VO TRANSLATIONSKONTROLLE

VO TRANSLATIONSKONTROLLEVO TRANSLATIONSKONTROLLEHelmut Dolznig, Teil 2

1 Signaltransduktion zur Translation

2 Translationskontrolle und Krebs

Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008

Helmut DolznigInst für Medizinische GenetikMedUniWien, Waehringer Srasse 10Tel 4277 67502 | email [email protected]

Translation and Cancer

Definitionen: Growth / Protein Synthesis Division / Cell Cycle

Erinnerung: Upstream Signalling to Translation

Transformation

PI3K, PKB/Akt

mTORmTOR

eIF4E

Andere Translationsfaktoren

Klinische Studien

Zusammenfassung

Literatur


Growth versus Proliferation

Normaler ZellzyklusGrowth, Mass Increase

Proliferation Cell di ision

Maintain cell sizeGrowth and division

Proliferation, Cell division

Growth, Mass Increase

Growth:Massenzunahme / ZeitProtein / Makromolekülzunahme: en Makromolekülzunahme: =mehr Synthese als AbbauKonzentration von Proteinen/ M

ass

e/Vo

lum

e

o e e / Makromolekülzunahme pro Volumen ändert sich nichtVolumszunahme =

M

Zeit


Massenzunahme = GrowthLangzeitproliferation braucht Massenzunahme

Growth = Prerequisite for Sustained Proliferation

ansonsten:

N M INo Mass Increase/

Volu

men

Mas

se

Zeit

St ti G öß d kti d Z ll b i j d T ilStetige Größenreduktion der Zellen bei jeder Teilung

->Proteinsynthese notwendig in Krebszellen


Cell Cycle

G1S Replikation

Synthese PhaseGap 1

G2M

Gap 2

MitMitose


Restriction Point

Nature Reviews Cancer1 (2001), 222-31


G1/S Transition



Growth <-> Division



Transformation

Transformation: Zellen - immortal- anchorage independent proliferation (soft agar assays)

keine Kontaktinhibierung- keine Kontaktinhibierung- erzeugen Tumoren in Tieren

Expression von proto-Oncogenen und Tumor Suppressor Genen auf verschiedenen Ebenen reguliert

Teil: Translation

transformierte Zellen: mehr Proteinsynthese

Cause or Consequence?

????

Ist Veränderung von Translationskomponenten ausreichend für Transformation ?

Translationskontrolle stark verbunden mit


Signaltransduktion, Expression von Oncogenen, Tumorsuppressorgenen

Upstream Signalling of Translation: Key Players

PKBAkt

PI3K

P

mTOR

S6K 4E-BPS6K 4E BP

T l ti


Translation

PI3K-AktPI3K Akt


PI3K-Akt

PTEN

PI3K

PKBAkt

P

PI3KPP


PI3K-Akt

PKBAktPP

mTOR

P

PI3K

P

in Zellkultur und Tiermodellen:

S6KPPPP 4E-BPPP PI3K Onkogen

Akt/PKB OnkogenPTEN Tumorsuppressorgen

in humanen Tumoren:

PI3K aktivierende Mutationen, Amplifikationen

Akt aktivierende MutationenAmplifikationenmRNA Überexpressionp

PTEN LOHMutationenPromotor Methylierung


Promotor Methylierung

PI3K-Akt

PKBAktPP

mTOR

P

PI3K

P

S6KPPPP 4E-BPPP

PI3K p110

Hotspot Mutationen: erhöhen Kinase Aktivität


PI3K-Akt

PKBAktPP

mTOR

P

PI3K

P

S6KPPPP 4E-BPPP


PI3K-Akt


PI3K-Akt


Different Inhibitors of RTK-PI3K-Akt-mTOR axis


PI3K-Akt-mTOR axis inhibitors


mTORmTOR


mTOR signalling

PKBAktFKBP12 Akt

P

P

Rapamycin

S6KP

PPP

mTORC1 Tsc1Tsc2 P

RHEB

4E-BPPP

Rib biRibosomenbiogenese

verbesserte Translation vonmRNAs mit regulatorischen Elementen in 5’UTR


z. B. Cyclin D1, E ...

