188

서 론

Etoposide는 topoisomerase II (Topo II) 억제제로서,1 소세포 폐암, 고환암, 림프종 등에서 널리 사용되는 항암제이다.1-3 Topo II 효소는 DNA 이중가닥의 일시 풀림(breakage)과 가닥통과(strand-passage), 재형성 및 세포 분열 등에 관여하는 효소로,4,5 Etoposide는 Topo II와 DNA 결합체에 결합하여 전사, DNA 합성, 세포분열을 억제하여 결국 세포자멸사(apoptosis)를 통해 세포사멸(cell

death)을 유도한다고 알려져 있다.4-11 Apoptosis는 현재까지 종양이 항암치료에 의해 효과를 나타내는 중요한 기전으로 알려져 있지만,12 최근 여러 종양세포에서 caspase의 활성과 관련이 없는 비세포자멸사(non-apoptotic)에 의한 세포 사멸이 보고되고 있다.13-18 이런 세포 사멸을 type II programmed cell death [type II PCD (apoptosis-type I programmed cell death)]라고 하며 특징적으로 자가포식낭(autophagic vacuole)의 형성이 과도하게 일어나는 것을 관찰할 수 있어 자가포식현상에

의한 세포사멸(autophagic cell death)이라 한다.13 자가포식낭은 세포막이 세포 내부로 함입되면서 미토콘드리아

나 골지체 등을 포함하는 이중막으로 구성된 구조물로

자가포식소체(autophagosome)라고도 하며, 용해소체(lyso-some)와 결합하여 자가포식용해소체(autophagolysoso-me)를 형성하여 용해 효소에 의해 세포 물질은 분해 한

논문접수일：2006년 5월 18일 채택일：2006년 6월 6일교신저자：박종섭, 137-040 서울시 서초구 반포동 505번지

가톨릭대학교 의과대학 산부인과학교실

전화：02) 590-2596․전송：02) 595-8774E-mail：jspark@catholic.ac.kr

이 논문의 요지는 대한부인종양․콜포스코피학회 제21차 학술대회에서 구연됨. 학술대상 수상.

원저부인종양 제17권 제3호 2006

Vol. 17, No. 3, September, 2006

자궁경부암 세포주에서 etoposide 항암치료에 의한 세포사멸 기전:

세포자멸사(apoptosis)와 비세포자멸사에 의한 세포 사멸

가톨릭대학교 의과대학 산부인과학교실

동서연․이승백․김정진․박종섭

목적：Etoposide는 흔히 사용되는 항암제로서 대부분의 세포에서 apoptosis를 유발하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 그 기전에 대해서는 별로 알려진 바가 없다. 이에 저자들은 자궁경부암 세포인 CaSki 세포(HPV-16)에서 etoposide에 의한 항암 효과와 세포사멸을 일으키는 기전을 알아보고자 한다. 연구 방법：MTT assay와 Propidium iodide (PI) staining, DNA fragmentation assay, fluorescence activated cell sorter (FACS)를 통해 자궁경부암 세포 내 일어나는 다양한 세포사멸 변화를 확인하 다. 또한 electron microscopic (EM)과 Western blot 분석, RT-PCR을 이용하여 자가포식용해소체/자가용해소체와 관련된 비세포자멸사 기전에 의한 세포 사멸 현상을 확인하 다. 3-methyladenine (자가포식현상 억제제)와 zVAD-fmk (세포자멸사 억제제)를 이용하여 각각의 변화를 확인하 다. 결과：Etoposide는 apoptosis를 유발한다. 그러나, 세포주기분석의 결과를 보면 apoptosis를 의미하는 hypodiploid DNA content가 낮아 다른 세포사멸 기전이 관여함을 추측할 수 있다. EM으로 관찰한 결과 세포질 내에 자가포식용해소체를 확인할 수 있었고, Western blot을 이용하여 autophagy를 증명하 다. 3-MA를 투여하면 autophagy관련 단백의 억제뿐아니라 세포사멸도 억제되며, zVAD-fmk를 투여하며 apoptosis는 억제되고 autophagy에 의한 세포사멸이 일어났다. 3-MA와 zVAD-fmk를 동시에 투여하면 etoposide에 의한 CaSki세포의 세포사멸이 대조군과 같은 정도로 억제됨을 관찰하 다. 결론：자궁경부암세포에서 etoposide는 apoptosis 뿐 아니라 동시에 autophagy를 유발하며 이 기전은 세포사멸에 직접적으로 관여한다. 항암제에 의한 autophagic cell death의 유도는 향후 항암치료 분야에 새로운 접근 방법을 제시하는데 유용할 것으로 생각된다.

