фосфорилированных пула β-катенин (который в эпителиальных клетках включает junctional β-катенин)36,37 является огнеупорной.: CA: это β-катенин бассейн находится в комплексе с E-кадгерина, высоким сродством лиганда (с Kd ~в 100 раз ниже Kя для CA ингибирование)38 , что дает спиральную структуру на H1, и защищает его от CA торможения. Отметим также, что β-катенин связывается с Е-кадгерина co-поступательно39,40, что бы оградить его от H1-опосредованной CA эффекты от его de novo синтез.

Согласно нашей модели, H1 представляет собой Ахиллесову Пяту " β-катенин, который, в отсутствие лигандов, которые стабилизируют его структуру в спиральную конформацию,18,22,23, выделяет его для proteasomal оборота в клетки путем стимулирования локализованных структурных возмущений, которые способствуют низкой степени агрегации. В частности, бесструктурной H1 также находится в β-катенин других видов (Дополнительная Таблица S5), так что эта Ахиллесова пята-видимому, сохраняется. Возможно, эта функция служит в качестве последнего средства мечения механизм для предотвращения случайной активации β-катенин, если не связывать его негативных регуляторов. Действительно, H1-зависимых proteasomal деградации β-катенина может быть особенно важно, когда его негативные регуляторы ограничение скорости, или отсутствует-например, в колоректальных раковых клеток при дисфункциональных APC, и низкий E-кадгерина уровни37. Это может оказать онкогенных β-катенин особенно уязвимы и подвержены деградации, свойства, общие с другими онкогенов, стабильность которого зависит от шапероны, такие как HSP90 (refs 41,42).

BCL9 семейные белков трансфер в и из ядра43, и может, таким образом, передать β-катенин от цитоплазмы, хроматина, привязанный Pygo в ФТС-целевых генов44. Интересно, что избыток BCL9 защищает unphosphorylated β-катенин против CA-индуцированной деградации, возможно, путем поощрения спиральную структуру H1. BCL9, таким образом, может иметь шаперон-подобных ('пасут') роль в защите онкогенных β-катенин против H1-зависимой деградации. Отметим, что BCL9 является меньшим сродством лиганда β-катенин, по сравнению с Е-кадгерина, и может, таким образом, должны присутствовать на высоких уровнях, чтобы позволить себе защиту. BCL9 белки надэкспрессироанных в клеток колоректального рака и карциномы12,13,14,15 и, таким образом, может быть эффективным в защите онкогенных β-катенин против H1-зависимой деградации.

β-Катенин-это непривлекательный лекарственной мишенью, потому что его широкое взаимодействие поверхностей с ФТС и негативных регуляторов4. Наши открытия, Ахиллесова пята у его N-конца, и H1-зависимые составные дестабилизирующих онкогенных β-катенин, открыть возможности для нового экрана конструкций, таких как ингибирование R4 взаимодействие с другими 'пасут' лигандов β-катенин-аналог перспективной стратегии, направленной на подавление онкоген взаимодействий с их стабилизации шаперона HSP9042. Действительно, как свидетельствуют последние исследования с c-Myc45 обеспечение адресности внутренне неупорядоченных участков белков, таких как H1 формируется стратегия поиска лекарств46.

DiscussionWe described a 'plus–minus' screen that led to the discovery of the rosemary compound CA, which

inhibits the binding of β-catenin to BCL9 in vitro, and which reduces the levels of oncogenic β-catenin in vivo, thus attenuating its transcriptional outputs. Our counter-screen allowed us to distinguish general chaotropic agents from compounds that specifically affect the HD2-ARD but not the nTCF-ARD interaction, which proved invaluable to discard unspecific hitters, which were prevalent in all three screens. The only three hits that survived the counter-screen came from the Phytopure library, suggesting that natural

48

product libraries provide a useful source of compounds for disrupting protein–protein interactions. These Phytopure hits led us to identify CA, the major phenolic diterpene in rosemary leaf extracts (constituting ~4% of their dry weight; see also ref. 30). Together with CO, CA is responsible for the antioxidant activity of rosemary extracts31, which apparently accounts for their potent anti-inflammatory and anti-tumourigenic effects32, and also for the neuroprotective effects of CA in cell culture and mouse brains33.

Our NMR studies identified β-catenin as a direct molecular target of CA. Three lines of evidence argue that the observed in vitro effects of CA on R4 could explain its in vivo effects on β-catenin. First, the CA-induced reduction of the cellular β-catenin levels is relatively rapid and dose dependent, consistent with a direct response. Second, the IC50s of the cellular responses of CA overlap its Ki for interfering with HD2-ARD binding, its Kd for binding to R4, and they are within the range of CA concentrations that promote in vitro aggregation of R4. Third, and most important, deletion of H1 eliminates the CA response of R4 in vitro, and that of β-catenin in vivo. This excellent correlation between in vitro and in vivo effects of CA is consistent with the latter reflecting the former, which we shall take to be the case below—bearing in mind that CA could have additional cellular targets that might affect β-catenin stability and outputs.

Our biophysical data suggest that H1 contains, or contributes to, the CA-binding site of R4, and that CA acts through H1 to exacerbate an intrinsic tendency of the ARD N-terminus to aggregate. Given that H1 is intrinsically unstructured19, and our evidence from AUC for a CA-induced R4 shape change, it is conceivable that CA, on binding to the ARD N-terminus, induces a conformational change of H1, which favours aggregation. Indeed, CA may fix H1 in a conformation that is incompatible with its folding into the helical structure necessary for accommodating HD2 (ref. 18; Supplementary Fig. S3), which would explain why CA interferes with HD2-ARD binding. Recall also that CA does not interfere with ARD binding to nTCF (predominantly involving residues downstream of R4 (ref. 34)), further supporting the notion that the CA-induced perturbations are limited to the ARD N-terminus.

In the light of our in vitro observations, we propose that the metastable H1 also predisposes β-catenin to low-grade aggregation in vivo, and that this is exacerbated by CA, which could earmark β-catenin for proteasomal degradation27,35 (Fig. 8). This model could explain why the phosphorylated pool of β-catenin (which in epithelial cells includes junctional β-catenin)36,37 is refractory to CA: this β-catenin pool is complexed with E-cadherin, a high-affinity ligand (with a Kd of ~100 times below the Ki for CA inhibition)38 that confers a helical structure on H1, and protects it from CA inhibition. Note also that β-catenin associates with E-cadherin co-translationally39,40, which would safeguard it against H1-mediated CA effects from its de novo synthesis.

According to our model, H1 constitutes an Achilles' Heel of β-catenin, which, in the absence of ligands that stabilize its structure in a helical conformation18,22,23, earmarks it for proteasomal turnover in cells by promoting localized structural perturbations that favour low-grade aggregation. Notably, an unstructured H1 is also found in β-catenin of other species (Supplementary Table S5), so this Achilles' Heel appears to be conserved. Perhaps, this feature serves as a last-resort tagging mechanism to prevent fortuitous activation of β-catenin, should it fail to bind to its negative regulators. Indeed, H1-dependent proteasomal degradation of β-catenin could be particularly important when its negative regulators are rate limiting, or absent—for example, in colorectal cancer cells with dysfunctional APC, and low E-cadherin levels37. This may render oncogenic β-catenin particularly vulnerable and prone to degradation, a property shared by other oncogenes whose stability is reliant on chaperones such as HSP90 (refs 41,42).

BCL9 family proteins shuttle in and out of the nucleus43, and could thus convey β-catenin from the cytoplasm to chromatin-bound Pygo at TCF-target genes44. Interestingly, excess BCL9 protects unphosphorylated β-catenin against CA-induced degradation, possibly by promoting a helical structure of H1. BCL9 may thus have a chaperone-like ('shepherding') role in protecting oncogenic β-catenin against H1-dependent degradation. We note that BCL9 is a lower-affinity ligand of β-catenin compared with E-cadherin, and may thus need to be present at high levels to afford protection. BCL9 proteins are overexpressed in colorectal cancer cells and carcinomas12,13,14,15 and may thus be effective in safeguarding oncogenic β-catenin against H1-dependent degradation.

β-Catenin is an unattractive drug target, because of its extensive interaction surfaces with TCF and negative regulators4. Our discoveries of an Achilles' Heel at its N-terminus, and of a H1-dependent compound destabilizing oncogenic β-catenin, open up avenues for new screen designs, such as inhibiting

49

R4's interaction with other 'shepherding' ligands of β-catenin—similar to a promising strategy aimed at inhibiting oncogene interactions with their stabilizing HSP90 chaperone42. Indeed, as exemplified by a recent study with c-Myc45, the targeting of intrinsically disordered stretches of proteins such as H1 is an emerging strategy in drug discovery46.

Antiproliferation эффект розмарина (Rosmarinus officinalis) на овариальный рак клеток in vitro.Розмарин (Rosmarinus officinalis L.) - это популярная кулинария/лечебные травы. Недавние

исследования показали, что он имеет Фармакологическое деятельности для рака химиопрофилактики и терапии. В этом исследовании оценивали antiproliferation деятельности экстракт розмарина (RE) против человеческих яичников, раковых клеток, и является ли экстракт и три его основные активные ингредиенты carnosol (CS), carnosic кислоты (CA) и розмариновой кислоты (RA) может повысить antiproliferation деятельности цисплатин (CDDP). Наше исследование показало, что ре имеет значительный antiproliferation деятельности на овариальный рак A2780 и CDDP упорная дочь клеточной линии A2780CP70, с IC(50) (50% ингибирующая концентрация) оценивается в 1/1000 и 1/400 разведениях соответственно. RE повысила antiproliferation эффект с CDDP на обоих A2780 и A2780CP70 клеток. Клеток A2780 были последовательно более чувствительны к CS, CA, RA, чем A2780CP70 клеток между 2.5 и 20μg/мл. CS и ра также свидетельствуют о синергизме antiproliferation эффект с CDDP на A2780 клеток в какой-то концентрации. RE обработанной методом ультрафильтрации, диализа и удаления фенолов потерял antiproliferation деятельности предположил, что активность находится в фенольных смол с MW<1000Da. Апоптоз массива исследование клеток A2780, получавших повторно показали, что экспрессия ряда генов, регулирующих апоптоз были модулируются лечения. Это исследование показало, что повторное ингибирует пролиферацию яичников раковые клеточные линии, воздействуя на клеточный цикл в несколько этапов. Это индуцированного апоптоза путем изменения экспрессии нескольких генов, регулирующих апоптоз, и имеет потенциал в качестве дополнения к рака химиотерапия.

Phytomedicine. 2012 Mar 15;19(5):436-43. doi: 10.1016/j.phymed.2011.12.012. Epub 2012 Feb 9.Antiproliferation effect of Rosemary (Rosmarinus officinalis) on human ovarian cancer cells in vitro.Tai J1, Cheung S, Wu M, Hasman D. 1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Child and Family Research Institute, University

of British Columbia, Canada. jtai@mail.ubc.caRosemary (Rosmarinus officinalis L.) is a popular culinary/medicinal herb. Recent studies have shown it

has pharmacologic activities for cancer chemoprevention and therapy. This study evaluated the antiproliferation activity of rosemary extract (RE) against human ovarian cancer cells, and whether the extract and its three main active ingredients carnosol (CS), carnosic acid (CA) and rosmarinic acid (RA) can enhance the antiproliferation activity of cisplatin (CDDP). Our study showed that RE has significant antiproliferation activity on human ovarian cancer A2780 and its CDDP resistant daughter cell line A2780CP70, with IC(50) (50% inhibitory concentration) estimated at 1/1000 and 1/400 dilutions respectively. RE enhanced the antiproliferation effect with CDDP on both A2780 and A2780CP70 cells. A2780 cells were consistently more sensitive to CS, CA, and RA than A2780CP70 cells between 2.5 and 20μg/ml. CS and RA also showed synergistic antiproliferation effect with CDDP on A2780 cells at some concentrations. RE treated by ultrafiltration, dialysis, and removal of phenolics lost the antiproliferation activity suggested that the activity resides in phenolics with MW<1000Da. Apoptosis array study of A2780 cells treated with RE showed that the expression of a number of genes regulating apoptosis were modulated by the treatment. This study showed that RE inhibited the proliferation of ovarian cancer cell lines by affecting the cell cycle at multiple phases. It induced apoptosis by modifying the expression of multiple genes regulating apoptosis, and holds potential as an adjunct to cancer chemotherapy.

Carnosic кислота ингибирует пролиферацию и миграцию потенциала человека колоректального рака клеток.

Колоректальный рак (КРР) является третьим наиболее распространенных злокачественных новообразований во всем мире. Целью данного исследования было изучить вопрос carnosic кислоты (CA), основного антиоксидантного соединения Rosmarinus officinalis Л., будет подавлять

50

жизнеспособность клеток трех CRC клеточных линий: Caco-2, HT29 и Лово в зависимости от дозы, с IC₅₀ значения в диапазоне за 24-96 мкм. CA-индуцированной гибели клеток путем апоптоза в Caco-2 линии после 24 ч лечения и ингибировали адгезию клеток и миграции, возможно, за счет снижения активности секретируемых протеаз, такие как активатора плазминогена урокиназы (uPA) и металлопротеиназы (MMPs). Эти эффекты могут быть связаны через механизм связанных с ингибированием ЦОГ-2 пути, потому что мы определили, что CA downregulates экспрессии ЦОГ-2 в клетках Caco-2, как на уровне мРНК и белка. Поэтому, CA модулирует различные цели-участие в разработке КПР. Эти результаты указывают на то, что carnosic кислота может иметь противоопухолевой активностью и могут быть полезны как роман химиотерапевтического агента.

Oncol Rep. 2012 Apr;27(4):1041-8. doi: 10.3892/or.2012.1630. Epub 2012 Jan 11.Carnosic acid inhibits the proliferation and migration capacity of human colorectal cancer cells.Barni MV1, Carlini MJ, Cafferata EG, Puricelli L, Moreno S.Author information 1Foundation Institute Leloir, IIBBA-CONICET, CABA 1405 Buenos Aires, Argentina.AbstractColorectal cancer (CRC) is the third most common malignant neoplasm worldwide. The objective of this

study was to examine whether carnosic acid (CA), the main antioxidant compound of Rosmarinus officinalis L., would inhibit the cell viability of three CRC cell lines: Caco-2, HT29 and LoVo in a dose-dependent manner, with IC₅₀ values in the range of 24-96 µM. CA induced cell death by apoptosis in Caco-2 line after 24 h of treatment and inhibited cell adhesion and migration, possibly by reducing the activity of secreted proteases such as urokinase plasminogen activator (uPA) and metalloproteinases (MMPs). These effects may be associated through a mechanism involving the inhibition of the COX-2 pathway, because we have determined that CA downregulates the expression of COX-2 in Caco-2 cells at both the mRNA and protein levels. Therefore, CA modulates different targets involved in the development of CRC. These findings indicate that carnosic acid may have anticancer activity and may be useful as a novel chemotherapeutic agent.

ОбсуждениеRosmarinus officinalisL.-лекарственное растение с повышенным содержанием антиоксидантные полифенолы, как СА и

ра. В настоящем исследовании мы продемонстрировали в человеческой CRC клеточных линий антипролиферативное и апоптотические эффекты CA, а также его ингибирующее действие на другие признаки прогрессии опухоли, такие как Миграция и адгезия.

Хотя РА и СА были способны подавлять рост клеток различной степени; CA был самый активный полифенол с момента его антипролиферативное действие сопровождалось существенным доза-зависимой цитотоксичности в три CRC линий проверил: Лово, HT29 и Caco-2 с различным генетическим фоном. В Caco-2 клеточной линии, мы показали, что в IC CA50 (92.1 мкм) был связан с индукцией апоптоза, о чем свидетельствует транслокации отличается в плазматической мембране (Рис. 3A), конденсации хроматина, и потеря нормальной ядерной архитектуре (Рис. 3B). Другие авторы описали, что CA ингибирует синтез ДНК на клетках Caco-2 в 23 мкм, используя [3H]инкорпорации тимидина анализа и переходных арест клеточного цикла в G2/M фазе с 50 мкм CA (25). В антипролиферативным действием СА (2.5-10 мкм) была также сообщил о HL-60 и U937 человека миелоидных лейкозных клеток отнести к ингибированию клеточного цикла при кратковременной блокировки в фазе G1 (14), в то время как другое исследование с HL-60 клеток сообщили, что высокие дозы CA (100 мкм) индуцирует апоптоз, связанный с активацией каспазы-9 и -3 (26). Мы обнаружили, что в клетках Caco-2, арестован в G2/M после инкубации с RE, содержащий приблизительно 30 мкм CA (данные не показаны).

Инвазия опухоли требует деградации базальной мембраны (БМ), который отделяет эпителиальных и мезенхимальных клеточных компартментах, и состоит из макромолекул, таких как коллаген, ламинин, и гепарансульфата. Ряд протеолитических ферментов, в том числе Мгэс и сериновых протеиназ, участвующих в деградации БМ. В частности, активации ММП-2 и ММП-9 играют важную роль в БМ деградации из-за их способности расщеплять коллаген. Среди сериновых протеиназ, урокиназа типа активатора плазминогена (УПА), которая вызывает протеолиз каскад,

51

ускоряя превращение плазминогена в плазмина, важно для инвазивности опухоли и метастазов и его экспрессия увеличивается при солидных опухолях. Плазмина может ухудшить фибрин, фибронектин, протеогликаны, ламинин найти в окружающие опухоль матрицы, активация коллагеназы и косвенно ухудшает коллагенов (27). Мы определили, что ЦС имеет ингибирующее действие на Caco-2 клеточной адгезии для коллагена I типа и фибронектина поверхностях (Рис. 4A и B). Кроме того, мы зафиксировали ингибирование распространения и pseudopodial расширение клетки предварительно обрабатывают IC CA50 (Рис. 4C). Тем не менее, дополнительные эксперименты, будет необходимо точно определить базовый механизм.

Опухолевые клетки миграции необходимо на первой ступени метастатического каскада, когда раковые клетки покидают первичную опухоль и получить доступ к циркуляции, а также при злокачественных клеток extravasate в паренхиме вторичной сайта. Опухолевые клетки имеют подвижных ответ на многие агенты, в том числе хост, производный от моторики и факторы роста, компоненты ECM, и опухоль-секретируемых факторов. В этом исследовании мы показали wound healing assay, что ЦС может препятствовать Caco-2 миграции клеток в зависимости от дозы образом (Рис. 5). Ингибирование миграции (50%) был достигнут в 48 мкм CA, примерно половина IC CA50 дозу. Кроме того, мы обнаружили, что при одинаковых концентрациях CA снижает активность важных ECM-унижающих достоинство видов протеаз, как uPA, MMP-9 и MMP-2, которые тесно связаны с опухолевой прогрессией. Наши результаты показывают, что CA лечение после 24 ч сократилось Caco-2 обусловлена СМИ деятельности УПА и ММП-9 и ММП-2.

Природных соединений в качестве потенциальных ингибиторов ключевых клеточных сигнальных путей, таких как ЦОГ-2 получили много внимания и терапевтических режимов либо соединений, по отдельности или в комбинации с существующими химиотерапевтические агенты были исследованы (28). Экспрессия ЦОГ-2 участвует в опухоли во время акции CRC прогрессии (23,29-31). Мы определили, что CA downregulates экспрессии ЦОГ-2 в клетках Caco-2, на обоих уровней мРНК и белка (Рис. 7A и B). Интересно отметить, что ЦОГ-1 мРНК уровень не влияет CA. Экспрессия ЦОГ-2 белка был снижен примерно в 2-3 раза после лечения с IC50 доза CA. Таким образом, ингибирующее рост действие ЦС могут быть опосредованы через механизм, который, возможно, сопровождается ингибированием ЦОГ-2 пути.

Клиническое значение этого эффекта заключается в том, что ЦС мог бы предложить терапевтический эффект нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) (30) с пониженной токсичностью на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта.

В заключение мы показали, что CA угнетал Caco-2 рост клеток путем индукции апоптоза и снижение адгезии, миграции и протеолитической активности ферментов, наиболее вероятно, снижение экспрессии ЦОГ-2 мРНК выражение. Коллективно, наши результаты показывают, что ЦС может модулировать различные цели, участвующих в пролиферации и апоптоза пути. Эти результаты указывают на то, что ЦС может служить химические и/или химиотерапевтическое средство против рака прямой кишки прогресса.

DiscussionRosmarinus officinalisL. is a medicinal plant with an elevated content of anti-oxidant polyphenols as CA and RA. In the present

study, we demonstrated in human CRC cell lines the antiproliferative and apoptotic effects of CA as well as its inhibitory effect on other hallmarks of tumor progression such as migration and adhesion.

Although RA and CA were capable of suppressing cell growth to different degree; CA was the most active polyphenol since its antiproliferative effect was accompanied by substantial dose-dependent cytotoxicity in the three CRC lines examined: LoVo, HT29 and Caco-2 with different genetic backgrounds. In Caco-2 cell line, we showed that CA at IC50 (92.1 μM) was associated with induction of apoptosis, as evidenced by the translocation of phosphatidylserine in the plasma membrane (Fig. 3A), chromatin condensation, and loss of normal nuclear architecture (Fig. 3B). Other authors have described that CA inhibits DNA synthesis on Caco-2 cells at 23 μM using [3H]thymidine incorporation assay, and transient cell cycle arrest in G2/M phase with 50 μM CA (25). The antiproliferative effect of CA (2.5–10 μM) was also reported on HL-60 and U937 human myeloid leukemia cells attributed to inhibition of cell cycle progression with a transient blockage in the G1 phase (14), while another study with HL-60 cell reported that a high dose of CA (100

52

μM) induces apoptosis associated with activation of caspase-9 and -3 (26). We found that Caco-2 cells are arrested in G2/M after incubation with a RE containing approximately 30 μM of CA (data not shown).

Tumor invasion requires degradation of basement membranes (BM), which separates the epithelial and mesenchymal cell compartments, and is composed of macromolecules such as collagen, laminin, and heparan sulfate. A number of proteolytic enzymes, including MMPs and serine proteases, are involved in the degradation of the BM. In particular, activated MMP-2 and MMP-9 play an important role in BM degradation because of their ability to cleave collagen. Among serine proteases, the urokinase type plasminogen activator (uPA), which triggers a proteolysis cascade by accelerating the conversion of plasminogen into plasmin, is important for tumor invasiveness and metastasis and its expression is increased in solid tumors. Plasmin can degrade fibrin, fibronectin, proteoglycans, and laminin found in the tumor-surrounding matrix, activates collagenases and indirectly degrades collagens (27). We determined that CA has an inhibitory effect on Caco-2 cell adhesion to type I collagen and fibronectin surfaces ( Fig. 4A and B). In addition, we documented the inhibition of spreading and pseudopodial extension of cells pre-treated with CA IC50 (Fig. 4C). Nevertheless, additional experiments will be required to identify the precise underlying mechanism.

Tumor cell migration is necessary at the first steps of the metastatic cascade, when cancer cells leave the primary tumor and gain access to the circulation, and also when malignant cells extravasate into the parenchyma of the secondary site. Tumor cells have a motile response to many agents, including host-derived motility and growth factors, ECM components, and tumor-secreted factors. In this study, we demonstrated by the wound healing assay that CA can inhibit Caco-2 cell migration in a dose-dependent manner (Fig. 5). Migration inhibition (50%) was reached at 48 μM of CA, approximately half the CA IC50

dose. Moreover, we found that at identical concentrations CA decreases the activity of important ECM-degrading proteases, as uPA, MMP-9 and MMP-2 which are closely associated with tumor progression. Our results show that CA treatment after 24 h decreased Caco-2 conditioned media uPA activity and MMP-9 and MMP-2.

Natural compounds as potential inhibitors of key cell signaling pathways such as COX-2 have gained much attention and therapeutic regimens with either the compounds alone or in combination with existing chemotherapeutic agents have been investigated (28). The expression of COX-2 is involved in tumor promotion during CRC progression (23,29-31). We have determined that CA downregulates the expression of COX-2 in Caco-2 cells at both mRNA and protein levels (Fig. 7A and B). Interestingly, COX-1 mRNA level was not affected by CA. The expression of COX-2 protein was reduced about 2-3-fold after the treatment with the IC50 dose of CA. Therefore, the growth inhibitory effect of CA may be mediated through a mechanism that probably involves inhibition of the COX-2 pathway.

The clinical importance of this effect lies in the fact that CA could offer therapeutic benefits of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) (30) with reduced toxicity to the gastrointestinal mucosa.

In conclusion, we have demonstrated that CA inhibited Caco-2 cell growth by inducing apoptosis and reducing adhesion, migration and proteolytic enzyme activities, most probably by downregulation of COX-2 mRNA expression. Collectively, our results suggest that CA might modulate different targets involved in proliferation and apoptotic pathways. These findings indicate that CA may serve as chemopreventive and/or chemotherapeutic agent against colorectal cancer progress.

Анти-ангиогенные свойства carnosol и carnosic кислоты, двух основных пищевых веществ из розмарина.

Использование розмарина (Rosmarinus officinalis) листьев и их составляющих, в качестве источника пищевых антиоксидантов и ароматизаторов постоянно растет. Carnosol и carnosic кислоты, из двух основных компонентов из экстрактов розмарина, показали активность для рака профилактика и терапия.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: В этом исследовании мы исследуем и цитотоксических анти-ангиогенных деятельности carnosol и

carnosic кислоты, чтобы получить дальнейшее понимание механизма их действия.

53

Результаты: Наши результаты показывают, что указанные дитерпены ингибируют определенные функции

эндотелиальных клеток, а именно, дифференцировки, пролиферации, миграции и протеолитической способностью. Наши данные указывают на то, что их рост-ингибирующее действие, оказываемое на пролиферирующих эндотелиальных и опухолевых клеток, может быть обусловлено, по крайней мере, в части, индукции апоптоза. Ингибирование указанных важные этапы ангиогенеза in vitro соглашается с наблюдается ингибирование ангиогенеза in vivo, обоснованных с помощью чик хориоаллантоисной мембране анализа.

Выводы: Анти-ангиогенных деятельности carnosol и carnosic кислоты может способствовать химические,

противоопухолевой и антиметастатической активностью экстракты розмарина и предлагает их потенциал в лечении других ангиогенеза, связанных с злокачественными новообразованиями.

Eur J Nutr. 2013 Feb;52(1):85-95. doi: 10.1007/s00394-011-0289-x. Epub 2011 Dec 16.Anti-angiogenic properties of carnosol and carnosic acid, two major dietary compounds from

rosemary.López-Jiménez A1, García-Caballero M, Medina MÁ, Quesada AR.Author information 1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Faculty of Sciences, University of Málaga,

29071, Málaga, Spain.The use of rosemary (Rosmarinus officinalis) leaves and their constituents as a source of dietary

antioxidants and flavoring agents is continuously growing. Carnosol and carnosic acid, two major components of rosemary extracts, have shown activity for cancer prevention and therapy.

AIM OF THE STUDY: In this study, we investigate the cytotoxic and anti-angiogenic activities of carnosol and carnosic acid, in

order to get further insight into their mechanism of action.RESULTS: Our results demonstrate that the mentioned diterpenes inhibit certain functions of endothelial cells,

namely, differentiation, proliferation, migration and proteolytic capability. Our data indicate that their growth inhibitory effect, exerted on proliferative endothelial and tumor cells, could be due to, at least in part, an induction of apoptosis. Inhibition of the mentioned essential steps of in vitro angiogenesis agrees with the observed inhibition of the in vivo angiogenesis, substantiated by using the chick chorioallantoic membrane assay.

CONCLUSIONS: The anti-angiogenic activity of carnosol and carnosic acid could contribute to the chemopreventive,

antitumoral and antimetastatic activities of rosemary extracts and suggests their potential in the treatment of other angiogenesis-related malignancies.

Регуляция NF-E2, связанных с фактором-2-зависимой глутатион, carnosol провоцирует цитопротекторный ответ и повышает выживаемость клеток.

Исследовать, является ли глутатиона (GSH) повышенный через Nrf-2 активации участвует в цитопротективные эффекты carnosol в клетки HepG2.

Методы: Человеческой клеточной линии гепатомы HepG2 были подвержены rosemarry эфирное масло или

carnosol. Жизнеспособность клеток измеряли с использованием Alamar blue анализа. Производство внутриклеточного GSH определяли с использованием monochlorobimane. Уровень белка или мРНК была обследована с помощью Вестерн-блоттинга или от-ПЦР, соответственно.

Результаты: Rosemarry эфирное масло (0,005%на -0.02%) и carnosol (5 и 10 моль/л) увеличение

внутриклеточного GSH уровней и ГШ синтез субъединицы фермента курс gclc/GCLM выражение. Эфирное масло розмарина и carnosol увеличение ядерного накопления, регулируемый белком nrf2 и расширенный, регулируемый белком nrf2-antioxidant responsive element (являются)-репортер

54

деятельности. Трансфекция обработанных клетках с регулируемый белком nrf2 siRNA строительстве энергоблоков курс gclc/GCLM индукции. Кроме того, предобработка клеток HepG2 с эфирным маслом и carnosol оказывал существенное цитопротективные эффекты от H(2)O(2) или алкоголя. В TNFα-обработанных клетках, ядерной транслокации и транскрипционной активности NF-b был упразднен в течение 12 ч после carnosol предварительной обработки. Cotreatment с ГШ также подавляются NF-b ядерных транслокации, в то время как cotreatment с BSO, ГШ блокатор синтеза, заблокировали ингибирующее влияние carnosol.

Вывод: Это исследование продемонстрировало, что регулируемый белком nrf2 участвует в

цитопротекторный эффекты, carnasol, которые были, по крайней мере, частично опосредуется через увеличение ГШ биосинтеза.

Acta Pharmacol Sin. 2011 Jan;32(1):62-9. doi: 10.1038/aps.2010.181. Epub 2010 Dec 13.Upregulation of NF-E2-related factor-2-dependent glutathione by carnosol provokes a cytoprotective

response and enhances cell survival.Chen CC1, Chen HL, Hsieh CW, Yang YL, Wung BS.Author information 1Department of Neurology, Saint Martin De Porres Hospital, Chiayi, Taiwan, China.To explore whether glutathione (GSH) increased through Nrf-2 activation is involved in the

cytoprotective effects of carnosol in HepG2 cells.METHODS: Human hepatoma cell line HepG2 were exposed to rosemarry essential oil or carnosol. Cell viability was

measured using an Alamar blue assay. The production of intracellular GSH was determined using monochlorobimane. The level of protein or mRNA was examined by Western blotting or RT-PCR, respectively.

RESULTS: Rosemarry essential oil (0.005%-0.02%) and carnosol (5 and 10 mol/L) increased the intracellular GSH

levels and GSH synthesis enzyme subunit GCLC/GCLM expression. Rosemary essential oil and carnosol increased nuclear accumulation of Nrf2 and enhanced Nrf2-antioxidant responsive element (ARE)-reporter activity. Transfection of the treated cells with an Nrf2 siRNA construct blocks GCLC/GCLM induction. Furthermore, pretreatment of the HepG2 cells with essential oil and carnosol exerted significant cytoprotective effects against H(2)O(2) or alcohol. In TNFα-treated cells, the nuclear translocation and transcriptional activity of NF-κB was abolished for 12 h following carnosol pretreatment. Cotreatment with GSH also suppressed NF-κB nuclear translocation, whereas cotreatment with BSO, a GSH synthesis blocker, blocked the inhibitory effects of carnosol.

CONCLUSION: This study demonstrated that Nrf2 is involved in the cytoprotective effects by carnasol, which were at

least partially mediated through increased GSH biosynthesis.

Rosmanol мощно индуцирует апоптоз посредством митохондриального пути апоптоза и гибели рецепторов в пути аденокарциномы толстой кишки человека COLO 205 клеток.

Розмарин (Rosmarinus officinalis), кулинарных специй и лекарственных трав, широко используется в Европейской народной медицине для лечения многочисленных недугов. Многие исследования показали, что экстракты розмарина играют важную роль в анти-воспалительные, анти-опухоли и борьбы с распространением в различных in vitro и in vivo настройки. Роли подавления опухоли розмарина были отнесены к основным компонентам, в том числе carnosic кислоты, carnosol, и розмариновой кислоты, rosmanol, и урсоловая кислоты. Данного исследования было изучить влияние rosmanol на рост COLO 205 человеческой колоректальной аденокарциномы клеток и определить основные механизмы. Когда, обработанных 50 мкм rosmanol на 24 часа, COLO 205 ячеек, которые отображаются в сильной апоптоз-индуцирующего ответ с 51% апоптотических соотношение (IC(50) ∼42 мкм). Rosmanol увеличение экспрессии Fas и FasL, привело к расщепление и активацию про-каспазы-8 и Bid, и мобилизовать Bax из цитозоля в митохондрии. Взаимной активации между

55

tBid и Бад снизился на мембранный потенциал митохондрий и выпустила цитохрома c и апоптоз-индуцирующего фактора (AIF) в цитозоле. В свою очередь, цитохрома c индуцированной обработки про-каспазы-9 и про-каспазы-3, затем расщепление поли-(ADP-рибоза) полимеразы (PARP) и фактор фрагментации ДНК (DFF-45). Эти результаты показывают, что rosmanol-индуцированного апоптоза в клетках COLO 205 является привлечение активации каспаз и с привлечением сложной регуляции, как митохондриального пути апоптоза и смерти рецепторному пути.

Food Chem Toxicol. 2011 Feb;49(2):485-93. doi: 10.1016/j.fct.2010.11.030. Epub 2010 Nov 26.Rosmanol potently induces apoptosis through both the mitochondrial apoptotic pathway and death

receptor pathway in human colon adenocarcinoma COLO 205 cells.Cheng AC1, Lee MF, Tsai ML, Lai CS, Lee JH, Ho CT, Pan MH.Author information 1Department of Nutrition and Health Sciences, Chang Jung Christian University, Tainan, Taiwan.

anniecheng@mail.cjcu.edu.twAbstractRosemary (Rosmarinus officinalis), a culinary spice and medicinal herb, has been widely used in European

folk medicine to treat numerous ailments. Many studies have shown that rosemary extracts play important roles in anti-inflammation, anti-tumor, and anti-proliferation in various in vitro and in vivo settings. The roles of tumor suppression of rosemary have been attributed to the major components, including carnosic acid, carnosol, and rosmarinic acid, rosmanol, and ursolic acid. This study was to explore the effect of rosmanol on the growth of COLO 205 human colorectal adenocarcinoma cells and to delineate the underlying mechanisms. When treated with 50 μM of rosmanol for 24h, COLO 205 cells displayed a strong apoptosis-inducing response with a 51% apoptotic ratio (IC(50) ∼42 μM). Rosmanol increased the expression of Fas and FasL, led to the cleavage and activation of pro-caspase-8 and Bid, and mobilized Bax from cytosol into mitochondria. The mutual activation between tBid and Bad decreased the mitochondrial membrane potential and released cytochrome c and apoptosis-inducing factor (AIF) to cytosol. In turn, cytochrome c induced the processing of pro-caspase-9 and pro-caspase-3, followed by the cleavage of poly-(ADP-ribose) polymerase (PARP) and DNA fragmentation factor (DFF-45). These results demonstrate that the rosmanol-induced apoptosis in COLO 205 cells is involvement of caspase activation and involving complicated regulation of both the mitochondrial apoptotic pathway and death receptor pathway.

Фенольные дитерпены, полученных из Hyptis incana индуцировать апоптоз и G(2)/M ареста клеток нейробластомы.

Нейробластома-одна из наиболее распространенных солидных опухолей в детской возрастной группе, и прогноз у больных с расширенным нейробластома-это очень плохо. В данном исследовании противоопухолевого эффектов пять фенольные дитерпены, полученных из Hyptis incana (Lamiaceae), Бразильский лекарственных растений, были рассмотрены на клетки нейробластомы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ: Цитотоксичность оценивали по 3-(4,5-dimethylthiazol-2-ил)-2,5-diphenyltetrazolium бромид (МТТ)

анализа. Apoptotic ядерной усадки следили Hoechst 33342 окрашивание. Клеточного цикла, статус оценивали методом проточной цитометрии и белок изменения контролировались с помощью вестерн-блоттинга. Дифференцированные клетки были сфотографированы и учитываются в рандомизированном моды.

Результаты: Всех исследуемых соединений выставлены значительную цитотоксичность в отношении клеток

нейробластомы. В частности, 7-ethoxyrosmanol имела высокую степень эффективности. Ядерной конденсации и деградации procaspase-3 и -9 наблюдались после лечения клетки этих соединений. Кроме того, фенольные дитерпены индуцированного клеточного цикла, арест в G(2)/M фазе. Rosmanol и epirosmanol, как правило, индуцируют дифференцировку.

56

Вывод: Фенольные дитерпены изолирован от H. incana иметь несколько противоопухолевое действие на

клетки нейробластомы.Anticancer Res. 2012 Nov;32(11):4781-9.Phenolic diterpenes derived from Hyptis incana induce apoptosis and G(2)/M arrest of neuroblastoma

cells.Tabata K1, Kim M, Makino M, Satoh M, Satoh Y, Suzuki T.Author information 1Laboratory of Clinical Medicine, School of Pharmacy, Nihon University, 7-7-1 Narashinodai,

Funabashi, Chiba, 274-8555, Japan. tabata.keiichi@nihon-u.ac.jpNeuroblastoma is one of the most commonly encountered solid tumors in the pediatric age group, and

the prognosis of patients with advanced neuroblastoma is very poor. In this study, the antitumor effects of five phenolic diterpenes derived from Hyptis incana (Lamiaceae), a Brazilian medicinal plant, were examined on neuroblastoma cells.

MATERIALS AND METHODS: Cytotoxicity was assessed by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)

assay. Apoptotic nuclear shrinkage was monitored by Hoechst 33342 staining. The cell-cycle status was evaluated by flow cytometry and protein alterations were monitored by western blotting. Differentiated cells were photographed and counted in a randomized fashion.

RESULTS: All of the examined compounds exhibited significant cytotoxicity towards the neuroblastoma cells. In

particular, 7-ethoxyrosmanol had a high degree of efficacy. Nuclear condensation and degradation of procaspase-3 and -9 were observed after treatment of the cells with these compounds. Moreover, phenolic diterpenes induced cell-cycle arrest in the G(2)/M phase. Rosmanol and epirosmanol tended to induce differentiation.

CONCLUSION: Phenolic diterpenes isolated from H. incana have multiple antitumor effects on neuroblastoma cells.

Антиоксидантные свойства фенольные дитерпены от Rosmarinus officinalis.Исследовать ингибирование потенциал carnosol, rosmanol, и epirosmanol, которые являются

фенольные дитерпены от Rosmarinus officinalis, окисленных липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) образование в крови человека и выявления их очистку деятельности, липидов, свободных радикалов и супероксид-аниона в условиях in vitro.

Методы: Антиоксидантная деятельности, которые были высказаны с inhibilities липидов, свободных

радикалов в мембранных липидов клеток и окисленных ЛПНП формирование оценивали надольник л анализа и метода ЭПР. Торможение на Cu2+-опосредованное окисление apo B в формировании ЛПНП исследовали методом флуоресцентной спектроскопии.

Результаты: Carnosol, rosmanol, и epirosmanol было ингибирующей активности перекисного окисления липидов

и окисленных apo B в формировании человеческой крови ЛПНП. С IC50 были 7-10 micromol/Л. антиоксидантный механизм, связанных с очисткой деятельности липидов, свободных радикалов.

Вывод: carnosol, rosmanol, и epirosmanol показал, активность, ингибируя окисление ЛНП.Acta Pharmacol Sin. 2001 Dec;22(12):1094-8.Antioxidant properties of phenolic diterpenes from Rosmarinus officinalis.Zeng HH1, Tu PF, Zhou K, Wang H, Wang BH, Lu JF.Author information 1School of Pharmaceutical Science, The State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs,

Peking University, Beijing 100083, China.

57

To investigate the inhibition capacities of carnosol, rosmanol, and epirosmanol, which are phenolic diterpenes from Rosmarinus officinalis, to oxidized low-density lipoprotein (LDL) formation in human blood and detect their scavenging activities to lipid free radical and superoxide anion in vitro.

METHODS: The antioxidant activities which were expressed with the inhibilities to lipid free radicals in the

membrane lipid of cell and oxidized LDL formation were evaluated by TBARS assay and ESR method. The inhibition on the Cu2+-mediated oxidization of apo B formation in LDL was investigated by fluorescence spectroscopy.

RESULTS: Carnosol, rosmanol, and epirosmanol had an inhibitory activity to lipid peroxidation and oxidized apo B

formation in human bloods LDL. The IC50 were 7-10 micromol/L. The antioxidant mechanism was related to the scavenging activities to lipid free radical.

CONCLUSION: carnosol, rosmanol, and epirosmanol showed the activity in inhibiting LDL oxidation.

Rosmarinus officinalis essential oil: антипролиферативным, антиоксидантным и антибактериальным деятельности.

Целью данной работы было изучение и сравнение антипролиферативным, антиоксидантным и антибактериальным деятельности Rosmarinus officinalis essential oil, родом из Пакистана. Эфирное масло Контента из листьев R. officinalis был 0.93 g 100г(-1). ГЖХ и ГХ-МС анализ показал, что основными компонентами, определенными в R. officinalis essential oil были 1,8-цинеол (38.5%), камфора (17.1%), α-пинен (12.3%), лимонен (6.23%), камфен (6.00%) и линалоол (5.70%). В антипролиферативное деятельности была апробирована в отношении двух рак (MCF-7 и LNCaP) и один фибробластов клеточной линии (NIH-3T3) с помощью МТТ-теста, в то время как, антиоксидантную активность оценивали по сокращению 2, 2-дифенил-1-picryl hydrazyl (DPPH) и измерения процента ингибирования перекисного окисления линолевой кислоты системы. Диск диффузии и модифицированных resazurin пластиковые пластины, анализы были использованы для оценки ингибирования зон (ПЗ) и минимальной ингибирующей концентрации (MIC) R. officinalis essential oil, соответственно. Она заключается из результатов, Rosmarinus officinalis эфирное масло выставлены антипролиферативным, антиоксидантным и антибактериальным деятельности.

Braz J Microbiol. 2010 Oct;41(4):1070-8. doi: 10.1590/S1517-838220100004000027. Epub 2010 Dec 1.Rosmarinus officinalis essential oil: antiproliferative, antioxidant and antibacterial activities.Hussain AI1, Anwar F, Chatha SA, Jabbar A, Mahboob S, Nigam PS.Author information 1Department of Chemistry, Government College University , Faisalabad , Pakistan ; Centre of

Molecular Biosciences, Institute of Biomedical Sciences Research, University of Ulster , Coleraine, BT52 1SA , UK.

AbstractThe aim of this work was to investigate and compare the antiproliferative, antioxidant and antibacterial

activities of Rosmarinus officinalis essential oil, native to Pakistan. The essential oil content from the leaves of R. officinalis was 0.93 g 100g(-1). The GC and GC-MS analysis revealed that the major components determined in R. officinalis essential oil were 1,8-cineol (38.5%), camphor (17.1%), α-pinene (12.3%), limonene (6.23%), camphene (6.00%) and linalool (5.70%). The antiproliferative activity was tested against two cancer (MCF-7 and LNCaP) and one fibroblast cell line (NIH-3T3) using the MTT assay, while, the antioxidant activity was evaluated by the reduction of 2, 2-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH) and measuring percent inhibition of peroxidation in linoleic acid system. The disc diffusion and modified resazurin microtitre-plate assays were used to evaluate the inhibition zones (IZ) and minimum inhibitory concentration (MIC) of R. officinalis essential oil, respectively. It is concluded from the results that Rosmarinus officinalis essential oil exhibited antiproliferative, antioxidant and antibacterial activities.

58

Ингибирующее влияние экстрактов розмарина, carnosic кислоты и розмариновой кислоты на рост различных человеческих раковых клеточных линий.