Rapamycin, CCI-779

i i idRapamycin: Fungizidisoliert aus Streptomyces hygroscopicus- antimicrobiell- immunosuppressivimmunosuppressiv- antiproliferativ, antitumor

wurde erst als Immunosuppressant bei Organtransplantationen verwendet um ll ft Ab t ß idallografte Abstoßung zu vermeiden

schlechte pharmakologische Eigenschaften: - bedingt wasserlöslich- schlechte chemische Stabilitätschlechte chemische Stabilität

Rapamycin-Esther: gut wasserlöslich, stabiler: CCI-779 (Wyeth, USA)

P äkli i h St di T lli i P t t B t SCL k i Präklinische Studien: Tumorzellinien: Prostata-, Brust-, SCLungenkarzinom, Gliobalastom, Melanom, T-Zell Leukämien

Humane Xenografts: erfolgreich, Tumorwachstum gestopptHumane Xenografts: erfolgreich, Tumorwachstum gestoppt

Phase I Studien beendet: Ziel: maximal tolerierbare DosisNebeneffekte: Haut

Hä t i Th b t i


Hämatopoiese: Thrombocytopenie

Rapamycin (Sirolimus, Rapamune), CCI-779

Tumoren: Renal Cell Carcinoma (häufigster Nierenkrebs) FDA approvedN ll L C iNon small Lung Carcinoma Regression,

Brustkrebs, Weichteilsarcom, Squamous SkinCarcinoma, , , q ,NH-Lymphoma wenig Effekte

Phase II PTEN, Akt Phosphorylierungsstatus erhobenp y g

ProstatacarcinomaBrustkrebs wenig Effekte wenig Effekte

Phase III Brustkrebs: Kombinationstherapie(CCI779+aromatase inhibitor)


( )

Possible mechanism

nC

1 in

hibi

tion

cont

rol

mTO

RC

Rapamycin


eIF4EeIF4E


Erinnerung: eIF4E Aktivierung

PKBAktPP

mTOR

P

PI3K

P

AS, Insulin, WF

S6KPPPPK

4E-BPPP

40SeIF3

eIF4APABP

4EBPP P

P

AS, Insulin, WF

4EBP

eIF4E eIF4E

eIF4GeIF4A

eIF4E

4EBP

Mnk-1P

Initiationskomplex

4EBP

P 2 Aufgaben: - Disssoziation von 4E


- Verhinderung der Wiederbindung

eIF4E

PKBAktPP

mTOR

P

PI3K

P

4E ist rate limiting -> Kompetition von verschiedenen mRNAs um Translationsinitiation

S6KPPPPK

4E-BPPP

a.) mRNAs mit unstrukturierten, kurzen UTRs (alle House Keeping genes), leichte Bindung und Scanning durch Präinitiationskomplex, präferentiell translatiert(strong RNAs)

b.) lange, strukturierte 5’UTRs, schlechte Cap dependent Translationenthalten oft IRESs (v.a. proto-Onkogene)(weak RNAs)

wenn mehr eIF4E vorhanden ist: überproportional bessere Translation von langen5’UTR messages verglichen mit kurzen: wenig Effekt

-> Anreicherung von Proteinen, die von komplizierten, sekundärstrukturreichen mRNAs codiert werden im Vergleich zur Masse an Transkripten

IF4E i


eIF4E overexpression-> Synthese von c-Myc, cyclin D1, RNR2, ODC, FGF-2, und VEGF angedreht

eIF4E

PKBAktPP

mTOR

P

PI3K

P

S6KPPPPK

4E-BPPP

Abhängigkeit der Translation vonAbhängigkeit der Translation von starken und schwachen mRNAs durch eIF4E levels

Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008eIF4E expression in tumors: its possible role in progression of malignancies. Arrigo De Benedetti a, *, Adrian L. Harris b

Induzierbares eIF4E in CHO Zellen

Expression von 4E in COS Zellen -> uninduziert: 7x, induziert: 20x 30-50%mehr Proteinsynthese, bestimmte Proteine stärker synthetisiert (Pfeile)Vermutung: translational repressed genes (weak mRNAs, Repression aufgehoben durch mehr 4E)


eIF4E expression in tumors: its possible role in progression of malignancies. Arrigo De Benedetti, Adrian L. Harris

eIF4E

FGF-2: fibroblast growth factor, mitogen und angiogenWundheilung, Tumorvaskularisierung

Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008eIF4E expression in tumors: its possible role in progression of malignancies. Arrigo De Benedetti, Adrian L. Harris

FGF-2 wird auch durch MMTV insertion angedreht

eIF4E

PKBAktPP

mTOR

P

PI3K

P

S6KPPPPK

4E-BPPP


Translational control: the cancer connectionMichael J. Clemens , Ulrich-Axel BommerThe International Journal of Biochemistry & Cell Biology 31 (1999)

eIF4E

PKBAktPP

mTOR

P

PI3K

P

S6KPPPPK

4E-BPPP


Translational control: the cancer connectionMichael J. Clemens , Ulrich-Axel BommerThe International Journal of Biochemistry & Cell Biology 31 (1999)

eIF4E ist ein Onkogen

Transformationsassays

- anchorage

- keine Kontaktinhibierung

eIF4E

NIH3T3

gindependentproliferation(soft agar assays)

fibroblastsCHOREF

- erzeugenTumoren in Mäusen

4E verstärkt Transformation mitv-mycE1AE1AMax

Knock down von 4E durch antisense hemmt oncogene/metastatische


eIF4E ist ein Onkogen

Knock down von 4E durch antisense hemmt oncogene/metastatische Eigenschaften von ras transformierten REFs

eIF4E in Tumoren

Überexpression in Blasen-, Head/Neck-, Colon- und Brustkarzinomen

Hypothese:

bessere Translation von mRNAs mit langen 5’UTR, komplexen Sekundärstruktureng , p

Brustkrebs:

4E expression könnte als Tumormarker, Prognostischer Indikator genutzt werdenÜberexpression meist transkriptionell, oder durch Genamplifikation

4E antisense in human breast cancer cell line: angiogene und tumorigene Eigenschaften vermindert

Head and neck squamous carcinomas (HNSC):Head and neck squamous carcinomas (HNSC):

Grenze Tumor / Normalgewebe schwer zu erkennen, 4E expression hilft


eIF4E

Apoptose:

4E Expression reduziert Apoptose in serum arretierten Zellen bzw in Myc-überexprimierenden Zellen

4E antisense: mehr Apoptose bei Starvation oder Bleomycin Behandlung


Summary Initiation Factors + Cancer


Translation initiation and its deregulation during tumorigenesis, Watkins and Norbury, BJCancer 86 (2002), 1023-27

Zusammenfassung

Wachstum (growth) ist nicht gleich Zellteilung (Proliferation, cell division)

Voraussetzung für Zellteilung ist Wachstum, Voraussetzung für Wachstum ist Translation

d.h. ohne Translation keine Zellteilung daher ohne Translation kein Tumordaher Inhibition der Translation sehr interessant für Tumortherapie!!!

PI3K-Akt-mTOR pathway sehr häufig dereguliert in humanen Tumoren PI3K Akt mTOR pathway sehr häufig dereguliert in humanen Tumoren neben Rb und p53 am häufigsten

Aktivierung von Proto-Onkogenen: PI3K Untereinheiten, PKB/Akt Familie durch aktivierende Mutationen, Amplifikationen, Überexpression

Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen: PTEN, TSC1/2 durch LOH, Mutationen, Silencing (Methylierung)

Komponenten der Translationsinitiationsmaschinerie impliziert in Krebs im MenscheneIF2, eIF3, eIF4A, eIF4E, eIF4E (überexprimiert)

eIF4E = Onkogen, transformiert Zellen und Überexpression resultiert in Tumoren im Tiermodell

Transformierende Wirkung wahrscheinlich durch selektiv bessere Translation von „schwachen“ mRNAs(langer stark strukturierter 5‘ UTR, z.B. myc, Cyclin D1, VEGF..)

