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7/27/2019 US20110318847.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/us20110318847pdf 1/21
US
20110318847A1
( 1 9 ) United
S t a t e s
( 1 2 ) Patent
Application
Publication ( 1 0 )
P u b .
N o . : US 2 0 1 1 / 0 3 1 8 8 4 7 A 1
SUNDREHAGEN ( 4 3 )
P u b .
D a t e : Dec.
2 9 , 201
( 5 4 ) CVD SSAY ( 3 0 ) F o r e i g n A p p l i c a t i o n P r i o r i t y
D a t a
( 7 5 ) I n v e n t o r ; Erling SUNDREHAGEN’ slo Dec. 2 0 , 2002 (GB) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0229747.1
(NO) P u b l i c a t i o n C l a s si ? c a t i o n
( 7 3 )
A s s i g n e e : A x i s - S h i e l d ASA, 0 5 1 0 ( N O )
( 5 1 )
I n t - C l
G 0 1 N 3 / 8 2 ( 2 0 0 6 . 0 1 )
( 2 1 )
A p p l .
N o . :
1 3 / 1 7 0 , 3 8 7
3 8 2 1 , 1 5 / 0 0 ( 2 0 1 1 0 1 )
( 5 2 )
US.
l .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
436/501; 977/773; 9 77/ 9 20
( 2 2 )
F i l e d : J u n .
2 8 , 2 0 1 1 ( 5 7 ) ABSTRACT
. .
An
assay method
and k i t
f o r t h e
d e t e c t i o n
of o t e n t i a l f o r
Related U ' s ' Apphcatlon Data CVD r p r o p e n s i t y
t o
CVD
n
a human r non-human
animal
( 6 2 )
D i v i s i o n o f
a p p l i c a t i o n N o ,
1 0 / 5 3 9 , 7
7 , ? l e d o n D e c , s u b j e c t , s a i d method
o m p r i s i n g
a s s e ss i n g t h e c o n c e n t r a t i o n
1 9 , 2 0 0 5 , ? l e d
as
a p p l i c a t i o n
N o .
PCT/GB03/05607
on
Dec.
2 2 , 2 0 0 3 .
o f
c a l p r o t e c t i n i n
a c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g
s a m p l e t a k e n
f r o m s a i d s u b j e c t .
7/27/2019 US20110318847.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/us20110318847pdf 2/21
P a t e n t
A p p l i c a t i o n P u b l i c a t i o n D e c . 2 9 , 2011
S h e e t
1
0 f
7 US 2 0 1 1 / 0 3 1 8 8 4 7
A 1
[ L 9 1 . 1
Figure
l
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P a t e n t
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S h e e t 2 0 f
7 US 2 0 1 1 / 0 3 1 8 8 4 7
A 1
1 +
1.
9 5% u n f i c i e m e e M i a m i ? f o r M1
. . . .
v
1
D i n - H a
Figure 2
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S h e e t 3 0 f
7
US
2 0 1 1 / 0 3 1 8 8 4 7
A 1
y
Fi g u r e 3
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S h e e t
4
0 f
7 US 2 0 1 1 / 0 3 1 8 8 4 7
A 1
.
5 5 : 3 .
_ § 5 % C u n ? d e n q a I n t e w a i f e r M 1
C B I i BIWI
D i ‘
Figure
:
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P a t e n t
A p p l i c a t i o n
P u b l i c a t i o n
a l p r o t e c t i ng / L
D e c . 2 9 ,
2 0 1 1
S h e e t 5 0 f 7
US
011/0318847
A 1
. O F J Q Q Q : ~ * : - * - * — ‘ ~ — *
o w i s o v o o o w o v o o
‘ l l l l l
C o n i r o l s
Figure
5
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S h e e t 6 0 f
7
US
2 0 1 1 / 0 3 1 8 8 4 7
A 1
100
80
60
F ' 5 I I I Iii : I
~ al r
- hs RP
. _ F ~ ' - - '
4O , i f , z
_ j ?
_
a? 1 :
2D i s .
S e n s i t i v i t y
O
I I
I l
I
I I I
l
I I
I
I
l
I
0 28 4D 60 8O _ 1 D D
1 O D ~ S p e c I ? c i t y
Figure
6
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A 1
( J a i p r
hs CRP
D e c .
2 9 , 2011
S h e e t
7 0 f 7
a t e n t
A p p l i c a t i o n
P u b l i c a t i o n
1000
O
1 ( J O - S p e c i ? c i t y
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A 1
CVD ASSAY
[ 0 0 0 1 ] The r e s e n t i n v e n t i o n r e l a t e s t o an s s a y
method
o r
d e t e c t i n g p o t e n t i a l f o r
o r
p r o p e n s i t y
o c a r d i o v a s c u l a r
d i s e a s e
(cvD) i n a
s u b j e c t ,
e .
g .
a
human r
non-human
a n i m a l , e s p e
c i a l l y a mammal, and
n
p a r t i c u l a r t o a n a s s a y
method
Which
may e used o d e t e c t a p o t e n t i a l f o r CVD r a
p r o p e n s i t y
t o
CVD e f o r e t h e o n s e t o f CVD symptoms n o t i c e a b l e by
t h e
s u b j e c t .
[ 0 0 0 2 ]
CVD s
a
major
s o u r c e
of l l
h e a l t h
among
t h e
human o p u l a t i o n . I n 1 9 9 a p p r o x i m a t e l y 40% f l l d e a t h s i n
t h e Western
World Was
a
r e s u l t
of
CVD i . e . 1 i n
e v e r y
2 . 5
d e a t h s ) .
F o r 2 0 0 2 ,
i t
i s
e s t i m a t e d t h a t , i n t h e USA,
o v e r
one
m i l l i o n
people
W i l l s u f f e r from a n e W o r r e c u r r e n t
coronary
a t t a c k , a n d
more
h a n 40% f t h e p e o p l e
s u f f e r i n g
f r o m t h e s e
a t t a c k s W i l l d i e . Many
o f
t h e s e
p e o p l e
W i l l
d i e
s u d d e n l y
W i t h o u t
e v e r
h a v i n g been
o s p i t a l i s ed o r t r e a t e d . M an y i l l
n o t
have
e a l i s e d
t h a t
t h e y
Were
s u s c e p t i b l e
t o
CV D .
[ 0 0 0 3] E a r l y o r
p r e - e m p t i v e
t r e a t m e n t
s u c h
a s a
change
o f
d i e t ,
r e d u c t i o n o r c e s s a t i o n o f s m o k i n g , i n c r e a s e i n e x e r c i s e ,
r e d u c t i o n
o f
b o d y W e i g h t ,
e t c . ,
h a s , h o W e v e r , a
h i g h
s u c c e s s
r a t e
o f p r e v e n t i n g CVD r r e d u c i n g
t h e
p r o p e n s i t y
t o C V D .
Thus i f
CVD r p o t e n t i a l f o r o r
p r o p e n s i t y
t o
CVD can be
d e t e c t e d , e f f ec t i v e t r e a t m e n t i s a v a i l a b l e .
[ 0 0 0 4 ] There
s
a c c o r d i n g l y a
need
o r methods Which can
be
u s e d
to d e t e c t
CVD
and
e s p e c i a l l y , t h e
p o t e n t i a l f o r o r
p r o p e n s i t y
o CVD, e f o r e t h e
d i s e a s e
h a s
p r o g r e s s e d
b e y o n d
t h e s t a g e
W h e r e
t r e a t m e n t (eg
c h a n g e
o f l i f e s t y l e a n d / o r
h a b i t )
i s
r o u t i n e l y s u c c e s s f u l . I n
a r t i c u l a r ,
t h e r e i s a n e e d
f o r
methods
Which can
be
used
o d e t e c t CVD t
t h e
e a r l y s t a g e s
When
h e symptoms a r e not apparent
o
a s u b j e c t o r
t o
a t h i r d
p a r t y ,
eg
p h y s i c i a n ,
i . e .
m e t h o d s f o r
t e s t i n g “symptom
f r e e ” s u b j e c t s a r e r e q u i r e d .
[ 0 0 0 5 ]
Such
methods may
b e u s e d t o
s c r e e n
t h e
g e n e r a l
p o p u l a t i o n ( i . e .
i n mass s c r e e n i n g ) o r a t - r i s k g r o u p s
W i t h i n
t h e p o p u l a t i o n , e . g . m a l e s o v e r 4 0 , W o r k e r s i n h i g h s t r e s s j o b s ,
i n d i v i d u a l s W i t h u n h e a l t h y d i e t s , i n d i v i d u a l s s u f f e r i n g f r o m
c l i n i c a l o b e s i t y , s m o k e r s , e t c . I n c a s e s Where
p o t e n t i a l
f o r
CVD r p r o p e n s i t y to CVD
s
d i a g n o s e d ,
p r e - e m p t i v e
t r e a t
ment may
e
g i v e n a n d /
r t h e p a t i e n t
may
e
e n c o u r a g e d to
make a d j u s t m e n t s t o l i f e s t y l e a n d h a b i t .
[ 0 0 0 6 ]
L i k e W i s e ,
W h e r e
p o t e n t i a l f o r CVD r p r o p e n s i t y
t o
CVD
s
d e t e c t e d ,
a
p a t i e n t
may be s u b m i t t e d to
f u r t h e r
t e s t
i n g , eg s i n g more x p e n s i v e
o r
t i m e c o n s u m i n g t e c h n i q u e s ,
s u c h
s ECG,
i t h
a n d
W i t h o u t p h y s i c a l a c t i v i t y , r a d i o i s o t o p e
i m a g i n g o f
y o c a r d i a l
p e r f u s i o n , X - r a y e . g . C T )
y o c a r d i a l
a n g i o g r a p h y ,
MR
m y o c a r d i a l
a n g i o g r a p h y
o r
p e r f u s i o n
i m a g i n g ,
e t c .
T h u s b y c o n ? r m i n g
t h e p o s s i b l e
p r e s e n c e
o f ,
o r
p o t e n t i a l
f o r ,
o r p r o p e n s i t y t o , CVD y u s i n g t h e
c h e a p
a n d
f a c i l e
a s s a y method f
t h e
i n v e n t i o n
i n an n i t i a l
s c r e e n
( e g
i n a mass
s c r e e n
o f “symptom-free”
h e a l t h y
s u b j e c t s ) t h e
l i k e l i h o o d
o f
d e t e c t i n g o r i d e n t i f y i n g u n d i s c o v e r e d
CV D ,
o r
p o t e n t i a l
f o r
CVD,
b e f o r e
h e a l t h damage
e c o m e s i r r e v e r s
i b l e i s i n c r e a s e d
W h i l s t ,
a t t h e same i m e , u n n e c e s s a r y u s e of
e x p e n s i v e a n d t i m e - c o n s u m i n g t e s t s i s l i m i t e d .
[ 0 0 0 7 ]
By “ C V D ”
i s meant
a n y
c o n d i t i o n
o f t h e h e a r t ,
a r t e r i e s ,
o r
v e i n s
Which d i s r u p t s
t h e s u p p l y o f oxygen to
l i f e - s u s t a i n i n g
a r e a s
o f t h e body
s u c h
a s t h e
b r a i n ,
t h e
h e a r t
e t c . Examples
f CVDs r e a r t e r i o s c l e r o s i s , a c u t e m y o c a r d i a l
i n f a r c t i o n ,
a n g i n a p e c t o r i s , i s c h e m i c h e a r t d i s e a s e , c e r e
b r o v a s c u l a r d i s e a s e ,
s t r o k e , s u b a r a c h n o i d
h a e m o r r h a g e ,
D e c . 2 9 , 2 0 1 1
i n t r a - c e r e b r a l
h a e m o r r h a g e ,
c e r e b r a l i n f a r c t i o n ,
c o n g e s t i v e
h e a r t f a i l u r e , a n g i n a , h e a r t a t t a c k , c a r d i a c a r r e s t a n d a r r h y t h
m i a .
[ 0 0 0 8 ]
The
p r e s e n t i n v e n t i o n i s b a s e d on t h e
s u r p r i s i n g
? n d i n g
t h a t
t h e p r o t e i n
c a l p r o t e c t i n
i s
a u s e f u l
“ m a r k e r ”
o r
“ i n d i c a t o r ” o f o t e n t i a l f o r
CVD
r p r o p e n s i t y t o
CVD
e f o r e
t h e
o n s e t o f CVD y m p t o m s ( i . e .
i n s y m p t o m - f r e e s u b j e c t s ) .
I n p a r t i c u l a r i t h a s
b e e n
s u r p r i s i n g l y f o u n d
t h a t
a b n o r m a l l y
h i g h
c a l p r o t e c t i n
l e v e l s i n v a r i o u s b o d y ? u i d s
i s
i n d i c a t i v e o f
s u s c e p t i b i l i t y
to CVD e f o r e
t h e
o n s e t
o f
CVD ymptoms s
a p p a r e n t t o a s u b j e c t
o r
t o a t h i r d p a r t y ( e g a p h y s i c i a n ) .
[ 0 0 0 9 ] F o r t h e
a v o i d a n c e
o f d o u b t , t h e t e r m
c a l p r o t e c t i n
i s
u s e d h e r e i n
synonymously W i t h “ L I
p r o t e i n ” ,
“MRP / 1 4 " , °
c y s t i c
? b r o s i s ( a s s o c i a t e d )
a n t i g e n
( C F A ) ”
n d “ c a l g r a n u l i n ” .
[ 0 0 1 0 ] C a i p r o t e c t i n e x i s t s i n b o t h d i m e r i c a n d t r i m e r i c
f o r m s .
As a d i m e r ,
c a l p r o t e c t i n c o m p r i s e s
t h e p o l y p e p t i d e
c h a i n s S100A8 and S100A9. A s a t r i m e r , c a l p r o t e c t i n
i s
a 36
kDa e t e r o t r i m e r i c
p r o t e i n
W i t h t W o h e a v y
( 1 4
kD) a n d o n e
l i g h t
c h a i n
( 8
k D ) n o n - c o v a l e n t l y
l i n k e d .
[ 0 0 1 1 ] C a i p r o t e c t i n
s
a
c a l c i u m
b i n d i n g
p r o t e i n
a n d
When
bound
to
c a l c i u m , c a l p r o t e c t i n i s r e s i s t a n t
to h e a t
and
to
p r o t e o l y s i s . T h i s may a l l o W f o r a Wide r a n g e
o f
a s s a y
t e c h
n i q u e s a n d c o n d i t i o n s t o b e e m p l o y e d .
[ 0 0 1 2 ]
E p i t o p e
m a p p i n g o f
c a l p r o t e c t i n
s h o W s
t h a t
a n t i
b o d i e s W i t h
s p e c i ? c i t y
f o r t h e
c o m p l e x
a n d / o r t s s i n g l e p r o
t e i n c h a i n s may e p r o d u c e d . At
e a s t
f o u r s e p a r a t e immuno
g e n i c
s i t e s
h a v e been shoWn t o e x i s t
on t h e
c a l p r o t e c t i n
c o m p l e x . Some
a n t i b o d i e s r e c o g n i s e
e i t h e r
t h e
h e a v y o r
t h e
l i g h t
c h a i n ,
W h i l s t o t h e r s
r e c o g n i s e
b o t h .
[ 0 0 1 3 ] C a l p r o t e c t i n
s
f o u n d i n e l l s , t i s s u e s
a n d ? u i d s
i n a l l
p a r t s o f
t h e
human o d y a n d i s
d e r i v e d
p r e d o m i n a n t l y
f r o m
n e u t r o p h i l s a n d m o n o c y t e s .
C a l p r o t e c t i n
i s p r o b a b l y
p r e s e n t
i n a l l
i n d i v i d u a l s s i n c e amongst
more h a n 5 , 0 0 0
i n d i v i d u a l s
t e s t e d ,
no
c a l p r o t e c t i n f r e e
i n d i v i d u a l
Was f o u n d . C a i p r o t e c
t i n
i s
a l s o
f o u n d
i n
r a t s ,
m i c e ,
r a b b i t s ,
s h e e p ,
c a t t l e
a n d
i g s .
I t i s
t h e r e f o r e
a n a b u n d a n t
u b i q u i t o u s m o l e c u l e .
[ 0 0 1 4 ] I n
v i v o , c a l p r o t e c t i n
i s
i n v o l v e d
i n numerous b i o
l o g i c a l
f u n c t i o n s i n c l u d i n g
i n t r a c e l l u l a r
s i g n a l
t r a n s d u c t i o n ,
n e u t r o p h i l a c t i v a t i o n , i n h i b i t i o n o f i n t r a c e l l u l a r e n Z y m e s
i n v o l v e d i n c e l l p r o l i f e r a t i o n , a n t i m i c r o b i a l
a c t i v i t y
a n d i n
n e u t r o p h i l
d e f e n c e . C a l p r o t e c t i n
i s
a l s o a
r e g u l a t o r y p r o t e i n
i n
in?ammatory r e a c t i o n s and
i n
t h i s r o l e may f u n c t i o n t o
s t i m u l a t e i m m u n o g l o b u l i n
p r o d u c t i o n , c h e m o t a c t i c
f a c t o r
a c t i v i t y
a n d n e u t r o p h i l
i m m o b i l i s i n g f a c t o r .
[ 0 0 1 5 ] W h i l s t b o d y ? u i d s p r o b a b l y a l W a y s
c o m p r i s e
c a l p r o t e c t i n , t h e c o n c e n t r a t i o n o f
a l p r o t e c t i n
i n v a r i o u s b o d y
? u i d s h a s
b e e n
f o u n d t o
c h a n g e , f o r e x a m p l e ,
t o
i n c r e a s e ,
i n
a
number f
i s e a s e c o n d i t i o n s
( e .
g . i n ? a m m a t o r y ,
i n f e c t i o u s
and
m a l i g n a n t d i s e a s e s ) .
Thus
measurement o f t h e c o n c e n
t r a t i o n
o f
c a l p r o t e c t i n
i n
b o d y
? u i d
f r o m
p a t i e n t s s u f f e r i n g
f r o m
s u c h d i s e a s e c o n d i t i o n s ( i . e . i n
i n d i v i d u a l s
s h o W i n g
symptoms n o t i c e a b l e t o
t h e
s u b j e c t a n d / o r t o
a
t h i r d p a r t y )
a n d
c o m p a r i n g
t h e c a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n d e t e r m i n e d
t o
t h a t i n body ? u i d
f r o m ,
f o r e x a m p l e , a h e a l t h y
( i . e .
a non
d i s e a s e d ) s u b j e c t
may e
used
s
a means
o f
d i a g n o s i n g
s u c h
d i s e a s e s .
[ 0 0 1 6 ] F o r e x a m p l e ,
W h i l s t t h e
symptoms o f a c t e r i a l a n d
v i r a l i n f e c t i o n s
a r e
v e r y s i m i l a r and
d i a g n o s i s
from t h e i r
symptoms
l o n e may
e i ? i c u l t , t h e c o n c e n t r a t i o n o f a l p r o
t e c t i n
i n t h e p l a s m a /
serum
o f t h e
i n f e c t e d s u b j e c t
i n c r e a s e s
a p p r o x i m a t e l y
1
to 2 t i m e s W i t h v i r a l i n f e c t i o n s b u t a r o u n d
t o 1 8 t i m e s
W i t h
b a c t e r i a l i n f e c t i o n s . T h u s t h e s u b j e c t
h a v i n g
n o t i c e d t h e symptoms
o f
i n f e c t i o n ,
c a n h a v e
t h e c o n c e n t r a
7/27/2019 US20110318847.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/us20110318847pdf 10/21
US 2011/0318847
A 1
t i o n
o f
c a l p r o t e c t i n i n
t h e i r body ? u i d m e a s u r e d
a n d
t h e i r
i n f e c t i o n d i a g n o s e d a n d t r e a t e d a c c o r d i n g l y .