Листьев Rosmarinus officinalis собрано из трех разных местах Турции, были извлечены оба метанольного и сверхкритической CO(2) экстракции. Впоследствии, шесть экстрактов и активных веществ, carnosic кислоты, розмариновой кислоты были применены для различных человеческих раковых клеточных линий, в том числе NCI-H82 (человека, мелкоклеточный), рак), DU-145 (человека, простаты, карцинома), Hep-3B (человеческий, черный, печени, карцинома гепатоцеллюлярная), K-562 (человека, хронической миелоидной лейкемии), MCF-7 (человека, молочной железы, аденокарцинома), ПК-3 (человека, простаты, аденокарциномы) и MDA-MB-231 (человека, молочной железы, аденокарцинома) с помощью МТТ-теста. Сверхкритический CO(2) экстракты имели улучшенный антипролиферативный эффект по сравнению с сокслета экстрактов. Хотя экстрактов представлены различные цитотоксические эффекты в отношении различных клеточных линий, сравнительно низкой IC(50) значения в диапазоне между 12.50 и 47.55 микрогр/мл были достигнуты в отношении K-562, являясь наиболее чувствительной клеточной линии. Кроме того, carnosic кислота причиной низкой жизнеспособности клеток со значениями в диапазоне от 13 до 30 % в концентрации 19 мама через 48 ч после процедуры, в результате чего superior антипролиферативным действием. Экстракт розмарина является потенциальным кандидатом для включения в анти-рак диета, с заранее определенными дозами избежать токсичности.

Plant Foods Hum Nutr. 2010 Jun;65(2):158-63. doi: 10.1007/s11130-010-0166-4.Inhibitory effects of rosemary extracts, carnosic acid and rosmarinic acid on the growth of various

human cancer cell lines.Yesil-Celiktas O1, Sevimli C, Bedir E, Vardar-Sukan F.Author information 1Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, Ege University, 35100, Bornova, Izmir,

Turkey. ozlem.yesil.celiktas@ege.edu.trAbstractThe leaves of Rosmarinus officinalis harvested from three different locations of Turkey were extracted by

both methanolic and supercritical CO(2) extraction. Subsequently, six extracts and the active compounds, carnosic acid, and rosmarinic acid were applied to various human cancer cell lines including NCI-H82 (human, small cell lung, carcinoma), DU-145 (human, prostate, carcinoma), Hep-3B (human, black, liver, carcinoma, hepatocellular), K-562 (human chronic myeloid leukemia), MCF-7 (human, breast, adenocarcinoma), PC-3 (human, prostate, adenocarcinoma) and MDA-MB-231 (human, breast, adenocarcinoma) by MTT assay. Supercritical CO(2) extracts had superior antiproliferative effect compared to the soxhlet extracts. Although the extracts exhibited various cytotoxic effects against different cell lines, comparatively low IC(50) values ranging between 12.50 and 47.55 microg/ml were attained against K-562, being the most sensitive cell line. Moreover, carnosic acid caused the lowest cell viability with values ranging from 13 to 30 % at a concentration of 19 muM after 48 h of treatments, resulting in superior antiproliferative effect. Rosemary extract is a potential candidate to be included in the anti-cancer diet with pre-determined doses avoiding toxicity.

Rosmarinus officinalis экстракт ингибирует рост клеток меланомы человека.Rosmarinus officinalis L. уделяется все большее внимание из-за его противовоспалительных и

антиоксидантных компонентов. Наши недавние исследования показали, что R. officinalis экстракт, содержащий 31,7% carnosic кислоты, был в состоянии нейтрализовать вредное воздействие УФ-R, защищая плазмидной ДНК из гидроксильных радикалов, генерируемых УФ-а. в данной работе мы оценили влияние этого экстракта на pBR322 расщепления ДНК, индуцированного оксида азота, и рост ингибирующей активностью в отношении двух клеточных линиях меланомы человека, M14 и А375. Экстракт показала защитное действие на плазмидной ДНК повреждения, и при концентрации 10-80 микрогр/мл был в состоянии уменьшить значительно (p<0,001) рост (МТТ) обеих клеточных линиях меланомы. Кроме того, наши результаты показывают, что апоптотической гибели клеток индуцируется в М14 и клетки А375. Нет статистически значимое повышение ЛДГ выпуска

59

наблюдалось в клетках меланомы, соотнесенные к фрагментации геномной ДНК, определяется комет.

Nat Prod Commun. 2009 Dec;4(12):1707-10.Rosmarinus officinalis extract inhibits human melanoma cell growth.Russo A1, Lombardo L, Troncoso N, Garbarino J, Cardile V.Author information 1Department of Biological Chemistry, Medical Chemistry and Molecular Biology, University of

Catania, V.le A. Doria 6, 95125 Catania, Italy. alrusso@unict.itAbstractRosmarinus officinalis L. is receiving increasing attention due to its anti-inflammatory and antioxidative

constituents. Our recent studies showed that R. officinalis extract, containing 31.7% of carnosic acid, was able to counteract the deleterious effects of UV-R, by protecting plasmid DNA from hydroxyl radicals generated by UV-A. In this work, we evaluated the effects of this extract on pBR322 DNA cleavage induced by nitric oxide, and the growth inhibitory activity against two human melanoma cell lines, M14 and A375. The extract showed a protective effect on plasmid DNA damage, and at concentrations of 10-80 microg/mL was able to reduce significantly (p<0.001) the growth (MTT assay) of both melanoma cell lines. In addition, our results indicate that apoptotic cell demise is induced in M14 and A375 cells. No statistically significant increase in LDH release was observed in melanoma cells, correlated to a fragmentation of genomic DNA, determined by COMET assay.

Урсоловая кислота ингибирует IL-1beta или TNF-Альфа-индуцированных глиомы С6 вторжения через подавление ассоциации ZIP/р62 с PKC-Зета и downregulating на MMP-9 выражение.

Урсоловая кислота (UA), постоянная составляющая Rosmarinus officinalis экстракты, тритерпеновые соединения, как было показано, обладают антиоксидантными и антиканцерогенными свойствами. В настоящем исследовании, мы обнаружили, что UA смог снизить интерлейкин-1 бета (IL-1beta) или некроза опухоли-Альфа (ФНО-Альфа)-индуцированной крысиной глиомы С6 в ячейку вторжения, который был осмотрен древесных материалов базальной мембраны в комплект камеры transwell. Однако ингибирующее влияние UA не влияло на пролиферацию клеток или вызывают клеточную cytotoxity. Результаты анализируются zymography анализа и Вестерн-блоттинга показал, что активность и экспрессию матриксной металлопротеиназы-9 (ММП-9) был ликвидирован UA, в зависимости от дозы образом. Потому что ММП-9 - целевого Гена фактора транскрипции ядерного фактора-kappaB (NF-kappaB), далее мы исследовали влияние UA на активность NF-kappaB. Как и ожидалось, UA upregulated уровни IkappaBalpha (IkappaBalpha) и ослабляются ядерной транслокации Р65. Кроме того, UA подавил IL-1beta или TNF-Альфа-индуцированной активации протеин киназы C-zeta (PKC-Зета). Наши данные показали, UA мощно подавлял ассоциации ZIP/р62 и PKC-Зета. Взятые вместе, мы показали, что UA может эффективно ингибировать взаимодействие ZIP/р62 и PKC-Зета. Кроме того, подавляется активация NF-kappaB и экспрессирован в ММП-9 белков, которые в свою очередь способствовали его ингибирующее влияние на IL-1beta или TNF-Альфа-индуцированных клеток глиомы C6 вторжения. Эти результаты демонстрируют потенциал UA имеет в проведение химиопрофилактики и лечения рака, метастазов и инвазии.

Mol Carcinog. 2009 Jun;48(6):517-31. doi: 10.1002/mc.20490.Ursolic acid inhibits IL-1beta or TNF-alpha-induced C6 glioma invasion through suppressing the

association ZIP/p62 with PKC-zeta and downregulating the MMP-9 expression.Huang HC1, Huang CY, Lin-Shiau SY, Lin JK.Author information 1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Taiwan University,

Taipei, Taiwan.AbstractUrsolic acid (UA), a constant constituent of Rosmarinus officinalis extracts, is a triterpenoid compound

which has been shown to have antioxidant and anticarcinogenic properties. In the present study, we found that UA was able to reduce interleukin-1 beta (IL-1beta) or tumor necrosis-alpha (TNF-alpha)-induced rat

60

C6 glioma cell invasion, which was examined by a reconstituted basement membrane in a set of transwell chambers. However, the inhibitory effect of UA did not influence cell proliferation or cause cell cytotoxity. The results analyzed by zymography assay and Western blotting revealed that the activity and expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) was eliminated by UA in a dose-dependent manner. Because MMP-9 is the target gene of the transcription factor nuclear factor-kappaB (NF-kappaB), we further investigated the effect of UA on the activity of NF-kappaB. As expected, UA upregulated the levels of IkappaBalpha (IkappaBalpha) and attenuated the nuclear translocation of p65. Furthermore, UA suppressed the IL-1beta or TNF-alpha-induced activation of protein kinase C-zeta (PKC-zeta). Our data showed UA potently inhibited the association of ZIP/p62 and PKC-zeta. Taken together, we demonstrated that UA could efficiently inhibit the interaction of ZIP/p62 and PKC-zeta. It also further suppressed the activation of NF-kappaB and downregulation of the MMP-9 protein, which in turn contributed to its inhibitory effects on IL-1beta or TNF-alpha-induced C6 glioma cell invasion. These results all showcase the potential UA has in the chemoprevention and treatment of cancer metastasis and invasion.

Исследования прогресс урсоловая кислота's противоопухолевого действия.Урсоловая кислота (UA) - это своего рода пентациклические тритерпеновые карбоновая кислота

очищенная из натуральных растений. UA имеет ряд биологических эффектов, таких как седативный, противовоспалительный, анти-бактериальной, анти-диабетических, противоязвенное и др. Обнаружено, что UA имеет широкий спектр противоопухолевого эффекта в последние годы, привлекает все большее и большее внимание исследователей. Этот обзор пояснил, противоопухолевым действиями UA, в том числе (1) защиты клеток ДНК от различных повреждений; (2) противоопухолевой клеточной пролиферации за счет ингибирования рецептора эпидермального фактора роста/митоген-активированной протеинкиназы сигнала или FoxM1 факторы транскрипции, соответственно; (3) antiangiogenesis, (4) иммунологические наблюдения опухоли; (5) ингибирование опухолевой клеточной миграции и инвазии; (6) влияние на UA каспазы, цитохромы C, ядерный фактор каппа B, циклооксигеназы, tumor necrosis factor-related apoptosis-индуцирующий лиганд (TRAIL) или mammalian target of rapamycin сигнал индуцировать апоптоз опухолевых клеток, соответственно, и т.д. Кроме того, UA имеет селективную токсичность по отношению к опухолевым клеткам, по сути, не влияет на нормальные клетки. Дальнейшие исследования, UA бы быть одним из потенциальных противоопухолевых агентов.

Chin J Integr Med. 2014 Jan;20(1):72-9. doi: 10.1007/s11655-013-1541-4. Epub 2013 Dec 29.Research progress of ursolic acid's anti-tumor actions.Zang LL1, Wu BN, Lin Y, Wang J, Fu L, Tang ZY.Author information 1Pharmacology Department, Dalian Medical University, Dalian, Liaoning Province, 116044, China.AbstractUrsolic acid (UA) is a sort of pentacyclic triterpenoid carboxylic acid purified from natural plant. UA has a

series of biological effects such as sedative, anti-inflammatory, anti-bacterial, anti-diabetic, antiulcer, etc. It is discovered that UA has a broad-spectrum anti-tumor effect in recent years, which has attracted more and more scholars' attention. This review explained anti-tumor actions of UA, including (1) the protection of cells' DNA from different damages; (2) the anti-tumor cell proliferation by the inhibition of epidermal growth factor receptor/mitogen-activated protein kinase signal or of FoxM1 transcription factors, respectively; (3) antiangiogenesis, (4) the immunological surveillance to tumors; (5) the inhibition of tumor cell migration and invasion; (6) the effect of UA on caspase, cytochromes C, nuclear factor kappa B, cyclooxygenase, tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) or mammalian target of rapamycin signal to induce tumor cell apoptosis respectively, and etc. Moreover, UA has selective toxicity to tumor cells, basically no effect on normal cells. With further studies, UA would be one of the potential anti-tumor agents.

Таргетинг воспалительных пути тритерпеноидов для профилактики и лечения рака.

61

Традиционная медицина и диета служила человечеству на протяжении веков для профилактики и лечения большинства хронических заболеваний. Монтаж доказательства свидетельствуют о том, что хроническое воспаление является посредником большинства хронических болезней, включая рак. Больше, чем другие факторы транскрипции ядерного фактора-kappaB (NF-b) и STAT3 возникли как основных регуляторов воспаления, клеточной трансформации и выживания опухолевых клеток, пролиферации, инвазии, ангиогенеза и метастазирования. Таким образом, агенты, которые могут ингибировать NF-b и активации STAT3 пути имеют потенциал, чтобы не только предотвратить и лечить рак. В этом обзоре мы рассмотрим возможности одной группы соединений, называемых тритерпены, производный от традиционной медицины и диета на их способность подавлять воспалительные путей, связанных онкогенез. Эти тритерпены включают avicins, betulinic кислоты, boswellic acid, celastrol, диосгенин, madecassic кислоты, maslinic кислоты, momordin, saikosaponins, platycodon, pristimerin, урсоловая кислота, и withanolide. Этот отзыв , таким образом, поддерживает знаменитое изречение Гиппократа: "пусть пища будет твоим лекарством, а Лекарство будет твоей пищей".

Toxins (Basel). 2010 Oct;2(10):2428-66. doi: 10.3390/toxins2102428. Epub 2010 Oct 22.Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer.Yadav VR1, Prasad S, Sung B, Kannappan R, Aggarwal BB.Author information 1Cytokine Research Laboratory, Department of Experimental Therapeutics, The University of Texas

M.D. Anderson Cancer Center, Houston 77030, TX, USA. vryadav@mdanderson.orgAbstractTraditional medicine and diet has served mankind through the ages for prevention and treatment of

most chronic diseases. Mounting evidence suggests that chronic inflammation mediates most chronic diseases, including cancer. More than other transcription factors, nuclear factor-kappaB (NF-κB) and STAT3 have emerged as major regulators of inflammation, cellular transformation, and tumor cell survival, proliferation, invasion, angiogenesis, and metastasis. Thus, agents that can inhibit NF-κB and STAT3 activation pathways have the potential to both prevent and treat cancer. In this review, we examine the potential of one group of compounds called triterpenes, derived from traditional medicine and diet for their ability to suppress inflammatory pathways linked to tumorigenesis. These triterpenes include avicins, betulinic acid, boswellic acid, celastrol, diosgenin, madecassic acid, maslinic acid, momordin, saikosaponins, platycodon, pristimerin, ursolic acid, and withanolide. This review thus supports the famous adage of Hippocrates, "Let food be thy medicine and medicine be thy food".

1. ВведениеПриродные соединения широко используются в лечении многих заболеваний и представляют

интерес для исследователей как в их природных форм и шаблонов для модификации синтетических. Природных соединений, используемых в настоящее время в медицине экспонат очень широкий химического разнообразия, и вместе с их аналогов и некоторых других натуральных продуктов, они демонстрируют важность соединений из природных источников в современных лекарств усилий. Примеры источников и молекулярные механизмы чрезвычайно важны в развитии романа, клинически полезным противоопухолевых агентов [1]. Заинтересованность в природных соединений выросла в последние годы, из-за озабоченности по поводу затрат на лекарства и безопасности. Например, глиобластома убивает почти всех, кто его получает, как правило, в чуть больше года. В сущности, $1,3 млрд, проведенное фармацевтической компании на новый глиобластома лекарств имели ограниченное влияние на улучшение жизни пациентов в течение одного года. Это свидетельствует о необходимости новых источников для поиска лекарств, и природные источники содержат ценную информацию для исследований в этой области. В течение последнего десятилетия был достигнут огромный прогресс на пути понимания клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в процесс канцерогенеза, приводя к развитию потенциальных профилактики рака вариантов называется химиопрофилактики [2]. Целью химиопрофилактики является использование noncytotoxic природных агентов, ингибирующих или обратного развития и прогрессирования предраковых клеток [3].

62

Рак-это сложное заболевание, которое может развиваться в организме человека в течение ряда лет (рис. 1). Развитие опухоли начинается с нормальных клеток, трансформированных путем активации прото-онкогенов и подавления генов-супрессоров опухолей, таких как р53. Трансформированные клетки больше не ведет себя как обычный сотовый, но начинает проявлять свойства раковой клетки. Такие трансформации в клетках делает их самодостаточными в сигналы роста и устойчивостью к antigrowth сигналов, в результате чего неудержимым распространением. Кроме того, эти клетки способны избежать апоптоза, в результате чего рост опухоли. Весь этот процесс преобразования может занять 10-20 лет. Рост опухоли способствует ангиогенеза, который не только обеспечивает продуктами питания опухоли, но и позволяет ее инвазии в окружающие ткани и метастазирования в отдаленные ткани; последняя, как правило, смертельным.

Воспаление, которое возникает как ответ на рак, имеет две стадии, острые и хронические. Острое воспаление, начальная стадия воспаления, представляет собой врожденный иммунитет; она опосредуется через активацию иммунной системы, длится в течение короткого периода и, как правило, рассматривается в качестве терапевтических воспаление. Если воспаление сохраняется в течение длительного периода времени, однако, на второй стадии, хронические воспаления, наборы в [4]. Хроническое воспаление связано с большинством хронических заболеваний, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания, сахарный диабет, ожирение, заболевания легких, неврологические заболевания [5] текущий обзор посвящен роли тритерпеноидов в адресности воспалительных путей, для профилактики и лечения рака.

Доказательства из культуры тканей, животных, а также клинических исследований свидетельствуют, что более чем 20.000 тритерпеноида-богатые плоды встречаются в природе и имеют потенциальную возможность ограничения развития и тяжести некоторых видов рака и воспалительных заболеваний [6]. Эти тритерпеноиды, наряду с их близкие химические родственники стероиды, являются членами большого семейства родственных структур, называемых cyclosqualenoids. Тритерпеноиды, синтезированных во многих растениях путем циклизации сквалена [7], широко используются в азиатской медицине. Более 100 прописанные лекарства в Соединенных Штатах, полученные из природных источников и представляют собой одну четвертую часть общей препаратов, используемых. Кроме этих препаратов, которые происходят из природных источников, другие фитохимические вещества также служат в качестве потенциальных лекарственных препаратов после структурной модификации [8].

Научные исследования показали, тритерпеноиды, чтобы потенциальные противовоспалительные и противораковые агенты. Этот обзор охватывает противовоспалительные и противораковые свойства тритерпеноидов, происходящих из растений, таких как лук, женьшень, брахми, azuma ichirinsou, shallaki, салаи guggal, Дэн лей гонг, лакрица, манго, оливковое, толокнянки, китайский колокольчик, серповидно-лист, tulsi, ашвагандха, и др. (Рис. 2 и табл. 1), которые ориентированы на одну или несколько различных стадиях опухолей. Как более 20 000 тритерпеноиды доступны в природе и трудно описать их все, это краткий обзор того, что мы знаем несколько тритерпеноидов с структурного подобия, в том числе avicin, erythrodiol, madecassic кислоты, maslinic кислоты, momordin, saikosaponins, 2-циано-3,12-dioxooleana-1,9(11)-диен-28-овой кислоты (CDDO) и его метиловый эфир CDDO-Me, platycodon D, withanolide, диосгенин, betulinic кислоты, boswellic кислот, pristimerin, и celastrol (рис. 3); их активных групп, для противовоспалительной и противоопухолевой активностью.

Таблица 1Общей медицине активно тритерпеноида, полученные из растений.

Химическое Соединение Общее Название Ботаническое Название

Тетрациклические тритерпеновые

Astragaloside Chinese milk vetch Астрагала перепончатого

Cucurbitacin Бриония белая Брионии alba

63

Химическое Соединение Общее Название Ботаническое Название

Диосгенин Пажитник Trigonella foenum graecum

Ganoderic кислоты Рейши Ganoderma lucidumГинзенозиды Женьшень Panax ginseng

Gypenoside Jiaogulan Gynostemma pentaphyllum

Oleandrin Олеандр Nerium oleanderПентациклические

тритерпеновыеAmyrin Японская хурма Diospyros kakiAsiatic acid Индийского щитолистника обыкновенного Центеллы азиатскойAvicin Элегантный wattle Acacia victoriaeBetulinic кислоты Индийский jujube Ziziphus mauritiana

Анемона Anemone raddeanaПлаунам Lycopodium cernuumТруба satinash Syzygium claviflorum

Boswellic acid Boswellia, Boswellia serrataЛадан, салаи guggal Boswellia carteri

Celastrol Лоза Бога грома Tripterygium wilfordii

Эсцин Конский каштан Aesculus hippocastanum

Глицирризин Солодка Glycyrrhiza glabra18-β-Глицирретиновой

кислоты Солодка Glycyrrhizia glabra

Люпеол Манго Mangifera indicaТри широколиственные каперсов Crataeva nurvala

Madecassic кислоты Индийского щитолистника обыкновенного, готу кола Центеллы азиатской

Momordin Горящий куст Kochia scoparia

Олеаноловая кислота Толокнянка Arctostaphyllos uva-ursi

Хизер Calluna vulgarisТри широколиственные каперсов Crataeva nurvalaРейши Ganoderma lucidumКитайский старец Бузина chinensisСодом apple Solanum incanum

Platycodon D Шар цветок Platycodon grandiflorum

Pristimerin Espinheira Санта Maytenus ilicifoliaБледно-Bittersweet Celastrus hypoleucusЛоза Бога грома Tripterygium wilfordii

Saikosaponins Заяц на ухо корень, серповидно-лист Bupleurum falcatum L.Урсоловая кислота Святой Василий, tulsi Ocimum sanctum L.

Тимьян Thymus vulgaris L.Лаванда Lavandula augustifoliaКотенок Nepeta sibthorpii

64

Химическое Соединение Общее Название Ботаническое Название

Мяты перечной листья Mentha piperita L.Withanolide Индийский женьшень, ашвагандха Withania somniferaВ обзоре также фокусируется на мишени для воспаления, пролиферации, апоптоза, инвазии,

метастазирования и ангиогенеза. Потому что большая часть этих нутрицевтиков показывают большой потенциал для нацеливания на раковые через различные механизмы, такие как снижение экспрессии транскрипционных факторов (например, ядерного фактора-kappaB [NF-b]), анти-апоптотических белков (например, bcl-2, bcl-xL), стимуляторов клеточной пролиферации (например, циклооксигеназы-2 [COX-2], циклин D1, c-myc), инвазивных и метастатических генов (например, матричных металлопротеиназ [Ммпс], внутриклеточные молекулы адгезии-1 (ICAM-1), и ангиогенный белок (фактор роста эндотелия сосудов (VEGF)) (Таблица 2); и иное использование этих тритерпеноиды приведены в таблице 3. Это краткий обзор источников и структуры тритерпеноидов и дает представление о базовых молекулярных мишеней для профилактики рака и терапии.

Таблица 3Другие виды использования тритерпеноида в лечении хронических заболеваний.Болезнь Тритерпеноида

Сахарный диабет

Astragaloside, Cucurbitacin, Диосгенин, Гинзенозиды, Amyrin, Asiatic acid, Avicin, Betulinic кислота, Эсцин, Глицирризин, Олеаноловая кислота, Platycodon D, Урсоловая кислота, Withanolide

Сердечно-сосудистые

Astragaloside, Cucurbitacin, Диосгенин, Гинзенозиды, Gypenoside, Oleandrin, Betulinic кислота, Эсцин, Глицирризин, Люпеол, Олеаноловая кислота, Platycodon D, Saikosaponins, Урсоловая кислота, Withanolide

Артрит Cucurbitacin, Диосгенин, Гинзенозиды, Amyrin, Boswellic acid, Celastrol,

Глицирризин, Люпеол, Олеаноловая кислота, CDDO-Me, Урсоловая кислота, Withanolide,

Атеросклероз Диосгенин, Gypenoside, Betulinic кислота, Глицирризин, Олеаноловая кислота, Урсоловая кислота

Ожирение Диосгенин, Гинзенозиды, Betulinic кислота, Эсцин, Глицирризин, Platycodon D, Momordin, Олеаноловая кислота, Урсоловая кислота

Болезнь Альцгеймера CDDO-мА, Альфа-onocerin

Паркинсон CDDO-МАРассеянный

склероз Олеаноловая кислота

Депрессия Asiatic acid Остеопороз Урсоловая кислотаИшемии

головного мозга Эсцин, Asiatic acid

Потеря памяти CDDO-МА2. Источник и структуру ТритерпеноидовТритерпеноиды являются метаболиты isopentenyl пирофосфата олигомеров, которые химически

связаны сквален, который является большой группы соединений, имеющих 30 атомов углерода, расположенных в пяти колец с несколькими атомами кислорода прилагается. Тритерпеноиды являются частью крупнейшей группы растительных продуктов, сапонины могут быть химически biosynthesized, когда один или более сахарных групп, прикрепить к агликона. Существует два типа сапонины, стероидные агликона и тритерпеновые агликона. Как стероидные и тритерпеновые систем являются biosynthesized из общего предшественника, такие как сквален [139]. Тритерпеноиды синтезируются из isopentenyl пирофосфата (IPP) и его изомер dimethylallyl пирофосфата (DMAPP). Для этой циклизации, три prenyltransferases синтезировать линейный prenyl пирофосфаты geranyl

65

пирофосфата (GPP), farnesyl пирофосфата (FPP), и geranylgeranyl пирофосфата (GGPP). Сквален является, в свою очередь, производный biosynthetically путем циклизации числа единиц изопрена, (C5Ч8)n, которые проходят раскладной через 20 различной структуры в присутствии prenyl пирофосфаты, чтобы сформировать моноциклические, бициклическим простым, трициклические, тетрациклические или пентациклических производных [140]. Семейство oxidosqualene cyclases может производить только один продукт, например, люпеол cyclases, но есть также многофункциональный oxidosqualene cyclases, которые используют dammarenyl катионных интермедиатов для производства многих продуктов. Однажды сквален подвергается циклизации, она проходит через цитозольной мевалонат пути, чтобы сделать экспресс-тетрациклические C30 соединения, ланостерин (Рис. 4), который далее подвергается окислению и катаболического метаболизма в виде холестерина.

Разнообразие тритерпеноидов в природе является результатом эволюции крупных терпеновые синтазы надсемейство. В одном исследовании проанализированы аминокислотные последовательности терпеновые синтазы генов и обнаружили, что все произошли от предков, дитерпены синтазы. Также было установлено, что разнообразие этих тритерпеноиды обусловлена структурными особенностями их катализатором ферментов. Терпены и их метаболитов широко распространены в различных растительных системах, которые зависят от различных биотических и абиотических факторов окружающей среды. Терпены и их метаболитов используются в нескольких развивающих и физиологических функций на основе дифференциальных профилей экспрессии терпеновые синтазы генов. Терпены и их метаболиты играют очень важную роль в защиту завода механизма. Они защищают растения от конститутивной и индуцированной защитные реакции против насекомых и экологического стресса [141,142]. Следовательно, тритерпеноиды обеспечивают очень хорошую защиту щитом для растений, с указанием их потенциал для использования в целях профилактики различных видов рака и воспалительных заболеваний в организме человека.

3. Молекулярные мишени действия ТритерпеноидовВ 1856 году Рудольф Вирхов впервые показал воспаление быть предрасполагающим фактором для

различных типов рака. Сегодня данные позволяют предположить, что по крайней мере один в семи злокачественных опухолей, диагностируемых во всем мире результаты от хронического воспаления и инфекции. Признание этого факта привело к большей интерес для исследования молекулярных мишеней, участвующих в воспалительных путей, которые вызывают рак, и, чтобы найти новые маркеры, которые сдерживают прогрессирование рака вдоль этих путей.

Обычные методы лечения рака включают хирургию, химиотерапию и/или лучевой терапии; режим лечения во многом зависит от типа рака у пациента. Инновационные, так называемая многозадачность терапии от природных ресурсов, необходимо срочно целевой различные этапы прогрессирования рака или процессы, участвующие в раке выживаемость клеток и метастазы в другие части тела.

Понятно теперь, что рак-это не простая болезнь с участием одного Гена, а комплекс заболеваний, при которых взаимодействие множества генов, либо в пределах одной ячейки или с соседних тканей. Предотвращение или прогрессирования рака человека зависит от целостности сложную сеть защитных механизмов, в которых 300-500 генов были допущены просчеты, ведущие к повышенной нежелательных продуктов, таких как антиапоптотических белков или подавление опухолевого супрессора белков.

3.1. NF-bNF-b, вездесущий фактор транскрипции, был обнаружен в 1986 году в качестве ядерного фактора,

который связывается с enhancer области b-цепи иммуноглобулинов в в-клетках. Он присутствует во всех клетках, и в покоящейся стадии, этот фактор находится в цитоплазме в качестве heterotrimer конференций; предлагается следующее: p50, p65, и ингибирующей субъединицы IκBα. NF-b активируется свободных радикалов, воспалительные стимулы, цитокинов, канцерогены, опухолевые промоторы, эндотоксины, γ-излучение, ультрафиолетовое излучение, рентгеновские лучи [143]. На активации, IκBα белок, ингибитор NF-b, проходит фосфорилирование, убиквитинирование, а деградация. p50 и p65 затем выпущен, чтобы быть перемещены в ядро, связываются со специфическими последовательностями ДНК, присутствующих в промоутеры различных генов, и инициировать транскрипцию более 400 генов. Киназы, что приводит к фосфорилированию IκBα

66

называется IκBα киназы (IKK). Принимая во внимание, что IKKβ опосредует классический/каноническом NF-b активация пути, IKKκ опосредствует неканонического пути. IKK сама должна быть активирована прежде, чем его можно активировать IκBα. Более десятка киназы были описаны, которые могут активировать IKK, в том числе протеинкиназы в (Akt), митоген-активированный протеин/внеклеточной сигнал-регулируемой киназы киназы 1 (MEKK1), MEKK3, трансформирующий фактор роста (TGF)-активация киназы 1 (TAK1), NF-b-активация киназы, NF-b-индуцирующего киназы, протеин киназы С, и двуцепочечной РНК-зависимой протеинкиназы (PKR).

3.2. STAT3Преобразователь сигналов и активатора транскрипции 3 (STAT3), одним из основных

молекулярных мишеней тритерпеноидов, был впервые выявлен в 1994 году в качестве ДНК-связывающий фактор, который избирательно связывается с IL-6-отзывчивым элементом промотора. Активация STAT3 регулируется фосфорилированием тирозина 705, рецепторов и nonreceptor протеин тирозин киназы, в том числе и рецептора эпидермального фактора роста (EGFR киназы [144], Src [145], Янус-активированных киназ (JAK) [146,147], и внеклеточной сигнал-регулируемой киназы (ERK) [148]. Фосфорилирование STAT3 в цитоплазме приводит к его димеризации, транслокацией в ядро и связывание ДНК, что приводит в регуляции ряда генов, участвующих в клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза.

3.3. Других ПутейБольшой объем доказательств свидетельствует о роли воспаления в развитии рака через

посредников, таких как активные формы кислорода (ROS), свободных радикалов и воспалительных цитокинов, как фактор некроза опухоли-α (TNFα), lymphotoxins, и ангиогенных факторов. Также известно, что влияние онкогенеза являются сигнальные пути, которые в нормальных клеток, вовлеченных в гомеостаз тканей, таких как NF-b, простагландинов/циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) и p53 пути; ДНК ремонта машин; и семейство Toll-like рецепторов белков.

Некоторые из наиболее широко известных молекулярных мишеней тритерпеноидов, участвующих в лечении и профилактике рака, были выбраны по всесторонние знания опухолевого роста и метастазирования. Такой подход позволит максимизировать эффект тритерпеноидов и минимизации побочных эффектов многозадачность клетки или процессов, которые позволяют раком, чтобы выжить и распространиться в организме человека.

4. Роль Тритерпеноидов в профилактике рака4.1. Роль Тритерпеноидов в воспалениеВоспаление происходит от латинского слова ‘inflammare или inflammati’, которое означает “ставим

на огонь.” Воспаление-это основной механизм защиты, при котором тело реагирует против инфекций, раздражений или других травм. Четыре главные особенности воспаления являются покраснение, жар, отек и боль. Воспаление стимулирует иммунный ответ в месте травмы или инфекции, и сам стимулируется увеличивает в крови и проницаемость сосудов, которые позволяют более инфильтрации плазмы и лейкоцитов из крови в травмированных тканях. Этот определенный тип иммунного ответа является важным, поскольку оно помогает организму защититься от патогенных микроорганизмов, а также инициировать процесс заживления в поврежденной ткани. Эта реакция классифицируется как острое воспаление. Исследования показали, что хроническое воспаление является родоначальником прогрессии опухоли и, что многие раки были найдены возникают из очагов инфекции, хроническое раздражение и воспаление. Воспаление управляет микросреду вокруг опухоли и позволяет им развиваться, способствуя пролиферации, выживания и миграции [149]. Воспалительные клетки и сети сигнальных молекул предусмотрено воспалительного микроокружения необходимых для злокачественной прогрессии трансформированных клеток.

Воспаление способствует развитию опухоли через обнаруживать и иммунной. NF-b является центральным фактором транскрипции опосредующих воспалительные и врожденные иммунные реакции. NF-b могут быть активированы различные факторы, в том числе цитокинов, патогенных микроорганизмов и окислительных, генотоксического, физиологических или химических стресс-факторов. В дополнение к этим, провоспалительных цитокинов и хронические инфекции могут играть важную роль в стимуляции активности IKK, которая приводит к конститутивной NF-b активации [150,151,152]. Активация NF-b через IKKβ играет важную роль в процессе воспаления,

67

индуцированного опухолевой промоции и прогрессии. Различных провоспалительных факторов, таких как TNFα и Толл-подобный рецептор лиганды, такие как липополисахарид (LPS), обычно активация этих путей [153]. Эта активация сигналов транскрипции различных рак-содействие генов, таких как антиапоптотических генов, проангиогенных гены, и proinvasion генов [154]. NF-b связывания ДНК, что в результате активации ряда генов, которые приводят к воспалительным заболеваниям, как болезнь Альцгеймера и артрита помимо рака [143].

Вместе с NF-b, факторов, таких как ФНО и интерлейкинов (IL-1β, IL-6 и IL-8) также служить связующим звеном между воспалением и раком. TNF снимается преимущественно из макрофагов и регулирует иммунные клетки. Ее дизрегуляции и перепроизводства привести к раку и другим заболеваниям. TNF также играет роль в активации NF-b путем привязки к TNF рецептор присутствует на поверхности клеток, что в свою очередь, инициирует пути, что приводит к активации IKK [3]. Интерлейкины представляют собой группу цитокинов выпущен в организме из многочисленных клеток в ответ на различные раздражители. В то время как IL-1β играет важную роль в воспалительной реакции против инфекции путем повышения экспрессии эндотелиальной адгезии факторов, таким образом, позволяя инфильтрации лейкоцитов в очаг инфекции, IL-6 является провоспалительных цитокинов выпущен в ответ на травму или повреждение тканей. IL-8, член CXC хемокиновых семьи, также известный как CXCL8, может функционировать как митогенных, ангиогенных, и мутагенным фактором, способствующим прогрессии рака [155].

Воспалительных клеток и их регуляторы находятся облегчить ангиогенез и способствуют росту, инвазии и метастазирования опухолевых клеток [156]. Нормальные уровни некоторых ферментов, как индуцибельной синтазы окиси азота (iNOS) и ЦИКЛООКСИГЕНАЗЫ-2 играют важную роль в физиологических защитных ответ на повреждение тканей, но если выражается в чрезмерных количествах, эти воспалительные ферменты могут вызывать канцерогенез [149,157,158]. В ткани опухоли, уровни простагландинов (PGs) часто повышен. ЗКС эндогенных медиаторов воспаления и образуются из арахидоновой кислоты конститутивными ЦОГ-1 и индуцируемая ЦОГ-2. Производство более высокие уровни PGs полагают, вызывают клеточные повреждения и, в конечном счете, привести к канцерогенеза путем ингибирования апоптоза, стимулируя клеточную пролиферацию, и стимулирующие ангиогенез опухоли и инвазивности [159]. Cycloartane тритерпеноидов из Цимицифуги даурской подавил выражение cdc2 и ЦОГ-2 белка. Эти результаты предполагают, что тритерпеноиды обладают потенциальной противоопухолевой деятельности и оказывать цитотоксичность путем апоптоза и G2/M клеточного цикла [146].

Многие тритерпеноиды, производных от ботанических источники играют важную роль в уменьшении воспаления. Они включают в себя avicin, asiatic acid, astragaloside, бетулин, betulinic кислоты, boswellic acid, celastrol, cucurbitacin, диосгенин, erythrodiol, ganoderiol, гинзенозиды, глицирризин, глицирретиновой кислоты, gypenoside, люпеол, madecassic кислоты, maslinic кислоты, oleandrin, олеаноловая кислота, platycodon D, pristimerin, saikosaponins, урсоловая кислота, и withanolide (Таблица 2). Многие из этих тритерпеноиды целевой NF-b, ведущая к его понижению функции.

Пентациклические тритерпеноиды были найдены, чтобы иметь много функций, хотя их эффективных концентраций для различных клеточные эффекты могут различаться в широких пределах. В зависимости от принятой дозы, тритерпеноиды может вызвать противовоспалительное, цитопротекторное, опухоли дифференциации, пролиферации-арестовывать, и апоптотические эффекты [160,161,162]. На противоопухолевую активность тритерпеноидов видимому, опосредовано, по крайней мере, в части, их общей способностью блокировать TNF-индуцированной NF-b активации, ингибирования IKKβ [163,164]. Синтетические тритерпеновые 1-[2-циано-3,12-dioxooleana-1,9(11)-диен-28-oyl] имидазола (CDDO-Im) блокирует NF-b активации путем прямого ингибирования IKKβ [35]. Это видно из того, что молекулярные мишени из синтетических oleanane тритерпеноиды включают IKK, а также путей с участием STAT, IL-6, TGF-β, и KEAP1 (ингибитора фактора транскрипции, регулируемый белком nrf2). Ингибирование несколько целей, тритерпеноиды считается опосредована promiscuous обратимым Майкл добавление этих соединений подвергается нуклеофильной группы (такие, как добраться цистеин сульфиды) различных восприимчивых сигнальных белков [165]. Тритерпеноиды воздействовать на несколько

68

сигнальных путей, и клинические свойства тритерпеноидов, в частности, пентациклические тритерпеноиды, как было показано в различных исследованиях. На связь структура-активность указывают на то, что присутствие α,β-ненасыщенных карбонильных групп, существенно повышают потенцию этих пентациклических тритерпеноидов. 12 пентациклические тритерпеноиды, четыре (CDDO, CDDO-Me, pristimerin, и celastrol) было показано, мощно и выборочно смертельным для различных раковых клетках и показывать несколько раз увеличить противовоспалительной активностью. Это действие обусловлено α,β-ненасыщенные карбонильные в кольце A. включение циано и кето группу в этом enone радикал, еще больше повышает его эффективность и потенция.

Avicins являются электрофильными пентациклических тритерпеноидов с проапоптотических, противовоспалительные и антиоксидантные свойства производных из Acacia victoriae. Avicins, как было показано, чтобы вызвать редокс-зависимых пост-трансляционная модификация остатков цистеина регулировать функции белка, который downregulate как STAT3 активности и экспрессии STAT3-регулируемых prosurvival белков и способствуют индукции апоптоза in vitro [166]. Avicins были обнаружены сильнодействующие ингибиторы TNF-индуцированной NF-b и медленное накопление Р65 субъединицы NF-b в ядре, однако, деградации IκBα был в силе. Кроме того Avicins блокировали связывание NF-b с ДНК в in vitro реакции связывания. Лечение клеток с дитиотреитол (DTT) полностью отменил avicin г-индуцированное ингибирование NF-b-активности, предполагая, что сульфгидрильных групп критическую для NF-b активации пострадали. Avicin G лечения уменьшилась экспрессия NF-b регулируемых белков, таких как iNOS и COX-2 [16]. Другие исследования показали, что pretreating клеток с тритерпеноидов в течение 24 часов значительно снижается индукция NF-b опосредованное через TNF-α [44,167].

Pristimerin, природные тритерпеновые, вызывает клеточный ответ, напоминающий те, индуцированный протеасомных ингибиторов, таких как быстрая индукция белков теплового шока (HSPs), активация фактора транскрипции 3 (ATF3), и C/EBP гомологичных белков (ЧОП). Pristimerin также ингибирует NF-b путем ингибирования активации IKK-α или IKK-β, в то время как ингибиторы протеасомы вместо того, чтобы подавить NF-b функция ущерба деградации убиквитинированных IκB. Ингибируя как IKK и протеасомы, pristimerin подавляет активацию учредительных NF-b в клетки миеломы. Множественная миелома является чрезвычайно чувствительны к протеасомы или NF-b путь торможения. В соответствии с этим, pristimerin было показано, мощно и выборочно смертельным для первичной клетки миеломы (IC50 < 100 нм) и ингибировать xenografted плазмоцитома опухолей у мышей [118]. Pristimerin также известен как противогрибковое, противомикробное, и противовоспалительное соединение завод с эффектом на iNOS системы в LPS-активированных RAW 264.7 макрофагов [168].

Celastrol, природные тритерпеновые со структурой, аналогичной pristimerin, находится в Лоза Бога грома и был идентифицирован как имеющий потенциал для использования в лечении рака, поскольку его способность повышать смерти клеток меланомы. Celastrol также ингибирует клеточную пролиферацию в клетках меланомы. Когда celastrol использовался для лечения меланомы, она (как pristimerin) повышение уровня убиквитинированных белков, снижение уровня TNF-α-индуцированных IκB фосфорилирования, и заблокирован NF-b транслокации в ядро в наномолярных концентрациях, однако, молекулярный механизм этих эффектов отличались. Celastrol обычно ингибирует ЛПС-индуцированного фосфорилирования митоген-активированных протеинкиназ/внеклеточной сигнал-регулируемой киназы 1/2 (MAPK/ERK1/2) и ДНК-связывающая активность NF-b [49]. Другие исследования показали, что TNF-индуцированной активации IKK требует активации TAK1 и что celastrol тормозит TAK1-индуцированной NF-b активации [52]. Celastrol также подавил овальбумин-индуцированной дыхательных путей, воспаления, гиперреактивности и ремоделирования тканей путем регулирования дисбаланса матриксных металлопротеиназ 2 и 9 (MMP2, MMP9) и тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 и 2 (TIMP1 и TIMP2) воспалительных цитокинов через MAP-киназ и NF-b в воспалительных клеток.

В тритерпеноидов erythrodiol и madecassic кислоты являются структурными аналогами друг друга и обладают антипролиферативным и противоопухолевой активностью. Однако, только madecassic кислоты также показал, LPS-стимулированной NF-b торможения с последующей блокировке белка Р65 транслокации в ядро [103]. Это может быть из-за наличия дополнительной гидроксильной carbon

69

2, которые играют важную роль в реакции электрофильного. Maslinic кислоты, которая аналогична madecassic кислоты, также ингибирует NF-b транслокации. Maslinic кислота также ингибирует p50, p65, и NF-b транслокации в зависимости от дозы образом, как в нестимулированных и phorbol-myristate ацетата (PMA)-оспорено клеток, особенно эффективные на Р50 субъединицы [169]. Momordin, аналог maslinic кислоты, не содержит гидроксильной группой у углерода 2 позиции, но все же он показал NF-b торможения в резорбционную дифференциации. Это может быть из-за momordin действий на c-Fos, компонент активирующий протеин-1 (AP-1) фактор транскрипции, который играет ключевую роль в резорбционную дифференциации. Momordin ингибирует активацию NF-b, а также AP-1 в рецептор активатора NF-b лиганда (RANKL)-индуцированной RAW264.7 ячеек, в которых momordin явился целевой деградации IκB и c-Fos экспрессии, но не MAPK сигнальных путей [104].