Sehr viele therapeutische Ansätze um PI3K - PKB/Akt – mTOR pathway bei Krebserkrankungen zu


Sehr viele therapeutische Ansätze um PI3K PKB/Akt mTOR pathway bei Krebserkrankungen zu blocken (präklinische Tests – Phase II Studien)

Literatur

Hildago et al. The rapamycin sensitive signal transduction pathway as a target for cancer therapy. Oncogene 19 (2000), 6680-86

Wyeth Homepage, www.wyeth.com

Watkins and Norbury Translation initiation and its deregulation during tumorigenesis Watkins and Norbury, Translation initiation and its deregulation during tumorigenesis, BJCancer 86 (2002), 1023-27

Arrigo De Benedetti and Adrian L. Harris. eIF4E expression in tumors: its possible role in progression of malignancies., The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 31 (1999)

Malumbres and Barbacid, To cycle or not to cycle: a critical decision in cancer.Nature Reviews Cancer1 (2001), 222-31

Garber, Rapamycin’s resurrection: a new way to target the cancer cell cycle.JNCI, 93 (2001), 1517-19

Averous J, Proud. When translation meets transformation: the mTOR story.Oncogene. 2006 Oct 16;25(48):6423-35.

Mamane Y, Petroulakis E, LeBacquer O, Sonenberg. mTOR, translation initiation and cancer.Oncogene. 2006 Oct 16;25(48):6416-22.

Corradetti MN, Guan KL. Upstream of the mammalian target of rapamycin: do all roads pass through mTOR?Oncogene. 2006 Oct 16;25(48):6347-60.

Crino PB, Nathanson KL, Henske EP. The tuberous sclerosis complex.N Engl J Med. 2006 Sep 28;355(13):1345-56.g p ( )

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Samuels Y, Ericson K. Oncogenic PI3K and its role in cancer.Curr Opin Oncol 2006 Jan;18(1):77-82


Curr Opin Oncol. 2006 Jan;18(1):77-82.

Cully M, You H, Levine AJ, Mak TW. Beyond PTEN mutations: the PI3K pathway as an integrator of multiple inputs during tumorigenesis.Nat Rev Cancer. 2006 Mar;6(3):184-92

eIF4A

2 Isoformen I und II40S

PABP eIF3RNA Helicase

Überexpression in Hepatocarcinomas, Melanoma ZellinieneIF4E

PABP eIF3eIF4G

eIF4A


eIF2

eIF2 PGSK3P

inactive

eIF2 Kinases

HRI, PKR, PERK

eIF2BeIF2eIF2GDPGTP

GTPGDP GTPGDP

eIF2GTP

M t RNA

Translation Initiation

Met-tRNA

Erhöhte Expression von eIF2 in transformierten Zelllinien, NH-Lymphoma,Magen-, Colon- und RektaltumorenMagen , Colon und Rektaltumoren

Überexpression von eIF2bzw. eIF2Mutante (keine P Stelle mehr)-> Transformation

Verlust von eIF2 Kinases: HRI niedrig in epithelialen Ovarialtumoren


Verlust von eIF2 Kinases: HRI niedrig in epithelialen OvarialtumorenPKR fraglich

eIF3

11 Untereinheiten40S

PABP eIF35 UE überexprimiert in manchen Tumoren (Brust, Cervix, Ösophagus, Lunge, Testis, Prostata)

Hypothese: Überexpression einer eIF3 UE-> mehr eIF3 eIF4E

eIF4GeIF4A

PABP eIF3

eIF3 bindet direkt an manche IRESs (Growth advantage?)


eIF4G

2 Isoformen I und II

Ü40S

PABP eIF3Überexpression von I Transformation in NIH3T3 Fibroblasten

Cap dependent und independent Translation erhöht in FM3A ZelleneIF4E

eIF4APABP eIF3

eIF4G

Überexpression gefunden in 30% Non Small cell lung cancers

Hypothese:

Kompetition mit 4EBP um 4E Bindung -> Inhibitorischer Effekt von 4EBP aufgehoben bzw geschwächt

Direkte IRES Bindung

eIF4G mRNA hat selbst IRES, positiver Feedbackloop?