중심단어：Etoposide, CaSki 세포, 자가포식현상, 세포자멸사

자궁경부암 세포주에서 etoposide 항암치료에 의한 세포사멸 기전

189

다.13,19-21 자가포식현상(autophagy)은 낮은 수준의 자극에 의해서 유도되는 경우는 세포 내의 항상성 유지 및 생존

에 필수적인 기전으로 이해되지만, 과도한 자극에서는 자가포식현상이 type II PCD와 연결된다고 이해되고 있다. 자가포식현상은 여러 종양 세포주에서 종양 치료제에 의해 활성화 된다고 보고되고 있지만, 암 형성이나 억제와의 관련성에 대해서는 확실히 규명된 바는 없

다.22-26

본 연구에서는 자궁경부암 세포에서 etoposide 투여 후 일어나는 PCD의 기전을 이해하고자 하고, 이에 의한 항 증식 효과를 규명하고자 한다.

연구 대상 및 방법

1. 세포주 배양과 세포 증식 분석

자궁경부암 세포주인 CaSki 세포(HPV-16)와 자가포식현상을 확인하기 위한 양성 대조군으로 사용할 U87 세포(human glioma cell line)20를 fetal bovine serum (Gibco BRL, MD) 10%가 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium (DMEM) 배지(Gibco BRL)를 사용하여 5% CO2, 37oC에서 배양하 다. Etoposide (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA)는 DMSO (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA)에 용해시켜, 세포증식 분석을 위해 96-well에 0.5×103 cells/ml이 되도록 희석하여 세포를 분주한 후, etoposide 농도 0.2-10μM로 3일 동안 배양하 다. 50μl의 MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] (Sigma, St. Louis, MO)를 첨가하고 4시간 반응시켜 formazan을 형성시킨 후, 상등액을 제거하고 DMSO 100μl/well을 가한다. Formazan을 녹인 다음 ELISA reader를 이용하여 550 nm 파장에서 cell viability를 측정하 다. 대조군의 흡광도에 대한 실험군의 흡광도를 % survival로 환산하여 세포의 증식을 50% 억제할 수 있는 농도 (IC50 value)를 기준으로 산출하 다.

2. Propidium iodide (PI) 염색 및 형광 현미경 관찰

Cover glass가 포함된 6 well plate에 2×105 cell/ml로 분주하여 배양 후 24시간에 zVAD-fmk (BD, San Diego) 100μM, 3-methyladenine (3-MA, Sigma, St. Louis, MO) 5 mM, 또는 Bafilomycin A1 (Upstate, Lake Placid, NY)

10 nM이 포함된 배지와 각각의 약물이 포함되지 않은 배지에 IC50에 해당하는 2μM의 etoposide를 처리하여 배양하 다. 3일 후 배지에 Propidium Iodide (PI) (Sigma) 2μM을 첨가하여 IX70w fluorescence microscope (Olym-pus, Tokyo, Japan)에서 관찰하 다. 또한, floating cell을 포함하는 모든 세포를 수거하여, PI 염색 후 핵의 모양에 의해 viability를 평가하 다. 간단하게 설명하면 상온에서 5분간 1μM PI로 염색 후 AX70 fluorescence micro-scope (Olympus) 하에서 관찰하 다.

3. DNA fragmentation assay

100 mm dish에 2×105 cell/ml로 세포를 분주한 뒤 24시간 후 etoposide를 처리하 다. 약제처리 24, 48, 72시간 후 700μl 용해 완충액 (500 mM Tris, 100 mM EDTA, 0.5% SDS와 17.5μl proteinase K (Roche, Indianapolis, IN) (20 mg/ml)로 첨가한 후 phenol 용액 700μl를 첨가하여 12,000 rpm에서 7분간 원심분리하 다. 상층액을 수거하여 3 M NaOAc (pH 7.0)을 첨가하고 -20oC에서 2시간 후 12,000 rpm에서 10분 원심분리하여 상층액을 제거하다. 70% ethanol로 세척하여 건조시키고 100μl TE

buffer에 RNase A를 넣고 pellet을 녹 다. 추출한 DNA를 정량하여 3μg을 1.0% agarose gell에서 전기 동 후 UV 하에서 DNA ladder를 관찰하 다.

4. 유세포(Flow cytometry)에 의한 세포 주기 분석

Etoposide 처리 24시간 후에 세포를 수거, 원심분리하여 상등액을 분리해 버렸다. 차가운 90% ethanol을 떨어뜨려 고정시키고 4oC에서 2시간 보관하 다. 원심분리 한 뒤 남은 pallet에 500μl washing buffer [RNase A (Sigma), 10 mg/ml]를 넣고, 30분 후 500μl PI를 넣어 mesh filter로 균일하게 세포를 수거하여 FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA)를 사용하여 세포 주기를 분석하 다.