[ 0 0 1 7 ] O t h e r
d i s e a s e s
i n Which a l p r o t e c t i n may e
u s e d
a s
a d i a g n o s t i c t e s t i n c l u d e :
r h e u m a t i c
d i s e a s e s (eg
h e u m a t o i d
a r t h r i t i s ,
j u v e n i l e
r h e u m a t o i d
r t h r i t i s ,
s y s t e m i c
l u p u s e r y t h e
m a t o s u s ) , S j o g r e n s s y n d r o m e ,
i n t r a o c u l a r
i n ? a m m a t o r y
c o n
d i t i o n s ,
c y s t i c ? b r o s i s , a c u t e a n d c h r o n i c l u n g d i s e a s e ,
l u n g
c a r c i n o m a
( s q u a m o u s
c e l l s ) , p u l m o n a r y
c a n c e r s ,
c o l o r e c t a l
c a n c e r , i n ? a m m a t o r y b o W e l
d i s e a s e ,
g a s t r i c c a n c e r , c o l o r e c
t a l
adenoma o r c a n c e r ,
C r o h n ’ s d i s e a s e ,
u l c e r a t i v e
c o l i t i s ,
g a s t r o i n t e s t i n a l m u c o s a l i n ? a m m a t i o n ,
u r i n a r y
s t o n e s , a l c o
h o l i c
l i v e r d i s e a s e ,
o r a l
i n ? a m m a t o r y m u c o s a l d i s e a s e , C NS
i n ? a m m a t o r y
d i s e a s e (eg m u l t i p l e s c l e r o s i s a n d a c u t e
e n c e p h a l i t i s ) , HIV
n f e c t i o n , s e c o n d a r y CNS
i n f e c t i o n s i n
HIV n f e c t e d p a t i e n t s ,
u r i n a r y
t r a c t
i n f e c t i o n s ,
c y s t i t i s , p y e l o
n e p h r i t i s , e n d o g e n o u s p o s t e r i o r u v e i t i s , h a e m a t o l o g i c a l c o n
d i t i o n s
( e . g . l e u k a e m i a ) , f e b r i l e c o n d i t i o n s
( i n f e c t i o u s
a n d
n o n - i n f e c t i o u s ) ,
a c u t e
m y o c a r d i a l i n f a r c t i o n a n d a p h e r e s i s .
[ 0 0 1 8 ] T h e
p l a s m a
c o n c e n t r a t i o n o f
c a l p r o t e c t i n
h a s a l s o
b e e n
f o u n d
t o
i n c r e a s e d u r i n g
open
e a r t s u r g e r y
( S e m b , A .
G . e t
a l ,
E u r . J . C a r d i o - t h o r a c S u r g . ( 1 9 9 1 ) 5 1 3 6 3 - 3 6 7 ,
S a a t v e d t , K . e t a l . ,
S c a n d ,
J . T h o r . C a r d i o v a s c .
S u r g .
( 1 9 9 6 )
3 0 :
5 3 - 6 0 , M o e n , O . e t a l . ,
P e r f u s i o n
( 1 9 9 4 ) 9 : 1 0 9 - 1 1 7 ) .
More p e c i ? c a l l y , S a a t v e d t
e t
a l .
r e p o r t t h a t c a l p r o t e c t i n
c o n
c e n t r a t i o n
i s e s
a f t e r t h e
s t a r t
o f c a r d i o p u l m o n a r y b y p a s s a n d
p e a k s 4 8
h o u r s p o s t - o p e r a t i v e l y .
[ 0 0 1 9 ] I t
h a s noW u r p r i s i n g l y b e e n f o u n d h a t t h e p o t e n t i a l
f o r
CVD
r
p r o p e n s i t y t o CVD n
a
s u b j e c t can
be
s s e s s e d
by
d e t e r m i n i n g t h e
c o n c e n t r a t i o n
o f
c a l p r o t e c t i n
i n a c a l p r o t e c
t i n - c o n t a i n i n g s a m p l e
t a k e n
f r o m s a i d
s u b j e c t .
I n
o t h e r
W o r d s , i t h a s been o u n d t h a t d e t e r m i n a t i o n o f t h e c o n c e n t r a
t i o n
o f
a l p r o t e c t i n i n
a c a l p r o t ec t i n - c o n t a i n i n g
s a m p l e t a k e n
from a s u b j e c t
c a n
be used t o
p r e d i c t , p r i o r
t o t h e o n s e t
o f
symptoms
Which
a r e
n o t i c e a b l e
t o
t h e
s u b j e c t o r t o a
t h i r d
p a r t y
(eg
p h y s i c i a n ) W h e t h e r o r
hoW
i k e l y t h e
s u b j e c t
i s to
s u f f e r CV D .
[ 0 0 2 0 ] By
“ p o t e n t i a l f o r ”
o r
“ p r o p e n s i t y
t o ” i s m e a n t t h e
l i k e l i h o o d o r p r o b a b i l i t y
h a t
t h e c u r r e n t l y
s y m p t o m - f r e e s u b
j e c t b e i n g
t e s t e d W i l l s u f f e r CVD n
t h e
f u t u r e . T h i s m i g h t
t a k e
t h e
form f
a n i n d e x , r a t i o , p e r c e n t a g e o r s i m i l a r number
r e ? e c t i v e
o f
t h e
r e l a t i v e
r i s k o f
CVD n
t h e
f u t u r e ( e .
g .
i n
t h e
f o l l o W i n g 1 - 2
y e a r s ,
a t
l e a s t i n
t h e f o l l o W i n g 6 m o n t h s ) .
[ 0 0 2 1 ] Thus i e W e d from
n e
a s p e c t t h e i n v e n t i o n
p r o v i d e s
an
a s s a y method
f o r
t h e d e t e c t i o n of
o t e n t i a l f o r
CVD r
p r o p e n s i t y t o CVD n a
human
r
non-human n i m a l
s u b j e c t ,
s a i d
m e t h o d c o m p r i s i n g a s s e s s i n g t h e
c o n c e n t r a t i o n
o f
c a l p r o t e c t i n i n
a c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g s a m p l e t a k e n
f r o m
s a i d s u b j e c t ,
eg
a
s a m p l e
o f
b l o o d , p l a s m a , s e r u m ,
c e r e
b r o s p i n a l
? u i d ,
o r a l ? u i d , u r i n e , f a e c e s , s y n o v i a l o r empyema
? u i d .
[ 0 0 2 2 ]
By
“ a s s e d s i n g ”
i t
i s
meant
t h a t
a
q u a n t i t a t i v e o r
s e m i - q u a n t i t a t i v e v a l u e f o r t h e
c o n c e n t r a t i o n
o f
c a l p r o t e c t i n
i s d e t e r m i n ed . T h i s may e t h e v a l u e f o r t h e C o n c e n t r a t i o n o f
t h e sample s
t e s t e d ,
e .
g . a f t e r t r e a t m e n t t o
remove h e c e l l s o r
o t h e r s a m p l e
c o m p o n e n t s
n o t b e i n g a s s a y e d f o r , o r t o c o n
c e n t r a t e
o r
d i l u t e
t h e sample o r t o
t r a n s f e r
t h e
c a l p r o t e c t i n
t o
a s e p a r a t e
medium,
. g . s o l i d s u b s t r a t e.
[ 0 0 2 3 ]
A l t e r n a t i v e l y ,
t h e a s s e s s m e n t may s i m p l y b e q u a l i
t a t i v e , i . e .
t o
i n d i c a t e W h e t h e r t h e c a l p r o t e c ti n i s above o r
beloW
one
o r
more r e - s e l e c t e d
t h r e s h o l d v a l u e s ,
eg
a l u e s
i n d i c a t i v e
o f a b s en c e o f
p o t e n t i a l f o r
CVD
r
p r o p e n s i t y to
CVD s
d e t e c t a b l e by h e a s s a y .
The
r e c i s e v a l u e s f o r t h e s e
t h r e s h o l d v a l u e s o r
o t h e r
r e f e r e n c e v a l u e s
f o r
c a l p r o t e c t i n
may
depend on
h e
n a t u r e
o f t h e s a m p l e ,
t h e a g e , W e i g h t , s e x
D e c . 2 9 , 2 0 1 1
and s p e c i e s o f a s u b j e c t and may be
d e t e r m i n e d
i n a r o u t i n e
manner b y m e a s u r i n g
t h e
c a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n
o f
t h e
r e l e v a n t
body
? u i d o f
e q u i v a l e n t
s u b j e c t s W i t h o u t CVD r
W i t h
CVD
t
v a r i o u s
s t a g e s o f
d e v e l o p m e n t .
[ 0 0 2 4 ]
A
a l u e
i n d i c a t i v e
o f
c a l p r o t e c t i n
c o n c e n t r a t i o n
determined o r “ a s s e s s e d ” i n accordance With t h e method of
t h e
i n v e n t i o n
may be an b s o l u t e
c o n c e n t r a t i o n
o f c a l p r o t e c
t i n o r may a l t e r n a t i v e l y b e a n
i n d e x ,
r a t i o , p e r c e n t a g e o r
s i m i l a r number e ? e c t i v e o f h e
c o n c e n t r a t i o n
o f a l p r o t e c t i n .
[ 0 0 2 5 ]
A
o d y s a m p l e u s e d i n
t h e a s s a y method
o f
t h e
i n v e n t i o n may e
a n y c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g
s a m p l e , eg
body
? u i d o r t i s s u e s a m p l e ,
o r
a s u s p e n s i o n e t c .
P r e f e r a b l y ,
t h e s a m p l e i l l b e a b o d y u i d , e . g .
u r i n e , c e r e b r o s p i n a l
? u i d ,
o r a l ? u i d ,
s y n o v i a l
? u i d o r empyema ? u i d , o r more p r e f e r
a b l y , blood o r a blood e r i v e d s a m p l e .
When h i s
i s t h e c a s e
( i . e .
When
b l o o d
o r a
b l o o d d e r i v e d
s a m p l e
i s
u s e d ) , t h e
s a m p l e
u s e d
f o r
a n a l y s i s
W i l l
p r e f e r a b l y b e c e l l - f r e e
( e . g .
serum
o r p l a s m a ) . A l t e r n a t i v e l y f a e c e s may be s e d .
[ 0 0 2 6 ]
The
a m p l e
may
e t r e at e d p r i o r o b e i n g u s e d n t h e
a s s a y
method
o f
t h e
i n v e n t i o n .
Thus
t h e
s a m p l e
may
b e
t r e a t e d t o remove any c e l l s a n d / o r any s ample components
n o t
b e i n g a s s a y e d
f o r . The
s a m p l e may a l s o b e t r e a t e d
t o
c o n c e n t r a t e o r d i l u t e t h e
sample
r t o
t r a n s f e r
t h e c a l p r o t e c t i n
t o a s e p a r a t e medium, e . g . s o l i d
s u b s t r a t e . F o r example
t h e
s a m p l e
may
e d i l u t e d by a d d i n g
a b u f f e r
o r o t h e r
a q u e o u s
medium. A l t e r n a t i v e l y , a s a m p l e , p a r t i c u l a r l y a p l a s m a o r
s e r u m
s a m p l e ,
may e u s e d d i r e c t l y .
[ 0 0 2 7 ]
The s a m p l e i s
o p t i o n a l l y t r e a t e d W i t h c a l c i u m o r a
c a l c i u m m i m i c
( e . g . i o n s
o f
a n o t h e r a l k a l i n e e a r t h m e t a l ) ,
p r i o r t o
b e i n g u s e d
i n t h e
a s s a y method f
t h e i n v e n t i o n .
The
c a l c i u m
o r
c a l c i u m
mimic may be
a n y
form Which r o v i d e s
C a 2 +
i o n s ( e . g . C a C l 2 ) I f c a l c i u m i s u s e d
t h e n
p r e f e r a b l y
s u f ? c i e n t
calcium r calcium mimic
s
added
o
t h e sample o
s a t u r a t e t h e c a l c i u m
b i n d i n g
s i t e s o f
c a l p r o t e c t i n .
F o r
example,
a
t e n molar
x c e s s
of
calcium s o u r c e
may e d d e d ,
more r e f e r a b l y , a ?ve molar
e x c e s s
o r
e s p e c i a l l y
p r e f e r a b l y
a three molar excess.
[ 0 0 2 8 ]
While
s s a y s
f o r c a l p r o t e c t i n a r e knoWn
and
may
e
u s e d i n t h e
method
f t h e i n v e n t i o n , t h e r e
h a s n o t p r e v i o u s l y
been
any s u g g e s t i o n t h a t c a l p r o t e c t i n i s a
marker
r i n d i c a t o r
o f
p o t e n t i a l f o r
CVD
r p r o p e n s i t y t o C V D . I n o t h e r W o r d s ,
t h e r e h a s n o t p r e v i o u s l y b e e n a n y s u g g e s t i o n t h a t
t h e c a l p r o
t e c t i n c o n c e n t r a t i o n
o f s y m p t o m - f r e e s u b j e c t s m i g h t
b e
u s e d
a s a
marker
r
i n d i c a t o r of
o t e n t i a l f o r o r
p r o p e n s i t y t o CVD
a n d ,
i n p a r t i c u l a r , t h e r e h a s n o t b e e n a n y s u g g e s t i o n t h a t
c a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n might
be
used
a s
t h e
marker
o r
i n d i c a t o r i n an a s s a y method s u i t a b l e f o r mass s c r e e n i n g of
h e a l t h y ( i . e .
s y m p t o m - f r e e )
s u b j e c t s .
[ 0 0 2 9 ]
Any knoWn a s s a y
method
o r
c a l p r o t e c t i n may
b e
u s e d i n t h e a s s a y method f t h e
i n v e n t i o n .
T h u s ,
f o r
e x a m p l e ,
t h e
method
i s c l o s e d i n
Us.
a t .
N o . 4 , 8 3 3 , 0 7 4 ( F a g e r h o l
e t
a l . )
f o r t h e
i s o l a t i o n o f
c a l p r o t e c t i n a n d f o r t h e
s u b s e q u e n t
p r o d u c t i o n o f m o n o s p e c i ? c a n t i - s e r a t h e r e t o may
e
u s e d
t o
produce a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s f o r u s e i n any conven
t i o n a l
a s s a y
m e t h o d .
The a n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d i e s
p r o
d u c e d
may b e u s e d , f o r i n s t a n c e , i n enZyme
l i n k e d - a n d
r a d i o - i m m u n o a s s a y s .
[ 0 0 3 0 ] A
N y c o C a r d ® ( A x i s - S h i e l d
P o C ,
O s l o , N o r W a y )
i m m u n o a s s a y
f o r m a t f o r c a l p r o t e c t i n
may l s o , f o r
e x a m p l e ,
be u s e d . T h i s a s s a y
u s e s
a s o l i d p h a s e ,
sandwich-format
i n
Which t h e t e s t
d e v i c e
c o m p r i s e s a membrane c o a t e d W i t h
i m m o b i l i s e d a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s . T h u s t h e s a m p l e
( o p t i o n a l l y d i l u t e d )
i s
a p p l i e d t o t h e d e v i c e a n d
When t h e
s a m p l e
? o W s
t h r o u g h h e
m e m b r a n e , a n y
c a l p r o t e c t i n p r e s e n t
7/27/2019 US20110318847.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/us20110318847pdf 11/21
US 2011/0318847
A 1
i s c a p t u r e d .
The
a l p r o t e c t i n , i m m o b i l i s e d on h e
membrane
i s
t h e n t r e a t e d
W i t h
a
g o l d - a n t i b o d y c o n j u g a t e Which i n d s to
t h e
c a l p r o t e c t i n - a n t i b o d y
c o m p l e x a n d t h e i n t e n s i t y o f
c o l o u r
( d u e
t o
t h e
g o l d
b e a d s ) ,
a s d e t e r m i n e d
by
a b s o r b a n c e o f r e d
l i g h t ,
i s
p r o p o r t i o n a l
to
t h e
amount
o f
c a l p r o t e c t i n .
The
c o n
c e n t r a t i o n of a l p r o t e c t i n can t h e r e f o r e be c a l c u l a t e d from a
c a l i b r a t i o n c u r v e
prepared
n
t h e c o n v e n t i o n a l
manner.
[ 0 0 3 1 ] A l t e r n a t i v e l y , t h e c o m m e r c i a l t e s t ( C a l p r e s t ® ) f o r
c a l p r o t e c t i n ,
f o r e x a m p l e ,
i n f a e c e s
( a v a i l a b l e
f r o m
E u r o s p i
t a l ® ) may
b e
u s e d .
T h i s a s s a y
u s e s a p o l y c l o n a l
a n t i b o d y
a g a i n s t
c a l p r o t e c t i n
i n a n
enZyme
l i n k e d i m m u n o - s o r b e n t
a s s a y s y s t e m . T h u s c a l p r o t e c t i n
p r e s e n t i n
a s a m p l e
t a k e n
from s u b j e c t becomes bound o a n t i b o d y ,
Which
s a d s o r b e d
to t h e s u r f a c e o f a p l a s t i c W e l l .
A
u b s t r a t e f o r t h e enZyme s
t h e n a d d e d a n d
t h e i n t e n s i t y o f h e
c o l o u r e d p r o d u c t p r o d u c e d
i s
p r o p o r t i o n a l t o
t h e
amount f
enZyme
and
h e r e f o r e
t o
t h e
amount f
a l p r o t e c t i n .
The o n c e n t r a t i o n o f a l p r o t e c t i n c a n
t h e r e f o r e be
c a l c u l a t e d
from a
c a l i b r a t i o n
c u r v e p r e p a r e d
i n
t h e conventional manner.
[ 0 0 3 2 ] I n d e e d ,
b o t h
m o n o -
a n d p o l y c l o n a l
a n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d i e s
a r e a v a i l a b l e
c o m m e r c i a l l y .
Egg
a n d
r a b b i t p o l y
c l o n a l s a r e ,
f o r e x a m p l e ,
a v a i l a b l e f r o m NorWegian n t i b o d
i e s A S
a n d
A x i s - S h i e l d
D i a g n o s t i c s
r e s p e c t i v e l y , W h i l s t
mouse monoclonal n t i b o d y
may e
o b t a i n e d from Dako
/
,
D e n m a r k . Any
a n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d y o b t a i n e d , f o r
e x a m p l e ,
b y a n y c o n v e n t i o n a l
t e c h n i q u e f o r
m a k i n g a n t i b o d
i e s ,
may e
u s e d
i n t h e
method
f t h e i n v e n t i o n . F o r
i n s t a n c e ,
r a b b i t a n t i c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d y
a s
W e l l
a s monoclonal a n t i
b o d i e s c a n
b e p r o d u c e d
a c c o r d i n g o t h e p r o t o c o l
d e s c r i b e d i n
H a r l o W a n d L a n e
( 1 9 8 8 ) , A n t i b o d i e s , A a b o r a t o r y M an u a l ,
C o l d
S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ,
N e W
o r k ,
N Y.
[ 0 0 3 3 ]
A l t e r n a t i v e l y , a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s may
b e
p r e p a r e d b y r e g u l a r l y i n j e c t i n g a c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g
s o l u t i o n i n t o c h i c k e n s , a n d
t h e n
c o l l e c t i n g t h e
y o l k s o f
t h e
c h i c k e n ’ s e g g s. C h i c k e n e g g p o l y c l o n a l
a n t i b o d y c a n t h e n
b e
i s o l a t e d
a c c o r d i n g
o
c o n v e n t i o n a l t e c h n i q u e s a n d p u r i ? e d b y
a ? i n i t y
c h r o m a t o g r a p h y .
[ 0 0 3 4 ]
P r e f e r a b l y , t h e a s s a y
method
f h e
i n v e n t i o n s u s e d
f o r
m a s s s c r e e n i n g o f h e a l t h y ( e . g . CVD
y m p t o m - f r e e ) s u b
j e c t s .
Where
p o t e n t i a l
f o r CVD r p r o p e n s i t y t o CVD
s
d e t e c t e d ,
t h e s u b j e c t may e s u b j e c t e d t o f u r t h e r t e s t i n g (eg
u s i n g m o r e
e x p e n s i v e
t e c h n i q u e s s p e c i ? c o CVD)
o
con?rm
t h e
presence o r
absence
of
CVD.
[ 0 0 3 5 ]
I n
g e n e r a l ,
b e s i d e s
t h e s a mp l e u n d e r e v a l u a t i o n ,
c a l i b r a t i o n s a m p l e s W i t h knoWn a l p r o t e c t i n c o n t e n t W i l l a l s o
b e a s s e s s e d i n
t h e
p e r f o r m a n c e o f
t h e
a s s a y
m e t h o d .
