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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
PABLO DE CASTRO SANTOS
OBTENÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA VERMELHA COMESTÍVEL Gracilaria birdiae E SUA
INFLUÊNCIA NA FORMAÇÃO E MORFOLOGIA DE CRISTAIS DE OXALATO DE CÁLCIO
NATAL
2016
PABLO DE CASTRO SANTOS
OBTENÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA VERMELHA COMESTÍVEL Gracilaria birdiae E SUA
INFLUÊNCIA NA FORMAÇÃO E MORFOLOGIA DE CRISTAIS DE OXALATO DE CÁLCIO
Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Bioquímica. Orientador: Dr. Leandro Silva Costa.
NATAL 2016
Dedico esta tese:
Ao meu co-orientador Hugo Alexandre de Oliveira Rocha pela amizade,
incentivo, paciência, seu convívio acadêmico e pessoal e por acreditar
que eu poderia realizar este trabalho. Agradeço por me oportunizar
ótimos momentos de aprendizagem científica e por compartilhar alguns
anos de sua vida tentando me ensinar um pouco do que aprendeu; Ao
meu orientador Leandro Silva Costa, pela amizade, apoio e
disponibilidade em me auxiliar. À minha família biológica e a que eu me
inseri após o casamento, pelo amor, apoio e compreensão. Em especial
as meninas da minha vida, minha mãe Anna Delma e a minha esposa
Ana Karinne.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente ao Grande Arquiteto do Universo, por permitir o
fenômeno da vida. A Minha Mãe Anna Delma e a Minha esposa Ana
Karinne, por estarem ao meu lado nos momentos mais difíceis e por
sonharem os meus sonhos comigo, por apoiarem minhas decisões,
torcer e aplaudir nos momentos certos e chamar atenção nos momentos
necessários. Sem o apoio de vocês eu não chegaria tão longe. Portanto,
muito obrigado. Podem contar comigo nas situações de mais adversas,
estarei com vocês. Amo vocês!!!!!!!
Ao meu sogro Elisberto, minha sogra Josélia, meu cunhado Luiz
Gustavo, por compartilharem momentos importantes da minha vida.
À meus primos (Armando, Paulo, Thiago, Oscar, Arthur, Karl e Victor) e
primas (Anna Lucy, Anuska, Larissa e Camille) que cresceram comigo e
me acompanharam ao longo da vida.
Às minhas tias (Anna d’arc, Anna Dilma, Anna Dulce e Anna Deyse) e
aos meu tios/amigos, Neto, Eimar, Álvaro, Robson, pois contribuem e
contribuíram de forma muito significativa na minha formação.
À minha Mãe, novamente, pois sempre me priorizou, mesmo nos
momentos mais difíceis nunca me deixou faltar nada e me ensinou a
caminhar com meus próprios pés de forma humilde e conduzindo a vida
com honestidade e dignidade. Te amo Mãe!!!
A minha esposa Ana Karinne, mais uma vez, por ser amiga,
companheira e enfrentar muitos desafios ao meu lado. Obrigado por
tornar permitir que eu possa ser parte de sua vida, meus dias são
melhores e mais felizes com você. Obrigado por ser, muitas vezes meus
braços e pernas. Te amo muito!!!
Ao meu Co-orientador Hugo Rocha, pela amizade, paciência, dedicação,
apoio, e oportunidades científicas. Obrigado por todos os momentos que
me dedicou desde 2007, no mestrado ainda. Muito obrigado por
entender, acreditar e fazer parte deste meu sonho. Obrigado por
contribuir com meu amadurecimento acadêmico e profissional e por ter
depositado confiança em mim. Muito obrigado meu amigo!!!!!!
Aos meus amigos do BIOPOL: Almino, Ana Karina, Arthur, Cinthia,
Danielle, Dayanne, Gabriel, Hugo, Ivan, Jailma, Jéssyka, Joanna, Karol,
Larisse, Leandro, Leonardo, Letícia, Mariana, Marília, Maxsuell, Moacir,
Monique, Ruth (rot, rot rot), Rafael, Raniere, Roni e Vinícius, por terem
me auxiliado sempre que precisei e por compartilharem da amizade de
vocês. Gostaria de agradecer em especial a Jaílma, Dayanne, Karol e
Gabriel e Rafael, por me ensinarem muita coisa no BIOPOL e por serem
pessoa excelentes.
Obrigado por permitirem compartilhar momentos que ficarão para
sempre na minha história, desde um simples cafezinho, até um rafting
nas cataratas do Iguaçu!! Agradeço a Leandro, meu orientador e amigo,
você é o cara!!!
MUITO OBRIGADO A TODOS DA FAMILIA BIOPOL!!!!
Aos meus amigos Professores e funcionários da UnP de Mossoró que
sempre me ajudaram, da melhor forma, nos momentos mais críticos do
doutorado, meus sinceros agradecimentos!!!
Aos meus amigos da UERN de Caicó, muito obrigado pela companhia,
amizade e por me receberem de braços abertos.
À banca de qualificação (professores Marcelo Silva, Eudes Euler e Ruth
Medeiros) pelas contribuições e melhorias na qualidade deste trabalho.
Aos professores do Departamento de Bioquímica, que de alguma forma,
contribuíram para minha formação. Ao Prof. Luiz Diz e Luciana da Matta,
pois abriram as portas da bioquímica para mim em 2004.
Aos funcionários, Carla Laize dos Santos Cruz Costa e Igor Zumba
Damasceno, do Laboratório de Caracterização Estrutural de Materiais/
Departamento de Engenharia de Materiais – DEMat – UFRN, pelo auxilio
na obtenção dos dados de Microscópia Eletrônica de Varredura e
Espectroscopia de Energia Dispersiva.
Ao professor Dárlio Inácio Alves Teixeira, pelo apoio durante o doutorado
e pela imagem de G. birdiae cedida para esta tese.
Aos funcionários do Departamento de Bioquímica e integrantes dos
demais laboratórios, muito obrigado pela ajuda ao longo dessa jornada.
Ao Programa de Pós Graduação em Bioquímica da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte pelas condições necessárias para o
desenvolvimento deste trabalho;
À Coordenação de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo
financiamento desta pesquisa.
“Conhecer e pensar não é chegar a uma verdade absolutamente certa,
mas dialogar com a incerteza” Edgar Morin
RESUMO
A urolitíase afeta aproximadamente 10% da população mundial e está associada fortemente a presença de cristais de oxalato de cálcio (OxCa). Atualmente não existe nenhum composto eficiente que pode ser utilizado para prevenir esta doença. No entanto, alguns polissacarídeos sulfatados (PS) de algas marinhas marrons demonstraram capacidade de inibir a formação de cristais de OxCa e alterar a morfologia destes in vitro. Os PS da alga vermelha Gracilaria birdiae têm atividades biológicas importantes, mas até o presente momento não foi avaliada como inibidora da formação de cristais de OxCa. O presente estudo teve como objetivo obter PS e verificar seu efeito na formação do OxCa. Para tal, extratos ricos em polissacarídeos foram obtidos utilizando extração alcalina, sonicação, digestão proteolítica, seguida por precipitação com etanol. Esses extratos ricos em PS (EB) foram separados em 5 frações (F-0.25; F-0.5; F-0.75; F-1.0 e F-1.25) através de cromatografia de troca iônica DEAE-celulose. A eletroforese em gel de agarose, infra vermelho e análises químicas mostraram que essas frações contêm o mesmo pool de polissacarídeos sulfatados ricos em galactose. F-0.25; F-0.5; F-0.75; F-1.0 foram capazes de inibir etapas importantes da formação dos cristais de OxCa, como a nucleação e agregação, no entanto a F-0.25 promoveu a maior inibição da nucleação em 76,92% e da agregação em 68,57%. As frações F-0.25 e F-0.5 foram capazes de inibir em 6 e 7 vezes, respectivamente, o número de cristais OxCa monohidratados (COM) formados in vitro, enquanto que as frações F-0.75 e F-1.0, reduziram apenas em 1,5 vezes. A morfologia dos cristais de OxCa foi afetada principalmente pelas amostras, EB, F-0.25; F-0.5 e F-0.75, pois promoveram as variações mais destoantes em relação ao controle. A análise do potencial zeta (ζ) dos cristais formados na presença das amostras, constatou um aumento de cargas negativas em suas superfícies. Através das imagens obtidas por microscopia de fluorescência, foi constatado que os PS estão distribuídos de forma homogênea nos cristais dihidratados (COD) e de forma periférica nos COM. Os dados obtidos através da microscopia eletrônica de varredura(MEV) e espectroscopia de energia dispersiva (EDS) revelaram grandes variações na distribuição de átomos de oxigênio e cálcio na superfície dos cristais na presença das F-0.25 e F-0.5. A células renais HEK-293, MDCK e 786-0 tiveram baixa toxicidade na presença do extrato bruto e das frações F-0.25; F-0.5; F-0.75. Estas amostras protegeram células renais MDCK e verificou-se um efeito reparador contra danos causados pelo H2O2 e OxCa. Por fim, as células MDCK submetidas ao tratamento prévio e simultâneo com a F-0.25 e a F-0.5 na presença de H2O2 e OxCa, reduziram a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). Com isto, verifica-se que PS da G. birdiae podem ser potenciais alvos farmacológicos do ponto de vista preventivo, terapêutico e reparador de danos causados pela urolitíase, porém é importante que outros estudos sejam realizados in vivo, bem como, sejam realizados experimentos para elucidar os mecanismos precisos de ação, pelos quais estes PS protegem as células contra danos por H2O2. Palavras-chave: algas vermelhas, galactana sulfatada, cálculo renal, nefrolitíase
ABSTRACT
The urolithiasis disease affects approximately 10% of the world's population and is strongly associated calcium oxalate crystals (CaOx). Until now, there is not an efficient compound that can be used to prevent this disease. However, some sulfated polysaccharides (SP) from brown seaweeds exhibited an ability to inhibit the formation of CaOx crystals and change the morphology in vitro. SP from the red seaweed Gracilaria birdiae has important biological activities, but they have not been evaluated as inhibitor of CaOx crystals formation. This study aimed to obtain SP from this seaweed and evaluate their effect on CaOx crystals formation. Thus, sulfated polysaccharide-rich extract (EC) was obtained using alkaline extraction, sonication, proteolytic digestion followed by ethanol precipitation. This extract was fractionated into five fractions (F-0.25; F-0.5; F-0.75; F-1.0; F-1.25) by DEAE-cellulose ion-exchange chromatography. Agarose gel electrophoresis, infrared and chemical analysis showed that these fractions contain the same pool of sulfated galactose-rich polysaccharides. F-0.25; F-0.5; F, 0.75; F-1.0 were able to inhibit important formation steps of the CaOx crystals, as nucleation and aggregation, we highlight F-0.25 that promoted the highest inhibition of nucleation in 76.92% and aggregation in 68.57%. The F-0.25 and F-0.5 fractions were able to reduce approximately 6 and 7 times, respectively, the number of these CaOx monohydrated crystals (COM) formed in vitro, whereas F-0.75 and F-1.0 fractions reduced this number only 1.5 times. The morphology of CaOX crystals was mainly affected by the samples EC, F-0.25; F-0.5 and F-0.75, they promoted the most discordant variations in the control. The analysis of the zeta potential (ζ) of the crystals formed in the presence of the samples was found an increase of negative charges on their surfaces. Through the images obtained by fluorescence microscopy revealed that the PS are distributed homogeneously in the dehydrated crystals (COD) and peripherally in COM. The data obtained by scanning electron microscopy (SEM) and energy dispersive spectroscopy (EDS) revealed wide variations in the distribution of oxygen and calcium atoms on the surface of the crystals in the presence of F-0.25 and F-0.5. The kidney cells HEK-293, MDCK and 786-0 showed low toxicity in the presence of EC and fractions F-0.25; F-0.5; F, 0.75. These samples protected kidney MDCK cells against damage caused by H2O2 and CaOx. Finally, the MDCK cells treated beforehand and concomitant with both F-0.25 and F-0.5 in the presence of H2O2 and CaOx, reduced the activity of superoxide dismutase and catalase enzymes. Overall, the data showed that PS G. birdiae may be potential pharmacological targets for preventive, therapeutic and repairing damage caused by urolithiasis. However, it is important that to make set in vivo experiments, as well as, experiments to elucidate the precise mechanism of action by which these PS protect the H2O2 damage on cells.
Keywords: red algae, sulfated galactans, kidney stones, nephrolithiasis.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 Representantes dos três principais grupos de algas: A - Spatoglossum crassum (Stramenopiles); B - Caulerpa cupressoides (Chloroplastida); C - Gracilaria brevis (Rhodophyceae).....................................................................................................
21
FIGURA 2 Mapa dos oceanos Indo-Pacífico e Atlântico e presença de gênero de algas marinhas, adaptada de Kerswell (2006).....................................................................................................................
21
FIGURA 3 Distribuição da produção de algas entre países....................................................................................................................
23
FIGURA 4 Representação estrutural de dissacarídeos sulfatados de algas vermelhas............................................................................................................
26
FIGURA 5 Estrutura das principais carragenanas utilizadas comercialmente..................................................................................................
27
FIGURA 6 Fatores que influenciam a formação dos cristais de OxCa....................................................................................................................
33
FIGURA 7 Fases da formação de cristais urinários..............................................................................................................
34
FIGURA 8 Diversidade morfológica (COM, COD e COT) de cristas de OxCa através de microscopia eletrônica de varredura...............................................................................................................
35
FIGURA 9 Figura representativa de sucessivos passos para formação das pedras de cálculo renal na placa de Randall.................................................................................................................
37
FIGURA 10 Cálculos renais formados por cristais monohidratados com a presença de placas de Randall.................................................................................................................
38
FIGURA 11 Imagem da alga Vermelha Gracilaria birdiae..................................................................................................................
43
FIGURA 12 Imagem do município de Rio do Fogo com coordenadas geográficas.........................................................................................................
44
FIGURA 13 Esquema representativo das etapas do estudo realizadas nesta tese........................................................................................................................
45
FIGURA 14 Lâmina de eletroforese em gel de agarose 0,6% contendo o
extrato bruto e frações polissacarídicas da alga marinha vermelha G. birdiae....................................................................................................................
56
FIGURA 15 Influencia do extrato bruto e frações polissacarídicas da G. birdiae sobre a quantidade e tamanho dos cristais...................................................................................................................
61
FIGURA 16. Influência de amostras contendo polissacarídeos sulfatados extraídos de G. birdiae sobre a formação e morfologia dos cristais de OxCa......................................................................................................................
64
FIGURA 17 Avaliação do potencial zeta (ζ ) sobre os cristais formados na presença e ausência de PS...........................................................................................................................
65
FIGURA 18 Microscopia de fluorescência de cristais de OxCa, formados na presença de polissacarídicas sulfatados de G. birdiae. Imagens de microscopia óptica(A,C,E) e de fluorescência (60x) (B,D,F) contendo cristais de OxCa formados na presença de polissacarídeos sulfatados conjugados com fluoresceína sobre a mesma área........................................................................................................................
67
FIGURA 19 Microscopia eletrônica de varredura, morfologia e indicação de regiões específicas dos cristas de OxCa formados na presença de PS G. birdiae, para quantificação de átomos...................................................................................................................
68
FIGURA 20 Imagens obtidas através de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de energia dispersiva (EDS) dos cristais de OxCa associados a frações polissacarídicas de G. birdiae....................................................................................................................
71
FIGURA 21 Influência do extrato bruto e frações polissacarídicas de G. birdiae sobre a capacidade de redução do MTT para células renais HEK-293 (A), MDCK(B) e a linhagem tumoral renal 786-0(C), após 24h de incubação..............................................................................................................
73
Figura 22 Avaliação do efeito pré-dano (A) pós-dano (B) das frações polissacarídicas de G. birdiae sobre a viabilidade de células da linhagem MDCK, submetidas a danos oxidativos pela exposição a 0,5 mM de H2O2 por 3 horas (ic=50) com posterior exposição a 3 mM de OxCa por 24 horas..........................................................................................................
76
FIGURA 23 Efeitos de frações polissacarídicas sobre as atividades de SOD (A) e CAT (B) em U/mg/Proteína.......................................................................................................
78
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Estrutura das unidades dissacarídicas encontradas nas galactanas (carragenanas) de algas vermelhas............................................................................................................
28
TABELA 2 Algumas atividades farmacológicas de Polissacarídeos sulfatados extraídos de algas marinhas................................................................................................................
29
TABELA 3 Sinais de espectros de infravermelho para amostras contendo PS obtidos em condições semelhantes às de Fidelis e colaboradores (2014)....................................................................................................................
54
TABELA 4 Rendimento de frações polissacarídicas de G. birdiae em coluna de DEAE-Celulose ..............................................................................................................................
55
TABELA 5 Composição química do extrato bruto e frações polissacarídicas da alga marinha vermelha Gracilaria birdiae...................................................................................................................
57
TABELA 6 Composição monossacarídica do extrato bruto e frações contendo PS da alga marinha vermelha Gracilaria birdiae...................................................................................................................
57
TABELA 7 Sinais assinalados de absorção referentes a espectroscopia de Infravermelho do extrato bruto e frações de polissacarídeos sulfatados de Gracilaria birdiae....................................................................................................................
59
TABELA 8 Efeito dos polissacarídeos sulfatados de G. birdiae sobre a nucleação e agregação de cristais de OxCa......................................................................................................................
60
TABELA 09 Tabela contendo as porcentagens de átomos em diferentes áreas dos cristais de OxCa formados na presença de PS da G. birdiare...................................................................................................................