5. Western blot analysis

자가포식현상을 유도하기 위해 U87세포에 Temozolo-mide (TMZ, Schering, Kenilworth, NJ)를 처리하여 대조군으로 사용하 다. CaSki 세포에 약물을 처리한 후 세포를 수거하여 용해액[1 M Tris (pH 7.5), 5 M NaCl, 0.5 M EDTA (pH 8.0), 1% Triton X-100, 50xPI, 100 mM

부인종양 제17권 3호 동서연 외

190

PMSF, 1 M DTT, 100 mM NaF, 100 mM NA3VO4]으로 세포를 용해시켜 단백질을 추출하여 정량하 다. 8%, 12%, 15% SDS-PAGE를 시행한 후 ECL nitrocellulose membrane (Amersham Bioscience)에 100V의 전압으로 60-90분간 옮겼다. 전사된 membrane은 blocking solution (5% skimmed milk in 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 125 mM NaCl, 0.1% Tween 20)으로 2시간 blocking 한 뒤, 1차 항체는 24시간, 4oC에서 반응시키고, 2차 항체는 1xTBS-T로 3번 세척 후 45분 동안 37oC에서 반응시켰다. 사용한 항체는 다음과 같다. p53 (1：200, Novocastra Lab, Newcastle upon Tyne, UK), p21 (1：500, Calbiochem, La Jolla, CA), Bcl-2 (1：500, Santa Cruz, CA), Bax (1：300, BD Bioscience, San Diego, CA), Cytochrom C (1：500, Santa Cruz, CA), caspase-3 (1：800, Upstate Biotechnolo-gy, Lake Placid, NY), caspase-9 (1：1,000, Upstate Bio-technology, Lake Placid, NY), Fas (1：500, Santa Cruz, CA), caspase-8 (1：800, BD Bioscience, San Diego, CA), β-actin (1：2,000, Sigma, Steinheim, Germany), beclin 1 (1：500, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), APG-5 (1：500, Santa Cruz, CA), APG 12 (1：300, Santa Cruz, CA), VDAC (1：1,000, Sigma, Steinheim, Germany), peroxidase-conjugated mouse (1：2,000), rabbit (1：5,000), goat (1：10,000) anti-IgG (Santa Cruz, CA).

6. Lysotracker probe를 사용하여 용해소체 확인

CaSki와 U87세포를 6-well에 3-MA (5 mM), zVAD-fmk (100μM), 3-MA와 zVAD-fmk가 모두 포함된 배지에 24시간 배양 후 etoposide (2μM) 또는 TMZ (500μM)을 첨가하여 48시간 동안 추가로 배양하 다. 각각에 50 nM LysoTracker Red DND-99를 첨가하여 37oC에서 1시간 동안 배양하고, 핵은 DAPI (4',6'-diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)(Sigma)로 대조 염색을 하여 AX70 fluo-rescence microscope (Olympus)하에서 관찰하 다.

7. 전자 현미경(electron microscopy; EM)

CaSki 세포의 사멸을 형태학적으로 분석하기 위해 EM을 시행하 다. zVAD-fmk 또는 3-MA가 포함된 배지에 etoposide로 처리한 세포를 72시간 동안 배양 후 수거하여 2% paraformaldehyde/ 2.5% glutaraldehyde로 1시간 동안 고정하 다. 이를 osmium tetroxide (OsO4)로 후고

정하 다. 세포를 탈수한 후 60-70 nm로 절단하여 uranyl acetate/lead citrate (Fluka)로 염색하여 JEM-1200EX (JEOL, Akishima, Tokyo, Japan) 전자 현미경으로 관찰하 다.

8. 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)

자가포식현상의 활성화를 나타내는 MAP1LC3 (mi-crotubule-associated protein 1 light chain 3, or shortly LC3)를13 확인하고자 semiquantitative RT-PCR을 시행하 다. TRIzol (Invitrogen, Life Technologies) 용액을 이용하여 배양된 세포에서 RNA를 분리하 다. 분리된 RNA를 TitanTM One Tube RT-PCR system (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)을 이용하여 hLC3-5 (5'-ATGCCGT-CGGAGAAGACCTT-3')과 hLC3-3 (5'-TTACACTGACA-ATTTCATCCCG-3') primer로 역전사 중합반응을 시행하여 유전자의 발현 양상을 확인하 다. GAPDH는 사용한 총 RNA양에 대한 정상 대조군으로 사용하 다. 실험 조건은 cDNA는 95oC에서 30초 변성(denaturation), 55oC에서 30초 결합(annealing), 70oC에서 1분간 신장(extension)을 25회 반복시켰다. PCR산물은 2% agarose gel에서 전기 동하여 ethidium bromide (EtBr) 염색 후 UV 하에서 관찰하 다.