Such
d e t e r m i n a t i o n s
can
be used t o
p l o t a c a l i b r a t i o n curve
from
W h i c h t h e c a l p r o t e c t i n c o n t e n t o f t h e s a m p l e u n d e r i n v e s t i g a
t i o n
may
e d e t e r m i n e d . The a t u r e o f
h e
c a l i b r a t i o n s a m p l e s
and
s e l e c t i o n o f c o n v e r s i o n
o r
a d j u s t m e n t f a c t o r s u s e d i n t h e
d e t e r m i n a t i o n
o f
t h e c a l p r o t e c t i n
may
v a r y d e p e n d i n g ,
f o r
e x a m p l e , on h e
manner
n Which h e
c a l p r o t e c t i n
i s
d e t e c t e d
i n
t h e a s s a y t ec h n i q u e
a c t u a l l y
u s e d
a n d
on t h e r
a s p e c t s o f
t h e
method Which
f f e c t t h e a s s a y r e s u l t , f o r e x a m p l e , b u f f e r
c o m p o s i t i o n , a s sa y
c o n d i t i o n s e t c .
[ 0 0 3 6 ]
T y p i c a l l y c a l i b r a t i o n
s a m p l e s h a v i n g
c a l p r o t e c t i n
c o n t e n t s o f
0
t o 5000 mg/ i l l be s e d . The e f e r e n c e
r a n g e
W i t h i n Which t h e v a l u e f o r c a l p r o t e c t i n
c o n c e n t r a t i o n
W i l l
g e n e r a l l y b e
f o u n d
i s 0 . 1 t o 1 0
m g / L .
[ 0 0 3 7 ] I n
g e n e r a l , t h e c o n c e n t r a t i o n o f
c a l p r o t e c t i n
i n t h e
serum and
plasma
of humans W i t h
l i t t l e
o r no p o t e n t i a l f o r
CVD r
p r o p e n s i t y
t o CVD i l l be i n t h e
r a n g e 0 . 0 1 - 0 . 7 5
m g / L . More
p e c i ? c a l l y , t h e
c o n c e n t r a t i o n
o f a l p r o t e c t i n i n
t h e serum
and plasma o f s u c h
humans
W i l l
b e i n t h e
r a n g e
D e c . 2 9 , 2 0 1 1
0 . 0 5 - 0 . 7 0 m g / L ,
e v e n more
s p e c i ? c a l l y 0 . 1 0 - 0 . 6 6 m g / L , f o r
i n s t a n c e ,
i n t h e
r a n g e 0 . 1 5 - 0 . 4 5
m g / L . F o r
e x a m p l e ,
t h e c o n
c e n t r a t i o n of a l p r o t e c t i n i n t h e serum r plasma of female
With
i t t l e
o r
no o t e n t i al f o r
CVD r p r o p e n s i t y
t o
CVD
i l l
b e
i n t h e
r a n g e
0 . 0 9 - 0 . 5 3
m g / L ,
f o r
e x a m p l e , a b o u t
0 . 3 1
mg/L
o r
0 . 3 0 mg/
. The
o n c e n t r a t i o n
o f c a l p r o t e c t i n
i n t h e
serum
o r
plasma
of a male With i t t l e o r no p o t e n t i a l f o r CVD r
p r o p e n s i t y
t o
CVD
i l l
b e i n
t h e
r a n g e 0 . 1 2 - 0 . 6 6 m g / L ,
f o r
e x a m p l e , 0 . 3 0 - 0 . 3 9 m g / L , e s p e c i a l l y
0 . 3 1
m g / L .
[ 0 0 3 8 ] A a l p r o t e c t i n , c o n c e n t r a t i o n i n serum r p l a s m a o f
g r e a t e r t h a n 0 . 7 5 mg/L i l l
g e n e r a l l y b e
v e r y s t r o n g l y i n d i c a
t i v e o f p o t e n t i a l f o r CVD r p r o p e n s i t y
t o C V D .
Thus
a
t h r e s h o l d
v a l u e above Which t h e a s s a y may
be
h e l d
t o be
p r e d i c t i v e o f
CVD o t e n t i a l o r p r o p e n s i t y
t o
CVD ay e n
e r a l l y b e n t h e
r a n g e
0 . 3 2 - 0 . 7 7
mg/ , f o r e x a m p l e , a b o u t 0 . 6 7
m g / L , p r e f e r a b l y
a b o u t
0 . 7 0 m g / L , e s p e c i a l l y
a b o u t
0 . 7 6
m g / L . More
r e f e r a b l y
t h e t h r e s h o l d v a l u e a b o v e W h i c h
t h e
a s s a y may be e l d t o be r e d i c t i v e o f
o t e n t i a l
f o r o r propen
s i t y
t o CVD s i n t h e r a n g e , 0 . 3 0 - 0 . 5 0 mg/L, even more
p r e f e r a b l y
i n
t h e
r a n g e
0 . 3 2 - 0 . 4 7
m g / L ,
f o r
e x a m p l e a b o u t
0 . 4 5
m g / L .
[ 0 0 3 9 ] I n g e n e r a l , t h e
c o n c e n t r a t i o n
o f c a l p r o t e c t i n i n t h e
f a e c e s
of humans
With
i t t l e o r no o t e n t i a l f o r CVD r
p r o
p e n s i t y t o
CVD
i l l
b e i n
t h e
r a n g e 0 . 0 1 - 1 0 m g / L . More
s p e c i ? c a l l y , t h e c o n c e n t r a t i o n
o f
a l p r o t e c t i n i n t h e f a e c e s
o f
such
humans W i l l be i n t h e
r a n g e 0 . 0 5 - 9 . 0
mg/L, even more
s p e c i ? c a l l y 0 . 5 0 - 8 . 0 m g / L .
[ 0 0 4 0 ]
A
a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n i n f a e c e s o f
g r e a t e r
t h a n 1 0 mg/ i l l g e n e r a l l y
b e s t r o n g l y n d i c a t i v e o f o t e n t i a l
f o r CVD r
p r o p e n s i t y
t o
CVD.
hus
a t h r e sh o l d v a l u e above
Which
h e
a s s a y
may
e
h e l d t o
b e
p r e d i c t i v e
o f CVD o t e n t i a l
o r
p r o p e n s i t y
t o
CVD
ay e n e r a l l y b e
a b o u t
9
mg/
,
more
p r e f e r a b l y a b o u t 1 0 . 5 m g / L , e s p e c i a l l y a b o u t
1 1
m g / L .
[ 0 0 4 1 ]
H o W e v e r ,
t h e t h r e s h o l d v a l u e s a r e b e t t e r c a l c u l a t e d
from a l p r o t e c t i n
d e t e r m i n a t i o n s u s i n g
t h e
same a s s a y t e c h
n i q u e s
f o r t h e same body ? u i d s a m p l e
t y p e
f r o m a
r a n g e
o f
p a t i e n t s
o f
s i m i l a r t y p e ( a g e , s e x , W e i g h t , s p e c i e s
e t c . )
f r o m
h e a l t h y
t h r o u g h e a r l y s t a g e
CVD o
s e r i o u s
C V D . Even more
p r e f e r a b l y , t h e t h r e s h o l d v a l u e s W i l l b e v a l u e s
d e t e r m i n e d
f o r
t h e s a m e p a t i e n t a t a n a r l i e r , h e a l t h y s t a g e . T h u s , p a r t i c u l a r l y
a t - r i s k ,
i n d i v i d u a l s c o u l d
m o n i t o r t h e i r
c a l p r o t e c t i n
l e v e l s
on
a r o u t i n e
b a s i s ( e . g .
e v e r y 6-months
o 1
y e a r )
i n
mass s c r e e n
i n g p r o g r a m m e s .
[ 0 0 4 2] I n a p r e f e r r e d
a s s a y
method
f
h e p r e s e n t
i n v e n t i o n ,
s a i d m e t h o d f u r t h e r
c o m p r i s e s
a d d i t i o n a l l y a s s e s s i n g t h e c o n
c e n t r a t i o n o f a n o t h e r
marker f o r p o t e n t i a l t o
CVD n
t h e
s a m p l e
t a k e n
f r o m t h e
s u b j e c t .
E x a m p l e s o f u i t a b l e m a r k e r s
may e h o m o c y s t e i n e , a c t i v a t e d f a c t o r X I I ,
c h o l e s t e r o l ,
c h o
l e s t e r o l z H D L a t i o , ? b r i n o g e n ,
t i s s u e - t y p e p l a s m i n o g e n
a c t i
v a t o r ,
F a c t o r s V ,
V I I a n d
I I I , l i p o p r o t e i n
( a ) ,
von
i l l e b r a n d
f a c t o r a n t i g e n , p l a s m i n - 0 t 2 a n t i p l a s m i n c o m p l e x , p r o t h r o m
b i n , f r a g m e n t 1 + 2 , t h r o m b i n - a n t i t h r o m b i n
I I I
c o m p l e x ,
? b r i n o p e p t i d e A , ? b r i n d e g r a d a t i o n
p r o d u c t s ,
D - d i m e r ,
a c t i
v a t e d p r o t e i n
C - r e s i s t a n c e , f a c t o r V I I c
a n d V I I a , t h r o m b i n ,
serum
a m y l o i d
A ,
v a s c u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e s
and o r o n a r y
c a l c i u m . P r e f er a b l y
t h e s e c o n d m a r k e r
i s
s e l e c t e d from
h o m o c y s t e i n e
o r
C - r e a c t i v e
p r o t e i n .
[ 0 0 4 3 ] More p r e f e r a b l y t h e a s s a y method
o f
t h e p r e s e n t
i n v e n t i o n
f u r t h e r c o m p r i s e s
a d d i t i o n a l l y
a s s e s s i n g
t h e c o n
c e n t r a t i o n
o f C - r e a c t i v e p r o t e i n ( C R P ) i n t h e s a m p l e
t a k e n
f r o m t h e s u b j e c t . P r e f e r a b l y , t h e c o n c e n t r a t i o n
o f
C RP
i s
a s s e s s e d s i m u l t a n e o u s l y o r s e q u e n t i a l l y t o s a i d c a l p r o t e c t i n
a s s a y .
7/27/2019 US20110318847.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/us20110318847pdf 12/21
US 2011/0318847
A 1
[ 0 0 4 4 ] The
measurement f
CRP
ay
e
e f f e c t e d
u s i n g
a n y
s t a n d a r d
i m m u n o a s s a y
t e c h n i q u e
( e . g . E L I S A ,
RIA t c . ) o r
may b e
d e t e r m i n e d
b y
NycoCard® ( a v a i l a b l e f r o m
A x i s
S h i e l d
P o C , O s l o ,
N o r w a y ) .
[ 0 0 4 5 ]
A
a l p r o t e c t i n
c o n c e n t r a t i o n
i n
serum
r
p l a s m a
o f
g r e a t e r t h a n 0 . 7 5
mg/L
n a d d i t i o n
t o
a
CRP
o n c e n t r a t i o n
o f
g r e a t e r t h a n 1 . 7 5 mg/L i l l
g e n e r a l l y b e
v e r y s t r o n g l y i n d i c a
t i v e o f p o t e n t i a l f o r CVD r p r o p e n s i t y t o C V D .
P r e f e r a b l y ,
t h e
p r e s e n c e of
h e above-mentioned o n c e n t r a t i o n s i s more
s t r o n g l y
i n d i c a t i v e
o f
p o t e n t i a l f o r
CVD r p r o p e n s i t y to
CVD h a n a c a l p r o t e c t i n o r
CRP
o n c e n t r a t i o n a l o n e .
[ 0 0 4 6 ]
T h u s t h r e s h o l d v a l u e s
o f
c a l p r o t e c t i n a n d C RP
a b o v e which h e
a s s a y
may
e
h e l d
t o b e h i g h l y
p r e d i c t i v e o f
CVD
o t e n t i a l o r
p r o p e n s i t y
to
CVD
ay e n e r a l l y b e
0 . 3 2
0 . 7 7
mg/L
n d
. 7 0 mg/L
e s p e c t i v e l y , more r e f e r a b l y a b o u t
0 . 6 7 mg/L
a n d 1 . 7 5
mg/L e s p e c t i v e l y ,
s t i l l
more
r e f e r a b l y
a b o u t
0 . 7 0 mg/L
n d
2 . 0 0 mg/L
e s p e c t i v e l y , e s p e c i a l l y a b o u t
0 . 7 6 mg/L
a n d
2 . 2 5 mg/L
e s p e c t i v e l y .
More r e f e r a b l y
t h e
t h r e s h o l d v a l u e s
above
which t h e
a s s a y
may be h e l d t o be
p r e d i c t i v e
o f
p o t e n t i a l f o r o r p r o p e n s i t y
t o
CVD
r e i n t h e
r a n g e ,
0 . 3 0 - 0 . 5 0 mg/L and
. 7 5
mg/L
e s p e c t i v e l y ,
e v e n more
p r e f e r a b l y i n
t h e
r a n g e 0 . 3 2 - 0 . 4 7 mg/L n d 0 . 7 5 mg/L e s p e c
t i v e l y ,
f o r
e x a m p l e a b o u t 0 . 4 5 mg/L a n d 0 . 7 5 mg/L e s p e c
t i v e l y .
[ 0 0 4 7 ] Viewed
from a
f u r t h e r a s p e c t ,
t h e
p r e s e n t i n v e n t i o n
p r o v i d e s an a s s a y k i t
f o r
u s e i n t h e method
f
t h e i n v e n t i o n ,
s a i d k i t
c o m p r i s i n g
r e a g e n t s a n d i n s t r u c t i o n s f o r t h e p e r f o r
mance o f t h e a s s a y
method
and f o r t h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e
r e s u l t s a n d ,
o p t i o n a l l y ,
c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g
r e f e r e n c e
s a m p l e s ,
a n d
o p t i o n a l l y ,
a d e t e c t o r .
P r e f e r a b l y , s a i d
a s s a y k i t
f u r t h e r c o m p r i s e s t h e
r e a g e n t s
a n d i n s t r u c t i o n s f o r d e t e r m i
n a t i o n
o f
CRP
o n c e n t r a t i o n .
[ 0 0 4 8 ]
The
n s t r u c t i o n s
i n t h e k i t may
o r
e x a m p l e
b e
i n t h e
form
of
l a b e l , a
manual
o r an i n s t r u c t i o n l e a ? e t ; however,
t h e y may
n s t e a d t a k e t h e form
of
computer program o r a
d a t a
c a r r i e r , eg
computer
i s k .
[ 0 0 4 9 ] The e t e c t o r ; w h e r e p r e s e n t ,
w i l l
g e n e r a l l y b e o n e
c a p a b l e o f
d e t e c t i n g a r e p o r t e r
s p e c i e s , eg s p e c t r o m e t e r ,
a
n u c l e a r
r a d i a t i o n
d e t e c t o r , a
s c a t t e r e d
l i g h t d e t e c t o r , e t c .
[ 0 0 5 0 ] The e a g e n t s w i l l b e
a g e n t s
s u i t a b l e f o r c a l p r o t e c t i n
d e t e r m i n a t i o n ,
e . g .
s u i t a b l e r e a g e n t s a r e s p e c i ? e d i n t h e l i t
e r a t u r e a s s o c i a t e d
w i t h t h e a v a i l a b l e t e s t s f o r c a l p r o t e c t i n
s u c h s f r o m E u r o s p i t a l ® a n d NycoCard a v a i l a b l e
f r o m A x i s
S h i e l d ASA,
O s l o ,
Norway) c i t e d h e r e i n . The
e a g e n t s
men
t i o n e d
i n
US.
a t .
No.
4 , 8 3 3 , 0 7 4
may
a l s o be s u i t a b l e .
[ 0 0 5 1 ] A a r t i c u l a r l y p r e f e r r e d a s s a y m e t h o d o r a s s e s s i n g
t h e
c o n c e n t r a t i o n
o f
c a l p r o t e c t i n i n
t h e p r e s e n t
i n v e n t i o n i s
a
p a r t i c l e - b a s e d i m m u n o a s s a y . T h i s i s a
s e n s i t i v e
t e c h n i q u e
which
s b a s e d on u r b i d i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f t h e c a l p r o
t e c t i n
c o n c e n t r a t i o n .
T h e s e n s i t i v i t y p r o v i d e d b y
t h e
a s s a y
a d v a n t a g e o u s l y a l l o w s
f o r
t h e
r e l a t i v e l y
l o w
c o n c e n t r a t i o n s
o f a l p r o t e c t i n i n b o d y ? u i d e . g . p l a s m a o r s e r u m ) s a m p l e s o
be
e t e r m i n e d w i t h
a
h i g h l e v e l o f
r e c i s i o n . At h e same
i m e ,
r e l a t i v e l y
h i g h
c o n c e n t r a t i o n s o f
c a l p r o t e c t i n
c a n a l s o b e
measured
i t h a c c u r a c y .
[ 0 0 5 2 ] T u r b i d i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n a l s o h a s
t h e
a d v a n t a g e
t h a t n o
s o l i d
s u r f a c e i s
r e q u i r e d
f o r
p h y s i c a l
s e p a r a t i o n i n t h e
a s s a y and numerous
washing
a n d / o r s e p a r a t i o n s t e p s
a r e
n o t
r e q u i r e d .
T h u s c o m p a r e d
o p r i o r
a r t
t e c h n i q u e s
e .
g . E L I S A ) ,
t h e h o m o g e n o u s t u r b i d m i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f c a l p r o t e c
t i n i s q u i c k
a n d e a s y
t o
p e r f o r m a n d
m a y ,
f o r i n s t a n c e , b e
a u t o m a t e d . Compared
o
a u t o m a t i o n o f n o n - h o m o g e n e o u s
t e c h n i q u e s i n v o l v i n g , f o r
e x a m p l e
a s o l i d s u r f a c e , a u t o m a t i o n
o f
a t u r b i d i m e t r i c
b a s e d
a s s a y
i s r e l a t i v e l y
f a c i l e . A l s o , t h e
D e c . 2 9 , 2 0 1 1
r e s u l t i n g
a u t o m a t e d
homogenous r o c e s s i s
o f t e n
more e l i
a b l e b e i n g l e s s p r o n e ,
f o r
e x a m p l e , t o b r e a k d o w n .
[ 0 0 5 3 ]
A n
u t o m a t e d t u r b i d i m e t r i c a s s a y s
a l s o
f a s t , a l l o w
i n g f o r a h i g h t h r o u g h p u t o f
s a m p l e s ,
a n d s r e l a t i v e l y c h e a p
t o r u n .
T y p i c a l l y i t c a n
be p e r f o r m e d
u s i n g a c o m m e r c i a l l y
a v a i l a b l e r o b o t ,
eg h e Cobas
Mira o r H i t a c h i 7 1 1 , b o t h o f
which a r e a v a i l a b l e from Roche D i a g n o s t i c s . Such an a u t o
m a t e d a s s a y
i s p a r t i c u l a r l y
a t t r a c t i v e
when
o u t i n e
t e s t i n g o f
i n d i v i d u a l s f o r p o t e n t i a l f o r o r p r o p e n s it y to
CVD s e n v i s
a g e d .
[ 0 0 5 4 ]
F o r
t u r b i d i m e t r i c
d e t e r m i n a t i o n o f
a l p r o t e c t i n c o n
c e n t r a t i o n ,
t h e c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g
s a m p l e w i l l g e n e r a l l y
b e
a body ? u i d , e .
g . u r i n e , c e r e b r o s p i n a l
? u i d ,
o r a l
? u i d ,
s y n o v i a l
?uid
r empyema
u i d , o r more
r e f e r a b l y ,
blood
r
a
b l o o d d e r i v e d s a m p l e . W he n h i s
i s
t h e c a s e ,
t h e
s a m p l e u s e d
f o r
a n a l y s i s
w i l l
p r e f e r a b l y b e c e l l - f r e e ( e . g . s e r u m o r p l a s m a )
[ 0 0 5 5 ]
Thus t h e sample may be
r e a t e d
to
remove
any e l l s
a n d / o r a n y s a m p l e c o m p o n e n t s n o t b e i n g
a s s a y e d
f o r . T h e
s a m p l e
may
l s o
be
r e a t e d
to
c o n c e n t r a t e o r
d i l u t e
t h e
sample
o r
t o
t r a n s f e r
t h e c a l p r o t e c t i n t o a s e p a r a t e
medium,
. g . s o l i d
s u b s t r a t e .
F o r i n s t a n c e , t h e s a m p l e may e d i l u t e d
b y a d d i n g
w a t e r ,
a
b u f f e r o r o t h e r , aqueous medium. A l t e r n a t i v e l y ,
a
s a m p l e , p a r t i c u l a r l y
a
serum r plasma s a m p l e , may e u s e d
d i r e c t l y .