69
LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS
AGPI Ácidos Graxos Poliinsaturados
AINES Anti inflamatórios não esteroidais
AnGal Anidro galactose
ANOVA Análise de Variância
BIOPOL Laboratório de biotecnologia de polímeros naturais
Ca2+ Cálcio
OxCa Oxalato de cálcio
CaP Fosfato de cálcio
C2 Carbono 2
C4 Carbono 4
CAT Catalase
COD Cristal dihidratado
COM Cristal monohidratado
COT Cristal trihidratado
DMB Dimetil Metileno
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
EB Extrato Bruto
EDS Espectroscopia de energia dispersiva
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EROS Espécies reativas de Oxigênio
FAO Food and Agriculture Organization of
United Nations
FITC Isotiocianato de fluoresceína
GAL Galactose
GPx Glutationa peroxidase
GSH Glutationa Reduzida
HCl Ácido clorídrico
HPLC Cromatografia líquida de alta
performance
Ic50 Concentração mínima inibitória capaz de matar 50% dos organismos
IV Infravermelho
K+ Potássio
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
MTT brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-
2,5difeniltetrazólio brometo
Nd Não detectado
OPN Osteopontina
PBS Tampão salino-fosfato
PDA Diaminopropano acetato
PGs Prostaglandinas
PS Polissacarídeos Sulfatado
PST Polissacarídeos Sulfatados Totais
RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute
SDS Dodecil sulfato de sódio
SFB Soro fetal bovino
SOD Superóxido dismutase
IV Infravermelho
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
pH Potencial Hidrogeniônico
Redealgas Rede Nacional em Biotecnologia de
Macroalgas Marinhas
RPM Rotações por minuto
SAR
Stramenopiles, Alveolata, Rhizaria
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 20
1.1 ALGAS E MACROALGAS MARINHAS ...................................................................... 20
1.2 UTILIZAÇÃO E POTENCIALIDADES DAS MACROALGAS MARINHAS................... 22
1.3 POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARINHAS .................................. 24
1.4 O GÊNERO GRACILARIA E POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS
VERMELHAS................................................................................................................... 25
1.5 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE
ALGAS MARINHAS ......................................................................................................... 29
1.6 ATIVIDADES DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE Gracilaria birdiae ........... 32
1.7 FORMAÇÃO DE CRISTAIS DE OxCa E INTERFERÊNCIA ATRAVÉS DE
POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS. ........................................................... 32
1.7.1 Urolitíase ............................................................................................................... 32
1.7.2 Influência dos cristais de OxCa e estresse oxidativo na formação de cálculo
renal...................................................................................................................................34
1.7.3 Polissacarídeos sulfatados de algas com atividade antiurolítica
………………399
2 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 41
2.1 MATERIAIS ............................................................................................................... 41
2.1.1 Reagentes .............................................................................................................. 41
2.1.2 Equipamentos Laboratoriais ................................................................................ 42
2.1.3 Material biológico ................................................................................................ 43
2.2 MÉTODOS ................................................................................................................. 43
2.2.1 Coleta da Gracilaria birdiae .................................................................................. 43
2.3 Obtenção dos polissacarídeos SULFATADOS DA ALGA MARINHA G. birdiae .. 44
2.3.1 Panorama da obtenção dos PS da alga marinha G. birdiae ............................... 44
2.3.2 Extração de polissacarídeos da G. bridiae ......................................................... 45
2.3.3 Fracionamento de Polissacarídeos da G. birdiae em coluna de DEAE–
celulose ............................................................................................................................46
2.4 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS POLISSACARÍDEOS EXTRAÍDOS DA
G.birdiae………………………………………………………………………….……...………..46
2.4.1 Dosagem de Açúcares Totais .............................................................................. 46
2.4.2 Dosagem de Sulfato.............................................................................................. 46
2.4.3 Dosagem de Proteínas ......................................................................................... 47
2.4.4 Dosagem de compostos fenólicos ...................................................................... 47
2.4.5 Determinação da Composição Monossacarídica ............................................... 47
2.4.6 Eletroforese em gel de agarose ........................................................................... 48
2.4.7 Espectroscopia de Infravermelho ........................................................................ 48
2.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE PS SOBRE A FORMAÇÃO DE CRISTAIS DE
OXCA .............................................................................................................................. 49
2.5.1 Ensaio de cristalização do OxCa ......................................................................... 49
2.5.2 Análise da morfologia dos cristais de OxCa por imagem de microscópica
óptica .............................................................................................................................. 49
2.5.3 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Espectroscopia de Energia
Dispersiva (EDS) ............................................................................................................ 50
2.5.4 Medida do potencial zeta (ζ) dos cristais de OxCa ............................................. 50
2.5.5 Utilização da microscopia de luz clara para análise da morfologia dos cristais
de OxCa .......................................................................................................................... 50
2.6 ENSAIO DO MTT ....................................................................................................... 51
2.6.1 Ensaio de redução do MTT a cristal de formazan............................................... 51
2.7 AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DE PS SOBRE LINHAGENS CELULARES
SUBMETIDAS A DANOS POR H2O2 E OXCA ................................................................ 52
2.7.1 Efeito protetor de polissacarídeos sulfatados de G. birdiae sobre a linhagem
celular renal MDCK, submetida a dano por peroxido de hidrogênio e OxCa. ........... 52
2.8 DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES, ........................ 52
2.8.1 Determinação de atividade enzimática antioxidante de superóxido dismutase-
SOD (EC 1.15.1.1), catalase-CAT (EC 1.11.1.6). ........................................................... 52
2.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................ 53
3 RESULTADOS .................................................................................................................. 54
3.1 EXTRAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS DA ALGA MARINHA G. birdiae ..................... 54
3.2 CARACTERIZAÇÃO DE AMOSTRA POR ESPECTROSCOPIA DE INFRA
VERMELHO. ................................................................................................................... 54
3.3 FRACIONAMENTO DE PS PRESENTES NO EXTRATO BRUTO ATRAVÉS DE
CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA (DEAE–CELULOSE.) ..................................... 54
3.4 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE DAS FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS
OBTIDAS DA ALGA MARINHA VERMELHA Gracilaria birdiae ....................................... 55
3.5 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE AÇUCARES TOTAIS, SULFATO, COMPOSTOS
PROTEICOS E FENÓLICOS PRESENTES NAS AMOSTRAS CONTENDO PS DA ALGA
VERMELHA G. birdiae ..................................................................................................... 56
3.6 DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA DO EXTRATO BRUTO
E FRAÇÕES CONTENDO PS DA ALGA VERMELHA G. birdiae .................................... 57
3.7 SINAIS DE INFRAVERMELHO (IV) DO EXTRATO BRUTO E DAS FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DA ALGA VERMELHA Gracilaria birdiae .... 58
3.8 AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DAS AMOSTRAS POLISSACARÍDICAS DA ALGA
VERMELHA G. BIRDIAE NA FORMAÇÃO DE CRISTAIS DE OxCa” .............................. 59
3.9 INFLUÊNCIA DE AMOSTRAS PS DE G. BIRDIAE SOBRE A FORMAÇÃO DOS
CRISTAIS DE OxCa. ....................................................................................................... 60
3.10 INFLUÊNCIA DAS AMOSTRAS SOBRE A MORFOLOGIA DOS CRISTAIS DE
OxCa ............................................................................................................................... 63
3.11 MEDIDA DO POTENCIAL ZETA (ζ) DOS CRISTAIS DE OxCa OBTIDOS NA
PRESENÇA DE PS DA G. birdiae ................................................................................... 66
3.12 MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA DE CRISTAIS DE OxCa FORMADOS NA
PRESENÇA DE PS da G. birdiae .................................................................................... 65
3.13 ANÁLISE DOS CRISTAIS DE OXCA POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE
VARREDURA (MEV) E ESPECTROSCOPIA DE ENERGIA DISPERSIVA (EDS) ........... 68
3.14 AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EXTRATO BRUTO E FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE G. birdiae, SOBRE A CAPACIDADE DAS
CÉLULAS RENAIS EM REDUZIR O MTT ....................................................................... 72
3.15 ATIVIDADE DAS AMOSTRAS POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE G.
birdiae SOBRE A VIABILIDADE CELULAR DE MDCK, AVALIADA PREVIAMENTE E
POSTERIORMENTE AO DANO CAUSADO POR H2O2 E OxCa. .................................... 74
3.16 DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA ANTIOXIDANTE DE
SUPERÓXIDO DISMUTASE-SOD (EC 1.15.1.1) E CATALASE-CAT (EC 1.11.1.6)
SOBRE CÉLULAS MDCK INCUBADAS COM FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS. .......... 77
4 DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 79
5. CONCLUSÕES ............................................................................................................... .92
REFERÊNCIAS.................................................................................................................... 93
20
1 INTRODUÇÃO
1.1 ALGAS E MACROALGAS MARINHAS
Os oceanos ocupam mais 70% da superfície terrestre e possuem uma
vasta diversidade de organismos marinhos que sintetizam diversos produtos
bioativos como os ácidos graxos poliinsaturados (AGPI), vitaminas, antioxidantes,
enzimas, peptídeos bioativos e polissacarídeos (WIJESEKARA et al., 2011). As
algas se enquadram neste contexto e constituem um grupo de organismos
aquáticos avasculares, autotróficos fotossintetizantes, podendo ser encontrados
nas formas unicelulares ou pluricelulares. (VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004).
Embora algumas algas sejam formadas por tecidos diferenciados, elas não
apresentam raízes, caules ou folhas verdadeiras (OLIVEIRA FILHO, 1977).
Habitam uma grande variedade de ambientes, como troncos de árvores, solos
úmidos, lagoas, rios e oceanos (VAN DEN HOECK et al., 1995). Sua
geodistribuição está relacionada a fatores como temperatura, disponibilidade de
luz solar, salinidade da água, disponibilidade de substrato, correntes dos oceanos
(marinhas), humidade do ar, assim como das condições físicas, químicas e
ambientais específicas (RAVEN; EVERT; EICHHNOR, 2007).
Recentemente, as macroalgas foram reclassificadas (ADL et al., 2012) e
distribuídas em dois dos cinco supergrupos propostos (Opisthokonta, Amoebozoa,
Excavata, Archaeplastida e SAR). De acordo com esta classificação, as algas
verdes e vermelhas pertencem ao supergrupo Archaeplastida e aos filos
Chloroplastida e Rhodophyceae, respectivamente e as algas marrons ao
supergrupo SAR (Stramenófila, Alveolata,Rhizaria), pertencente ao filo
Stramenopiles.
Segundo Boulin e colaboradores (2011) as macroalgas (Figura 1) estão
inseridas em três filos principais: Stramenopiles, formadas pelas algas marrons
ricas em clorofila c e carotenoides como a fucoxantina; as Chloroplastida,
constituem o filo das algas verdes que apresentam pigmentos de clorofila a e b,
além de carotenos e xantofila; e, as Rhodophyceae, as algas vermelhas, que
possuem como pigmento os carotenos e ficobilinas. Esta última constitui um dos
mais antigos grupos ancestrais eucariontes encontrados, o Bangiomorpha
pubescens com aproximadamente 1,2 bilhões de anos (BLOUIN et al., 2011).
21
Figura 1: Representantes dos três principais grupos de algas: A - Spatoglossum crassum (Stramenófila); B - Caulerpa cupressoides (Chloroplastida); C - Gracilaria brevis (Rhodophyceae); Fonte: http://www.algaebase.org/search/images/ (Acesso em 19.09.2015).
Estes organismos estão amplamente presentes em regiões litorâneas ao
redor do globo terrestre (Figura 2), são organismos pluricelulares e apresentam
linhas ancestrais independentes do ponto de vista filogenético, com exceção das
algas verdes, as quais têm relação com as embriófitas (plantas terrestres)
(STREIT et al., 2005). Segundo Guiry e Guiry (2008), existem 130.594 espécies
de macroalgas registradas no mundo, sendo que no Brasil existem 774
identificadas, compreendendo 482 algas vermelhas, 191 verdes e 101 pardas
(FUJII et al., 2008). Marinho-Soriano (2011) afirmaram que em 2011 pelo menos
820 táxons já foram identificados ao longo da costa brasileira e isto reflete sua
vasta diversidade no Brasil. Na costa nordeste brasileira os estados da Paraíba,
Rio Grande do Norte e Ceará se destacam pela diversidade da flora algal e no
tocante exploracao de espécies para fins comerciais, a atividade de maior porte
corresponde a coleta de algas vermelhas, com destaque para os gêneros
Gracilaria e Hypnea (RODRIGUES, 2006; OLIVEIRA et al., 2014).
Figura 2: Mapa dos oceanos Indo-Pacífico e Atlântico e presença de gênero de algas marinhas, adaptada de Kerswell (2006). No Oceano Indo-Pacífico, centros de diversidade ocorrem no sul da Austrália e do Japão, onde há 350-450 gêneros de algas. O arquipélago Indo-australiano e o Oceano Índico meridional têm riqueza moderada de 250-300 gêneros. O mar vermelho e a costa chilena apresentam uma diversidade atenuada com 150 gêneros. A costa leste do mapa apresenta uma diversidade maior do que a oeste, com a maior hotspot de biodiversidade no Atlântico, localizado ao longo do litoral europeu, que se estende até o sul de Marrocos com 250-300 gêneros. No atlântico sul existem de 150-200 gêneros. As áreas de menor diversidade ocorrem nas regiões polares, com menos de 100 gêneros.
A B C
22
Estas macroalgas marinhas possuem elevado valor nutritivo, são ricas em
carotenoides, proteínas, fibras, ácidos graxos, vitaminas, minerais e antioxidantes,
o que as tornam promissores organismos a serem explorados.
1.2 UTILIZAÇÃO E POTENCIALIDADES DAS MACROALGAS MARINHAS
As macroalgas marinhas contém compostos de grande interesse
econômico e comercial como o agar e a carragenana, presentes em algas
vermelhas, formados principalmente por monômeros de galactose e utilizados
amplamente na indústria farmacêutica, de cosméticos, gelatinas, meios de
cultura, (HOFFMAN; BOUSSIBA, 2002; RASMUSSEM; MORRISSEY, 2007;
COSTA, 2008; CAMPO et al., 2009; VIPUL et al., 2014), assim como os alginatos,
presentes em algas marrons, constituídos por unidades monoméricas de ácido
manurônico e glucurônico e amplamente aplicados também na indústria
farmacêutica, de alimentos, cosmética e biodiesel (FERREIRO, 2011; SONG et
al., 2015).
A utilização das algas marinhas na alimentacao humana e conhecida
desde o seculo IV no Japao e desde o seculo VI na China, no entanto, os
primeiros registros de comercialização de extratos de algas surgiram a partir da
década de 1930, onde eles eram vendidos como agentes espessantes e
gelificantes (MCHUGH, 2003). Nas últimas três décadas, a producao de alga
aumentou de 3,8 milhoes de toneladas em 1990 para 19 milhoes de toneladas em
2010 e algumas espécies se destacam na indústria de algas marinhas, como a
Kappaphycus alvarezzi, Eucheuma ssp, Undaria pinnatifida, Gracilaria ssp,
Porphyra ssp, estas contabilizam 98,9% da produção mundial. De acordo com a
Food and Agriculture Organization of United Nations (FAO) 99,6% da produção de
algas está concentrada em 8 países (Figura 3), (FAO, 2012).
23
Figura 3: Distribuição da produção de algas entre países. Fonte: Adaptado da Food and Agriculture Organization of United Nations (FAO), (2012).
Apesar dos estudos sobre macroalgas marinhas e seu potencial
biotecnológico receberem destaque mundialmente, (TAKESHI et al., 2005; KI-
BONG et al., 2008; AL-AMOUDI et al., 2009; ZHANG et al., 2012), no Brasil isto
ainda ocorre muito aquém do seu potencial, principalmente se comparado aos
países orientais. Apesar de existirem relatos da exploração do potencial
biotecnológico de macroalgas na costa brasileira durante a década 1940, (HUMM;
WILLIAMS, 1948), somente nas últimas duas décadas estes estudos tiveram
maior destaque. Devido a criação em 2005 da Redealgas (Rede Nacional em
Biotecnologia de Macroalgas Marinhas), esta impulsionou e promoveu
discussões, pesquisas e ações para o desenvolvimento da Ciência, Tecnologia e
Inovação sobre a biodiversidade marinha do litoral brasileiro (BRASIL, 2010;
FERNANDES; OLIVEIRA; VALENTIN, 2014). Desde então, a percepção deste
grande potencial biotecnológico de algas no Brasil tem despertado a necessidade
de conhecer e explorar estes recursos.
Estes organismos, pelo fato de sobreviverem em um bioma aquático muito
competitivo, diversificado e muitas vezes em condições extremas, tem
desenvolvido estratégias de adaptação e defesa que resultam em uma variedade
de compostos produzidos por diversas vias metabólicas diferentes. Esta
característica, faz das algas organismos promissores na síntese de moléculas
quimicamente bioativas, isto desperta a necessidade de explorar o potencial
biotecnológico destas algas (FERNANDES; OLIVEIRA; VALENTIN, 2014). Dentro
deste contexto, desde 1975 a investigação de produtos naturais aquáticos tem se
focado em quatro grandes grupos: o das toxinas, bioprodutos, quimiotaxonomia e
ecologia química. Este interesse, aliado a novas técnicas de caracterização,
gerou conhecimento sobre cerca de 13.000 novos compostos isolados de algas
58,40%
20,60%
9,50%
4,70%
2,30% 2,30%
1,10% 0,70%
0,5%
China
Indonesia
Filipinas
Coreia do Sul
Coreia do Norte
Japão
Malásia
Republica Unida da Tanzania
Paises ocidentais
24
nos últimos 35 anos (MARINHO-SORIANO, 2011). Essa área de estudo tem se
intensificado cada vez mais devido a avanços, principalmente nas áreas
ambientais, industriais, biotecnológica e da saúde.
Vários grupos de pesquisa já mostraram que as algas marinhas ainda
apresentam um espectro de moléculas bioativas importantes como esteróis
(FLEURY; PITOMBO, 1996), lectinas (CARDOZO et al., 2007), polifenois
(PEREIRA et al., 1990), toxinas (MARINHO-SORIANO, 2011) e principalmente
polissacarídeos sulfatados (ROCHA et al., 2005; ROCHA et al., 2006; POMIN,
2009; CIANCIA; QUINTANA; CEREZO, 2010; CAMARA et al., 2011; MELO, et
al., 2013; FIDELIS et al., 2014), isto faz destes organismos um promissor alvo de
estudos na área biomédica. Dentre os diversos compostos bioprospectados de
algas marinhas, os estudos dos polissacarídeos sulfatados foram os que mais
cresceram na última década (ROCHA et al., 2006; LI et al., 2008; MELO et al.,
2013, FIDELIS et al 2014).
1.3 POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARINHAS
Os polissacarídeos sulfatados (PS) são encontrados na matriz
mucilaginosa de macroalgas, correspondem de 80 a 85% do peso seco das algas
(KLOAREG; QUATRANO, 1988) e suas atividades biológicas ainda não foram
completamente elucidadas. Estes polissacarídeos nas algas podem estar
relacionadas ao armazenamento de reserva energética, a rigidez e flexibilidade da
alga permitindo que ela cresça no meio aquoso e ao mesmo tempo se mantenha
estendida o suficiente para que ela possa suportar a ação mecânica das ondas e
dessa forma possa captar a luz solar e nutrientes de forma mais eficaz (ARAD;
LEVY-ONTMAN, 2010). Outra função atribuída para estes polissacarídeos, está
relacionada a osmoregulação e proteção hídrica, para evitar a desidratação das
algas em longos períodos de baixa-mar (PAINTER, 1983; BALAKRISHNAN;
KANDASAMY; NITHYANAND, 2014)
Os tipos de polissacarídeos sulfatados presentes na parede celular das
algas podem variar de acordo com a sazonalidade, localização geográfica,
especie de alga (O’SULLIVAN et al., 2010), inclusive em diferentes tecidos de
uma mesma espécie de alga (COSTA et al., 2014; DIETRICH et al., 1995). No
entanto, pode-se verificar uma predominância de certos tipos de PS conforme os
25
grupos de macroalgas marrons, verdes e vermelhas. As algas marrons
apresentam como polissacarídeos sulfatados predominantes as fucanas, que têm
como característica principal a presença de α-L-fucose sulfatada (ROCHA et al.,
2006). Esses polissacarídeos podem se apresentar sobre a forma de
homopolíssacarídeos como homofucanas ou heteropolíssacarídeos incluindo as
heterofucanas ou fucoidans (NGO; KIM, 2013). As algas verdes apresentam
polissacarídeos sulfatados mais heterogêneos, formados por monômeros
galactose, manose, xilose, arabinose, ácidos urônicos, mas há a possibilidade de
se encontrar homopolissacarideos como arabinanas e galactanas (HAYAKAWA et
al., 2000; MATSUBARA et al., 2001; FARIAS et al 2008; COSTA et al., 2014). Já
as algas vermelhas apresentam como principais polissacarídeos sulfatados as
galactanas sulfatadas (KNUTSEN et al., 1994), ricas em D-galactose (importância
econômica, utilizados na indústria alimentícia). Neste grupo encontram-se o ágar
(mistura de diversas galactanas), as agaranas e diversos tipos de carragenanas
(homogalactanas sulfatadas) (VIANA, 2005), porém, em alguns estudos há relatos
de outros tipos de polissacarídeos sulfatados encontrados em algas marinhas
vermelhas como xilomananas (MANDAL et al., 2008), xilogalactana (YANG et al.,
2011) e heteropolissacarídeos compostos por D-fucose, D-glicose, D-manose e D-
galactose (LIM; RYU, 2009; COSTA et al., 2014).
1.4 O GÊNERO Gracilaria E POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS VERMELHAS
Gracilaria é um gênero de macroalgas marinhas vermelhas, possuem um
talo cilíndrico, delgado ou filamentoso, estas podem variar de comprimento entre
0,1 a 5 metros e coloração com tonalidades que podem variar do vermelho ao
verde (PLASTINO et al., 1999). As algas desse gênero são mais presentes em
ambientes tropicais e temperados, inclusive é cultivada no nordeste do Brasil.
Podem ser encontradas entre a zona entremarés e o infra litoral raso, mas
predominam em ambientes mais protegidos de estresse mecânico, como os
provocados pelas ondulações, possuem elevada tolerância a variação de
condições ambientais tais como, variação do fluxo de água, temperatura e
salinidade (OLIVEIRA, 1998).
26
A matriz mucilaginosa das algas marinhas vermelhas é formada por
galactanas sulfatadas como carragenanas e agaranas (KNUTSEN et al., 1994),
além de xilomanana (MANDAL et al., 2008) e outros heteropolissacarídeos (LIM;
RYU, 2009; COSTA et al., 2014). As galactanas sulfatadas de algas vermelhas
são formadas por duas unidades monossacarídicas de β-D-galactopiranose 3-
ligadas e α-galactopiranose 4-ligadas, no entanto, quando esta última unidade
encontra-se na configuração D, é denominada de carragenanas e na configuração
L, de agaranas, e além disso, estas duas unidades monossacarídicas podem ter
sulfatação em diferentes posições (LAHAYE, 2001; VAN DE VELDE; PEREIRA;
ROLLEMA, 2004), como representado na Figura 4 abaixo.
(1).
[ 3)- β-D-galactopiranose-(14)- α-galactopiranose-(1]n
(2).