결 과

1. Etoposide에 의한 세포 성장 억제와 apoptosis 유도

CaSki 세포에 etoposide를 농도별로 투여하여 3일 배양 후 세포 성장을 관찰하여 etoposide의 농도와 시간에 의존적으로 세포 성장이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 세포에 대한 약제의 독성 결과는 IC50 값으로 표시하는데, CaSki 세포에 대한 etoposide의 IC50 값은 2μM의 농도에서 나타났다. 세포의 형태적 변화를 관찰하기 위해 Etoposide를 처리한 후 0, 24, 48, 72시간 후 세포의 형태학적 변화를 관찰하 다. CaSki 세포는 약제처리 후 시간 의존적으로 apoptotic body, chromatic condensation, chromatin fragmentation이 2.6배, 10배, 24배로 시간 의존적으로 증가하는 양상을 보 다(Fig. 1A). Apoptosis에 의한 DNA 분절을 확인하기 위해 약제 처리 후 0, 24, 48, 72시간에 DNA ladder를 확인한 결과, 24, 48, 72시간에 ladder가 관찰되었다(Fig. 1B). CaSki 세포에서 etoposide 처리가 세포의 성장과 분화

자궁경부암 세포주에서 etoposide 항암치료에 의한 세포사멸 기전

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에 향을 주는지 알아보기 위해 flow cytometry로 세포 주기를 시간별로 분석한 결과, apoptosis를 의미하는 sub-G1시기는 0.82%에서 24시간에는 1.85%, 48시간에는 2.11%, 72시간에는 3.69%로 4.5배 증가하 다(p＜0.05). G1기는 시간에 따라 감소하 고, G2/M기는 72시간 후 2.2배 증가하 다(p＜0.05)(Fig. 1C). CaSki 세포에서 etoposide에 의해 유도되는 세포 사멸 기전을 확인하기 위해 Western blot을 실시하 다. HPV- 16을 갖고 있는 CaSki 세포에서 etoposide에 의해 Rb 단백은 비활성화 Rb 단백질(hypophosphorylation form)이 증가되는 것을 확인하 고, HPV-16 E6와 반응하여 소멸

되는 p53 단백이 약제 투여 후 증가하는 것이 관찰되었다. 세포막 연관 세포사멸(membrane-related apoptosis)기전과 관련되는 Fas, caspase-8, caspase-3을 확인하 다. Fas 단백은 대조군에 비해 증가하 고, caspase-8은 pre-cursor form은 0.5배 감소, cleavage form은 증가하여 발현됨을 확안하 고, caspase-3 역시 cleavage form이 증가함을 관찰하 다. 또한, 미토콘드리아 연관 세포사멸(mito-chondria-related apoptosis)기전을 확인하기 위해 bcl-2, bax, cytochrome c, caspase-9의 단백질 발현 변화를 확인하 다. Anti-apoptosis인 bcl-2 단백은 20배 감소하 고, pro-apoptosis인 bax 단백은 2.5배 증가하 다. 미토콘드

Fig. 1. Effects of etoposide on cell proliferation in CaSki cells. (A) Nuclear morphology of PI stained cells was examined by fluorescence microscopy (×400,arrows: apoptotic bodies and nuclear chromatin condensa-tion). (B) Analysis of molecular weight DNA fragments and in -ternucleosomal DNA cleavage. Time-dependent effect of etopo-side on DNA fragmentation as-say. (C) Cell cycle progression of CaSki cells treated with eto -poside.

A B

30

% a

popto

tic c

ells

Time (hr)

60

50

40

30

20

10

% o

f cells

0

24 h 48 h 72 h0 h

25

20

15

10

5

00 24 48 72

Sub G1 G1 S G2/M

400

0 h 24 h

48 h 72 h

C

24 h0 h

72 h48 h

부인종양 제17권 3호 동서연 외

192

리아 막간 공간에서 세포질로 이행되는 cytochrome c 단백의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 하위 단계인 caspase-9 단백은 precusor가 1.5배 감소되고, clea-vage form이 강하게 발현됨을 확인하 다. 각각 단백질 양이 동량임을 β-actin으로 보여 주었다(Fig. 2). 이로서 etoposide를 투여한 CaSki 세포에서 apoptosis에 의한 세포사멸이 발생하는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나, FACS 분석결과 apoptosis에 해당하는 sub-G1이 72시간에도 3.69% 정도로 관찰되고, 형태학적으로도 apoptosis를 의미하는 apoptotic body와 chromatin condensation이 25.3%에서만 관찰되어 apoptosis이외의 다른 세포사멸 기전이 일어남을 추측할 수 있었다.