Saikosaponins являются тритерпеновые сапонины, полученных из лекарственных растений Bupleurum falcatum L. (Umbelliferae) показали, что различные Фармакологические и иммуномодулирующее действие, в том числе противовоспалительные, антибактериальные, противовирусные и противораковые эффекты в АЧН, C32, Caco-2 , А375, А549, и да-7D12 клеточных линий [170]. Исследования показали, что saikosaponins не только подавляли пролиферацию человеческих Т-клеток costimulated с OKT3 и CD28, но также ингибирует PMA-, РМА/иономицином-и конканавалин а-индуцированного мышь активация Т-лимфоцитов in vitro. Этот ингибиторный эффект saikosaponins на PMA-индуцированной активации Т-лимфоцитов было связано с подавление NF-b сигнализации путем подавления IKK и Akt деятельности. Saikosaponins также подавляются как ДНК-связывающая активность и ядерную транслокацию ядерного фактора активированных Т-клеток (NF-AT) и AP-1 в РМА/иономицином-стимулированных Т-клеток. Кроме того, поверхностные клеточные маркеры, как рецептора IL-2 (CD25) были также downregulated, и продукцию провоспалительных цитокинов, таких как ил-6, ФНО-α и интерферона (IFN)-γ была снижена. Эти результаты указывают на то, что NF-b, NF-AT и AP-1 (c-Fos) сигнальных путей, участвующих в Т-клеток ингибирование, вызываемые saikosaponins, демонстрируя свой потенциал для лечения Т-клеточного аутоиммунного условиях [123]. Другое исследование показало, что saikosaponins имеют непосредственного участия в р53, NF-b - Fas/Fas лиганд-опосредованной индукции апоптоза и клеточного цикла в человеческой линии клеток гепатомы. Saikosaponins также ингибирует выживания клетки сигнализации путем повышения количества IκBα в цитоплазме и снижение уровня и активности NF-b в ядре, и в дальнейшем ослабляется экспрессия bcl-xL в HepG2 и клетки Hep3B. Saikosaponins поэтому снизилась клеточной пролиферации и апоптоза, как в р53-позитивных HepG2 и р53-негативных клетки Hep3B [121].

Диосгенин, стероидные тритерпеновые наличие двух пентациклических кольца, присутствует в Trigonella foenum graecum и другие растения, и было показано, подавляют воспаления, ингибируют пролиферацию и индуцировать апоптоз в различных опухолевых клеток. Диосгенин тормозит osteoclastogenesis, инвазии и распространения через снижение экспрессии Akt, активации IKK, и NF-b-регулируемой экспрессии генов. Диосгенин подавляет NF-b посредством прямого связывания ДНК, активация IKK, IκBα фосфорилирования, деградации IκBα, Р65 фосфорилирования, Р65 и ядерной транслокации за счет ингибирования активации Akt. NF-b-зависимого репортерного Гена выражение было также отменено диосгенин [64]. Аналогичную деятельность найден Withania somnifera, также известный как Индийский женьшень, который широко используется в Аюрведической системе медицины для лечения опухолей, воспаления, артрит, астма и гипертония. Химическое исследование корней и листьев этого растения дало биологически активных withanolides, группа C28-steroidal лактон тритерпеноидов. Withania somnifera ингибирует ЦОГ ферментов и перекисное окисление липидов, и пролиферации опухолевых клеток, и это усиливает апоптоз, тормозит вторжения, и отменяет osteoclastogenesis через подавление NF-b и активации NF-b-регулируемой экспрессии генов [135].

Урсоловая кислота является пентациклические тритерпеновые соединения изолированных от многих видов лекарственных растений и широко присутствуют в рационе питания человека. Это, как сообщается, обладают широким спектром фармакологических свойств и является одним из самых перспективных химические агенты для рака. Показано, подавлять экспрессию ряда генов, связанных

70

с онкогенез. Она подавляла NF-b активация, индуцированная различными канцерогенами, в том числе TNF, PMA, окадаиновой кислоты, перекись водорода (H2O2), и сигаретный дым конденсата. Урсоловая кислота ингибирует ДНК-связывания NF-b. Урсоловая кислота ингибирует IκBα деградации IκBα фосфорилирования, активации IKK, Р65 фосфорилирования, Р65 ядерной транслокации, и NF-b-зависимого репортерного Гена выражение. Урсоловая кислота также ингибирует NF-b-зависимого репортерного Гена экспрессия активированных TNF-рецептором (TNFR), TNFR-associated death domain (TRADD), TNFR-associated factor (TRAF), NF-b-индуцирующего киназы (NIK), IKK, и p65 [125]. CDDO и CDDO-Me, два мощных oleanane тритерпеноиды, имеющие структуры, подобные урсоловая кислоты, в настоящее время находятся в фазе I клинических испытаний для лечения лейкемии и солидных опухолей. CDDO блокирует действие NF-b по предотвращению ядерной транслокации Р65; это блокирует трансактивационную из NOS2 и PTGS2 гены, таким образом, играет противовоспалительное роль и вызывает арест клеточного цикла. Cucurbitacin в сочетании с CDDO было показано, чтобы вызвать апоптоз путем ингибирования NF-b активации, IκBα фосфорилирования и деградации, NF-b-репортер экспрессии генов, индуцированных ФНО, и STAT сигнализации. Некоторых других тритерпеноидов как astragaloside, boswellic кислот, celastrol, ganoderiol F, и gypenoside также блокируется действие NF-b, ингибируя трансактивационную из ЦОГ-2 [44,51,171,172,173]. CDDO, в наномолярных концентрациях подавляет de novo синтез воспалительных ферментов iNOS и COX-2 в активированных макрофагов, потому что они содержат α,β-ненасыщенных карбонильных групп. Так как iNOS и COX-2, гиперэкспрессия были вовлечены как можно усилители канцерогенеза, CDDO имеет потенциал, чтобы быть использованы как химические агента. Кроме того, CDDO может также служить в качестве химиотерапевтического агента, как микромолярных в наномолярных концентрациях эффективно индуцированной дифференцировки человеческих миелоидных лейкозных клеток, ингибирует пролиферацию различных человеческих опухолевых клеточных типов, и индуцированного апоптоза в человеческих миелобластный и лимфобластный лейкоз клеток, клеток остеосаркомы, и клетки рака молочной железы, в том числе клеточных линий, резистентных к химиотерапии [160].

Boswellic кислот, Тип пентациклические тритерпеновые, было показано, индуцируют апоптоз в различных раковых клетках. На молекулярном уровне эти соединения ингибируют конститутивно активированный NF-b сигнализация, перехватывая IKK деятельности; сигнализации через ИФН-стимулированных ответ элемент оставался неизменным, предполагая, специфичность для IKK ингибирования [45,46]. В xenograph изучение животного менингиома клеток, boswellic кислот были обнаружены сильнодействующие цитотоксической активности с IC50 значения в диапазоне 2-8 мкм. При низких микромолярных концентрациях, boswellic кислот быстро и мощно ингибирует фосфорилирование ERK-1/2 и нарушенной моторикой менингиома клетки стимулировали с platelet derived growth factor (PDGF) BB. Цитотоксическое действие boswellic кислот на менингиома клетки могут быть опосредованы, по крайней мере частично, путем ингибирования ERK пути трансдукции сигнала, который играет важную роль в сигнальной трансдукции и онкогенез [174].

Platycodon, тритерпеновые изолированы от Platycodon grandiflorum показали химические воздействия на опухоли, инвазии и миграции в HT-1080 опухолевых клеток. Platycodon снижение PMA-enhanced MMP9 и MMP2 активации в зависимости от дозы образом. Platycodon подавлено PMA усиленной экспрессии MMP9 белка, а также транскрипции мРНК и активности уровней через подавление NF-b активация без изменения TIMP1 уровнях. Platycodon также уменьшается PMA-enhanced выражение MMP2 активных форм путем подавления мембранного типа 1 ММП (MT1-MMP), но platycodon не изменяет MMP2 и TIMP2 уровнях. Кроме того, ROS производства индуцированных PMA был частично уменьшилась в присутствии platycodon, и это подавление выработки АФК может быть связано уменьшилась NF-b активностью [175]. В этом случае, NF-b ингибирование полностью ROS опосредованное, и большинство этих ROS высвобождаются из молекул глюкозы, которые присутствуют на боковой цепи. Platycodon было показано цитотоксическое и подавлять активности теломеразы, downregulating hTERT выражение в концентрации между 10 и 20 мкм. Platycodon также уменьшается c-Myc и SP1 уровни белка и ДНК-связывающих деятельности является дозозависимым [176] и подавил LPS-индуцированной экспрессии iNOS и COX-2 генов, подавляя NF-b активации на транскрипционном уровне [51].

71

Platycodon также усиленной экспрессии мРНК цитокинов IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10 и транскрипционного фактора T-bet и GATA-3 в мышей splenocyte индуцированных конканавалин а. это говорит о том, что количество сахарных остатков в гликозидных цепей, присоединенных к с-3 агликона может повлиять на гемолитические и адъювантной деятельности platycodigenin типа сапонинов [177]. Betulinic кислоты подавляется NF-b-зависимого репортерного Гена выражения и производство NF-b-регулируемых генов, продукты, такие как ЦОГ-2 и MMP9, которые вызваны воспалительные стимулы. Он также подавляются TNF-индуцированного апоптоза посредством активации NF-b и NF-b-регулируемой экспрессии генов, индуцируемых канцерогенами и воспалительных стимулов [35].

4.2. Роль Тритерпеноидов в опухоли выживаемость клеток, апоптоза и пролиферацииАпоптоз, что в переводе с греческого буквально означает “отпадение” - это процесс

программированной клеточной смерти, которая возникает обычно в многоклеточные организмы. Апоптоз-это естественный, организованный процесс, который играет важную роль в эмбриональном развитии и взрослой ткани равновесия, регулируя физиологические процессы. Человеческое тело состоит из шести триллионов клеток, около трех миллиардов клеток, заменить каждую минуту. Через процесс апоптоза, организм может устранить поврежденные или ненужные клетки без локального воспаления от утечки содержимого ячейки [178].

Потому что дерегуляции апоптоза является одним из наиболее важных факторов, участвующих в прогрессии опухолевых клеток, количество научных исследований было проведено на этот процесс, чтобы определить, если она может быть использована в лечении рака. Апоптоз-это механизм человеческого тела, для уничтожения клеток, что имеет нарушения, такие как повреждение ДНК, активации онкогенов, дефицит питательных веществ, или гипоксия. Но раковые клетки обладают способностью защитить апоптоза, что позволяет опухоли расти стремительно и неудержимо.

Апоптоз в раковых клетках могут быть вызваны активацией протеаз, такие как каспаз, ведущих к клеткам разрушения. Есть два различных пути, по которым это можно стимулировать апоптоз в раковых клетках. Первый-это внутренние пути через митохондрий, которая выпускает цитохром с-белков, таких как второй митохондрий derived activator of caspases (SMACs), которые связывают и деактивировать ингибиторы белков апоптоза (IAPs), что позволяет апоптоза, чтобы продолжить. Апоптотических сигналов в этом пути, могут прийти в форме члены Bcl-2 семейство белков, таких как pro-apoptotic Bax, которые могут быть upregulated по опухолевого супрессорного белка р53 в ответ на повреждение ДНК [179]. Второй путь-это внешние пути, в которых апоптоз инициируется активацией этих рецепторов, таких как рецепторы смерти 4 и 5 (DR4 и DR5) и ФАС, которые присутствуют на клеточной поверхности. Активация рецептора смерти путь рецепторов приводит к агрегации, которая затем инициирует подбор и активации инициатора каспазы-8. В то время как р53 участвует в собственном пути, это не играет никакой роли в примесной пути [178,180,181,182].

Активация STAT3 был связан с клеточной выживаемости, пролиферации и инвазии в различных опухолей человека. Некоторые члены Bcl-2 семейство белков, таких как Bcl-2 и Bcl-xL, также играют роль в апоптозе и были найдены, чтобы быть повышенными в различных типах раковых клеток. Эти белки вызывают у некоторых клеток развивать устойчивость к препаратов, используемых в лечении рака. Другой белок, survivin, может играть роль в прогрессии опухоли, как было установлено, в избыточных количествах в раковых клетках. Мишени для лечения рака может быть те, которые вызывают снижение экспрессии Bcl-2, Bcl-xL, и survivin белков и регуляция р53, Bax, и каспазы белков.

Тритерпеноиды были найдены действуют через внутренние пути апоптоза для предотвращения прогрессии опухоли. Например, многие spice производных тритерпеноидов, как было показано, индуцируют апоптоз в различных типах раковых клеток через различные механизмы. Среди них наиболее важными являются asiatic acid, astragaloside, celastrol, cucurbitacin, диосгенин, gypenoside, хедерагенина, люпеол, и momordin (Таблица 2). Эти тритерпеноиды имеют общую цель, антиапоптотических белков Bcl-2, который может индуцировать апоптоз в раковых клетках.

Pristimerin было показано, индуцируют митохондрий и гибели клетки в раковые клетки человека, и Роси зависимой активации как Bax и поли (ADP-рибоза) полимераза-1 (PARP-1) критически необходимых для митохондриальной дисфункции [117,183]. В человека HL-60 клеток, pristimerin также показал, антипролиферативным эффектами, с IC50 0.88 мкм [184]. В дополнение к этому,

72

pristimerin показали, что c-Jun N-терминальной киназы (JNK) был вовлечен в АФК-зависимой активации Bax, что увеличивает внутриклеточных ROS, активация JNK, конформационные изменения, и митохондриальных перераспределение Bax, мембранный потенциал митохондрий потери и гибель клеток. Предварительная обработка с pristimerin также активации PARP-1 [117]. Другое исследование показало, что pristimerin индуцированного апоптоза путем воздействия на протеасом в клетки рака простаты. Это может быть из-за накопления убиквитинированных белков и три протеасомных белков-мишеней, Bax, р27 и IκBα, в андрогенных рецепторов (АР)-отрицательный PC-3 клетки рака простаты, который поддерживает вывод о том, что протеасомы подавляется pristimerin [120]. Другое исследование показало, что этот апоптоз может быть индуцирован с pristimerin через прямое действие каспаз на митохондрии в MDA-MB-231 клеток [119]. Pristimerin показал противовирусной активностью, подавляя синтез вирусной ДНК, но не было никакого вирулицидный эффект [185].

Celastrol в сочетании с TNF-related apoptosis-индуцирующий лиганд (TRAIL/APO-2L) оказывало сильное синергическое антипролиферативное действие против раковых клетках человека, в том числе от рака яичника (ОВЧАР-8), рак толстой кишки (SW620) и рака легкого (95-D). In vivo, противоопухолевая эффективность TRAIL/APO-2L резко увеличился celastrol. Эти усиленные противораковые мероприятия сопровождались строке наступления каспазы-опосредованного апоптоза. Celastrol также подавляются TNF-индуцированную экспрессию различных генов, продукты, участвующие в антиапоптоза (IAP1, IAP2, Bcl-2, Bcl-xL, c-FLIP, и survivin), пролиферации (циклин D1 и ЦОГ-2), вторжение (MMP9) и ангиогенеза (VEGF) [52].

Диосгенин-индуцированного апоптоза был связан с ЦОГ-2 регуляция в Хель клеток [75]. Диосгенин также downregulated продуктов генов, участвующих в клеточной пролиферации (циклин D1, ЦОГ-2 и c-myc) и антиапоптоза (IAP1, Bcl-2, Bcl-xL, Bfl-1/A1, TRAF1, и cFLIP) [64].

Avicins романом растительные метаболиты, что снижение энергетического обмена в клетках опухоли путем воздействия на наружной митохондриальной мембраны Avicins dephosphorylated STAT3 в различных человеческих опухолевых клеточных линиях, ведущих к снижению транскрипционной активности STAT3. Экспрессии STAT3-регулируемых белков, таких как c-myc, циклин D1, Bcl-2, survivin, и VEGF были снижены в ответ на avicin лечения. Avicin также индуцированное дефосфорилирование STAT3, дефосфорилирование JAKs, и активации белка фосфатазы-1 [11]. Другое исследование показало, что avicins индуцированного апоптоза и downregulated p-STAT3, Bcl-2, и survivin в кожной T-клеточной лимфомы клеток. Avicin D не изменение экспрессии STAT3, но она снизилась фосфо-белка STAT3 уровнях [13,187].

Betulinic кислота ингибирует конститутивной активации STAT3, Src киназы, JAK1 и JAK2. Pervanadate отменил betulinic кислоты наведенные вниз регуляции активации STAT3, что позволяет предположить участие белка тирозин фосфатазы (PTP). Betulinic кислоты также downregulated экспрессии STAT3 регулируемые генные продукты, такие как Bcl-xL, Bcl-2, циклин D1, и survivin. Это связано с увеличением апоптоза, о чем свидетельствуют увеличение в суб-G1 клеточной популяции и увеличение каспазы-3-индуцированного расщепления PARP [188].

В последнее время, некоторые исследователи обнаружили, что природные тритерпеновые диолов стимулировать апоптоз клеток астроцитомы через АФК-опосредованного митохондриальной деполяризации и активации JNK. Спирты, извлеченные из оливкового масла, erythrodiol (промежуточный из олеаноловой кислоты), и его изомера, uvaol, были зарегистрированы противоопухолевым, особенно на раковые клетки мозга. Erythrodiol и uvaol эффективно пострадавших пролиферации клеток, а также фазы клеточного цикла и индуцированной 1321N1 гибели клеток и модулировать апоптотической реакции, продвижение ядерной конденсации и фрагментации. Эти результаты могут быть из-за производства рос с потеря митохондриального трансмембранного потенциала и коррелирует с активацией JNK. Наличие каталазы отменил тритерпеновые диолов индуцированной митохондриальной деполяризации, активация JNK, и апоптотической смерти, указывая на решающую роль АФК в действие диолов кольца соединений [189]. Олеаноловая кислота также upregulated экспрессия ЦОГ-2 и индуцированной простациклина (PGI2) синтез. Эти эффекты могут быть результатом ранней активации cAMP нормативно-element-binding protein (сниженная калорийность creb), ключевых транскрипционных факторов, участвующих

73

в ЦОГ-2 транскрипционная регуляция. Олеаноловая кислота также показал, кардиопротекторный эффекты [190].

Maslinic кислота присутствует в высоких концентрациях в оливковых выжимок. Различные исследования, в которых изучались реакции HT-29 и Caco-2 клеточные линии рака толстой кишки, чтобы maslinic кислотной обработки. Это также вызывает сильные G0/G1 клеточного цикла, арест и фрагментации ДНК, и повышенная активность каспазы-3. Однако, maslinic кислота не изменяет клеточного цикла или апоптоз в неопухолевой кишечной клеточных линий IEC-6 и IEC-18 [191].

Momordin ингибирует пролиферацию и индуцированного апоптоза в промиелоцитарного лейкоза человека (HL-60) клеток и цитотоксических для HL-60 клеток с IC50 из 19.0 мкг/мл. В антипролиферативный эффекты momordin видимому, объясняется его индукции апоптотической гибели клеток, как momordin индуцированной ядерной морфологии изменений и internucleosomal фрагментации ДНК и увеличилась доля гиподиплоид клеток. Momordin снизилась экспрессия антиапоптотических белков Bcl-2, но увеличение экспрессии проапоптотических белков Bax. Кроме того, лечение с momordin индуцированную активацию каспазы-3 и расщепление PARP [105]. Многие производные тритерпеноидов с природой, целевые каспаз, которые необходимы для апоптотической гибели клеток.

Saikosaponins были обнаружены цитотоксические в различных клеточных линий рака оказывать существенное ингибирование продукции оксида азота в LPS-индуцированной RAW 264.7 макрофагов, с IC50 4,2 и 10,4 мкм, соответственно [170]. Saikosaponins показали различные Фармакологические и иммуномодулирующее действие, в том числе противовоспалительные, антибактериальные, противовирусные и противораковые свойства. Лечение MDA-MB-231 с saikosaponin-к увеличению популяции клеток в суб-G1 фазы клеточного цикла. Эти результаты показали, что апоптоз в MDA-MB-231 клеток не зависит от р53/р21 пути механизму и сопровождается увеличением соотношения Bax, Bcl-2, увеличилось c-myc уровнях, и повышенной активации каспазы-3. В отличие от апоптоза клеток MCF7 было инициировано Bcl-2 семейство белков и участвует р53/р21-зависимого пути механизм, и это сопровождается увеличением уровня c-myc белок [192]. В другом исследовании, аксессуар в ФАС и двух лигандов, связанный с мембраной Fas лиганда (mFasL) и растворимый Fas лиганда (sFasL), а также белка Bax, было показано, что ответственность за эффект апоптоза, индуцированного saikosaponins [121]. Saikosaponins значительно повышают уровень c-myc и p53 мРНК [193]. Saikosaponins также вызвало G0/G1 клеточного цикла активированных Т-клеток путем downregulating уровни протеина CDK6 и циклин D3 и upregulating уровень протеина р27(КИП) [194].

Ингибирование NF-b активации урсоловая кислоты коррелирует с подавлением NF-b зависимых циклин D1, COX-2, и MMP9 выражение [125]. Урсоловая кислота заблокирован клеточного цикла в фазе G1 и было связано с заметным снижением экспрессии белков циклин D1, D2 и E, и их активация партнеров cdk2, cdk4 и cdk6 с сопутствующей индукции р21. Накопление p21/WAF1 может быть р53 зависимого. Накопление p21/WAF1 коррелирует с повышенной ФАС, ФАС лигандов и Бакс, и подавление NF-b, Bcl-2 и Bcl-xL [121]. Урсоловая кислота также upregulated апоптотических генов р53 и каспазы-3, а антиапоптотических генов Bcl-2 был downregulated [124].

CDDO, сосредоточены на 1-5 мкм, индуцированного апоптоза в различных клеточных линий рака. Кроме того, CDDO в сочетании с тропы способствовало индукции апоптоза. CDDO обычно действует через внешние и внутренние пути активации расщепления BID и каспаз-3, -8 и -9; downregulating флип; или индуцировать транслокацию Bax в митохондрии и высвобождение цитохрома C [195,196,197]. Противоопухолевая активность CDDO-Me был связан с ингибирование p-Akt, mammalian target of rapamycin (mTOR) и NF-b сигнальных белков и их нижестоящих целей, таких как p-плохо и p-Foxo3a для Akt; p-S6K1, p-eIF-4E и p-4E-BP1 для mTOR; и ЦОГ-2, VEGF и циклин D1 для NF-b [167].

Ацетил-11-кето-β-boswellic acid (AKBA), производная boswellic acid было показано, индуцируют апоптоз в раковых клетках. AKBA опосредованного ингибирования фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K)/Akt пути; этот путь имеет решающее значение для пролиферации и выживания [198]. Другое исследование показало, что циклин D1 и E, CDK2 и 4 и фосфорилированного белка ретинобластомы (Rb) были снижены в AKBA-обработанных клетках, в то время как p21expression был увеличен. Рост

74

ингибиторный эффект AKBA зависит от р21, но не р53 [199]. Цитостатического и апоптоз индуцирующего деятельности boswellic кислот в сторону злокачественных клеточных линиях было показано, in vitro [200]. Boswellic кислот запускается апоптоз посредством путь зависит от каспазы-8 активация, но независимая от Fas/Fas лиганд взаимодействия клеток рака толстой кишки [201]. AKBA ингибирует NF-b-зависимого репортерного Гена экспрессия активируется TNFR, TRADD, TRAF2, NIK, IKK, но не активируется p65 субъединицы NF-b, который указывает на то, что AKBA повышает апоптоза, индуцированного цитокинами и химиотерапевтических препаратов [46].

В HT-29 человеческих клеток рака толстой кишки, platycodon индуцированного апоптоза через ДНК фрагментацию и расщепление PARP. Апоптоз, индуцированный platycodon было связано с активизацией инициатор каспаз-8 и -9, а также эффекторные каспазы-3. Platycodon стимулировали Bid декольте, указывая, что апоптотические действием каспазы-8-опосредованному ставку расщепление приводит к активации каспазы-9. Увеличение экспрессии проапоптотических белков Bax и снижение экспрессии антиапоптотических белков Bcl-2. Platycodon также увеличение экспрессии каспаз-независимый митохондриального апоптоза фактором, апоптоз-индуцирующего фактора (AIF), в НТ-29 клеток. Таким образом, platycodon оказывает свой эффект апоптоза через каспаз-зависимый и каспаз-независимому пути [116,202,203].

Несколько тритерпеновые соединения, как было показано, как активировать каспазы деятельности и downregulate экспрессии Bcl-2 или Bcl-xL. Способность подавлять пролиферацию и индуцировать апоптоз в раковых клетках человека, безусловно, важен для препаратов для, либо злокачественные клетки в лечении или предраковых клеток в профилактике.

Одним из характерных признаков рака является агрессивной пролиферации клеток. В нормальной клетки, прекрасный баланс между ростом сигналы и antigrowth сигналов регулирует пролиферацию. Однако, этот прекрасный согласование теряется в раковые клетки, которые часто показывают неконтролируемого роста из-за потери обоих рост-регулирующих факторов. С одной стороны, раковые клетки приобретают способность генерировать собственные сигналы роста, а с другой стороны, они также не реагировать на antigrowth сигналов [204]. Многочисленные факторы регулируют естественный ход нормальной клетки. Некоторые из этих факторов, такие как cyclins, upregulated в раковые клетки, причиняя клеткам бесконтрольно тиражировать. Cyclins являются регуляторные белки, которые контролируют клеточный цикл, в то время как другие факторы, такие как ЦОГ-2 и c-myc играть вспомогательную роль. Наиболее часто затрагиваемых циклин в раковых клетках является циклин D1, важный регулятор клеточного цикла, что играет роль в переход клетки из фазы G1 в S фазу. Раковые клетки посмотреть гиперэкспрессия этого циклин D1 и, таким образом, это было связано с развитием и прогрессированием рака.

Avicins downregulate как STAT3 и экспрессии STAT3-регулируемых prosurvival белков, которые вносят свой вклад в индукцию апоптоза в опухолевых клетках. STAT3 играет важную роль в воспалении и ранения, и in vivo ингибирование VEGF. В мыши канцерогенеза кожи модели, avicins угнетал экспрессии STAT3, в результате подавления провоспалительных и прооксидантные стромальных среды опухолей [11]. Avicins в концентрациях 0.5-5.0 мкг/мл не вызывал апоптоз у больных' Sézary клеток, чем у здоровых доноров CD4+ Т-клеток и активированных CD4+ Т-клеток и снижение ингибиторов апоптоза bcl-2 и survivin [13]. Кроме того, avicin D-индуцированной autophagic гибели клеток было отменено сногсшибательность туберозный склероз комплекс 2 (TSC2), ключевого медиатора, связывающего AMP-активированной протеинкиназы (AMPK) ингибирование mTOR, предполагая, что активация AMPK является ключевым событием мишенью avicins. Avicins также, как было показано ниже, энергия метаболизма опухолевых клеток путем воздействия на наружной митохондриальной мембраны, вызывая гибель раковых клеток [187]. Опухолевые клетки генерировать гидроперекисей в очень высоком темпе, и avicins может обеспечить новые стратегии противоопухолевой терапии путем сенсибилизации клеток с высоким уровнем АФК для апоптоза. В другом исследовании, boswellic кислот, которые ингибируют активацию STAT3, привело к подавлению продуктов генов, участвующих в пролиферации (циклин D1), выживание (Bcl-2, Bcl-xL и Mcl-1) и ангиогенеза (VEGF) [32].

Maslinic кислоты показало, антипролиферативное действие в отношении Caco-2 раковые клетки (EC50 = 15 мкм), HT-29 человеческих клеток рака толстой кишки (EC50 = 74 мкм), 1321N1 астроцитома

75

клеток (EC50 = 25 мкм), и человеческих лейкозных клеток (ГК РФ-CEM и CEM/ADR5000) (EC50 = 7 и 9 мкм, соответственно). Maslinic кислоты, антипролиферативное деятельности, скорее всего, происходит от индукции окислительного пути апоптоза, который вызывает клеточный цикл и изменения цитоскелета. Maslinic кислота была найдена для уменьшения внутриклеточного окислительного стресса путем ингибирования NO и H2O2 производства и снижение провоспалительных цитокинов поколения в мышиных макрофагов [205]. Maslinic кислота ингибировала рост клеток с ЕС50 101,2 мкм без некротические эффекты. Этот эффект maslinic кислоты обусловлено гидроксильной группой у углерода 2 позиции, в конечном счете активирует каспазы-3 в качестве премьер-протеазы апоптоза [206]. 200 мкм концентрация maslinic кислоты было достаточно для активации каспазы-3, которая ингибирует пролиферацию клеток [207]. Maslinic кислоты от томатов оливковое масло показали угнетающее действие на окислительный стресс и в стимулированной продукции цитокинов мышиных макрофагов [208]. Тритерпеноиды изолирован от apple пилинги показали мощным антипролиферативным деятельности и может быть частично ответственным за яблоки’ противоопухолевой активностью.

Saikosaponins предотвратить распространение MCF-7 клеток при концентрации 10 нм до 10 мкм и был значительно тормозится специфический рецептор эстрогена (ER) антагонист сис-182780 [209]. Это антипролиферативный эффект за счет синтеза белков внеклеточного матрикса через экспрессирован в CDK4, c-Junи c-Fos гены [210], в котором блок клеточного цикла в фазе G1.

Потенции урсоловая кислоты был связан с ZIP/р62 и протеин киназы C-zeta (PKC-Зета). Урсоловая кислота ингибирует взаимодействие ZIP/р62 и PKC-Зета. Кроме того, подавляется активация NF-b и экспрессирован в MMP9 белка, что в свою очередь способствовало урсоловая кислоты, ингибирующий эффект на IL-1β или TNF-индуцированной клеток глиомы C6 вторжение [127]. Урсоловая кислота выявили сильнейших ингибирующей активности урокиназы (IC50 = 12 мкм) и катепсина B (IC50 = 10 мкм), и как протеазы участвуют в опухолевой инвазии и метастазирования, эта деятельность может быть полезным в лечении рака [211]. CDDO-Me ингибирует рост и индуцированного апоптоза в PC-3 и С4-2 клетки и был связан с ингибированием p-Akt, mTOR и NF-b сигнальных белков и ЦОГ-2, VEGF и циклин D1 [167]. Некоторые тритерпеновые производные, полученные из урсоловая кислоты показали способность подавлять de novo формирование двух ферментов, iNOS и COX-2, ИФН-γ стимулированного первичных мышиных макрофагов или LPS-активированных RAW 264.7 макрофагов, которые используются в качестве анализа систем [212].

Ингибирование активации STAT3 boswellic кислот привело к подавлению продуктов генов, участвующих в пролиферации (циклин D1), выживание (Bcl-2, Bcl-xL и Mcl-1) и ангиогенеза (VEGF. Betulinic кислоты в сочетании с винкристином показал синергическое цитотоксическое действие на клетки меланомы, индуцирование клеточного цикла в различных точках (betulinic кислоты в G1 фазе и винкристин в фазе G2/M) и вызывая апоптоз в клетках меланомы B16F10. У мышей линии C57BL/6 мышей, винкристин, ингибирует метастазирование клеток меланомы в легких, эффект, который был дополнен добавлением betulinic кислоты [213].

4.3. Роль Тритерпеноидов в Инвазия, Метастазирование и АнгиогенезПомимо бесконтрольного распространения, основных характеристик раковых клеток инвазии и

метастазирования. В метастазирования раковых клеток мигрируют от их первоначального исходного узла на другие части тела, либо через кровь или лимфатическую систему. Среди факторов, влияющих на вторжение, которое влияет ли опухоль метастазы, Ммпс и ICAM-1. Мгэс (в частности, MMP2 и MMP9) endopeptidases, которые деградируют компонентов базальной мембраны, разделяющей клетки от окружающей их ткани и позволяя им свободно двигаться и распространяться в другие ткани [214]. Хемокинового рецептора CCR7 важно для лимфатической инвазии раковых клеток и надэкспрессироанных в метастатических клеток рака молочной железы; withanolide тормозит TAK1, чтобы подавить NF-b-индуцированной экспрессии CCR7 в клетках рака молочной железы и полезен для профилактики лимфатического вовлечение клеток рака молочной железы [215].

Erythrodiol-3-ацетат, тритерпеновые, снизился уровень MMP1 и индуцированной проколлагена 1 типа в зависимости от дозы образом [216]. Ganoderma lucidum известный гриб, содержащий platycodon, показали значительное ингибирующее действие на PMA-индуцированной MMP9 и MMP2 активации в зависимости от дозы образом и дальше угнетали HT-1080 и HepG2 клеток инвазии и

76

миграции [217]. Другое исследование показало, что boswellic кислот усиливал апоптоз, индуцированный TNF и химиотерапевтических агентов, подавленные, TNF-индуцированной вторжения, и ингибирует NF-b-индуцированной osteoclastogenesis [46].

Ангиогенез является основанием для солидных опухолей, развитие и распространение, и антиангиогенных препаратов были продемонстрированы, чтобы быть активным на сайте рака. Рост человеческих опухолей и развитие метастазов зависит от de novo формирование кровеносных сосудов [218]. Ангиогенез, физиологический процесс, в котором новые кровеносные сосуды развиваются из уже существующих, как правило, возникает в период роста, размножения и заживления ран; однако, этот процесс также является маркером, указывающим, что опухоль прогрессировала от дремлющего в злокачественное состояние. Ангиогенез способствует росту опухоли, обеспечивая кислородом и питательными веществами размножение клеток через новообразованные сосуды. Некоторые проангиогенных факторов, которые способствуют развитию новых кровеносных сосудов включают в себя IL-8, ФНО, фактор роста фибробластов-2 (FGF-2) и PDGF. Однако, наиболее важным фактором во всем процессе ангиогенеза является VEGF. Различные исследования показали, что она является мощным стимулятором ангиогенеза in vitro [218]. Из-за его важную роль в ангиогенезе, он был предназначен для контроля прогрессии опухоли. Ограничение VEGF в опухоли было показано, приводят к крови и разрушение сосудов и предотвращает рост новых, тем самым снижая кровоснабжение опухоли. Ингибирование тирозинкиназы VEGF сигнальный путь заблокирован ангиогенеза в растущие опухоли, ведущие к застою и регрессу опухоли. Таким образом, агенты, которые могут downregulate или ингибировать экспрессию VEGF или его сигнальных путей в опухолевых клетках может оказаться очень перспективным в предотвращении опухолевого роста и метастазирования.

Saikosaponin C, один из saikosaponins настоящее время в китайской травой, Radix bupleuri установлено , что обладают мощным индуцирующим эффектом на эндотелиальных клетках пупочной вены человека’ жизнеспособности и роста. Saikosaponin C также индуцированной миграции эндотелиальных клеток и капиллярной трубки формирования. Saikosaponin C индуцированной экспрессии или активации MMP2, VEGF, и p42/p44 MAPK, что коррелирует с роста эндотелиальных клеток, миграцию и ангиогенеза, соответственно [219]. Другое исследование показало, что saikosaponins может препятствовать физиологического ангиогенеза куриных эмбрионов, особенно для средних и малых судов [220].

CDDO-Me и CDDO-Im было показано, подавляют активацию ERK1/2 пути после стимуляции с VEGF в эндотелиальных клетках пупочной вены человека [221]. CDDO-Me также потенцировал цитотоксические эффекты TNF и химиотерапевтических агентов. Это может быть потому, что CDDO-Me ингибирует NF-b через ингибирование IκBα киназы, ведущих к подавлению NF-b-регулируемых генов продукта (VEGF, COX-2, и MMP9) выражения и ангиогенеза [222]. Boswellic кислот подавляется VEGF-индуцированного фосфорилирования рецептора VEGF 2 (VEGFR2) киназы (KDR/Flk-1), IC50 из 1,68 мкм. В частности, boswellic кислот подавила вниз по течению протеинкиназ из VEGFR2, включая киназы семейства Src, киназы фокальной адгезии, ЭРК, AKT, mTOR и рибосомного белка S6 киназы [223]. В ex vivo модель, boswellic кислот значительно ингибирует образование кровеносных сосудов в Матригеля plug биопробы на мышах и эффективно подавляются VEGF индуцированной микрососудов прорастания в крысиной аорты кольцо анализа. Кроме того, boswellic кислот, ингибирует VEGF-индуцированной пролиферации клеток, хемотаксические моторики, формирование капилляроподобных структур из первичных культивируемых человеческой пуповины сосудистых эндотелиальных клеток в зависимости от дозы [223]. Betulinic кислота также ингибирует фактор роста-индуцированной in vitro ангиогенез путем модуляции функции митохондрий в клетках эндотелия [224].

Различные in vivo исследования показали, что celastrol можете downregulate плотность микрососудов опухоли значительно в разных дозах. Иммуногистохимия показала, что celastrol также снизились уровни VEGFR1 и VEGFR2 выражение, но не уровень экспрессии VEGF [225]. Однако, avicins, downregulate экспрессии VEGF [166]. В in vivo исследование показало, что Ganoderma lucidum учитывая, 100 и 200 мг/кг угнетал первичной твердой рост опухоли в селезенке, печени, метастазами, и вторичный метастатический рост опухоли в печени в intrasplenic карциномой легких

77

Льюис-имплантированных мышам. В in vivo assay system экстракт ингибирует Матригеля индуцированного ангиогенеза [226].

5. Роль Тритерпеноидов в лечении ракаТритерпеноиды являются структурно разнообразных органических соединений. Более 20 000

тритерпеновые сортов формируются различные модификации базовой опорной структуры. Несколько тритерпеноиды, таких как avicin, betulinic кислоты, boswellic кислот, celastrol, диосгенин, madecassic кислоты, maslinic кислоты, momordin, saikosaponins, platycodon, pristimerin, урсоловая кислота, CDDO, и withanolide, как было показано в нашей лаборатории, и другие обладают противоопухолевой и противовоспалительной активности. Предварительные данные проводимых исследований свидетельствуют о том, что некоторые синтетические тритерпеноиды разрабатываются с улучшенными противоопухолевой активностью. Несколько тритерпеноиды теперь в клинических испытаниях на разных фазах (Таблица 4; www.clinicaltrials.gov). Синтетические тритерпеноида, CDDO, проходит испытания у пациентов с различными формами рака. Betulinic кислота мазь при оценке для лечения диспластических невусов, которые обладают способностью трансформироваться в меланому. Тритерпеноиды очень многофункциональный и, таким образом, обещание в качестве агентов в лечении рака, потому что их способность блокировать NF-b активации, индуцировать апоптоз, и препятствуют пролиферации, инвазии, метастазирования и ангиогенеза.

Таблица 4Список тритерпеноидов в клинических испытаниях.

Тритерпеноиды Рак Фаза Статус Спонсо

ры

CDDO-Me Солидные опухоли или Я Прекращено MDACC

Лимфоидные злокачественные новообразования

CDDO Солидные Опухоли Я Завершен NCIили Лимфома

CDDO-Me Заболевания печени I/II Прекращено RPI

Гинзенозиды Рак молочной железы II Текущие SIUГинзенозиды Гипертония II Завершен SMH

Гинзенозиды Ишемический Инсульт II/III Завершен XH

Betulinic кислоты Диспластические nervus синдром I/II Текущие UIЭсцин Arm лимфедема II Завершен UWГлицирризин Гепатит C III Текущие SPГлицирретиновой

кислоты Терминальная стадия почечной

недостаточности II Текущие Ухи

Глицирретиновой кислоты AME II/

III Завершен BWH

MDACC, MD Anderson Cancer Center, США; NCI, Национальный институт рака, США; RPI, Reata Pharmaceuticals, Inc; SIU, Southern Illinois University; SMH, St. Michael's Hospital, Торонто; XH, Xijing больницы, Китай; UI, Университет Иллинойса; UW, Университет Висконсина, США; SP, Schering-Plough; ухи, Университет, больница, больницы, Швейцария; AME, очевидно, Mineralocorticoid избыток; BWH, Brigham and Women's Hospital, США

78

6. ВыводыЭтот обзор показал, что тритерпеноиды являются важными активных компонентов, полученных из

различных растений и могут быть рассмотрены для использования в обоих химиопрофилактики и химиотерапии рака. Воспалительных белков и их пути важных целей в профилактике и лечении рака. Таким образом, выявление агентов или препараты, которые могут угнетать этих путей имеет огромное значение.

Полициклические тритерпеноиды теперь важно предложить новые платформы для разработки лекарств. Природные тритерпеновые платформе предусмотрено уникальный стереохимия этих соединений, и циклизации линейного 30-углеродные молекулы сквалена, предоставили отличную базу новых агентов более мощным, чем родительский сквален может быть разработана.

Таким образом, агенты, которые могут подавлять NF-b и активации каспаз и других путей (например, DR4, DR5), скорее всего, будут эффективные препараты. Потому что их безопасность и способность воздействовать на несколько целей, натуральные продукты, вероятно, будут иметь особое место в профилактической и терапевтической арсенале против рака. Хотя существуют обширные доклинические данные для поддержки таких претензий, только клинические исследования можно полностью проверить их.

1. IntroductionNatural compounds have been used extensively in the treatment of many diseases and are of interest to

researchers both in their natural forms and as templates for synthetic modification. Natural compounds currently used in medicine exhibit a very wide chemical diversity, and together with their analogues and several other natural products, they demonstrate the importance of compounds from natural sources in modern drug discovery efforts. Sample sources and molecular mechanisms are highly important in the development of novel, clinically useful anticancer agents [1]. Interest in natural compounds has grown in recent years because of concerns about drug costs and safety. For example, glioblastoma kills almost everyone who gets it, usually in a little over a year. In effect, the $1.3 billion spent by a pharmaceutical company on a new glioblastoma drug discovery had the limited impact of improving patients’ lives for about one year. This illustrates the need for new sources for drug discovery, and natural sources provide valuable information for research in this area. During the past decade, tremendous progress has been made toward understanding the cellular and molecular mechanisms underlying the process of carcinogenesis, leading to the development of potential cancer prevention options termed chemoprevention [2]. The goal of chemoprevention is to use noncytotoxic natural agents to inhibit or reverse the development and progression of precancerous cells [3].

Cancer is a complicated disease that may develop in humans over a number of years (Figure 1). Development of a tumor starts with a normal cell that is transformed through the activation of proto-oncogenes and the suppression of tumor suppressor genes such as p53. The transformed cell no longer behaves like a normal cell but begins to exhibit the properties of a cancer cell. Such transformation in the cells makes them self-sufficient in growth signals and resistant to antigrowth signals, resulting in uncontainable proliferation. In addition, these cells are able to avoid apoptosis, resulting in tumor growth. This whole process of transformation may take 10–20 years. The growth of the tumor is aided by angiogenesis, which not only provides nutrition to the tumor but also enables its invasion to surrounding tissues, and its metastasis to distant tissues; the latter is usually lethal.

Roles of the NF-κB-mediated inflammatory pathway in cellular transformation and in cancer cell survival, proliferation, invasion, angiogenesis, and metastasis.

Inflammation, which occurs as a response to cancer, has two stages, acute and chronic. Acute inflammation, the initial stage of inflammation, represents innate immunity; it is mediated through the activation of the immune system, lasts for a short period and generally is regarded as therapeutic inflammation. If the inflammation persists for a long period of time, however, the second stage, chronic inflammation, sets in [4]. Chronic inflammation has been linked with most chronic illnesses, including cancer, cardiovascular disease, diabetes, obesity, pulmonary disease, and neurologic disease [5], the current review focuses on the role of triterpenoids in targeting inflammatory pathways for prevention and treatment of cancer.

79

Evidence from tissue culture, animal, and clinical studies suggests that more than 20,000 triterpenoid-rich fruits are found in nature and have the potential ability to limit the development and severity of certain cancers and inflammatory diseases [6]. These triterpenoids, along with their close chemical relatives the steroids, are members of a larger family of related structures called cyclosqualenoids. Triterpenoids, synthesized in many plants by the cyclization of squalene [7], are widely used in Asian medicine. More than 100 prescribed drugs in the United States are obtained from natural sources and represent one fourth of the total drugs used. Apart from these drugs that originate from natural sources, other phytochemicals also serve as potential drugs after structural modification [8].