[ 0 0 5 6 ]
The s a m p l e i s
o p t i o n a l l y t r e a t e d
w i t h
c a l c i u m o r a
c a l c i u m m i m i c , p r i o r
o
b e i n g u s e d i n t h e
a s s a y met
o l d .
The
c a l c i u m
o r
c a l c i u m
mimic may be
a n y
form which r o v i d e s
C a 2 + i o n s ( e . g . C a C l Z ) . I f c a l c i u m
i s
u s e d
t h e n
p r e f e r a b l y ,
s u f ? c i e n t calcium r calcium mimic
s
added
o
t h e
sample
o
s a t u r a t e
t h e
c a l c i u m
b i n d i n g
s i t e s o f
c a l p r o t e c t i n . F o r
example,
a
t e n molar x c e s s of
calcium
s o u r c e may e d d e d ,
more r e f e r a b l y , a ?ve
molar
e x c e s s
o r
e sp e c i al l y p r e f e r a b l y
a three molar excess.
[ 0 0 5 7 ] O p a c i t y ,
f o r
t u r b i d i m e t r i c
d e t e r m i n a t i o n
o f c a l p r o
t e c t i n c o n c e n t r a t i o n , w i l l
g e n e r a l l y
b e
g e n e r a t e d
b y
c o n t a c t
i n g
t h e c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g s a m p l e ,
d r
a n a l i q u o t
t h e r e o f ,
w i t h a n a n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d y ,
a n t i b o d y f r a g m e n t o r
mix
t u r e of
n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s
(e g
a
m i x t u r e of mono
c l o n a l a n t i b o d i e s ) .
T h e
e g g
p o l y c l o n a l
a n t i - h u m a n c a l p r o t e c
t i n
a n t i b o d y
c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e f r o m N o r w e g i a n
A n t i b o d i e s A S
a y , f o r e x a m p l e , b e u s e d
o
g e n e r a t e o p a c i t y .
Any
n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d y o b t a i n e d , f o r e x a m p l e , b y
a n y
c o n v e n t i o n a l t e c h n i q u e o r
m a k i n g
n t i b o d i e s , may e u s e d
n
t h e method f t h e i n v e n t i o n .
[ 0 0 5 8 ]
The a n t i b o d i e s ,
o r a n t i b o d y f r a g m e n t s , which a r e
used o r t u r b i d i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f c a l p r o t e c t i n
concen
t r a t i o n
p r e f e r a b l y show
no o r l i t t l e c r o s s
r e a c t i o n s with t h e r
b l o o d
p r o t e i n s t h a t may e p r e s e n t i n t h e e l u a t e . The
u a n t i t y
o f
a n t i b o d y , o r a n t i b o d y f r a g m e n t,
u s e d s h o u l d o f
c o u r s e
b e
o p t i m i s e d
a g a i n s t c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g s t a n d a r d s a m p l e s
a s
o p a c i ? c a t i o n
a r i s e s
f r o m t h e
hook
f f e c t w h e r e b y
m u l t i p l e
c a l p r o t e c t i n
b i n d i n g
g e n e r a t e s
t h e o p a c i ? c a t i o n c e n t r e s .
C a l p r o t e c t i n , a s
mentioned
above h a s numerous a n t i b o d y
b i n d i n g
s i t e s ,
a n d
s p a r t i c u l a r l y s u i t a b l e f o r d e t e c t i o n
i n
s u c h
an assay.
[ 0 0 5 9 ]
I n
o n e p r e f e r r e d e m b o d i m e n t , t h e a n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d y , o r a n t i b o d y f r a g m e n t, may
e
i m m o b i l i s e d
b y
b i n d
i n g o r c o u p l i n g , e i t h er d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y , t o a n y w e l l
known
s o l i d
s u p p o r t
o r
m a t r i x
which
s commonly s e d
f o r
i m m o b i l i s a t i o n . P r e f e r a b l y t h e s o l i d
s u p p o r t
o r
m a t r i x
t a k e s
t h e f o r m o f a r t i c l e s ,
p r e f e r a b l y n a n o p a r t i c l e s .
C o n v e n i e n t l y
t h e
s o l i d
s u p p o r t may e made o f g l a s s , s i l i c a , l a t e x , m e t a l
7/27/2019 US20110318847.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/us20110318847pdf 13/21
US 2011/0318847
A 1
( e . g . g o l d )
o r
a
p o l y m e r i c
m a t e r i a l
(eg
o l y e t h y l e n e ) . P r e f
e r a b l y t h e s o l i d s u p p o r t i s
made
f a p o l y m e r i c m a t e r i a l
s u c h
a s p o l y e t h y l e n e .
[ 0 0 6 0 ]
B i n d i n g
o r
i m m o b i l i s a t i o n o f
t h e a n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d y
o r
a n t i b o d y
f r a g m e n t
may
b e
a c h i e v e d u s i n g
a n y
c o n v e n t i o n a l
t e c h n i q u e .
F o r
e x a m p l e , a v i d i n
( a v a i l a b l e
f r o m
P i e r c e Chemical Company) may be
m m o b i l i s e d
on chlorom
e t h y l a c t i v a t e d
p o l y s t y r e n e
n a n o p a r t i c l e s ( a v a i l a b l e f r o m
I n t e r f a c i a l
D y n a m i c
C o r p o r a t i o n ,
U S )
b y a g i t a t i o n i n b u f f e r
(eg
a t
room t e m p e r a t u r e f o r 2 4 h o u r s ) a n d t h e n
u s e d
i n
c o n j u n c t i o n
W i t h
b i o t i n
l a b e l l e d
a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s
( p r e p a r e d a c c o r d i n g t o c o n v e n t i o n a l t e c h n i q u e s
i n
t h e
a r t ) .
T h u s , f o r
e x a m p l e ,
p l a s m a t a k e n
f r o m
t h e
s u b j e c t o
b e t e s t e d
f o r p o t e n t i a l
f o r ,
o r p r o p e n s it y
t o , CVD s
added o a s o l u t i o n
of v i d i n - c o a t e d n a n o p a r t i c l e s i n a q u a r t z c u v e t t e of s p e c
t r o p h o t o m e t e r ,
f o l l o W e d
b y t h e
a d d i t i o n o f
b i o t i n l a b e l l e d
a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d y . T u r b i d i m e t r i c r ea d i n g s a r e
t h e n
t a k e n .
[ 0 0 6 1 ]
A l t e r n a t i v e l y , t h e b i o t i n l a b e l l e d a n t i b o d i e s
may
e
added p r i o r t o
t h e a d d i t i o n
of plasma o r
s e r u m .
I n o t h e r
W o r d s ,
W h i l s t t h e
same e a g e n t s
a r e t y p i c a l l y
u s e d
r e g a r d l e s s
o f
t h e
i n s t r u m e n t
u s e d
f o r t u r b i d i t y d e t e c t i o n ,
t h e p r e c i s e
sequence
i n Which h e v a r i o u s r e a g e n t s a r e added
may a r y .
G e n e r a l l y , t h e
s e q u e n c e
u s e d s h o u l d
b e
i n
a c c o r d a n c e W i t h
t h e i n s t r u c t i o n s a c c o m p a n y i n g t h e
s p e c t r o p h o t o m e t e r
u s e d
(eg
a ShimadZu UV-160 s p e c t r o p h o t o m e t e r ) .
[ 0 0 6 2 ]
T u r b i d i m e t r i c r e a d i n g s
a r e
made ( i . e .
t h e
l i g h t
a b s o r p t i o n
a t a s u i t a b l e W a v e l e n g t h i s measured a t r e g u l a r
i n t e r v a l s )
a n d
t h e l i g h t
a b s o r p t i o n
r e l a t i v e t o a r e f e r e n c e i s
d e t e r m i n e d .
O p t i o n a l l y , m u l t i p l e
W a v e l e n g t h
i n s t r u m e n t s
may e u s e d t o make u r b i d i m e t r i c r e a d i n g s and may r o v i d e
more r e c i s e
r e s u l t s .
S u i t a b l e i n s t r u m e n t s
f o r
t a k i n g t u r b i d i
m e tr i c r e a d i n g s
i n c l u d e
t h e
C o b a s
M i r a , R o c h e I n t e g r a a n d
M e r c k ’ s T u r b i q u a n t .
[ 0 0 6 3 ] I n
a n a l t e r n a t i v e e x p e r i m e n t a l
s e t - u p ,
t h e a n t i
c a i p r o t e c t i n
a n t i b o d y , o r
a n t i b o d y
f r a g m e n t , may
e
immo
b i l i s e d
d i r e c t l y
o n
c h l o r o m e t h y l a c t i v a t e d
n a n o p a r t i c l e s
( a v a i l a b l e f r o m I n t e r f a c i a l D y n a m i c C o r p o r a t i o n , U S ) . F o r
i n s t a n c e , a n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d y (eg
h e e g g
p o l y c l o n a l
a n t i b o d y
a v a i l a b l e f r o m
N o r w e g i a n A n t i b o d i e s AS)
may e
mixed
W i t h
t h e a b o v e - m e n t i o n e d a c t i v a t e d p a r t i c l e s i n a
b u f f e r ( 1 0 mM
o r a t e ,
1 5 mM
o d i u m c h l o r i d e , pH
. 0 ) a n d
a g i t a t e d
(eg
a t
room
t e m p e r a t u r e f o r 2 4
h o u r s )
t o f u r n i s h
a n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d y - c o a t e d
n a n o p a r t i c l e s .
S u c h
n a n o
p a r t i c l e s may b e u s e d f o r t u r b i d i m e t r i c
d e t e r m i n a t i o n
o f
c a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n
b y
a d d i n g
them o a s a m p l e o f
plasma
o r
s e r u m , t a k e n from t h e s u b j e c t
to
be t e s t e d f o r
p o t e n t i a l
f o r , o r p r o p e n s i t y t o C V D , i n a b u f f e r a n d t a k i n g
t u r b i d i m e t r i c
r e a d i n g s i n k i n e t i c
m o d e .
[ 0 0 6 4 ]
A l t e r n a t i v e l y , t h e plasma
r serum
may be added o
t h e
a n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d y - c o a t e d
n a n o p a r t i c l e s .
I n o t h e r
W o r d s , W h i l s t t h e same e a g e n t s
a r e t y p i c a l l y
u s e d r e g a r d l e s s
o f t h e i n s t r u m e n t u s e d f o r
t u r b i d i t y
d e t e c t i o n , t h e p r e c i s e
sequence i n Which h e v a r i o u s r e a g e n t s a r e added may a r y .
G e n e r a l l y , t h e
s e q u e n c e u s e d s h o u l d b e
i n
a c c o r d a n c e W i t h
t h e i n s t r u c t i o n s a c c o m p a n y i n g t h e
s p e c t r o p h o t o m e t e r
u s e d
(eg
a ShimadZu UV-160 s p e c t r o p h o t o m e t e r ) .
[ 0 0 6 5 ]
Examples
o f a u t o m a t e d r o b o t s Which
a r e
s u i t a b l e
f o r
t a k i n g t u r b i d i m e t r i c r e a d i n g s
i n
a c c o r d a n c e W i t h t h e a s s a y
method
f
t h e i n v e n t i o n i n c l u d e t h e
Cobas
Mira and H i t a c h i
7 1 1 , b o t h
o f
Which a r e a v a i l a b l e
from
Roche i a g n o s t i c s .
[ 0 0 6 6 ] The p a r t i c l e s t o W h i c h t h e a n t i b o d y , o r a n t i b o d y
f r a g m e n t ,
may
e bound a r e t y p i c a l l y s p h e r i c a l . The i Z e o f
t h e p a r t i c l e s u s e d i n t h e a s s a y
may
f f e c t t h e p r e c i s i o n
W i t h
D e c . 2 9 , 2 0 1 1
Which t h e
c a l p r o t e c t i n
c o n c e n t r a t i o n i s
m e a s u r e d .
W h i l s t
l a r g e r p a r t i c l e s
a l l o W
f o r
l o W e r c o n c e n t r a t i o n s o f
a l p r o t e c t i n
t o be e t e c e d , t h e i r reduced u r f a c e a r e a means h a t t h e y
have
a l o W e r
b i n d i n g
c a p a c i t y . F o r
e x a m p l e , d o u b l i n g
t h e p a r t i c l e
d i a m e t e r , h a l v e s t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f a
mass
u n i t
o f p a r
t i c l e s .
[ 0 0 6 7 ] A d d i t i o n a l l y i n c r e a s i n g
t h e
p a r t i c l e
d i a m e t e r
i n c r e a s e s t h e l e v e l o f
b a c k g r o u n d
l i g h t a b s o r b a n c e
a n d
l i g h t
s u s p e n s i o n a t t h e
W a v e l e n g t h s
t y p i c a l l y u s e d i n s u c h a s s a y s
(eg
3 3 0
o
6 0 0
n m ) .
T h u s W h i l s t l a r g e r
p a r t i c l e s
i n c r e a s e t h e
s e n s i t i v i t y o f
t h e
a s s a y , t h i s may b e a c c o m p a n i e d
by some
l o s s o f a c c u r a c y
and
n
p a r t i c u l a r ,
an n c r e a s e
i n
t h e number f
f a l s e
n e g a t i v e
e s u l t s
o b t a i n e d .
T h i s
i s
p a r t i c u l a r l y l i k e l y
t o b e
t h e c a s e W i t h s a m p l e s c o n t a i n i n g
r e l a t i v e l y
h i g h c a l p r o t e c t i n
c o n c e n t r a t i o n s ( i . e . t h o s e s a m p l e s o b t a i n e d
f r o m i n d i v i d u a l s
W i t h
a
h i g h
p o t e n t i a l
f o r o r p r o p e n s i t y t o
CV D )
h e r e i n t h e
n a n o p a r t i c l e - b o u n d
b i n d i n g s i t e s
may become
s a t u r a t e d
W i t h o u t
a l l
o f t h e c a l p r o t e c t i n b e c o m i n g
b o u n d .
[ 0 0 6 8 ] T h e s e c o u n t e r - a c t i n g e f f e c t s a s s o c i a t e d W i t h c h a n g
i n g
t h e
p a r t i c l e s i z e
(eg
n c r e a s i n g
t h e
p a r t i c l e s i Z e
i n c r e a s e s
s e n s i t i v i t y
b u t d e c r e a s es a c c u r a c y )
r e p r e s e n t s a
s i g n i ? c a n t
problem
to be
overcome
i n t h e
development
o f a
s e n s i t i v e
a s s a y
f o r
d e t e c t i n g t h e
r a n g e o f e v e l s
o f c a l p r o t e c t i n
p r e s e n t
i n b o d y ? u i d s .
[ 0 0 6 9 ] A l s o i t i s p r e f e r a b l e i n t h e
a s s a y
method o f t h e
i n v e n t i o n
t h a t t h e p a r t i c l e s used a l l o W f o r a Wide r a n g e o f
c a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n s t o b e d e t e r m i n e d W i t h p r e c i s i o n .
T h i s may mean
h a t a
high
e v e l
of
con?dence
can be
a t t r i b
u t e d
t o
b o t h
a n e g a t i v e
r e s u l t ( i . e .
a
c o n c e n t r a t i o n
f a l l i n g
beloW t h e
t h r e s h o l d
v a l u e )
a s
W e l l
a s
a
p o s i t i v e
r e s u l t
I t
i s
p a r t i c u l a r l y
p r e f e r r e d
i n
t h e a s s a y method
o f
t h e i n v e n t i o n
t h a t
s a m p l e s h a v i n g
a
c a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n
i n t h e
r a n g e
0 . 5 - 5 0 mg/L e . g . 1 - 4 0
m g / L )
c a n
b e m e a s u r e d .
[ 0 0 7 0 ]
The
p a r t i c l e s t o W h i c h
t h e a n t i b o d y , o r
a n t i b o d y
f r a g m e n t ,
may e
bound
r e t y p i c a l l y s p h e r i c a l
W i t h
a diam
e t e r
of
1-150
nm,
f o r example 10-90 nm r 15-60
nm, f o r
i n s t a n c e ,
44
nm. I n
a
p a r t i c u l a r l y p r e f e r r e d
a s s a y method o f
t h e i n v e n t i o n t h e p a r t i c l e s t o Which h e a n t i b o d y o r a n t i b o d y
fragments a r e
bound have
a diameter of 55-140 nm, more
p r e f e r a b l y
6 5 - 1 1 0
nm, f o r
e x a m p l e , 7 0 - 9 0
nm.
[ 0 0 7 1 ]
A l t e r n a t i v e l y t h e
d i a m e t e r
o f t h e p a r t i c l e s c a n b e
measured once
n t i b o d i e s
o r
a n t i b o d y
fragments a r e bound o
t h e i r s u r f a c e . I n t h i s
c a s e , t h e
d i a m e t e r o f
t h e
a n t i b o d y o r
a n t i b o d y
f r a g m e n t
c o a t e d
p a r t i c l e s
i s p r e f e r a b l y 6 5 - 1 4 0 n m ,
more
r e f e r a b l y 75-120 nm, t i l l
more
r e f e r a b l y 80-100 nm.
C o a t e d
p a r t i c l e s
o f
t h e s e
s i Z e s a r e e s p e c i a l l y
p r e f e r r e d
When
t h e
s a m p l e
t e s t e d i s p l a s m a .
[ 0 0 7 2 ] The a r t i c l e s ,
i n
b o t h t h e
“ n u d e ”
a n d c o a t e d
s t a t e s ,
p r e f e r a b l y
have
a d i a m e t e r Which d o e s n o t i t s e l f e n a b l e
a b s o r p t i o n o f h e W a v e l e n g t h o f i g h t u s e d
f o r
s p e c t r o p h o t o
m e t r i c
d e t e r m i n a t i o n .
Thus
t h e
s u s p e n s i o n
o f
c o a t e d
nano
p a r t i c l e s i s a p p r o x i m a t e l y
( e . g .
s u b s t a n t i a l l y )
t r a n s p a r e n t
u n t i l c a l p r o t e c t i n i n d u c e d a g g r e g a t e
f o r m a t i o n
o c c u r s r e s u l t
i n g i n
t h e
f o r m a t i o n o f a g g r e g a t e s h a v i n g
a
l a r g e r
d i a m e t e r .
S u c h a g g r e g a t e s
h a v e
t h e a b i l i t y
t o
a b s o r b t h e
W a v e l e n g t h
o f
l i g h t u s e d
b y
t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r .
[ 0 0 7 3 ]
F u r t h e r , t h e
p a r t i c l e s a r e p r e f e r a b l y s u b s t a n t i a l l y
a l l
of h e
same
i Z e ,
more s p e c i ? c a l l y
a l l of h e
same
d i a m e t e r .
P r e f e r a b l y , m o n o d i s p e r s e
m e t a l
( e . g . g o l d ) o r p o l y m e r p a r
t i c l e s a r e u s e d .
M o n o d i s p e r s e
polymer a r t i c l e s a r e a v a i l a b l e
f r o m
D y n a l
B i o t e c h A S , O s l o ,
N o r w a y .
[ 0 0 7 4 ] W h i l s t n o t W i s h i n g o b e bound by h e o r y , i t
may
e
t h a t t h e u s e o f
i m m o b i l i s e d
a n t i b o d y o r
a n t i b o d y
f r a g m e n t s
i n c r e a s es t h e
s e n s i t i v i t y o f
t h e a s s a y b y
i n c r e a s i n g t h e s i Z e o f
7/27/2019 US20110318847.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/us20110318847pdf 14/21
US 2011/0318847
A 1
a n y c a l p r o t e c t i n d e r i v e d
o p a c i t y
g e n e r a t i n g s i t e s a n d
t h e r e
f o r e t h e
amount
f i g h t s c a t t e r e d t h e r e f r o m . By
s i n g
a s o l i d
s u p p o r t o r m a t r i x
( e . g .
n a n o p a r t i c l e s )
W h i c h
s s u b s t a n t i a l l y
a l l
o f t h e
same
s i Z e
i t
may
be t h a t t h e s e n s i t i v i t y
o f
t h e
t u r b i d i m e t r y
a s s a y
i s
f u r t h e r i n c r e a s e d .
[ 0 0 7 5 ]
As i s
r o u t i n e
i n
t u r b i d i m e t r i c a s s a y s , a p o l y m e r i c
o p a c i ? c a t i o n
e n h a n c e r , s u c h a s p o l y e t h y l e n e g l y c o l , i s p r e f
e r a b l y a l s o a d d e d t o t h e e l u a t e .