2. Etoposide에 의한 자가포식현상에 의한 세포사멸

(autophagic cell death)

1) Etoposide에 의한 용해소체 및 자가포식용해소체의 발현

자가포식작용에서는 자가포식용해소체를 형성하기 위해 용해소체의 발현이 필수적이다. CaSki 세포에서

etoposide에 의해 자가포식 작용이 일어나는지를 확인하기 위해 LysoTracker probe를 사용하여 TMZ을 처리한 U87세포와 Etoposide를 투여한 CaSki 세포에 용해소체를 염색하여 형광현미경으로 관찰하 다. 그 결과 U87세포에서 발현되는 것과 같은 양상으로 CaSki 세포에서도 용해소체의 발현을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). 또한 약제에 의한 세포의 구조적 변화를 확인하기 위해 전자

현미경을 이용하여 관찰하 다. Fig. 3에서 보이는 것처럼 Etoposide를 처리한 CaSki cell에서는 자가포식용해소체와 자가용해소체(autolysosome)가 세포질에서 발현됨을 관찰할 수 있었다. 반면, DMSO만 처리한 대조군에서는 이런 특징이 관찰되지 않았다(Fig. 3B). 그러나 apo-ptosis 동안 관찰되는 핵의 응축(condensation)도 동시에 관찰되어 apoptosis와 autophagic cell death가 동시에 일어남을 형태학적으로 확인할 수 있었다.

2) 자가포식현상에 의한 세포사멸(autophagic cell death) 확인

Etoposide를 처리한 세포에서 자가포식현상의 발현을

β actin-

HyperphosphorylationHypophosphorylation

-

-

p21

p53

Rb

- +

EtoposideA

β actin-

Precursor form(55 kDa)

Caspase 8-

Fas

- +

EtoposideB

Caspase-3

Cleavage form(41 kDa)Precursor form(47 kDa)

Cleavage form(17 kDa)

β actin-

Precursor form(47 kDa)

Cytochrome c

Bax

Bcl 2-

- +

EtoposideC

Caspase 9-Cleavage form(37 kDa)

Fig. 2. Regulation of apoptosis-related proteins in etoposide-treated CaSki cells. W estern blot of cellular protein extracted in CaSki cells for 72 hours after treated with etoposide. (A) Rb, p53, and p21. Arrows: two forms of pRb were shown by hyperphosphorylated form (120 kDa) and hypo-phosphorylated form (115 kDa). (B) Fas, caspase-8and caspase-3 protein. Arrows: the forms of caspase-8, -3 were shown by precursor form (55 kDa, 47 kDa) and cleavage form (33 kDa, 17 kDa). (C) Bcl-2, released cytochrome C and caspase-9. Arrows: two forms of caspase-9 were shown by precursor form (47 kDa) and cleavage form (37 kDa). β-actin levels are loading control.

자궁경부암 세포주에서 etoposide 항암치료에 의한 세포사멸 기전

193

보기위해 beclin 1, APG5, APG12, p53에 대한 Western blot analysis를 시행하 다. Beclin 1은 자가포식현상에 중요한 작용을 하는 class III PI3 kinase complex의 부분으로 APG 단백을 조절하는 작용을 한다.13,20 APG5 단백은 APG12와 함께 자가포식소체의 형성에 중요한 역할을 한다.19 Etoposide를 투여한 CaSki 세포에서 DMSO를 처리한 세포에 비해 beclin 1, APG5, APG12가 각각 17배

이상, 3배, 5배 증가함을 관찰할 수 있었다(p＜0.05). 또한 etoposide를 투여한 후 시간에 비례하여 beclin 1과 p53의 발현이 증가함을 볼 수 있었다. 자가포식소체막과 관련된 LC3 mRNA의 발현 역시 etoposide 투여 72시간 후 대조군에 비해 2.5배 증가함을 관찰할 수 있었다(p＜0.01)(Fig. 4). 이러한 결과를 통해 etoposide 투여에 의해 자가포식현상이 발생함을 확인할 수 있었다.

Fig. 3A. Etoposide-induced autophagy triggers cytoplasmic formation of the lysosomal subcellular structure. Thelysosome was detected by LysoTracker probe. Nuclear morphology was stained with DAPI. TMZ; temozolomide. (×400).

DM

SO

CaSki

DAPI LysoTracker Overlay

Eto

posid

eD

MS

OTM

Z

U87

A

부인종양 제17권 3호 동서연 외

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3) Apoptosis 억제 후 etoposide 투여 시 자궁경부암 세포의 변화

자가포식현상이 세포 사멸에 관여한다는 것을 증명하기 위해 pan-caspase inhibitor인 zVAD-fmk 2μM을 처리한 후 etoposide를 투여하 다. 형광현미경 하에서 시간경과에 따라 세포를 관찰하 다. 세포 사멸 후 핵에 염색되는 PI 염샘을 이용하여 관찰한 결과 시간이 지남에 따라 PI 양성 세포가 증가함을 관찰할 수 있었다. LysoTraker Red DND-99와 DAPI를 이용해 세포를 염색한 후 관찰한 결과 핵은 변화가 없이 세포질에 용해소체

가 붉은색으로 관찰되었다. 이 상의 결과로 볼 때 eto-poside를 투여한 CaSki 세포에서 apoptosis가 억제되어도 자가포식현상에 의해 세포사멸이 유도됨을 관찰하 다

(Fig. 5A).