Scientific studies have shown triterpenoids to be potential anti-inflammatory and anticancer agents. This review covers the anti-inflammatory and anticancer property of triterpenoids originating from plants such as onion, ginseng, brahmi, azuma ichirinsou, shallaki, salai guggal, lei gong teng, licorice, mango, olive, bearberry, Chinese bellflower, sickle-leaf, tulsi, ashwagandha, and others (Figure 2 and Table 1) that target one or more of the various phases of tumorigenesis. As more than 20,000 triterpenoids are available in nature and it is difficult to describe them all, this review summarizes what we know of a few triterpenoids with structural similarity, including avicin, erythrodiol, madecassic acid, maslinic acid, momordin, saikosaponins, 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oic acid (CDDO) and its methyl ester CDDO-Me, platycodon D, withanolide, diosgenin, betulinic acid, boswellic acids, pristimerin, and celastrol (Figure 3); their active moieties for anti-inflammatory and anticancer activity

Table 1Common medicinally active triterpenoid obtained from plants.Chemical Compound Common Name Botanical NameTetracyclic

triterpenoid

Astragaloside Chinese milk vetch Astragalus membranaceus

Cucurbitacin White bryony Bryonia alba

Diosgenin Fenugreek Trigonella foenum graecum

Ganoderic acid Reishi Ganoderma lucidumGinsenoside Ginseng Panax ginseng

Gypenoside Jiaogulan Gynostemma pentaphyllum

Oleandrin Oleander Nerium oleanderPentacyclic

triterpenoidAmyrin Japanese persimmon Diospyros kakiAsiatic acid Indian pennywort Centella asiaticaAvicin Elegant wattle Acacia victoriaeBetulinic acid Indian jujube Ziziphus mauritiana

Anemone Anemone raddeanaClub mosses Lycopodium cernuumTrumpet satinash Syzygium claviflorum

Boswellic acid Boswellia, Boswellia serrataFrankincense, salai guggal Boswellia carteri

Celastrol Thunder god vine Tripterygium wilfordiiEscin Horse chestnut Aesculus hippocastanumGlycyrrhizin Licorice Glycyrrhiza glabra18-β-Glycyrrhetinic

acid Licorice Glycyrrhizia glabra

80

Chemical Compound Common Name Botanical NameLupeol Mango Mangifera indica

Three leaved caper Crataeva nurvala

Madecassic acid Indian pennywort, gotu kola Centella asiatica

Momordin Burning bush Kochia scopariaOleanolic acid Bearberry Arctostaphyllos uva-ursi

Heather Calluna vulgarisThree leaved caper Crataeva nurvalaReishi Ganoderma lucidumChinese elder Sambucus chinensisSodom's apple Solanum incanum

Platycodon D Balloon flower Platycodon grandiflorumPristimerin Espinheira santa Maytenus ilicifolia

Pale Bittersweet Celastrus hypoleucusThunder god vine Tripterygium wilfordii

Saikosaponins Hare's ear root, sickle-leaf Bupleurum falcatum L.Ursolic acid Holy basil, tulsi Ocimum sanctum L.

Thyme Thymus vulgaris L.Lavender Lavandula augustifoliaCatnip Nepeta sibthorpiiPeppermint leaves Mentha piperita L.

Withanolide Indian ginseng, ashwagandha Withania somnifera

The review also focuses on targets for inflammation, proliferation, apoptosis, invasion, metastasis and angiogenesis. Because a large portion of these nutraceuticals show great potential for targeting cancer through various mechanisms—such as the downregulation of transcription factors (e.g., nuclear factor-kappaB [NF-κB]), anti-apoptotic proteins (e.g., bcl-2, bcl-xL), promoters of cell proliferation (e.g., cyclooxygenase-2 [COX-2], cyclin D1, c-myc), invasive and metastatic genes (e.g., matrix metalloproteinases [MMPs], intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), and angiogenic protein (vascular endothelial growth factor (VEGF)) (Table 2); and other uses of these triterpenoids are shown in Table 3. This review summarizes the sources and structures of triterpenoids and provides insight into the underlying molecular targets for cancer prevention and therapy.

Table 3Other uses of triterpenoid in treatment of chronic diseases.Disease Triterpenoid

Diabetes Astragaloside, Cucurbitacin, Diosgenin, Ginsenoside, Amyrin, Asiatic acid, Avicin, Betulinic acid, Escin, Glycyrrhizin, Oleanolic acid, Platycodon D, Ursolic acid, Withanolide

Cardiovascular

Astragaloside, Cucurbitacin, Diosgenin, Ginsenoside, Gypenoside, Oleandrin, Betulinic acid, Escin, Glycyrrhizin, Lupeol, Oleanolic acid, Platycodon D, Saikosaponins, Ursolic acid, Withanolide

Arthritis Cucurbitacin, Diosgenin, Ginsenoside, Amyrin, Boswellic acid, Celastrol, Glycyrrhizin, Lupeol, Oleanolic acid, CDDO-Me, Ursolic acid, Withanolide,

Atherosclerosis Diosgenin, Gypenoside, Betulinic acid, Glycyrrhizin, Oleanolic acid, Ursolic acid

Obesity Diosgenin, Ginsenoside, Betulinic acid, Escin, Glycyrrhizin, Platycodon D, Momordin, Oleanolic acid, Ursolic acid

Alzheimer CDDO-MA, Alpha-onocerinParkinson CDDO-MA

81

Disease TriterpenoidMultiple

sclerosis Oleanolic acid

Depression Asiatic acid Osteoporosis Ursolic acidCerebral

ischemia Escin, Asiatic acid

Memory loss CDDO-MA2. Source and Structure of TriterpenoidsTriterpenoids are metabolites of isopentenyl pyrophosphate oligomers that are chemically related to

squalene, which is a large group of compounds having 30 carbon atoms arranged in five rings with several oxygen atoms attached. Triterpenoids are part of the largest group of plant products, Saponins can be chemically biosynthesized when one or more sugar moieties attach to aglycone. There are two types of saponins, steroidal aglycone and triterpenoid aglycone. Both steroid and triterpenoid systems are found to be biosynthesized from a common precursor such as squalene [139]. Triterpenoids are synthesized from isopentenyl pyrophosphate (IPP) and its isomer dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP). For this cyclization, three prenyltransferases synthesize the linear prenyl pyrophosphates geranyl pyrophosphate (GPP), farnesyl pyrophosphate (FPP), and geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP). Squalene is in turn derived biosynthetically by the cyclization of a number of units of isoprene, (C5H8)n, which undergo folding through 20 different patterns in the presence of prenyl pyrophosphates to form monocyclic, dicyclic, tricyclic, tetracyclic, or pentacyclic derivatives [140]. A family of oxidosqualene cyclases may produce only a single product, such as lupeol cyclases, but there are also multifunctional oxidosqualene cyclases that use dammarenyl cation intermediates to produce many products. Once squalene undergoes cyclization, it goes through the cytosolic mevalonate pathway to make a proximate tetracyclic C30 compound, lanosterol (Figure 4), which further undergoes oxidation and catabolic metabolism to form cholesterol.

The variety of triterpenoids in nature is a result of the evolution of a large terpene synthase superfamily. One study analyzed the amino acid sequences of terpene synthase genes and found that all originated from an ancestral diterpene synthase. It was also found that the diversity of these triterpenoids is due to the structural features of their catalyst enzymes. Terpenes and their metabolites are widely distributed in various plant systems that depend on various biotic and abiotic environmental factors. Terpenes and their metabolites are used in several developmental and physiological functions on the basis of the differential expression profiles of terpene synthase genes. Terpenes and their metabolites play a very important role in a plant’s defense mechanism. They protect the plants from both constitutive and induced defensive responses against insects and environmental stress [141,142]. Hence, triterpenoids provide a very good protection shield for plants, indicating their potential for use in the prevention of various cancers and inflammatory diseases in humans.

3. Molecular Targets of TriterpenoidsIn 1856, Rudolf Virchow for the first time showed inflammation to be a predisposing factor for various

types of cancer. Today, the data suggest that at least one in seven malignant tumors diagnosed worldwide results from chronic inflammation and infection. Recognition of this fact has led to greater interest in research for molecular targets involved in the inflammatory pathways that trigger cancer and to find novel markers that restrain cancer progression along these pathways.

The conventional methods of treatment of cancer include surgery, chemotherapy and/or radiotherapy; the mode of treatment depends largely upon the type of cancer the patient has. Innovative, so-called multitargeting therapies from natural resources are urgently needed to target the various steps of cancer progression or the processes involved in cancer cell survival and metastasis to other parts of the body.

It is clear now that cancer is not a simple disease involving a single gene, but a complex disease involving interaction between multiple genes, either within the same cell or with those of neighboring tissues. The prevention or progression of human cancer depends on the integrity of a complex network of defense mechanisms in which 300–500 genes have gone wrong, leading to the upregulation of undesired products such as antiapoptotic proteins or the downregulation of tumor suppressor proteins.

82

3.1. NF-κBNF-κB, a ubiquitous transcription factor, was discovered in 1986 as a nuclear factor that binds to the

enhancer region of the κB chain of immunoglobulin in B cells. It is present in all cells, and in its resting stage, this factor resides in the cytoplasm as a heterotrimer consisting of p50, p65, and inhibitory subunit IκBα. NF-κB is activated by free radicals, inflammatory stimuli, cytokines, carcinogens, tumor promoters, endotoxins, γ-radiation, ultraviolet light, and x-rays [143]. On activation, the IκBα protein, an inhibitor of NF-κB, undergoes phosphorylation, ubiquitination, and degradation. p50 and p65 are then released to be translocated to the nucleus, bind to specific DNA sequences present in the promoters of various genes, and initiate the transcription of more than 400 genes. The kinase that causes the phosphorylation of IκBα is called IκBα kinase (IKK). Whereas the IKKβ mediates the classic/canonical NF-κB activation pathway, the IKKκ mediates the noncanonical pathway. IKK itself must be activated before it can activate IκBα. More than a dozen kinases have been described that can activate IKK, including protein kinase B (Akt), mitogen-activated protein/extracellular signal-regulated kinase kinase 1 (MEKK1), MEKK3, transforming growth factor (TGF)–activating kinase 1 (TAK1), NF-κB–activating kinase, NF-κB–inducing kinase, protein kinase C, and the double-stranded RNA-dependent protein kinase (PKR).

3.2. STAT3Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), one of the major molecular targets of

triterpenoids, was first identified in 1994 as a DNA-binding factor that selectively binds to the IL-6-responsive element in the promoter. The activation of STAT3 is regulated by the phosphorylation of tyrosine 705 by receptor and nonreceptor protein tyrosine kinases, including epidermal growth factor receptor (EGFR) kinase [144], Src [145], Janus-activated kinases (JAK) [146,147], and extracellular signal-regulated kinase (ERK) [148]. The phosphorylation of STAT3 in the cytoplasm leads to its dimerization, translocation into the nucleus, and DNA binding, which results in the regulation of several genes involved in cell proliferation, differentiation, and apoptosis.

3.3. Other PathwaysA large body of evidence signifies the role of inflammation in cancer development through mediators

such as reactive oxygen species (ROS), free radicals, and inflammatory cytokines like tumor necrosis factor-α (TNFα), lymphotoxins, and angiogenic factors. Also known to influence oncogenesis are signaling pathways that in normal cells are involved in tissue homeostasis, such as the NF-κB, prostaglandin/cyclooxygenase-2 (COX-2), and p53 pathways; the DNA repair machinery; and a family of the Toll-like receptor proteins.

Some of the most commonly known molecular targets of triterpenoids involved in the treatment and prevention of cancer have been targeted according to comprehensive knowledge of tumor growth and metastasis. This approach will maximize the effect of triterpenoids and minimize side effects by multitargeting the cells or processes that enable cancer to survive and spread in humans.

4. Role of Triterpenoids in Cancer Prevention4.1. Role of Triterpenoids in InflammationInflammation is derived from the Latin word ‘inflammare or inflammatio’, which means, “to set on fire.”

Inflammation is a basic defense mechanism in which the body reacts against infections, irritations, or other injuries. The four key features of inflammation are redness, heat, swelling, and pain. Inflammation stimulates the immune response at the site of injury or infection and is itself stimulated by increases in blood supply and vascular permeability, which allow more infiltration of plasma and leukocytes from the blood into injured tissues. This particular type of immune response is important because it helps the body to ward off pathogens and also to initiate the healing process in the damaged tissues. This reaction is classified as acute inflammation. Studies have shown that chronic inflammation is a progenitor of tumor progression and that many cancers have been found to arise from sites of infection, chronic irritation, and inflammation. Inflammation orchestrates the microenvironment around tumors and allows them to progress by fostering proliferation, survival, and migration [149]. The inflammatory cells and the network of signaling molecules provided by the inflammatory microenvironment are necessary for the malignant progression of transformed cells.

Inflammation promotes tumor development through both nonimmune and immune. NF-κB is a central transcription factor mediating inflammatory and innate immune responses. NF-κB may be activated by

83

various factors, including cytokines, microbial pathogens, and oxidative, genotoxic, physiological, or chemical stress factors. In addition to these, proinflammatory cytokines and chronic infections can play an important role in the stimulation of IKK activity, which leads to constitutive NF-κB activation [150,151,152]. The activation of NF-κB through IKKβ plays a major role in inflammation induced tumor promotion and progression. Various proinflammatory factors like TNFα and Toll-like receptor ligands such as lipopolysaccharide (LPS) normally activate these pathways [153]. This activation signals the transcription of various cancer-promoting genes such as antiapoptotic genes, proangiogenic genes, and proinvasion genes [154]. NF-κB DNA binding is thought to result in the activation of a number of genes that lead to inflammatory diseases like Alzheimer disease and arthritis in addition to cancer [143].

Along with NF-κB, factors such as TNF and interleukins (IL-1β, IL-6, and IL-8) also serve as connecting links between inflammation and cancer. TNF is released mainly from macrophages and regulates immune cells. Its dysregulation and overproduction lead to cancer and other diseases. TNF also plays a role in the activation of NF-κB by binding to a TNF receptor present on the cell surface that in turn triggers a pathway that leads to the activation of IKK [3]. Interleukins are a group of cytokines released in the body from numerous cells in response to various stimuli. While IL-1β plays an important role in the inflammatory response against infection by increasing the expression of endothelial adhesion factors, thus allowing infiltration of leukocytes at the site of infection, IL-6 is a proinflammatory cytokine released in response to trauma or tissue damage. IL-8, a member of the CXC chemokine family also known as CXCL8, can function as a mitogenic, angiogenic, and mutagenic factor promoting cancer progression [155].

Inflammatory cells and their regulators are found to facilitate angiogenesis and promote the growth, invasion, and metastasis of tumor cells [156]. Normal levels of some enzymes like inducible nitric oxide synthase (iNOS) and COX-2 play an essential role in the physiological protective response to tissue injury, but if expressed in excessive amounts, these inflammatory enzymes may cause carcinogenesis [149,157,158]. In tumor tissue, levels of prostaglandins (PGs) are often elevated. PGs are endogenous mediators of inflammation and are formed from arachidonic acid by constitutive COX-1 and inducible COX-2. Production of higher levels of PGs is thought to cause cellular injury and ultimately lead to carcinogenesis by inhibiting apoptosis, stimulating cellular proliferation, and promoting angiogenesis and tumor invasiveness [159]. Cycloartane triterpenoids from Cimicifuga dahurica suppressed the expression of cdc2 and COX-2 protein. These results imply that triterpenoids possess potential antitumor activities and exert their cytotoxicity through apoptosis and G2/M cell cycle arrest [146].

Many triterpenoids derived from botanical sources play an important role in reducing inflammation. These include avicin, asiatic acid, astragaloside, betulin, betulinic acid, boswellic acid, celastrol, cucurbitacin, diosgenin, erythrodiol, ganoderiol, ginsenosides, glycyrrhizin, glycyrrhetinic acid, gypenoside, lupeol, madecassic acid, maslinic acid, oleandrin, oleanolic acid, platycodon D, pristimerin, saikosaponins, ursolic acid, and withanolide (Table 2). Many of these triterpenoids target NF-κB, leading to its downregulation.

Pentacyclic triterpenoids have been found to have many functions, although their effective concentrations for various cellular effects may vary widely. Depending upon the dose administered, triterpenoids can induce anti-inflammatory, cytoprotective, tumor-differentiating, proliferation–arresting, and apoptotic effects [160,161,162]. The anticancer activities of triterpenoids appear to be mediated, at least in part, by their common ability to block TNF-induced NF-κB activation by inhibiting IKKβ [163,164]. The synthetic triterpenoid 1-[2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oyl] imidazole (CDDO-Im) blocks NF-κB activation through direct inhibition of IKKβ [35]. This is evident from the fact that the molecular targets of the synthetic oleanane triterpenoids include IKK and also pathways involving STAT, IL-6, TGF-β, and KEAP1 (the inhibitor of the transcription factor Nrf2). Inhibition of multiple targets by triterpenoids is believed to be mediated by the promiscuous reversible Michael addition of these compounds to exposed nucleophilic groups (such as accessible cysteine sulfides) of various susceptible signaling proteins [165]. Triterpenoids affect multiple signaling pathways, and the clinical properties of triterpenoids, particularly those of pentacyclic triterpenoids, have been shown in various studies. The structure-activity relationships indicate that the presence of α,β-unsaturated carbonyl moieties significantly enhance the potency of these pentacyclic triterpenoids. Of the 12 pentacyclic triterpenoids, four (CDDO, CDDO-Me, pristimerin, and celastrol) have been shown to be potently and selectively lethal to different cancer cells and show a several

84

fold increase in anti-inflammatory activity. This action is caused by the α,β-unsaturated carbonyl in ring A. The incorporation of a cyano and keto group within this enone moiety further enhances its efficacy and potency.

Avicins are electrophilic pentacyclic triterpenoids with proapoptotic, anti-inflammatory, and antioxidant properties derived from Acacia victoriae. Avicins have been shown to induce redox-dependent post-translational modification of cysteine residues to regulate protein function, which downregulate both STAT3 activity and the expression of STAT3-regulated prosurvival proteins and contribute to the induction of apoptosis in vitro [166]. Avicins were found to be potent inhibitors of TNF-induced NF-κB and to slow the accumulation of the p65 subunit of NF-κB in the nucleus; however, the degradation of IκBα was unaffected. In addition Avicins blocked the binding of NF-κB to DNA in in vitro binding assays. Treatment of cells with dithiothreitol (DTT) totally reversed the avicin G-induced inhibition of NF-κB activity, suggesting that sulfhydryl groups critical for NF-κB activation were being affected. Avicin G treatment decreased the expression of NF-κB regulated proteins such as iNOS and COX-2 [16]. Other studies showed that pretreating cells with triterpenoids for 24 hours significantly reduced the induction of NF-κB mediated through TNF-α [44,167].

Pristimerin, a natural triterpenoid, elicits cellular responses closely resembling those elicited by proteasome inhibitors, such as the rapid induction of heat shock proteins (HSPs), activating transcription factor 3 (ATF3), and C/EBP homologous protein (CHOP). Pristimerin also inhibits NF-κB activation by inhibiting IKK-α or IKK-β, whereas proteasome inhibitors instead suppress NF-κB function by impairing the degradation of ubiquitinated IκB. By inhibiting both IKK and the proteasome, pristimerin suppresses the activation of constitutive NF-κB in myeloma cells. Multiple myeloma is exquisitely sensitive to proteasome or NF-κB pathway inhibition. Consistent with this, pristimerin has been shown to be potently and selectively lethal to primary myeloma cells (IC50 < 100 nM) and to inhibit xenografted plasmacytoma tumors in mice [118]. Pristimerin is also known as an antifungal, antimicrobial, and anti-inflammatory plant compound with an effect on the iNOS system in LPS-activated RAW 264.7 macrophages [168].

Celastrol, a natural triterpenoid with a structure similar to that of pristimerin, is found in the thunder god vine and was identified as having potential for use in cancer treatment because of its ability to enhance the death of melanoma cells. Celastrol also inhibited cell proliferation in melanoma cells. When celastrol was used to treat melanoma cells, it (like pristimerin) increased levels of ubiquitinated proteins, reduced levels of TNF-α-induced IκB phosphorylation, and blocked NF-κB translocation to the nucleus at nanomolar concentrations; however, the molecular mechanism for these effects differed. Celastrol normally inhibits LPS-induced phosphorylation of mitogen-activated protein kinases/extracellular signal-regulated kinases 1/2 (MAPK/ERK1/2) and the DNA binding activity of NF-κB [49]. Other studies have indicated that TNF-induced IKK activation requires the activation of TAK1 and that celastrol inhibits the TAK1-induced NF-κB activation [52]. Celastrol also suppressed the ovalbumin-induced airway inflammation, hyperresponsiveness, and tissue remodeling by regulating the imbalance of matrix metalloproteinase 2 and 9 (MMP2, MMP9) and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and 2 (TIMP1 and TIMP2) by inflammatory cytokines through MAP kinases and NF-κB in inflammatory cells.

The triterpenoids erythrodiol and madecassic acid are structural analogues of each other and have antiproliferative and anticancer activity. However, only madecassic acid has also shown LPS-stimulated NF-κB inhibition with subsequent blocking of p65 protein translocation to the nucleus [103]. This may be because of the presence of an additional hydroxyl at carbon 2, which play an important role in the electrophilic reaction. Maslinic acid, which is similar to madecassic acid, also inhibits NF-κB translocation. Maslinic acid also inhibited p50, p65, and NF-κB translocation in a dose-dependent manner in both unstimulated and phorbol-myristate acetate (PMA)-challenged cells, being particularly effective on the p50 subunit [169]. Momordin, an analogue of maslinic acid, does not contain any hydroxyl group at the carbon 2 position but still it has shown NF-κB inhibition in osteoclast differentiation. This may be because of momordin’s action on c-Fos, a component of the activating protein-1 (AP-1) transcription factor that plays a key role in osteoclast differentiation. Momordin inhibited the activation of NF-κB as well as AP-1 in receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)-induced RAW264.7 cells, in which momordin appeared to target IκB degradation and c-Fos expression, but not MAPK signaling pathways [104].

85

Saikosaponins are triterpene saponins derived from the medicinal plant Bupleurum falcatum L. (Umbelliferae) that have shown various pharmacological and immunomodulatory activities including anti-inflammatory, antibacterial, antiviral and anticancer effects in ACHN, C32, Caco-2 , A375, A549, and Huh-7D12 cell lines [170]. Studies demonstrated that saikosaponins not only suppressed the proliferation of human T cells costimulated with OKT3 and CD28 but also inhibited PMA-, PMA/ionomycin-, and concanavalin A-induced mouse T-cell activation in vitro. This inhibitory effect of saikosaponins on PMA-induced T-cell activation was associated with the downregulation of NF-κB signaling through the suppression of IKK and Akt activities. Saikosaponins also suppressed both the DNA binding activity and the nuclear translocation of nuclear factor of activated T cells (NF-AT) and AP-1 in the PMA/ionomycin-stimulated T cells. In addition, the cell surface markers like IL-2 receptor (CD25) were also downregulated, and the production of proinflammatory cytokines such as IL-6, TNF-α, and interferon (IFN)-γ was decreased. These results indicate that the NF-κB, NF-AT, and AP-1 (c-Fos) signaling pathways are involved in the T cell inhibition evoked by saikosaponins, demonstrating their potential for treating T cell-mediated autoimmune conditions [123]. Another study showed that saikosaponins have direct involvement in p53-, NF-κB- and Fas/Fas ligand-mediated induction of apoptosis and cell cycle arrest in human hepatoma cell lines. Saikosaponins also inhibited cell survival signaling by enhancing the amount of IκBα in the cytoplasm and reducing the level and activity of NF-κB in the nucleus, and subsequently attenuated the expression of bcl-xL in HepG2 and Hep3B cells. Saikosaponins therefore decreased cell proliferation and induced apoptosis both in p53-positive HepG2 and p53-negative Hep3B cells [121].

Diosgenin, a steroidal triterpenoid having two pentacyclic rings, is present in Trigonella foenum graecum and other plants and has been shown to suppress inflammation, inhibit proliferation, and induce apoptosis in a variety of tumor cells. Diosgenin inhibits osteoclastogenesis, invasion, and proliferation through the downregulation of Akt, IKK activation, and NF-κB-regulated gene expression. Diosgenin suppresses NF-κB through direct DNA binding, activation of IKK, IκBα phosphorylation, IκBα degradation, p65 phosphorylation, and p65 nuclear translocation by inhibiting Akt activation. NF-κB-dependent reporter gene expression was also abrogated by diosgenin [64]. Similar activity was found in Withania somnifera, also known as Indian ginseng, which is widely used in the Ayurvedic system of medicine to treat tumors, inflammation, arthritis, asthma, and hypertension. Chemical investigation of the roots and leaves of this plant has yielded bioactive withanolides, a group of C28-steroidal lactone triterpenoids. Withania somnifera inhibits COX enzymes, lipid peroxidation, and proliferation of tumor cells, and it potentiates apoptosis, inhibits invasion, and abolishes osteoclastogenesis through the suppression of NF-κB activation and NF-κB-regulated gene expression [135].

Ursolic acid is a pentacyclic triterpene compound isolated from many types of medicinal plants and widely present in the human diet. It has been reported to possess a wide range of pharmacological properties and is one of the most promising chemopreventive agents for cancer. It has been shown to suppress the expression of several genes associated with tumorigenesis. It suppressed NF-κB activation induced by various carcinogens including TNF, PMA, okadaic acid, hydrogen peroxide (H2O2), and cigarette smoke condensate. Ursolic acid inhibited DNA binding of NF-κB. Ursolic acid inhibited IκBα degradation, IκBα phosphorylation, IKK activation, p65 phosphorylation, p65 nuclear translocation, and NF-κB-dependent reporter gene expression. Ursolic acid also inhibited NF-κB-dependent reporter gene expression activated by TNF receptor (TNFR), TNFR-associated death domain (TRADD), TNFR-associated factor (TRAF), NF-κB-inducing kinase (NIK), IKK, and p65 [125]. CDDO and CDDO-Me, two potent oleanane triterpenoids having structures similar to ursolic acid, are currently in Phase I clinical trials for the treatment of leukemia and solid tumors. CDDO blocks the action of NF-κB by preventing the nuclear translocation of p65; this blocks the transactivation of the NOS2 and PTGS2 genes, thus playing an anti-inflammatory role and causing cell cycle arrest. Cucurbitacin combined with CDDO has been shown to bring about apoptosis by inhibiting NF-κB activation, IκBα phosphorylation and degradation, NF-κB-reporter gene expression induced by TNF, and STAT signaling. Some other triterpenoids like astragaloside, boswellic acids, celastrol, ganoderiol F, and gypenoside also blocked the action of NF-κB, inhibiting the transactivation of cox-2 [44,51,171,172,173]. CDDO, at nanomolar concentrations, suppresses the de novo synthesis of the inflammatory enzymes iNOS and COX-2 in activated macrophages because they contain α,β-unsaturated carbonyl moieties. Since iNOS and COX-2 overexpression have been implicated as possible enhancers of

86

carcinogenesis, CDDO has potential to be used as a chemopreventive agent. Furthermore, CDDO may also serve as a chemotherapeutic agent, as micromolar to nanomolar concentrations effectively induced differentiation of human myeloid leukemia cells, inhibited the proliferation of various human tumor cell types, and induced apoptosis in human myeloid and lymphocytic leukemia cells, osteosarcoma cells, and breast cancer cells, including cell lines resistant to chemotherapy [160].

Boswellic acids, a type of pentacyclic triterpenoid, have been shown to induce apoptosis in different cancer cells. At the molecular level, these compounds inhibit constitutively activated NF-κB signaling by intercepting the IKK activity; signaling through the IFN-stimulated response element remained unaffected, suggesting specificity for IKK inhibition [45,46]. In a xenograph study of animal meningioma cells, boswellic acids were found to have potent cytotoxic activity with IC50 values in the range of 2–8 μM. At low micromolar concentrations, boswellic acids rapidly and potently inhibited the phosphorylation of ERK-1/2 and impaired the motility of meningioma cells stimulated with platelet derived growth factor (PDGF) BB. The cytotoxic action of boswellic acids on meningioma cells may be mediated, at least in part, by the inhibition of the ERK signal transduction pathway, which plays an important role in signal transduction and tumorigenesis [174].

Platycodon, a triterpenoid isolated from Platycodon grandiflorum, showed chemopreventive effects on tumor invasion and migration in HT-1080 tumor cells. Platycodon reduced PMA-enhanced MMP9 and MMP2 activation in a dose dependent manner. Platycodon suppressed PMA enhanced expression of MMP9 protein as well as mRNA and transcription activity levels through the suppression of NF-κB activation without changing the TIMP1 levels. Platycodon also reduced PMA-enhanced expression of MMP2 active forms through the suppression of membrane-type 1 MMP (MT1-MMP), but platycodon did not alter MMP2 and TIMP2 levels. Moreover, ROS production induced by PMA was partly decreased in the presence of platycodon, and this suppression of ROS production may be related to diminished NF- κB activity [175]. In this case, NF-κB inhibition is totally ROS mediated, and most of these ROS are released from glucose molecules that are present on the side chain. Platycodon has been shown to be cytotoxic and to inhibit telomerase activity by downregulating hTERT expression at concentrations between 10 and 20 μM. Platycodon also reduced c-Myc and SP1 protein levels and DNA binding activities in a dose-dependent manner [176] and suppressed the LPS-induced expression of iNOS and COX-2 genes by suppressing NF-κB activation at the transcriptional level [51]. Platycodon also enhanced the mRNA expression of cytokines IL-2, IFN-γ, IL-4, and IL-10 and transcription factors T-bet and GATA-3 in mice splenocyte induced by concanavalin A. This suggests that the number of sugar residues in the glycosidic chains attached to C-3 of aglycone could affect the hemolytic and adjuvant activities of platycodigenin-type saponins [177]. Betulinic acid suppressed NF-κB-dependent reporter gene expression and the production of NF-κB-regulated gene products such as COX-2 and MMP9, which are induced by inflammatory stimuli. It also suppressed TNF-induced apoptosis through the activation of NF-κB and NF-κB-regulated gene expression induced by carcinogens and inflammatory stimuli [35].

4.2. Role of Triterpenoids in Tumor Cell Survival, Apoptosis, and ProliferationApoptosis, which in Greek literally means “falling away,” is a process of programmed cell death that

occurs normally in multicellular organisms. Apoptosis is a natural, organized process that plays an important role in embryonic development and adult tissue equilibrium by adjusting the physiological processes involved. The human body is made up of six trillion cells, with approximately three billion cells replaced every minute. Through the process of apoptosis, the body can eliminate damaged or unneeded cells without local inflammation from the leakage of cell contents [178].

Because deregulation of apoptosis is one of the most important factors involved in tumor cell progression, a number of scientific studies have been done on this process to determine if it can be exploited in cancer treatment. Apoptosis is the human body’s mechanism for destroying any cell that has abnormalities such as DNA damage, oncogene activation, nutrient deficiency, or hypoxia. But cancer cells have the ability to escape apoptosis, allowing tumors to grow rapidly and uncontrollably.

Apoptosis in cancer cells can be triggered by the activation of proteases such as caspases, leading to the cells’ destruction. There are two different pathways by which this apoptosis can be stimulated in cancer cells. The first is the intrinsic pathway through mitochondria, which releases cytochrome C proteins such as second mitochondria derived activator of caspases (SMACs) that bind to and deactivate inhibitor of

87

apoptosis proteins (IAPs), allowing apoptosis to proceed. Apoptotic signals in this pathway may come in the form of members of the Bcl-2 family of proteins such as pro-apoptotic Bax, which can be upregulated by tumor suppressor protein p53 in response to DNA damage [179]. The second pathway is the extrinsic pathway, in which apoptosis is triggered by the activation of proapoptotic receptors such as death receptors 4 and 5 (DR4 and DR5) and Fas, which are present on the cell surface. The activation of the death receptor pathway leads to receptor aggregation, which then initiates the recruitment and activation of initiator caspase-8. While p53 is involved in the intrinsic pathway, it has no role in the extrinsic pathway [178,180,181,182].

STAT3 activation has been associated with cell survival, proliferation, and invasion in various human cancers. Some members of the Bcl-2 family of proteins, such as Bcl-2 and Bcl-xL, also play a role in apoptosis and have been found to be elevated in different types of cancer cells. These proteins cause some cells to develop resistance to drugs used in cancer treatment. Another protein, survivin, may play a role in tumor progression as it has been found at excessive levels in cancer cells. Targets for the treatment of cancer could be those that cause downregulation of the Bcl-2, Bcl-xL, and survivin proteins and upregulation of the p53, Bax, and caspase proteins.

Triterpenoids have been found to act through the intrinsic apoptosis pathway to prevent tumor progression. For example, many spice derived triterpenoids have been shown to induce apoptosis in different types of cancer cells through a wide variety of mechanisms. Among the most important of these are asiatic acid, astragaloside, celastrol, cucurbitacin, diosgenin, gypenoside, hederagenin, lupeol, and momordin (Table 2). These triterpenoids have a common target, the antiapoptotic protein Bcl-2, which can induce apoptosis in cancer cells.

Pristimerin has been shown to induce mitochondrial cell death in human cancer cells, and the ROS dependent activation of both Bax and poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) is critically required for mitochondrial dysfunction [117,183]. In human HL-60 cells, pristimerin also showed antiproliferative effects, with an IC50 of 0.88 μM [184]. In addition to this, pristimerin showed that c-Jun N-terminal kinase (JNK) was involved in ROS-dependent Bax activation, which increases intracellular ROS, JNK activation, conformational change, and mitochondrial redistribution of Bax, mitochondrial membrane potential loss, and cell death. Pretreatment with pristimerin also activated PARP-1 [117]. Another study showed that pristimerin induced apoptosis by targeting the proteasome in prostate cancer cells. This may be because of the accumulation of ubiquitinated proteins and three proteasome target proteins, Bax, p27 and IκBα, in androgen receptor (AR)-negative PC-3 prostate cancer cells, which supports the conclusion that proteasome is inhibited by pristimerin [120]. Another study showed that this apoptosis might be induced by pristimerin through the direct effect of caspase on mitochondria in MDA-MB-231 cells [119]. Pristimerin showed antiviral activity by inhibiting the viral DNA synthesis but had no virucidal effect [185].

Celastrol combined with TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL/APO-2L) exerted strong synergistic antiproliferative effect against human cancer cells, including those from ovary cancer (OVCAR-8), colon cancer (SW620), and lung cancer (95-D). In vivo, the antitumor efficacy of TRAIL/APO-2L was dramatically increased by celastrol. These enhanced anticancer activities were accompanied by the prompt onset of caspase-mediated apoptosis. Celastrol also suppressed the TNF-induced expression of various gene products involved in antiapoptosis (IAP1, IAP2, Bcl-2, Bcl-xL, c-FLIP, and survivin), proliferation (cyclin D1 and COX-2), invasion (MMP9), and angiogenesis (VEGF) [52].

Diosgenin-induced apoptosis was associated with COX-2 upregulation in HEL cells [75]. Diosgenin also downregulated gene products involved in cell proliferation (cyclin D1, COX-2, and c-myc) and antiapoptosis (IAP1, Bcl-2, Bcl-xL, Bfl-1/A1, TRAF1, and cFLIP) [64].

Avicins are novel plant derived metabolites that lower energy metabolism in tumor cells by targeting the outer mitochondrial membrane Avicins dephosphorylated STAT3 in a variety of human tumor cell lines, leading to a decrease in the transcriptional activity of STAT3. The expression of STAT3-regulated proteins such as c-myc, cyclin D1, Bcl-2, survivin, and VEGF were reduced in response to avicin treatment. Avicin also induced dephosphorylation of STAT3, dephosphorylation of JAKs, and activation of protein phosphatase-1 [11]. Another study showed that avicins induced apoptosis and downregulated p-STAT3, Bcl-2, and survivin in cutaneous T-cell lymphoma cells. Avicin D did not change STAT3 expression, but it decreased phospho-STAT3 protein levels [13,187].

88

Betulinic acid inhibited the constitutive activation of STAT3, Src kinase, JAK1, and JAK2. Pervanadate reversed the betulinic acid induced down regulation of STAT3 activation, suggesting the involvement of a protein tyrosine phosphatase (PTP). Betulinic acid also downregulated the expression of STAT3 regulated gene products, such as Bcl-xL, Bcl-2, cyclin D1, and survivin. This correlated with an increase in apoptosis as indicated by an increase in the sub-G1 cell population and an increase in caspase-3-induced PARP cleavage [188].

Recently, some researchers found that natural triterpenic diols promote apoptosis in astrocytoma cells through ROS-mediated mitochondrial depolarization and JNK activation. Alcohols extracted from olive oil, erythrodiol (an intermediate from oleanolic acid), and its isomer, uvaol, have been reported anticancerous, particularly on brain cancer cells. Erythrodiol and uvaol effectively affected cell proliferation as well as cell cycle phases and induced 1321N1 cell death and modulated the apoptotic response, promoting nuclear condensation and fragmentation. These results may be due to production of ROS with loss of mitochondrial transmembrane potential, and correlated with the activation of JNK. The presence of catalase reversed the triterpenic diols induced mitochondrial depolarization, JNK activation, and apoptotic death, indicating the critical role of ROS in the action of diols ring compounds [189]. Oleanolic acid also upregulated COX-2 expression and induced prostacyclin (PGI2) synthesis. These effects may be as a result of the early activation of cAMP regulatory element-binding protein (CREB), a key transcription factor involved in COX-2 transcriptional upregulation. Oleanolic acid has also shown cardioprotective effects [190].

Maslinic acid is present in high concentrations in olive pomace. Various studies have examined the responses of HT-29 and Caco-2 colon cancer cell lines to maslinic acid treatment. It also induced strong G0/G1 cell-cycle arrest and DNA fragmentation, and increased caspase-3 activity. However, maslinic acid did not alter the cell cycle or induce apoptosis in the non-tumorous intestinal cell lines IEC-6 and IEC-18 [191].

Momordin inhibited proliferation and induced apoptosis in human promyelocytic leukemia (HL-60) cells and was cytotoxic to HL-60 cells with an IC50 of 19.0 μg/mL. The antiproliferative effects of momordin appear to be attributable to its induction of apoptotic cell death, as momordin induced nuclear morphology changes and internucleosomal DNA fragmentation and increased the proportion of hypodiploid cells. Momordin decreased the expression of the antiapoptotic protein Bcl-2 but increased the expression of the proapoptotic protein Bax. In addition, treatment with momordin induced the activation of caspase-3 and the cleavage of PARP [105]. Many of the triterpenoids derived from nature, target caspases, which are essential for apoptotic cell death.

Saikosaponins were found to be cytotoxic in different cancer cell lines and to exert significant inhibition of nitric oxide production in LPS-induced RAW 264.7 macrophages, with IC50 of 4.2 and 10.4 μM, respectively [170]. Saikosaponins have shown a variety of pharmacological and immunomodulatory activities, including anti-inflammatory, antibacterial, antiviral and anticancer effects. Treatment of MDA-MB-231 with saikosaponin-A increased the population of cells in the sub-G1 phases of the cell cycle. These results showed that apoptosis in MDA-MB-231 cells was independent of the p53/p21 pathway mechanism and was accompanied by an increased ratio of Bax to Bcl-2, increased c-myc levels, and increased activation of caspase-3. In contrast, apoptosis of MCF7 cells may have been initiated by the Bcl-2 family of proteins and involved the p53/p21-dependent pathway mechanism, and it was accompanied by an increased level of c-myc protein [192]. In another study, an enhancement in Fas and its two ligands, membrane-bound Fas ligand (mFasL) and soluble Fas ligand (sFasL), as well as Bax protein, was shown to be responsible for the apoptotic effect induced by saikosaponins [121]. Saikosaponins significantly increased the levels of c-myc and p53 mRNA [193]. Saikosaponins also caused G0/G1 cell cycle arrest of activated T cells by downregulating the protein levels of CDK6 and cyclin D3 and upregulating the protein level of p27(kip) [194].

The inhibition of NF-κB activation by ursolic acid correlated with the suppression of NF-κB dependent cyclin D1, COX-2, and MMP9 expression [125]. Ursolic acid blocked cell cycle progression in the G1 phase and was associated with a marked decrease in the protein expression of cyclin D1, D2, and E, and their activating partners cdk2, cdk4, and cdk6 with concomitant induction of p21. The accumulation of p21/WAF1 might be p53 dependent. The accumulation of p21/WAF1 correlated with the upregulation of Fas, the Fas ligands and Bax, and the downregulation of NF-κB, Bcl-2, and Bcl-xL [121]. Ursolic acid also

89

upregulated apoptotic genes p53 and caspase-3, while the antiapoptotic gene Bcl-2 was downregulated [124].

CDDO, concentrated at 1–5 μM, induced apoptosis in various cancer cell lines. Moreover, CDDO combined with TRAIL promoted the induction of apoptosis. CDDO normally acts through both the extrinsic and intrinsic pathways by activating the cleavage of BID and of caspases-3, -8, and -9; by downregulating FLIP; or by inducing the translocation of Bax to the mitochondria and the release of cytochrome C [195,196,197]. The antitumor activity of CDDO-Me was associated with the inhibition of p-Akt, mammalian target of rapamycin (mTOR), and NF-κB signaling proteins and their downstream targets such as p-Bad and p-Foxo3a for Akt; p-S6K1, p-eIF-4E and p-4E-BP1 for mTOR; and COX-2, VEGF and cyclin D1 for NF-κB [167].

Acetyl-11-keto-β-boswellic acid (AKBA), a derivative of boswellic acid has been shown to induce apoptosis in cancer cells. AKBA mediated inhibition of the phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/Akt pathway; this pathway is crucial for cell proliferation and survival [198]. Another study showed that cyclin D1 and E, CDK2 and 4 and phosphorylated retinoblastoma protein (Rb) were decreased in AKBA-treated cells, while p21expression was increased. The growth inhibitory effect of AKBA was dependent on p21 but not p53 [199]. The cytostatic and apoptosis inducing activities of boswellic acids toward malignant cell lines has been shown in vitro [200]. Boswellic acids triggered apoptosis by means of a pathway dependent on caspase-8 activation but independent of Fas/Fas ligand interaction in colon cancer cells [201]. AKBA inhibited the NF-κB-dependent reporter gene expression activated by TNFR, TRADD, TRAF2, NIK, and IKK, but not that activated by the p65 subunit of NF-κB, which indicates that AKBA enhances apoptosis induced by cytokines and chemotherapeutic agents [46].

In HT-29 human colon cancer cells, platycodon induced apoptosis through DNA fragmentation and PARP cleavage. The apoptosis induced by platycodon was associated with the activation of initiator caspases-8 and -9 as well as effector caspase-3. Platycodon stimulated Bid cleavage, indicating that the apoptotic action of caspase-8-mediated Bid cleavage leads to the activation of caspase-9. It increased the expression of the proapoptotic protein Bax and decreased the expression of the antiapoptotic protein Bcl-2. Platycodon also increased the expression of the caspase-independent mitochondrial apoptosis factor, apoptosis inducing factor (AIF), in HT-29 cells. Thus, platycodon exerts its apoptotic effect via both caspase-dependent and caspase-independent pathways [116,202,203].

A few triterpenoid compounds have been shown to both activate caspase activity and downregulate the expression of Bcl-2 or Bcl-xL. The ability to suppress proliferation and induce apoptosis in human cancer cells is clearly important for drugs targeting either malignant cells in treatment or premalignant cells in prevention.

One of the hallmarks of cancer is aggressive proliferation of cells. In a normal cell, a fine balance between growth signals and antigrowth signals regulates proliferation. However, this fine orchestration is lost in cancer cells, which often show uncontrolled growth due to the loss of both growth-controlling factors. On one hand, cancer cells acquire the capability to generate their own growth signals, while on the other hand, they also become unresponsive to antigrowth signals [204]. Numerous factors regulate the natural progression of a normal cell. Some of these factors, such as cyclins, are upregulated in cancer cells, causing the cells to replicate uncontrollably. Cyclins are the regulatory proteins that control the cell cycle, while other factors such as COX-2 and c-myc play a supporting role. The most commonly affected cyclin in cancer cells is cyclin D1, an important cell cycle regulator that plays a role in transition of the cell from the G1 phase to the S phase. Cancer cells show overexpression of this cyclin D1 and thus it has been linked to the development and progression of cancer.