“A” “B” “A” “B”
Carragenana Agarana
Figura 4: Representação estrutural de dissacarídeos sulfatados de algas vermelhas. (1) Representação de unidades repetidas encontradas em galactanas sulfatadas de algas vermelhas. (2) Representação estrutural de dissacarídeos (carragenana e agarana) que formam a galactana (R = H ou CH3 ; R’ = H ou SO3
- ; R”=H ou CH3). Fonte: Adaptado de LAHAYYE, 2001.
Apesar das galactanas apresentarem uma estrutura repetitiva, possuem
diversidade estrutural devido a presença de grupos substituintes como
principalmente o sulfato, grupos de éter metílico, acetal e piruvato. Estes
polissacarídeos sulfatados possuem valor econômico, uma vez que são utilizados
na indústria alimentícia como um substituinte do amido e de lipídeos,
especialmente na indústria de enlatados e laticínios, na produção de gelatinas e
geleias, além do uso como espessante, emulsificante e estabilizante (STEPHEN,
1995; STANLEY; GOFF; SMITH, 1996).
As carragenanas são polissacarídeos sulfatados lineares constituídos por
um esqueleto central de α-D-galactose, com diferentes posições de sulfatação. As
27
carragenanas diferenciam-se das agaranas por possuírem a unidade B na forma
de α-D-galactose enquanto que as agaranas possuem a configuração α-L-
galactose. São encontradas nos gêneros Solieria, Eucheuma, Meristotheca
(Meristiella) e Calophucis (CUNHA; FEITOSA; PAULA, 2009) e representam de
30 a 75% do peso seco dessas algas. Na Figura 5, apresenta-se a estrutura das
carragenanas. De acordo com Campo e col. (2009), as carragenanas mais
importantes do ponto de vista comercial sao: Kappa (κ-), Lambda (λ-) e Iota (ι-),
que diferem entre si de acordo com o número, posição da sulfatação e a presença
de 3,6-anidro-α-D-galactopiranose (LIU et al., 2015).
Figura 5: Estrutura das principais carragenanas utilizadas comercialmente. Fonte: (VERA et al, 2011).
As carragenanas kappa (κ) sao formadas por uma unidade dissacarídica
repetitiva que é constituída de uma β-D-galactose sulfatada em C4, ligada a uma
anidrogalactose que formam géis rígidos na presença de potássio (K+). Já as
lambda (λ) sao formadas por uma β-D-galactose sulfatada em C2, ligada a uma α-
D-galactose sulfatada em C2 e C6 e suas cadeias estruturais não formam hélices;
por isso, são PS não-gelificantes. Sem depender de íons, estas formam soluções
viscosas, e por isso sao usadas como espessantes em alimentos. As iota (ι) sao
formadas por uma β-D-galactose sulfatada em C4, ligada a uma anidrogalactose
sulfatada em C2 (VERA et al., 2011). Formam géis macios, resistentes e elásticos
na presença de cálcio (Ca2+), e por causa dessa capacidade de formar soluções
viscosas ou géis, as galactanas sulfatadas de algas vermelhas são usadas em
muitos produtos alimentícios, farmacêuticos e biotecnológicos (CARDOSO, 2007).
A tabela 1 exibe informações sobre as estruturas de carragenanas e suas
variações.
28
Tabela 1 – Estrutura das unidades dissacarídicas encontradas nas galactanas (carragenanas) de algas vermelhas.
Símbolo
grego 1,3-ligado (unidade A) 1,4-ligado (unidade B)
kappa (κ) β-D-galactose 4-sulfato 3,6-anidro-α-D-galactose
iota (ι) β-D-galactose 4-sulfato 3,6-anidro-α-D-galactose 2-sulfato
mu (μ) β-D-galactose 4-sulfato α-D-galactose 6-sulfato
nu (ν) β-D-galactose 4-sulfato α-D-galactose 2,6-di-sulfato
ômicron (ο) β-D-galactose 4-sulfato α-D-galactose 2-sulfato
beta (β) β-D-galactose 3,6-anidro-α-D-galactose
gama (γ) β-D-galactose α-D-galactose 6-sulfato
ômega (ω) β-D-galactose 6-sulfato 3,6-anidro-α-D-galactose
psi (ψ) β-D-galactose 6-sulfato α-D-galactose 6-sulfato
delta (δ) β-D-galactose α-D-galactose 2,6-di-sulfato
alfa (α) β-D-galactose 3,6-anidro-α-D-galactose 2-sulfato
lambda (λ) β-D-galactose 2-sulfato α-D-galactose 2,6-di-sulfato
theta (θ) β-D-galactose 2-sulfato 3,6-anidro-α-D-galactose 2-sulfato
xi (ξ) β-D-galactose 2-sulfato α-D-galactose 2-sulfato
pi (π) β-D-galactose P,2-sulfato α-D-galactose 2-sulfato
Fonte: Adaptado de (LAHAYE, 2001;MACIEL e Col, 2008)
As agaranas são encontradas nos gêneros Gracilaria, Gelidium e
Pterocladiella. (CUNHA; FEITOSA; PAULA, 2009). Sua estrutura básica é uma
cadeia linear formada por várias unidades dissacarídicas de (1-3)-β-D-galactose-
(1-4)-α-L-galactose, os íons sulfatos podem ser substituídos em várias posições.
Os resíduos de α-L-galactose podem ser substituídos na 3,6-anidro-α-L-galactose
por eliminação de grupos sulfato na posição 6 (Figura 4). Além dos grupos sulfato,
podem ser encontrados piruvato e/ou grupos metil (CH3) (CUNHA; FEITOSA;
PAULA, 2009; DUARTE et al., 2004, MACIEL et al., 2008). As agaranas são
utilizadas na indústria de alimentos (ágar e substituintes), em meios de separação
e purificação de biomoléculas (géis de eletroforese e cromatografias), além de
produtos de química fina; biodistribuição de fármacos; moldes odontológicos;
criminologia; fabricação de corantes, gelatinas e microesferas de gel (YI et al.,
29
2004), em meios de cultura para microrganismos, imobilização de enzimas e
células e encapsulamento de bactérias e células (RINAUDO, 2008).
1.5 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARINHAS
Nas últimas duas décadas, as pesquisas que envolvem bioprospecção de
moléculas bioativas vem crescendo rapidamente e neste contexto se destacam os
polissacarídeos sulfatados por apresentarem diversas atividades biológicas e
farmacológicas (BARROW; SHAHIDI, 2008; KIM; WIJESEKARA, 2010;
WIJESEKARA et al., 2011; JIAO et al., 2011; NGO; KIM, 2013). As atividades
biológicas destes polissacarídeos têm correlação com suas propriedades
estruturais e físico-químicas como: o teor e posição de sulfatos, densidade de
cargas, estrutura química, peso molecular e conformação da cadeia (FONSECA
et al., 2008; ZHANG et al., 2012; RODRIGUES et al., 2012; RODRIGUES et al.,
2012a). Além destas características os polissacarídeos apresentam mínimo risco
por contaminação viral e toxicidade relativamente baixa (TALARICO et al., 2005;
TALARICO et al., 2005a). A tabela 2 contém algumas atividades farmacológicas
de polissacarídeos sulfatados encontrados em algas vermelhas, marrons e
verdes.
Tabela 2. Algumas atividades farmacológicas de Polissacarídeos sulfatados extraídos de algas marinhas
ALGAS VERMELHAS ATIVIDADE REFERÊNCIA
Gracilaria birdiae
Proteção a dano intestinal BRITO et al., 2014
Gracilaria birdiae
Gracilaria caudata
Eucheuma spinosa Eucheuma cotonni Gigartina pisillata
Gigartina acicularis
Corallina officinalis
Schizymenia binderi
Antioxidante
FIDELIS et al., 2014. OLIVEIRA et al., 2014
COSTA et al., 2010
SOUZA et al., 2007
YANG et al., 2011
BARAHONA et al., 2011
30
Scinaia hatei Gracilaria cordata Grateloupia indica
Sebdenia polydactyla
Chondrus crispus
Gymnogongrus griffithsiae
e Cryptonemia crenulata
Antiviral
PUJOL et al., 2012
GHOSH et al., 2009
KULSHRESHTHA et al., 2015
TALARICO et al., 2005 TALARICO et al., 2005a
Chondrus armatus Chondrus ocellatus Amansia multifida
Imunomodulatória
YERMAK et al., 2012 ZHOU et al., 2004
SOUZA et al., 2012
Champia feldmannii Chondrus ocellatus
Antitumoral
LINS et al., 2009 ZHOU et al., 2004
Gracilaria cornea Gracilaria birdiae
Anti-inflamatória
COURA et al., 2012. BRITO et al., 2014
Hypnea musciformis
Proteção a dano Gástrico
DAMASCENO et al., 2013
Botryocladia occidentalis
Gigartina skottsbergii
Hypnea musciformis
Anticoagulante
FARIAS et al., 2000
CARLUCCI et al., 1997
ALVES et al., 2012,
Botryocladia occidentalis Gelidum crinale
Hypnea musciformis
Antitrombótica
FONSECA et al., 2008
ALVES et al., 2012a
. ALGAS MARRONS ATIVIDADE REFERÊNCIA
Spatoglossum schröederi Antiadesiva ROCHA et al., 2001.
Fucus vesiculosus Antiadipogênica YOKOTA et al., 2009; KIM; LEE; LEE, 2010;
PARK; JUNG; ROH, 2011.
Ascophyllum nodosum Sargassum vulgare
Antiangiogênica MATOU et al., 2002. DORE et al., 2013.
Canistrocarpus cervicornis
Dictyopteris justii Dictyota delicatula
Anticoagulante
CAMARA et al., 2011. MELO et al., 2012.
COSTA et al., 2010; MAGALHÃES et al., 2011.
31
Dictyota menstrualis Ecklonia cava
Laminaria japonica
Anti-inflamatória ALBUQUERQUE et al., 2013.
KANG et al., 2011. LI et al., 2005.
Fucus evanescens Antimetastática ALEKSEYENKO et al., 2007.
Dictyota menstrualis Antinociceptiva ALBUQUERQUE et al., 2013.
Dictyota cervicornis Dictyopteris justii
Fucus vesiculosus Antioxidante
COSTA et al., 2010. MAGALHÃES et al., 2011.
RUPEREZ et al., 2002.
Ecklonia cava S. schröederi
Antitrombótica JUNG et al., 2007.
ALMEIDA-LIMA et al., 2010.
D. delicatula Fucus evanescens Undaria pinnatifida
Antitumoral MAGALHÃES et al., 2011.
ALEKSEYENKO et al., 2007. SYNYTSYA et al., 2010.
Cladosiphon okamuranus Fucus. vesiculosus
Antiúlcera SHIBATA et al., 2003.
Undaria pinnatifida Antiviral HEMMINGSON et al., 2006.
Fucus vesiculosus Undaria pinnatifida
Imunomodulatória KIM; JOO, 2008; DO et al., 2010.
YOO et al., 2007.
ALGAS VERDES ATIVIDADE REFERÊNCIA
Ulva rotundata
Antiadesiva GADENNE et al., 2013
C. racemosa Antiviral PUJOL et al., 2012
Codium cylindricum Antiangiogênica MATSUBARA et al., 2003
Caulerpa cupressoides
Caulerpa prolifera
Caulerpa veravalensis
Caulerpa peltata
Anticoagulante
COSTA et al., 2012
RODRIGUES et al, 2012; SHANMUGAM et al., 2001.
Caulerpa racemosa Caulerpa cupressoides
Anti-inflamatória PIRES et al., 2013;
RIBEIRO et al., 2014; RODRIGUES et al., 2012a.
Caulerpa okamurai Antitrombótica HAYAKAWA et al., 2000
Enteromorpha prolifera Antioxidante CHO et al., 2011
Caulerpa mexicana Antinociceptiva CARNEIRO et al., 2014
Caulerpa racemosa Antimicrobiana RIBEIRO et al., 2014
Fonte: Autoria Própria.
32
1.6 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE Gracilaria birdiae
Os PS de G. birdiae são bastante estudados, pois apresentam uma
variedade de atividades biológicas, dentre as quais se destacam: anti-inflamatória
(VANDERLEI et al., 2011; BRITO et al., 2014); gastroprotetora (SILVA, 2012);
protetora de dano intestinal (BRITO et al., 2014); atividade sequestradora de
radicais DPPH e hidroxila (SOUZA et al., 2012); antioxidante; queladora de ferro e
cobre; além de inibidora da formação de cristais de OxCa (OLIVEIRA, et al.,
2014). As diversas atividades biológicas atribuídas a PS da alga vermelha G.
birdiae podem ser modificadas, até mesmo potencializadas, dependendo do
método de extração dos PS. Diversos métodos de extração (MACIEL et al., 2008;
VANDERLEI et al., 2011; SOUZA et al., 2012) já foram mostrados na literatura,
porém FIDELIS e Col (2014) propuseram um método diferente de extração de PS
da G. birdiae, o qual foi reproduzido nesta tese. A extração por este método pode
promover modificações nos PS ou em suas cargas e acredita-se que possa
interferir na morfologia e síntese de cristais de OxCa.
1.7 FORMAÇÃO DE CRISTAIS DE OxCa E INTERFERÊNCIA ATRAVÉS DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS.
1.7.1 Urolitíase
A litíase urinária atinge entre 5% e 15% da populacao mundial
(STAMATELOU et al., 2003) e caracteriza-se como uma condição fisiopatológica
proveniente da formação de cálculos renais. Estes são formados pela
aglomeração de cristais amalgamados por proteínas, esta condição é
denominada popularmente como “pedras nos rins” (MOE, 2006). A urina e uma
solucao estável e qualquer variacao no grau de saturacao, do pH, osmolaridade e
concentracao dos inibidores da cristalização, tais como glicosaminoglicanos,
glicoproteínas, pirofosfato e ácido cítrico, podem alterar o equilíbrio existente e
dar origem a urolitíase (LI; XUE; OUYANG, 2013). Esta condição pode estar
associada a diversos fatores como: estilo de vida, clima, genética, síndrome
metabólica, hábitos alimentares, descompensações endócrinas, dentre outros
33
(SELVAM, 2002; MOE, 2006; XU et al., 2013; WONG; COOK; SOMANI, 2015),
conforme (Figura 6).
Figura 6: Fatores que influenciam a formação dos cristais de OxCa. Fonte: Autoria Própria.
Nas duas últimas décadas, o aumento de casos de urolitíase parece estar
associado a mudanças no estilo de vida e nos hábitos alimentares (KNOLL, 2010;
XU et al., 2013), devido principalmente ao aumento de ingestão de proteína
animal, lipídeos, cálcio e sódio (RICCARDI; GIACCO; RIVELLESE, 2004; LÓPEZ;
HOPPE, 2010; ROMERO; AKPINAE; ASSIMOS, 2010). Além dos fatores já
citados, Jackson e col. (2006) mostraram que neste mesmo período houve uma
elevada correlação entre o uso indiscriminado de vitamina D em crianças e a
formação cálculos renais (JACKSON et al., 2006).
Do ponto de vista epidemiológico, a maior incidência de cálculo renal
ocorre em homens, entre 20 e 60 anos (WONG; COOK; SOMANI, 2015; MOE,
2006) principalmente nos países em desenvolvimento (MEHMET; ENDER, 2015;
DAWSON; TOMSON, 2012), de clima quente, localizados no hemisfério oeste do
globo (LÓPEZ; HOPPE, 2010; ROMERO; AKPINAE; ASSIMOS, 2010). Os
cálculos renais formados por OxCa, constituem aproximadamente 80% dos
casos, os de ácido úrico representam entre 5% e 10%, a estruvita (fosfato-
amônio-magnesio) em torno de 10%, e urato de amônio e cistina, menos de 1%
(MOE, 2006; LÓPEZ; HOPPE, 2010; DAWSON; TOMSON, 2012; DAUDON;
BAZIN; LETAVERNIER, 2015).
34
Do ponto de vista clínico, estes cálculos podem causar dor suprapubica, na
glande, disuria, hematuria, jato de urina fraco e entrecortado, hesitacao, dentre
outros. Atualmente o recurso mais utilizado diante de uma crise renal causada
pelo cálculo é a analgesia, promovida principalmente pela administração dos
AINES e PGs, já o tratamento tradicional se baseia na eliminação de forma
espontânea do cálculo, através da utilização de fármacos bloqueadores de canais
de cálcio como a Nifedipina, assim como a quemólise, para a dissolução de
cálculo de ácido úrico ou ainda, procedimentos mais invasivos e com grau de
risco mais crítico, como o cirúrgico tradicional ou bombardeamento a laser
(KNOLL; PERARLE, 2013). Na última década houve um aumento no números de
pesquisas com interesse em prospectar compostos que possam combater a
urolitíase e neste contexto, os polissacarídeos sulfatados de algas, parecem ser
importantes compostos que apresentam potencial antiurolítico (OUYANG et al.,
2011; ZHANG et al., 2012).
1.7.2 Influência dos cristais de OxCa e estresse oxidativo na formação de
cálculo renal.
A formação do cristal de OxCa deriva de um processo físico-químico
dividido em 3 fases: nucleação, crescimento e agregação do cristal (Figura 7).
Figura 7: Fases da formação de cristais urinários. Fonte: Adaptado de ZERATI FILHO; NARDOZZA JÚNIOR; REIS, 2010.
A condição sine qua non para que haja formação do cristal é a
supersaturação urinária, pois, devido a elevada concentração de íons em solução,
35
ocorre uma maior interação entre cargas, com uma maior tendência de se
agruparem, gerando cristais minúsculos. Esta etapa é denominada nucleação e
consiste na formação de estrutura de nanocristais, podendo ser dividida em
homogênea, quando o nanocristal serve de suporte para a deposição da mesma
estrutura nanocristalina, e a heterogênea, quando a deposição ocorre em um
substrato quimicamente diferente do cristal (RUSSELL; FLEISCH, 1973;
GRASES; COSTA-BAUZA; GARCIA-FERRAGUT, 1998; BASARAVAJ, 2007).
Paralelo a esta etapa, ocorre a fase de crescimento, gerado pela diminuição da
energia potencial de átomos e moléculas devido a formação de ligações químicas
entre si (COE; PARKS; FAVUS, 1997; BASARAVAJ, 2007; HESS et al., 2000). A
terceira etapa é a agregação, formada pela união de um ou mais núcleos em
crescimento, os quais formam cristais com maior dimensão e massa que podem
se precipitar (FERNANDES-QUEIROZ et al., 2015).
Os cristais de OxCa podem assumir três formas diferentes de cristalização:
O cristal monohidratado (COM), que apresenta uma geometria de prisma
tetragonal alongada, com estrutura densa de elevada dureza, superfície externa
irregular e são termodinamicamente estáveis; já o dihidratado (COD) possui uma
geometria em formato bipiramidal tetraédrica semelhante a um cata-vento e são
do ponto de vista termodinâmico, mais instáveis; o trihidratado (COT), por sua
vez, possui geometria drusiforme e instabilidade termodinâmica e são raramente
encontrados na urina (FERNANDES-QUEIROZ et al., 2015; MELO et al., 2013;
YU, et al., 2011; GRASES; GENESTAR; MILLAN, 1989; DEGANELLO, 1991)
Figura 8.
Figura 8: Diversidade morfológica (COM, COD e COT) de cristas de OxCa através de microscopia eletrônica de varredura: (A) Aumento de 1500x; (B) Aumento de 4000x. Fonte: Autoria própria.
COM
COD
COT
B
COM COD
COT
A
36
A urolitíase pode ser influenciada diretamente pelo tipo de cristal formado,
uma vez que este se liga inicialmente ao epitélio renal para dar início a formação
dos cálculos. Neste contexto, o cristal monohidratado (termodinâmica estável)
apresenta maior afinidade com o epitélio renal e adere preferencialmente a
camadas danificadas aniônicas do epitélio (FONG-NGERN et al., 2011). Estes
danos podem estar relacionados a eventos de estresse oxidativo, espécies
reativas de oxigênio (EROS), assim como, podem ocorrer danos físicos ao epitélio
que poderiam expor diversas substâncias eletronegativas na superfície celular
como os glicosaminoglicanos e osteopontina (OPN) (SELVAN, 2002; KHAN;
CANALES, 2015; WONG; COOK; SOMANI, 2015; GAN, 2016), contribuindo para
a formação cálculos e das placas de Randall.