[ 0 0 7 6 ]
B e f o r e
t h e t u r b i d i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n
i s m a d e ,
t h e
f r a c t i o n , a n t i b o d y o r a n t i b o d y f r a g m e n t , p r e f er a b l y
b o u n d
o
a n a n o p a r t i c l e , and p t i o n a l l y
e n h a n c e r may e i n c u b a t e d f o r
a s h o r t p e r i o d , eg m i n u t e s t o
a n
h o u r ,
p r e f e r a b l y a b o u t 1 0
m i n u t e s ,
a t
room
t e m p e r a t u r e .
O p t i o n a l l y ,
i n d e t e r m i n i n g
c a l p r o t e c t i n
c o n c e n t r a t i o n
u s i n g t h e
t u r b i d i m e t r y
t e c h n i q u e ,
a k i n e t i c r e a d i n g
mode
may
be
s e d .
[ 0 0 7 7 ] The i g h t u s e d
i n
t h e d e t e r m i n a t i o n
o f
o p a c i ? c a t i o n
s h o u l d h a v e
a n a p p r o p r i a t e
W a v e l e n g t h ,
f o r e x a m p l e , 3 0 0 - 6 0 0
nm. n
t h i s regard t
W a s found h a t use
of 300-450 nm l t e r ,
p r e f e r a b l y a 340 nm
r
a
405
mm l t e r , fumished a r t i c u l a r l y
good
e s u l t s .
Use
f a
560
nm
l t e r
may
l s o
y i e l d
e s p e c i a l l y
g o o d r e s u l t s .
[ 0 0 7 8 ]
I n g e n e r a l , i n
a d d i t i o n
t o t h e
s a m p l e u n d e r
e v a l u a
t i o n c a l i b r a t i o n s a m p l e s W i t h knoWn c a l p r o t e c t i n
c o n t e n t s
W i l l a l s o b e a s s e s s e d i n
t h e p e r f o r m a n c e
o f
t h e
a s s a y m e t h o d .
Such
d e t e r m i n a t i o n s can be used t o
p l o t
a
c a l i b r a t i o n curve
f r o m W h i c h t h e c a l p r o t e c t i n
c o n t e n t
o f t h e
s a m p l e
u n d e r
e v a l u a t i o n c a n b e d e t e r m i n e d . P r e f e r a b l y
c a l i b r a t i o n
s a m p l e s
h a v i n g
c a l p r o t e c t i n c o n t e n t s
o f u p t o 5 0 0 0 mg/L (eg 1 5 0 0 ,
1 0 0 0 , 7 5 0 , 2 5 0 , 1 0 0 ) o r u p o 1 0 0 mg/L (eg 5 , 5 0 , 2 5 , 5 , 1 . 0
a n d
0 . 5
mg/L)
W i l l b e
u s e d . More r e f e r a b l y t h e
c a l i b r a t i o n
s a m p l e s h a v e a c a l p r o t e c t i n c o n t e n t
o f p
t o
1 0
mg/L e . g . 1 0 ,
8 , 6 , 4 ,
2 m g / L ) , s t i l l m o r e p r e f e r a b l y u p t o 5 mg/L
5 ,
4 . 5 , 4 ,
3 . 5 ,
3 ,
2 . 5 ,
2 , 1 . 5 , 1 , 0 . 5
m g / L ) .
[ 0 0 7 9 ] The a b o v e d e s c r i b e d
t u r b i d i m e t r i c
a s s a y
f o r t h e
d e t e r m i n a t i o n
o f
c a l p r o t e c t i n
i s
s u r p r i s i n g l y
r e l i a b l e ,
q u i c k ,
c h e a p ,
f a c i l e and
amenable
o
a u t o m a t i o n .
T h i s i s
i n c o n t r a s t
to
t h e c u r r e n t l y a v a i l ab l e a s s a y methods
Which
r e r e l a t i v e l y
complex
a n d
a r e
n o t
d i r e c t l y
a p p l i c a b l e t o
t h e
a u t o m a t e d
m u l t i - t a s k d i a g n o s t i c m a c h i n e s c o m m o n l y u s e d
b y
d i a g n o s
t i c
l a b o r a t o r i e s .
[ 0 0 8 0 ] Automation
s
p a r t i c u l a r l y d e s i r a b l e Where
numer
o u s
m i x i n g , a d d i t i o n a n d / o r
d i l u t i o n s t e p s ar e
i n v o l v e d s i n c e
t h e s e may b e a c h i e v e d W i t h a
h i g h e r d e g r e e o f
a c c u r a c y .
R o b o t s may a l s o o f f e r a h i g h e r l e v e l o f
r e l i a b i l i t y
a n d / o r
r e p r o d u c i b i l i t y . A u t o m a t i o n a l s o i n c r e a s e s t h r o u g h p u t .
[ 0 0 8 1 ]
The c u r r e n t l y a v a i l a b l e a s s a y m e t h o d s W h i c h
may
o f f e r r e a s o n a b l e
l e v e l s
o f
p r e c i s i o n ( e . g . ELISA) r e ,
hoW
e v e r ,
d i ? i c u l t t o a u t o m a t e . T h i s
i s a t
l e a s t i n p a r t
b e c a u s e
t h e y
t y p i c a l l y
i n v o l v e
n u m e r o u s W a s h i n g
a n d s e p a r a t i o n
s t e p s
( e . g .
a t t a c h m e n t
t o
a
s o l i d s u r f a c e )
and
a u t o m a t i o n o f
non
homogeneous r o c e s s e s i s o f t e n p r o b l e m a t i c . A l s o
t h e s e p r o
c e s s e s t y p i c a l l y
i n v o l v e
a r e l a t i v e l y l a r g e
number
o f s t e p s
W h i c h
i n c r e a s es t h e
c o m p l e x i t y o f a n y a u t o m a t e d p r o t o c o l .
O t h e r c o n v e n t i o n a l t e c h n i q u e s f o r d e t e r m i n a t i o n o f
c a l p r o
t e c t i n ( e . g . n e p h e l o m e t r y ) o f f e r h i g h p r e c i s i o n b u t
r e q u i r e
s p e c i a l e q u i p m e n t to
c a r r y o u t th e
n e c e s s a r y m e a s u r e m e n t s .
S p e c i a l i s e d
e q u i p m e n t
i s
n o t
t y p i c a l l y
e a s y t o i n c o r p o r a t e
i n t o
a n
automated r o t o c o l .
[ 0 0 8 2 ]
I n d e e d
t h e r e
s
a
c o n t i n u i n g n e e d o r c h e a p , r e l i a b l e ,
q u i c k a n d f a c i l e c a l p r o t e c t i n a s s a y s f o r u s e i n d i a g n o s t i c
t e c h n i q u e s .
[ 0 0 8 3 ]
T h u s , a c c o r d i n g t o a f u r t h e r a s p e c t , t h e p r e s e n t
i n v e n t i o n p r o v i d e s
an
a s s a y method o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f
D e c . 2 9 , 2 0 1 1
c a l p r o t e c t i n i n a
c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g
b o d y ? u i d , s a i d
m e t h o d
c o m p r i s i n g t h e s t e p s
o f :
[ 0 0 8 4 ] ( a ) o b t a i n i n g a c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g l i q u i d
s a m p l e o f ,
o r
d e r i v e d f r o m , s a i d ? u i d ;
[ 0 0 8 5 ]
( b )
c o n t a c t i n g
s a i d
s a m p l e o f
s a i d
b o d y
? u i d
W i t h
a n , o p t i o n a l l y n a n o p a r t i c l e - b o u n d , a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d y
o r a n t i b o d y f r a g m e n t , t o b i n d s a i d c a l p r o t e c t i n ;
[ 0 0 8 6 ]
( c )
o p t i o n a l l y , a d d i n g a n o p a c i t y e n h a n c e r ;
a n d
[ 0 0 8 7 ]
( d )
a s s e s s i n g t h e c a l p r o t e c t i n c o n t e n t b y
t u r b i d i m
e t r y .
[ 0 0 8 8 ] Such a s
a s s a y may b e
u s e f u l
i n
t h e d i a g n o s i s
o f
v a r i o u s d i s e a s e
c o n d i t i o n s
Which r e c h a r a c t e r i s e d by b n o r
m a l l e v e l s
( e . g .
h i g h l e v e l s ) o f
c a l p r o t e c t i n .
S u c h d i s e a s e
c o n d i t i o n s i n c l u d e : r h e u m a t i c d i s e a s e s (eg r h e u m a t o i d
a r t h r i t i s , j u v e n i l e
r h e u m a t o i d
r t h r i t i s , s y s t e m i c
l u p u s
e r y t h e
m a t o u s ) , S j o g r e n s
s y n d r o m e ,
i n t r a o c u l a r i n ? a m m a t o r y c o n
d i t i o n s ,
c y s t i c ? b r o s i s , a c u t e a n d c h r o n i c
l u n g d i s e a s e ,
l u n g
c a r c i n o m a
( s q u a m o u s
c e l l s ) , p u l m o n a r y
c a n c e r s ,
c o l o r e c t a l
c a n c e r , i n ? a m m a t o r y
b o W e l
d i s e a s e ,
g a s t r i c c a n c e r , c o l o r e c
t a l
adenoma
o r ’ c a n c e r ,
C r o h n ’ s
d i s e a s e , u l c e r a t i v e
c o l i t i s ,
g a s t r o i n t e s t i n a l m u c o s a l i n ? a m m a t i o n ,
u r i n a r y
s t o n e s , a l c o
h o l i c
l i v e r d i s e a s e ,
o r a l
i n ? a m m a t o r y
m u c o s a l
d i s e a s e , C NS
i n ? a m m a t o r y
d i s e a s e (eg m u l t i p l e s c l e r o s i s a n d a c u t e
e n c e p h a l i t i s ) , HIV
n f e c t i o n , s e c o n d a r y CNS
i n f e c t i o n s
i n
HIV
n f e c t e d p a t i e n t s ,
u r i n a r y
t r a c t
i n f e c t i o n s ,
c y s t i t i s , p y e l o
n e p h r i t i s , e n d o g e n o u s p o s t e r i o r u v e i t i s , h a e m a t o l o g i c a l c o n
d i t i o n s ( e . g .
l e u k a e m i a ) , f e b r i l e c o n d i t i o n s
( i n f e c t i o u s
a n d
n o n - i n f e c t i o u s ) ,
a c u t e
m y o c a r d i a l
i n f a r c t i o n a n d a p h e r e s i s .
[ 0 0 8 9 ] Thus vieWed from
a
f u r t h e r a s p e c t
t h e
i n v e n t i o n
p r o v i d e s
a
method o f
d i a g n o s i s o f a n y
o f
t h e above-men
t i o n e d d i s e a s e s , c o m p r i s i n g t h e method s
d e s c r i b e d
h e r e i n
b e f o r e f o l l o W e d b y
c o m p a r i s o n
o f s a i d c a l p r o t e c t i n c o n t e n t
W i t h
a
p r e d e t e r m i n e d
t h r e s h o l d
v a l u e .
The t h r e s h o l d v a l u e
i n d i c a t i v e o f a n y p a r t i c u l a r
d i s e a s e
s t a t e may e d e t e r m i n e d
by a n y
c o n v e n t i o n a l method
knoWn
n
t h e a r t . P r e f e r a b l y t h e
method s
u s e d f o r t h e
d i a g n o s i s o f
C V D .
[ 0 0 9 0 ]
A
o d y s a m p l e u s e d i n t h e t u r b i d i m e t r i c
a s s a y
method may b e a n y
c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g
s a m p l e , eg
a
body
? u i d o r t i s s u e s a m p l e , o r a s u s p e n s i o n e t c . P r e f e r a b l y ,
t h e s a m p l e i l l b e a b o d y u i d , e . g .
u r i n e , c e r e b r o s p i n a l
? u i d ,
o r a l ? u i d , s y n o v i a l ? u i d o r
empyema
? u i d , o r more p r e f e r
a b l y ,
blood o r a blood
e r i v e d
s a m p l e . When h i s i s
t h e c a s e
( i . e .
b l o o d
o r b l o o d d e r i v e d s a m p l e i s u s e d ) , t h e s a m p l e
u s e d
f o r
a n a l y s i s
W i l l p r e f e r a b l y b e c e l l - f r e e
( e . g .
serum o r
p l a s m a ) . A l t e r n a t i v e l y f a e c e s may e u s e d .
[ 0 0 9 1 ]
P r e f e r a b l y ,
t h e b o d y
s a m p l e i s
s e l e c t e d
t o p r o v i d e
t h e m o s t s e n s i t i v e i n d i c a t i o n o f
t h e d i s e a s e b e i n g
d i a g n o s e d .
Thus
W h i l s t b l o o d , p l a s m a o r
serum
i g h t
b e t e s t e d
t o d i a g
n o s e i n f e c t i o n s ( e . g . H I V , b a c t e r i a l i n f e c t i o n ) , r h e u m a t i c d i s
e a s e , l e u k a e m i a e t c . , f a e c e s
m i g h t
b e t e s t e d d u r i n g d i a g n o s i s
o f
d i s e a s e s a s s o c i a t e d
W i t h
t h e
g a s t r o i n t e s t i n a l
t r a c t ( e . g .
C r o h n ’ s d i s e a s e , u l c e r a t i v e c o l i t i s , c o l o r e c t a l c a n c e r s ) .
[ 0 0 9 2 ] VieWed
from
e t a f u r t h e r a s p e c t , t h e i n v e n t i o n
p r o
v i d e s
a
k i t f o r
a
d i a g n o s t i c
t u r b i d i m e t r i c
a s sa y a c c o r d i n g t o
t h e i n v e n t i o n , s a i d
k i t
c o m p r i s i n g :
[ 0 0 9 3 ] p r e f e r a b l y ,
a
c a l p r o t e c t i n
s o l u t i o n
o f knoWn o n c e n
t r a t i o n
and
more r e f e r a b l y a set of such
s o l u t i o n s
having a
r a n g e o f a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n s ;
[ 0 0 9 4 ] one r more n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d i e s o r
a n t i b o d y
f r a g m e n t s , o p t i o n a l l y i m m o b i l i s e d on a
s o l i d
s u p p o r t
(eg
n a n o p a r t i c l e s ) ;
[ 0 0 9 5 ]
p r e f e r a b l y ,
a
l i g h t
t r a n s m i t t i n g v e s s e l ;
[ 0 0 9 6 ]
p r e f e r a b l y ,
a n o p a c i ? c a t i o n
e n h a n c e r ;
a n d
[ 0 0 9 7 ]
p r e f e r a b l y ,
a d e t e c t o r .
7/27/2019 US20110318847.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/us20110318847pdf 15/21
US 2011/0318847
A 1
[ 0 0 9 8 ] I f d e s i r e d a n a u t o m a t e d
a p p a r a t u s
may e a r r a n g e d
t o
r e c e i v e
a c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g
b o d y
? u i d s a m p l e , a p p l y
t h e a n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d y
o r a n t i b o d y
f r a g m e n t , o p t i o n
a l l y
i m m o b i l i s e d
on
a
s o l i d s u p p o r t
( e . g . n a n o p a r t i c l e s ) ,
o p t i o n a l l y
a p p l y
a n
o p a c i ? c a t i o n
e n h a n c e r ,
a n d
a s se s s c a l p r o
t e c ti n c o n t e n t . Such an
p p a r a t u s i s
a l s o deemed o f a l l W i t h i n
t h e s c o p e o f t h e
i n v e n t i o n .
[ 0 0 9 9 ] The i n v e n t i o n W i l l
noW b e
d e s c r i b e d
f u r t h e r W i t h
r e f e r e n c e
t o
t h e
f o l l o w i n g n o n - l i m i ti n g
E x a m p l e s a n d t h e
a c c o m p a n y i n g ? g u r e s
i n
W h i c h :
[ 0 1 0 0 ] F I G . 1 i s
t h e d i s t r i b u t i o n
c u r v e f o r c a l p r o t e c t i n i n
t h e
200
s u b j e c t s t e s t e d . The summary t a t i s t i c s f o r F I G . 1 a r e :
[ 0 1 0 1 ] A n d e r s o n - D a r l i n g N o r m a l i t y
T e s t
A 2 : 8 . 1 6 0
P - v a l u e : 0 . 0 0 0
M ea n
0 . 4 0 3
S t a n d a r d D e v i a t i o n 0 . 2 3 8
V a r i a n c e 0 . 0 5 7
SkeWness 1 . 6 7 9
K u r t o s i s 3 . 3 0 2
N
199
Minimum
0 . 0 7 0
1 s t Q u a r t i l e
0 . 2 4 0
Median
0 . 3 4 0
3 r d
Q u a r t i l e 0 . 5 0 0
Maximum 1 . 3 7 0
95
con?dence i m i t f o r Mu
0 . 3 7 0
0 . 4 3 6
9 5% con?dence i m i t f o r Sigma 0 . 2 1 7
0 . 2 6 4
95
con?dence i m i t f o r
Median 0 . 3 1 0
0 . 3 7 0
[ 0 1 0 2 ]
FIG. 2 i s
t h e d i s t r i b u t i o n c u r v e f o r
calcium
s c o r e i n
t h e
200 s u b j e c t s t e s t e d . The summary t a t i s t i c s f o r F I G .
2
a r e
[ 0 1 0 3 ]
A n d e r s o n - D a r l i n g N o r m a l i t y
T e s t
A 2 :
2 5 . 0 3 7
P - v a l u e : 0 . 0 0 0
M ea n
217.060
S t a n d a r d D e v i a t i o n 399.000
V a r i a n c e 159201
SkeWness 3 . 4 6 2
K u r t o s i s 1 5 . 3 4 1
N 200
Minimum 0 . 0 0
1 s t Q u a r t i l e 0 . 0 0
Median 7 8 . 0 0
3 r d Q u a r t i l e 2 5 9 . 2 5
Maximum 2794.00
95
con?dence i m i t f o r Mu
1 6 1 . 4 2
272.70
9 5%
con?dence
i m i t
f o r
Sigma
3 6 3 . 3 5
442.46
95
con?dence i m i t
f o r
Median 0 . 0 0
1 1 7 . 3 3
[ 0 1 0 4 ]
F I G .
3
i s
t h e d i s t r i b u t i o n c u r v e f o r
hsCRP n
t h e 200
s u b j e c t s t e s t e d .
The summary t a t i s t i c s f o r
F I G .
3 a r e :
[ 0 1 0 5 ] A n d e r s o n - D a r l i n g N o r m a l i t y
T e s t
A 2 :
2 1 . 2 2 1
P - v a l u e : 0 . 0 0 0
M ea n 2 . 3 3 1
D e c . 2 9 , 2 0 1 1
- c o n t i n u e d
S t a n d a r d D e v i a t i o n 2 . 9 7 0
V a r i a n c e
8 . 8 1 9
SkeWness
2 . 2 4 3
K u r t o s i s 5 . 1 0 3
N 197
Minimum 0 . 1 5 0
1 s t
Q u a r t i l e
0 . 5 4 0
Median 1 . 1 5 0
3 r d
Q u a r t i l e 2 . 5
8 0
Maximum 1 6 . 3 0
95
con?dence i m i t f o r Mu
1 . 9 1 3
2 . 7 4 8
95% con?dence i m i t
f o r Sigma
2 . 7 0 3
3 . 2 9 6
95
con?dence i m i t f o r
Median 0 . 9 3 3
1 . 3 7 5
[ 0 1 0 6 ]
F I G . 4 i s
t h e d i s t r i b u t i o n
c u r v e
f o r
h o m o c y s t e i n e i n
t h e 200
u b j e c t s t e s t e d . The summary t a t i s t i c s f o r F I G .
4
a r e :
[ 0 1 0 7 ]
A n d e r s o n - D a r l i n g N o r m a l i t y
T e s t
A 2 : 2 . 5 3 5
P - v a l u e : 0 . 0 0 0
M ea n 8 . 3 9 1
S t a n d a r d D e v i a t i o n
1 . 9 6 6
V a r i a n c e 3 . 8 6 7
SkeWness
0 . 8 7 5
K u r t o s i s 0 . 7 3 0
N 1 9 9
Minimum 5 . 1 0 0
1 s t Q u a r t i l e
7 . 1 0 0
Median 8 . 1 0 0
3 r d Q u a r t i l e 9 . 6 0 0
Maximum
1 5 . 3 0 0
95
con?dence i m i t f o r Mu 8 . 1 1 7
8 . 6 6 6
95%
con?dence
i m i t
f o r
Sigma
1 . 7 9 0
2 . 1 8 1
95
con?dence i m i t f o r Median 7 . 6 2 0
8 . 4 0 0
[ 0 1 0 8 ] F I G .