Avicins downregulate both STAT3 and the expression of STAT3-regulated prosurvival proteins, which contribute to the induction of apoptosis in tumor cells. STAT3 plays an important role in inflammation and wounding, and the in vivo inhibition of VEGF. In a mouse skin carcinogenesis model, avicins inhibited the expression of STAT3, resulting in the suppression of the pro-inflammatory and pro-oxidant stromal environment of tumors [11]. Avicins at concentrations of 0.5–5.0 μg/mL caused more apoptosis in patients' Sézary cells than in healthy donors' CD4+ T cells and activated CD4+ T cells and decreased apoptosis inhibitors bcl-2 and survivin [13]. Furthermore, avicin D-induced autophagic cell death was abrogated by knockdown of tuberous sclerosis complex 2 (TSC2), a key mediator linking AMP-activated protein kinase (AMPK) to mTOR inhibition, suggesting that AMPK activation is a crucial event targeted by avicins. Avicins

90

also have been shown to lower energy of metabolism in tumor cells by targeting the outer mitochondrial membrane, causing cancer cell death [187]. Tumor cells generate hydroperoxides at a very high rate, and avicins could provide a new strategy of anticancer therapy by sensitizing cells with high levels of ROS to apoptosis. In another study, boswellic acids, which inhibit STAT3 activation, led to the suppression of gene products involved in proliferation (cyclin D1), survival (Bcl-2, Bcl-xL, and Mcl-1), and angiogenesis (VEGF) [32].

Maslinic acid has shown an antiproliferative effect against Caco-2 cancer cells (EC50 = 15 µM), HT-29 human colon cancer cells (EC50 = 74 µM), 1321N1 astrocytoma cells (EC50 = 25 µM), and human leukemia cells (CCRF-CEM and CEM/ADR5000) (EC50 = 7 and 9 µM, respectively). Maslinic acid’s antiproliferative activity likely comes from the induction of an oxidative apoptotic pathway, which causes cell cycle and cytoskeleton alterations. Maslinic acid has been found to attenuate intracellular oxidative stress by inhibiting of NO and H2O2 production and reducing proinflammatory cytokine generation in murine macrophages [205]. Maslinic acid inhibited cell growth with an EC50 of 101.2 μM without necrotic effects. This effect of maslinic acid is caused by a hydroxyl group at the carbon 2 position, ultimately activates caspase-3 as a prime apoptosis protease [206]. A 200 μM concentration of maslinic acid was sufficient for activating caspase-3, which inhibits cell proliferation [207]. Maslinic acid from pomace olive oil demonstrated a suppressive effect on oxidative stress and cytokine production in stimulated murine macrophages [208]. Triterpenoids isolated from apple peels have shown potent antiproliferative activity and may be partially responsible for apples’ anticancer activity.

Saikosaponins prevented the proliferation of MCF-7 cell at the concentration of 10 nM to 10 μM and was significantly inhibited by the specific estrogen receptor (ER) antagonist ICI-182780 [209]. This antiproliferative effect is due to the synthesis of extracellular matrix proteins through the downregulation of the CDK4, c-Jun, and c-Fos genes [210], which block cell cycle progression at the G1 phase.

The potency of ursolic acid was associated with ZIP/p62 and protein kinase C-zeta (PKC-zeta). Ursolic acid inhibited the interaction of ZIP/p62 and PKC-zeta. It also further suppressed the activation of NF-κB and the downregulation of the MMP9 protein, which in turn contributed to ursolic acid’s inhibitory effects on IL-1 β or TNF-induced C6 glioma cell invasion [127]. Ursolic acid showed the strongest inhibitory activity to urokinase (IC50 = 12 μM) and cathepsin B (IC50 = 10 μM), and as proteases are involved in tumor invasion and metastasis, this activity could be beneficial in cancer treatment [211]. CDDO-Me inhibited growth and induced apoptosis in PC-3 and C4-2 cells and was associated with the inhibition of the p-Akt, mTOR, and NF-κB signaling proteins and COX-2, VEGF and cyclin D1 [167]. Some of the triterpenoid derivatives obtained from ursolic acid have shown ability to suppress the de novo formation of two enzymes, iNOS and COX-2, in IFN-γ-stimulated primary mouse macrophages or LPS-activated RAW 264.7 macrophages that are used as assay systems [212].

The inhibition of STAT3 activation by boswellic acids led to the suppression of gene products involved in proliferation (cyclin D1), survival (Bcl-2, Bcl-xL, and Mcl-1), and angiogenesis (VEGF. Betulinic acid combined with vincristine showed a synergistic cytotoxic effect on melanoma cells, inducing cell cycle arrest at different points (betulinic acid at G1 phase and vincristine at G2/M phase) and causing apoptosis in B16F10 melanoma cells. In C57BL/6 mice, vincristine inhibited metastasis of melanoma cells to the lung, an effect that was augmented by the addition of betulinic acid [213].

4.3. Role of Triterpenoids in Invasion, Metastasis, and AngiogenesisBesides uncontrolled proliferation, the other major characteristics of cancer cells are invasion and

metastasis. In metastasis the cancer cells migrate from their original site of origin to other parts of the body, either via the bloodstream or lymphatic system. Among the factors influencing invasion, which affects whether or not a tumor will metastasize, are MMPs and ICAM-1. MMPs (specifically MMP2 and MMP9) are endopeptidases that degrade the basement membrane components, separating the cells from their surrounding tissue and enabling them to move freely and spread to other tissues [214]. Chemokine receptor CCR7 is important for lymphatic invasion of cancer cells and is overexpressed in metastatic breast cancer cells; withanolide inhibits TAK1 to repress NF-κB-induced CCR7 expression in breast cancer cells and is useful for the prevention of lymphatic involvement by breast cancer cells [215].

Erythrodiol-3-acetate, a triterpenoid, reduced the level of MMP1 and induced type 1 procollagen in a dose dependent manner [216]. Ganoderma lucidum, a well known mushroom containing platycodon,

91

showed a significant inhibitory effect on PMA-induced MMP9 and MMP2 activation in a dose dependent manner and further inhibited HT-1080 and HepG2 cell invasion and migration [217]. Another study found that boswellic acids potentiated the apoptosis induced by TNF and chemotherapeutic agents, suppressed TNF-induced invasion, and inhibited NF-κB-induced osteoclastogenesis [46].

Angiogenesis is the basis for solid tumor development and distribution, and antiangiogenic drugs have been demonstrated to be active at the site of cancer. The growth of human tumors and development of metastases depends on the de novo formation of blood vessels [218]. Angiogenesis, the physiological process in which new blood vessels develop from pre-existing ones, normally occurs during growth, reproduction, and wound healing; however, this process is also a marker indicating that a tumor has progressed from a dormant to malignant state. Angiogenesis favors tumor growth by providing oxygen and nutrients to multiplying cells via the newly formed blood vessels. Some proangiogenic factors that favor development of new blood vessels include IL-8, TNF, fibroblast growth factor-2 (FGF-2), and PDGF. However, the most important factor in the whole process of angiogenesis is VEGF. Various studies have shown it to be a potent stimulator of angiogenesis in vitro [218]. Because of its critical role in angiogenesis, it has been targeted for controlling tumor progression. Limiting VEGF in tumors has been shown to lead to blood vessel destruction and to prevent the growth of new ones, thus reducing the blood supply to the tumor. Inhibition of the VEGF tyrosine kinase signaling pathway blocked angiogenesis in growing tumors, leading to stasis and regression of the tumors. Thus, agents that can downregulate or inhibit the expression of VEGF or its signaling pathway in tumor cells could prove to be very promising in preventing tumor growth and metastasis.

Saikosaponin C, one of the saikosaponins present in a Chinese herb, Radix bupleuri, has been found to have a potent inducing effect on human umbilical vein endothelial cells’ viability and growth. Saikosaponin C also induced endothelial cell migration and capillary tube formation. Saikosaponin C induced the gene expression or activation of MMP2, VEGF, and the p42/p44 MAPK that correlates with endothelial cell growth, migration, and angiogenesis, respectively [219]. Another study found that saikosaponins can inhibit the physiological angiogenesis of chicken embryos, especially for the medium and small vessels [220].

CDDO-Me and CDDO-Im were shown to inhibit the activation of the ERK1/2 pathway after stimulation with VEGF in human umbilical vein endothelial cells [221]. CDDO-Me also potentiated the cytotoxic effects of TNF and chemotherapeutic agents. This may be because CDDO-Me inhibits NF-κB through the inhibition of IκBα kinase, leading to the suppression of NF-κB-regulated gene product (VEGF, COX-2, and MMP9) expression and to angiogenesis [222]. Boswellic acids suppressed VEGF-induced phosphorylation of VEGF receptor 2 (VEGFR2) kinase (KDR/Flk-1) with an IC50 of 1.68 μM. Specifically, boswellic acids suppressed the downstream protein kinases of VEGFR2, including Src family kinase, focal adhesion kinase, ERK, AKT, mTOR, and ribosomal protein S6 kinase [223]. In an ex vivo model, boswellic acids significantly inhibited blood vessel formation in the Matrigel plug assay in mice and effectively suppressed VEGF induced microvessel sprouting in a rat aortic ring assay. Furthermore, boswellic acids inhibited VEGF induced cell proliferation, chemotactic motility, and the formation of capillary-like structures from primary cultured human umbilical vascular endothelial cells in a dose-dependent manner [223]. Betulinic acid also inhibits growth factor-induced in vitro angiogenesis by modulating mitochondrial function in endothelial cells [224].

Various in vivo studies have found that celastrol can downregulate the density of tumor microvessels significantly at different doses. Immunohistochemistry showed that celastrol also decreased the levels of VEGFR1 and VEGFR2 expression, but not the level of VEGF expression [225]. However, avicins, downregulate the expression of VEGF [166]. An in vivo study showed that Ganoderma lucidum given at 100 and 200 mg/kg inhibited primary solid tumor growth in the spleen, liver metastasis, and secondary metastatic tumor growth in the liver in intrasplenic Lewis lung carcinoma-implanted mice. An in vivo assay system extract inhibited Matrigel induced angiogenesis [226].

5. Role of Triterpenoids in Cancer TreatmentTriterpenoids are structurally diverse organic compounds. More than 20,000 triterpenoid varieties are

formed by multiple modifications of the basic backbone structure. Several triterpenoids such as avicin, betulinic acid, boswellic acids, celastrol, diosgenin, madecassic acid, maslinic acid, momordin, saikosaponins, platycodon, pristimerin, ursolic acid, CDDO, and withanolide, have been shown in our laboratory and others to possess anticancer and anti-inflammatory activities. Preliminary data from

92

ongoing studies indicate that some synthetic triterpenoids are being developed with improved anticancer activity. Several triterpenoids are now in clinical trials at different phases (Table 4; www.clinicaltrials.gov). Synthetic triterpenoid, CDDO, is being tested in patients with various cancers. Betulinic acid ointment is under evaluation for the treatment of dysplastic nevi that have the potential to transform into melanoma. Triterpenoids are highly multifunctional and thus have promise as agents in the treatment of cancer because of their ability to block the NF-κB activation, induce apoptosis, and inhibit proliferation, invasion, metastasis and angiogenesis.

6. ConclusionsThis review has illustrated that triterpenoids are important active constituents obtained from various

plants and could be considered for use in both the chemoprevention and chemotherapy of cancer. Inflammatory proteins and their pathways are critical targets in both the prevention and treatment of cancer. Therefore, identification of agents or drugs that can suppress these pathways is of enormous importance.

Polycyclic triterpenoids now offer important new platforms for drug development. The natural triterpenoid platform provided by the unique stereochemistry of these particular compounds, and the cyclization of the linear 30-carbon squalene molecule, have provided an excellent base from which new agents more potent than the parent squalene could be developed.

Thus, agents that can suppress NF-κB and activate caspase and other pathways (e.g., DR4, DR5) are likely to be effective drugs. Because of their safety and ability to affect multiple targets, natural products are likely to have a special place in the preventive and therapeutic armamentarium against cancer. Although there are extensive preclinical data to support such claims, only clinical studies can fully validate them.

Клинически полезным противоопухолевых, противоопухолевой и antiwrinkle агент, урсоловая кислоты и связанных с ними производных инструментов, как в лечебных целях важно натуральный продукт.

Лекарственные растения становятся важным направлением исследований для романа и биоактивных молекул лекарств. Новых терапевтических стратегий и агенты срочно требуются для лечения различных неизлечимых болезней. Многие из растительного сырья активных соединений в клинических испытаниях. В настоящее время урсоловая кислота в человеческих клинических испытаний для лечения рака, опухоли, кожи и морщины. Этот обзор включает в себя клиническое использование урсоловая кислота при различных заболеваниях, в том числе противоопухолевых, противоопухолевой и antiwrinkle химий, и выделения и очистки этого tritepernoid из различных растений для обновления имеющихся знаний на экспресс-анализ урсоловая кислоты с помощью аналитических методов. Кроме того, химические модификации урсоловая кислота чтобы сделать более эффективным и водорастворимых производных, предыдущей и текущей информации о ее природные и полусинтетические аналоги, ориентируясь на его противоопухолевых цитотоксических, противоопухолевое, антиоксидантное, противовоспалительное, анти-ВИЧ, ацетил холинэстеразы, α-глюкозидазы, противомикробным, и гепатопротекторное, кратко обсуждение-это попытка здесь его перспективы исследования. Этот обзор статья содержит четырнадцать лечебных целях важно урсоловая кислоты и производных 351 ссылки.

J Enzyme Inhib Med Chem. 2011 Oct;26(5):616-42. doi: 10.3109/14756366.2010.546793. Epub 2011 Mar 22.

Clinically useful anticancer, antitumor, and antiwrinkle agent, ursolic acid and related derivatives as medicinally important natural product.

Sultana N1.Author information 1Pharmaceutical Research Center, PCSIR Laboratories Complex, Karachi, Pakistan.

nighat2001us@hotmail.comAbstractMedicinal plants are becoming an important research area for novel and bioactive molecules for drug

discovery. Novel therapeutic strategies and agents are urgently needed to treat different incurable 93

diseases. Many plant derived active compounds are in human clinical trials. Currently ursolic acid is in human clinical trial for treating cancer, tumor, and skin wrinkles. This review includes the clinical use of ursolic acid in various diseases including anticancer, antitumor, and antiwrinkle chemotherapies, and the isolation and purification of this tritepernoid from various plants to update current knowledge on the rapid analysis of ursolic acid by using analytical methods. In addition, the chemical modifications of ursolic acid to make more effective and water soluble derivatives, previous and current information regarding, its natural and semisynthetic analogs, focusing on its anticancer, cytotoxic, antitumor, antioxidant, anti-inflammatory, anti-HIV, acetyl cholinesterase, α-glucosidase, antimicrobial, and hepatoprotective activities, briefly discussion is attempted here for its research perspectives. This review article contains fourteen medicinally important ursolic acid derivatives and 351 references.

Розмариновая кислота противодействует активатора протеина-1-зависимой активации циклооксигеназы-2 выражение в человеческой рак и доброкачественные клеточные линии.

Один механизм, с помощью которого биологически активные компоненты пищи могут оказывать противоопухолевый эффект за счет снижения экспрессии провоспалительных генов циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2), которая рассматривалась в качестве фактора риска развития опухоли. Розмариновая кислота (РА) - это фенольные производные кофейной кислоты, присутствующие в розмарин (Rosmarinus officinalis). Предыдущие исследования зафиксировали, что РА может оказывать противовоспалительное действие. Однако, механизмы действия РА по экспрессия ЦОГ-2 не были исследованы. Здесь мы сообщаем, что в толстой кишке рак НТ-29 клеток, РА (5, 10 и 20 micromol/Л), снижение на 12-O-tetradecanoylphorbol-13-ацетата (тра)-индуцированной ЦОГ-2 активности промотора (P < 0,05) и уровнем белка (P < 0,05). Кроме того, cotreatment с РА снижается (5 micromol/Л, P < 0,05; 10 и 20 micromol/Л, P < 0,01) TPA-индуцированной транскрипции от управления активатора протеина-1 (AP-1) промоутер-люциферазы построить и репрессированных связывания AP-1 факторов c-Jun (10 micromol/Л; P < 0,01) и c-Fos (10 micromol/Л; P < 0,05) и ЦОГ-2 промоутера олигонуклеотидов укрывают cAMP-response element (CRE). Анти-AP1 влияния РА были также рассмотрены в груди доброкачественные эпителиальные клеточные линии (MCF10A), в которой RA отталкивала стимулирующее влияние ТПА на ЦОГ-2 белка выражение (5 micromol/Л, P < 0,05; 10 и 20 micromol/Л, P < 0,01), набор c-Jun и c-Fos (10 micromol/Л; P < 0,01) и ЦОГ-2/CRE олигонуклеотидов, и активации внеклеточной сигнал-регулируемой киназы-1/2 (ERK1/2) (10 micromol/Л; P < 0,01), член митоген-активированной протеинкиназы пути. Кроме того, РА отталкивала ERK1/2 активации в толстой кишки НТ-29 и молочной железы MCF-7 раковые клетки (10 micromol/Л; P < 0,01). Таким образом, мы полагаем, что РА может быть эффективным профилактическим средством в борьбе против ЦОГ-2 активации AP-1-индуцирующих агентов в обоих рак и доброкачественные молочной эпителиальных клеток.

J Nutr. 2008 Nov;138(11):2098-105. doi: 10.3945/jn.108.090431.Rosmarinic acid antagonizes activator protein-1-dependent activation of cyclooxygenase-2 expression

in human cancer and nonmalignant cell lines.Scheckel KA1, Degner SC, Romagnolo DF.Author information 1Department of Nutritional Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ 85718, USA.AbstractOne mechanism through which bioactive food components may exert anticancer effects is by reducing

the expression of the proinflammatory gene cyclooxygenase-2 (COX-2), which has been regarded as a risk factor in tumor development. Rosmarinic acid (RA) is a phenolic derivative of caffeic acid present in rosemary (Rosmarinus officinalis). Previous research documented that RA may exert antiinflammatory effects. However, the mechanisms of action of RA on COX-2 expression have not been investigated. Here, we report that in colon cancer HT-29 cells, RA (5, 10, and 20 micromol/L) reduced the 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-induced COX-2 promoter activity (P < 0.05) and protein levels (P < 0.05). In addition, the cotreatment with RA reduced (5 micromol/L, P < 0.05; 10 and 20 micromol/L, P < 0.01) TPA-induced transcription from a control activator protein-1 (AP-1) promoter-luciferase construct

94

and repressed binding of the AP-1 factors c-Jun (10 micromol/L; P < 0.01) and c-Fos (10 micromol/L; P < 0.05) to COX-2 promoter oligonucleotides harboring a cAMP-response element (CRE). The anti-AP1 effects of RA were also examined in a nonmalignant breast epithelial cell line (MCF10A) in which RA antagonized the stimulatory effects of TPA on COX-2 protein expression (5 micromol/L, P < 0.05; 10 and 20 micromol/L, P < 0.01), the recruitment of c-Jun and c-Fos (10 micromol/L; P < 0.01) to the COX-2/CRE oligonucleotides, and activation of the extracellular signal-regulated protein kinase-1/2 (ERK1/2) (10 micromol/L; P < 0.01), a member of the mitogen-activated protein kinase pathway. Additionally, RA antagonized ERK1/2 activation in colon HT-29 and breast MCF-7 cancer cells (10 micromol/L; P < 0.01). Thus, we propose that RA may be an effective preventative agent against COX-2 activation by AP-1-inducing agents in both cancer and nonmalignant mammary epithelial cells.

В последние годы наблюдается растущий интерес к chemopreventative и химиотерапевтических способность биологически активных компонентов пищи, чтобы предотвратить возникновение хронических заболеваний и рака (18). Разнообразные диетические полифенольных агенты, такие как ресвератрол, генистеин, куркума, кверцетин, и эпигаллокатехин галлат, как было показано, обладают chemoprotective эффектов (19). Розмариновая кислота [(RA) α-o-caffeoyl-3, 4-dihydroxyphenyl молочной кислоты] - это полифенольные соединения, найденные в Lamiaceae травы, такие как Perilla frutescens, орегано, шалфей, мята, базилик, и перилла (20). РА наблюдал, обладают антиоксидантными и противовоспалительными свойствами (21-23). Несколько исследований сообщили, что РА оказывало противовоспалительное действие путем ингибирования активации комплемента (24) и Кокс (25) деятельности. Однако, механизмы, лежащие в основе РА-индуцированные эффекты у экспрессия ЦОГ-2 остаются неизвестными. Таким образом, в данном исследовании мы рассмотрели влияние ра на экспрессия ЦОГ-2 в толстой кишки и молочной железы раковые клетки в доброкачественные молочной эпителиальных клеток. Мы предлагаем, чтобы по крайней мере частично, РА может оказывать противовоспалительное и антиканцерогенное воздействие интригу AP-1-зависимой активации ЦОГ-2 на экспрессию генов.

In the recent past, there has been growing interest in the chemopreventative and chemotherapeutic ability of bioactive food components to prevent chronic diseases and cancer (18). A variety of dietary polyphenolic agents, such as resveratrol, genistein, curcumin, quercetin, and epigallocatechin gallate, have been shown to possess chemoprotective effects (19). Rosmarinic acid [(RA) α-o-caffeoyl-3, 4-dihydroxyphenyl lactic acid] is a polyphenolic compound found in Lamiaceae herbs such as Perilla frutescens, oregano, sage, mint, sweet basil, and perilla (20). RA has been observed to possess antioxidant and antiinflammatory properties (21–23). Several studies reported that RA exerted antiinflammatory effects by inhibiting complement activation (24) and COX (25) activity. However, the mechanisms underlying the RA-induced effects on COX-2 expression remain unknown. Therefore, in this study, we examined the effects of RA on COX-2 expression in colon and breast cancer cells and in nonmalignant mammary epithelial cells. We propose that at least in part, RA may exert antiinflammatory and anticarcinogenic effects by antagonizing AP-1–dependent activation of COX-2 gene expression.

ОбсуждениеАктивация экспрессии ЦОГ-2 рассматривается как причинный фактор в возникновении ряда

воспалительных состояний и колоректальной этиологии (4) и груди (34) опухолей. ЦОГ-2 была мишенью для терапии на основе НПВП и селективные ингибиторы ЦОГ-2. Поскольку НПВП были показаны для улучшения желудочно-кишечные язвы (9) и селективные ингибиторы ЦОГ-2 повышает риск сердечно-сосудистых заболеваний (10), интерес был сформирован в направлении развития альтернативных и профилактических анти-ЦОГ-2 стратегии, что отсутствие этих негативных эффектов (35).

Препараты из растения Rosmarinus officinalis недавно были исследованы на их способность оказывать антипролиферативное и антиоксидантными свойствами (36,37) и защиты от опухолей кожи (38) и повреждения ДНК (21). Более ранние исследования сообщили, что экстракты розмарина, ингибирует 7,12-диметил-бенз[a]антрацен-индуцированных ДНК-аддукты и опухолей молочной железы у самок крыс Sprague-Dawley (39-41) и бензо[a]пирен-индуцированной генотоксичность в бронхиальных клеток (42). Местное применение экстрактов розмарина угнетал бензо[a]пирен - и диметил-бенз[a]антрацен-индуцированного возбуждения опухолей кожи мыши, а также ДТС-

95

индуцированной опухоли акции (43). Некоторые защитные эффекты экстрактов розмарина были приписаны усиление детоксикации ксенобиотиков (44).

Экстракты розмарина содержат несколько полифенольных компонентов, в том числе carnosic кислоты, carnosol, и ра. Последняя представляет собой продукт этерификации кофейной кислоты с 3,4-dihydroxyphenyllactic кислота, которая также содержится в полыни, мяты и мелиссы (20). В предыдущих расследований, предварительная обработка с РА было показано, уменьшить ЦОГ-2 мРНК выражение в ДТС-оспариваемый кожи модели мыши (45). Поэтому в настоящем исследовании мы рассмотрели механизмы, с помощью которых РА может раздражать экспрессия ЦОГ-2. Мы обнаружили, что cotreatment рака толстой кишки НТ-29 клеток при РА снижение ДТС-индуцированной ЦОГ-2 промоутера деятельности и уровней протеина. РА отталкивала AP-1-зависимой активации ЦОГ-2 транскрипции, о чем свидетельствует его способность подавлять транскрипцию с коллагеназы AP-1-люциферазы построить в трансфицированных толстой кишки НТ-29 клеток рака. Кроме того, cotreatment НТ-29 клеток с РА репрессированных в ДТС-индуцированной набор c-Jun и c-Fos белков ЦОГ-2 промоутера олигонуклеотидов. Анти-AP-1 эффекты РА не были специфическими для НТ-29 клеток, потому что РА отпор, связывание c-Jun и c-Fos в ядерных экстрактах, полученных от рака молочной железы MCF-7 клеток. Наконец, мы зафиксировали в nontransformed MCF10A молочных эпителиальных клеток, что РА " снизило ДТС-индуцированного накопления ЦОГ-2 белка и набор c-Jun и c-Fos к ЦОГ-2 промоутера олигонуклеотидов.

Далее мы рассмотрели влияние ра на пути передачи сигналов, которые, как известно активации AP-1 (46). В cotreatment HT-29, MCF-7, и MCF10A клеток при РА снижение клеточном уровнях ERK1/2, компонент митоген-активированной протеинкиназы пути. Модель (Рис. 7) свидетельствует о том, что профилактическое воздействие РА против ДТС-индуцированной ЦОГ-2 активации может быть связано, по крайней мере, в части подавление сигнальных путей, которые участвуют в активации ERK, предотвращая, таким образом, вниз по течению активации AP-1. Наши данные параллельного тех недавних исследований (47) отчетности, что лечение H9c2 клетки сердечной мышцы с более высоких концентрациях РА, чем те, которые используются в данном исследовании (55 против 10 μмоль/л) в течение 2 ч отталкивала адриамицин-зависимой активации c-Jun N-терминальной киназы и ЭРК и частично ингибирует связывание AP-1 элементов управления AP-1 олигонуклеотидных. Однако, наши результаты контрастируют с данными других исследований (48) документирование что cotreatment с РА (30 μмоль/л в течение 16 ч) не помешало, а, скорее, слегка индуцированной, ДТС-зависимых AP-1 активация в трансфицированных Jurkat Т-клеток. Одна из возможных интерпретаций этих контрастных результатов заключается в том, что способность РА либо стимулировать, либо подавлять AP-1 активность может быть из-за клетки-специфические различия или связанных с более высокие дозы и длительное время инкубации. Такое толкование согласуется с предыдущими исследованиями человеческого рака толстой кишки НТ-29 клеток документирование что chemopreventative функции различных соединений на пути передачи сигнала, таких как AP-1 может быть сильно зависит от дозы (49). Это также возможно, что влияние ра на AP-1 активность может быть из-за косвенного влияния метаболитов, феруловой и кофейной кислоты. В самом деле, феруловая кислота димера (50) и хлорогеновой кислоты (51), этерификации продукт кофейной кислоты с хинная кислоты, но не кофейной кислоты (52), было показано, ингибируют Т-зависимой активации AP-1.

Один важный вопрос касается физиологическое значение этих результатов. Мало информации доступно в отношении плазмы значения РА достижимых в организме человека. Предыдущие исследования, которые измеряли РА уровни у здоровых людей после однократного перорального приема 200 мг РА сообщили плазмы значения ∼1.2 μмоль/л (53). Однако Размер выборки этих исследований было ограничено до 6 человек и большие колебания концентрации в плазме не наблюдалось. Одной группе сообщили, плазменный значения ∼5 μмоль/л после перорального введения РА (50 мг/кг веса тела), Sprague-Dawley крыс-самцов (54). В наших исследованиях мы использовали концентрации ра в диапазоне от 5 до 20 μмоль/л при минимальной концентрации тестирование (5 μмоль/л), которая приблизительно равна плазме ранее документально (53), мы наблюдали, что РА снижена экспрессия ЦОГ-2, снижение АП-1 активации, и отталкивала ERK1/2 активации. В то время как будущие исследования должны изучить эффекты РА с помощью добавок

96

или совокупное потребление из различных растительных источников ра на плазменный уровень достижимых в организме человека, в нашем исследовании обеспечивает романа доказательств того, что РА подавляет AP-1-зависимой активации экспрессии ЦОГ-2. Тем не менее, предлагаемый влияния ра на AP-1 активация и экспрессия ЦОГ-2 ждут дальнейшего подтверждения в других клеточных линий рака in vivo моделей. Учитывая роль ЦОГ-2 в воспаления и канцерогенеза, и роль AP-1 в пролиферации и трансформации, это исследование предоставляет механистической доказательств того, что РА заслуживает дальнейшего расследования в качестве натуральных биоактивных компонентов для модуляции AP-1 и ЦОГ-2 на экспрессию генов.

DiscussionThe activation of COX-2 expression has been regarded as a causative factor in the onset of several

inflammatory conditions and etiology of colorectal (4) and breast (34) tumors. COX-2 has been a target for therapies based on NSAID and selective COX-2 inhibitors. Because NSAID have been shown to enhance gastrointestinal ulceration (9) and selective COX-2 inhibitors increased the risk for cardiovascular diseases (10), interest has been generated toward the development of alternative and prophylactic anti-COX-2 strategies that lack these negative effects (35).

Preparations from the plant Rosmarinus officinalis have been recently investigated for their ability to exert antiproliferative and antioxidant properties (36,37) and protect against skin tumorigenesis (38) and DNA damage (21). Earlier studies reported that rosemary extracts inhibited 7,12-dimethyl-benz[a]anthracene-induced DNA adducts and mammary tumors in female Sprague-Dawley rats (39–41) and benzo[a]pyrene-induced genotoxicity in bronchial cells (42). The topical application of rosemary extracts inhibited benzo[a]pyrene- and dimethyl-benz[a]anthracene–induced initiation of tumors in mouse skin as well as TPA-induced tumor promotion (43). Some of the protective effects of rosemary extracts were attributed to enhancement of xenobiotic detoxification (44).

Rosemary extracts contain several polyphenolic components, including carnosic acid, carnosol, and RA. The latter is an esterification product of caffeic acid with 3,4-dihydroxyphenyllactic acid, which is also found in sage, peppermint, and lemon balm (20). In previous investigations, the pretreatment with RA was shown to reduce COX-2 mRNA expression in a TPA-challenged skin mouse model (45). Therefore, in this study, we examined the mechanisms through which RA may antagonize COX-2 expression. We found that the cotreatment of colon cancer HT-29 cells with RA reduced TPA-induced COX-2 promoter activity and protein levels. RA antagonized the AP-1–dependent activation of COX-2 transcription, as evidenced by its ability to repress transcription from a collagenase AP-1-luciferase reporter construct transfected into colon HT-29 cancer cells. Moreover, the cotreatment of HT-29 cells with RA repressed the TPA-induced recruitment of c-Jun and c-Fos proteins to COX-2 promoter oligonucleotides. The anti-AP-1 effects of RA were not specific to HT-29 cells, because RA counteracted the binding of c-Jun and c-Fos in nuclear extracts obtained from breast cancer MCF-7 cells. Finally, we documented in nontransformed MCF10A mammary epithelial cells that RA reduced the TPA-induced accumulation of COX-2 protein and recruitment of c-Jun and c-Fos to the COX-2 promoter oligonucleotides.

We further examined the effects of RA on signal transduction pathways that are known to activate AP-1 (46). The cotreatment of HT-29, MCF-7, and MCF10A cells with RA reduced the cellular levels of ERK1/2, a component of the mitogen-activated protein kinase pathway. The model (Fig. 7) suggests that the preventative effects of RA against TPA-induced COX-2 activation may be attributable at least in part to repression of signaling pathways that participate in activation of ERK, thus preventing the downstream activation of AP-1. Our data parallel those of recent investigations (47) reporting that the treatment of H9c2 cardiac muscle cells with higher concentrations of RA than those used in this study (55 vs. 10 μmol/L) for up to 2 h antagonized the adriamycin-dependent activation of c-Jun N-terminal kinase and ERK and partially inhibited the binding of AP-1 members to a control AP-1 oligonucleotide. However, our results contrast with those of other studies (48) documenting that the cotreatment with RA (30 μmol/L for 16 h) did not prevent, but rather slightly induced, TPA-dependent AP-1 activation in transfected Jurkat T cells. One possible interpretation for these contrasting results is that the ability of RA to either stimulate or repress AP-1 activity may be due to cell-specific differences or related to higher doses and longer times of incubation. This interpretation is consistent with that of previous investigations with human colon cancer HT-29 cells documenting that the chemopreventative functions of various compounds on signal

97

transduction pathways such as AP-1 may be highly dose dependent (49). It is also feasible that the effect of RA on AP-1 activity may be due to indirect effects of the metabolites ferulic and caffeic acid. In fact, ferulic acid dimer (50) and chlorogenic acid (51), an esterification product of caffeic acid with quinic acid, but not caffeic acid (52), have been shown to inhibit the TPA-dependent activation of AP-1.

One important question pertains to the physiological significance of these results. Little information is available concerning the plasma values of RA achievable in humans. Previous research that measured RA levels in healthy men after a single oral administration of 200 mg RA reported plasma values of ∼1.2 μmol/L (53). However, the sample size of these studies was limited to 6 individuals and large variations in plasma concentrations were observed. The same group reported plasma values of ∼5 μmol/L after oral administration of RA (50 mg/kg body weight) to Sprague-Dawley male rats (54). In our studies, we used concentrations of RA ranging from 5 to 20 μmol/L. At the lowest concentration tested (5 μmol/L), which approximates the plasma levels previously documented (53), we observed that RA reduced COX-2 expression, reduced AP-1 activation, and antagonized ERK1/2 activation. While future studies should investigate the effects of RA through supplementation or cumulative intake from various herbal sources of RA on plasma levels achievable in humans, our study provides novel evidence that RA represses AP-1–dependent activation of COX-2 expression. Nevertheless, the proposed effects of RA on AP-1 activation and COX-2 expression await further confirmation in other cancer cell lines and in vivo models. Given the role of COX-2 in inflammation and carcinogenesis, and the role of AP-1 in proliferation and transformation, this study provides mechanistic evidence that RA merits further investigation as a natural bioactive component to modulate AP-1 activity and COX-2 gene expression.

Розмариновая кислота ингибирует ДМГ-индуцированной пролиферации клеток в экспериментальных крыс.

Абстрактный фон: толстой кишки , рак является одним из самых распространенных видов рака у мужчин и женщин. Настоящее исследование является попыткой разгадать антиканцерогенные эффекты розмариновой кислоты (ра) в 1,2-диметилгидразина (ДМГ)-индуцированных крыс канцерогенез толстой кишки. Администрация ДМГ вызывает множественные опухоли толстой кишки крысы, который имитирует человеческие кишки рак. Методы: у крыс-самцов Вистар были разделены на шесть групп и кормили высоким содержанием жиров. 1 группа служила контролем, 2 группы крыс были даны РА [5 мг/кг массы тела (б.ж.)] устно каждый день на общий срок 30 недель, и группы 3-6 давались еженедельные инъекции ДМГ (20 мг/кг в / б.Вт. подкожно -) раз в неделю в паховой области в течение первых 15 недель. В дополнение к ДМГ, группы 4-6 получили ра в дозе 5 мг/кг в / б.Вт. во время посвящения и postinitiation этапах, а также в течение всего периода исследования. Двоеточие тканей были исследованы гистологически; кроме того, степень окислительного стресса оценивали путем измерения перекисного окисления липидов и антиоксидантной уровней в слизистой оболочки толстой кишки крыс. Результаты: Макроскопические и микроскопические опухоли были выявлены во всех группах, что получил ДМГ. Результаты показали, что добавки с РА значительно ингибирует формирование опухоли и опухоли множественности в ДМГ у крыс, получавших. РА добавок к ДМГ, административные функции которых выполняет крыс значительно снижается пролиферация клеток маркеров, а именно, argyrophilic ядрышек организации регионов, а также пролиферативной cell nuclear antigen маркировки индекса. Кроме того, РА добавок уменьшает проявления фактора некроза опухоли-α, interlukin-6, и циклооксигеназы-2, и модулирует экспрессию Р65. Выводы: приведенные выше данные четко подчеркивают химические эффективность РА против ДМГ-индуцированного канцерогенеза толстой кишки.

J Basic Clin Physiol Pharmacol. 2014 Sep 11. pii: /j/jbcpp.ahead-of-print/jbcpp-2014-0044/jbcpp-2014-0044.xml. doi: 10.1515/jbcpp-2014-0044. [Epub ahead of print]

Rosmarinic acid inhibits DMH-induced cell proliferation in experimental rats.Karthikkumar V, Sivagami G, Viswanathan P, Nalini N.AbstractAbstract Background: Colon cancer is one of the most common cancers in both men and women. The

present study is an effort to unravel the anticarcinogenic effects of rosmarinic acid (RA) in 1,2-98

dimethylhydrazine (DMH)-induced rat colon carcinogenesis. Administration of DMH induces multiple tumors in the rat colon, which mimics human colon cancer. Methods: Male Wistar rats were divided into six groups and fed a high-fat diet. Group 1 served as control, group 2 rats were given RA [5 mg/kg body weight (b.w.)] orally every day for a total period of 30 weeks, and groups 3-6 were given weekly injections of DMH (20 mg/kg b.w. subcutaneous) once a week in the groin for the first 15 weeks. In addition to DMH, groups 4-6 received RA at a dose of 5 mg/kg b.w. during the initiation and postinitiation stages, and also throughout the entire study period. Colon tissues were examined histologically; further, the extent of oxidative stress was assessed by measuring lipid peroxidation and antioxidant levels in the colonic mucosa of rats. Results: Macroscopic and microscopic tumors were identified in all the groups that received DMH. The results revealed that supplementation with RA significantly inhibited the tumor formation and tumor multiplicity in DMH-treated rats. RA supplementation to DMH-administered rats significantly reduced the cell proliferation markers, namely, argyrophilic nucleolar organizing regions as well as proliferative cell nuclear antigen labeling index. In addition, RA supplementation reduces the expressions of tumor necrosis factor-α, interlukin-6, and cyclooxygenase-2, and modulates the expression of p65. Conclusions: The above findings clearly underline the chemopreventive efficacy of RA against DMH-induced colon carcinogenesis.

Анти-вторжение действие розмариновой кислоты через внеклеточной сигнал-регулируемой киназы и окислительно-восстановительных путь в Ls174-Т-клеток.

Розмариновая кислота является основным phenylpropanoid изолирован от Prunella vulgaris L., которая является состав травяного чая на протяжении веков в Китае. Однако, анти-вторжение деятельности на Ls174-T клеток карциномы толстой кишки человека не изучена. В этом исследовании мы исследовали анти-метастазы функции по wound healing assay, адгезия анализа, и Transwell анализа и обнаружил, что розмариновая кислота может препятствовать миграции, адгезии и инвазии доза-зависимо. Розмариновая кислота также может снизить уровень активных форм кислорода, повышение уровня восстановленного глутатиона гормона. Кроме того, розмариновой кислоты репрессированных активности и экспрессии матриксной металлопротеиназы-2,9. По данным Вестерн-блот и количественной ПЦР в режиме реального времени, розмариновая кислота может ингибировать метастазирование от колоректального рака в основном через пути внеклеточной сигнал-регулируемой киназы. В животном эксперимента, внутрибрюшинного введения 2 мг розмариновой кислоты уменьшение массы опухоли и число легочных узелков значительно по сравнению с данными контрольной группы. Таким образом, эти результаты показали, что розмариновая кислота может эффективно ингибировать метастазов опухоли in vitro и in vivo.

J Cell Biochem. 2010 Oct 1;111(2):370-9. doi: 10.1002/jcb.22708.Anti-invasion effect of rosmarinic acid via the extracellular signal-regulated kinase and oxidation-

reduction pathway in Ls174-T cells.Xu Y1, Xu G, Liu L, Xu D, Liu J.Author information 1State Key Laboratory of Bioreactor Engineering & School of Pharmacy, East China University of

Science and Technology, #268, 130 Meilong Road, Shanghai 200237, PR China.AbstractRosmarinic acid is a major phenylpropanoid isolated from Prunella vulgaris L., which is a composition of

herbal tea for centuries in China. However, the anti-invasion activity on Ls174-T human colon carcinoma cells has not been studied. In this study, we investigated the anti-metastasis functions according to wound healing assay, adhesion assay, and Transwell assay and found that rosmarinic acid could inhibit migration, adhesion, and invasion dose-dependently. Rosmarinic acid also could decrease the level of reactive oxygen species by enhancing the level of reduced glutathione hormone. In addition, rosmarinic acid repressed the activity and expression of matrix metalloproteinase-2,9. According to Western blot and quantitative real-time PCR assay, rosmarinic acid may inhibit metastasis from colorectal carcinoma mainly via the pathway of extracellular signal-regulated kinase. In animal experiment, intraperitoneal administration of 2 mg of rosmarinic acid reduced weight of tumors and the number of lung nodules significantly compared with

99

those of control group. Therefore, these results demonstrated that rosmarinic acid can effectively inhibit tumor metastasis in vitro and in vivo.

Флавоноидов и фенольных соединений из Rosmarinus officinalis.Новый флавоноид, 6"-O-(E)-feruloylhomoplantaginin (1), и 14 известных соединений, 6"-O-(E)-

feruloylnepitrin (2), 6"-O-(E)-p-coumaroylnepitrin (3), 6-methoxyluteolin 7-глюкопиранозида (4), лютеолин-3'-O-бета-D-глюкуронида (5), лютеолин-3'-O-(3"-O-ацетил)-бета-D-глюкуронида (6), кемпферол (7), лютеолин (8), генкванином (9), и ladanein (10), вместе с 1-O-feruloyl-бета-D-глюкопиранозой (11), 1-O-(4-hydroxybenzoyl)-бета-D-глюкопиранозой (12), розмариновой кислоты (13), carnosic кислоты (14), и carnosol (15), были изолированы из листьев Rosmarinus officinalis . Структуры были созданы на основе ЯМР-спектроскопические методы, Поддерживаемые HRMS. Всех выделенных соединений были испытаны на цитотоксичность человеческого рака линий клеток HepG2, COLO 205, и HL-60) и противовоспалительным деятельности в липополисахарида (LPS)-обработанный RAW 264.7 макрофагальных клеток. Среди них соединений 14 и 15 были скромно активность в ингибировании продукции нитритов в макрофагах, с последующим соединений 8 и 5. Соединений 14 и 15 были более эффективны в качестве антипролиферативного агента в HL-60 клетках с IC(50) значения 1,7 и 5,5 мкм, с последующим соединений 8 и 7 с IC(50) 39.6 и 82,0 мкм, соответственно. Кроме того, соединения 14 и 15 показали мощным антипролиферативным эффектами на клетки COLO 205 с IC(50) значения в 32,8 29,9 мкмоль, соответственно.

J Agric Food Chem. 2010 May 12;58(9):5363-7. doi: 10.1021/jf100332w.Flavonoids and phenolic compounds from Rosmarinus officinalis.Bai N1, He K, Roller M, Lai CS, Shao X, Pan MH, Ho CT.Author information 1Naturex, Inc., South Hackensack, New Jersey 07606, USA.AbstractA new flavonoid, 6''-O-(E)-feruloylhomoplantaginin (1), and 14 known compounds, 6''-O-(E)-

feruloylnepitrin (2), 6''-O-(E)-p-coumaroylnepitrin (3), 6-methoxyluteolin 7-glucopyranoside (4), luteolin 3'-O-beta-D-glucuronide (5), luteolin 3'-O-(3''-O-acetyl)-beta-D-glucuronide (6), kaempferol (7), luteolin (8), genkwanin (9), and ladanein (10), together with 1-O-feruloyl-beta-D-glucopyranose (11), 1-O-(4-hydroxybenzoyl)-beta-D-glucopyranose (12), rosmarinic acid (13), carnosic acid (14), and carnosol (15), were isolated from the leaves of Rosmarinus officinalis . The structures were established on the basis of NMR spectroscopic methods supported by HRMS. All isolated compounds were tested for cytotoxicity in human cancer cell lines (HepG2, COLO 205, and HL-60) and for anti-inflammatory activities in lipopolysaccharide (LPS)-treated RAW 264.7 macrophage cells. Among them, compounds 14 and 15 were modestly active in the inhibition of nitrite production in macrophages, followed by compounds 8 and 5. Compounds 14 and 15 were more effective as an antiproliferative agent in HL-60 cells with IC(50) values of 1.7 and 5.5 microM, followed by compounds 8 and 7 with IC(50) of 39.6 and 82.0 microM, respectively. In addition, compounds 14 and 15 showed potent antiproliferative effects on COLO 205 cells with IC(50) values of 32.8 and 29.9 microM, respectively.