4) 자가포식현상 억제 후 etoposide 투여 시 자궁경부암 세포의 변화

자가포식현상이 억제된 후에도 etoposide에 의한 세포 사멸이 일어나는지 관찰하기 위해 Phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) 억제제인 3-MA13,19,20 5 mM과 자가포식소

Fig. 3B. Morphology of the autophagosomal/autolysosomal compartment during etoposide-induced apoptosis. CaSkicells were examined using transmission electron microscopy. (a) Nuclear and mitochondrial morphologies were normal in control cells treated with DMSO (×7,500). (b) Etoposide treatment showed chromatin condensation andautophagocytic granules in CaSki cells (×7,500, arrowheads, chromatin). (c, f, g) Autophagosome/lysosome showingmembrane-wrapped organelles (×20,000, m; mitochondria, N; nuclei). (d, e) Morphology of various types of autophagic vacuoles (d) (×7,500) (e, g) Close-up of autophagosome/autolysosome with extensively degraded organelles. (×18,000, m; mitochondria, N; nuclei, arrows; autophagosome/autolysosome, arrowhead; late auto -phagosome).

a b c

f

ged

DMSO EtoposideB

자궁경부암 세포주에서 etoposide 항암치료에 의한 세포사멸 기전

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체와 용해소체의 결합을 억제하는 bafilomycin A113,20 10 nM를 각각 투여한 후 etoposide를 처리하여 CaSki 세포의 변화를 확인하 다. 3-MA를 투여한 경우 etoposide만

투여한 군에 비해 살아있는 세포수가 38%에서 73%로 증가하 고, bafilomycin A1을 투여한 경우 역시 38%에서 49%로 세포 생존이 증가하 다(p＜0.05). 형태학적으

Fig. 5. (A) Loss of viablility and induction autophagy in CaSki cells treated with etoposide. Inhibition of etoposide-induced cell death by zVAD-fmk for 0 h, 24 h, 48 h, and 72 h. Control (closed circles), DMSO (open circles), and CaSki cells were treated with 2μM etoposide in the presence (closed triangles) or absence (open triangles) of 100μM zVAD-fmk. Data are shown as mean±S.D. (n=4). (B) Inhibition of etoposide-induced cell death by 3-MAor Bafilomycin A1 for 0 h, 24 h, 48 h, and 72 h. Control (closed circles), DMSO (open circles), and CaSki cells weretreated with 2μM etoposide in the presence (closed triangles) or absence (open triangles) of 5 mM 3-MA. The presence of Bafilomycin A1 is shown by closed squares. Data are shown as mean±S.D. (n=4).

Fig. 4. Enhancement of autophagy in etoposide-treated CaSki cells during apoptosis. (A) Expression levels of Beclin1, APG 5, APG 12, and VDAC (loading control) were analyzed by W estern blot analysis. (B) Expression levels ofBeclin 1, p53, VDAC (loading control), and β-actin (loading control) were analyzed by W estern blot analysis. (C) Involvement of LC3 in ET-induced autophagy. Semi-quantitative RT-PCR analysis of LC3 mRNA in CaSki cells. DMSO,cells treated with DMSO, ET; cells treated with etoposide (2μM) for 72 h, TMZ; cells treated with TMZ (500μM) for72 h. TMZ was used as a positive control to induce autophagy. GAPDH was used as the loading control.

61 kDa Beclin 1

32 kDa APG 5

22 kDa APG 12

31 kDa VDAC

DMSO ET DMSO TMZ

CaSki U87A

61 kDa Beclin 1

31 kDa VDAC

53 kDa p53

48 kDa β-actin

0 24 48 72

EtoposideB

500 bp GAPDH

DMSO ET DMSO TMZ

CaSkiC U87

LC3227 bp

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196

로도 3-MA를 선처치한 경우 용해소체가 감소하는 것이 관찰되었다(Fig. 5B). 이 결과 CaSki 세포에 etoposide를 투여하면 apoptosis 뿐 아니라 자가포식현상도 동시에 발생함을 관찰할 수 있었다.