5
i s a d o t
p l o t
f o r t h e d i s t r i b u t i o n o f
a l p r o t e c t i n
b e t W e e n t h e c a l c i u m p o s i t i v e a n d c a l c i u m n e g a t i v e r e s u l t s ;
and
[ 0 1 0 9 ]
FIGS. 6 and 7
a r e t h e
ROC
u r v e s f o r c a l p r o t e c t i n
a n d hsCRP f o r a l l
200
s u b j e c t s t e s t e d a n d f o r t h e
male
s u b
j e c t s
t e s t e d
r e s p e c t i v e l y .
EXAMPLE
A n t i - C a l p r o t e c t i n A n t i b o d y
( a )
I s o l a t i o n
o f
a l p r o t e c t i n
[ 0 1 1 0 ] C a l p r o t e c t i n may e i s o l a t e d a c c o r d i n g o t h e meth
o d s d e s c r i b e d i n Examples a n d
2
o f U . S . P a t . N o . 4 , 8 3 3 , 0 7 4
( F a g e r h o l ) .
[ 0 1 1 1 ] C a l p r o t e c t i n may a l t e r n a t i v e l y b e p u r i ? e d f r o m
human b u f f y c o a t s .
A
e l l - s u s p e n s i o n i n 2 . 5 mM DTA s
made
y
t h e
a d d i t i o n
o f E D T A 5 0 m M ,
pH
) t o
c e l l s . T h e
c e l l s
a r e t h e n Washed
n
1
60mM mmonium h l o r i d e / 1 0 mM
s o d i u m h y d r o g e n c a r b o n a t e f o r
3
m i n u t e s a n d c e n t r i f u g e d
( 1 6 0 > < g )
f o r 1 0
m i n u t e s a t 4 0 C . The
e s u l t i n g
p e l l e t
i s
Washed
i n E D T A 2 . 5 m M ) / N a C l
( 1 5 0 mM)
n d c e n t r i f u g e d ( 5 5 > < g )
f o r a
f u r t h e r
1 0
m i n u t e s
a t
4 0 C .
The e l l e t
s
t h e n r e s u s p e n d e d
i n 0 . 6 2 5 mM DTA/18.75 mM i e m a l ,
pH . 4
and r o Z e n a t
—700
C .
f o r
a t
l e a s t 24
h o u r s .
7/27/2019 US20110318847.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/us20110318847pdf 16/21
US 2011/0318847
A 1
[ 0 1 1 2 ] F o l l o w i n g
t h a w i n g , t h e r e s u l t i n g m a t e r i a l i s c e n t r i
f u g e d
( a t
3 7 0 0
x g )
f o r 3 0
m i n u t e s , t h e n
t h e
s u p e r n a t a n t i s
removed and
? l t e r e d
( w i t h
a 0 . 4 5 [ m i ? l t e r
a v a i l a b l e from
M i l l i p o r e ) ,
t h e n l o a d e d o n t o
a
DEAE
( d i e t h y l a m i n o e t h y l )
S e p h a r o s e i o n - e x c h a n g e
c o l u m n
a v a i l a b l e
f r o m
P h a r m a c i a ) ,
p r e - p r e p a r ed u s i n g a
b i n d i n g
b u f f e r
( e . g . 0 . 6 3
mM
D T A / 1 8 .
7 5
mM i e m a l ,
pH . 4 ) . Any
n o n - b i n d i n g m a t e r i a l
p a s s e s
t h r o u g h
t h e column
n d
s e l u t e d . Once
l l
o f h e
n o n - b i n d i n g
m a t e r i a l i s e l u t e d f r o m t h e c o l u m n ,
p u r e
c a l p r o t e c t i n s e l u t e d
u s i n g a c a l c i u m - c o n t a i n i n g e l u t i o n
b u f f e r
(eg
7 5
mM
D i e m a l
b u f f e r /
1 0
mM
a C l 2 ) .
About
2 5 mg a l p r o t e c t i n i s
o b t a i n e d p e r b u f f y
c o a t .
( b )
P r e p a r a t i o n o f
n t i - C a l p r o t e c t i n A n t i b o d y
[ 0 1 1 3 ]
A n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s
may b e p r e p a r e d
a c c o r d i n g t o
t h e
method e s c r i b e d i n Example
3 o f
US. a t .
N o .
4 , 8 3 3 , 0 7 4
( F a g e r h o l )
[ 0 1 1 4 ] C h i c k e n e g g p o l y c l o n a l s
may l t e r n a t i v e l y
b e
p r e
p a r e d . A o l u t i o n
c o m p r i s i n g c a l p r o t e c t i n
( 0 . 5 m g / m l ) a n d
F r e u n d ’ s a d j u v a n t
s
i n j e c t e d
n t o
c h i c k e n s e v e r y 1 4 d a y s
f o u r
t i m e s ( o r
f o r
two o n t h s ) , and h e n o n c e e v e r y
1
m o n t h . A f t e r
1 2
w e e k s ,
t h e e g g s o f t h e
c a l p r o t e c t i n - i n j e c t e d
c h i c k e n
may
b e
c o l l e c t e d
a n d
h e i r y o l k s
r e m o v e d ( w i t h o u t
t h e ? l m ) . F o l
l o w i n g d i l u t i o n i n H C l .
( 5
mM),
h e
y o l k s
c e n t r i f u g e d
a n d
t h e
s u p e r n a t a n t i s
c o l l e c t e d .
The s u p e r n a t a n t i s
t h e n ? l t e r e d
and
t r e a t e d
with s a t u r a t e d ammonium u l f a t e t o a ?nal con
c e n t r a t i o n
o f 3 . 8 M . The i x t u r e i s c e n t r i f u g e d and h e p r e
c i p i t a t e p r o d u c e d s c o l l e c t e d
a n d d i s s o l v e d
i n b u f f e r ( 0 . 1 1
M
s o d i u m
c e t a t e ,
0 . 1 5
M
a C l , pH . 4 ) . T h e
e s u l t i n g
s o l u t i o n
i s ? n a l l y
d i a l y s e d
w i t h
a
membrane h a v i n g
a p o r e
s i Z e o f
1 0 , 0 0 0 kD
n d t h e n
p u r i ? e d
b y a ? i n i t y
c h r o m a t o g r a p h y .
[ 0 1 1 5 ]
T h e
c o l u m n
t y p i c a l l y u s e d f o r a ? i n i t y c h r o m a t o g
r a p h y
c o m p r i s e s a n
a c t i v a t e d
m a t r i x
o f
s u c c i n i m i d e - a c t i v a t e d
s e p h a r o s e
( H i T r a p NHS c t i v a t e d a v a i l a b l e f r o m Amersham
P h a r m a c i a )
which
i s
s u i t a b l e f o r
t h e
i m m o b i l i s a t i o n
o f
c a l p r o t e c t i n . More s p e c i ? c a l l y , t h e a c t i v a t e d r e s i n r e a c t s
s p o n t a n e o u s l y , a t pH
- 8 ,
w i t h r e e a m i n e s
i n
t h e
a l p r o t e c t i n .
F o r
c h r o m a t o g r a p h y
t h e
d i a l y s i s s o l u t i o n
i s
u s u a l l y d i l u t e d o
a
c o n c e n t r a t i o n
o f
a b o u t
3
mg/ml
n PBS
r i o r to
i t s a p p l i c a
t i o n t o
t h e
c o l u m n . The a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s a r e
s u b
s e q u e n t l y
e l u t e d
u s i n g 6
M
r e a
i n i c e
c o l d
PBS o r 0 . 1 M
s o d i u m
c i t r a t e s o l u t i o n , pH . 0 . P r e f e r a b l y , 0 . 1
M o d i u m
c i t r a t e s o l u t i o n s
u s e d .
F o l l o w i n g e l u t i o n , t h e a n t i - c a l p r o t e c
t i n a n t i b o d y c o n t a i n i n g f r a c t i o n s a r e
i m m e d i a t e l y
d i l u t e d a n d
d i a l y s e d i n P B S .
EXAMPLE
T u r b i d i m e t r i c
A s s a y f o r
C a l p r o t e c t i n
( a )
P r e p a r a t i o n
o f v i d i n - C o a t e d
N a n o p a r t i c l e s
[ 0 1 1 6 ]
600
[ m i
o f 4.2%
w/v
c h l o r o m e t h y l a c t i v a t e d
nano
p a r t i c l e s
( d i a m e t e r
4 4
nm)
a v a i l a b l e f r o m I n t e r f a c i a l
Dynamic C o r p o r a t i o n ,
US
a r e
d i a l y s e d a g a i n s t w a t e r
w i t h
a
membrane a v i n g a p o r e
s i Z e
of 0 , 0 0 0 kD. 0 . 5
ml
of b o r a t e
( 1 0 m M ) n d s o d i u m c h l o r i d e ( 1 5 m M ) o l u t i o n
a t pH
. 0
i s
added
and m i x e d . 1 0 mg
v i d i n ,
d i s s o l v e d i n 0 . 5 ml
of
1 0
mM o r a t e
and
1 5 mM
aCl
s o l u t i o n
a t
pH
( a v a i l a b l e from
P i e r c e
C h e m i c a l
Company)
s a d d e d a n d
t h e
m i x t u r e i s a g i
t a t e d
a t
room t e m p e r a t u r e f o r 2 4
h o u r s .
4 0 [ 1 . 1 o f g l y c i n e
s o l u t i o n ( 2 M , pH . 0 )
i s t h e n
a d d e d a n d
t h e m i x t u r e
i s
a g i
t a t ed f o r
a
f u r t h e r
4 hours at r o om t e m p e r a t u r e .
[ 0 1 1 7 ]
The a r t i c l e s
a r e t h e n
d i l u t e d t o a
volume
of 100 ml
and
d i a ? l t r a te d , ? r s t l y i n
500
ml o f a 1 0
mM o r a t e and
1 5
D e c . 2 9 , 2 0 1 1
mM odium
h l o r i d e
s o l u t i o n a t
pH
. 0 and
s e c o n d l y i n a 2 5
mM r i s , 1 5 0 mM odium c h l o r i d e and 0.01% Tween® 20
s o l u t i o n t pH . 4 ( a v a i l a b l e f r o m S i g m a US) s i n g a P e l l i c o n
XL i l t e r ( c u t o f f
3 0 0 , 0 0 0 )
a n d a l a b s c a l e
TTF
S y s t e m ( a v a i l
a b l e
f r o m
M i l l i p o r e )
i n
a c c o r d a n c e w i t h
t h e
i n s t r u c t i o n s
s u p
p l i e d f r o m t h e i n s t r u m e n t s s u p p l i e r s . The
e s i r e d
c o n c e n t r a
t i o n o f a v i d i n - c o a t e d n a n o p a r ‘ t i c l e s
i s
? n a l l y
o b t a i n e d
b y
c e n t r i f u g a t i o n a n d r e - s u s p e n s i o n o f t h e p a r t i c l e s i n a 2 5 mM
THIS, 1 5 0 mM odium h l o r i d e and 0.01% Tween® 20 s o l u
t i o n . Any a g g r e g a t e s
f o r m e d
d u r i n g t h i s p r e p a r a t i o n p r o c e
d u r e may
e
r e m o v e d b y
s l o w c e n t r i f u g a t i o n .
( b ) A s s a y f o r C a l p r o t e c t i n
U s i n g
A v i d i n - C o a t e d N a n o p a r
t i c l e s
[ 0 1 1 8 ]
A
u s p e n s i o n
h a v i n g a
c o n c e n t r a t i o n o f a b o u t
0 . 3 0
mg a r t i c l e s o f t h e a b o v e - d e s c r i b e d a v i d i n - c o a t e d n a n o p a r
t i c l e s p e r m l i s p r e p a r e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d
r e - s u s p e n s i o n
o f t h e a b o v e - d e s c r i b e d
p r e p a r a t i o n
i n a 2 5
mM
HIS, 1 5 0
mM aC1,0.1% Tween® 20 and 2 PEG 000 o l u t i o n t
pH
7 . 4
( a v a i l a b l e
f r o m
S i g m a ) .
5 0 0 1 . 1
o f
h i s p a r t i c l e
s u s p e n s i o n
i s mixed
w i t h
a
p l a s m a
s a m p l e ( a b o u t 2 0 [ 1 . 1 ) , t a k e n
f r o m
a
s u b j e c t b e i n g
t e s t e d
f o r p r o p e n s i t y t o
CVD,
i n
a
r e a d i n g
q u a r t z c u v e t t e
o f
a r e c o r d i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r (eg a S h i
madZu U V - 1 6 0 ) . The a b s o r p t i o n o f
340
nm
onochromatic
l i g h t
i s r e c o r d e d a n d
a f t e r 6 0
s , 7 5 [ 1 g o f
a n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d y l a b e l l e d w i t h 0 . 1 5 nmol i o t i n ( e . g . b i o t i n l a b e l l e d
a ? i n i t y p u r i ? e d
e g g p o l y c l o n a l p u r c h a s e d f r o m
N o r w e g i a n
A n t i b o d i e s AS,
N o r w a y ) , d i l u t e d i n 5 0 1 . 1 o f a
2 5
mM H I S ,
1 5 0
mM
aCl
and
0.1% Tween®
20 s o l u t i o n a t pH 7 . 4 i s
added
o t h e q u a r t z c u v e t t e
and i x e d . The b s o r p t i o n o f 340
nm
monochromatic l i g h t i s
i m m e d i a t e l y
r e c o r d e d u s i n g a
r e f e r e n c e c u v e t t e
c o n t a i n i n g a s o l u t i o n
o f 2 5 mM RIS, 1 5 0
mM
aCl
and
0.1% Tween®
20 a t
pH
7 . 4 , and
a g a i n
a t
r e g u l a r n t e r v a l s ( e . g .
e v e r y
2 m i n u t e s ) u n t i l a b o u t 1 5
m i n u t e s
h a s
e l a p s e d .
The
i n c r e a s e
i n
a b s o r p t i o n
a t
e a c h t i m e
p o i n t
i s
c a l c u l a t e d i n
a c c o r d a n c e w i t h
s t a n d a r d
t u r b i d i m e t r i c r e a d i n g
i n
k i n e t i c mode
r “ e n d - p o i n t ” r e a d i n g s . T h a t s , t h e i n c r e a s e
i n
l i g h t a b s o r p t i o n
a t
e a c h t i m e - p o i n t i s c a l c u l a t e d r e l a t i v e
t o
t h e r e a d i n g
made p r i o r
t o t h e
a d d i t i o n
o f a n t i b o d y - c o a t e d
n a n o p a r ‘ t i c l e s a n d / o r a t
t h e e n d
o f
t h e r e c o r d i n g .
[ 0 1 1 9 ] A a l i b r a t i o n
c u r v e s
c o n s t r u c t e d by a r r y i n g o u t a n
i d e n t i c a l p r o c e d u r e w i t h s t a n d a r d s h a v i n g
a
know n
concen
t r a t i o n o f c a l p r o t e c t i n .
The c o n c e n t r a t i o n
o f
c a l p r o t e c t i n
i n
t h e sample can
h e n
be a l c u l a t e d from h e c a l i b r a t i o n c u r v e .
EXAMPLE
A l t e r n a t i v e T u r b i d i m e t r i c
A s s a y
f o r C a i p r o t e c t i n
( a )
P r e p a r a t i o n
o f
n t i - C a l p r o t e c t i n
A n t i b o d y C o a t ed
N a n o
p a r t i c l e s
[ 0 1 2 0 ] 1
m1 o f
4.2% w/v c h l o r o m e t h y l
a c t i v a t e d
n a n o p a r
t i c l e s
( d i a m e t e r
4 4
nm)
a v a i l a b l e
f r o m I n t e r f a c i a l Dynamic
C o r p o r a t i o n , US r e d i a l y s e d a g a i n s t
w a t e r
w i t h a
membrane
h a v i n g
a
p o r e s i Z e o f 1 0 , 0 0 0 kD. . 5
m1
f
a
1 0 mM o r a t e and
1 5
mM odium h l o r i d e
s o l u t i o n
a t
pH
. 0 i s t h e n
a d d e d .
2 7
mg
f u r i ? e d a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s ( e . g . a ? i n i t y p u r i
? e d
e g g
p o l y c l o n a l
a n t i b o d i e s
a v a i l a b l e f r o m N o r w e g i a n
A n t i b o d i e s AS, Norway)
r e
d i a l y s e d a g a i n s t a 1 0 mM o r a t e
and 1 5 mM odium h l o r i d e s o l u t i o n a t pH . 0 .
[ 0 1 2 1 ] F o l l o w i n g
a d d i t i o n
o f t h e n a n o p a r ‘ t i c l e s t o t h e
p u r i
? e d
a n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d i e s th e
m i x t u r e i s a g i t a t e d f o r 2 4
7/27/2019 US20110318847.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/us20110318847pdf 17/21
US 2011/0318847
A 1
h o u r s a t
room
e m p e r a t u r e .
40 l o f a
g l y c i n e
s o l u t i o n ( 2
M
t
pH . 0 ) i s t h e n
a d d e d a n d t h e
m i x t u r e i s
a g i t a t e d f o r a f u r t h e r
4 hours at room e m p e r a t u r e .
[ 0 1 2 2 ] The a r t i c l e s a r e t h e n d i l u t e d
t o
t o t a l
volume f 100
ml
and
i a ? l t r a t e d
a g a i n s t
1000
ml
f
a
1 0
mM
o r a t e
and
1 5
mM
odium
c h l o r i d e
s o l u t i o n
a t pH 9 . 0 t o Which
0.1%
Tween@ 20 and
3
mg/ml
e g g
a l b u m i n
i s
added s i n g
a
P e l l i
con
XL l t e r ( c u t o f 3 0 0 , 0 0 0 )
and
a l a b s c a l e TFF s y s t e m
( a v a i l a b l e
f r o m M i l l i p o r e ) i n
a c c o r d a n c e
W i t h
t h e
i n s t r u c t i o n s
s u p p l i e d from h e i n s t r u m e n t s s u p p l i e r s .
The
e s i r e d c o n c e n
t r a t i o n
o f a n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d y - c o a t e d n a n o p a r t i c l e s i s
? n a l l y o b t a i n e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d r e - s u s p e n s i o n
o f
t h e
p a r t i c l e s i n s o l u t i o n .
Any
a g g r e g a t e s
f o r m e d
d u r i n g
t h i s
p r e p a r a t i o n
p r o c e d u r e may e
r e m o v ed b y
s l o W c e n t r i f u g a
t i o n .
( b ) A s s a y f o r
C a l p r o t e c t i n
U s i n g
A n t i - C a l p r o t e c t i n
A n t i
b o d y - C o a t e d N a n o p a r t i c l e s
[ 0 1 2 3 ] A u s p e n s i o n c o m p r i s i n g 4 0 0
u g
o f t h e a b o v e - d e
s c r i b e d
a n t i b o d y - c o a t e d
n a n o p a r t i c l e s i n
5 0
u l
o f
a
1 0
mM
b o r a t e , 1 5
mM a C l ,
0.1% Tween@ 2 0 , 3
g / l e g g
a l b u m i n
s o l u t i o n a t pH . 0 i s p r e p a r e d .
[ 0 1 2 4 ]
S i m u l t a n e o u s l y ,
2 0 u l o f p l a s m a , t a k e n f r o m t h e
s u b j e c t b e i n g
t e s t e d
o r p o t e n t i a l f o r
CVD, n
5 0 0 a s s a y
b u f f e r
( 2 5
mM R I S ,
1 5 0
mM
a C l ,
0.1% Tween@
20 and
2 E G
6 0 0 0 a t pH 7 . 4 ( a v a i l a b l e f r o m S i g m a )
i s
p u t i n a r e a d i n g
q u a r t z c u v e t t e
o f
a r e c o r d i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r ( e . g . S h i
madzu
UV-160) and t h e l i g h t a b s o r p t i o n
o f
340 nm mono
c h r o m a t i c l i g h t
i s m e a s u r e d . A f t e r 6 0
, t h e
a b o v e - m e n t i o n e d
s u s p e n s i o n c o m p r i s i n g
4 0 0
o f a n t i b o d y - c o a t e d a n o p a r t i c l e s
i s a d d e d , a n d mixed
i n
t h e
c u v e t t e . The l i g h t
a b s o r p t i o n
i m m e d i a t e l y a f t e r a d d i n g
t h e
a n t i b o d y - c o a t e d n a n o p a r t i c l e s
i s r e c o r d e d ,
a n d
a g a i n a t r e g u l a r i n t e r v a l s ( e . g . e v e r y 2 min
u t e s ) u n t i l a b o u t 1 5
m i n u t e s h a s
e l a p s e d .