Ингибирование костных метастазов из карциномы молочной железы, розмариновой кислоты.Скелетные расстройства являются частым осложнением рака молочной железы и их можно будет

найти в подавляющее большинство женщин с метастатической болезни. Наши исследования показали, что розмариновая кислота (РА) могут препятствовать миграции MDA-MB-231BO кости человека-homing молочной железы клетки доза-зависимо. Кроме того, в ST-2 мышиных стромальные клетки костного мозга культивировали с РА значительно и дозо-зависимое увеличение щелочной фосфатазы (ALP) деятельности, количество и размер минерализованной узелки увеличиваются. По данным Вестерн-блот и количественной ПЦР в режиме реального времени, РА может тормозить с костными метастазами от рака молочных желез, в основном через пути рецептора активатора NF kappaB лиганда (RANKL)/RANK/osteoprotegerin (ОПГ) и, одновременно подавляя экспрессию

100

интерлейкина-8 (IL-8). РА, таким образом, может быть хорошим кандидатом для нового терапевтического подхода в костных метастазов из карциномы молочной железы.

Planta Med. 2010 Jul;76(10):956-62. doi: 10.1055/s-0029-1240893. Epub 2010 Feb 15.Inhibition of bone metastasis from breast carcinoma by rosmarinic acid.Xu Y1, Jiang Z, Ji G, Liu J.Author information 1State Key Laboratory of Bioreactor Engineering & School of Pharmacy, East China University of

Science and Technology, Shanghai, P. R. China.AbstractSkeletal disorders are a common complication of breast cancer and will be found in the vast majority of

women with metastatic disease. Our study showed that rosmarinic acid (RA) could inhibit the migration of MDA-MB-231BO human bone-homing breast cancer cells dose-dependently. Furthermore, in ST-2 murine bone marrow stromal cells cultured with RA there was a significant and dose-dependent increase in alkaline phosphatase (ALP) activity, with the number and size of mineralized nodules increasing. According to Western blot and quantitative real-time PCR assay, RA may inhibit bone metastasis from breast carcinoma mainly via the pathway of the receptor activator of NF kappaB ligand (RANKL)/RANK/osteoprotegerin (OPG) and by simultaneously suppressing the expression of interleukin-8 (IL-8). RA may thus be a good candidate for a new therapeutic approach in bone metastasis from breast carcinoma.

Розмариновая кислота обнаруживает гибель клеток через подавление ФНО-Альфа-индуцированных NF-kappaB активации и ОРУ поколения в лейкоза человека U937 клеток.

Потому что фактор некроза опухоли-Альфа (ФНО-Альфа) - это хорошо известный вызывать воспалительные реакции, таким образом, его клиническое применение ограничено в рак лечение. Розмариновая кислота (РА), естественным полифенолов, флавоноидов, сообщил ингибируют TNF-Альфа-индуцированных NF-kappaB активации в человеческих дермальных фибробластов. Однако, точные механизмы РА не были хорошо освещены в TNF-Альфа-опосредованной анти-рак терапию. В этом исследовании мы обнаружили, что РА лечения значительно усиливает характерный ФНО-α-индуцированного апоптоза в лейкоза человека U937 клеток путем подавления ядерного транскрипционного фактора-kappaB (NF-kappaB) и активных форм кислорода (АФК). Активация каспаз в ответ на TNF-alpha была заметно увеличился лечения РА. Однако, предварительная обработка с каспазы-3 ингибитор, z-DEVD-fmk, способный значительно восстановление жизнеспособности клеток в ответ на комбинированное лечение. РА также подавляются NF-kappaB активации путем ингибирования фосфорилирования и деградации IkappaBalpha, и ядерной транслокации p50 и p65. Это угнетение коррелирует с подавлением NF-kappaB-зависимых антиапоптозных белков (ИАП-1, ИАП-2, и XIAP). РА лечения, а также нормализовалось TNF-Альфа-индуцированных АФК поколения. Кроме того, внематочная Bcl-2 выражая U937 вспять комбинированное лечение-индуцированной гибели клеток, цитохром c высвобождение в цитозоль, и коллапсу митохондриального потенциала. Эти результаты показали, что РА ингибирует TNF-Альфа-индуцированных АФК поколения и NF-kappaB активации, и повышает уровень ФНО-α-индуцированного апоптоза.

Cancer Lett. 2010 Feb 28;288(2):183-91. doi: 10.1016/j.canlet.2009.06.033. Epub 2009 Jul 19.Rosmarinic acid sensitizes cell death through suppression of TNF-alpha-induced NF-kappaB activation

and ROS generation in human leukemia U937 cells.Moon DO1, Kim MO, Lee JD, Choi YH, Kim GY.Author information 1Department of Marine Life Sciences, Jeju National University, Republic of Korea.AbstractBecause tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) is well-known to induce inflammatory responses, thus

its clinical use is limited in cancer treatment. Rosmarinic acid (RA), a naturally occurring polyphenol flavonoid, has been reported to inhibit TNF-alpha-induced NF-kappaB activation in human dermal

101

fibroblasts. However, the precise mechanisms of RA have not been well elucidated in TNF-alpha-mediated anti-cancer therapy. In this study, we found that RA treatment significantly sensitizes TNF-alpha-induced apoptosis in human leukemia U937 cells through the suppression of nuclear transcription factor-kappaB (NF-kappaB) and reactive oxygen species (ROS). Activation of caspases in response to TNF-alpha was markedly increased by RA treatment. However, pretreatment with the caspase-3 inhibitor, z-DEVD-fmk, was capable of significantly restoring cell viability in response to combined treatment. RA also suppressed NF-kappaB activation through inhibition of phosphorylation and degradation of IkappaBalpha, and nuclear translocation of p50 and p65. This inhibition was correlated with suppression of NF-kappaB-dependent anti-apoptotic proteins (IAP-1, IAP-2, and XIAP). RA treatment also normalized TNF-alpha-induced ROS generation. Additionally, ectopic Bcl-2 expressing U937 reversed combined treatment-induced cell death, cytochrome c release into cytosol, and collapse of mitochondrial potential. These results demonstrated that RA inhibits TNF-alpha-induced ROS generation and NF-kappaB activation, and enhances TNF-alpha-induced apoptosis

Розмариновая кислота индуцирует синтез меланина путем активации протеинкиназы сигнализации.

Синтез меланина-это физиологический процесс, который приводит к синтезу меланина, которые играют важную защитную роль против кожи photocarcinogenesis. Для того, чтобы определить влияние розмариновой кислоты на процесс меланогенеза и выяснение молекулярных событий, индуцированного меланогенеза и происходит розмариновой кислоты, некоторые эксперименты были выполнены в клетках меланомы B16. В этом исследовании мы показали, что содержание меланина и тирозиназы выражении увеличились на розмариновой кислоты в концентрации-зависимым способом. Кроме того, после того, как содержание меланина был увеличен на розмариновой кислоты она сократилась до H-89 и KT 5720, протеинкиназа а (ПКА) ингибиторы, но не SB203580, p38(mapk) ингибитор, или Ро-32-0432, ингибитор PKC, что предполагает вовлеченность PKA в розмариновой кислоты-индуцированного меланогенеза и происходит. В соответствии с этим, розмариновая кислота индуцирует фосфорилирование CRE-связывающий белок (сниженная калорийность creb), но не оказал влияния на фосфорилирование р38(mapk) или ингибирование фосфорилирования Akt. Кроме того, розмариновой кислоты , индуцированной активации cAMP response element (CRE) не оказывает никакого влияния на лагерь производства, которая предполагает, что розмариновая кислота-индуцированного меланогенеза и происходит опосредовано PKA, что происходит ниже по течению от лагеря продукции. Этот результат был подтвержден тот факт, что розмариновая кислота-индуцированного фосфорилирования, сниженная калорийность creb был тормозится H-89, но не PD98059, ингибитор MEK1, или LY294002, фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) ингибитора. Розмариновая кислота-индуцированную экспрессию тирозиназы белка была ослабляется H-89. Основываясь на этих результатах, мы отчет в первый раз, что розмариновая кислота индуцирует синтез меланина через PKA активации сигнализации.

Biochem Pharmacol. 2007 Oct 1;74(7):960-8. Epub 2007 Jun 14.Rosmarinic acid induces melanogenesis through protein kinase A activation signaling.Lee J1, Kim YS, Park D.Author information 1Biospectrum Life Science Institute, SK Ventium 101-701, Dangjung Dong, Gunpo City, 436-776

Kyunggi-do, Republic of Korea.AbstractMelanogenesis is a physiological process that results in the synthesis of melanin pigments, which play a

crucial protective role against skin photocarcinogenesis. In order to determine the effects of rosmarinic acid on melanogenesis and elucidate the molecular events of melanogenesis induced by rosmarinic acid, several experiments were performed in B16 melanoma cells. In this study, we showed that the melanin content and tyrosinase expression were increased by rosmarinic acid in a concentration-dependent manner. In addition, after the melanin content was increased by rosmarinic acid, it was reduced by H-89

102

and KT 5720, protein kinase A (PKA) inhibitors, but not by SB203580, a p38(mapk) inhibitor, or Ro-32-0432, a PKC inhibitor, which suggests the involvement of PKA in rosmarinic acid-induced melanogenesis. Consistent with this, rosmarinic acid induced the phosphorylation of CRE-binding protein (CREB), but had no effect on the phosphorylation of p38(mapk) or the inhibition of Akt phosphorylation. Additionally, rosmarinic acid induced the activation of cAMP response element (CRE) without having any effect on cAMP production, which suggests that rosmarinic acid-induced melanogenesis is mediated by PKA, which occurs downstream of cAMP production. This result was further confirmed by the fact that rosmarinic acid-induced phosphorylation of CREB was inhibited by H-89, but not by PD98059, a MEK1 inhibitor, or by LY294002, a phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) inhibitor. Rosmarinic acid-induced expression of tyrosinase protein was attenuated by H-89. Based on these results, we report for the first time that rosmarinic acid induces melanogenesis through PKA activation signaling.

Антипролиферативные и антиоксидантные свойства розмарина Rosmarinus officinalis.Составляющих в розмарине показали различные Фармакологические мероприятия для рака

химиопрофилактики и терапии в in vitro и in vivo моделей. Для того, чтобы глубже изучить химические свойства сырой экстракты розмарина (Rosmarinus officinalis L), мы изучали его анти-пролиферативной собственности на несколько человеческих рака клеточные линии и его антиоксидантные и противовоспалительные свойства in vitro в мышь RAW 264.7 макрофагов/моноцитов клеточной линии. Наше исследование показывает, что сырой этанольный экстракт розмарина (РО) имеет дифференциальный анти-пролиферативные эффекты на лейкоза человека и клеток карциномы молочной железы. 50% ингибирующей концентрации (IC50), был оценен в 1/700, 1/400, 1/150 и 1/500 разведениях, для HL60, K562, MCF7 и MDA-MB-468 клеток, соответственно. Номера-цитотоксических концентраций РО в разведении 1/1000 минимально индуцированной дифференцировки клеток HL60 в гранулоцитарный lineage 9,5+/-2.2% по сравнению с 2.8+/-0.8% в необработанных контроля (p<0,001), и не вызывать HL60 клеточной дифференцировки в моноциты/макрофаги lineage. 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметил-chroman-2-карбоновой кислоты (Trolox) equivalent antioxidant capacity анализа показали, что РО имеет значительную антиоксидантную активность с RO на 1/10 и 1/5 разведениях имея 8.1 и 12,6 мкмоль Тролокса эквивалентов, соответственно. RO на номера-цитотоксических и 1/1000 1/2000 разведениях не влияет на окись азота (NO) производство не стимулируется RAW 264.7 клеток. Однако, в то же разведениях RO значительно снижение продукции NO липополисахаридом (LPS)-активированных клеток в зависимости от дозы образом с 32,6+/-2.3 microM в LPS-активированных клеток 19.2+/-2.2 мкмоль (р<0,01), и 7,7+/-1.2 мкмоль (р<0,001), соответственно. От-ПЦР анализ показал, что RAW 264.7 клеток, обработанных 1/1000 и 1/500 разведениях в течение 5 ч не влияет TNFalpha, IL-1beta, iNOS и COX-2 мРНК экспрессии в этих клетках по сравнению с необработанными управления, ни в разведении 1/1000 РО повлиять TNFalpha, IL-1beta, iNOS и COX-2 экспрессии мРНК в LPS-активированных клеток. В разведении 1/500, RO значительно снижается IL-1beta (p<0,01) и ЦОГ-2 (p<0,05) экспрессии мРНК и курение значительно снижается TNFalpha и экспрессии мРНК iNOS в LPS-активированных клеток. Ввиду химические потенциалы, необходимы дальнейшие исследования для изучения других биологических свойств этой популярной специи, применяемой во многих культурах мира.

Oncol Rep. 2007 Jun;17(6):1525-31.Anti-proliferative and antioxidant properties of rosemary Rosmarinus officinalis.Cheung S1, Tai J.Author information 1Department of Pathology and Pediatrics, Center for Complementary Medicine Research, Child and

Family Research Institute, British Columbia Children's and Women's Health Center, University of British Columbia, British Columbia V6H 3N4, Canada.

AbstractConstituents in rosemary have shown a variety of pharmacological activities for cancer chemoprevention

and therapy in in vitro and in vivo models. In order to further explore the chemopreventive properties of 103

crude extracts of rosemary (Rosmarinus officinalis L), we studied its anti-proliferative property on several human cancer cell lines and its antioxidant and anti-inflammatory properties in vitro in a mouse RAW 264.7 macrophage/monocyte cell line. Our study shows that crude ethanolic rosemary extract (RO) has differential anti-proliferative effects on human leukemia and breast carcinoma cells. The 50% inhibitory concentration (IC50) was estimated at 1/700, 1/400, 1/150 and 1/500 dilutions, for the HL60, K562, MCF7 and MDA-MB-468 cells, respectively. Non-cytotoxic concentrations of RO at 1/1000 dilution minimally induced HL60 cell differentiation into granulocyte lineage at 9.5+/-2.2% compared to 2.8+/-0.8% in the untreated control (p<0.001), and did not induce HL60 cell differentiation into monocyte/macrophage lineage. The 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-chroman-2-carboxylic acid (Trolox) equivalent antioxidant capacity assay showed that RO has substantial antioxidant activity with RO at 1/10 and 1/5 dilutions having 8.1 and 12.6 microM Trolox equivalents, respectively. RO at non-cytotoxic 1/2000 and 1/1000 dilutions did not affect nitric oxide (NO) production by non-stimulated RAW 264.7 cells. However, at the same dilutions RO significantly reduced NO production by lipopolysaccharide (LPS)-activated cells in a dose-dependent manner from 32.6+/-2.3 microM in the LPS-activated cells to 19.2+/-2.2 microM (p<0.01), and 7.7+/-1.2 microM (p<0.001), respectively. RT-PCR analyses showed that RAW 264.7 cells treated with 1/1000 and 1/500 dilutions for 5 h did not affect TNFalpha, IL-1beta, iNOS and COX-2 mRNA expression in these cells when compared to the untreated controls, nor did the 1/1000 dilution of RO affect TNFalpha, IL-1beta, iNOS and COX-2 mRNA expression in the LPS-activated cells. At 1/500 dilution, RO significantly reduced IL-1beta (p<0.01) and COX-2 (p<0.05) mRNA expression and non-significantly reduced TNFalpha and iNOS mRNA expression in the LPS-activated cells. In view of the chemopreventive potentials, further studies are needed to explore other biological properties of this popular spice used by many cultures in the world.

Кооператив противоопухолевые эффекты витамина D3 производные и препараты розмарина в мышиной модели миелоидного лейкоза.

1альфа,25-дигидроксивитамин D(3) (1,25 D(3)) является мощным дифференциации агент, который имеет потенциал для лечения миелоидной лейкемии и других видов рака, но calcemia производства фармакологически активных дозах исключает использование этого агента в клинике. Мы показали, что carnosic кислоты, основные розмарина полифенолов, способствует дифференциации и антипролиферативный эффекты низких концентраций 1,25 D(3) в миелоидной лейкемии человека линии клеток (HL60, U937). Здесь мы перевели эти выводы в условиях in vivo с использованием сингенных мышь лейкоз опухоли модели. С этой целью мы впервые показали, что как в HL60 клеток, дифференциации WEHI-3B D(-) мышиной миеломоноцитарной лейкемией клеток, индуцированных 1 нм 1,25 D(3) или его низкой calcemic аналоговый, 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-холекальциферол (Ro25-4020), может быть синергично потенцируется carnosic кислоты (10 мкмоль) или carnosic кислоты богатых этанольный экстракт листьев розмарина. Этот эффект сопровождался арест клеточного цикла в G0 + G1 фазе и заметное ингибирование роста клеток. В исследованиях in vivo, я.p. инъекции 2 микрогр Ro25-4020 в Balb/c мышей, несущих WEHI-3B D(-) опухолях произведены значительные задержки в опухоли, возникновение и уменьшение размера опухоли без значительной токсичности. Другой аналоговый, 1,25-дигидрокси-16,23 Z-диен-20-эпи-26,27-hexafluoro-19-нор-холекальциферол (Ro26-3884) назначают в той же дозе был менее эффективен, чем Ro25-4020 и глубоко токсичен. Главное, что комбинированное лечение с 1% сухой экстракт розмарина (в смеси с кормом) и 1 микрогр Ro25-4020 в результате сильного кооператива противоопухолевый эффект, не вызывая гиперкальциемия. Эти результаты показывают, что растения полифенольных подготовка и производные витамина D могут сотрудничать не только в индукции дифференциации лейкозных клеток in vitro, но и в противолейкозных активности in vivo. Эти данные могут предложить роман протоколы для химиопрофилактики или дифференциации лечения миелоидного лейкоза.

Int J Cancer. 2006 Jun 15;118(12):3012-21.Cooperative antitumor effects of vitamin D3 derivatives and rosemary preparations in a mouse model

of myeloid leukemia.

104

Sharabani H1, Izumchenko E, Wang Q, Kreinin R, Steiner M, Barvish Z, Kafka M, Sharoni Y, Levy J, Uskokovic M, Studzinski GP, Danilenko M.

Author information 1Department of Clinical Biochemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva, Israel.Abstract1alpha,25-dihydroxyvitamin D(3) (1,25D(3)) is a powerful differentiation agent, which has potential for

treatment of myeloid leukemias and other types of cancer, but the calcemia produced by pharmacologically active doses precludes the use of this agent in the clinic. We have shown that carnosic acid, the major rosemary polyphenol, enhances the differentiating and antiproliferative effects of low concentrations of 1,25D(3) in human myeloid leukemia cell lines (HL60, U937). Here we translated these findings to in vivo conditions using a syngeneic mouse leukemia tumor model. To this end, we first demonstrated that as in HL60 cells, differentiation of WEHI-3B D(-) murine myelomonocytic leukemia cells induced by 1 nM 1,25D(3) or its low-calcemic analog, 1,25-dihydroxy-16-ene-5,6-trans-cholecalciferol (Ro25-4020), can be synergistically potentiated by carnosic acid (10 microM) or the carnosic acid-rich ethanolic extract of rosemary leaves. This effect was accompanied by cell cycle arrest in G0 + G1 phase and a marked inhibition of cell growth. In the in vivo studies, i.p. injections of 2 microg Ro25-4020 in Balb/c mice bearing WEHI-3B D(-) tumors produced a significant delay in tumor appearance and reduction in tumor size, without significant toxicity. Another analog, 1,25-dihydroxy-16,23Z-diene-20-epi-26,27-hexafluoro-19-nor-cholecalciferol (Ro26-3884) administered at the same dose was less effective than Ro25-4020 and profoundly toxic. Importantly, combined treatment with 1% dry rosemary extract (mixed with food) and 1 microg Ro25-4020 resulted in a strong cooperative antitumor effect, without inducing hypercalcemia. These results indicate for the first time that a plant polyphenolic preparation and a vitamin D derivative can cooperate not only in inducing leukemia cell differentiation in vitro, but also in the antileukemic activity in vivo. These data may suggest novel protocols for chemoprevention or differentiation therapy of myeloid leukemia.

Недавно мы показали, что carnosic кислоты (Рис. 1) Основные полифенольных антиоксидантов, содержащихся в растении Rosmarinus officinalis L. (rosemary), заметно повышает 1,25 D3-индуцированной дифференциацию и подавляет пролиферацию HL60 и U937 миелобластный клеток в жидкой культуре.36,38,40,41 В настоящем исследовании, мы перевели эти результаты in vivo сингенных мышей миелоидного лейкоза модель, с помощью WEHI-3B D - мышиной миеломоноцитарной лейкемии клеточной линии известных дифференцироваться в моноцитов/макрофагов lineage в ответ на 1,25 D3.16 Как carnosic кислоты и carnosic кислоты богатых этанольный экстракт листьев розмарина значительно усиливал в in vitro дифференциации и антипролиферативный эффекты 1,25 D3 и его низкой calcemic аналоговый, 1,25-дигидрокси-16-ен-5,6-транс-холекальциферол (Ro25-4020), (см. рис. 1 Для VDD структур) в WEHI-3B D- ячеек. Кроме того, мы впервые показали, что пероральное лечение экстракт розмарина, который в одиночку оказала значительное antitumorigenic эффект, в сочетании с низкой дозой я.p. Ro25-4020 в результате сильного кооператива ингибирование WEHI-3B D- рост опухоли без токсичности. Результаты нашего исследования позволяют предположить, что использование полифенолов-богатый розмарина препаратов в сочетании с низкими calcemic витамин D3 аналоги могут представлять новых эффективных и малотоксичных подход в сочетании дифференциации терапии острых миелоидных лейкозов.

Recently, we have shown that carnosic acid (Fig. 1), the major polyphenolic antioxidant found in the plant Rosmarinus officinalis L. (rosemary), markedly enhances 1,25D3-induced differentiation and inhibits proliferation of HL60 and U937 myeloblastic cells in liquid culture.36,38,40,41 In the present study, we translated these findings to the in vivo syngeneic murine myeloid leukemia model, using WEHI-3B D−

murine myelomonocytic leukemia cell line known to differentiate into monocyte/macrophage lineage in response to 1,25D3.16 Both carnosic acid and carnosic acid-rich ethanolic extract of rosemary leaves significantly potentiated the in vitro differentiating and antiproliferative effects of 1,25D3 and its low-calcemic analog, 1,25-dihydroxy-16-ene-5,6-trans-cholecalciferol (Ro25-4020), (see Fig. 1 for VDD structures) in WEHI-3B D− cells. Furthermore, we showed for the first time that oral treatment with rosemary extract, which alone had a significant antitumorigenic effect, in combination with a low dose of i.p. Ro25-4020 resulted in a strong cooperative inhibition of WEHI-3B D− tumor growth without toxicity. The

105

results of our study suggest that the use of polyphenol-rich rosemary preparations together with low calcemic vitamin D3 analogs may represent a novel effective and low-toxic approach to combination differentiation therapy of acute myeloid leukemias

Carnosic кислота ингибирует пролиферацию и усиливает дифференцировку клеток лейкемии человека, индуцированных 1,25-дигидроксивитамин D3 и ретиноевая кислота.

Carnosic кислоты, полифенольных дитерпеновых производных от Розмари, - это сильное биологически антиоксидантом, который проявляет антимутагенных свойств у бактерий и антиканцерогенную активность в различных клеточных и животных моделях. В настоящем исследовании мы показываем, что carnosic кислоты (2.5-10 мкмоль) подавляет пролиферацию HL-60 и U937 человека миелоидных лейкозных клеток (половина максимальной ингибирующей концентрации = 6-7 мкм) без индукции апоптоза или некротической гибели клеток. Рост арест произошел одновременно с временной блок клеточного цикла в фазе G1, который сопровождался увеличением immunodetectable уровнях всеобщей циклин-зависимые киназы, ингибиторы p21WAFI и p27Kipl. Carnosic кислоты вызвало лишь незначительное индукции дифференциации, как контролируется способность генерировать супероксид-радикалов и экспрессия поверхностных клеточных антигенов (CD11b и CD14) и рецепторы для хемотаксиса пептид N-формил-L-methionyl-L-leucyl-L-фенилаланина. Однако, при низких концентрациях, это полифенол существенно дополнена (в 100 - 1000 раз) дифференцирующие эффекты 1,25-дигидроксивитамин D3 и полностью транс-ретиноевой кислоты. Кроме того, такие комбинации carnosic кислоты и любой из этих индукторов дифференцировки синергически ингибирует пролиферацию и клеточный цикл прогрессии. Эти результаты указывают на то, что carnosic кислота способна антипролиферативное действие в лейкозных клетках и могут сотрудничать с другими природными противоопухолевых соединений в рост-ингибирующей и дифференциации эффектов.

Nutr Cancer. 2001;41(1-2):135-44.Carnosic acid inhibits proliferation and augments differentiation of human leukemic cells induced by

1,25-dihydroxyvitamin D3 and retinoic acid.Steiner M1, Priel I, Giat J, Levy J, Sharoni Y, Danilenko M.Author information 1Department of Clinical Biochemistry, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the

Negev and Soroka Medical Center of Kupat Holim, Beer-Sheva 84 105, Israel. misha@bgumail.bgu.ac.ilAbstractCarnosic acid, the polyphenolic diterpene derived from rosemary, is a strong dietary antioxidant that

exhibits antimutagenic properties in bacteria and anticarcinogenic activity in various cell and animal models. In the present study, we show that carnosic acid (2.5-10 microM) inhibits proliferation of HL-60 and U937 human myeloid leukemia cells (half-maximal inhibitory concentration = 6-7 microM) without induction of apoptotic or necrotic cell death. Growth arrest occurred concomitantly with a transient cell cycle block in the G1 phase, which was accompanied by an increase in the immunodetectable levels of the universal cyclin-dependent kinase inhibitors p21WAFI and p27Kipl. Carnosic acid caused only a marginal induction of differentiation, as monitored by the capacity to generate superoxide radicals and the expression of cell surface antigens (CD11b and CD14) and receptors for the chemotactic peptide N-formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine. However, at low concentrations, this polyphenol substantially augmented (100- to 1,000-fold) the differentiating effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3 and all-trans retinoic acid. Furthermore, such combinations of carnosic acid and any of these differentiation inducers synergistically inhibited proliferation and cell cycle progression. These results indicate that carnosic acid is capable of antiproliferative action in leukemic cells and can cooperate with other natural anticancer compounds in growth-inhibitory and differentiating effects.

Carnosic кислота индуцирует Апоптоз посредством активных форм кислорода-опосредованной стресс Эндоплазматического Ретикулума индукции в человеческой Карциномы почек Caki клеток.

106

Carnosic кислоты, которая является одним из экстракта компоненты розмарина, обладает противовоспалительными, антиоксидантными и анти-рак эффекты. Однако, анти-рак эффект carnosic кислоты в человека почечная карцинома клеток неизвестна.

Методы: Проточной цитометрии анализа был использован для изучения влияния carnosic кислоты на

апоптоз, и Asp-Glu-Val-Asp-ase activity assay kit был использован для проверки причастности активации каспаз. Для определения экспрессии белков апоптотических и эндоплазматический ретикулум (ER), связанных со стрессом белков, мы использовали Вестерн-блоттинга. Внутриклеточное накопление активных форм кислорода (АФК) была определена с помощью флуоресцентных зондов 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein диацетата (H2DCFDA).

Результаты: Carnosic кислоты индуцированной sub-диплоидным содержанием ДНК, sub-G1, населения и поли

(ADP-рибоза) полимеразы (PARP) расщепления и активации каспазы-3. Пан-ингибитор каспаз, benzyloxycarbonylvalyl-аланил-аспартил fluoromethyl кетон, заметно снижается апоптоз в carnosic кислота-обработанных клетках. Carnosic кислоты способствовало внутриклеточных ROS производства и предварительной обработки с ROS падальщики (N-ацетил-L-цистеин и глутатион-этиловый эфир), подавляет carnosic кислота-индуцированного апоптоза. Кроме того, carnosic кислоты также индуцированной экспрессии ER стресс-маркерные белки, в том числе и активация транскрипционного фактора 4 (ATF4) и CCAAT/enhancer-binding protein-гомологичный белок (ЧОП), в дозо - и время-зависимым образом. Вниз-регулирование ATF4 и измельчить с помощью малых интерферирующих РНК (siRNA) заметно снижается carnosic кислота-индуцированной sub-G1 населения и расщепления PARP. Кроме того, carnosic кислоты индуцированного апоптоза в карциномы молочной железы человека MDA-MB-361 и человеческой гепатоцеллюлярной карциномы SK-HEP1 клеток, но не в нормальных человеческих кожных фибробластов клетки, так и нормальные мыши почечных эпителиальных TMCK-1 клеток.

Вывод: Carnosic кислоты индуцированного апоптоза за счет производства ROS и индукции ER стресса у

человека почечная карцинома Caki клеток.J Cancer Prev. 2014 Sep;19(3):170-8. doi: 10.15430/JCP.2014.19.3.170.Carnosic Acid Induces Apoptosis Through Reactive Oxygen Species-mediated Endoplasmic Reticulum

Stress Induction in Human Renal Carcinoma Caki Cells.Min KJ1, Jung KJ1, Kwon TK1.Author information 1Department of Immunology, School of Medicine, Keimyung University, Daegu, Korea.Carnosic acid, which is one of extract components of rosemary, has anti-inflammatory, anti-oxidant, and

anti-cancer effects. However, the anti-cancer effect of carnosic acid in human renal carcinoma cells is unknown.

METHODS: Flow cytometry analysis was used to examine the effects of carnosic acid on apoptosis, and Asp-Glu-Val-

Asp-ase activity assay kit was used to investigate the involvement of caspase activation. To determine protein expression of apoptotic and endoplasmic reticulum (ER) stress-related proteins, we used Western blotting. Intracellular accumulation of reactive oxygen species (ROS) was determined using the fluorescent probes 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA).

RESULTS: Carnosic acid induced sub-diploid DNA content, sub-G1, population and poly (ADP-ribose) polymerase

(PARP) cleavage and activated caspase-3. A pan-caspase inhibitor, a benzyloxycarbonylvalyl-alanyl-aspartyl fluoromethyl ketone, markedly reduced apoptosis in carnosic acid-treated cells. Carnosic acid promoted intracellular ROS production, and pretreatment with the ROS scavengers (N-acetyl-L-cysteine and glutathione ethyl ester) inhibited carnosic acid-induced apoptosis. Furthermore, carnosic acid also induced expression of ER stress marker proteins, including activating transcription factor 4 (ATF4) and CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein (CHOP), in a dose- and time-dependent manner. Down-regulation of ATF4 and CHOP by small interfering RNA (siRNA) markedly reduced carnosic acid-

107

induced sub-G1 population and PARP cleavage. In addition, carnosic acid induced apoptosis in human breast carcinoma MDA-MB-361 and human hepatocellular carcinoma SK-HEP1 cells, but not in normal human skin fibroblast cells and normal mouse kidney epithelial TMCK-1 cells.

CONCLUSION: Carnosic acid induced apoptosis through production of ROS and induction of ER stress in human renal

carcinoma Caki cells.ВведениеCarnosic кислоты, которая является дитерпены присутствуют в розмарин (Rosmarinus officinalis),

имеет противоопухолевые эффекты in vitro, в том числе ингибирование ангиогенеза, пролиферации и миграции. Carnosic кислота ингибирует фактор роста эндотелия сосудов выражение, которое является антигенным маркером, во 7,12-dimethylbenz[a]антрацен-индуцированной хомяка щеки чехол канцерогенеза.1 одним из важных противораковых эффектов, индуцированных carnosic кислоты ингибирование пролиферации. Carnosic кислота ингибирует пролиферацию лейкозных клеток и индуцированных рост ареста в G2/M фазе через down-регуляции циклин выражение в клеток рака толстой кишки.2-4 Кроме того, carnosic кислоты снижение миграционного потенциала за счет ингибирования активатора плазминогена урокиназы и металлопротеиназ при раке толстой кишки и меланомы.5,6 кроме того, carnosic кислота усиливают апоптоз в несколько раковых клеток. Для примера, carnosic кислоты индуцированного апоптоза путем ингибирования Akt и ядерного фактора-b сигнализации по индукции белка фосфатазы 2А деятельности в клетки рака простаты.7 в клетки нейробластомы, carnosic кислоты также индуцированного апоптоза методом реактивного кислорода (ROS)-индуцированной p38 митоген-активированной протеинкиназы активации.8 Однако, последствия carnosic кислоты на апоптоза в почечной карциномы клетки были неизвестны.

Эндоплазматический ретикулум (ER) является одним из важнейших органелл локализовать и сложите белков в клетках, и дисбаланса гомеостаза в ER срабатывает по различным раздражителям, в том числе гипоксии, глюкозы и кальция магазин истощения и редукции дисульфидных связей, с последующим накоплением неразвернутых и развернутых белков в просвете.9-12 накопления неразвернутых и развернутых белков в ER индуцированного клеточного стресса и вызвал unfolded protein response, Инозитол, требующие фермента 1, РНК-зависимой протеинкиназы-как ER киназы, и активация Транскрипционного фактора 6.13,14 Если ER стресс индуцированных в клетках, unfolded protein response, способствует клеточной реакции для поддержания клеточного гомеостаза, но если адаптация ответа не достаточно, апоптоза была вызвана.15,16 Несколько белков, участвующих в ER стресс-опосредованного апоптоза. Среди них, активация транскрипционного фактора 4 (ATF4) имеет важную роль в ER стресс-опосредованного апоптоза. Anacardic кислоты увеличилось ER стресс-опосредованного апоптоза, и вниз-регулирование ATF4 и угнетение апоптоза в гепатомы и клеток меланомы, и бортезомиб - или fenretinide-индуцированного апоптоза связан с ATF4 индукции в человеческой нейроэктодермальная опухоль клеток.17,18 кроме того, CCAAT/enhancer-binding protein-гомологичный белок (ЧОП) также важен для ER стресс-опосредованного апоптоза. ЧОП участвует в 15-Дезокси-Δ12,14-простагландина J2-опосредованного апоптоза в возникновении рака шейки матки клеток и rottlerin-индуцированный апоптоз клеток рака толстой кишки.19,20

В этом исследовании мы исследовали, может ли carnosic кислоты индуцированного апоптоза, и определила молекулярные мишени из carnosic кислота-опосредованного апоптоза в почечной карциномы человека Caki клеток.

INTRODUCTIONCarnosic acid, which is a diterpene present in rosemary (Rosmarinus officinalis), has anti-tumor effects in

in vitro, including inhibition of angiogenesis, proliferation, and migration. Carnosic acid inhibited vascular endothelial growth factor expression, which is an angiogenic marker, during 7,12-dimethylbenz[a]anthracene-induced hamster buccal pouch carcinogenesis.1 One of important anti-cancer effects induced by carnosic acid is inhibition of proliferation. Carnosic acid inhibited proliferation of leukemia cells and induced growth arrest at G2/M phase via down-regulation of cyclin A expression in colon cancer cells.2–4 In addition, carnosic acid reduced migration capacity through inhibition of urokinase plasminogen activator and metalloproteinases in colon cancer and melanoma cells.5,6 Furthermore, carnosic acid increased apoptosis in multiple cancer cells. For examples, carnosic acid induced apoptosis

108

through inhibition of Akt and nuclear factor-κB signaling by induction of protein phosphatase 2A activity in prostate cancer cells.7 In neuroblastoma cells, carnosic acid also induced apoptosis by reactive oxygen species (ROS)-induced p38 mitogen-activated protein kinases activation.8 However, the effects of carnosic acid on apoptosis in renal carcinoma cells have been unknown.

The endoplasmic reticulum (ER) is a critical organelle to localize and fold of proteins in the cells, and a misbalance of homeostasis in ER is triggered by various stimuli, including hypoxia, glucose and calcium store depletion, and disulfide bonds reduction, followed by accumulation of unfolded and misfolded proteins in the lumen.9–12 Accumulation of unfolded and misfolded proteins in the ER induced cellular stress and elicited the unfolded protein response by Inositol Requiring Enzyme 1, RNA-dependent protein kinase-like ER kinase, and Activating Transcription Factor 6.13,14 If ER stress was induced in the cells, unfolded protein response promotes cellular responses to maintain cellular homeostasis, but if adaptation response is not sufficient, apoptosis was triggered.15,16 Multiple proteins are involved in ER stress-mediated apoptosis. Among them, activating transcription factor 4 (ATF4) has important roles in ER stress-mediated apoptosis. Anacardic acid increased ER stress-mediated apoptosis, and down-regulation of ATF4 suppressed apoptosis in hepatoma and melanoma cells, and bortezomib- or fenretinide-induced apoptosis is associated with ATF4 induction in human neuroectodermal tumor cells.17,18 In addition, CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein (CHOP) is also important for ER stress-mediated apoptosis. CHOP is involved in 15-Deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2-mediated apoptosis in cervical cancer cells and rottlerin-induced apoptosis in colon cancer cells.19,20

In this study, we investigated whether carnosic acid induced apoptosis, and identified the molecular targets of carnosic acid-mediated apoptosis in human renal carcinoma Caki cells.

ОбсуждениеCarnosic кислота была известна в качестве лекарства против рака, но основной механизм не

определена. В нашем исследовании мы определили механизм carnosic кислота-индуцированного апоптоза в почечной карциномы человека Caki клеток. Наиболее важные наблюдения, сделанные в настоящем документе, являются следующие: (i) Carnosic кислоты индуцированных АФК производства. (ii) ROS производства, связанных с апоптозом. (iii) Carnosic кислоты индуцированной ER стресс. (iv) ER стресс-опосредованной ATF4 и нарезать выражение частично участвует в carnosic кислота-индуцированного апоптоза.

В предыдущих исследованиях, сообщается, что carnosic кислота обладает сильным антиоксидантным действием. Carnosic кислота эффективно очищает супероксид-анион через ксантин/ксантиноксидазы и подавлял митохондриального и микросомального перекисного окисления липидов.29 Эти антиоксидантные эффекты тесно связаны с функциями carnosic кислоты. Для примера, carnosic кислота (10-20 мкм), ингибирует миграцию через подавление АФК-опосредованного матрицы metalloprotease-9 активация фактора некроза опухолей-α-лечить человека гладкомышечные клетки аорты, а carnosic кислотой (10 мкм) ингибирует IL-1β-induced cell adhesion molecule выражение через подавление производства рос.30,31 Carnosic кислота была известна как радикалов, так как carnosic кислоты трансфертов водорода и радикалов. Кроме того, carnosic кислотой (10 мкм) также увеличил ферментов фазы II, в том числе гема oxygease-1, никотинамид аденин динуклеотид фосфат хинон оксидоредуктазы 1, и γ-gluta-mylcysteine синтетазы.23 Carnosic кислота индуцирует S-алкилирования цистеином тиол из Keap1 белков с помощью привязки к конкретному Keap1 остатков цистеина, а затем Keap1/регулируемый белком nrf2 путь активируется.32 Регулируемый белком nrf2 освобожден от Keap1, carnosic кислоты может связать до antioxidant response element, который является важным экспрессии ферментов фазы II.23 кроме того, carnosic кислоты (<1 мкм), индуцированной up-регуляции внутриклеточного глутатиона.33 Глутатион является важным молекулы модулировать клеточный уровни АФК, и жестко регулируется γ-glutamylcystein лигаза (γ-GCL). Γ-GCL состоит из двух субъединиц, GCL каталитической субъединицы и GCL модификатор субъединицы, и выражение GCL каталитической субъединицы и GCL модификатор субъединица связывается с регулируемый белком nrf2/antioxidant response element пути. В отличие от этого, carnosic кислоты индуцированных АФК производства. В клетки нейробластомы человека, carnosic кислоты (>30 мкм) заметно индуцированных АФК производства.8 В нашем исследовании, carnosic кислоты (40 мкм), также увеличение уровня внутриклеточных АФК и

109

АФК участвует в carnosic кислота-индуцированного апоптоза. Хотя механизм ROS производство carnosic кислоты в высоких концентрациях (> 30 мкм) не ясно, действие carnosic кислоты на ROS производства может быть разным в зависимости от концентрации, типы клеток и др. Однако, наши данные позволяют предположить, что ROS производство carnosic кислоты (40 мкм) имеет важное значение в carnosic кислота-индуцированного апоптоза, по крайней мере, в человеческой карциномы почек Caki клеток.

ЧОП является основным ER стресс-опосредованной pro-apoptotic фактор транскрипции. ЧОП модулирует экспрессию апоптоз белков, связанных, в том числе апоптоза Bcl-2 семейство белков, смерть рецепторов, ER 1 окислительно-восстановительных реакциях организма, и tribbles-related protein 3.34 Petiwala et al. сообщили, что экстракт розмарина, выражение carnosic кислота (43%), индуцированной ЧОП выражение.26 В нашем исследовании, carnosic кислоты заметно индуцированной содержащих ATF4, а также ЧОП (Рис. 3A и B), и carnosic кислота-индуцированного апоптоза связан с регулированием ATF4 и нарезать выражение (фиг. 3C D). Механизм индукции ER стресс carnosic кислоты не ясно. Однако, мы обнаружили, что carnosic кислоты увеличение уровня внутриклеточных АФК. Окислительно-восстановительные дисбаланс является одной из причин, чтобы побудить ER стресс. ROS падальщики (НАК и GEE) заметно тормозится ATF4 и нарезать выражение в carnosic кислота-обработанных клеток (Рис. 3E). Коллективно, наши результаты показывают, что carnosic кислоты индуцированного апоптоза через АФК-опосредованного ER стресс индукции в человеческой карциномы почек Caki клеток.

DISCUSSIONCarnosic acid has been known as an anti-cancer drug, but the underlying mechanism is not well defined.

In our study, we identified the mechanism of carnosic acid-induced apoptosis in human renal carcinoma Caki cells. The most important observations made herein are as follows: (i) Carnosic acid induced ROS production. (ii) ROS production is associated with apoptosis. (iii) Carnosic acid induced ER stress. (iv) ER stress-mediated ATF4 and CHOP expression is partially involved in carnosic acid-induced apoptosis.

In previous studies, it is reported that carnosic acid has strong anti-oxidant effect. Carnosic acid effectively scavenges superoxide anion via xanthine/xanthine oxidase and inhibited mitochondrial and microsomal lipid peroxidation.29 These anti-oxidant effects are closely associated with functions of carnosic acid. For examples, carnosic acid (10–20 μM) inhibited migration via suppression of ROS-mediated matrix metalloprotease-9 activation in tumor necrosis factor-α-treated human aortic smooth muscle cells, and carnosic acid (10 μM) inhibited IL-1β-induced cell adhesion molecule expression via suppression of ROS production.30,31 Carnosic acid has been known as a radical scavenger, because carnosic acid transfers hydrogen to radicals. Furthermore, carnosic acid (10 μM) also increased the phase II enzymes, including heme oxygease-1, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate quinone oxidoreductase 1, and γ-gluta-mylcysteine synthetase.23 Carnosic acid induces of S-alkylation of the cystein thiol of the Keap1 proteins via binding to a specific Keap1 cysteine residue, and then the Keap1/Nrf2 pathway is activated.32 Nrf2 released from Keap1 by carnosic acid could bind to the antioxidant response element, which is important in expression of phase II enzymes.23 Furthermore, carnosic acid (<1 μM) induced up-regulation of intracellular glutathione levels.33 Glutathione is an important molecule to modulate cellular ROS levels, and is tightly regulated by γ-glutamylcystein ligase (γ-GCL). The γ-GCL is composed of two subunits, GCL catalytic subunit and GCL modifier subunit, and expression of GCL catalytic subunit and GCL modifier subunit is associated with the Nrf2/antioxidant response element pathway. In contrast, carnosic acid induced ROS production. In human neuroblastoma cells, carnosic acid (>30 μM) markedly induced ROS production.8 In our study, carnosic acid (40 μM) also increased intracellular ROS levels, and ROS is involved in carnosic acid-induced apoptosis. Although the mechanism of ROS production by carnosic acid at the high concentrations (> 30 μM) is not clear, action of carnosic acid on ROS production might be different depending on concentrations, cell types, etc. However, our data suggest that ROS production by carnosic acid (40 μM) is important in carnosic acid-induced apoptosis at least in human renal carcinoma Caki cells.