Em 1937, Alexander Randall propôs uma teoria denominada "A origem e o
crescimento de cálculos renais" (RANDALL, 1937). A partir de estudos forenses
realizados entre 1935 e 1938, que se observou, na ponta das papilas renais,
lesões constituídas depósitos de fosfato de cálcio (CaP) e carbonato acumulados
em regiões subepiteliais do rim (Figura 9). Estas lesões são denominadas “Placas
de Randall” e se formam inicialmente na região intersticial, e com o seu
crescimento podem resultar em ruptura do urotélio, assim como a formação de
placa em contato com a urina supersaturada, ou ainda, devido a necrose de
células epiteliais tubulares poderiam dar origem a cristalização com posterior
deposição nos túbulos coletores, os quais serviriam de substrato para a
deposição de mais cristais, inclusive, na pelve renal, ductos papilares e alça de
Henle (RANDALL, 1937; RANDALL, 1940; KHAN; CANALES, 2015; JAMESON;
LOSCALZO, 2013).
37
Figura 9: Figura representativa de sucessivos passos para formação das pedras de cálculo renal na placa de Randall. Fonte: Autoria Própria.
Atualmente, está em evidencia a “teoria unificada” para formacao de placas
de Randall e de acordo com os autores, estas se iniciam pela peroxidação lipídica
causada pelo estresse oxidativo em células epiteliais renais, assim como,
excreção elevada de fosfato, cálcio e oxalato, diminuição da produção de
inibidores de formação de cristais, ou ainda quando surgem danos, traumas ou
decorrem do processo senil (KHAN; CANALES, 2015; WONG; COOK; SOMANI,
2015).
O estresse oxidativo promove um aumento da expressão de genes e
síntese de proteínas específicas de células osteoblásticas, isto promove uma
desdiferenciação das células epiteliais renais em células tipo-osteoblásticas. Esta
transformação, induz a formação de vesículas que se originam do polo basal de
células epiteliais tubulares, em direção à membrana basal do tecido.
Concomitante, ocorre a nucleação e agregação dos cristais de fosfato de cálcio
(CaP) que formam placas e ultrapassam a membrana basal. Estas placas
calcificam-se ao entrar em contato com restos necróticos e fibras, induzem a
formação de fibrose, inflamação tópica com mais calcificação até atingir a
superfície do epitélio papilar e devido ao aumento de atividade de
metaloproteinases de matriz ou força física causada pelo aumento da calcificação
subepitelial, expõe a placa de Randall na pelve renal (Figura 10) (KHAN;
CANALES, 2015)
38
Figura 10: Cálculos renais formados por cristais monohidratados com a presença de placas de Randall. (A) Pedras expelidas de cálculo renal formadas por OxCa monohidratado. As regiões mais claras indicadas por seta são constituídas por placas de Randall. (B) Microscopia eletrônica da placa de Randall na superfície da célula, com resquícios de fragmentos tubulares indicados por seta. Fonte: Adapatado de Daudon; Bazin; Letavernier, 2015.
Na pelve renal, as camadas superficiais de cristais de fosfato de cálcio são
substituídas por OxCa, através da desmineralização de CaP e mineralização de
OxCa. Por conseguinte, a nucleação de cristais de OxCa ocorre diretamente
sobre a matriz orgânica que cobre a placa e promove o aumento do tamanho do
cálculo constituído principalmente por OxCa (KHAN; CANALES, 2015). Esta
teoria é reforçada por achados histológicos de pacientes que apresentam cálculos
de OxCa idiopáticos associados às placas de Randall (EVAN, 2010; WONG;
COOK; SOMANI, 2015; DAUDON; BAZIN; LETAVERNIER, 2015).
Em 2002, Selvan realizou um estudo em ratos, que foram induzidos a
formarem cálculos renais de OxCa, foi verificado que houve diminuição das
atividades das enzimas antioxidantes como a superóxido dismutase (SOD),
catalase, glutationa peroxidase (GPx), glucose-6-fosfato desidrogenase,
glutationa-S-transferase, assim como diminuição dos níveis de sequestradores de
radicais livres como a vitamina E, vitamina C, proteína tiol (TSH) e glutationa
reduzida (GSH) e houve aumento plasmático de moléculas marcadoras de
peroxidação lipídica. Alternativamente, em pessoas portadores de cálculo de
OxCa, foi observada uma correlação positiva entre a presença do oxalato/OxCa,
formação de cristais de OxCa e diminuição de compostos antioxidantes
(BACKMAN; DANIELSON; LJUNGHALL, 1985; ANBAZHAGAN, et al., 1999).
Seguindo esta perspectiva, uma alternativa para minimizar os eventos que
levam a formação das placas e dos cálculos renais, seria através do aumento dos
níveis/atividades antioxidantes e como polissacarídeos sulfatados possuem
A B
39
atividade antioxidante, poderiam influenciar a inibição de formação de cristais de
oxalato de cálcio ou cálculo renal.
1.7.3 Polissacarídeos sulfatados de algas com atividade antiurolítica
Na última década, os polissacarídeos sulfatados de algas, principalmente
devido ao seu potencial antioxidante, passaram a ser avaliados quanto a sua
capacidade antiurolítica (KHAN, 2013). Estudos in vitro, demonstraram que
polissacarídeos da Laminaria japonica promoveu a diminuição dos cristais COM e
estabilizaram os do tipo COD, que dificilmente se ligam a membrana celular
devido a sua instabilidade termodinâmica (OUYANG et al., 2011). Outro
polissacarídeo, da alga Sargassum graminifolia, foi capaz de inibir a cristalização
de OxCa (ZHANG et al., 2012). O grupo em que esta tese se insere,
recentemente, demonstrou que polissacarídeos sulfatados da alga Dictyopteris
justii foram capazes de inibir a formação de cristais de OxCa, com destaque para
a fucana DJ-0.4, já a glucana DJ-0.5 foi capaz de estabilizar os cristais de OxCa
na forma dihidratada COD, prevenindo a formação dos cristais do tipo COM mais
agressivos e fortemente associados a urolitíase (MELO et al., 2013). Em estudos
in vivo, foi verificado que através suplementação exógena de polissacarídeos
sulfatados de Fucus vesiculosus em ratos hiperoxalúricos, houve menor dano a
membrana celular devido a incapacidade de retenção do cristal de OxCa, assim
como, diminuição do estresse oxidativo causado pelo processo de cristalização,
com aumento da atividade de enzimas antioxidantes como SOD, CAT, GPX e
redução da peroxidação lipídica. (VEENA et al., 2007; OUYANG; WU, 2005).
Devido a uma escassez de dados na literatura sobre atividade antiurolítica
de PS de algas, é importante que mais estudos ocorram para se compreender
melhor os mecanismos que o envolvem. Além disso, devidos as condições
geográficas e climáticas, o litoral do Nordeste e em especial o do Rio Grande do
Norte, possuem uma vasta diversidade de algas marinhas, as quais são
excelentes fontes para bioprospecção de polissacarídeos sulfatados e até o
momento não há relatos na literatura que mostrem a utilização destes
polissacarídeos de alga vermelha comestível, para se avaliar a capacidade de
inibição de cristais de OxCa e seu potencial antiurolítico. Por todas essas razões,
este trabalho tem como objetivo geral verificar o efeito de diferentes frações de
40
polissacarídeos sulfatados (PS) da alga vermelha comestível, Gracilaria birdiae
sobre a formação de cristais de OxCa e avaliar o efeito protetor em células renais.
Para tal, pretende-se realizar:
- Extração ou Obtenção de polissacarídeos sulfatados da alga G. birdiae;
- Caracterização físico/química dos polissacarídeos obtidos;
- Analisar características estruturais dos PS por espectroscopia de infravermelho;
- Investigar a ação dos polissacarídeos sulfatados obtidos sobre a formação e
morfologia de cristais de OxCa;
- Avaliar a atividade proliferativa /viabilidade celular dos PS sobre as linhagens
renais MDCK, HEK-293 e 786 (linhagem tumoral);
- Avaliar o efeito protetor dos PS sobre a ação de H2O2 e OxCa em linhagens
celulares;
- Investigar a ação de PS sobre as enzimas SOD e CAT.
41
2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 MATERIAIS 2.1.1 Reagentes
• Ácido acético, ácido sulfúrico, ácido clorídrico, álcool etílico, álcool metílico,
azul de toluidina, brometo de cetiltrimetilamônio P.A. (CETAVLON), citrato de
sódio, cloreto de bário, fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio
monobásico, hidróxido de sódio, coomasie brilliant blue R 250, peróxido de
hidrogênio e foram obtidos da CRQ (Diadema, SP, Brasil);
• Ácido D-glucurônico, acetato de sódio, albumina, cloreto de cálcio, cloreto de
sódio, D-xilose, D-galactose, D-manose, D-glucose, D-arabinose, D-ramnose,
L-fucose, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenil tetrazolium bromide),
foram obtidos da Sigma-Aldrich (São Paulo, SP, Brasil);
• Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) proveniente da VETEC (Duque de
Caxias, RJ, Brasil);
• Membrana de PVDF da Millipore Corp. (Bedford, MA, USA);
• Sephadex G-100 da GE Healthcare (São Paulo, SP, Brasil);
• Reagente de Bradford da Bio-Rad (NY, EUA);
• Bacto-Getatina adquirido da Difco Laboratories (Detroit, MI, USA);
• Agarose (Standart Low-MR) proveniente da BioRad Laboratories (Richmond,
CA, EUA);
• Fenol, molibdato de amônia, sulfato de cobre, sulfato de potássio e sulfato de
sódio anidro adquiridos da Reagen Quimibrás Indústrias Químicas S.A. (Rio
de Janeiro, RJ, Brasil);
• Prozima (preparação enzimática a base de protease alcalina PROLAV 750)
adquirida da Prozyn Biosolutions, São Paulo, SP, Brasil;
• Reagente de Folin-Ciocalteau da Merck (Darmstadt, Alemanha);
• DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI e Soro Fetal Bovino (SFB)
da Cultilab (Campinas, SP, Brasil);
• O soro fetal bovino (SFB) e penicilina/estreptomicina (10000 U e 10 mg para
cada litro de meio, respectivamente) foram obtidos da Cultilab Materiais para
Cultura Celulas LTDA (Campinas – SP).
42
• As linhagens celulares foram obtidas do Banco de Células do Rio de Janeiro
(BCRJ, Rio de Janeiro, RJ).
2.1.2 Equipamentos Laboratoriais
• Agitador orbital modelo 255-B, banhos-maria e estufas de temperatura
constante da FANEM Ltda. (São Paulo, SP, Brasil);
• Sonicador Unique Ultracleaner 1600 (São Paulo-SP);
• Balança analítica de precisão e mesa oscilante TE-143-EL da TECNAL
(Piracicaba, SP, Brasil);
• Cuba para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido por Jaques e
col. (1968), da Técnica Permatron Ltda. (São Paulo, SP, Brasil);
• Centrífuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co. Ltd. (Tóquio, Japão);
• Fontes de corrente contínua da BioAgency Biotecnologia Ltda. (São Paulo,
SP, Brasil);
• Espectrofotômetro Femto 700 plus, Femto Ind. Com. Instrumentos Ltda. (São
Paulo, SP, Brasil);
• Medidor de pH Orion Research, modelo 701 A/digital lonalyzer (Cambridge,
MA, EUA);
• Bomba a vácuo da TECNAL modelo TE-058 (Piracicaba, SP, Brasil);
• Sistema cromatográfico de HPLC, Merck (Richmond, CA, EUA) com coluna
LiChroCART® 250-4 LiChrospher® 100 NH2 (10 μm) acoplada;
• Bancada de Fluxo Laminar Pachane Pa300 (Piracicaba, SP, Brasil);
• Banhos e estufas de temperatura controlável da FANEM Ltda (São Paulo, SP,
Brasil);
• Zetaplus® analyzer, (Brookhaven instruments, Holtsville, NY, USA);
• Destilador de água MA-270 da Marconi Ltda (Piracicaba, SP, Brasil);
• Espectrofotômetro digital DR5000 UV/VIS da Hach Company® (Loveland,
Colorado, EUA);
• Incubadora de CO2 com desinfecção UV - Modelo L212 foi obtido da
LABOVEN (TÜV – Alemanha);
• Leitor de microplacas Epoch-Biotek Instruments (Winooski, VT, EUA);
• Microscópio NIKON Eclipse Ti-U, NIS Elements AR Ver4.30.01 DU1 64 bit,
ano de 2014 (Melville, NY, EUA);
43
• Purificador de água Milli-Q® Water System da Millipore Corp. (Bedford, MA,
EUA);
• Espectrometro Thermo-Nicolet Nexus 470 pesetas;
• Microscópio eletrônico de varredura com detector de espectroscopia de
energia dispersiva modelo Hitachi Tabletop Microscope TM-3000, Oxford
Instruments detector(Dallas, TX, EUA).
2.1.3 Material biológico
- Alga Marinha Vermelha - Gracilaria birdiae
Figura 11: (A) Imagem da alga Vermelha Gracilaria birdiae no recife costeiro marinho em Rio do Fogo-RN. (Filo: Rodhophyta; Classe: Florideophyceae; Ordem: Gracilariales; Família: Gracilariaceae; Gênero: Gracilaria; Espécie: Gracilaria birdiae). Fonte: Arquivo pessoal do Prof. Dr. Dárlio Inácio Alves Teixeira (Escola Agrícola de Jundiaí - UFRN).
2.2 MÉTODOS 2.2.1 Coleta da Gracilaria birdiae
A macroalga marinha Gracilaria birdiae foi coletada em banco natural na
praia do município de Rio do Fogo (figura11), situado no litoral Nordeste do Rio
Grande do Norte, cujas coordenadas geográficas são: latitude 05º 16’ 22” Sul e
longitude 35º 22’ 59” Oeste.
44
Figura 12: Imagem do município de Rio do Fogo com coordenadas geográficas. Fonte: ©2015 Google. Acessado em 11.11.2015.
Após a coleta as algas vermelhas Gracilaria birdiae foram armazenadas
temporariamente em recipientes refrigerados, hermeticamente fechados e foram
conduzidas ao Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL) no
centro de biociências da UFRN. Estas foram selecionadas, lavadas com água
corrente para a remoção de epífitas e outros contaminantes, em seguida foram
desidratadas em estufa aerada a 45 °C, trituradas, pesadas e submetida a um
processo de despigmentação e delipidação.
2.3 OBTENÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA MARINHA G. birdiae 2.3.1 Panorama da obtenção dos PS da alga marinha G. birdiae
Os polissacarídeos da alga G. birdiae foram fracionados e caracterizados
quimicamente, bem como, submetidos a diferentes testes in vitro, inclusive a
experimentos em cultura de células. Na figura 13, de forma esquemática, estão
resumidas as principais etapas metodológicas realizadas durante o
desenvolvimento desta tese. Nos tópicos seguintes, apresenta-se de forma mais
detalhada a descrição de cada uma delas.
45
Figura 13: Esquema representativo das etapas do estudo realizadas nesta tese. Fonte: Autoria Própria.
2.3.2 Extração de polissacarídeos da G. bridiae
A extração de polissacarídeos sulfatados foi realizada conforme descrito
por FIDELIS e col. (2014), para tal, 5 g da alga delipidada foi colocada em um
becker e adicionou-se 50 mL de NaOH 0,1M. Posteriormente, este becker
contendo o material, foi colocado em um sonicador e submetido as onda sonoras
na frequência de 20 kHz (60 W) por 10 minutos, esse procedimento foi repetido 3
vezes com intervalos de 5 minutos a 60 ºC. Após este processo, o material foi
deixado a 22 ºC sob agitação por 24 horas e em seguida foi realizada a proteólise,
para tal, foram adicionados 50 mL de NaCl 0,25 M a 5 g de alga em seguida o pH
do meio foi ajustado para 8,0 com NaOH 2 M, este pH é ideal para a ação das
enzimas proteolíticas. Em seguida, 75 mg de enzimas proteolíticas (prozima),
foram adicionadas ao meio. O recipiente com esse material foi colocado em
banho-maria a 60 ºC por 16 horas. Após este passo, o material resultante foi
centrifugado a 10000 g/ 4 ºC/ 15 minutos, filtrado e o seu volume final aferido. Em
46
seguida, foi adicionado dois volumes de etanol PA (~100 mL) para promover a
precipitação dos polissacarídeos. Após 24 h a 4 ºC, o precipitado foi separado da
solução por centrifugação (10000 g/ 4 ºC/ 15 minutos), seco sob pressão
atmosférica reduzida, triturado e estocado para os procedimentos seguintes. O
material seco foi denominado extrato bruto (EB) e armazenado em recipiente
hermético para ser utilizado posteriormente.
2.3.3 Fracionamento de Polissacarídeos da G. birdiae em coluna de DEAE –
celulose.
O EB (150 mg), foi dissolvido em 5 mL de tampão acetato de sódio 0,1 M
(pH 5,0) e estes foram aplicados em uma coluna de DEAE-celulose de troca
iônica (6,5 x 1,5 cm) equilibrada com o mesmo tampão e acoplada a um coletor
de frações. A coluna foi eluída, passo a passo, com soluções de diferentes
concentrações de NaCl (0,25; 0,50; 0,75; 1,0; 1,25; 1,50, 1,75 e 2,0 M) também
preparadas no mesmo tampão de equilíbrio. O fluxo da coluna foi de 120 mL/h,
sendo coletadas frações de 5 mL/tubo. Os PS foram monitorados pela
propriedade metacromática com 1,9-azul-dimetilmetileno (DMB) utilizando um
espectrofotômetro ajustado a 525 nm.
2.4 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS POLISSACARÍDEOS EXTRAÍDOS DA G. birdiae
2.4.1 Dosagem de Açúcares Totais
Os açúcares totais foram determinados conforme DUBOIS e col. (1956),
pelo método do fenol/ácido sulfúrico. O teor de açúcares existente no extrato bruto
e em cada fração foi calculado a partir dos valores expressos na leitura por
espectrofotometria a 490 nm, utilizando como referência uma curva padrão de
solução de D-galactose.
2.4.2 Dosagem de Sulfato
O teor de sulfato foi determinado com base no método gelatina/bário
descrito por (DODGSON; PRICE, 1962). Inicialmente, seis soluções (10 mg/mL),
47
contendo cada uma das amostras, foram colocadas (100 μL) individualmente em
ampolas de vidro e estas adicionou-se 100 μL HCl (8 M). Estas ampolas foram
seladas e colocadas em fervura (100 ºC) durante 6 horas. Posteriormente, as
ampolas foram rompidas e o material foi seco a pressão reduzida em um
recipiente que também continha pastilhas de NaOH. Após, a secagem adicionou-
se 200 μL de água destilada e fez-se uma nova desidratação. Este procedimento
foi repetido três vezes. Em seguida, o material foi ressuspendido em um volume
pré-determinado e utilizado para reagir com sais de bário dispersos em gelatina.
O material resultante deste procedimento foi lido a 500 nm. Como curva padrão
utilizou-se uma solução de sulfato de sódio a 1 μg/μL em um intervalo de 0 a 40
μg.
2.4.3 Dosagem de Proteínas
A quantificação de proteínas do extrato bruto e frações foi determinada
utilizando o reagente comercial de Bradford®, como descrito em Melo e
colaboradores (2013). Um total de 10 μL de cada uma das solucoes das amostras
(10 mg/mL) foi aplicada um em microplaca de 96 poços e a estas foi acrescentado
o reagente de Bradford® em um volume pré-determinado (200 μL). Após 10
minutos a temperatura ambiente (22 °C), a microplaca, contendo as amostras
juntamente ao reagente, foi lida em espectrofotômetro a 595 nm. Como padrão foi
utilizado uma curva de albumina que variou de 0 a 50 μg.
2.4.4 Dosagem de compostos fenólicos
As frações foram avaliadas do ponto de vista qualitativo pelo método
colorimétrico de Folin-Ciocalteau e as leituras realizadas a 765 nm. O ácido gálico
foi utilizado como padrão de leitura (COSTA et al., 2010) resultado foi expresso
como a razão de mg de ácido gálico/g de amostra.
2.4.5 Determinação da Composição Monossacarídica
Para a identificação das unidades monossacarídicas dos polissacarídeos
sulfatados de G. birdiae, as amostras foram submetidas à hidrólise com 2 M de
HCl, por 2 horas, a temperatura de 100 °C, permitindo o rompimento das ligações
48
glicosídicas dos polissacarídeos presentes. Após hidrólise, as amostras foram
desidratadas à pressão atmosférica reduzida, na presença de pastilhas de NaOH.