The n c r e a s e
i n l i g h t
a b s o r p t i o n
a t
e a c h
t i m e - p o i n t
i s
c a l c u l a t e d
r e l a t i v e t o
t h e
r e a d i n g made r i o r
t o
t h e a d d i t i o n o f a n t i b o d y - c o a t e d n a n o
p a r t i c l e s a n d / o r
a t
t h e e n d
o f
t h e r ec o r d i n g . I n o t h e r
W o r d s ,
t u r b i d i m e t r i c r e a d i n g s
i n
k i n e t i c mode o r
“ e n d - p o i n t ”
r e a d
i n g s a r e made.
[ 0 1 2 5 ] A a l i b r a t i o n c u r v e
i s
a l s o
c o n s t r u c t e d by c a r r y i n g
o u t
an i d e n t i c a l
p r o c e d u r e W i t h s t a n d a r d s
h a v i n g
a
knoWn
c o n c e n t r a t i o n
o f
a l p r o t e c t i n . The
o n c e n t r a t i o n
o f
a l p r o t e c
t i n i n
t h e
sample can
t h e n
be c a l c u l a t e d
from
t h e
c u r v e .
EXAMPLE
T u r b i d i m e t r i c A s s a y
f o r
C a l p r o t e c t i n
( a )
P r e p a r a t i o n o f
t r e p t a v i d i n - C o a t e d N a n o p a r t i c l e s
[ 0 1 2 6 ] 600
pm
f 4.2% W/v
c h l o r o m e t h y l
a c t i v a t e d nano
p a r t i c l e s
( d i a m e t e r
6 7
nm)
a v a i l a b l e
f r o m
I n t e r f a c i a l
Dynamic
C o r p o r a t i o n , US
a r e d i a l y s e d a g a i n s t W a t e r W i t h a
membrane h a v i n g
a
p o r e s i z e of 1 0 , 0 0 0 kD. 0 . 5
ml
o f
a
p h o s p h a t e ( 1 0
mM)
a n d
s o d i u m c h l o r i d e ( 1 5 0 mM) u f f e r
s o l u t i o n a t pH . 4 i s a d d e d t o g e t h e r W i t h 1 0 mg t r e p t a v i d i n ,
d i s s o l v e d i n 0 . 5
ml
f
a 1 0
mM h o s p h a t e and 1 5 0 mM aCl
b u f f e r s o l u t i o n
a t
pH 7 . 4
( a v a i l a b l e
f r o m P i e r c e C h e m i c a l
Company)
and h e
m i x t u r e s
a g i t a t e d t
room e m p e r a t u r e
f o r
2 4 h o u r s . 4 0 p a o f l y c i n e
s o l u t i o n
( 2 M , pH . 0 )
i s
t h e n a d d e d
and
t h e m i x t u r e i s
a g i t a t e d f o r
a
f u r t h e r
4 h o u r s a t room
t e m p e r a t u r e .
[ 0 1 2 7 ]
The a r t i c l e s a r e
t h e n
d i l u t e d t o a
volume
of 100 ml
and
d i a ? l t r a te d , ? r s t l y i n
500
ml o f a 1 0
mM o r a t e and
1 5
mM
odium h l o r i d e so l u t i o n a t pH
. 0
and s e c o n d l y
i n
a 2 5
D e c . 2 9 , 2 0 1 1
mM r i s , 1 5 0 mM odium c h l o r i d e and 0.01% Tween@
20
s o l u t i o n t pH . 4 ( a v a i l a b l e f r o m S i g m a US) s i n g a P e l l i c o n
XL i l t e r ( c u t o f f 3 0 0 , 0 0 0 ) a n d a l a b s c a l e
TTF
S y s t e m ( a v a i l
a b l e
f r o m
M i l l i p o r e ) i n a c c o r d a n c e W i t h t h e i n s t r u c t i o n s
s u p
p l i e d f r o m t h e i n s t r u m e n t s s u p p l i e r s . The
e s i r e d
c o n c e n t r a
t i o n
o f a v i d i n - c o a t e d n a n o p a r t i c l e s
i s
? n a l l y
o b t a i n e d
b y
c e n t r i f u g a t i o n a n d r e - s u s p e n s i o n o f t h e p a r t i c l e s i n a 2 5 mM
TRIS, 150
mM odium h l o r i d e and
0 . 0 1 0
Tween@ 20 s o l u
t i o n . Any a g g r e g a t e s
f o r m e d
d u r i n g t h i s
p r e p a r a t i o n
p r o c e
d u r e may e r e m o v e d b y
s l o W c e n t r i f u g a t i o n .
[ 0 1 2 8 ] The mean a r t i c l e s i z e o f t h e s t r e p t a v i d i n c o a t e d
n a n o p a r t i c l e s
Was measured
o be 8 2 nm y
S i n t e f f AS,
N o r
W a y .
( b ) A s s a y f o r C a l p r o t e c t i n U s i n g
S t r e p t a v i d i n - C o a t e d
N a n o
p a r t i c l e s
[ 0 1 2 9 ]
A
u s p e n s i o n
h a v i n g
a c o n c e n t r a t i o n o f a b o u t
0 . 6 0
mg a r t i c l e s o f t h e a b o v e - d e s c r i b e d a v i d i n - c o a t e d n a n o p a r
t i c l e s p e r m l i s p r e p a r e d b y
c e n t r i f u g a t i o n
a n d r e - s u s p e n s i o n
o f t h e a b o v e - d e s c r i b e d
p r e p a r a t i o n
i n a 2 5
mM
RIS, 1 5 0
mM a C l , 0.1% Tween@ 20 and
1
PEG 000 o l u t i o n t
pH
7 . 4
( a v a i l a b l e
f r o m
S i g m a ) .
5 0 0 1 . 1
o f
h i s
p a r t i c l e s u s p e n s i o n
i s
mixed
W i t h
a
p l a s m a
s a m p l e
( a b o u t
5
u l ) ,
t a k e n
f r o m
a
s u b j e c t
b e i n g
t e s t e d f o r
p r o p e n s i t y t o
CVD,
i n
a r e a d i n g
q u a r t z c u v e t t e
o f
a
r e c o r d i n g
s p e c t r o p h o t o m e t e r (eg a S h i
madzu. U V - 1 6 0 ) .
The
a b s o r p t i o n o f 560 nm onochromatic
l i g h t
i s
r e c o r d e d
a n d
a f t e r 6 0
s , 7 5
u g
o f
a n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d y
l a b e l l e d W i t h 0 . 1 5
nmol
i o t i n ( e . g . b i o t i n l a b e l l e d
a ? i n i t y p u r i ? e d
e g g
p o l y c l o n a l
p u r c h a s e d f r o m
N o r W e g i a n
A n t i b o d i e s AS,
N o r W a y ) , d i l u t e d
i n 5 0 u l o f a 2 5
mM R I S ,
1 5 0 mM
aCl and 0.1%
Tween@
20 s o l u t i o n
a t
pH . 4 i s
added o t h e q u a r t z c u v e t t e and i x e d . The b s o r p t i o n
o f 340
nm
o n o c h r o m a t i c l i g h t i s i m m e d i a t el y r e c o r d e d
u s i n g
a
r e f e r e n c e c u v e t t e
c o n t a i n i n g
a
s o l u t i o n
o f 2 5
mM RIS,
1 5 0
mM
aCl
and 0.1% Tween@ 20
a t
pH
7 . 4 ,
and
a g a i n
a t
r e g u l a r n t e r v a l s ( e . g . e v e r y 2 m i n u t e s ) u n t i l a b o u t 1 5 m i n u t e s
h a s e l a p s e d . The i n c r e a s e i n a b s o r p t i o n a t e a c h t i m e p o i n t
i s
c a l c u l a t e d i n
a c c o r d a n c e W i t h
s t a n d a r d t u r b i d i m e t r i c r e a d i n g
i n
k i n e t i c mode
r
“ e n d - p o i n t ” r e a d i n g s . T h a t s , t h e i n c r e a s e
i n
l i g h t
a b s o r p t i o n
a t
e a c h
t i m e - p o i n t
i s
c a l c u l a t e d
r e l a t i v e
t o
t h e r e a d i n g made
p r i o r
t o t h e a d d i t i o n o f a n t i b o d y - c o a t e d
n a n o p a r t i c l e s a n d / o r
a t
t h e e n d
o f
t h e r e c o r d i n g .
[ 0 1 3 0 ]
A a l i b r a t i o n c u r v e s c o n s t r u c t e d by
a r r y i n g o u t
a n
i d e n t i c a l p r o c e d u r e W i t h s t a n d a r d s h a v i n g a
knoWn
concen
t r a t i o n o f c a l p r o t e c t i n . The c o n c e n t r a t i o n o f c a l p r o t e c t i n i n
t h e sample can
h e n
be
a l c u l a t e d from h e
c a l i b r a t i o n
c u r v e .
EXAMPLE
( a )
P r e p a r a t i o n o f
n t i - C a l p r o t e c t i n A n t i b o d y
C o a t e d N a n o p a r t i c l e s
[ 0 1 3 1 ] 1
ml o f
4.2% W/v c h l o r o m e t h y l
a c t i v a t e d
n a n o p a r
t i c l e s
( m e a n
d i a m e t e r 6 7 nm) a v a i l a b l e f r o m
I n t e r f a c i a l
Dynamic
o r p o r a t i o n ,
U S ,
a r e d i a l y s e d a g a i n s t W a t e r W i t h
a
membrane
a v i n g a
p o r e
s i z e o f
1 0 . 0 0 0 k D ,
and
h e n
d i l u t e d
t o
1 0 ml W i t h W a t e r .
2 7
mg f p u r i ? e d
e g g
p o l y c l o n a l
a n t i
b o d i e s
( e . g .
a f ? n i t y
p u r i ? e d
e g g
p o l y c l o n a l
a n t i b o d i e s
a v a i l
a b l e f r o m
N o r W e g i a n
A n t i b o d i e s A S , N o r W a y ) a r e d i a l y s e d
a g a i n s t a 1 0 mM o r a t e and 1 5 mM odium c h l o r i d e b u f f e r
s o l u t i o n
and n a l l y
d i l u t e d
t o 6 ml
n
t h e same 1 0
mM
o r a t e
and 1 5
mM odium
h l o r i d e
s o l u t i o n a t p H : 9 . 0 .
[ 0 1 3 2 ]
Under a g i t a t i o n , t h e
p a r t i c l e s
a r e mixed W i t h
t h e
a n t i b o d i e s ,
and
g i t a t i o n
s
c o n t i n u e d
t
room e m p e r a t u r e
f o r
2 4
h o u r s . 4 0 u l
o f
a g l y c i n e s o l u t i o n ( 2 M
t
pH . 0 ) i s t h e n
added
and h e
mixture
s
a g i t a t e d
f o r a f u r t h e r
4 h o u r s
a t
room
t e m p e r a t u r e .
[ 0 1 3 3 ]
The p a r t i c l e s a r e
t h e n
d i l u t e d t o a t o t a l volume of
1 0 0
ml
i n 1 0
mM
o r a t e ,
1 5
mM
odium c h l o r i d e b u f f e r
t o
Which
0.1% Tween@ 20 and
3
mg/ml e g g a l b u m i n i s added
a n d
d i a ? l t r a t e d a g a i n s t 1 0 0 0 ml o f s a i d b o r a t e / sodium
h l o
r i d e
b u f f e r t o Which
0.1%
Tween@
20
and 3 mg/ml
e g g
7/27/2019 US20110318847.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/us20110318847pdf 18/21
US 2011/0318847
A 1
a l b u m i n i s a d d e d , u s i n g
a
P e l l i c o n XL
l t e r ( c u t o f f 3 0 0 . 0 0 0
D )
a n d a l a b s c a l e
TFF s y s t e m ( a v a i l a b l e f r o m
M i l l i p o r e )
i n
a c c o r d a n c e W i t h t h e i n s t r u c t i o n s s u p p l i e d
f r o m t h e
i n s t r u
ment u p p l i e r s ,
and
n t h e
end
h e p a r t i c l e s a r e c o n c e n t r a t e d to
a
volume
of
40
t o
100
m l .
[ 0 1 3 4 ] The
mean
d i a m e t e r o f t h e
p a r t i c l e s
o b t a i n e d Was
measured o b e 8 1 nm y S i n t e f f AS, N o r w a y .
( b )
A s s a y
f o r C a l p r o t e c t i n U s i n g n t i - c a l p r o t e c t i n
A n t i b o d y - C o a t e d N a n o p a r t i c l e s
[ 0 1 3 5 ] A u s p e n s i o n o f
0 . 7
mg/ml
o f
t h e a b o v e d e s c r i b e d
a n t i - c a l p r o t e c t i n
a n t i b o d y c o a t e d
p a r t i c l e s i s
made
i n 0 . 2 5
mM R I S ,
0 . 1 5 M
aCl and 0.1% TWeen t pH . 0 .
[ 0 1 3 6 ]
5
[ 1 . 1 o f a p l a s m a s a m p l e , t a k e n f r o m t h e s u b j e c t
b e i n g
t e s t e d
f o r CVD, s
d i s s o l v e d i n
a s s a y b u f f e r ( 4 6 0 1 . 1 2 5
mM
R I S , 1 5 0
mM
a C l , 0.1% W e e n , 1 . 0 %
p o l y e t h y l e n e g
l y c o l
6 0 0 0 ,
pH
. 4 )
i n
a r e a d i n g
q u a r t z c u v e t t e i n
a r e c o r d i n g
s p e c t r o p h o t o m e t e r ( e . g . S h i m a d Z u U V - 1 6 0 ) a n d t h e l i g h t
a b s o r p t i o n o f
5 6 0 nm onochromatic i g h t i s m e a s u r e d .
A f t e r
6 0 s ,
1 0 0 [ 1 . 1 o f
t h e a b o v e m e n t i o n e d s u sp e n si o n c o m p r i s i n g
0 . 7 m g / m l o f a n t i b o d y c o a t e d n a n o p a r t i c l e s
i s
a d d e d ,
a n d
mixed
n t h e c u v e t t e .
The
i g h t
a b s o r p t i o n
b e f o r e
a n d
imme
d i a t e l y a f t e r a d d i n g t h e
a n t i b o d y - c o a t e d
n a n o p a r t i c l e s i s
r e c o r d e d ,
a n d
a g a i n
a t
r e g u l a r
i n t e r v a l s
( e g . e v e r y
2 0 s ) u n t i l
1 5 m i n u t e s
h a s
e l a p s e d . The i n c r e a s e
i n
l i g h t a b s o r p t i o n a t
e a c h t i m e
p o i n t
i s
c a l c u l a t e d e l a t i v e
t o
t h e r e a d i n g made
r i o r
t o t h e ad d i t i o n o f
a n t i b o d y c o a t e d
n a n o p a r t i c l e s and t t h e end
o f t h e r e c o r d i n g . I n o t h e r W o r d s , t u r b i d i m e t r i c
r e a d i n g s
i n
k i n e t i c
mode a n d / o r “ e n d p o i n t ” r e a d i n g s
a r e
m a d e .
[ 0 1 3 7 ]
A a l i b r a t i o n
c u r v e i s
a l s o
c o n s t r u c t e d by c a r r y i n g
o u t
a n i d e n t i c a l
p r o c e d u r e W i t h s t a n d a r d s h a v i n g a
known
c o n c e n t r a t i o n s o f
c a l p r o t e c t i n .
The c o n c e n t r a t i o n o f c a l p r o
t e c t i n i b t h e sample can
t h e n
be c a l c u l a t e d from h e c u r v e .
EXAMPLE
S t a t i s t i c a l A n a l y s i s
C o m p a r i s o n o f a l p r o t e c t i n a n d
O t h e r
M a r k e r s
f o r D e t e c t i o n
of
o t e n t i a l
f o r
CVD
r P r o p e n s i t y
t o
CVD
[ 0 1 3 8 ]
C o r o n a r y
c a l c i ? c a t i o n h a s
b e e n
shoWn t o
b e
s t r o n g l y a s s o c i a t e d W i t h t h e o c c u r r e n c e o f
CVD
nd a s a l s o
been d e m o n s t r a t e d t o be a u s e f u l method f o r p r e d i c t i n g
p o t e n t i a l f o r
CVD e . g .
m y c o c a r d i a l i n f a r c t i o n o r , s t r o k e ) .
[ 0 1 3 9 ] The x t e n t
o f
o r o n a r y c a l c i ? c a t i o n s
q u a n t i t a t i v e l y
m e a s u r e d
u s e d e l e c t r o n - b e a m c o m p u t e d
t o m o g r a p h y
(EBCT) a n d i s r e p r e s e n t e d b y
a
c a l c i u m s c o r e ( C S ) . A i g h
calcium
s c o r e r e p r e s e n t s a
high
l e v e l
of
a l c i ? c a t i o n and a
h i g h r i s k o f d e v e l o p i n g
CVD.
[ 0 1 4 0 ] I n t h e
f o l l o W i n g
s t u d y t h e CS o f
2 0 0
s u b j e c t s ( 1 0 0
c o n t r o l s h a v i n g a C S <100
and 100
c a s e s h a v i n g a C S >100)
aged 45 o r
g r e a t e r
Was
t e s t e d
a s W e l l
a s t h e i r c a l p r o t e c t i n ,
CRP n d h o m o c y s t e i n e p l a s m a o r
serum
e v e l s . The s u b j e c t s
Were e i t h e r s e l f -
o r
p h y s i c i a n - r e f e r r e d asymptomatic i n d i
v i d u a l s and
had had
an EBCT
c a n W i t h i n t h e p r e v i o u s 2 y e a r s
( u s u a l l y W i t h i n t h e p r e v i o u s 6 m o n t h s ) t o t e s t i n g o f
t h e i r
plasma
o r
serum f o r t h e
c o n c e n t r a t i o n
o f
c a l p r o t e c t i n ,
CRP
a n d
h o m o c y s t e i n e .
Methods
C a l p r o t e c t i n
[ 0 1 4 1 ] C a l p r o t e c t i n W a s m e a su r e d b y
t h e C a l p r e s t ® t e s t
( d i s t r i b u t e d
b y
E u r o s p i t a l ® , I t a l y ) a n d d a t a
W e r e su m m a r i s e d
f o r
t h e p a t i e n t a n d t h e
c o n t r o l
g r o u p u s i n g s t a n d a r d
d e v i a t i o n ,
m e d i a n , minimum a n d maximum. 9 5%
con?dence
n t e r v a l s
f o r median Were c a l c u l a t e d . The n d e r s o n - D a r l i n g c a l c u l a
t i o n W a s used
a s
a t e s t f o r n o r m a l i t y .
[ 0 1 4 2 ] C a l p r o t e c t i n
W a s a l s o s u m m a r i s e d
b y
g e n d e r
u s i n g
t h e
same s u mma r y
s t a t i s t i c s .
D e c . 2 9 , 2 0 1 1
C a l c i u m S c o r e ( C S )
[ 0 1 4 3 ]
Calcium
s c o r e
Was d e t e r m i n e d by
Electron-Beam
Computed o m o g r a p h y (ERCT) s c a n n i n g .
D a t a
f o r c a s e a n d
c o n t r o l
groups
Were summarised.
High
S e n s i t i v e
C - R e a c t i v e
P r o t e i n
( h s C R P )
hsCRP
Was
d e t e r m i n e d b y D a d e
B e h r i n g ’ s “N
H i g h
S e n s i t i v i t y CRP”
a s s a y
( R o b e r t s
e t a l . , C l i n i c a l C h e m i s t r y , 2 0 0 0 , 4 6 : 4 , p
4 6 1
4 6 8 ) . D a t a Were summarised
f o r
t h e
p a t i e n t
and
t h e
c o n t r o l
g r o u p s u s i n g
m e a n , s t a n d a r d
d e v i a t i o n , m e d i a n , minimum
and
maximum.