mRNAs with IRES



Translation Initiation

The rate of synthesis of any given protein is determined primarily by the level of translation initiation. In brief, a ternary complex is formed between eIF2, GTP and the initiator methionyl-tRNA (met-tRNAi) hil f 40S ib l b it b d t IF3 l lti b it i iti ti f t tRNAi), while free 40S ribosomal subunits are bound to eIF3, a large, multi-subunit, initiation factor. Free 60S ribosomal units are similarly bound to the monomeric eIF6. Together, eIF3 and eIF6prevent premature association of the 60S and 40S ribosomal subunits. The ternary complex is transferred to eIF3/40S along with eIF1 and eIF1A, to form a 43S pre-initiation complex. eIF3 can

bi d t th IF4F l hi h i i t d ith th RNA th li ki th 40S ib now bind to the eIF4F complex, which is associated with the mRNA, thus linking the 40S ribosome to the mRNA and generating the 48S pre-initiation complex.eIF4F itself consists of three components: eIF4G, eIF4E, and eIF4A. eIF4G binds eIF3 and acts as a scaffold for eIF4E and eIF4A. eIF4E recognises and binds the 5' mRNA cap structure while the RNA d d t ATP IF4A i th ht t i d d t t i th 5' t l t d i dependent ATPase eIF4A is thought to unwind secondary structure in the 5' untranslated region (UTR). eIF4B is an additional factor that may stimulate the eIF4A helicase activity and promote RNA binding. The poly(A) tail of the mRNA interacts with poly(A) binding protein (PABP), which in turn has a binding site on eIF4G allowing the mRNA to circularise. The 48S pre-initiation complex

d t f th RNA 5' d til it t AUG i iti ti d Thi now scans downstream from the mRNA 5' end until it encounters an AUG initiation codon. This process can only occur if the 43S complex has formed in the presence of eIF1 and eIF1A.With the Met-tRNAi positioned at the AUG codon, eIF5 interacts with the pre-initiation complex via EIF2 and eIF3. eIF2-bound GTP is hydrolysed and eIF2-GDP is released. The hydrolysis of a second GTP bo nd to the initiation factor eIF5B is acti ated b the 60S ribosomal s b nit These second GTP bound to the initiation factor eIF5B is activated by the 60S ribosomal subunit. These two successive GTP hydrolysis events, and the simultaneous release of eIF3, are essential for the joining of the 60S subunit. A functional 80S ribosome is consequently formed and peptidyl transfer can now occur.



Regulation of ternary complex formation

Translation InitiationRegulation of ternary complex formationThe protein kinases PKR, HRI and PERK can phosphorylate the alpha subunit of eIF2 and this results in an increased affinity for eIF2B, a guanine nucleotide exchange factor. Normally, eIF2B catalyses the exchange of eIF2-bound GDP with GTP so that a new interaction with met-tRNAi can take place and the ternary complex can re-form Phosphorylated eIF2a sequesters eIF2B can take place and the ternary complex can re-form. Phosphorylated eIF2a sequesters eIF2B, preventing the formation of additional ternary complexes and inhibiting translation initiation. eIF2a has also been shown to be cleaved during apoptotic cell death, rendering eIF2 inactive and consequently disabling the ternary complex.

Regulation of mRNA-bindingmRNA binding to ribosomes is generally the rate limiting step in translation initiation and consequently is a major focus for regulatory pathways. Disruption of the eIF4F complex abolishes the link between the capped mRNA and the ribosomes and drastically inhibits translation the link between the capped mRNA and the ribosomes and drastically inhibits translation. Formation of eIF4F complexes also depends upon the presence of active eIF4E which, while it is the least abundant of the translation initiation factors, is essential for binding the pre-initiation complex to the cap structure. Availability of eIF4E is regulated through the activities of 4E-BP/2/3. These exist in a hypophosphorylated state in quiescent cells and have the capacity to sequester These exist in a hypophosphorylated state in quiescent cells and have the capacity to sequester eIF4E by competing with eIF4G for a common 4E-binding site. This in turn prevents assembly of the eIF4F complex and inhibits translation initiation. 4E-BP1 hyperphosphorylation at multiple amino acid residues occurs in response to growth factors such as insulin, IGF-1 and angiotensin-II and involves protein kinases including mTOR MAP kinases PKC ATM and casein kinase II involves protein kinases including mTOR, MAP kinases, PKC, ATM and casein kinase II. Hyperphosphorylated 4E-BP1 dissociates from eIF4E, leaving it free to participate in eIF4F formation. The activity of eIF4E may be regulated by phosphorylation (e.g. by the MAP kinase-stimulated protein kinase, Mnk1). Low levels of eIF4E phosphorylation are correlated with reduced translation rates in quiescent and mitotic cells


translation rates in quiescent and mitotic cells.


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