CHOP is a major ER stress-mediated pro-apoptotic transcription factor. CHOP modulates expression of apoptosis-related proteins, including apoptotic Bcl-2 family proteins, death receptor, ER oxidoreduction 1, and tribbles-related protein 3.34 Petiwala et al. reported that rosemary extract, expression of carnosic acid (43%), induced CHOP expression.26 In our study, carnosic acid markedly induced containing ATF4 as well as

110

CHOP (Fig. 3A and B), and carnosic acid-induced apoptosis is associated with up-regulation of ATF4 and CHOP expression (Fig. 3C and D). The mechanism of induction of ER stress by carnosic acid is not clear. However, we found that carnosic acid increased intracellular ROS levels. Redox imbalance is one of causes to induce ER stress. ROS scavengers (NAC and GEE) markedly inhibited ATF4 and CHOP expression in carnosic acid-treated cells (Fig. 3E). Collectively, our results suggest that carnosic acid induced apoptosis through ROS-mediated ER stress induction in the human renal carcinoma Caki cells.

Комплексный foodomics исследование механизмов, работающих на различных молекулярных уровней в раковых клетках в ответ на индивидуальные розмарина полифенолы.

В этой работе, вклад carnosic кислоты (CA) и carnosol (CS), два крупных соединений, присутствующих в розмарин, против толстой кишки рак НТ-29 клеток исследуется с помощью комплексного Foodomics подход. В Foodomics исследование показывает, что CA индуцирует транскрипционной активации генов, которые кодируют детоксицирующих ферментов и изменению экспрессии генов, связанных транспорта и биосинтеза терпеноидов в толстой кишке рак клеточной линии. Функциональный анализ выделил активизацию ROS метаболизма и изменения нескольких генов, участвующих в пути, описывающие окислительной деструкции соответствующих эндогенных метаболитов, предоставление новых доказательств, подтверждающих изменение транскрипционной вызванных CA в НТ-29 клеток. Метаболомика анализ показал, что лечение с CA пострадавших внутриклеточный уровень глутатиона. Повышенные уровни GSH представило дополнительные доказательства transcriptomic результаты, касающиеся химические реакции клеток CA лечения. Кроме того, Foodomics подход был полезным для установления связи между снижением уровня N-acetylputrescine и его пути деградации на генном уровне. Выводы из этой работы и предсказания, основанные на данных микрочипов позволит исследовать роман обменные процессы и потенциальных сигнальных путей дальнейшего выяснения влияния CA в колоне раковые клетки.

Anal Chem. 2014 Oct 7;86(19):9807-15. doi: 10.1021/ac502401j. Epub 2014 Sep 17.Comprehensive foodomics study on the mechanisms operating at various molecular levels in cancer

cells in response to individual rosemary polyphenols.Valdés A1, García-Cañas V, Simó C, Ibáñez C, Micol V, Ferragut JA, Cifuentes A.Author information 1Laboratory of Foodomics, Institute of Food Science Research (CIAL), CSIC , Nicolas Cabrera 9,

Campus de Cantoblanco, 28049 Madrid, Spain.AbstractIn this work, the contribution of carnosic acid (CA) and carnosol (CS), two major compounds present in

rosemary, against colon cancer HT-29 cells proliferation is investigated using a comprehensive Foodomics approach. The Foodomics study reveals that CA induces transcriptional activation of genes that encode detoxifying enzymes and altered the expression of genes linked to transport and biosynthesis of terpenoids in the colon cancer cell line. Functional analysis highlighted the activation of the ROS metabolism and alteration of several genes involved in pathways describing oxidative degradation of relevant endogenous metabolites, providing new evidence about the transcriptional change induced by CA in HT-29 cells. Metabolomics analysis showed that the treatment with CA affected the intracellular levels of glutathione. Elevated levels of GSH provided additional evidence to transcriptomic results regarding chemopreventive response of cells to CA treatment. Moreover, the Foodomics approach was useful to establish the links between decreased levels of N-acetylputrescine and its degradation pathway at the gene level. The findings from this work and the predictions based on microarray data will help explore novel metabolic processes and potential signaling pathways to further elucidate the effect of CA in colon cancer cells.

Carnosic кислота индуцирует autophagic гибели клеток путем ингибирования Akt/mTOR в клетках гепатомы человека.

Терапевтическая цель рак лечение в настоящее время направлена на запуск опухоли-селективной гибели клеток с autophagic гибели клеток необходима для химиотерапии апоптоза устойчивостью

111

рака. В этом исследовании, Carnosic кислоты (CA), полифенольных дитерпены, изолированных из розмарина (Rosemarinus officinalis), значительно индуцированной autophagic гибели клеток в клетки HepG2. Ca лечения, обусловили формирование autophagic вакуоли производится увеличение соотношения LC3-II LC3-я во время - и дозо-зависимый характер, но не влиял на уровень аутофагии-связанный белок ATG6 и ATG13 выражение. Autophagy ингибиторы 3-methyladenine (3-мА), хлорохин и bafilomycin A1, или ATG сайленсинг генов в клетки HepG2 значительно ингибирует СА-индуцированного autophagic гибели клеток. CA лечения снизился уровень фосфорилированной Akt и mTOR без каких-либо эффектов на PI3K или PTEN. Самое главное, гиперэкспрессия Akt и нокдаун PTEN ослабляется индукции аутофагии в CA-обработанных клетках. Взятые вместе, наши результаты показали, что CA индуцированной autophagic гибели клеток путем ингибирования Akt/mTOR в клетках гепатомы человека. Эти результаты показывают, что ЦС имеет большой потенциал для лечения гепатомы через autophagic индукции.

J Appl Toxicol. 2014 Sep 1. doi: 10.1002/jat.3049. [Epub ahead of print]Carnosic acid induces autophagic cell death through inhibition of the Akt/mTOR pathway in human

hepatoma cells.Gao Q1, Liu H, Yao Y, Geng L, Zhang X, Jiang L, Shi B, Yang F.Author information 1Department of integrated traditional Chinese and western medicine, Affiliated cancer hospital of

Zhengzhou University, Zhengzhou, Henan, 450008, China.AbstractThe therapeutic goal of cancer treatment is now geared towards triggering tumour-selective cell death

with autophagic cell death being required for the chemotherapy of apoptosis-resistant cancer. In this study, Carnosic acid (CA), a polyphenolic diterpene isolated from Rosemary (Rosemarinus officinalis), significantly induced autophagic cell death in HepG2 cells. Ca treatment caused the formation of autophagic vacuoles produced an increasing ratio of LC3-II to LC3-I in a time- and dose-dependent manner but had no effect on the levels of autophagy-related protein ATG6 and ATG13 expression. Autophagy inhibitors, 3-methyladenine (3-MA), chloroquine and bafilomycin A1, or ATG genes silencing in HepG2 cells significantly inhibited CA-induced autophagic cell death. The CA treatment decreased the levels of phosphorylated Akt and mTOR without any effects on PI3K or PTEN. Most importantly, overexpression of Akt and knockdown of PTEN attenuated autophagy induction in CA-treated cells. Taken together, our results indicated that CA induced autophagic cell death through inhibition of the Akt/mTOR pathway in human hepatoma cells. These findings suggest that CA has a great potential for the treatment of hepatoma via autophagic induction. Copyright © 2014 John Wiley & Sons, Ltd.

Carnosol индуцирует апоптоз посредством генерации АФК и инактивации STAT3 сигнализации в толстой кишке человека раковых клеток HCT116.

Carnosol, активной составляющей розмарина, как сообщается, обладают противовоспалительным и противоопухолевым деятельности. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе противоопухолевого воздействия carnosol остаются плохо понятыми. В настоящем исследовании, мы обнаружили, что carnosol значительно снижается жизнеспособность человеческой толстой кишки рак (HCT116) клеток в концентрации - и время-зависимым образом. Лечение клеток с carnosol индуцированного апоптоза, что было связано с активацией каспазы-9 и -3 и расщепления поли-(ADP-рибоза) полимеразы (PARP). Инкубации с carnosol повышенной экспрессии Bax и угнетал уровни Bcl-2 и Bcl-xl. Carnosol индуцированной экспрессии р53 и тормозится, что мыши-двойной минутах-2 (Mdm2). Кроме того, carnosol генерируются активные формы кислорода (ROS), подготовка поверхности с N-ацетил цистеин отменен carnosol-индуцированного расщепления каспазы-3 и PARP. Учредительные фосфорилирования связывание ДНК и активности репортерного Гена сигнала преобразователя и активатора транскрипции 3 (STAT3) была уменьшена на лечение с carnosol. Для дальнейшего выяснения молекулярных механизмов STAT3 инактивации, мы обнаружили, что carnosol ослабляется фосфорилирование Януса-активированной киназы-2 (Jak2) и Src киназы. Фармакологическое ингибирование Jak2 и Src ингибирует фосфорилирование STAT3. Кроме того,

112

carnosol ослабляется экспрессия целевого Гена STAT3 продуктов, таких как survivin, циклин D1, -D2,- D3. Взятые вместе, наше исследование представляет первый отчет, который carnosol индуцированного апоптоза в клетках HCT116 через поколение ROS, индукция р53, активация каспаз и ингибирование STAT3 сигнальный путь.

Int J Oncol. 2014 Apr;44(4):1309-15. doi: 10.3892/ijo.2014.2281. Epub 2014 Jan 27.Carnosol induces apoptosis through generation of ROS and inactivation of STAT3 signaling in human

colon cancer HCT116 cells.Park KW1, Kundu J1, Chae IG1, Kim DH2, Yu MH3, Kundu JK1, Chun KS1.Author information 1College of Pharmacy, Keimyung University, Daegu 704-701, Republic of Korea. 2College of Pharmacy, Seoul National University, Seoul 151-742, Republic of Korea. 3Department of Food Science and Technology, Keimyung University, Daegu 704-701, Republic of

Korea.AbstractCarnosol, an active constituent of rosemary, has been reported to possess anti-inflammatory and

anticancer activities. However, the molecular mechanisms underlying the anticancer effects of carnosol remain poorly understood. In the present study, we found that carnosol significantly reduced the viability of human colon cancer (HCT116) cells in a concentration- and time-dependent manner. Treatment of cells with carnosol induced apoptosis, which was associated with activation of caspase-9 and -3 and the cleavage of poly-(ADP-ribose) polymerase (PARP). Incubation with carnosol elevated the expression of Bax and inhibited the levels of Bcl-2 and Bcl-xl. Carnosol induced expression of p53 and inhibited that of murine-double minute-2 (Mdm2). Moreover, carnosol generated reactive oxygen species (ROS), and pretreatment with N-acetyl cysteine abrogated carnosol-induced cleavage of caspase-3 and PARP. The constitutive phosphorylation, the DNA binding and reporter gene activity of signal transducer and activator of transcription-3 (STAT3) was diminished by treatment with carnosol. To further elucidate the molecular mechanisms of STAT3 inactivation, we found that carnosol attenuated the phosphorylation of Janus-activated kinase-2 (Jak2) and Src kinase. Pharmacological inhibition of Jak2 and Src inhibited STAT3 phosphorylation. Furthermore, carnosol attenuated the expression of STAT3 target gene products, such as survivin, cyclin-D1, -D2, and -D3. Taken together, our study provides the first report that carnosol induced apoptosis in HCT116 cells via generation of ROS, induction of p53, activation of caspases and inhibition of STAT3 signaling pathway.

Carnosic кислота, розмарин фенольные соединения, индуцирует апоптоз посредством активных форм кислорода-опосредованной активации p38 в нейробластомы человека IMR-32 клеток.

Carnosic кислоты (CA), розмарин фенольных соединений, было показано, дисплей анти-рак деятельности. Мы исследовали эффект апоптоза CA в нейробластомы человека IMR-32 клеток и осветил роль активных форм кислорода (АФК) и митоген-активированной протеинкиназы (MAPK), связанных с канцерогенезом. Результат указал, что ЦС снижена жизнеспособность клеток в зависимости от дозы образом. Дальнейшие исследования в IMR-32 клеток показало, что клеточный апоптоз следующие CA лечение-это механизм, как было подтверждено методом проточной цитометрии, hoechst 33258, и каспазы-3/-9 и поли(ADP-рибоза) полимеразы (PARP) активации. Иммуноблотинга предложил down-регуляции анти-апоптоза Bcl-2 протеина в CA-обработанных клетках. В flow cytometric analysis, CA причиной генерации активных форм кислорода (АФК), однако, предварительная обработка с помощью антиоксиданта N-ацетилцистеина (NAC) ослабляется CA-индуцированная генерация АФК и апоптоза. Этот эффект сопровождается усилением активации p38 и снижением активации внеклеточной сигнал-регулируемой киназы (ERK), а также активацию c-Jun NH(2)-терминальные киназы (JNK). Кроме того, НАК ослабляется CA-индуцированного фосфорилирования р38. Подавление p38 с помощью siRNA нокдаун Гена снижена CA-индуцированную активацию каспазы-3. В заключение, ROS-опосредованной активации p38 MAPK играет важнейшую роль в СА-индуцированного апоптоза в IMR-32 клеток.

Neurochem Res. 2011 Dec;36(12):2442-51. doi: 10.1007/s11064-011-0573-4. Epub 2011 Aug 11.113

Carnosic acid, a rosemary phenolic compound, induces apoptosis through reactive oxygen species-mediated p38 activation in human neuroblastoma IMR-32 cells.

Tsai CW1, Lin CY, Lin HH, Chen JH.Author information 1Department of Nutrition, China Medical University, 91 Hsueh-Shih Rd, Taichung 404, Taiwan.

cwtsai@mail.cmu.edu.twAbstractCarnosic acid (CA), a rosemary phenolic compound, has been shown to display anti-cancer activity. We

examined the apoptotic effect of CA in human neuroblastoma IMR-32 cells and elucidated the role of the reactive oxygen species (ROS) and mitogen-activated protein kinase (MAPK) associated with carcinogenesis. The result indicated that CA decreased the cell viability in a dose-dependent manner. Further investigation in IMR-32 cells revealed that cell apoptosis following CA treatment is the mechanism as confirmed by flow cytometry, hoechst 33258, and caspase-3/-9 and poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) activation. Immunoblotting suggested a down-regulation of anti-apoptotic Bcl-2 protein in the CA-treated cells. In flow cytometric analysis, CA caused the generation of reactive oxygen species (ROS); however, pretreatment with the antioxidant N-acetylcysteine (NAC) attenuated the CA-induced generation of ROS and apoptosis. This effect was accompanied by increased activation of p38 and by decreased activation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) as well as activation of c-Jun NH(2)-terminal kinase (JNK). Moreover, NAC attenuated the CA-induced phosphorylation of p38. Silencing of p38 by siRNA gene knockdown reduced the CA-induced activation of caspase-3. In conclusion, ROS-mediated p38 MAPK activation plays a critical role in CA-induced apoptosis in IMR-32 cells.

Угнетение противоопухолевого препарата измеряем транспортера Р-гликопротеина, розмарин фитохимических веществ.

Последствия антиоксидантные пищевые и химические розмарина фитохимических веществ на функции человеческого препарата измеряем транспортера Р-гликопротеина (MDR1, ABCB1) и множественной лекарственной устойчивости белка 1 (MRP1, ABCC1) были исследованы с помощью P-гликопротеин-overexpressing человеческой карциномы KB-C2 клетки и человеческого Гена MRP1-трансфицированных КБ/ППМ клеток. Воздействие природных фитохимические вещества, найденные в розмарин например carnosic кислоты, carnosol, розмариновая кислота, урсоловая кислоты были исследованы. Накопление даунорубицин или родамин 123, флуоресцентных субстратов Р-гликопротеина, в КБ-C2 клеток увеличивалось в присутствии carnosic кислоты, carnosol, и урсоловая кислоты в концентрации-зависимым способом. В отличие от этого, carnosic кислоты, carnosol, розмариновая кислота, урсоловая кислота не имели влияния на накопление calcein, флуоресцентный субстрат MRP1 в КБ/ППМ клеток. В Атфазы деятельности P-гликопротеина стимулировало carnosic кислоты, carnosol, и урсоловая кислоты. КБ-C2 клеток, сенсибилизированных к винбластин цитотоксичность по carnosic кислоты, показывая, что carnosic кислота меняет множественной лекарственной устойчивости. Эти результаты позволяют предположить, что розмарин фитохимические вещества, такие как carnosic кислоты, оказывают ингибирующее влияние на противоопухолевый препарат измеряем транспортера Р-гликопротеина и может стать полезным для повышения эффективности рака химиотерапия.

Pharmacol Res. 2010 Mar;61(3):259-63. doi: 10.1016/j.phrs.2009.11.010. Epub 2009 Nov 26.Inhibition of anticancer drug efflux transporter P-glycoprotein by rosemary phytochemicals.Nabekura T1, Yamaki T, Hiroi T, Ueno K, Kitagawa S.Author information 1Faculty of Pharmaceutical Sciences, Niigata University of Pharmacy and Applied Life Sciences,

Higashi-jima, Akiha-ku, Niigata 956-8603, Japan. nabe@nupals.ac.jpAbstractThe effects of dietary antioxidative and chemopreventive rosemary phytochemicals on the function of

the human drug efflux transporter P-glycoprotein (MDR1, ABCB1) and multidrug resistance protein 1 (MRP1, ABCC1) were investigated using P-glycoprotein-overexpressing human carcinoma KB-C2 cells and

114

human MRP1 gene-transfected KB/MRP cells. The effects of natural phytochemicals found in rosemary such as carnosic acid, carnosol, rosmarinic acid, and ursolic acid were investigated. The accumulation of daunorubicin or rhodamine 123, fluorescent substrates of P-glycoprotein, in KB-C2 cells increased in the presence of carnosic acid, carnosol, and ursolic acid in a concentration-dependent manner. In contrast, carnosic acid, carnosol, rosmarinic acid, and ursolic acid had no effects on the accumulation of calcein, a fluorescent substrate of MRP1, in KB/MRP cells. The ATPase activities of P-glycoprotein were stimulated by carnosic acid, carnosol, and ursolic acid. KB-C2 cells were sensitized to vinblastine cytotoxicity by carnosic acid, showing that carnosic acid reverses multidrug resistance. These results suggest that rosemary phytochemicals, such as carnosic acid, have inhibitory effects on anticancer drug efflux transporter P-glycoprotein and may become useful to enhance the efficacy of cancer chemotherapy.

Carnosol задержки химиотерапии-индуцированной фрагментации ДНК и морфологические изменения, связанные с апоптоза в лейкозных клетках.

Carnosol, из травы розмарина, было показано, индуцируют апоптотической гибели клеток с высокой степенью риска пре-B-острый лимфобластный лейкоз (олл). В настоящем исследовании, carnosol проверяли на способность к чувствительности лейкозных клеток к химиотерапевтическим агентам. Carnosol снижается процент гибели клеток в пре-B все строчки SEM, RS4;11, и REH в сочетании с цитарабин, Метотрексат, или винкристин по сравнению с химиотерапевтическими агентами в одиночку. Анализ ДНК с помощью terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling показал, что carnosol задержка расщепления ДНК в клетках в сочетании с химиотерапевтическими препаратами. Co-лечение клеток с carnosol и химиотерапевтические препараты не снижают митохондриальной деполяризации мембран по сравнению с медикаментозное лечение в одиночку. Время курса анализа каспазы-3 активации методом проточной цитометрии показал совместного лечения с carnosol и наркотики повышенной активации каспазы-3, выше того, что наблюдалось для химиотерапевтических препаратов в одиночестве. Меньший процент каспазы-3 позитивных клеток прогрессировала к апоптотической фенотип, когда со-относиться с carnosol и химиотерапевтических препаратов по сравнению с препаратами, в одиночку. Эти данные показывают, что carnosol блокирует терминал апоптотических событий, вызванных химиотерапевтическими препаратами и предположить, что увеличилось потребление с пищей carnosol может потенциально уменьшить эффективность некоторых стандартные процедуры, используемые для химиотерапии лейкозов.

Nutr Cancer. 2009;61(1):94-102. doi: 10.1080/01635580802357360.Carnosol delays chemotherapy-induced DNA fragmentation and morphological changes associated

with apoptosis in leukemic cells.Zunino SJ1, Storms DH.Author information 1United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Western Human Nutrition

Research Center, University of California, Davis 95616, USA. susan.zunino@ars.usda.govAbstractCarnosol, from the herb rosemary, has been shown to induce apoptotic cell death in high-risk pre-B

acute lymphoblastic leukemia (ALL). In the present study, carnosol was tested for its ability to sensitize leukemia cells to chemotherapeutic agents. Carnosol reduced the percentage of cell death in the pre-B ALL lines SEM, RS4;11, and REH when combined with cytarabine, methotrexate, or vincristine compared to the chemotherapeutic agents alone. Analysis of DNA strand breaks by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling showed that carnosol delayed DNA cleavage in the cells when combined with chemotherapeutic drugs. Co-treatment of the cells with carnosol and chemotherapeutic drugs did not reduce mitochondrial membrane depolarization compared to the drug treatment alone. Time course analysis of caspase-3 activation by flow cytometry showed co-treatment with carnosol and drugs increased the activation of caspase-3 above that observed for the chemotherapeutic drugs alone. A lower percentage of caspase-3 positive cells progressed to an apoptotic phenotype when co-treated with carnosol and the chemotherapeutic drugs compared to drugs alone. These data show that carnosol blocks the terminal

115

apoptotic events induced by chemotherapeutic drugs and suggest that increased dietary intake of carnosol may potentially decrease the effectiveness of some standard chemotherapy treatments used for leukemia.

Carnosol индуцирует АФК-опосредованного beclin1-независимый аутофагии и апоптоза в тройной отрицательный рак молочной железы.

В данной работе мы исследовали in vitro и in vivo противоопухолевый эффект carnosol, естественно, полифенолов, в тройной отрицательный рак молочной железы.

Результаты: Мы обнаружили, что carnosol значительно ингибирует жизнеспособность колонии и роста

индуцированных G2 ареста в тройной негативный MDA-MB-231. Блокада клеточного цикла было связано с повышенным p21/WAF1 выражение и снижение экспрессии р27. Интересно, carnosol был найден, чтобы вызвать beclin1-независимый аутофагии и апоптоза в MDA-MB-231 клеток. Сосуществование обоих мероприятиях, аутофагии и апоптоза, было подтверждено электронно микрографии. Индукция аутофагии было установлено, что ранние события, обнаруженных в течение 3 ч после лечения, что впоследствии привело к апоптозу. Carnosol лечение также вызывает дозозависимое увеличение уровня фосфорилированных внеклеточной сигнал-регулируемой киназы 1 и 2 (pERK1/2). Кроме того, мы показываем, что carnosol индуцированных повреждений ДНК, снижение митохондриального потенциала и вызвало активизацию внутреннего и внешнего пути апоптоза. Кроме того, мы обнаружили, что carnosol индуцированное доза-зависимой генерации активных форм кислорода (АФК) и ингибирование АФК, тирон, ROS старьевщик, заблокировали индукции аутофагии и апоптоза и ослабленных повреждения ДНК. По нашим сведениям, это первый отчет для определения индукции аутофагии, carnosol.

Вывод: В заключение наши результаты дают убедительные доказательства, что carnosol может быть

альтернативным терапевтическим кандидата против агрессивной формы рака молочной железы и, следовательно, заслуживает более глубокого изучения.

PLoS One. 2014 Oct 9;9(10):e109630. doi: 10.1371/journal.pone.0109630. eCollection 2014.Carnosol induces ROS-mediated beclin1-independent autophagy and apoptosis in triple negative

breast cancer.Al Dhaheri Y1, Attoub S2, Ramadan G1, Arafat K2, Bajbouj K1, Karuvantevida N1, AbuQamar S1, Eid A3, Iratni

R1.Author information 1Department of Biology, College of Science, United Arab Emirates University, Al Ain, United Arab

Emirates. 3Department of Biological and Environmental Sciences, College of Arts and Sciences, Qatar

University, Doha, Qatar.In this study we investigated the in vitro and in vivo anticancer effect of carnosol, a naturally occurring

polyphenol, in triple negative breast cancer.RESULTS: We found that carnosol significantly inhibited the viability and colony growth induced G2 arrest in the

triple negative MDA-MB-231. Blockade of the cell cycle was associated with increased p21/WAF1 expression and downregulation of p27. Interestingly, carnosol was found to induce beclin1-independent autophagy and apoptosis in MDA-MB-231 cells. The coexistence of both events, autophagy and apoptosis, was confirmed by electron micrography. Induction of autophagy was found to be an early event, detected within 3 h post-treatment, which subsequently led to apoptosis. Carnosol treatment also caused a dose-dependent increase in the levels of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (pERK1/2). Moreover, we show that carnosol induced DNA damage, reduced the mitochondrial potential and triggered the activation of the intrinsic and extrinsic apoptotic pathway. Furthermore, we found that carnosol induced a dose-dependent generation of reactive oxygen species (ROS) and inhibition of ROS by tiron, a ROS scavenger, blocked the induction of autophagy and apoptosis and attenuated DNA damage. To our knowledge, this is the first report to identify the induction of autophagy by carnosol.

116

CONCLUSION: In conclusion our findings provide strong evidence that carnosol may be an alternative therapeutic

candidate against the aggressive form of breast cancer and hence deserves more exploration.ВведениеРак молочной железы по-прежнему второй ведущей причиной онкологической смертности у

женщин. Американское онкологическое Общество оценивается почти 232,670 новых случаев заболевания и около 40 000 смертей по оценкам, из-за рака молочной железы у женщин на 2014 год [1].

Приблизительно от 10 до 15% случаев рака молочной железы относятся к TNBC (тройной негативный рак молочной железы) группа рака. TNBC отсутствие экспрессии эстрогенов, прогестерона и HER-2 эпидермального фактора роста мембранных рецепторов, высоко агрессивных и инвазивных с плохой прогноз больных и, не реагируют на гормональную терапию. В настоящее время, не существует определенных стандартных стратегия лечения для предотвращения повторения этого заболевания, чем другие традиционные химиотерапии [2].

Апоптоз, основные форма запрограммированной клеточной гибели, считается защитным механизмом и опухолевого супрессора пути, необходимыми для развития и поддержания клеточного гомеостаза. Когда дерегулируемых апоптоза приводит к неконтролируемой пролиферации поврежденных клеток и ключевую роль в патогенезе и прогрессии рака, позволяя опухолевым клеткам выжить за пределами нормальной продолжительности жизни, но и приводит к резистентности к химио-или лучевой терапии [3]. Апоптоз может быть вызван разнообразных клеточных сигналов. Они включают в себя внутриклеточные сигналы, вырабатываемые в ответ на клеточные стрессы, такие как увеличение внутриклеточного Ca2+ концентрация, повреждение ДНК и высокие уровни активных форм кислорода (АФК). Внешними индукторами апоптоза являются бактериальные патогены, токсины, оксида азота, ростовых факторов и гормонов [4]. Апоптоз регулируется в упорядоченным образом с помощью ряда сигнальных каскадов и встречается при двух подключенных путей. Внешняя пути инициируется на поверхности клетки рецептора смерти стимуляции и активации каспазы-8, в то время как внутренние пути включает цитохром c Релиз от митохондрий и последующие каспазы-9 активации. Активации каспазы-8 и-9 activate палач каспаз, в том числе каспазу-3, который, в свою очередь, активация цитоплазматических эндонуклеаз и протеаз, которые деградируют ядерных материалов и ядерных и белков цитоскелета, соответственно, в результате чего путем устранения аномальных клеток [5]. Уклонение от апоптоза является отличительной чертой раковых клеток, что приводит к неконтролируемой пролиферации поврежденных клеток и способствует развитию рака и повышает сопротивление обычных противораковых терапий, таких как радиация и цитотоксических агентов. Большинство химиотерапевтических препаратов вызывать гибель раковых клеток путем активации апоптоза пути. Однако большинство используемых в настоящее время химиотерапия препаратами связаны с цитотоксической побочных эффектов и развития хемостойкость [6]-[7].

Хотя апоптоз является общим механизмом для большинства химиотерапевтических препаратов, которые индуцируют гибель раковых клеток, в последнее время, статус аутофагии в терапии рака также уделяется все большее внимание. Аутофагия-это высококонсервативных лизосомальной деградации, путь, по которому смятых или агрегированных белков, поврежденных органелл и внутриклеточных возбудителей исключаются [8]. Autophagy начинается, когда такие ненужные побочные продукты и поврежденных органелл засасывает в двойной мембраной везикулы (autophagosomes) и транспортируется в лизосомах, где autophagosomes предохранитель с лизосом в виде единого мембраны autolysosomes где внутренний охватившего материалы разложилась и переработанных. Поэтому, аутофагии имеет важное значение для поддержания гомеостаза и, кажется, играть pro-survival роль [9]. Апоптоза и аутофагии рассматриваются два различных мероприятий; cross-talk между аутофагии и апоптоза существует и тонкой взаимосвязи между этими двумя механизмами-это большой вызов для лечения рака. Аутофагия-видимому, играют роль в развитии рака выживаемость клеток и клеточной смерти. Это способствует цитопротекторный события, которые помогают раковым клеткам выжить и защитить клетки от апоптоза [10]. В других обстоятельствах, аутофагии может стимулировать про-смерть сигнального пути в раковых клетках.

117

Более того, в некоторых ситуациях, апоптоза и аутофагии может оказывать синергетические эффекты, в то время как в других условиях аутофагии может быть запущен только тогда, когда происходит подавление апоптоза [10].

Фитохимические вещества являются природные растительные соединения, которые, как было показано, влияние во многом здоровье человека. Недавно, эти природные соединения, приобретал все большее интерес для их укрепляющие свойства для здоровья, особенно в отношении рака молочной железы, лечения и профилактики [11]. Выявление и разработка новых химиотерапевтических препаратов из растений получили значительное признание в области лечения рака и стать одним из главных направлений экспериментальных исследований рака. Различные фитохимические вещества, присутствующие в пище были обнаружены (я) убить клетки рака молочной железы in vitro и (ii) предотвращение и/или подавления прогрессирования рака молочной железы в различных доклинических моделях животных [12]. Фитохимические вещества, как было показано целевой рака молочной железы, развития и прогрессирования путем ингибирования клеточной пролиферации, подавление воспалительных процессов, арест клеточного цикла, индуцирующие апоптоз, модулируя экспрессию генов, и ингибирования ангиогенеза и инвазии потенциал многих метастатических раковых клеточных линий. Фитохимическое становятся все более привлекательными для профилактики и лечения рака, потому что они были доказаны, чтобы быть очень эффективным, и не имеют больших побочных эффектов по сравнению с синтетическими лекарствами. Примеры противоопухолевых препаратов, полученных из растений и в настоящее время в клинической использования включают vinca алкалоиды винбластин и винкристин были изолированы от Catharan roseus, терпеновые паклитаксел от Taxus brevifolia Натт, и ДНК-топоизомераза I ингибитор клетках от Camptotheca acuminata [13]. Следовательно, скрининг новых природные фитохимические настоящее время основным направлением для открытия новых и более сильнодействующие химические и химиотерапевтических противоопухолевых препаратов. В настоящее время, большое внимание уделяется в понимание молекулярных механизмов, посредством которых эти химиотерапевтические фитохимических веществ оказывает свои противораковые эффекты.

Carnosol-это природный полифенол (диетическое дитерпены) найти в кулинарных трав, таких как розмарин, шалфей и орегано. Исследования показали, что carnosol обладает многими фармакологическими свойствами, в том числе противовоспалительное, антиоксидантное, анти-микробных и анти-раковые свойства [14]. Carnosol было показано, что значительный рост ингибирующей и цитотоксические эффекты в несколько человеческих раковых клеточных линиях и животных моделях [14]. В самом деле, carnosol было показано, подавляют рост человека НТ-1080 фибросаркома клеток [15], MCF-7 клеток рака молочной железы человека [16] PC3 человеческие клетки рака простаты [17] и совсем недавно человеческих клеток рака толстой кишки [18]. Исследования сообщили, что carnosol могут мешать несколько сигнальных путей, которые в дерегулируемых воспаления и рака [14]. По сути, было показано, что carnosol ингибировал пролиферацию, индуцированную G2 ареста и апоптоза при раке предстательной железы PC3 клеток, активируя внутренние пути апоптоза [17]. Кроме того, carnosol был найден в том, чтобы приложить силу в PC3 клеток, воздействуя на несколько сигнальных путей, в том числе ингибирование PI3K/Akt, и активации 5'-аденозинмонофосфат-активируемой протеин киназы (AMPK) пути [17]. Carnosol также индуцированной внутренней митохондриального пути апоптоза, путем модуляции anti-apoptotic члены Bcl-2 семейство белков, в острой лейкозных клеточных линий [18].

Кроме того, carnosol было показано, чтобы быть эффективным ингибитором ангиогенеза как in vitro и in vivo продемонстрирована его способность ингибировать дифференцировку, пролиферацию, миграцию и протеолитический потенциал эндотелиальных клеток [19]. Безопасность мудрый, carnosol показано, чтобы быть безопасным и хорошо переносится при приеме внутрь животным и, самое главное, имеет селективную токсичность по отношению к раковым клеткам по сравнению с опухолевой клетки [16].

В настоящей работе мы исследовали влияние carnosol на высокую пролиферативную и инвазивную тройной негативный MDA-MB-231 клеток рака молочной железы человека. Мы показываем, что carnosol заблокирован клеточного цикла в G2-фазе и индуцированных АФК-

118

зависимого апоптоза и beciln1-независимый аутофагии в клетках рака молочной железы. Мы также показываем, что carnosol инактивированной сигнала преобразователя и активатора транскрипции 3 (STAT3) сигнального пути и эффективно ингибировал рост опухоли и метастазирование in vivo клеток рака молочной железы.

IntroductionBreast cancer continues to be the second leading cause of cancer-related deaths in women. The

American Cancer Society estimated nearly 232,670 new cases and about 40 000 deaths estimated due to breast cancer in women for the year 2014 [1].

An approximate of 10 to 15% of breast cancer cases belong to the TNBC (Triple-negative breast cancer) group of cancer. TNBC lack expression of estrogen, progesterone, and the HER-2 epidermal growth factor membrane receptors, are highly aggressive and invasive with poor prognosis of patients and, do not respond to hormonal therapies. Currently, there is no defined standard treatment strategy for prevention of reoccurrence for this disease other than traditional chemotherapy [2].

Apoptosis, major form of programmed cell death, is believed to be a defense mechanism and a tumor suppressor pathway essential for development and maintaining cellular homeostasis. When deregulated apoptosis leads to uncontrolled proliferation of damaged cells and a key role in the pathogenesis and progression of cancer by allowing tumor cells to survive beyond a normal lifespan, but also leads to resistance to chemo or radiotherapy [3]. Apoptosis can be triggered by diverse cellular signals. These include intracellular signals produced in response to cellular stresses, such as increased intracellular Ca2+

concentration, DNA damage and high levels of reactive oxygen species (ROS). Extrinsic inducers of apoptosis include bacterial pathogens, toxins, nitric oxide, growth factors, and hormones [4]. Apoptosis is regulated in an orderly way by a series of signaling cascades and occurs by two connected pathways. The extrinsic pathway is initiated by cell surface death receptor stimulation and activation of caspase-8, while the intrinsic pathway involves cytochrome c release from mitochondria and subsequent caspase-9 activation. Activated caspase-8 and-9 activate executioner caspases, including caspase-3, which in turn activate a cytoplasmic endonucleases and proteases that degrade nuclear materials and nuclear and cytoskeletal proteins respectively resulting by eliminating abnormal cells [5]. Evasion from apoptosis is a hallmark of cancer cells which leads to uncontrolled proliferation of damaged cells and contributes to cancer development and enhances resistance to conventional anti-cancer therapies, such as radiation and cytotoxic agents. Most chemotherapeutic agents induce cancer cell death by activation of the apoptotic pathway. However, most of the currently used chemotherapeutics drugs are associated with cytotoxic side-effects and development of chemoresistance [6]–[7].

Although apoptosis is a common mechanism for most of chemotherapeutic drugs that induce cancer cell death, recently, the status of autophagy in cancer therapy has also been given increasing attention. Autophagy is a highly conserved lysosomal degradation pathway by which misfolded or aggregated proteins, damaged organelles and intracellular pathogens are eliminated [8]. Autophagy starts when such unnecessary byproducts and damaged organelles are engulfed into double-membrane vesicles (autophagosomes) and transported to lysosomes where autophagosomes fuse with lysosomes to form single-membrane autolysosomes where the inner engulfed materials are ultimately degraded and recycled. Therefore, autophagy is essential for maintaining homeostasis and seems to play a pro-survival role as well [9]. Apoptosis and autophagy are considered two different events; cross-talk between autophagy and apoptosis exists and the intricate interplay between these two mechanisms is a big challenge for cancer treatment. Autophagy seems to play a role in cancer cell survival and cell death. It contributes to cytoprotective events that help cancer cells to survive and to protect cells from apoptosis [10]. In other circumstances, autophagy can stimulate a pro-death signal pathway in cancer cells. Moreover, under some situations, apoptosis and autophagy can exert synergetic effects, whereas in other conditions autophagy can be triggered only when apoptosis is suppressed [10].

Phytochemicals are natural plant-derived compounds that have been shown to influence in many ways human health. Recently, these natural compounds gained increasing interest for their health promoting properties especially with regard to breast cancer treatment and prevention [11]. Identification and development of new chemotherapeutic agents from plants have gained significant recognition in the field of cancer therapy and become a major area of experimental cancer research. Various phytochemicals

119

present in the diet were found to (i) kill breast cancer cells in vitro and (ii) prevent and/or suppress breast cancer progression in various preclinical animal models [12]. Phytochemicals have been shown to target breast cancer development and progression through inhibiting cellular proliferation, suppressing inflammatory processes, arresting cell cycle, inducing apoptosis, modulating gene expression, and inhibiting angiogenesis and invasion potential of many metastatic cancer cell lines. Phytochemical are becoming more attractive for cancer prevention and treatment because they were proven to be very effective, and do not have large side-effect compared to synthetic drugs. Examples of anticancer drugs derived from plants and currently in clinical use include the vinca alkaloids vinblastine and vincristine were isolated from Catharan roseus, the terpene paclitaxel from Taxus brevifolia Nutt, and the DNA topoisomerase I inhibitor camptothecin from Camptotheca acuminata [13]. Hence, screening for new natural phytochemicals present a major avenue for the discovery of new and more potent chemopreventive and chemotherapeutic anticancer drugs. Nowadays, much attention is given in understanding the molecular mechanism(s) through which these chemotherapeutic phytochemicals exerts their anti-cancer effects.

Carnosol is a naturally occurring polyphenol (dietary diterpene) found in culinary herbs such as rosemary, sage, and oregano. Studies revealed that carnosol possesses many pharmacological activities, including anti-inflammatory, anti-oxidant, anti-microbial, and anti-cancer properties [14]. Carnosol has been shown to have significant growth inhibitory and cytotoxic effects in several human cancer cell lines and animal models [14]. In fact, carnosol was shown to inhibit the growth of the HT-1080 human fibrosarcoma cells [15], MCF-7 human breast cancer cells [16], PC3 human prostate cancer cells [17] and very recently in human colon cancer cells [18]. Studies reported that carnosol can interfere with multiple signaling pathways that are deregulated in inflammation and cancer [14]. As matter of fact, it has been shown that carnosol inhibited the proliferation, induced G2 arrest and apoptosis in prostate cancer PC3 cells, by activating the intrinsic apoptotic pathway [17]. Moreover, carnosol was found to exert its effect in PC3 cells by affecting several signaling pathways including inhibition of the PI3K/Akt, and activation of the 5'-adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) pathway [17]. Carnosol also induced intrinsic mitochondrial apoptotic pathway, through modulating the anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins, in acute leukemic cell lines [18].

Additionally, carnosol has been shown to be a potent inhibitor of angiogenesis both in vitro and in vivo demonstrated by its ability to inhibit differentiation, proliferation, migration and proteolytic potential of endothelial cells [19]. Safety wise, carnosol shown to be safe and well tolerated when administered to animals and most importantly has a selective toxicity toward cancerous cells versus non-tumorigenic cells [16].

In the present study, we investigated the effect of carnosol on the highly proliferative and invasive triple-negative MDA-MB-231 human breast cancer cells. We show that carnosol blocked cell cycle at G2 phase and induced ROS-dependent apoptosis and beciln1-independent autophagy in breast cancer cells. We also show that carnosol inactivated the Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3) signaling pathway and efficiently inhibited tumor growth and metastasis in vivo of breast cancer cells.

ОбсуждениеТройной негативный рак молочной железы (TNBC) рассматривается как высоко агрессивной

формой рака, с плохой выживаемости пациентов [29]. В настоящее время для лечения TNBC в основном посредством обычной химиотерапии, который показал ограниченный успех в долгосрочной перспективе [30]. Следовательно, выявление новых, более эффективных терапевтических соединений в отношении TNBC остается важной клинической проблемой.

В настоящей работе мы исследовали эффективность carnosol, природное соединение, против TNBC MDA-MB-231 клеток. Мы показали, что carnosol эффективно ингибировали in vitro и in vivo рост MDA-MB-231 клеток. Мы обнаружили, что carnosol индуцированного клеточного цикла в фазе G2 подтверждено уменьшение p(ser10) гистона H3 . G2 ареста carnosol было также показано в случае рака предстательной железы PC3 клеток [17] и был связан с upregulation CDK ингибиторы р21 и р27. В MDA-MB-231 клеток, однако, мы обнаружили, что арест клеточного цикла коррелирует с upregulation ингибитора CDK р21 и вниз регулирование р27, таким образом предполагая, что carnosol-индуцированного клеточного цикла в TNBC, возможно, предполагает другой механизм(ы) и не

120

требует р27. Аналогично carnosol, salinomycin, монокарбоновых полиэфирных антибиотиков, также было показано, чтобы вызвать G2 ареста, регуляция Р21 и снижение экспрессии р27 в MDA-MB-231 клеток [31]. Мы также обнаружили, что арестован MDA-MB-231 клеток, в ответ на carnosol, подвергается апоптозу. Этот вывод находится в согласии с предыдущими докладами, демонстрируя, что противораковый эффект carnosol на лейкоз [19], предстательной железы [15], [17] и рака толстой кишки [18] клеточные линии был из-за ее апоптоз-индуцирующим действием. Интересно, наши результаты впервые показали, что carnosol активированный как внутренние, так и внешние пути апоптоза в TNBC через активацию каспазы 9 и 8 соответственно. Carnosol индуцированной экспрессии про-апоптозного белка с одновременным снижением экспрессии Bcl2 и потеря митохондриального мембранного потенциала.