Após este procedimento, o material hidrolisado foi aplicado em cromatografia
líquida de alta performance (HPLC), utilizando-se uma coluna LiChroCART® 250-
4 LiChrospher® 100 NH2 (10 μm), tendo como fase móvel acetonitrila: água
(80:20) em um fluxo de 1 mL/min, a 40 ºC . Foram usados como padrões os
açúcares: L-fucose, D-xilose, D-galactose, D-manose, D-glucose, D-arabinose, D-
manose e ácido D-glucurônico.
2.4.6 Eletroforese em gel de agarose
O gel de agarose foi preparado na concentração de 0,6 % em tampão 1,3 –
diaminopropano acetato (PDA) e colocado sob lâminas de vidro (5,0 cm X 7,5 cm
X 1,5 mm). Cinco microlitros de cada extrato na concentracao de 10 μg/μL, foram
aplicados em canaletas no gel e submetidos à corrida eletroforética (100 V/cm por
1 hora) em tampão PDA pH 9,0, dentro de uma cuba refrigerada a 4 ºC, as
amostras foram aplicadas partindo do pólo negativo. Em uma das canaletas foram
aplicados 5 μL de uma amostra padrao de corrida (vermelho de cresol).
Terminada a corrida, os polissacarídeos foram precipitados com brometo de
cetiltrimetilamônio 0,1 % (CETAVLON) por um período de no mínimo 2 horas, à
temperatura ambiente. Posteriormente, o gel foi submetido a uma corrente de ar
quente para ser seco e então corado com azul de toluidina 0,6%. O excesso de
corante foi removido por uma solução de ácido acético 1% e etanol 49% em água
(solução descorante). Após a remoção do corante em excesso a lâmina revelada
foi seca à temperatura ambiente e analisada.
2.4.7 Espectroscopia de Infravermelho
A espectroscopia de infravermelho dos extratos e frações de PS de G.
birdiae foi realizada em aparelho espectrômetro PerkinElmer, nas faixas de 500 a
4000 cm-1, e realizado no Departamento de Química da Universidade Federal do
Rio grande do Norte. Os extratos de PS (10 mg) foram analisados após secagem
em aparelho de Abdenhalden, sob forma de pastilha constituídas também de
brometo de potássio (KBr) contendo pentóxido de difósforo (P2O5) a 60 ºC.
49
Sessenta e sete varreduras em uma resolução de 4 cm-1 foram calculados e
referenciadas contra o ar.
2.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE PS SOBRE A FORMAÇÃO DE CRISTAIS DE OxCa
2.5.1 Ensaio de cristalização do OxCa
Os cristais de OxCa podem ser formados in vitro a partir de Ca2+ e oxalato
a partir da mistura de cloreto de cálcio (8 mmol/L), oxalato de sódio (1 mmol/L),
cloreto de sódio (200 mmol/L) e acetato de sódio (10 mmol/L), sendo as
concentrações finais desta solução, semelhantes a das concentrações fisiológicas
da urina. A formação dos cristais de OxCa foi avaliada na presença ou na
ausência (controle) dos polissacarídeos e suas respectivas frações, através de
espectrofotometria, após 30 min a 620 nm. A partir dos valores de absorbância
obtidos foi possível montar o perfil de formação de cristais de OxCa na presença
dos polissacarídeos.
2.5.2 Análise da morfologia dos cristais de OxCa por imagem de
microscópica óptica
Os cristais foram sintetizados em duas condições, (na presença e na
ausência dos polissacarídeos sulfatados), após a formação destes, as soluções
contendo estes cristais foram centrifugadas a 5000 x g e o sobrenatante foi
descartado. O precipitado é composto principalmente por cristais de OxCa e foi
ressuspendido em 0,5 mL de água e uma alíquota de 0,1 mL foi colocada em
lâmina histológica e observada em microscópio ótico (600x) imediatamente após a
ressuspenção. Foram obtidas imagens de 10 campos diferentes aleatórios para
cada lâmina, em seguida os diâmetros e tamanhos dos cristais foram analisados
utilizando o software NIS Elements AR Ver4.30.01 DU1 64 bit, ano de 2014
(Melville, NY, EUA). As conclusões acerca das aferições dos cristais de OxCa
foram obtidas após a realização de experimentos distintos, repetidos quatro vezes.
50
2.5.3 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Espectroscopia de
Energia Dispersiva (EDS)
Para se caracterizar a morfologia e composição dos cristais de OxCa na
presença e ausência do extrato bruto e frações com melhores rendimentos, foi
realizada a microscopia eletrônica de varredura MEV (modelo Hitachi Tabletop
Microscope TM-3000, com aceleração de voltagem de 5 kV, frequência de
50/60Hz, magnificação da imagem de 15 à 30000 vezes) e a Espectroscopia de
Energia Dispersiva EDS (o equipamento utilizado foi Swift ED TM-3000, fabricante
Oxford Instruments detector). As imagens foram geradas com a resolução
1280x960 pixels.
2.5.4 Medida do potencial zeta (ζ) dos cristais de OxCa
Após 30 minutos do início da formação dos cristais na presença e na
ausência dos polissacarídeos, as soluções foram centrifugadas (5000 x g). O
sobrenadante foi descartado e o precipitado rico em cristais de OxCa foi
ressuspendido em 1,5 mL de água e avaliado no Zeta Plus® (controle de
temperatura ativo entre -5°C a 110°C, ±0.2°C, 1 a 4 s/ciclo, faixa de pH: 2 a 12,
condutividade: 0 a 7,5 mS/cm, intensidade do campo elétrico: 0 a 3.2 kV/m,) para
obtenção do potencial zeta.
2.5.5 Utilização da microscopia de luz clara para análise da morfologia dos
cristais de OxCa
Para melhor compreensão acerca da morfologia e disposição dos
polissacarídeos sulfatados nos cristais de OxCa, o extrato bruto e as frações
polissacarídicas foram marcados com isotiocianato de fluoresceína (FITC). Foram
utilizadas 5 mg de cada fração e adicionadas a uma solução 0,1 M de tampão
fosfato (PBS) em pH 7,0 contendo 0,1 mg de FITC. A solução foi mantida em
ambiente com redução de luminosidade, sob leve agitação, à temperatura
ambiente por 1 hora. Em seguida o material foi dialisado contra água deionizada
em membranas com poros de 6 kDa de diâmetro e em seguida, liofilizado.
Amostras sem polissacarídeos sulfatados, assim como amostras de extrato bruto
e de frações foram marcadas com FITC para a produção de novos cristais de
OxCa, conforme metodologia descrita anteriormente no item 2.5.1, já as laminas
51
foram montadas conforme item 2.5.2. Para a visualização das imagens (10
campos) foi utilizado o Microscópio Confocal Zeiss LSM 700 (Objetiva 60x/Oil) e
analisados através do software ZEN (Nikon, Japão).
2.6 ENSAIO DO MTT
2.6.1 Ensaio de redução do MTT a cristal de formazan
O ensaio do MTT foi realizado como descrito por Almeida-Lima e col.
(2010). Células renais HEK-293 (Human Embryonic Kidney 293 cells) e MDCK
(Mardin Darby Canine Kidney) foram cultivadas em frascos de cultura em meio
DMEM com 10 % soro fetal bovino com 100 ug/mL de estreptomicina e 100 IU/mL
de penicilina (Sigma). Também foram utilizadas células 786-0 (linhagem de célula
de adenocarcinoma renal humano) em meio RPMI com soro, nas mesmas
condições. As células foram colocadas em placas estéreis de 96 poços a uma
densidade de 5 x 103 células/poço e deixadas a aderir durante a noite (18 h) a
37 °C e 5 % de CO2. No ensaio de redução do MTT, foram adicionados o extrato
bruto e frações em diferentes concentrações (0,1, 0,5, 1 e 2 mg/mL). Após 24
horas de incubação, os vestígios celulares foram removidas por lavagem das
células com PBS. Meio de cultura (10 uL), contendo 12 mM de MTT (Sigma) (3 -
(4,5- dimetiltiazol - 2 - il) -2,5-difeniltetrazólio brometo), foi dissolvido em soro e
adicionado para determinar os efeitos da amostra sobre a proliferação celular. As
células foram então incubadas durante 4 h a 37 °C e 5 % de CO2. Para solubilizar
o produto de MTT reduzido, 100 mL de isopropanol contendo 0,04 N de HCl foi
adicionado a cada poço e completamente misturados utilizando um pipetador
multicanal. Dentro de 1 hora de adição de HCl - isopropanol, a absorbância a 570
nm foi lida utilizando um leitor de microplacas Multiskan Ascent (Thermo
Labsystems, Franklin, MA, EUA) .
52
2.7 AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DE PS SOBRE LINHAGENS CELULARES SUBMETIDAS A DANOS POR H2O2 E OxCa
2.7.1 Efeito protetor de polissacarídeos sulfatados de G. birdiae sobre a
linhagem celular renal MDCK, submetida a dano por peroxido de hidrogênio
e OxCa.
As células foram “plaqueadas” em microplacas estéreis de 96 poços em
uma densidade de 1 x 104 células/poço e mantidas em repouso para adesão por
24 horas, à 37 °C e 5% CO2. Em seguida, o meio foi trocado por um novo sem a
presença de SFB e as células foram mantidas em carenciamento por 24 horas.
Após este período, foram utilizadas duas condições para se avaliar o dano celular
na presença dos PS. Na primeira condição (pré-dano), foi adicionado um novo
meio enriquecido com SFB com diferentes concentrações das frações
polissacarídicas, e as células permaneceram incubadas por um novo período de
24 horas. Após este período, o meio foi retirado e as células foram submetidas à
exposição em meio contendo 0,5 mM de H2O2 por 3 horas (melhor condição do
Ic=50). Posteriormente o meio foi retirado e as células foram expostas a outro
meio contendo 3 mM de OxCa, durante 24 horas. Em seguida foi realizada a
segunda condição, no entanto as diferentes concentrações das frações
polissacarídicas foram adicionadas ao mesmo tempo que o H2O2 por 3 horas, em
seguida meio foi retirado e as células foram expostas a outro meio contendo 3 mM
de OxCa pelo mesmo tempo de 24 horas. Posteriormente, realizou-se o ensaio de
redução do MTT.
2.8 DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES
2.8.1 Determinação de atividade enzimática antioxidante de superóxido
dismutase -SOD (EC 1.15.1.1), catalase - CAT (EC 1.11.1.6).
A determinação da atividade da SOD foi avaliada quantificando-se a
inibição de auto oxidação de superóxido dependente de adrenalina, através de
espectrofotometria a 480 nm, e os resultados foram expressos como unidades de
SOD/mg de proteínas. A atividade da catalase foi obtida medindo a taxa de
diminuição na absorbância H2O2 num espectrofotómetro a 240 nm, e os
resultados são expressos como unidades de CAT/mg de proteína. A formação de
53
bolhas na geração de oxigênio pela atividade CAT foi monitorada e não interfere
na medição das atividades CAT para faixa linear de detecção da atividade CAT.
2.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados dos experimentos realizados foram expressos em porcentagem
ou como médias ± desvio padrão (n=3). Para testar diferenças entre os extratos
aquosos, foi utilizado o teste de análise de variância (ANOVA). O teste de
Student–Newman–Keuls (Nível de significância de p<0,05) foi aplicado para se
comprovar algumas similaridades encontradas pela ANOVA. Todos os testes
foram realizados utilizando o GraphPad Prism 5.0f, (2014) versão OS X Lion
(OSX 10.7) (GraphPad Softwares, USA).
54
3 RESULTADOS
3.1 EXTRAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS DA ALGA MARINHA G. birdiae
A obtenção de polissacarídeos sulfatados foi realizada conforme o método
de extração otimizado e descrito por Fidelis e col. (2014). O rendimento bruto
médio (massa seca) de PS por extração, foi de 413 ± 16 mg (8,6%), a partir da
utilização de 5 g de alga.
3.2 CARACTERIZAÇÃO DE AMOSTRA POR ESPECTROSCOPIA DE INFRA VERMELHO.
Com a finalidade de se confirmar se amostra obtida é constituída pelo
mesmo material descrito por Fidelis e col. (2014), o extrato bruto foi submetido a
uma análise de espectroscopia de infravermelho. Os principais sinais detectados
no espectro são demonstrados na tabela 3. Nela observa-se também os valores
publicados por Fidelis e col. (2014).
Tabela 3: Sinais de espectros de infravermelho para amostras contendo PS obtidos em condições semelhantes às de Fidelis e colaboradores (2014).
Fonte: FIDELIS et al., 2014.
Como pode ser observado na tabela 3, os sinais que foram identificados no
espectro da amostra obtida aqui neste trabalho se assemelham muito com
aqueles descritos anteriormente (FIDELIS et al., 2014), o que confirma a
identidade do material obtido.
3.3 FRACIONAMENTO DE PS PRESENTES NO EXTRATO BRUTO ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA (DEAE–CELULOSE.)
Na tabela 4 estão resumidos os dados referentes ao rendimento do
processo de fracionamento dos polissacarídeos sulfatados do extrato bruto obtido
da alga G. birdiae. A amostra contendo polissacarídeos sulfatados foi eluída em
Condições de Extrações dos PS
Sinais (cm-1)
Fidelis e col. (2014) 3460 2922 1662 1238 1065 849
Dados desta tese 3457 2936 1648 1245 1071 853
55
coluna de cromatografia de troca iônica DEAE celulose e obteve-se oito frações
(F-0.25; F-0.5; F-0.75; F-1.0; F-1.25; F-1.5; F-1.75 e F-2.0), nominadas conforme
molaridade de eluição com NaCl. Posteriormente estas frações foram dialisadas e
em seguida pesadas para se verificar o rendimento percentual de massa, em
relação ao peso seco da amostra. Os maiores rendimentos foram verificados com
as frações F-0.25, com 13,49%, F-0.5, com 15,2% e F-0.75% com 7,85%. Estas
amostras foram selecionadas para os ensaios posteriores.
Tabela 4: Rendimento de frações polissacarídicas de G. birdiae em coluna de DEAE-Celulose
Fração da G. birdiae Rendimento (%)a
F-0,25 13,49 ± 1,3 F-0,5 15,12 ± 2,1
F-0,75 7,85 ± 0,8 F-1,0 1,74 ± 2,8
F-1,25 ndb
F-1,5 ndb F-1,75 ndb F-2,0 ndb
a Porcentagem em relação a massa seca de extrato bruto aplicada a coluna de DEAE-Celulose. b Não detectado. Fonte: Autoria própria. 3.4 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE DAS FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS OBTIDAS DA ALGA MARINHA VERMELHA Gracilaria
birdiae
No intuito de confirmar a presença de polissacarídeos sulfatados no extrato
bruto e frações obtidas após a eluição na cromatografia DEAE celulose, as
mesmas foram submetidas a eletroforese em gel de agarose com tampão PDA,
conforme descrito em métodos. Na figura 14, mostra-se uma imagem
representativa de uma das lâminas obtidas. Nesta lamina, pode-se verificar a
presença de PS no extrato bruto e nas demais frações. Observa-se que todas as
bandas são constituídas de polissacarídeos sulfatados com mobilidade
eletroforética semelhante.
56
Figura 14: Lâmina de eletroforese em gel de agarose 0,6% contendo o extrato bruto e frações polissacarídicas da alga marinha vermelha G. birdiae. 50 μg do extrato bruto e cada fração foram aplicados no gel de agarose em tampão PDA (1,3- diaminopropano-acetato) pH 9.0 e submetidas a eletroforese à 100 V/cm por 1 hora a partir do ponto de origem (pólo negativo para o pólo positivo). O gel foi mantido em 0.1% CTV (cetiltrimetilamônio), desidratado e os polissacarídeos foram corados com azul de toluidina 0.1% em uma solução contendo 49% de etanol e 1% de ácido acético em água. Fonte: Autoria própria
3.5 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE AÇUCARES TOTAIS, SULFATO, COMPOSTOS PROTEICOS E FENÓLICOS PRESENTES NAS AMOSTRAS CONTENDO PS DA ALGA VERMELHA G. birdiae
Para se estimar a quantidade de polissacarídeos, sulfatos, proteínas e
compostos fenólicos presentes nas amostras obtidas da alga, foram feitas as
respectivas dosagens, e os dados obtidos constam na tabela 5. Pode-se observar
que o teor de polissacarídeos encontrados para o extrato bruto e as frações F-
0.25; F-0.5 e F-0.75 foram semelhantes, ou seja, variou entre 71,24% e 80,45%,
já com a fração F-1,0, encontrou-se um valor inferior de polissacarídeo, cerca de
duas vezes e meia menor do que aquele obtido com as frações anteriores. Na
fração F-1,25 não foi possível identificar a presença dos carboidratos totais nas
condições avaliadas.
A relação de açúcar/sulfato foi semelhante para as frações F-0.25; F-0.5 e
F-0.75, já para a fração F-1.0 para este parâmetro foi em torno de 30% maior.
Para todas as frações foram encontrados baixos níveis de contaminação proteica
como pode-se observar na tabela 5. A contaminação por compostos fenólicos
+
-
EB |F1.75 |F1.5 | F1.25 | F1.0 | F0.75 | F0.5 | F0.25
57
também foi baixa para todas as frações, atingindo a valor máximo de 1,8 % em F-
0.25 e F-0.5
Tabela 5: Composição química do extrato bruto e frações polissacarídicas da alga marinha vermelha Gracilaria birdiae.
Frações Açúcares totais (%)
Sulfato (%)
Açúcar /sulfato
Proteínas (%)
Fenólicos (%)
Ex. Bruto 76,01 ± 0,06a 4,62 ± 0,06a 16,45 ± 0,06a 1,22 ± 0,05a 1,7 ± 0,02a
F-0.25 73,88 ± 0,04b 3,51 ±0,04b 21,04 ± 0,02b 0,30 ± 0,01b 1,8 ± 0,03a
F-0.5 80,45 ± 0,06c 3,24 ± 0,02b 24,83 ± 0,08c 0,26 ± 0,01b 1,8 ± 0,03a
F-0.75 71,42 ± 0,03d 3,41 ± 0,04b 20,94 ± 0,03b 0,68 ± 0,02c 1,3 ± 0,04b
F-1.0 23,9 ± 0,05e 0,8 ± 0,01c 29,87 ± 0,04d 0,34 ± 0,01b *nd
F-1.25 *nd 1,09 ± 0,02d *nd *nd *nd
*nd – não detectado. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3); a,b,c,d,e Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre as amostras; O total de açucares e sulfato das frações polissacarídicas foi determinado pelos métodos fenol/H2SO4 e gelatina BaCl2, respectivamente; Proteínas e compostos fenólicos totais foram determinados pelo método Bradford® e Folin-Ciocalteau. Fonte: Autoria própria.
3.6 DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA DO EXTRATO BRUTO E FRAÇÕES CONTENDO PS DA ALGA VERMELHA G. birdiae
A tabela 6 contém dados acerca da composição monossacarídica do
extrato bruto e frações contendo polissacarídeos sulfatados. Nota-se que para
todas as amostras, não há diversidade de monossacarídeos. É observada a
presença de galactose e anidrogalactose para maioria das frações, no entanto,
nas frações F-0.25 e F-0.5 encontrou-se apenas galactose.
Tabela 6: Composição monossacarídica do extrato bruto e frações contendo PS da alga marinha vermelha Gracilaria birdiae.
Composição Monossacarídica da G. birdiae
Frações Massa μg Relação (%) Molaridade
Gal AnGal Gal AnGal Gal AnGal
Extrato Bruto 8,75 2,96 74,71 25,29 1 0,34 F0.25 8,74 *nd 100,00 0,00 1 0,00 F0.5 7,04 *nd 100,00 0,00 1 0,00 F0.75 7,75 1,16 86,99 13,01 1 0,15 F1.0 3,85 2,44 61,18 38,82 1 0,63
1Gal- Galactose; 2AnGal – Anidrogalactose. *nd – Não detectado. A composição monossacarídica foi estimada por HPLC Fonte: Autoria Própria.
58
3.7 SINAIS DE INFRAVERMELHO (IV) DO EXTRATO BRUTO E DAS FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DA ALGA VERMELHA Gracilaria birdiae
Na tabela 7 são expostos os principais sinais de infravermelho dos
polissacarídeos sulfatados de Gracilaria birdiae. As frações F-0.25, F-0.5 e F0.75
foram caracterizadas por IV no intuito de verificar possíveis semelhanças ou
diferenças estruturais entre os polímeros presentes nestas frações. Já a fração F-
1.0 devido a baixa quantidade de amostra obtida após a eluição na coluna de
DEAE celulose, não foi utilizada neste experimento. Os sinais de IV obtidos com
as frações testadas são característicos de carboidratos de algas vermelhas e
foram semelhantes entre si.