5) 3-MA와 zVAD-fmk 동시 투여로 etoposide에 의한 세포사멸 억제효과

3-MA와 zVAD-fmk를 동시에 처리한 CaSki 세포는 etoposide를 투여하여도 대조군과 같은 정도의 beclin 1 감소를 나타낸다(Fig. 6A). Fig. 6B를 보면 etoposide와 3-MA와 zVAD-fmk를 동시에 투여한 경우는 etoposide를 투여하지 않은 대조군과 비슷한 정도의 95%의 생존력을 3-MA만 투여한 경우는 65%, zVAD-fmk만 투여한 경우는 58% 정도의 세포가 생존하는 것이 관찰되었다.

고 찰

1972년 Kerr 등27은 세포사멸 기전을 apoptosis와 necrosis 두 가지로 분류하여 기술하 다. 이후 과학분야에서 apoptosis에 대해 많은 연구들이 시행되어 왔으나, 쥐의 배아 및 태아 발생을 관찰하는 과정에서 다른 세포

사멸 기전에 대한 관심이 대두되었고,13 1990년 Clarke28

가 세포사멸의 기전을 형태학적 기준에 의해 4가지로 다시 구분하 다. Type I PCD는 세포의 수축과 핵의 농축, 분절 등을 형성하는 apoptosis 이고, type II PCD는 세포질에 낭포가 형성되어 미토콘드리아나 세포 소기관을

용해소체에 의해 파괴하는 자가포식현상(autophagy= self-eating in Greek)으로 분류하 다. 그 외 type III PCD는 A와 B 두 가지로 나뉘며 낭포를 형성하나 용해소체가 관여하지 않는 세포 파괴 현상으로 분류하 다. 자가포식현상은 생리적 현상으로 세포의 항상성을 유지하기 위해 손상된 세포 소기관을 제거하고 고분자 합

성과 생체에너지로 재사용하는 데 필수적인 과정이

다.13,19,20 또한, 외부적인 환경의 변화, 즉 양분의 고갈, 병원균의 침임 등으로 유도되기도 하며, 조직의 분화, 발달 등에도 관여되고 있다.29,30 가장 관심이 모아지고 있는 것은 종양화와의 관계이다. 이미 apoptosis에 관한 연구를 통해서 밝혀진 것처럼 세포사멸과 종양화는 접한 관련이 있다.13 Liang 등31

은 유방암 세포에서 정상 상피에 비해 beclin 1 발현이 현저히 감소되어 있는데, MCF7 유방암 세포에 beclin 1을 발현시키면 자가포식현상을 유도하여 종양화가 억제

되는 것을 관찰하 다. Beclin 1 유전자가 위치하는 염색체 17q21의 allele loss는 유방암뿐 아니라, 난소암, 전립선암 등에서도 관찰된다.32 이는 beclin 1이 종양억제인자로서 작용할 가능성을 시사한다. 그러나, 종양 말기에는 종양의 안쪽에 있는 암세포에 양분의 고갈로 자가

포식현상이 유도되고 이로 인해 극한상황에도 세포가

생존할 수 있게 된다. 또한 방사선 치료로 인한 손상된 소포체를 자가포식현상으로 제거함으로써 생존에 유리

한 방향으로 작용하기도 한다.24 이런 이유로 종양치료에 의해서도 자가포식현상이 유도될 수 있기 때문에 종

양세포에서 자가포식현상이 관찰된다고 이것이 종양세

포 파괴와 연관이 있는지에 대해서는 논란이 있어 왔다. 본 연구에서는 etoposide에 의한 세포사멸에 apoptosis뿐

Fig. 6. Etoposide-treated CaSki cells were rescued by a combination of 3-MA and zVAD-fmk. At 24 h after respective exposure to 3-MA (5 mM), Bafilomycin A1 (10 nM), zVAD-fmk (100μM), and a combination of 3-MAand zVAD-fmk, etoposide (2μM) was added and cul-tured for additional 48 h. (A) Expression levels of Beclin-1 and VDAC (loading control) were analyzed byW estern blot analysis. (B) Cell viability was measured by PI staining. The viability of the untreated cells was regarded to be 100%. Data are shown as mean±S.D.(n=5).

DMSOEtoposide

3 MA-zVAD fmk-

Ba A1

31 kDa

Beclin 1

VDAC

61 kDa

- + + + + + +- - + + + + +- - - + - - +- - - - + - +- - - - - + -

A

B 100

80

60

40

20PI

negative c

ell (

%)

-

Etoposide

0Con DMSO (-) 3 MA- zVAD Ba A1 3 MA

+zVAD-

자궁경부암 세포주에서 etoposide 항암치료에 의한 세포사멸 기전

197

아니라 자가포식현상이 관여한다는 것을 실험적으로 증

명하 으며, apoptosis보다 자가포식현상에 의한 세포사멸 현상이 오히려 더 크게 작용한다는 것을 3-MA와 zVAD-fmk를 사용하여 증명하 다. 또한, 자궁경부암 세포에서 etoposide에 의해 자가포식현상이 발생함을 처음으로 증명하 다. 그러나, apoptosis와 자가포식현상이 서로 공유되어 나타나는 부분과 상호작용 및 조절 기전