Увеличение числа противоопухолевой терапии было показано, индуцируют аутофагии в различных типов раковых клеток [32]. Еще, то ли аутофагии в ответ противоопухолевой терапии - pro-смерть или pro-survival остается предметом споров. Однако все больше свидетельств того, что Beclin1-независимый аутофагии неизменно ассоциируется с клеточной гибели [33], [34]. В настоящем исследовании, мы обнаружили, что carnosol также индуцированной аутофагии в MDA-MB-231. Этот вывод подтверждается большой объем доказательств, (i) электронная микрофотография наблюдения аутофагии функций, таких как массивные mitophagy и вакуолизация цитоплазмы, (ii) модуляции аутофагии-специфических маркеров, таких как преобразование LC3 я к LC3-II и модуляции р62(SQSTM1) накопления. Насколько нам известно, это первое исследование, которое показывает, что carnosol индуцирует аутофагии в раковых клеточных линиях. Мы обнаружили, что индукция аутофагии, который произошел еще 3 ч после лечения, предшествует активация программируемой клеточной смерти, который состоялся в 24 ч после лечения. Кроме того, электронная микрофотография анализ выявил наличие как события, т.е. аутофагии и апоптоза, в пределах одной ячейки. Одновременная индукция аутофагии и каспаз-зависимого апоптоза в раковых клетках, также было описано несколько противораковых соединений, таких canabidiol в борьбе с раком молочной железы MDA-MB-231 клеток [36], микротрубочки-модулирующего агента, Красный-Br-nos [35] и oridonin [36] в PC3 клетки рака простаты. По нашим сведениям, это первый отчет, который показывает, что carnosol индуцирует аутофагии в раковых клетках. Поразительно, мы обнаружили, что carnosol-индуцированной аутофагии является Beclin1-независимые. На самом деле уровень Beclin1 оставался неизменным при всех экспериментальных условиях, используемых концентраций и времени экспозиции (данные не представлены), следовательно, демонстрируя, что carnosol-опосредованной аутофагии является beclin1-независимые в MDA-MB-231 клеток. Хотя Beclin1 был большую часть времени воспринимается как ключевой игрок в аутофагии исполнения и его сбить блоки autophagic гибели клеток [37] недавнее исследование, проведенное Вонг и соавторы показали, что низкомолекулярное соединение по тексту-C1, что триггеры внутриклеточных ROS производства, индуцированных одновременной индукции Beclin1-независимый аутофагии и апоптоза в различных раковых клеток типа, в том числе и MDA-MB-231 клеток рака молочной железы [21]. Эти авторы также показали, что устойчивый ERK1/2 активации выступают как вышестоящие звенья управления как аутофагии и апоптоза в ответ на высокий уровень внутриклеточных АФК, и что его Фармакологическое ингибирование заблокировали C1 индуцированной аутофагии и апоптоза [21]. Интересно, что здесь мы показали, что carnosol индуцированная оба ROS производство и устойчивый ERK1/2 активации, следовательно, убедительно свидетельствуют о том, что carnosol, возможно, оказывает цитотоксическое действие на TNBC, по крайней мере, частично через ERK1/2 активации. Это исследование добавляет carnosol на растущий список противораковых соединений, которые индуцируют Beclin1 независимых аутофагии в клетках опухоли.

Появляется все большее количество доказательств, которые играют центральную роль в АФК производства в индукции аутофагии и гибели клеток многих типов раковых клеток. В самом деле, некоторые противораковые агенты были показаны опосредуют свое действие через Рось, и ингибирование производства рос, рос старьевщик блоков аутофагии и гибели клеток многих типов рака [34, 35, 38, 39]. Аналогичным образом, в данном исследовании мы наблюдали carnosol повышенной ROS поколения в клетках рака молочной железы в дозо - и время-зависимым образом.

121

Недавние исследования показали, что степень ROS уровень производимого, в ответ на противораковые агенты, вызывает различные реакции в раковых клетках. В то время как низкий уровень ROS было показано, что они индуцируют аутофагии, чрезмерное накопление АФК срабатывает как апоптоз и гибель клеток. В согласии с этими исследованиями, мы обнаружили, что, в зависимости от концентрации и времени воздействия, carnosol вызвало различные отклики в MDA-MB-231 клеток. Мы обнаружили, что carnosol на номера цитотоксической концентрации (25 мкм) в результате низкого уровня в рос производства и γH2AX активации, индуцированной аутофагии. Мы считаем, что в данном контексте, аутофагии был вынужден удалить поврежденные органеллы из обработанных клеток. Однако, облучение клеток, за короткий период времени, в более высокой концентрации carnosol (≥50 мкм) срабатывает аутофагии в качестве самообороны механизм выживания. Длительное воздействие такой концентрации carnosol привело к чрезмерной ROS производства, что в итоге вылилось в более высокие уровни окислительного повреждения, которое превышает клетки ремонт возможностей, что в итоге привело запрограммированной смерти клетки путем активации внутреннего и внешнего апоптотических путей. Эти результаты подчеркивают важную роль ROS накопления поддерживаются следующие доказательства: отмена ROS производства ROS старьевщик тирон, полностью заблокирован аутофагии и апоптоза в клетках, обработанных 50 мкм carnosol и значительно ослабляется оба события в более высокой концентрации (100 мкм). В целом, эти данные всячески демонстрировать, что ROS производства в ответ на carnosol выступать в качестве вышестоящего эффекторных для аутофагии и последующей индукцией апоптоза. Подобный механизм был описан Лин и сотрудников для safingol, противоопухолевого препарата в фазе I клинических испытаний, в которых было показано, способствующей концентрации-зависимого эффекта в MDA-MB-231 и раковых клеток HT29 [38]. Эти авторы показали, что низкая концентрация safingol срабатывает аутофагии, как ремонт повреждения механизма, в то время как высокие концентрации привела к гибели клеток [38].

Повреждения ДНК, вызванные генотоксичности химических веществ или ROS накопление было показано, что они индуцируют аутофагии. По-прежнему механизмы повреждения ДНК триггеры аутофагии неясны [40]. Интересно, что мы обнаружили, что carnosol индуцировать дозозависимое увеличение γH2AX, маркера повреждения ДНК, обнаружены еще 3 ч, время, которое совпадает с индукции аутофагии. Самое главное, мы обнаружили, что ингибирование АФК производства тирон ослабляется активации γH2AX. Баз по этим выводом, мы показываем, что повреждение ДНК-это последующий ответ ROS производства, которые могли бы способствовать вызывать аутофагии и апоптоза в MDA-MB-231 клеток.

В настоящее время большое внимание направлено на потенциальную роль митохондрий ущерб в индукции аутофагии. Текущая гипотеза заключается в том, что клетки реагируют на митохондриальных повреждений в градуированных мода: когда только несколько митохондрии повреждены, аутофагии происходит и в митохондриях, лизосомах; при более митохондрии повреждены, апоптоз индуцируется, и клетки гибнут [32]. В согласии с этой гипотезой, наша электронная микрофотография данные четко показали, что carnosol пострадавших митохондриальной морфологии в зависимости от дозы образом, что в итоге вылилось в потерю митохондриального мембранного потенциала. Таким образом, индукция аутофагии с или без последующей активации апоптоза, возможно, отражает степень повреждения митохондрий в carnosol-обработанных клетках.

В заключение наши данные согласуются с моделью, представленной на рис. 9, в которых лечение с carnosol триггеры окислительного повреждения TNBC. Величина ущерба, которая зависит от концентрации carnosol, определяет ответ клетки. Мы полагаем, что в присутствии большого количества внутриклеточных повреждений, вызванных высокой концентрацией carnosol, MDA-MB-231 клетки реагируют путем запуска аутофагии с последующим апоптоз через активацию обоих внутренняя и внешняя пути. В отличие от этого, ограниченное внутриклеточные повреждения, вызванные низкой концентрации carnosol триггеры только аутофагии, как ремонт механизма. Наше нынешнее исследование является экспериментальным доказательством того, что завод-производный carnosol может быть перспективным кандидатом для тройного негативного рака молочной железы терапии.

122

В настоящей работе мы исследовали влияние carnosol на высокую пролиферативную и инвазивную тройной негативный MDA-MB-231 клеток рака молочной железы человека. Мы покажем, что для carnosol заблокирован клеточного цикла в G2-фазе и индуцированных АФК-зависимого апоптоза и beciln1-независимый аутофагии в MDA-MB-231 клеток рака молочной железы.

DiscussionThe triple negative breast cancer (TNBC) is considered as highly aggressive form of cancer with poor

survival rate for the patients [29]. Currently, treatment of TNBC is mainly through conventional chemotherapy which showed limited long-term success [30]. Hence, Identification of new more effective therapeutic compounds against TNBC remains an important clinical challenge.

In the present study we investigated the effectiveness of carnosol, a natural compound, against the TNBC MDA-MB-231 cells. We showed that carnosol efficiently inhibited in vitro and in vivo the growth of the MDA-MB-231 cells. We found that carnosol induced cell cycle arrest at G2 phase confirmed by a decrease in p(ser10) histone H3 . G2 arrest by carnosol was also shown in prostate cancer PC3 cells [17] and was associated with an upregulation of the CDK inhibitors p21 and p27. In MDA-MB-231 cells, however, we found that the cell cycle arrest correlated with an upregulation of the CDK inhibitor p21 and down regulation of p27, thus suggesting that carnosol-induced cell cycle arrest in TNBC might involves different mechanism(s) and does not require p27. Similar to carnosol, salinomycin, a monocarboxylic polyether antibiotic, was also shown to induce G2 arrest, upregulation of P21 and downregulation of p27 in MDA-MB-231 cells [31]. We also found that arrested MDA-MB-231 cells, in response to carnosol, undergoes apoptosis. This finding is in agreement with previous reports demonstrating that the anticancer effect of carnosol on leukemia [19], prostate cancer [15], [17] and colon cancer [18] cell lines was due to its apoptosis-inducing activity. Interestingly, our results showed for the first time that carnosol activated both intrinsic and extrinsic apoptotic pathway in TNBC through an activation of caspase 9 and 8 respectively. Carnosol induced expression of pro-apoptotic protein with concomitant decrease of Bcl2 expression and loss of mitochondrial membrane potential.

Increasing number of anticancer therapies has been shown to induce autophagy in different cancer cell types [32]. Still, whether autophagy in response to anticancer therapies is pro-death or pro-survival remains subject to debate. However, there are increasing evidences that Beclin1-independent autophagy is invariably associated with cell death [33], [34]. In the present study, we found that carnosol also induced autophagy in MDA-MB-231. This finding is supported by large body of evidence, (i) Electron micrograph observation of autophagy features such as massive mitophagy and cytoplasmic vacuolation, (ii) modulation of autophagy-specific markers such as conversion of LC3 I to LC3 II and modulation of p62(SQSTM1) accumulation. To our knowledge this is the first study to show that carnosol induces autophagy in cancer cell lines. We found that autophagy induction, which occurred as early as 3 h post-treatment, precedes the activation of the programmed cell death which took place at 24 h post-treatment. Moreover, electron micrograph analysis revealed the existence of both events, i.e. autophagy and apoptosis, within the same cell. Simultaneous induction of autophagy and caspase-dependent apoptosis in cancer cells was also described for several anticancer compounds such canabidiol in the breast cancer MDA-MB-231 cells [36], microtubule-modulating agent, Red-Br-nos [35] and oridonin [36] in PC3 prostate cancer cells. To our knowledge, this is the first report that shows that carnosol induces autophagy in cancer cells. Strikingly we found that carnosol-induced autophagy is Beclin1-independent. In fact the level of Beclin1 remained unchanged under all experimental conditions used of concentrations or time of exposure (data not shown), hence demonstrating that carnosol-mediated autophagy is beclin1-independent in MDA-MB-231 cells. Although Beclin1 was most of the time perceived as key player in autophagy execution and its knock down blocks autophagic cell death [37], a recent study by Wong and collaborators showed that small molecule compound, referred as C1, that triggers intracellular ROS production, induced simultaneous induction of Beclin1-independent autophagy and apoptosis in various cancer cell type including MDA-MB-231 breast cancer cells [21]. These authors also showed that sustained ERK1/2 activation act as an upstream effector controlling both autophagy and apoptosis in response to high level of intracellular ROS, and that its pharmacological inhibition blocked the C1 induced autophagy and apoptosis [21]. Interestingly, here we showed that carnosol induced both ROS production and sustained ERK1/2 activation hence strongly

123

suggesting that carnosol might exerts its cytotoxic effect on TNBC at least partly through ERK1/2 activation. This study adds carnosol to the increasing list of anticancer compounds that induce Beclin1 independent autophagy in tumor cells.

There is increasing number of evidences highlighting the central role of ROS production in inducing autophagy and cell death in many cancer cell types. In fact, several anticancer agents were shown to mediate their effect through ROS, and inhibition of ROS production by ROS scavenger blocks autophagy and cell death in many cancer types [34, 35, 38, and 39]. Similarly, in this study we observed carnosol-enhanced ROS generation in breast cancer cells in dose- and time-dependent manner. Recent studies showed that the extent of ROS level produced, in response to anticancer agents, elicits different responses in cancer cells. While low level of ROS was shown to induce autophagy, excessive ROS accumulation triggered both apoptosis and cell death. In agreement with these studies, we found that, depending on the concentration and time of exposure, carnosol elicited different responses in MDA-MB-231 cells. We found that carnosol at non cytotoxic concentration (25 µM) resulted in low level in ROS production and γH2AX activation, and induced autophagy. We believe that in this context, autophagy was induced to remove damaged organelles from treated cells. However, exposure of cells, for short period of time, to higher concentration of carnosol (≥50 µM) triggered autophagy as self-defense survival mechanism. A prolonged exposure to such concentration of carnosol led to excessive ROS production, which ultimately resulted in higher levels of oxidative damage that exceeds the cell's repair capabilities that eventually caused programmed cell death through activation of intrinsic and extrinsic apoptotic pathways. These findings which highlight the essential role of ROS accumulation are supported by the following evidence: The abrogation of ROS production by the ROS scavenger tiron, totally blocked autophagy and apoptosis in cells treated with 50 µM carnosol and significantly attenuated both events at a higher concentration (100 µM). Altogether, these data strongly demonstrate that ROS production in response to carnosol act as an upstream effector for autophagy and subsequent apoptosis induction. Similar mechanism has been described by Lin and collaborators for safingol, an anticancer drug in phase I clinical trial, which has been shown to mediate a concentration-dependent effect in MDA-MB-231 and HT29 cancer cells [38]. These authors showed that Low concentration of safingol triggered autophagy as damage repair mechanism, while higher concentration led to cell death [38].

DNA damage caused by genotoxic chemicals or ROS accumulation was shown to induce autophagy. Still the mechanisms by which DNA damage triggers autophagy are unclear [40]. Interestingly, we found that carnosol induced a dose-dependent increase in γH2AX, a marker of DNA damage, detected as early as 3 h, a time that coincides with autophagy induction. Most importantly, we found that inhibition of ROS production by tiron attenuated the activation of γH2AX. Bases on these finding, we demonstrate that DNA damage is a downstream response to ROS production that might contribute to induce autophagy and apoptosis in MDA-MB-231 cells.

Nowadays, much attention is directed toward the potential role of mitochondria damage in autophagy induction. The current hypothesis is that cells respond to mitochondrial damage in a graded fashion: when only a few mitochondria are damaged, autophagy takes place and the mitochondria are degraded; when more mitochondria are damaged, apoptosis is induced, and the cells die [32]. In agreement with this hypothesis, our electron micrograph data clearly revealed that carnosol affected the mitochondrial morphology in dose-dependent manner which ultimately resulted in loss of mitochondrial membrane potential. Thus, the induction of autophagy with or without subsequent apoptosis activation might reflect the extent of mitochondria damage in carnosol-treated cells.

In conclusion, our data are consistent with a model shown in figure 9, in which treatment with carnosol triggers oxidative damage to TNBC. The magnitude of damage, which depends upon the concentration of carnosol, determines the response of the cells. We propose that in the presence of large amounts of intracellular damages induced by high concentration of carnosol, MDA-MB-231 cells respond by triggering autophagy with subsequent apoptosis through an activation of both intrinsic and extrinsic pathway. In contrast, limited intracellular damage caused by low concentration of carnosol triggers only autophagy as repair mechanism. Our current study provides experimental evidence that the plant-derived carnosol can be promising candidate for triple negative breast cancer therapy.

124

In the present study, we investigated the effect of carnosol on the highly proliferative and invasive triple-negative MDA-MB-231 human breast cancer cells. We show for that carnosol blocked cell cycle at G2 phase and induced ROS-dependent apoptosis and beciln1-independent autophagy in MDA-MB-231 breast cancer cells.

Оценка анти-рак и иммуномодулирующий эффекты carnosol в Balb/c WEHI-164 фибросаркома модели.

Реферат агенты, которые разрушают опухолевые клетки и одновременно повышать host противоопухолевого иммунитета большой интерес в рак терапии. В настоящем исследовании, эффект carnosol на противоопухолевый иммунитет в Balb/c мыши модель фибросаркома оценивали. Carnosol вводили внутрибрюшинно ежедневно (по 5 или 10 мг/кг/день, 7 дней) опухоли-подшипник мышей (т.е. через 7 дней после инъекции опухолевых клеток). Другая группа опухоль-подшипник мышей, получавших 20 мг циклофосфамид/кг/сут (положительный контроль); итоговый группа получила транспортного средства (vehicle control). После первоначального измерения на день 0, Размер опухоли измеряли дважды в течение 7-дневного периода лечения. Однажды после окончательной обработки автомобиля/carnosol (т.е. в день 7), мышам их опухоли измеряется и затем были умерщвлены, чтобы разрешить их селезенки и опухоли заготовленная для изоляции, соответственно, спленоцитов и опухоль-ассоциированных лимфоцитов. Используя эти материалы, спонтанной и митоген-индуцированного высвобождения интерлейкина (IL)-4, IL-10 и интерферона (IFN)-γ, пролиферацию лимфоцитов и абсолютное число/относительное процентное соотношение селезенки и опухоль-ассоциированных Т-регуляторных (Tрег) и других Т-лимфоцитов подмножества были оценены. Результаты показали, что carnosol в обеих дозах значительно подавлял рост опухоли и приводит к истощению селезенки и опухоль-ассоциированных Трег ячеек. Этим и вызвана относительной (по сравнению с контролем мыши ячейку значения) уменьшается в splenocyte спонтанный/индуцибельной продукции IL-4 и IL-10 и увеличивается в Ифнγ и пролиферации клеток. Carnosol либо доза не вызвать изменения в процентные соотношения CD4+ или CD8+ лимфоцитов в селезенке или в опухоль-ассоциированных лимфоцитов популяции. Наблюдаемое увеличение Ифнγ, уменьшение IL-10 и IL-4 производства, и сокращение селезенки/опухолеассоциированных Tрег в ячейках могут быть признаки, отражающие потенциальную противоопухолевую активность carnosol. На основе выводов здесь, утверждается, что carnosol является вероятным кандидатом - после более полного токсиколого оценки - для возможного использования в качестве анти-рак терапевтической.

J Immunotoxicol. 2014 Jul 16:1-8. [Epub ahead of print]Evaluation of anti-cancer and immunomodulatory effects of carnosol in a Balb/c WEHI-164

fibrosarcoma model.Rahnama M1, Mahmoudi M, Zamani Taghizadeh Rabe S, Balali-Mood M, Karimi G, Tabasi N, Riahi-Zanjani

B.Author information 1Immunology Research Center, Bu-Ali Research Institute, Mashhad University of Medical Sciences ,

Mashhad , Iran .AbstractAbstract Agents that destroy tumor cells and simultaneously boost host anti-tumor immunity are of keen

interest in cancer therapy. In the present study, the effect of carnosol on anti-tumor immunity in a Balb/c mouse model of fibrosarcoma was evaluated. Carnosol was administered intraperitoneally daily (at 5 or 10 mg/kg/day, for 7 days) to tumor-bearing mice (i.e. 7 days after initial injection of tumor cells). Another group of tumor-bearing mice was treated with 20 mg cyclophosphamide/kg/d (positive control); a final group received vehicle only (vehicle control). After an initial measure on Day 0, tumor size was measured twice during the 7-day treatment period. One day after the final treatment with vehicle/carnosol (i.e. Day 7), the mice had their tumors measured and then were euthanized to permit their spleen and tumor to be harvested for isolation of, respectively, splenocytes and tumor-associated lymphocytes. Using these materials, spontaneous and mitogen-induced release of interleukin (IL)-4, IL-10, and interferon (IFN)-γ, lymphocyte proliferation, and the absolute numbers/relative percentages of splenic and tumor-associated

125

T-regulatory (Treg) and other T-lymphocyte sub-sets were evaluated. The results showed that carnosol at both doses significantly suppressed tumor growth and caused depletion of splenic and tumor-associated Treg cells. It also caused relative (vs control mouse cell values) decreases in splenocyte spontaneous/inducible production of IL-4 and IL-10 and increases in IFNγ and cell proliferation. Carnosol at either dose did not cause changes in the percentages of CD4+ or CD8+ lymphocytes in the spleen or in tumor-associated lymphocyte populations. The observed increases in IFNγ, decreases in IL-10 and IL-4 production, and reductions in splenic/tumor-associated Treg cell levels might be signs reflecting the potential anti-tumor activity of carnosol. Based on the findings here, it is asserted that carnosol is a likely candidate - after more complete toxicologic evaluation - for eventual use as an anti-cancer therapeutic.

Carnosol, радиационной и меланомы: трансляционные возможности.Сравнить генозащитных и радиопротекторное действие carnosol (COL) от повреждений,

индуцированных ионизирующим излучением с аналогичными влияния различных антиоксидантных соединений.

Методы: В генозащитных эффект был изучен с помощью данного теста для антимутагенная активность, в

которой снижение частоты микроядер была оценена в цитокинез-блокированных клеток лимфоцитов человека. Радиопротекторный эффекты исследовали жизнеспособность клеток тест (МТТ) в PNT2 (нормальной простаты) и B16F10 (меланомы) клеточных линий, когда они вводили перед воздействием различных X-ray дозах (4, 6, 8, 10 и 0 гр).

Результаты: Carnosol показывает значительное генозащитных мощность (p < 0,001) против излучения с

фактором защиты 50 %, и снижению доз облучения фактор 4.3. Выживаемость клеток, полученных с COL, вводят до облучения 10 гр рентген показал фактором защиты 55,1 %, исключая 39 % радиационно-индуцированной гибели клеток в нормальных эпителиальных клетках простаты (PNT2) (p < 0,001). Однако, в клеточных линиях меланомы (B16F10) проанализированы, COL действовал не в качестве радиопротектора, но в качестве сенсибилизирующего агента повышение клеточной смерти на 34 % (p < 0,01) и производить аксессуар отношение 2.12.

Выводы: Carnosol могут быть разработаны в качестве радиопротектора в опухолевых клетках. Однако, в

B10F16 клетках меланомы, процесс меланогенеза активируется COL ведущих к перераспределению ферментативной остатки глутатиона и цистеина-лиазы производства, которые могли бы нарушить внутриклеточные окислительно-восстановительные системы обороны. Этот эффект проявляется как увеличение мощности ионизирующего излучения-индуцированного повреждения, и, таким образом, демонстрирует парадоксальное защитный эффект COL на клетках меланомы.

Clin Transl Oncol. 2013 Sep;15(9):712-9. doi: 10.1007/s12094-012-0994-9. Epub 2013 Jan 29.Carnosol, radiation and melanoma: a translational possibility.Alcaraz M1, Achel DG, Olivares A, Olmos E, Alcaraz-Saura M, Castillo J. 1Radiology and Physical Medicine Department, Faculty of Medicine/Dentistry, University of Murcia,

30100 Espinardo, Murcia, Spain. mab@um.esTo compare the genoprotective and radioprotective effect of carnosol (COL) against damage induced by

ionizing radiation with similar effects produced by different antioxidant compounds.METHODS: The genoprotective effect was studied by means of the micronucleus test for antimutagenic activity in

which the reduction in the frequency of micronuclei was evaluated in cytokinesis-blocked cells of human lymphocytes. The radioprotective effects were studied by cell viability test (MTT) in PNT2 (normal prostate) and B16F10 (melanoma) cell lines when they were administered before exposure to different X-ray doses (4, 6, 8, 10 and 0 Gy).

RESULTS: Carnosol shows a significant genoprotective capacity (p < 0.001) against radiation with a protection

factor of 50 %, and a dose-reduction factor of 4.3. Cell survival obtained with COL administered before 126

exposure to 10 Gy of X-rays showed a protection factor of 55.1 %, eliminating 39 % of radiation-induced cell death in normal epithelial cells of prostate (PNT2) (p < 0.001). However, in the melanoma cell lines (B16F10) assayed, COL acted not as a radioprotector, but as a sensitizing agent increasing the cellular death by 34 % (p < 0.01) and producing an enhancement ratio of 2.12.

CONCLUSIONS: Carnosol may be developed as a radioprotective agent in the non-tumoral cells. However, in the B10F16

melanoma cells, melanogenesis is activated by COL leading to redistribution of the enzymatic balances of glutathione and cysteine-lyase production, which could compromise the intracellular redox defence system. This effect appears as an increase in the capacity of ionizing radiation-induced damage, and thus exhibits a paradoxical protective effect of COL on melanoma cells.

Carnosol, диетическое дитерпены, отображает рост ингибиторных эффектов в человеческой предстательной железы PC3 клеток, ведущих к G2-фазе клеточного цикла и задач 5'-AMP-активированной протеинкиназы (AMPK) пути.

Данное исследование рассматривает анти-рак эффект carnosol в человеческой предстательной железы PC3 клеток и ее роль в модуляции нескольких сигнальных путей, связанных с канцерогенезом.

Методы: PC3 клетки были обработаны carnosol и оценивали с помощью проточной цитометрии, белок

массива и Вестерн-блот анализ с целью выявления сигнальных путей мишенью carnosol.Результаты: С помощью МТТ-теста мы обнаружили, что carnosol (10-70 мкм) снижает жизнеспособность клеток

во времени и дозозависимым. Дальнейший анализ с использованием проточной цитометрии, а также биохимический анализ выявленных в G2-фазе клеточного цикла. Для установления более точного механизма, мы провели белка массив, который оценивается 638 белков, участвующих в клеточных сигнальных путей. Белка массива определены 5'-AMP-активированной протеинкиназы (AMPK), серин/треонин протеинкиназы, участвующие в регуляции клеточного энергетического баланса в качестве потенциальной цели. Далее, вниз по течению эффекты согласуются с раком ингибирование включены модуляции mTOR/HSP70S6k/4E-BP1 пути. Кроме того, мы обнаружили, что carnosol целевые PI3K/Akt пути в зависимости от дозы образом.

Выводы: Эти результаты позволяют предположить, что carnosol цели несколько сигнальных путей, которые

включают AMPK пути. Способность carnosol ингибировать предстательной железы in vitro предполагает carnosol может быть новым агентом для управления СПС.

Pharm Res. 2008 Sep;25(9):2125-34. doi: 10.1007/s11095-008-9552-0. Epub 2008 Feb 21.Carnosol, a dietary diterpene, displays growth inhibitory effects in human prostate cancer PC3 cells

leading to G2-phase cell cycle arrest and targets the 5'-AMP-activated protein kinase (AMPK) pathway.Johnson JJ1, Syed DN, Heren CR, Suh Y, Adhami VM, Mukhtar H.Author information 1Center for Women's Health Research, University of Wisconsin, School of Medicine and Public

Health, Madison, Wisconsin, USA.This study examines the anti-cancer effect of carnosol in human prostate cancer PC3 cells and its role in

modulating multiple signaling pathways associated with carcinogenesis.METHODS: PC3 cells were treated with carnosol and were evaluated using a flow cytometry, a protein array and

Western blot analysis to identify signaling pathways targeted by carnosol.RESULTS: Using an MTT assay we found that carnosol (10-70 microM) decreases cell viability in a time and dose-

dependent manner. Further analysis using flow cytometry as well as biochemical analysis identified G2-phase cell cycle arrest. To establish a more precise mechanism, we performed a protein array that evaluated 638 proteins involved in cell signaling pathways. The protein array identified 5'-AMP-activated

127

protein kinase (AMPK), a serine/threonine protein kinase involved in the regulation of cellular energy balance as a potential target. Further downstream effects consistent with cancer inhibition included the modulation of the mTOR/HSP70S6k/4E-BP1 pathway. Additionally, we found that carnosol targeted the PI3K/Akt pathway in a dose dependent manner.

CONCLUSIONS: These results suggest that carnosol targets multiple signaling pathways that include the AMPK pathway.

The ability of carnosol to inhibit prostate cancer in vitro suggests carnosol may be a novel agent for the management of PCa.

Carnosol (рис. 1) является биологически дитерпены изолирован от кулинарных трав, которые включают розмарин, шалфей, орегано и был известен своей мощной антиоксидантной активностью, однако, carnosol уделяется мало внимания для химиопрофилактики рака свойства.(6) около 5% сухого веса листьев розмарина входят антиоксидант фенольного diterpenese carnosol и carnosic кислоты.(7) Carnosol и carnosic кислоты, как было показано, чтобы быть ответственным за 90% антиоксидантную активность нашли в розмарине.(6, 8) В традиционной китайской медицине экстракты розмарина даются в устной форме, которые содержат высокое количество дитерпены и тритерпены были использованы для лечения воспалительных состояний. Кроме того, различные пищевые добавки, экстракты розмарина, которые были стандартизированы, чтобы carnosol и/или carnosic кислоты. В in vivo исследование выполнено оценили антимутагенная активность розмарина и carnosol было связано со значительным снижением, 74% и 65%, соответственно, в число DMBA-индуцированной аденокарциномы молочной железы по сравнению с контрольной группой.(9) другой in vivo исследование показало, что пищевые carnosol (0.1%), снизилась APC, связанные аденома формирование на 46% в C57BL/6J/мин./+ (Min/+) мышь, когда по сравнению с контролем (10). Недавно, in vitro работа была выполнена и было показано, что carnosol индуцирует G2/M клеточного цикла, что цели циклин а и циклин B1 с IC50 = 23 мкм в Caco-2 клеток аденокарциномы толстой кишки, которые являются репрезентативными предраковых поражений.(11) дополнительные in vitro работы показали, что carnosol значительно ингибирует высокой метастатической меланомы мыши B16 клетки вниз через регулирование матриксная металлопротеиназа-2, c-jun, а также редокс-чувствительных факторов транскрипции ядерного фактора-каппа B (Nf-b).

Мы предположили, что carnosol могут обеспечить химические, а также химиотерапевтическое воздействие против СПС. В этом исследовании мы впервые продемонстрировал снижение жизнеспособности клеток против человеческого СПС PC3 линии клеток, обработанных carnosol. Мы наблюдали снижение жизнеспособности клеток, что мы нашли для целевой G2-фазе клеточного цикла, а также cyclins и циклин зависимых киназ (cdks). Для дальнейшего понимания модуляции множественных сигнальных путей, carnosol мы проанализировали белка массив, специфичный для 638 белки, которые определили AMP-активированной протеинкиназы, который является целью carnosol в человеческой PC3 клеток.

Carnosol (Figure 1) is a dietary diterpene isolated from culinary herbs that include rosemary, sage, and oregano and has been noted for its potent antioxidant activity, however, carnosol has received little attention for its cancer chemoprevention properties.(6) Approximately 5% of the dry weight of rosemary leaves is comprised of the antioxidant phenolic diterpenese carnosol and carnosic acid.(7) Carnosol and carnosic acid have been shown to be responsible for 90% of the antioxidant activity found in rosemary.( 6, 8) In traditional Chinese medicine rosemary extracts are given orally that contain high amounts of diterpenes and triterpenes have been used to treat inflammatory conditions. Additionally, a variety of dietary supplements of rosemary extracts are available that have been standardized to carnosol and/or carnosic acid. An in vivo study performed evaluated the antimutagenic activity of rosemary and carnosol was associated with a significant decrease, 74% and 65%, respectively, in the number of DMBA-induced mammary adenocarcinomas when compared to controls.(9) Another in vivo study showed that dietary carnosol (0.1%) decreased APC associated adenoma formation by 46% in the C57BL/6J/Min/+ (Min/+) mouse when compared to controls (10). Recently, in vitro work has been performed and it has been shown that carnosol induces G2/M cell cycle arrest that targets cyclin A and cyclin B1 with an IC50 of 23 µM in Caco-2 colon adenocarcinoma cells which are representative of precancerous lesions.(11) Additional in

128

vitro work has shown that carnosol significantly inhibited the highly metastatic mouse melanoma B16 cells through down regulation of matrix metalloproteinase 2, c-jun, as well as the redox sensitive transcription factor nuclear factor-kappa B (Nf-κB).

We hypothesized that carnosol may provide chemopreventive as well as chemotherapeutic effects against PCa. In this study, we first demonstrated a decrease in cell viability against the human PCa PC3 cell line treated with carnosol. We observed a decreased cell viability that we found to target the G2 phase of the cell cycle as well as the cyclins and cyclin dependent kinases (cdks). To further understand the modulation of multiple signaling pathways by carnosol we analyzed a protein array specific for 638 proteins that identified the AMP-activated protein kinase that is targeted by carnosol in human PC3 cells.

ОбсуждениеРак предстательной железы является наиболее распространенной формой рака у мужчин в США и

представляет собой второй по значимости причиной смерти во всех кобелей.(1) Первоначальная стратегия лечения рака предстательной железы (PCa) через блокаду андрогенов и сильно зависит от стадии заболевания (т.е. Глисона), симптомы и продолжительность жизни пациента. В зависимости от постановки клинических рекомендаций часто рекомендуют более инвазивных стратегий, таких как лучевая терапия или радикальная простатэктомия в качестве первоначального вмешательства. Пациентов и провайдеров часто неохотно возбуждают этих вмешательств. В результате фармакологических методов лечения были разработаны для подавления активности андрогенов, таких как LH-RH агонисты (леупролид), анти-андрогены (флутамид, бикалютамид, и nilutamide), и даже эстрогенов. Каждое из этих мероприятий имеет уникальный спектр побочных эффектов, которые часто рассматриваются в качестве раздражающих и надоедливых пациентов и может привести к несоблюдению и ограничивает их полезность. Поэтому важно, чтобы в дальнейшем агенты будут разработаны для их использования в СПС. Проведение химиопрофилактики путем использования естественных пищевых веществ-привлекательный вариант в рак предстательной железы из-за ее распространенности у мужчин в возрасте старше пятидесяти, и длинные задержки между предзлокачественные поражения и клинически выраженная рака.(2) Интенсивно развиваться агентов с высоким терапевтическим потенциалом в сочетании с менее системной токсичности поиске по всему миру. Развитие агентов, которые отображают химические свойства для лечения рака привлекает все больший интерес и популярность, так как он может иметь потенциал, чтобы значительно улучшить качество жизни больных раком предстательной. Мы оценивали рост ингибирующее влияние carnosol по правам СПС клеток и нашли дозу и в зависимости от времени ингибирующее действие в PC3 клеток. В этом исследовании, мы предоставляем доказательства того, что carnosol, диета на основе агента, могут тормозить человека PCa клеточной линии PC3. Несколько белков, которые способствуют блокады клеточного цикла, а также апоптоза были показаны, чтобы быть смодулировано carnosol в PC3 клеток, однако, flow cytometric analysis установлено, что смерть клеток с помощью уникального механизма. Мы предлагаем carnosol индуцированной клеточной смерти PC3 клеток через AMPK пути.

Недавние исследования показали, что активированный AMP протеинкиназы (AMPK) выступает в качестве регулятора до нескольких сигнальных путей и должны быть оценены в качестве терапевтической мишени для рака (рис. 8). (12, 13) AMPK является гетеротримерный комплекс каталитического α, и нормативных β и γ субъединиц и встречается во всех эукариот.(14) активации AMPK возникает при условиях, разрушающих клеточную АТФ и поднять AMP уровнях, таких как глюкоза лишения, гипоксии, ишемии и теплового шока, которые были связаны с повышенным АМФ/АТФ отношение.(15) Когда AMPK активируется она фосфорилирует различные метаболические ферменты, участвующие в энергетическом зависимых событий, в том числе синтез жирных кислот, холестерина и белков.

Одним из наиболее изученных рака путей в отношении AMPK модуляции является mTOR сигнального пути. Когда достаточное количество питательных веществ, доступных mTOR отвечает фосфатидной кислоты опосредованного сигнала, приводящее к активации p70 S6 киназы и инактивирует в eIF4E ингибитор, 4E-BP1.(16) агентов, таких как AMP-mimetic 5-aminoimidazole-4-карбоксамида рибонуклеозида (AICAR) было показано, что активация AMPK, энергетического голода, ведущего к фосфорилирования TSC2 на Thr-1277 и Ser-1345.(13, 17) Фосфорилирование этих сайтов

129

повышает активность TSC1-TSC2 комплекс ингибирует mTOR.(12, 18). В текущем исследовании мы подтвердили результаты белковой массив и обнаружили, что carnosol побудило AMPK-α-субъединицы. Мы обнаружили, что AMPK-α активации carnosol ингибирует фосфорилирование mTOR на Ser-2448 ведущих к раку торможения. Мы также наблюдали снижение экспрессии p70 S6K, а также в индукции eIF4E ингибитор, 4E-BP1.

Активация AMPK AMP миметический AICAR было показано, вызывает G1 клеточного цикла через р53-р21 оси в гепатомы HepG2 клеток.(19 В этом исследовании мы обнаружили, что carnosol способствовало G2 клеточного цикла в PC3 клеточной линии и был независимый статус р53 с PC3 клеточной линии не несут ген-супрессор опухоли р53. Индукция циклин зависимые киназы, ингибиторы p21 а также р27 наблюдалось наряду с зависимыми от дозы ингибирование cyclins D1, D2 и E вместе с cdk 2 и 6. Интересно, что flow cytometric analysis установлено, что ограниченное апоптоза произошло в PC3 клеток, однако, белков, участвующих в апоптозе, оказались модулированных предполагая, что других клеточных линий рака могут отображать апоптоза при лечении carnosol.

Akt активируется роста и выживаемости различных факторов и повышает выживаемость клеток путем ингибирования апоптоза через несколько целей, которые включают в себя плохо, TSC2, и mTOR.(12, 20-23), когда Akt активируется она фосфорилирует TSC2 на сайты фосфорилирования Ser-939 и Thr-1462, что приводит к ингибированию TSC2 тем самым активации mTOR.(12, 23) мы наблюдали значительное доза-зависимое снижение уровня активированных форм Akt на сайты фосфорилирования Thr-308 и Ser-473, а также ингибирование PI3K (р85) и PI3K (p110).

ВыводыВзятые вместе, наши результаты показывают, что при использовании carnosol in vitro обладает

противоопухолевой активностью с механистическое обоснование в андроген нечувствительность человеческого рака предстательной железы PC3 клеточной линии. Carnosol способствовало G2 клеточного цикла с ингибированием cyclins A, D1, D2 и cdk 2 и 6. Оценка белкового массива определены AMPK путь как цель carnosol. Активация AMPK путь привел ниже по течению эффекты, которые согласуются с раком торможения. Эти наблюдения требуют дальнейшего in vitro исследований, а также in vivo перорального исследования в животной модели, которая имитирует человеческий рак предстательной железы. Будущие исследования помогут оценить потенциал carnosol в качестве химиопрофилактики рака и/или химиотерапевтическое средство для профилактики человеческое СПС.

DISCUSSIONProstate cancer is the most common cancer among men in the USA and represents the second leading

cause of death in all males.(1) The initial strategy for treatment of prostate cancer (PCa) is through androgen blockade and is heavily dependent on the stage of disease (i.e. Gleason Score), symptoms, and life expectancy of the patient. Depending on the staging clinical guidelines often recommend more invasive strategies such as radiotherapy or radical prostatectomy as initial interventions. Patients and providers may often be reluctant to initiate these interventions. As a result, pharmacologic therapies have been developed to inhibit androgen activity such as LH-RH agonists (leuprolide), anti-androgens (flutamide, bicalutamide, and nilutamide), and even estrogens. Each of these interventions has a unique array of adverse effects that are often viewed as irritating and annoying by patients and can lead to non-compliance and limits their usefulness. Therefore, it is essential that further agents be developed for their use in PCa. Chemoprevention by the use of naturally occurring dietary substances is an attractive option in prostate cancer due to its prevalence in men over the age of fifty, and long latency between pre-malignant lesions and clinically evident cancer.(2) An intensive effort to develop agents with high therapeutic potential coupled with less systemic toxicity is being searched for worldwide. The development of agents that display chemopreventive properties for the treatment of cancer is gaining interest and popularity because it may have the potential to greatly improve the quality of life of prostate cancer patients. We evaluated the growth inhibitory effects of carnosol on human PCa cells and found a dose and time dependent inhibitory effect in PC3 cells. In this study, we provide evidence that carnosol, a diet based agent, can inhibit the human PCa cell line PC3. Several proteins that promote cell cycle blockade as well as apoptosis were shown to be modulated by carnosol in PC3 cells, however, flow cytometric analysis determined that

130

cell death was through a unique mechanism. We propose that carnosol induced cell death of PC3 cells is through the AMPK pathway.

Recent studies have suggested that activated AMP protein kinase (AMPK) acts as a regulator to several signaling pathways and should be evaluated as a therapeutic target for cancer (Figure 8). (12, 13) AMPK is a heterotrimeric complex of a catalytic α, and regulatory β and γ subunits and is found in all eukaryotes.(14) Activated AMPK occurs when conditions deplete cellular ATP and elevate AMP levels such as glucose deprivation, hypoxia, ischemia and heat shock which have been associated with an increased AMP/ATP ratio.(15) When AMPK is activated it phosphorylates a variety of metabolic enzymes involved in energy dependent events including synthesis of fatty acids, cholesterol, and protein.

One of the more studied cancer pathways in regard to AMPK modulation is the mTOR signaling pathway. When sufficient nutrients are available mTOR responds to a phosphatidic acid mediated signal leading to activation of p70 S6 kinase and inactivates the the eIF4E inhibitor, 4E-BP1.(16) Agents such as the AMP-mimetic 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside (AICAR) have been shown to activate AMPK by energy starvation leading to phosphorylation of TSC2 at Thr-1277 and Ser-1345.(13, 17) Phosphorylation at these sites increases the activity of the TSC1-TSC2 complex to inhibit mTOR.(12, 18). In the current study we confirmed the results of a protein array and found that carnosol induced the AMPK-α subunit. We found that AMPK-α activation by carnosol inhibits the phosphorylation of mTOR at Ser-2448 leading to cancer inhibition. We also observed a decreased expression of p70 S6K as well as in induction of the eIF4E inhibitor, 4E-BP1.

AMPK activation by the AMP mimetic AICAR has been shown to cause G1 cell cycle arrest through the p53-p21 axis in hepatoma HepG2 cells.(19) In this study we found that carnosol promoted G2 cell cycle arrest in the PC3 cell line and was independent of p53 status since the PC3 cell line does not carry the p53 tumor suppressor gene. The induction of cyclin dependent kinase inhibitors p21 as well as p27 was observed along with dose dependent inhibition of cyclins D1, D2, and E along with cdks 2 and 6. It is interesting that flow cytometric analysis found that limited apoptosis occurred in PC3 cells, however, proteins involved in apoptosis were found to be modulated suggesting that other cancer cell lines may display apoptosis when treated with carnosol.

Akt is activated by various growth and survival factors and promotes cell survival by inhibiting apoptosis through several targets that include Bad, TSC2, and the mTOR pathway.(12, 20–23) When Akt is activated it phosphorylates TSC2 at phosphorylation sites Ser-939 and Thr-1462 that leads to the inhibition of TSC2 thereby activating the mTOR pathway.(12, 23) We observed a significant dose dependent decrease in the activated forms of Akt at phosphorylation sites Thr-308 and Ser-473 as well as an inhibition of PI3K (p85) and PI3K (p110).

ConclusionsTaken together, our findings show that carnosol when used in vitro has anti-cancer activity with a

mechanistic rationale in the androgen insensitive human prostate cancer PC3 cell line. Carnosol promoted G2 cell cycle arrest with inhibition of cyclins A, D1, D2 and cdks 2 and 6. Evaluation of a protein array identified the AMPK pathway as a target of carnosol. Activation of the AMPK pathway resulted in downstream effects that are consistent with cancer inhibition. These observations warrant further in vitro studies as well as in vivo oral delivery studies in an animal model that mimics human prostate cancer. Future studies will help estimate the potential of carnosol as a cancer chemoprevention and/or chemotherapeutic agent for the prevention of human PCa.

131