59
Tabela 7 – Sinais assinalados de absorção referentes a espectroscopia de Infravermelho do extrato bruto e frações de polissacarídeos sulfatados de Gracilaria birdiae.
Sinais (cm-1)
Extrato Bruto F-0.25 F-0.5 F-0.75
3437,0 3412,2 3407,1 3420,0
2936,0 2901,0
2959,2 2927,5
2960,8 2929,2
2959,0 2930,6
1646,7 1663,0 1652,9
1648,2 1657,5 1639,0
1562,3 1453,1 1413,6
1537,5 1542,2 1415,9
1543,4 1412,2
1539,1 1419,8
1368,7 1368,7 1365,4 1368,0
1245,8 1263,4 1254,6 1223,1
1287,0 1225,4
1153,7 1152,6 1149,9 1144,9
1071,3 1073,6 1071,5 1073,7
1041,1 1041,9 1040,0 1045,0
927,3 933,3 929,2 *nd
887,8 863,0
890,0 887,5 *nd
853,0 *nd *nd *nd
*nd 799,5 798,1 798,0
768,6 738,3
767,8 740,0
766,6 *nd
614; 534,7 *nd *nd *nd
* nd – não detectado. Fonte: Autoria Própria.
3.8 AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DAS AMOSTRAS POLISSACARÍDICAS DA ALGA VERMELHA G. birdiae NA FORMAÇÃO DE CRISTAIS DE OxCa
Na tabela 8, encontram-se valores referentes as inibições da nucleação e
agregação dos Cristais de OxCa. Ao observar esta tabela, verifica-se que o menor
valor de inibição de nucleação é encontrado com o uso do extrato bruto (41,76%),
porém foram achados valores mais elevados com o uso das frações
polissacarídicas, com destaque para a F-0.25 que promoveu a inibição da
nucleação em mais de 76,92%. Já a agregação, que é uma etapa posterior a
nucleação, teve sua maior inibição na presença da fração F-0.25 (68,57%). As
frações F-0.5 e F-0.75 tiveram valores de nucleação e agregação acima de 42% e
60
o menor valor registrado para a agregação foi atribuído a fração F-1.0, com
14,29%.
Tabela 8: Efeito dos polissacarídeos sulfatados de G. birdiae sobre a nucleação e agregação de cristais de OxCa.
Polissacarídeos sulfatados*
Inibição da Nucleação do cristal de OxCa (%)
Inibição da Agregação do cristal de OxCa (%)
Extrato Bruto 41,76 41,91
F-0.25 76,92 68,57
F-0.5 52,11 42,68
F-0.75 47,70 50,46
F-1.0 46,26 14,29
* 250 μg de amostra. Fonte: Autoria Própria.
3.9 INFLUÊNCIA DE AMOSTRAS PS DE G. birdiae SOBRE A FORMAÇÃO DOS CRISTAIS DE OxCa
Os cristais de OxCa formados tanto na ausência de amostras
polissacarídicas, (controle e citrato de sódio), quanto na presença dos PS da G.
birdiae (Extrato Bruto e frações), foram analisados através de um microscópio de
luz clara. Na figura 15-A, pode-se observar a média do número de cristais
monoidratados, diidratados e triidratados e em 15-B a média do comprimento
destes que foram formados na ausência de amostras polissacarídicas (controle),
na presença de um inibidor (citrato), assim como na presença de diferentes
amostras polissacarídicas.
61
Figura 15: Influencia do extrato bruto e frações polissacarídicas da G. birdiae sobre a quantidade e tamanho dos cristais. (A) Número e tipos de cristais (azul: cristais monohidratados (COM); vermelho: cristais dihidratados (COD); verde: cristais trihidratados(COT); (B) Comprimento dos cristais.
Ao se observar os dados relacionados ao grupo controle (Figura 15-A),
observa-se que o número total de cristais foi de 238 e que foram encontrados os
três tipos de cristais (COM, COD e COT). Todavia, quantitativamente, não se
encontrou números semelhantes dos diferentes tipos, nota-se que existem 204
cristais COM e apenas 17 cristais COD e 17 COT, ou seja, os cristais COM foram
cerca de 12 vezes mais predominantes que os demais para esta amostra.
Estes números se modificaram quando os cristais foram formados na
presença de citrato de sódio. O número de cristais COM, que no grupo controle
era de 204, com o citrato foi de 171, o que percentualmente correspondeu a uma
queda de 16%. Por outro lado, observou-se um aumento de cerca 8 vezes do
número de cristais COD na presença de citrato, o número que no grupo controle
era de 17, com o tratamento passou a para 142.
62
Quando se observa os dados obtidos com o grupo tratado com o extrato
bruto, nota-se um valor de 440 cristais (Figura 15-A), ou seja, quase o dobro do
número de cristais observados no grupo controle. Porém, pôde-se verificar que
este aumento não ocorreu com mesma proporcionalidade para todos os tipos de
cristais, o número de cristais COM aumentou apenas 1,2 vezes, enquanto o de
COD aumentou 9 vezes e o de COT cerca de 2 vezes, ao se comparar com grupo
controle.
O tratamento realizado com a fração F-0.25 foi capaz de inibir a síntese
dos cristas COM de OxCa, pois quando se compara os números destes cristais
(36 cristais) aos do grupo controle (204 cristais), observa-se que houve uma
redução primeiro em relação ao segundo em aproximadamente 6 vezes. Os
cristas COD na presença da F-0.25 tiveram seu número aumentado (161 cristais)
quando comparado ao controle (17 cristais). Este aumento foi de
aproximadamente 10 vezes. Já os cristas COT (Figura 15-A) com o uso desta
mesma fração teve sua síntese inibida (4 cristais), se comparado ao grupo
controle (17 cristais).
Ao se observar a quantidade de cristais COM (30 cristais) formados na
presença da F-0.5 comparando-se ao controle (204 cristais), verifica-se que
houve uma redução do número destes cristais em aproximadamente 7 vezes. Os
número de cristais COD para este mesmo tratamento (89,5 cristais), quando
comparados ao controle (17 cristais), verifica-se que houve um aumento de
aproximadamente 5 vezes. Já os COT diminuíram de 17 cristas formados no
controle para 9 na presença da F-0.5 (Figura 15-A).
A presença das frações polissacarídicas F-0.75 foi capaz de inibir a síntese
de cristais COM (140 cristais) quando comparada ao controle (204 cristais). Essa
redução representa um valor de aproximadamente 1,5 vezes menos cristais
formados do que o controle. Os cristais COD para este tratamento teve seu
número aumentado de 17 cristais formados no controle para 108 na presença da
fração F-0.75, ou seja, o número de cristais aumentou em mais de 6 vezes. A
síntese dos cristais COT, de acordo com estes resultados, não teve grande
interferência nesse tratamento, pois só houve o aumento de 2 cristais em relação
ao grupo controle (Figura 15-A).
A F-1.0 foi capaz de inibir a síntese dos COM de 204 cristais no controle,
para apenas 127 na presença desta fração, ou seja, pouco mais de 1,5 vezes.
63
Porém foi quando se refere ao cristal COD, o seu número aumentou de 17 para
127, o que representou um aumento de aproximadamente 7,5 vezes. Já os
cristais COT teve seu número reduzido em aproximadamente 2 vezes, de 17
cristas no controle para 9 na presença da fração (Figura 15-A).
A figura 15-B refere ao comprimento dos cristais formados em diferentes
condições, (controle, citrato e amostras polissacarídicas). Ao se observar o
comprimento dos cristais COM (9,5 μm) no controle, verifica-se que apenas as
com o uso das frações F-0.25 (10 μm) e F-1.0 (10,5 μm) foi que se identificou
cristais maiores que estes, porém o comprimento não variou muito. Para as
demais amostras, os cristais COM foram menores, com destaque para os cristais
formados na presença da F-0.75, pois estes exibiram o menor comprimento, em
torno de 6 μm.
Os cristais COD tiveram as maiores médias de comprimentos na condição
controle e foram dentre todos o cristais os maiores, com 13 μm e com o uso das
outras amostras nao houve grandes variacoes (entre 9 μm e 11 μm). Os cristais
COT tiveram seus comprimentos homogêneos e pequenas variações de
comprimentos (entre 8 μm e 11 μm).
No conjunto dos resultados, observa-se que as amostras que interferiram
mais na formação dos cristais de OxCa foram o extrato bruto, F-0.25 e F-0.5, pois
promoveram as variações mais destoantes em relação ao controle.
3.10 INFLUÊNCIA DAS AMOSTRAS SOBRE A MORFOLOGIA DOS CRISTAIS DE OxCa
A figura 16 mostra-se imagens captadas no microscópio de luz clara, estas
são imagens representativas de dez campos obtidos em experimento realizado
em quadruplicata. Ao se olhar esta figura, observa-se a imagem dos cristais de
OxCa formados na presença do controle, citrato de sódio, extrato bruto e das
frações contendo PS da G. birdiae.
64
Figura 16. Influência de amostras contendo polissacarídeos sulfatados extraídos de G. birdiae sobre a formação e morfologia dos cristais de OxCa. (A-G) Microscopia de campo claro (600 X ) dos cristais formados; (A) Controle negativo; (B) Citrato de sódio (1mM); (C) Extrato bruto; (D) F-0.25; (E) F-0.5; (F) F-0.75; (G) F-1.0; A concentração utilizadas das frações foi de 0,25
mg/mL. Cristais COM; Cristais COD Cristais COT Cristais COM de bordas arredondadas.
Ao se observar o grupo controle (Figura 16-A), verifica-se que há presença
predominante de cristais COM e COD. Os cristais COM tem uma morfologia
retangular com a formação de pontas nas extremidades, os cristais COD exibem
um formato tetragonal, que se assemelha a um “cata-vento”. Já os cristais COM
formados na presença do citrato (Figura 16-B), exibem uma alteração drástica na
morfologia, pois este cristal assume um formato oblongo, sem pontas nas
extremidade, além de visualmente possuir um comprimento menor. Os COD no
tratamento com citrato não exibem significantes alterações morfológicas.
Quando os cristais são formados na presença das amostras
polissacarídicas, todas elas parecem de alguma forma alterar a morfologia dos
cristais de OxCa, com destaque para a síntese dos cristas COM, principalmente
na presença do Extrato bruto(Figura 16-C), F-0.25(Figura 16-D), F-0.5(Figura 16-
E), e F-0.75(Figura 16-F), pois, de acordo com as imagens estes cristais
65
apresentaram morfologia muito diferente (oblongo sem ponta e visualmente
menor) em relação ao grupo controle. Os cristais COD tiveram sua morfologia
mais alterada quando formados na presença do extrato bruto, F-0.5 e F-0.75, pois
são menores, e com aspecto piramidal e tetraédrico. Os cristais COT não
apresentaram regularidade na morfologia.
3.11 MEDIDA DO POTENCIAL ZETA (ζ) DOS CRISTAIS DE OxCa OBTIDOS NA PRESENÇA DE PS DA G. birdiae
Pode-se observar na figura 17 os valores do potencial ζ para os cristais de
OxCa formados na presença do controle, extrato bruto e frações. O controle
exibiu o valor médio do potencial ζ de -17,2mV, aproximadamente. Para os
cristais formados na presença do extrato bruto, o potencial zeta manteve-se em
torno de - 28mV, já as frações F-0.25, F-0.5 e F-0.75 exibiram valores crescentes
de -25,6mV, -32,5mV e -36,6mV, respectivamente.
Figura 17 – Avaliação do potencial zeta (ζ ) sobre os cristais formados na presença e ausência de PS. a,b,c indicam diferença estatísticas significativas (p <0,05).
66
3.12 MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA DE CRISTAIS DE OxCa FORMADOS NA PRESENÇA DE PS DA G. birdiae
Com intuito de confirmar se alterações do potencial zeta vistas no
experimento anterior adivinha de uma possível associação dos polissacarídeos
com os cristais, os PS foram marcados com o FITC, como descrito em métodos, e
se tornaram sondas fluorescentes. Então, ensaios de formação de cristais foram
realizados na presença dessas sondas.
Figura 18: Microscopia de fluorescência de cristais de OxCa, formados na presença de polissacarídicas sulfatados de G. birdiae. Imagens de microscopia óptica(A,C,E) e de fluorescência (60x) (B,D,F) contendo cristais de OxCa formados na presença de polissacarídeos sulfatados
conjugados com fluoresceína sobre a mesma área. (A) Cristal do tipo COD em microscopia óptica e (B) cristal do tipo COD em microscopia confocal (Extrato Bruto); (C) e (D) cristais COM formados na presença da fração F-0.25; (E) e (F) cristais COD, formados na presença da fração F-0.25.
68
Ao verificar as imagens produzidas pela microscopia de fluorescência de
forma análoga as da microscopia óptica, observa-se que os polissacarídeos
sulfatados estão distribuídos ao longo da estrutura cristalina, como pode ser visto
nas imagens 18-A, 18-B. Porém nota-se uma maior fluorescência nas bordas dos
cristais COM, representados pelas imagens 18-C e 18-D, o que pode estar
relacionado a maior presença de PS nesta superfície. Ao se visualizar as imagens
18-E e 18-F, referentes ao cristal COD, observa-se uma distribuição homogênea
sobre toda a estrutura cristalina.
3.13 ANÁLISE DOS CRISTAIS DE OxCa POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV) E ESPECTROSCOPIA DE ENERGIA DISPERSIVA (EDS)
Para se verificar com mais detalhes a morfologia dos cristais formados na
presença de PS da G. birdiae e compreender como e onde os íons estão
distribuídos na superfície do cristal (faces, cristas e extremidades), afim de entender
como esta distribuição pode interferir na forma do cristal, foram realizadas a
microscopia eletrônica de varredura e a espectroscopia de energia dispersiva.
As imagens obtidas pelo MEV, (figura 19) corroboraram com os achados
anteriores realizados através da microscopia óptica, porém foi possível identificar as
imagens com maior resolução e mais detalhes estruturais dos cristais. Os dados
obtidos através da EDS em conjunto com as imagens do MEV, identificou a
distribuição dos átomos na superfície do cristal.
Figura 19. Microscopia eletrônica de varredura, morfologia e indicação de regiões específicas dos cristas de OxCa formados na presença de PS G. birdiae, para quantificação de átomos. Esta figura mostra áreas selecionadas para se realizar a espectroscopia de energia dispersiva
69
Observa-se na tabela 09 que as frações F-0.25 e F-0.5, em relação aos
cristais COM, tiveram as grandes variações relacionadas a distribuição de átomos na
superfície do cristal, com destaque para o oxigênio e cálcio, que na fração F-0.5
exibiu uma maior diferença em relação ao controle. As quantidades de oxigênio
foram 2,7 vezes menor no ápice, 3,8 nas cristas, 2,7 na face 1 e 3,7 na face 2. Por
outro lado, o cálcio para esta mesma fração, teve um aumento de 4,4 vezes no
ápice, 3,4 nas cristas, 2,5 na face1 e 1,7 na face 2.
Para os cristais COD, verifica-se a mesma tendência, com diminuição do
oxigênio em 5,5 vezes para o ápice, 4,6 para a crista e 2,5 para a face. Já o cálcio
aumentou no ápice 2,9 vezes aproximadamente, nas cristas, 4,4 e na face 1,3 em
relação ao controle. Os valores para íon sódio, foram mais elevados para fração F-
0.5, em relação ao controle e F-0.25. Apesar de não haver um padrão homogêneo
de distribuição destes íons na superfície do cristal, o enxofre foi detectado em maior
quantidade em todos os cristais (COM e COD) formados na presenças da F-0.25.
Tabela 09: Tabela contendo as porcentagens de átomos em diferentes áreas dos cristais de OxCa formados na presença de PS da G. birdiae. Cristal COM (Ápice, crista, face 1 e face 2) e para o COD (Ápice, crista e face).
Fonte: Autoria própria.
70
Nota-se na figura 20 que o sódio (A, B e C) parece não ser um íon
estruturante do cristal, está presente em torno deste. Nas imagens (D, E e F)
observa-se a distribuição homogênea do cálcio, fazendo parte predominante da
superfície do cristal. Já as imagens (G, H e I) referem-se ao enxofre, ausente no
controle e presente nas frações F-0.25 e F-0.5, devido a presença de PS, porém em
pequena quantidade. As imagens (J, K e L) ilustram a interposição de íos e (M,N e
O), indicam as imagens originais do MEV.
71
Figura 20: Imagens obtidas através de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de energia dispersiva (EDS) dos cristais de OxCa associados a frações polissacarídicas de G. birdiae. A primeira coluna está relacionada ao controle, a segunda a F-0.25 e a terceira a F-0.5. As imagens (A, B e C), referem-se a distribuição dos íons sódio; (D, E e F), cálcio; (G, H e I) enxofre; (J, K e L), sobreposição de imagens destes íons; (M, N e O), imagens do MEV.
A B C
D E F
G H I
J K L
M N O
Controle F-0.25 F-0.5
72
3.14 AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EXTRATO BRUTO E FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE G. birdiae, SOBRE A CAPACIDADE DAS CÉLULAS RENAIS EM REDUZIR O MTT
Para verificar se a capacidade das células em reduzirem o MTT poderia ser
afetada pelas amostras, o extrato bruto e frações F-0.25, F-0.5 e F-0.75, foram
incubadas em diferentes concentrações, com as células renais HEK-293, MDCK e a
linhagem tumoral renal 786-0, por um período de 24 h. Os resultados podem ser
visualizados na Figura 21 (a,b,c).
73
Figura 21. Influência do extrato bruto e frações polissacarídicas de G. birdiae sobre a capacidade de redução do MTT para células renais HEK-293 (A), MDCK(B) e a linhagem tumoral renal 786-0(C), após 24h de incubação. O valores na figura representam a média de três determinações realizadas em triplicatas com os desvios padrões ±. As letras a,b,c distintas, referem-se a uma diferença significativa (p < 0.05) entre diferentes concentrações de uma mesma amostra, no mesmo intervalo de tempo. Os números 1,2 indicam uma diferença significativa (p < 0.05) entre as mesmas concentrações para diferentes amostras em um mesmo intervalo de tempo. O * indica amostras sem diferença significativa (p < 0.05) em relação ao controle negativo.
A
B
C
74
Com a linhagem celular HEK-293 (Figura 21-A), teve-se a menor capacidade
de redução do MTT na presença das frações F-0.5 e F-0.75 (0,1 mg/mL), algo em
torno de 35% quando comparado ao controle. As maiores capacidades de redução
do MTT ocorreram quando se usou as concentrações de 1 mg/mL, para todas as
amostras, com destaque para o extrato bruto (não apresentou diferença estatística
significativa em relação ao controle) e a fração F-0.25, cuja viabilidade das células
na presença dela foi em torno de 95% e 80%, respectivamente. Com cada amostra
observa-se uma tendência de aumento da viabilidade celular a medida que ocorre
aumento das concentrações.
Pode-se observar que para a linhagem celular MDCK (Figura 21-B) na
presença do extrato bruto, nas concentrações 0,1 mg/mL e 0,5 mg/mL, obteve-se
discreta diminuição da capacidade de redução do MTT, com valores que variam
entre 60 e 80% do controle. Com as demais frações, as células da linhagem MDCK
tiveram ótima viabilidade celular, entre 85 e 120% aproximadamente, com destaque
para a fração F-0.25, que nas concentrações 0,5 mg/mL e 1,0 mg/mL, se obteve
valores estatisticamente semelhantes ao controle.
A capacidade de redução do MTT foi avaliada utilizando-se linhagem tumoral
renal 786-0 (Figura 21-C) na presença do extrato bruto e frações contendo PS em
diferentes concentrações. O MTT foi reduzido por estas células e estatisticamente,
os valores não foram diferentes daqueles observados com controle negativo para
todas as frações, excetuando-se as frações F-0.25 (1,0 mg/mL), F-0.5 (0,1 mg/mL e
1 mg/mL).
3.15 ATIVIDADE DAS AMOSTRAS POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE G. birdiae SOBRE A VIABILIDADE CELULAR DE MDCK, AVALIADA PREVIAMENTE E SIMULTANEAMENTE AO DANO CAUSADO POR H2O2 E OxCa.
A partir das observações anteriores sobre a capacidade dos PS de G. birdiae
interferirem na formação e morfologia dos cristais de OxCa e levando-se em
consideração que a capacidade das células renais em reduzir MTT na presença
destes PS não foi muito afetada, amostras contendo PS foram avaliadas quanto a
possibilidade de proteger células renais contra danos provocados por peróxido de
hidrogênio e OxCa. Para tal foram utilizadas a linhagem de células renais MDCK e a
viabilidade foi avaliada através da redução do MTT a cristal de formazan (Figura 22).