H o m o c y s t e i n e
( H y c )
[ 0 1 4 4 ]
P l a s m a H o m o c y s t e i n e ( H c y ) W a s d e t e r m i n e d
b y t h e
A b b o t t
I M x method
( S h i p c h a n d l e r ,
M .
.
a n d Moore E .
G . ,
C l i n i c a l C h e m i s t r y , 1 9 9 5 , 4 1 : 7 , p . 9 5 1 - 9 9 4 ) .
D a t a Were
sum
m a r i s e d f o r t h e p a t i e n t a n d t h e c o n t r o l g r o u p s u s i n g s t a n d a r d
d e v i a t i o n ,
m e d i a n , minimum
a n d
maximum.
C o m p a r i s o n
B e t W e e n
C s a n d
C a l p r o t e c t i n , h s C R P ,
Hcy
( i ) C h i - S q u a r e d
[ 0 1 4 5 ]
The
h i - s q u a r e d e s t
Was
used o t e s t f o r
c o v a r i a n c e
b e t W e e n p a i r s
o f
m a r k e r s .
( i i ) O d d s R a t i o
[ 0 1 4 6 ] The o d d s r a t i o u s e d W i t h t h e 2x2
c r o s s - t a b u l a t i o n
( i e t h e
c h i - s q u a r e d
t a b l e ) i s t h e r a t i o o f t h e o d d s o f t W o t e s t s
c o - v a r y i n g
to t h e o d d s
o f
tWo e s t s d i s a g r e e i n g .
T h e r e f o r e , t h e
odds r a t i o ma y be i n t e r p r e t e d
a s
a
measure bf
h e
magnitude
of s s o c i a t i o n
betWeen
h e tWo e s t s .
[ 0 1 4 7 ] Odds a t i o Was c a l c u l a t e d f o r C S e r s u s c a i p r o t e c
t i n , hsCRP a n d H c y r e s p e c t i v e l y .
Comparison f Median a l u e s o f t h e
M a r k e r s
( i ) M a n n - W h i t n e y T e s t
[ 0 1 4 8 ]
T h i s i s
a
n o n - p a r a m e t r i c
( t h e d a t a d o e s
n o t
need o
be
o r m a l l y d i s t r i b u t e d )
Which
Was s e d
t o
t e s t i f t h e
median
v a l u e s of tWo m a r k e r s
a r e s i g n i ? c a n t l y
d i f f e r e n t . M i n i t a b
r a n k s a l l t h e d a t a from o t h s e t s
o f
d a t a i n o r d e r , a s s i g n i n g 1
t o
t h e l o W e s t up
o
200
o r
t h e
h i g h e s t .
The s o f t W a r e t h e n
a d d s
up t h e r a n k - s c o r e f o r t h e tWo
g r o u p s t o be
compared
and
r e p o r t s
t h e
“P”
a l u e
Which
n d i c a t e s
t h e
c h a n c e
t h a t
random
s a m p l i n g Would e s u l t i n medians s f a r a p a r t a s t h a t o b s e r v e d
i n t h e
e x p e r i m e n t .
[ 0 1 4 9 ]
C a l p r o t e c t i n , hsCRP
a n d
Hcy m e d i a n v a l u e s Were
compared
t o C S s p l i t i n t o
c a s e and
c o n t r o l g r o u p s
and t h e
Mann-Whitney e s t Was
used
o t e s t f o r s i g n i ? c a n c e .
( i i )
R O C - c u r v e s
f o r C a l p r o t e c t i n a n d
C a l c i u m
S c o r e
[ 0 1 5 0 ] The a b i l i t y of t e s t t o d i s c r i m i n a t e d i s e a s e d c a s e s
from normal a s e s c a n be v a l u a t e d u s i n g R e c e i v er O p e r a t i n g
C h a r a c t e r i s t i c (ROC) u r v e a n a l y s i s . ROC u r v e
a n a l y s i s
Was
used o r b o t h
c a l p r o t e c t i n and
hsCRP and s a comparison f
t h e tWo m a r k e r s .
[ 0 1 5 1 ] The ROC u r v e s Were
p r o d u c e d u s i n g
1 1 c u t - o f f
l i m i t s
f o r c a l c u l a t i o n o f
t h e
s e n s i t i v i t y ( y - a x i s ) a n d t h e
1 - s p e c i ? c i t y ( x - a x i s ) .
The
a t a
f r o m
t h e c o n t r o l and h e
c a s e
g r o u p s
Were o o l e d
t o g e t h e r
and a n k e d f r o m
l o W e s t t o
h i g h
e s t
v a l u e .
A n a l y s i s
Was
e r f o r m e d
on
h e
o t a l
p o p u l a t i o n
and
on
h e
male o p u l a t i o n . The r e a s under h e ROC
urves
W e r e
c a l c u l a t e d u s i n g t h e t r a p e Z o i d a l r u l e .
R e s u l t s
Summary t a t i s t i c s f o r C a l p r o t e c t i n
[ 0 1 5 2 ] F I G . 1 shoWs
t h e
d i s t r i b u t i o n c u r v e f o r a l l 200
s u b
j e c t s t e s t e d .
[ 0 1 5 3 ]
T a b l e
1
beloW shoWs
t h e
summary
s t a t i s t i c s f o r
c a l p r o t e c t i n
i n t h e
c o n t r o l
and
t h e c a s e
g r o u p s .
The
median
c a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n i n t h e c o n t r o l g r o u p i s 0 . 3 1 mg/L
compared o 0 . 3 8
mg/L
n t h e
c a s e
g r o u p .
The
median a l p r o
t e c t i n c o n c e n t r a t i o n s 0 . 3 1
mg/L o r
t h e m a l e s
a n d
0 . 3 0
mg/L
f o r
t h e f e m a l e s i n t h e c o n t r o l g r o u p . I n t h e c a s e group t h e
m e d i a n
c a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n f o r m a l e s i s 0 . 3 9 mg/L
c o m p a r e d t o 0 . 3 1 mg/L
f o r f e m a l e s .
7/27/2019 US20110318847.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/us20110318847pdf 19/21
US
2 0 1 1 / 0 3 1 8 8 4 7 A1 D e c . 2 9 ,
2 0 1 1
TABLE
Summary t a t i s t i c s f o r
C a l p r o t e c t i n
C o n t r o l s Cases
C a l p r o t e c t i n A l l F e m a l e s
M a l e s
A l l
F e m a l e s M a l e s
N
100
59 4 1 100
1 5
8 5
SD 0 . 2 2 8 0 . 2 3 2 0 . 2 2 5 0 . 5 0 3 0.202 0 . 5 3 7
95 CI f o r median 0 . 2 8 - 0 . 3 4 0 . 2 8 - 0 . 3 3 0 . 2 7 - 0 . 3 9 0 . 3 4 - 0 . 4 3 0 . 1 9 - 0 . 4 7 0 . 3 4 - 0 . 4 5
Median ( m g / L ) 0 . 3 1 0 . 3 0
0 . 3 1
0 . 3 8
0 . 3 1
0 . 3 9
Min
( m g / L ) 0 . 0 9 0 . 0 9
0 . 1 1
0 . 0 7 0 . 0 8 0 . 0 7
Max m g / L ) 1 . 3 7 1 . 3 7
1 . 3 6
4 . 8 5 0. 7 3 4 . 8 5
Summary t a t i s t i c s f o r C a l c i u m S c o r e
[ 0 1 5 4 ]
F I G .
2
shows
t h e d i s t r i b u t i o n c u r v e f o r
a l l 200
s u b
j e c t s
t e s t e d .
[ 0 1 5 5 ]
T a b l e
2 below shows
t h e
summary
s t a t i s t i c s f o r
EBCT
calcium
s c o r e
i n
t h e c o n t r o l
and
c a s e g r o u p s .
The
median
a l c i u m
s c o r e i n t h e
c o n t r o l g r o u p i s 0
compared
t o
259 n
t h e
c a s e g r o u p . The median
calcium
s c o r e i s
0
o r
both
f e m a l e s and m a l e s i n
t h e
c o n t r o l g r o u p and 315 and
2 5 6 ,
r e s p e c ti v e l y , i n t h e c a s e g r o u p .
TABLE
Summar y
t a t i s t i c s f o r Calcium
s c o r e
C o n t r o l s Cases
Calcium s c o r e A l l Females Males A l l
Females
Males
N
100
59
41 100 1 5 8 5
SD
5 . 6
0 . 7 8 . 7 474.7
3 6 5 . 1
4 9 3 . 3
95
CI
f o r median
0 - 0
0 - 0 0 - 0
3 1 3 . 5 - 2 1 5 . 0 1 7 4 . 8 — 5 38 . 0 3 0 0 . 4 — 2 0 7 . 5
Median
0 0 0 259 315 256
Min 0 0 0 100 100 100
MaX 56 5 56 2 7 94 1507 2794
Summary
t a t i s t i c s f o r hsCRP
[ 0 1 5 6 ]
F I G .
3
shoWs
t h e d i s t r i b u t i o n c u r v e f o r
a l l 200
s u b
j e c t s t e s t e d .
[ 0 1 5 7 ]
T a b l e
3
beloW shoWs
t h e
summary
s t a t i s t i c s f o r
hsCRP
n t h e c o n t r o l and a s e
g r o u p s .
The
median
hsCRP
n
b o t h
t h e c o n t r o l
g r o u p and
t h e
c a s e
g r o u p i s 1 . 2
mg/L. The
median
hsCRP i s 1 . 6 mg/L
f o r
f e m a l e s a n d 0 . 7 mg/L
f o r
m a l e s i n t h e c o n t r o l g r o u p a n d
1 . 3
mg/L a n d 1 . 1 m g / L ,
r e s p e c ti v e l y , i n t h e c a s e g r o u p .
TABLE
Summary
t a t i s t i c s
f o r hsCRP
C o n t r o l s Cases
hsCRP A l l
Females Males
A l l
Females Males
N 100 59 41 100 1 5 8 5
SD 6 . 6 3
8 . 3 6
1 . 5 3 1 2 . 7 0 3 . 1 6
1 3 . 7 1
95
CI
f o r median 0 . 7 9 - 1 . 4 7 1 . 3 6 - 2 . 7 4 0. 5 6 - 0 . 9 7 0 . 9 4 - 1 . 5 6 0 . 6 5 - 2 . 5 3 0 . 8 9 - 1 . 5 9
Median
( m g / L )
1 . 1 7 1 . 5 9
0 . 6 8
1 . 2 3 1 . 2 8
1 . 1 1
Min ( m g / L ) 0 . 1 5 0 . 1 5 0 . 1 5 0 . 1 7 0 . 3 4 0 . 1 7
Max m g / L )
6 2 . 1
6 2 . 1 9 . 2 9 1 2 0 . 0
1 1 . 9
1 2 0 . 0
7/27/2019 US20110318847.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/us20110318847pdf 20/21
US 2011/0318847
A 1
1
2
Summary t a t i s t i c s f o r Hcy
[ 0 1 5 8 ] F I G . 4 shows t h e d i s t r i b u t i o n c u r v e f o r
a l l 200
s u b
j e c t s t e s t e d .
[ 0 1 5 9 ]
T a b l e 4
b e l o w s h o W s
t h e
summary
t a t i s t i c s
f o r
Hcy
i n t h e c o n t r o l
and
a s e
g r o u p s .
The
median Hcy
o n c e n t r a t i o n
i n t h e c o n t r o l g r o u p i s
7 . 5
u m o l / L compared o 8 . 5 u m o l / L
i n
t h e
c a s e
g r o u p .
The
median
Hcy
o n c e n t r a t i o n
s
7 . 1 5
umol/L
f o r f e m a l e s and . 5 5
mol/L
o r
m a l e s
i n
t h e c o n t r o l g r o u p and
7 . 3 5
umol/L a n d 8 . 5 5 u m o l / L r e s p e c t i v e l y i n t h e
c a s e g r o u p .
TABLE
Summary
t a t i s t i c s
f o r Hcv
C o n t r o l s Cases
Hcy A l l F e m a l e s
M a l e s
A l l F e m a l e s
M a l e s
N 100 59 41 100
1 5
8 5
SD 1 . 9 4 1 . 5 8 2 . 1 8 6 . 0 3 2 . 1 8 6 . 4 6
95 CI 7 . 7 - 8 . 5 7 . 1 - 7 . 9 8 . 1 - 9 . 5 8 . 1 - 1 0 . 6 . 8 - 9 . 2 8 1 - 1 0 9
f o r median
Median 7 . 5 7 . 1
8 . 5
8 . 5 7 . 3 8 . 5
( p I n o l / L )
Min
( p I n o l / L ) 5 . 3 5 . 3 5 . 3 5 . 1 5 . 1 5 . 2
Max
p I n o l / L ) 1 4 . 7 1 1 . 8 1 4 . 7
6 5 . 8 1 2 . 4 6 5 . 8
C o m p a r i s o n b e t W e en
c a l c i u m s c o r e
a n d
a l p r o t e c t i n ,
h s C R P ,
H c y
( i ) C h i - S q u a r e d
T e s t
[ 0 1 6 0 ] U s i n g M i n i t ab , c h i - s q u a r e d t a b l e s W e r e
p e r f o r m e d
( s e e
t a b l e
5 b e l o W ) . T h i s
e s t
c o m p a r e s e x p e c t e d d i s t r i b u t i o n s
betWeen
s e t s
o f
d a t a ( a s s u m i n g a
random d i s t r i b u t i o n ) and
t h o s e o b s e r v e d .
The
s i g n i ? c a n c e v a l u e
i s
a
measure
o f
t h e
d e g r e e t o Which t h e d a t a
i s n o t
randomly d i s t r i b u t e d . F o r
e x a m p l e ,
c o n s i d e r i n g
t h e
d a t a
f o r
c a l p r o t e c t i n p o s i t i v e i t
Would e
e x p e c t e d
t h a t t h e r e Would e
an
even p i l t betWeen
c a l c i u m
p o s i t i v e
a n d
n e g a t i v e
( i . e .
3 0 . 5
e x p e c t e d
i n b o t h
c o l u m n s ) .
T h e o b s e r v e d s p l i t , h o W e v e r ,
i s
2 2 n e g a t i v e a n d 3 9
p o s i t i v e
i n d i c a t i n g
a
t e n d e n c y
f o r t h e c a l p r o t e c t i n p o s i t i v e s
t o
c o - v a r y
W i t h
t h e
c a l c i u m p o s i t i v e s .
[ 0 1 6 1 ] M i n i t a b
p r o v i d e s a n
o v e r a l l
measure o f
t h e s i g n i ?
c a n c e
o f t h e s e d i f f e r e n c e s ( b o t h a g r e e m e n t
a n d
d i s a g r e e
ment)
and
i n t h i s c a s e P s 0 . 0 0 9 . Thus t h e r e
i s
a s i g n i ? c a n t
c o - v a r i a t i o n o f c a l c i u m W i t h c a l p r o t e c t i n .
TABLE
C h i - S q u a r e comparison of a l p r o t e c t i n v e r s u s Calcium
s c o r e
C a l c i u m ( c o 1 0 0 )
C a l p r o t e c t i n
N e g a t i v e
P o s i t i v e A l l
( c o 0 . 4 5 m g / L )
( N ) ( N ) ( N )
N e g a t i v e Obs 7 8
6 1
1 3 9
Exp 6 9 . 5 6 9 . 5
1 3 9
P o s i t i v e
O bs
22 39
6 1
Exp 3 0 . 5
3 0 . 5 6 1
A l l O bs
100 100
200
Exp 1 0 0 1 0 0 200
[ 0 1 6 2 ]
A n
a n a l o g o u s c o m p a r i s o n Was made
b e t W e e n
c a l p r o t e c t i n a n d hsCRP s e e
T a b l e
6
b e l o W ) .
D e c . 2 9 , 2 0 1 1
TABLE
C h i - S q u a r e
c o m p a r i s o n
o f a l p r o t e c t i n
versus hsCRP
P =
0 )
hsCRP
( c o
1 . 6 9 m g / L )
C a l p r o t e c t i n N e g a t i v e
P o s i t i v e A l l
( c o 0 . 4 5
m g / L ) ( N ) ( N ) ( N )
N e g a t i v e Obs 1 0 0 3 9
1 3 9
Exp 8 8 . 9 6 5 0 . 0 4
1 3 9
P o s i t i v e O bs
28 33
6 1
Exp 3 9 . 0 4 2 1 . 9 6 6 1
A l l O bs
128 72
200
Exp 1 2 8
7 2
200
( i i )
O d d s R a t i o
[ 0 1 6 3 ] Odds a t i o s can
e
d e r i v e d
from a b l e s 5 and 6 and
g i v e
a
measure
of
hoW
f a r
t h e
v a l u e s
observed
d e v i a t e
from
t h e e x p e c t e d . I f t h e e x p e c t e d a g r e e m e n t ? g u r e s
a r e
m u l t i p l i e d
t o g e t h e r
a n d
d i v i d e d
b y
t h e
p r o d u c t o f
t h e
d i s a g r e e m e n t
e x p e c t e d ? g u r e s
a
v a l u e o f
s h o u l d
b e
o b t a i n e d .
[ 0 1 6 4 ] T a k i n g t h e d a t a i n T a b l e 6 ,
f o r
i n s t a n c e , t h e o d d s
r a t i o on t h e e x p e c t e d v a l u e s i s 1 : ( 8 8 . 9 6 > < 2 1 . 9 0 / ( 5 0 . 0 4 > < 3 9 .
0 4 ) . 1 9 5 3 . 6 4 / 1 9 5 3 . 6 : 1 .
[ 0 1 6 5 ] The o d d s r a t i o
o b s e r v e d i n
t h i s
t a b l e
i s :
( l 0 0 > < 3 3 ) /
( 3 9 x 2 8 ) : 3 3 0 0 / 1 0 9 2 : 3 . 0 2 .
[ 0 1 6 6 ]
The
f u r t h e r t h e o d d s r a t i o from 1 t h e
more p r o
nounced h e
c o - v a r i a t i o n ; a n o d d s
r a t i o
o f
3
i s s i g n i ? c a n t .
[ 0 1 6 7 ] The e s u l t s of an odds
r a t i o
a n a l y s i s c a r r i e d o u t on
t h e c o - v a r i a n c e
d a t a
o b t a i n e d from t h e s t u d y a r e shoWn i n
T a b l e
7 .
TABLE
Summary f
O d d s - R a t i o
? n d i n g s
R i s k m a r k e r s
Odds
a t i o
( N l # p o s , N 2 # n e g ) C a l c i u m C a l p r o t e c t i n
CRP
Calcium Score
(co
100)
Calprotectin (co 0.45 mgL) 2. 27 i i
CRP c o 1 . 6 9 mgL)
1 . 0 0 3 . 0 2 i
Hcy c o 1 2 p I n o l / L ) 1 . 2 1 1 . 3 2 1 . 5 2
N1 =11,N2 = 1 8 9
( c o
10
p I n o l / L ) 1 . 6 3 1 . 5 5 1 . 1 2
co =
cutoff
[ 0 1 6 8 ]
A i g h
o d d s r a t i o
i n d i c a t e s a h i g h
d e g r e e
o f
c o
v a r i a t i o n betWeen h e e s t s . I t canbe e e n from a b l e 7 t h a t t h e
t e s t f o r c a l p r o t e c t i n g i v e s t h e h i g h e s t o d d s r a t i o t o c a l c i u m
s c o r e and h e r e f o r e t
can be
deduced h a t c a l p r o t e c t i n
h a s
t h e
h i g h e s t d e g r e e o f c o v a r i a n c e W i t h c a l c i u m
s c o r e
o u t o f
c a l p r o t e c t i n , CRP n d h o m o c y s t e i n e .
[ 0 1 6 9 ] A d d i t i o n a l l y ,
c a l p r o t e c t i n g i v e s a h i g h o d d s
r a t i o
W i t h
CRP,
a n o t h e r m a r k e r
f o r C V D .
C h i - S q u a r e d n a l y s i s U s i n g M i n i t a b
[ 0 1 7 0 ]
A h i - s q u a r e d e s t
on h e
a b o v e
d a t a ,
u s i n g
t h e
same
c u t - o f f s a s th e o d d s - r a t i o t e s t , shoWed s i g n i ? c a n t ( P 0 . 0 0 9 )
a g r e e m e n t
betWeen t h e c a l c i u m s c o r e and c a l p r o t e c t i n
7/27/2019 US20110318847.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/us20110318847pdf 21/21