들에 대해서는 연구되어야 할 부분이 많이 남아있다.32 Murine embryonic fibroblasts (MEFs)에서 apoptosis를 유도하는 BAX, BAK 단백에 이상이 있으면 apoptosis는 억제되는 반면 자가포식에 의한 세포사멸은 촉진되며,19 HeLa 세포에서 자가포식 억제를 위해 3-MA를 투여하거나, siRNA를 이용한 경우 apoptosis가 유도된다는 보고도 있다.33 이처럼 종양분야에서 자가포식현상의 의미에 대해서는 여전히 해결되지 않은 문제들이 많으며 그만큼 많은

연구들이 시행되어 계속 보고되고 있다. 동물 모델에서는 자가포식현상이 결핍되면 종양이 유발되고, 항암 치료에 의해서는 여러 세포에서 apoptosis 대신에 자가포식 세포 사멸이 일어나는 것이 관찰된다.32 이것은 종양의 진행 단계에 따라 자가포식현상이 다른 향을 보인다

는 것을 의미한다. 본 연구에서도 항암제 투여로 자가포식현상이 유도되었고 이를 억제하면 세포의 사멸이 억

제되는 것이 관찰되었다. 그러나, 아직까지 여러 연구에서는 자가포식현상이 종양 억제인자로서 작용하는지 아

니면 항암 치료에 대한 세포 보호작용으로 활성화 되는

지에 관해서는 논란이 있다. 만약 자가포식현상으로 세포의 성장이 억제된다면 이를 치료적으로 이용할 수 있

을 것이고, 항암치료에 대한 세포 보호작용으로 자가포식현상이 일어난다면 이를 siRNA 등으로 억제하여 항암효과의 증진을 기대할 수 있을 것이다. 이런 이유로 자가포식현상에 대한 연구는 종양치료의 역을 넓히기

위해 지속적으로 연구가 필요한 분야로 생각되며, 이를 통해 향후 항암치료에 대한 새로운 접근 방법을 제시할

수 있을 것으로 생각된다.

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자궁경부암 세포주에서 etoposide 항암치료에 의한 세포사멸 기전

199

The mechanism of cell death in etoposide treated cervical cancer cells:

apoptotic and non-apoptotic programmed cell death

Seo-Yun Tong, Seung-Baek Lee, Jung-Jin Kim, Jong-Sup Park

Division of Gynecologic Oncology, Department of Obstetrics and Gynecology,

College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea

Objective：Etoposide is a potent and widely used antineoplastic agent. It is able to induce apoptosis in most cell types. However,

very little is known about its mechanism of action. In this study, we demonstrate the cytotoxic signal that induced by etoposide

and investigate how etoposide exerts antitumor activity in HPV-16 (+) CaSki cervical carcinoma cells.

Methods：Antiproliferation activity was measured in CaSki cell lines by using MTT assays, DNA fragmentation assay. Cell cycle

distribution was analyzed using flow cytometry. Expression of proteins involved in the apoptotic pathway was analyzed by Western

blotting (WB). Electron microscopic (EM) and biochemical studies (Western blotting, RT-PCR) revealed that non-apoptotic death

was associated with autophagosomes/-autolysosomes. These parameters have also been measured in cells treated with

3-methyladenine (an autophagy inhibitor), zVAD-fmk (a pan-caspase inhibitor) and both.

Results：The etoposide induced apoptosis. In cell cycle analysis, etoposide-treated CaSki cells were few induced hypodiploid

DNA content, suggesting that apoptotic cell death. EM study revealed that autophagic appearance in the presence of etoposide

exhibited by autophagosomes/autolysosomes. It was confirmed by LysoTracker probe and WB against Beclin 1, APG 5, APG 12

and p53. When autophagy was blocked by 3-MA, not only the protein expression of Beclin 1, but also the antitumor effect of

etoposide was suppressed. On the other hand, the addition of zVAD-fmk could induce a few etoposide-induced autophagy. And

etoposide-treated CaSki cells were rescued by combination of 3-MA and zVAD-fmk.

Conclusion：Our results suggest that etoposide not only initiated apoptosis but ultimately caused cell death through autophagy.

In this study, we demonstrate novel features for the action of etoposide in HPV-16 (+) CaSki cervical carcinoma cells. Autophagic

cell death induction by some anticancer agents underlines the potential utility of its induction as a new cancer treatment modality.

Key Words : Etoposide, CaSki cell, Autophagy, Apoptosis