Ao se observar a figura 22-A (pré-dano), verifica-se que as células quando
75
expostas ao peroxido e ao oxalato perdem sua capacidade de reduzir o MTT, já que
nota-se que esta capacidade das células cai em torno de 40% (controle positivo) em
relação ao controle negativo. Ainda nesta figura, nota-se que a viabilidade celular
(aproximadamente 80%) foi alta quando da presença do extrato bruto, em todas as
concentrações avaliadas, com destaque para a concentração 0,1 mg/mL, que,
estatisticamente, impediu a ação danosa das agentes agressores. Ou seja, quando
amostras, contendo extrato bruto são aplicadas previamente (24 h) às células e
depois estas células são expostas ao H2O2 e OxCa, nota-se que as amostras
parecem auxiliar na proteção desta linhagem celular testada.
Ao se observar os valores referentes à redução do MTT na presença de
diferentes concentrações de F-0.25, F-0.5 e F-0.75, verifica-se um efeito dose-
dependente, pois a medida em que a concentração aumentou, a capacidade da
célula em reduzir o MTT diminuiu, isto sugere um efeito sinérgico com peroxido e
oxalato. Contudo, vale salientar que quando as células foram testadas com
concentrações baixas (0,1 mg/mL) de PS, a sua capacidade de reduzir o MTT foi até
superior ao controle negativo, o que mostrou que em baixas concentrações esses
PS protegem, em certa extensão, as células dos danos causados pelos agentes
agressores.
Já na figura 22-B (simultânea ao dano), as células renais foram expostas ao
peróxido de hidrogênio e OxCa e posteriormente foram tratadas com as amostras
PS em diferentes concentrações. Em seguida, foi avaliada a capacidade destas
células em reduzir o MTT.
Ao se observar o controle positivo, percebe-se que capacidade das células
em reduzir o MTT do grupo controle positivo foi cerca de 50% em relação ao controle
negativo. As MDCK na presença do extrato bruto em todas as concentrações,
durante os danos, exibiram elevada capacidade de redução do MTT, com destaque
para a concentração 0,5 mg/mL, já que as células expostas a essa concentração
tiveram sua capacidade de reduzir o MTT semelhante a das células do grupo
controle.
Seguindo esta mesma perspectiva, o uso das frações F-0.25, F-0.5 também
favoreceu a redução do MTT pelas células, já que estas quando expostas a
diferentes concentrações dessas frações foram capazes de reduzir o MTT a valores
significativamente superiores a aqueles observados com o grupo controle positivo.
Com F-0.75 este efeito foi observado com maior intensidade com a menor
76
concentração testada (0,1 mg/mL), já com as demais o efeito não foi tão
pronunciado, apesar da capacidade de redução do MTT das células tratadas com
essas concentrações ainda foi significativamente (p<0,05) maior do que aquelas do
que das células do grupo controle.
Figura 22. Avaliação do efeito pré-dano (A) simultânea ao dano (B) das frações polissacarídicas de G. birdiae sobre a viabilidade de células da linhagem MDCK, submetidas a danos oxidativos pela exposição a 0,5 mM de H2O2 por 3 horas (ic=50) com posterior exposição a 3 mM de OxCa por 24 horas. Os valores na figura representam a média de três determinações realizadas em triplicatas com os desvios padrões ±. As letras a,b,c distintas, referem-se a uma diferença significativa (p < 0.05) entre diferentes concentrações de uma mesma amostra, no mesmo intervalo de tempo. Os números 1,2,3.4 indicam uma diferença significativa (p < 0.05) entre as
mesmas concentrações para diferentes amostras em um mesmo intervalo de tempo. O # indica
amostras sem diferença significativa (p < 0.05) em relação ao controle negativo.
A
B
77
3.16 DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA ANTIOXIDANTE DE SUPERÓXIDO DISMUTASE-SOD (EC 1.15.1.1) E CATALASE-CAT (EC 1.11.1.6) SOBRE CÉLULAS MDCK INCUBADAS COM FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS.
No intuito de verificar se existe relação entre as atividades de enzimas
antioxidantes e efeito observado com a presença dos polissacarídeos sobre
linhagens de células MDCK, foi realizada a determinação da atividade de duas
enzimas antioxidantes, SOD e CAT (Figura 23). Para tal, foram selecionadas as
frações polissacarídicas F-0.25 e F-0.5 na concentração 0,1 mg/mL, devido aos bons
resultados obtidos com essa linhagem nos experimentos.
As células MDCK foram submetidas a dois tipos de tratamentos, no primeiro
tratamento as células foram tratadas durante 24 h com as frações PS, o meio foi
lavado e foi adicionado o H2O2 e o OxCa. Após um período foi realizada a dosagem
das atividades de SOD e CAT, já no segundo tratamento às células foram
adicionados o H2O2 e o OxCa e após 24 h os PS, em seguida foi verificada a
atividade das enzimas SOD e CAT (para mais detalhes ver métodos).
Na figura 23 quando se compara os grupos controles positivos com os
negativos, verifica-se que há um aumento significativo tanto da atividade de SOD
(Fig 23 A), como de CAT (Fig 23-B).
Na figura 23-A, observa-se que a atividade de SOD das células que foram
submetidas ao tratamento “pós dano” e menor do que aquela observada com as
células do controle positivo. Contudo, o efeito mais significativo é observado quando
se olha a atividade da SOD do grupo proveniente do tratamento “pre-dano”. Após o
tratamento com as amostras a atividade da SOD não aumentou, inclusive, no caso
das células tratadas com F-0,25 (“pre dano”) ficou significativamente menor (20 %
menor) do que aquela observada com o grupo controle negativo.
Ao observar a figura 23-B nota-se que a atividade da CAT foi afetada pela
presenca dos polissacarídeos. Nos dois tratamentos (“pre e pós dano”), com as duas
amostras, a atividade da CAT foi significativamente menor do que aquela observada
com o grupo controle positivo. No caso do tratamento pré-dano com F-0,25 a
atividade da CAT foi até menor que a aquela observada com a CAT do controle
negativo. No caso dos tratamento pós-dano a atividade da CAT ficou semelhante
com aquela observada com o controle negativo.
78
Figura 23: Efeitos de frações polissacarídicas sobre as atividades de SOD (A) e CAT (B) em U/mg/Proteína. A figura representam a média de três determinações realizadas em triplicatas com os desvios padrões ±. O * indica uma diferença significativa (p < 0.05) entre amostras e o controle negativo.
A
B
79
4 DISCUSSÃO
Vários trabalhos nas duas últimas décadas vem relatando os benefícios de
compostos marinhos bioativos, sua importância biotecnológica e a necessidade de
bioprospecção destes (HOFFMAN; BOUSSIBA, 2002; CAMPO et al., 2009; NGO,
2013). Dentre os vários organismos marinhos, as macroalgas se destacam pela
capacidade de ser cultivada e apresentar compostos com potencial biotecnológico
(KIM; WIJESEKARA, 2010) com destaque para os seus polissacarídeos sulfatados
que se inserem neste contexto por apresentar importantes atividades biológicas e
farmacológicas, (HAYAKAWA et al., 2000; ZHANG et al., 2003), além de ampla
aplicação nas áreas industriais e de alimentos no mundo (STEPHEN, 1995;
STANLEY; GOFF; SMITH, 1996; PRESA, 2013). O grupo no qual esta tese faz
parte, há mais de uma década, tem se focado na bioprospecção, caracterização e
busca por atividades biológicas e farmacológicas de polissacarídeos sulfatados,
(ROCHA et al., 2001; ROCHA et al., 2005; ROCHA et al., 2005a; BARROSO et al.,
2008; ALMEIDA-LIMA et al., 2010; CAMARA et al., 2011; COSTA et al., 2012; MELO
et al., 2013; FIDELIS et al., 2014.). No entanto, apesar de existir muitos trabalhos
que mostram a bioprospecção de polissacarídeos bioativos, ainda existe uma grande
diversidade de algas marinhas que não tiveram seus PS investigados, em especial
na costa do Nordeste do Brasil, no qual se insere o estado do Rio Grande do Norte
(RN), com o seu vasto litoral.
Diante do exposto, a escolha pela utilização da alga vermelha Gracilaria
birdiae, a qual contém polissacarídeos sulfatados se deu por alguns fatores, como:
vasta disponibilidade desta alga na costa do RN; O elevado valor nutritivo destas,
pois são ricas em carotenóides, proteínas, fibras, ácidos graxos, vitaminas e
minerais, o que as tornam promissores compostos a serem explorados. Contém
compostos de grande interesse econômico, como ágar e carragenana; São algas
comestíveis e utilizadas na elaboração de pratos da culinária japonesa e brasileira;
Em trabalhos anteriores realizados por este grupo, foram evidenciadas importantes
atividades farmacológicas para o extrato bruto rico em polissacarídeos sulfatados da
G. birdiae; A necessidade de descobrir atividades farmacológicas diferentes para
polissacarídeos sulfatados purificados dessa alga, assim como, aumentar o valor
agregado a este organismo e dar continuidade a esta linha de pesquisa
desenvolvida pelo grupo no qual esta tese se insere.
80
A partir deste contexto, foram coletados espécimes da macroalga marinha da
G. birdiae no município de Rio do Fogo (Figura 12), localizado no litoral do Rio
Grande do Norte. O local de escolha foi definido devido a abundância desta alga
para coleta e facilidade de obtenção. Em seguida, os extratos ricos em
polissacarídeos sulfatados foram obtidos. Após esta etapa, as amostras foram
submetidas a espectroscopia de infravermelho e verificou-se que o extrato bruto aqui
obtido era semelhante a aquele obtido anteriormente pelo grupo (FIDELIS et al.,
2014) o que confirma a reprodutibilidade e confiança do método de extração
utilizado.
Após a cromatografia de troca iônica obteve-se oitos frações e quatro delas
contiveram polissacarídeos sulfatados. A soma da massa do material obtido nessas
frações corresponde a aproximadamente 35% da massa de extrato bruto aplicada a
coluna. Estes resultados foram melhores que os de extrações realizadas para outras
algas vermelhas como a G. cervicornis, por Marinho-Soriano (2001), que obtiveram
valores entre 11 e 20% de rendimento, assim como G. cornea, por Melo e col.
(MELO et al., 2002), com 11 e 21,4%, e G. gracilis, por Mollet e col. (1998), entre
11,1 e18,7% e foi melhor do que os dados obtidos para G. birdiae, por Maciel et al.
(2008), cujo rendimento de extração foi de 6,5%. Os maiores rendimentos obtidos,
foram para as frações F-0.25 (13,49%), F-0.5(15,2%) e F-0.75%(7,85%). O
rendimento obtido nesta tese pode ser considerado bom e foi semelhante ao de
outras algas vermelhas do gênero Gracilaria.
Através da técnica de eletroforese verificou-se que os polissacarídeos
presentes nas frações exibem apenas uma banda eletroforética, indicando que cada
fração tem a mesma população de polissacarídeo sulfatado. Observou-se também
que os polissacarídeos de cada fração têm mobilidades semelhante entre si. Vale
salientar que no sistema de eletroforese utilizado (tampão PDA, pH 9,0) a mobilidade
dos polissacarídeos sulfatados não é meramente um efeito da carga do
polissacarídeo, é um efeito das cargas do polissacarídeo que não foram
neutralizadas pelas aminas do tampão. Como esta neutralização depende da
conformação do polissacarídeo, que expõem ou esconde as cargas das aminas, os
autores que propuseram está técnica dizem que aqueles polissacarídeos, mesmo
que possuam diferenças entre as suas cargas totais, mas apresentam conformações
espaciais semelhantes, terão mobilidades semelhantes (Dietrich; Dietrich, 1976).
Portanto, propõem-se que os polissacarídeos sulfatados de cada fração, apesar de
81
terem cargas diferentes, já que foram eluídos com molaridades de sal distintas e
apresentam mobilidade semelhantes, sejam o mesma população de polissacarídeo.
Estes dados indicam que a alga em estudo sintetiza apenas uma população de
polissacarídeo, e que esse pode ser obtido com diferente grau de sulfatação. No
entanto é comum encontrar uma diversidade de PS em algas vermelhas como
Aghardhiella tenera (WITVROUW et al., 1994), Nothogenia fastigiata (DAMONTE et
al., 1994; KOLENDER et al., 1997), Gigartina skottsbergii (MANDAL et al., 2008),
Corallina officinalis (CASES; STORTZ; CEREZ, 1994), assim como para algas
marinhas verdes, como Enteromorpha intestinallis (WANG et al., 2014), Ulva fasciata
(SHAO; CHEN; SUN, 2013), e nas marrons como Canistrocarpus cervicornis
(CAMARA et al., 2011), Sargassum filipendula (COSTA et al., 2012).
A Tabela 5 exibiu o teor de açúcares totais para o extrato bruto (76,01%), F-
0.25 (73,88%), F-0.5 (80,45%), F-0.75 (71,42%) este resultado foi maior do que o
encontrado por Vanderlei et al. (2011) com 68,2% para a G. birdiae e os de Coura et
al. (2012), para a alga marinha vermelha Gracilaria cornea, com 68,8 %. Na literatura
não foi encontrado nenhum estudo desta natureza, cujo este método de
fracionamento empregado para obtenção de PS, tenha sido verificado quanto ao
rendimento. O teor de açúcar para as outras frações eluídas em molaridades mais
elevadas foi baixo ou não detectado e por este fato não foram utilizadas para
análises posteriores. A porcentagem de sulfato foi semelhante para estas três
frações, em torno de 3,4%, este baixo teor de sulfato, corrobora com os achados de
TISCHER, 2006, este afirma que os polissacarídeos sulfatados do gênero Gracilaria
presentes, principalmente nas estruturas das algas G. birdiae e G. cornea são
galactanas do tipo agarana, que conforme descrita na literatura, são consideradas
menos sulfatadas que outros PS, provavelmente este fato explica a baixa
capacidade de interação com o azul de toluidina na lâmina de agarose (Figura 14).
Chama-se atenção para a baixa contaminação proteica, semelhante para as
frações F-0.25, F-0.5 e F-1.0, com aproximadamente 0,3%. Já a presença de
compostos fenólicos, quando detectados, variou de 1,3 a 1,8%. Estes dados foram
baixos quando comparados aos dados de Melo e colaboradores (Melo et al., 2013),
que obteve 1,6% de proteínas e até 5,0% de compostos fenólicos, assim como, com
os de Silva e colaboradores (SILVA et al., 2005) que encontrou a porcentagem de
proteínas variando entre 0,6 e 5,8% e corrobora com os dados de Fidelis e
colaboradores (FIDELIS et al., 2014) com contaminação proteica de 0,4%. Estes
82
dados quando comparados, sugerem que a metodologia utilizada neste trabalho foi
importante para a obtenção de amostras contendo menos contaminantes.
Ao se observar a tabela 6, acerca da composição monossacarídica das fração
de G. birdiae, verifica-se a presença predominante de homopolissacarídeos de
galactose, incluindo a forma de anidro galactose. A presença desses
homopolissacarídeos é comum para algas vermelhas deste gênero Gracilaria, cujo
seus PS são compostos principalmente por unidades alternadas de β-D-
galactopiranose, ligada através do carbono 3 e 3,6-anhydro-α-L-galactopyranose,
ligada apelo carbono 4, como mostrada na literatura por Andriamanantoanina;
Chambat; Reinaldo (2007); Freile-Pelegrın; Murano (2005); Lahaye; Yaphe (1988);
Melo et al. (2002); Mazumder et al. (2002); Valiente et al.(1992). É importante
destacar que apesar da aparente homogeneidade de carboidratos encontradas na
amostra, estes podem apresentar conformação espacial e padrões de sulfatação
diferentes, e por isto, atuar em distintos alvos bioquímicos, além da possibilidade de
exibir atividades diversificadas e aumentar o valor biotecnológico agregado a esses
biopolímeros naturais.
Os sinais mais relevantes encontrados no espectro de infravermelho (IV),
corroboram com a idéia de que este PS investigados são formados por galactanas
sulfatadas constituídas de monossacarídeos de galactose e anidrogalactose e pelo
grupo sulfato. Na tabela 7 identifica-se a presença de sinais de IV, tanto para o
extrato bruto como para frações polissacarídicas. Estes sinais já foram observados
em outros polissacarídeos, inclusive de algas vermelhas, e a sua presença indica a
existência de grupos específicos nas amostras como mostrados para os sinais entre
3437 e 3407,1 e entre 2960,8 e 2927 que estão relacionados a vibração do H-O
existente na ligação do hidrogênio e a vibração do – CH, respectivamente (SUN et
al., 2009). Os sinais compreendidos entre 1663 e 1639 refere-se a presença de água
associada ao composto (KIM et al., 2006), já as absorbâncias captadas entre 1562,3
e 1412,2 estão relacionadas a vibração simétrica devido a grupos carboxila (VAN
HOOGMOED; BUSSCHER; DE VOS, 2003). Os valores expressos compreendidos
entre 1400 e 700 são característicos de galactanas do tipo agarana. Os valores sinal
1368,7 e1365,4 refere-se a vibrações C-O do anel piranose, comum aos
polissacarídeos (GOMES-ORDÓÑEZ; RUPÉREZ, 2011) e a presença de éster
sulfato (MELO et al., 2002; VANDERLEI, 2011). Já os sinais 1073,6, 1071,7, 1071,5,
1071,3, foram atribuídos a formação do esqueleto da galactana (MELO et al., 2002)
83
e 931,2, 929,2, 927,3 indicam a presença da ligação C-O da 3,6-anidro-α-L-
galactopiranose (PEREIRA et al., 2009). A faixa de absorbância entre 889,4 e 887,5
refere-se a ligação C-O-SO4 no C4 da galactose (PEREIRA et al., 2009; MELO et
al., 2002). O sinal do esqueleto de flexão da piranose pode ser associado aos
valores entre 768,6 e 738,3 (MATSUSHIRO, 1996). Os resultados apresentados,
indicam que as amostras possuem polissacarídeos sulfatados, com diferenças sutis
em relação a posição do sulfato nas amostras, no extrato bruto, a banda 853, é
associada a presença da galactose 4-sulfato, valor este, detectado nas demais
frações, porém a banda de 799,5 presente nas frações é atribuída a presença de
sulfato no carbono 2 da 3,6 anidro-L-galactose. Estas modificações podem ter
ocorrido devido ao processo de fracionamento na cromatografia de troca iônica.
Esses dados levam a proposição que a condição de extração e fracionamento levou
a obtenção da mesma população de polissacarídeos sulfatados.
Parâmetros como a inibição de nucleação e agregação podem auxiliar na
compreensão de como as amostras contendo polissacarídeos podem influenciar na
quantidade e no tamanho dos cristais de OxCa, para tal, tanto a nucleação como
agregação foram avaliadas. Estes valores podem ser visualizados na tabela 8. Os
maiores valores de inibição de nucleação e agregação foram 76,92% e 68,57%,
respectivamente, atribuídos a F-0.25, notou-se também o maior aumento no
tamanho dos cristais em relação as demais frações. Estes valores foram
semelhantes aos encontrados por ZHANG e colaboradores (ZHANG et al., 2012),
durante um estudo realizado com extrato bruto da alga marrom Sargassum
graminifolium, que exibiu valores de inibição de nucleação e agregação de 69,2% e
76,8%, respectivamente, além de ser observada uma diminuição no número de
cristais formados e aumento do comprimento destes (ZHANG et al., 2012). A
comparação a outras algas se deve ao fato de escassez de dados na literatura
envolvendo algas vermelhas para este item. Melo e colaboradores obtiveram
resultados semelhantes para polissacarídeos sulfatados da alga marrom Dictyopteris
justii com inibição da nucleação em até 84,1% e agregação em até 86%. Além
desses elevados valores, as amostras desta alga, denominadas DJ-0.5 e DJ-1.2
estabilizaram os cristais diidratados, já as frações DJ-0.3 e DJ-0.4 modificaram a
morfologia dos cristais monoidratados, pois produziu cristais com facetas mais
arredondas, muito semelhantes aos cristais formados na presença da frações F-0.25
e F-0.5 deste trabalho, que são menores e mais fáceis de serem excretados, assim
84
como MELO et al. (2013) demonstrou.
Para se entender melhor como as amostras contendo PS podem interferir na
formação, morfologia e proporção de diferentes formas de cristais, ao se analisar a
figura 16, percebe-se que todas as frações polissacarídicas de G. birdiae alteraram a
formação dos cristais de OxCa, tanto na morfologia, como no tipo de cristal (COM,
COD ou COT), também no tamanho e ainda na quantidade destes. Na maioria dos
campos ocorre a presença dos três tipos distintos de cristais, com predomínio para
os do tipo COM e COD (figura 15-A, 15-B). Os cristais formados na presença do
extrato bruto se encontram em maior número, porém possuem menor comprimento
para os monohidratados e dihidratados em relação ao controle. Estes resultados, se
assemelham aos de Escobar et al. (2008), que ao testar compostos sulfatados como
dermatan sulfato, heparina hipersulfatada, queratan sulfato e quitosana fosforilada,
perceberam uma maior inibição da cristalização do OxCa e ao mesmo tempo
mostraram um efeito protetor contra a formação de cálculos renais, provavelmente,
devido a estabilização dos cristais COD, e por conseguinte menor formação dos
cristais COM, mais danosos ao néfron.
Contudo, é importante destacar que as frações F-0.25 e F-0.5 foram capazes
de diminuir a quantidade de cristais COM em 6 vezes(82,4%) e 7 vezes(85,5%)
respectivamente, se comparadas ao controle negativo(Figura 15-A). Este resultado é
surpreendente, pois demonstra o elevado potencial destas amostras fracionadas em
diminuir a quantidade do cristal mais danoso ao sistema renal. Já as frações F-0.75
e F-1.0, apesar de apresentarem valores menores que as frações F-0.25 e F-0.5,
ainda sim, diminuíram a quantidade de cristais COM em 1,5 vezes(31,37%) e 1,6
vezes (37,75%) em relação ao controle, respectivamente. Os dados obtidos a partir
do extrato bruto da Gracilaria birdiae e principalmente pelas frações F-0.25 e F-0.5,
levaram a observação de que alguns PS desta alga possuem capacidade de inibição
de formação dos cristais de OxCa maior que a do citrato de sódio. Estes valores são
semelhantes aos apresentados por Zhang et al. (2012), com 70% e 77% e aos de
Melo et al. (2013) com 73,33% e 84,07%. Já os comprimentos dos cristais exibidos,
não diferiram drasticamente em diferentes amostras. A partir dos resultados
apresentados, fortalece a ideia de que o processo de cristalização parece ser
multifatorial, e não unicamente pelo efeito de cargas, mas também de acordo com a
distribuição destas cargas na molécula, além da topografia do cristal, devido,
principalmente a variações de distribuição de Ca2+ ou oxalato, e substâncias como a
85
Osteopontina e o Citrato (QIU et al., 2004; GROHE et al., 2007; GROHE et al., 2011;
MELO et al., 2013).
Com o intuito de se compreender melhor acerca da distribuição da carga
superficial do cristal na presença de PS da G. birdiae, e dessa forma entender como
estes PS podem influenciar na modificação da morfologia dos cristais de OxCa
realizou-se a análise do potencial zeta (ζ) dos cristais formados e análise por
microscópia. O potencial ζ refere-se a medida da carga total da superfície de
partículas (inclusive moléculas), esta medida reflete a estabilidade eletrostática da
superfície da partícula (Cristal) em uma solução. Segundo Andrade (2008) e Calvo;
Vila-jato; Alonso (1997), os valores superiores a +/- 30 mV demonstram uma boa
estabilidade das partículas em suspensão, prevenindo a agregação a esta partícula
devido ao aumento da estabilidade eletrostática entre a solução e a superfície da
partícula.
A figura 17 contem valores referentes a medida do potencial ζ dos cristais,
incluindo o controle e tratados com o extrato bruto e com o as frações contendo PS.
O valor médio obtido para as cargas superficiais do controle foi em torno de – 17
mV, já os cristais tratados com extrato bruto e demais frações exibiram valores para
o potencial ζ mais negativos, este fato pode ser explicado pela interacao dos
polissacarídeos sulfatados com os íons Ca2+ presentes na superfície dos cristais,
deixando-a mais negativa. Para os cristais formados na presença do extrato bruto, o
potencial zeta manteve-se em torno de - 27mV, já os cristais formados na presença
das frações F-0.25, F-0.5 e F-0.75 exibiram valores crescentes (mais negativos) de -
25 mV, -32 mV e -36 mV, respectivamente. Os valores acima de -30 mV obtidos,
revelam uma estabilidade de cargas na superfície dos cristais. Ao se comparar estes
achados com as imagens representadas na figura 16, observa-se que os cristas
COM (mais estáveis) foram formados em maior quantidade na presença de
amostras, cujos potenciais ζ foram menores, o que sugere um aumento da repulsão
eletrostática e, por conseguinte, inibição/diminuição da agregação dos cristais. No
entanto, o teor de sulfato das frações F-0.25, F-0.5 e F-0.75 foram semelhantes,
porem os cristais formados na presença destas, exibiram diferentes potenciais ζ, isto
pode estar relacionado a outros fatores que vão além da distribuição de cargas,
como características topográficas dos cristais e capacidade de interação própria de
cada PS com o Ca2+ e oxalato da superfície do cristal e isto pode ter afetado a
distribuição da carga liquida dos PS em contato com a superfície do cristal de OxCa.
86
Conforme Melo et al. (2013), este comportamento também ocorreu com
polissacarídeos sulfatados da alga Dictyopteris justii, nesse caso glucanas e fucanas
sulfatadas. Estes autores verificaram que cristais formados com um dos
polissacarídeos menos sulfatados apresentavam potencial ζ maior do que aqueles
formados na presença de polissacarídeos mais sulfatados. Estes resultados
demonstram que as frações da G. birdiae contendo PS tem capacidade de alterar a
carga superficial do cristal de OxCa e modificar a dinâmica da cristalização,
provavelmente devido a interação das cargas do PS com a superfície do cristal
durante a síntese destes.
Para tentar compreender como ocorre a distribuição de PS ao longo dos
cristais as frações polissacarídicas foram associadas ao FITC. Ao se verificar a
formação dos cristais utilizando o extrato bruto e as frações de G. birdiae associadas
ao FITC (Figura 18), identifica-se as presença de polissacarídeos na superfície dos
cristais. Ao se verificar as imagens produzidas pela microscopia de fluorescência de
forma mais detalhada, observa-se que os polissacarídeos estão distribuídos ao
longo de toda a estrutura cristalina (18-A, 18-B), com ênfase para a fluorescência
nas bordas dos cristas COM (18-C, 18-D), o que pode estar relacionado a morfologia
das facetas com aspecto mais arredondado. Já a distribuição de PS no cristal COD
apresentou-se mais homogênea (18-E, 18-F). Em um estudo realizado por QIU e
colaboradores, 2004, demonstrou-se que ocorre uma deposição gradual de íons
formando, assim, camadas durante o crescimento dos cristais (QIU et al., 2004).
Este comportamento parece ser semelhante ao obtido nesta tese, pois ao observar
as imagens de microscopia de fluorescência, parece que os polissacarídeos
sulfatados se depositam de forma intercalada com as camadas de cristais alterando
a morfologia destes. Para os cristais COD supõe-se que a interação com os
polissacarídeos pode ter ocorrido de forma mais homogênea, porém para os COM,
claramente nota-se uma maior fluorescência nas bordas, atribuída ao presença de
PS e talvez por este motivo apresentem aspecto morfológico mais arredondado.
Os cristais formados na presença de PS da G. birdiae foram visualizados e
analisados através das técnicas de microscopia eletrônica de varredura e de
espectroscopia de energia dispersiva para se verificar com mais detalhes a sua
morfologia e tentar compreender como e onde os íons estão distribuídos na
superfície do cristal (faces, cristas e extremidades), conforme figuras 19 e 20. Para
tal, foram utilizadas além do controle, as frações F-0.25 e F-0.5, pois tiveram maior
87
rendimento e, em seu conjunto, provocaram maiores alterações em relação aos
cristais de OxCa, conforme os resultados dos experimentos anteriores.
Ao se observar a tabela 09, nota-se que a distribuição de alguns átomos: o
oxigênio, cálcio e enxofre variam de acordo com a fração utilizada e a localização
em cada tipo de cristal. Uma das razões pelas quais estas variações podem ocorrer,
é pelo fato destes cristais serem sintetizados através da formação de camadas
intercaladas com os PS, como proposto por QIU et al. (2004), isto poderia de
alguma forma “expor” regioes distintas com O, Ca ou S, dependendo de como
ocorresse a interação como o PS.
Para o cristal COM, observou-se que a sua formação na presença das
frações F-0.25 e F-0.5, (aparentemente da mesma população de polissacarídeos),
teve grande diferença relacionada a distribuição de átomos na superfície do cristal.
Estes dados reforçam ainda mais o que foi apresentado por Qiu et al. (2004); Grohe
et al.(2007); Grohe et al. (2011) e Melo et al. (2013) sobre a distribuição de cargas
na molécula, a topografia do cristal, assim como, variações de distribuição de Ca2+ e
oxalato, como fatores que podem alterar a morfologia do cristal. Para o cristal do tipo
COD, a fração F-0.5 se destacou em relação a diferenças de distribuição dos átomos
de O, Ca e S ao longo de diferentes partes do cristal (ápice, crista e face). Apesar de
não haver um padrão homogêneo de distribuição destes íons na superfície do cristal,
o sulfato foi detectado em maior quantidade em todos os cristais (COM e COD)
formados na presença da F-0.25. Isto evidencia, que estes polissacarídeos devem
apresentar diferenças conformacionais ou de distribuição de cargas importantes,
responsáveis por promover estas alterações nos cristais.
De acordo com WIERZBICKI e colaboradores (1995), durante o estudo do
crescimento de cristais COM na presença de inibidores como o citrato ou
fosfocitrato, estes podem além de interagir com a face -101, substituir os grupos
oxalato da rede cristalina. Neste mesmo estudo afirma-se que a forma e a
distribuição das cargas do inibidor produz uma maior interferência na síntese do
cristal, do que a própria capacidade remoção de íons do oxalato e consequente
rearranjo dos íos de cálcio circunvizinhos (WIERZBICKI et al., 1995). As frações F-
0.25 e F-0.5, seguindo esta lógica, parecem realizar tanto interações de cargas
específicas como não específicas nos planos -101, estabilizando o crescimento
desta face e promovendo uma morfologia ligeiramente curvada no cristal.
Através da figura 20, nota-se a distribuição de alguns átomos como sódio,
88
cálcio, e enxofre, individualmente e sobrepostos em imagens obtida por microscopia
eletrônica de varredura. O sódio (A, B e C) parece não ser um íon estruturante do
cristal, mas está presente em torno deste, já o cálcio (D, E F) é encontrado
distribuído de forma mais homogênea em todas as amostras, o enxofre (G, H e I)
aparece em alguns pontos do cristais formados na presença da frações F-0.25 e F-
0.5, devido a sulfato, porém em pequena quantidade, como já era esperado. As
imagens J, K e L, referem-se a sobreposição do sódio, cálcio e enxofre e mostra o
forma polidispersa destes íons na superfície do cristal.
A partir da análise das figuras 19 e 20, observa-se que há uma
complementariedade dos resultados obtidos para os potenciais zeta e os de
microscopia de luz clara e de fluorescência. Isto, fortalece a ideia de que o processo
de cristalização na presença destes PS parece ser multifatorial, e não unicamente
pelo efeito de cargas, mas também de acordo com a distribuição destas cargas na
molécula, além da topografia do cristal, devido, principalmente a variações de
distribuição de Ca2+, oxalato, outras substâncias e interações específicas e não
específicas de cargas.
Devido a ação de F-0.25 e F-0.5 na formação dos cristais surgiram perguntas
sobre como seria ação dos polissacarídeos dessas frações sobre células renais, pois
afinal este é o órgão alvo que se pretende alcançar caso os polissacarídeos venham
a ser utilizados no tratamento da urolitíase. Assim, escolheu-se três linhagens
derivadas originárias do tecido renal (HEK-293, MDCK e tumoral renal 786-0).
Verificou-se que apenas com a linhagem HEK-293, que é de tecido embrionário,
portanto mais sensível, foi que se observou sinais de citoxidade com algumas
frações.
Apesar de algumas atividades biológicas já terem sido atribuídas a
polissacarídeos sulfatados de G. birdiae, como por exemplo, o efeito protetor de
dano intestinal (BRITO et al., 2014), atividade anti-inflamatória, (VANDERLEI et al.,
2011; BRITO et al., 2014), antioxidante (SOUZA et al., 2012; COSTA et al., 2014),
não há relato na literatura que relacione os PS da G. birdiae à alteração na
viabilidade celular para estas linhagens citadas acima. Portanto, os dados aqui
fortalecem a proposição de que os PS de G. birdiae podem ser utilizados no
tratamento da urolitíase.
A partir das observações anteriores, que evidenciaram mudanças na
formação e morfologia dos cristais de OxCa na presença de diferentes frações
89
polissacarídicas, assim como a partir dos testes de viabilidade celular para as
linhagens celulares HEK-293, MDCK e 786-0 (Figura 21). A linhagem MDCK foi
escolhida para realização dos próximos experimentos, esta escolha se deu pelo fato
dessas células apresentarem um ótima viabilidade celular em experimentos
anteriores e possuir um sistema enzimático de resposta ao estresse oxidativo
“maduro”, o que nao ocorre para as HEK-293 que são células renais embrionárias.
Portanto, avaliou-se a capacidade das amostras em proteger células MDCK
de danos oxidativos provocados por peróxido de hidrogênio e OxCa, dois dos
principais agentes apontados em diversas teorias como formadores de cálculos
renais (BYER; KHAN, 2005; KHAN, 2013; KHAN; CANALES, 2015).
Os experimentos foram feitos em dois momentos: o tratamento pré-dano,
quando objetivou-se criar uma situação em se simulasse ação do polissacarídeo
impedindo o efeito danoso do H2O2 e OxCa; e simultâneo ao dano, quando se
observaria o efeito dos polissacarídeos durante a ocorrência de danos celulares.
Como observado na figura 22, o uso de H2O2 e OxCa levam a uma
diminuição da capacidade das células em reduzir MTT, o que é tido como um sinal
de citotoxidade. Em dados não publicados pelo grupo de pesquisa em que está
inserido esta tese, verifica-se que esses dois agentes em conjunto, nas condições
aqui usadas, levam as células morrerem por necrose.
No tratamento pré-dano, verificou-se que a presença das amostras na
concentração mais baixa, bem como no extrato bruto em todas as concentrações
avaliadas, fizeram com que as células ficassem mais resistentes a ação danosa do
peróxido de hidrogênio e OxCa. Devido ao tempo de exposição das células por 24 h,
em contato com os PS, acredita-se que estes influenciaram o metabolismo celular
deixando-as mais resistentes. Há vários exemplos na literatura que mostram
polissacarídeos sulfatados de algas interferindo no metabolismo celular levando ao
aumento ou diminuição da expressão/atividade de várias moléculas como
carboidratos (Rocha et al., 2005), óxido nítrico e citocinas (LI, 2015), dentre outras.
Portanto, avaliou-se a atividade de duas enzimas importantes no metabolismo de
espécies reativas, a catalase e a superóxido dismutase.
Constatou-se que nas células tratadas com o H2O2 e OxCa a atividade
dessas enzimas está aumentada em cerca de 2 vezes em comparação com as
enzimas do grupo controle negativo (não tratado). Esse aumento provavelmente é
uma resposta das células a presença dos agentes agressores que tem como
90
mecanismo aumentar o estresse oxidativo. Por outro lado, o que se viu foi que as
atividades dessas enzimas, nas células tratadas (pré-dano) como os polissacarídeos
por 24 horas, estavam próximas daquelas observadas nas células não tratadas
(controle negativo).
A diminuição exacerbada da atividade de SOD (pré dano), pode sugerir que a
presença de PS podem inibir a atividade de SOD ou talvez proteger a célula por
outro mecanismo sinérgico a SOD, uma vez que atividade desta enzima foi bastante
reduzida. Estes resultados sugerem que as frações utilizadas no tratamento prévio
das MDCK protegeram as células da ação do peroxido de OxCa.
Não se identificou estudos semelhantes aos aqui apresentados realizados
com polissacarídeos sulfatados de algas vermelhas, mas foi demonstrado que ratos
que foram suplementados com polissacarídeos sulfatados de algas marrons
apresentaram aumento de atividade de CAT e SOD, com diminuição do estresse
oxidativo (HASSAN et al., 2011; MOHAN KUMAR et al., 2012). Além disso,
fucoidans (polissacarídeos sulfatados de algas marrons) quando administrados em
peixe gato (Pelteobagrus fulvidraco) podem aumentar ou diminuir a atividade dessas
duas enzimas, e que isso estava relacionado ao tipo de fucoidan administrado ao
animal (YANG et al., 2014). O que mostra que assim, como ocorreu na inibição da
formação dos cristais, o efeito dos PS de G. birdiae não é dependente meramente
de suas cargas, e fortalece a proposta de que esses polissacarídeos tem potencial
para serem utilizados no tratamento da urolitíase.
Os dados parecem indicar que a ação dos PS de G. birdiae não está
diretamente relacionada com a CAT e a SOD (Figura 23). Em estudos futuros
pretende-se expor as células aos PS de G. birdiae e fazer um análise proteômica
com intuito de se identificar quais proteínas estariam sendo afetadas pela presença
dos PS e quais estariam envolvidas no mecanismo protetor dos PS contra o oxalato
e o peroxido.
Com o tratamento pós dano, se verificou que a catalase (Figura 23-B) foi a
enzima que teve sua atividade mais reduzida em relação ao grupo tratado com os
agentes agressores. Em estudos com ratos tratados com tetracloreto de carbono e
fucoidan, foi demonstrado que a atividade da CAT e a da SOD estava aumentada
nos animais tratados com o tetracloreto, mas nos animais que além do tetracloreto
recebiam fucoidan, as atividades das enzimas estavam reduzidas, próximas do
controle. Os autores sugerem que isso ocorria porque o fucoidan tinha atividade
91
antioxidante e diminuía o stress oxidativo, o que indiretamente diminuía a
expressão/atividade da CAT e SOD (KANG et al., 2008). É possível que os PS de G.
birdiae também tenham agido assim, ou seja que eles tenham uma ação mais direta,
por exemplo sequestrando o peroxido e impedindo sua ação.
Os resultados encontrados neste trabalho demonstram que as amostras
contendo polissacarídeos sulfatados da alga vermelha comestível G. bridiae
possuem um potencial farmacológico importante, principalmente sobre a litíase
urinária, uma vez que estas amostras foram capazes de interferir na formação dos
cristais de OxCa, alterar a morfologia e quantidade destes, o que pode significar um
provável efeito benéfico frente a esta doença. Além disso, pode-se visualizar um
potencial terapêutico e reparador para algumas destas frações polissacarídicas, pois
as mesmas apresentaram ação profilática e reparadora em células renais frente a
danos celulares ocasionados pelo peróxido de hidrogênio e por cristais de OxCa. É
importante que outros estudos possam demonstrar a ação destas frações
polissacarídicas in vivo, bem como sejam realizados experimentos mais específicos
para elucidar os mecanismo precisos de ação pelos quais estes PS protegem e
corrigem os danos das células.
92
5 CONCLUSÕES
A alga vermelha comestível Gracilaria birdiae sintetiza uma população de
galactanas sulfatadas, que se diferenciam entre si principalmente pelo teor de
anidrogalactose;
A presença do extrato bruto e das frações F-0.25; F-0.5; F-0.75 interferiu na
síntese dos cristais OxCa: promovendo modificação na distribuição de cargas na
superfície destes e alterando a quantidade de cristais e sua morfologia;
Foi verificada baixa toxicidade nas células renais HEK-293, MDCK e 786-0
quando estas foram expostas ao extrato bruto e as frações F-0.25; F-0.5; F-0.75;
A exposição das células MDCK ao extrato bruto e a 0,1 mg/mL das frações F-
0.25; F-0.5; F-0.75 por 24 h protegeu essas do dano causado pela presença de
H2O2 e OxCa;
O extrato bruto e as frações F-0.25; F-0.5; F-0.75, em todas as concentrações
avaliadas, no tratamento pós dano, protegeram as células;
A presença de F-0.25, como com a F-0.5 promoveu diminuição da atividade da
SOD e CAT.
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![Sulfated zirconia[1]](https://img.pdfslide.us/doc/110x75/5568f2ecd8b42aff2e8b4932/sulfated-zirconia1.jpg)
