UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Aline de Sousa Marques

Grupo de pesquisa em Quimiometria Aplicada – GPQA

Uso da Espectroscopia do Infravermelho Próximo e técnicas multivariadas para diferenciar Escherichia coli e Salmonella Enteritidis inoculadas em polpa de fruta

(abacaxi).

Natal/RN

2013

2

Aline de Sousa Marques

Professor Orientador: Kássio Michell Gomes de Lima

Uso da Espectroscopia do Infravermelho Próximo e técnicas multivariadas para diferenciar Escherichia coli e Salmonella Enteritidis inoculadas em polpa de fruta

(abacaxi).

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos necessários para obtenção do título de Mestre em Química.

NATAL/RN

2013

UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede. Catalogação da Publicação na Fonte.

Marques, Aline de Sousa.

Uso da espectroscopia do infravermelho próximo e técnicas

multivariadas para diferenciar escherichia coli e salmonela enteritidis

inoculadas em polpa de fruta (abacaxi). / Aline de SousaMarques. –

Natal, RN, 2013.

67 f. : il.

Orientador: Prof. Dr. KássioMichell Gomes de Lima.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Ciências Exatas e da Terra. Instituto de Química.

Programa de Pós-Graduação em Química.

1. Espectroscopia - Dissertação. 2. Transflectância NIR - Dissertação.

3. Escherichia Coli - Dissertação. 4. SalmonellaEnteritidis– Dissertação.

5. SIMCA – Dissertação. 6. PLS-DA – Dissertação. I. Lima,

KássioMichell Gomes de. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BCZM CDU 543.42

4

Á Deus, por permitir e me dar a capacidade de

tornar este trabalho possível, por me encorajar

quando as minhas forças já não eram

suficientes, por colocar no meu caminho o

professor Kássio, que me motivou a caminhar

por caminhos ainda não conhecidos.

Ao meu pai, que por tanto lutou para me ajudar a

chegar onde estou, que acreditou quando mais

ninguém acreditava, que me incentivou a ir além

do que ele pôde.

Com AMOR e GRATIDÃO,

Eu dedico.

5

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, João e Wilma, pelo amor, carinho, dedicação e educação que me

deram ao longo da minha vida, permitindo meu crescimento pessoal para atingir

mais essa conquista.

Às minhas irmãs Clarice, Valéria e Marília, pela relação de união que temos.

Ao meu noivo, Felipe, que esteve comigo por toda essa caminhada, acreditando,

incentivando e muitas vezes me ajudando ‘cientificamente’ para que o trabalho

fosse realizado, e por todo carinho e amor que fez a caminhada mais amena.

Às Helena’s do GPQA, Ana Carolina, Jábine, Fernanda e Raquel, por estarem

sempre presentes dando sentido àquilo que não tinha, atribuindo conhecimento e

tornando o trabalho mais divertido.

Ao professor Dr. Kássio Lima, pela oportunidade, orientação, apoio e confiança.

A professora Celeste por fornecer o seu conhecimento e laboratório para a

aquisição das amostras e a Thiago seu orientando pelo apoio, dedicação e

disposição.

A Jábine pelo companheirismo, pelas tardes e mais tardes de dedicação do seu

tempo me ajudando em tudo o que eu precisava, o mérito também é dela.

Em especial, a Ana Carolina que esteve presente em toda caminhada, estudou,

apoiou, acreditou, brigou, chorou, sempre ao meu lado, ela acreditou em mim até

quando eu não acreditava, por tudo, obrigada.

Enfim, a todos de maneira direta e indireta que estiveram contribuindo com esta

realização profissional.

6

RESUMO

Visando à segurança do consumidor, é de extrema importância identificar

a presença de contaminantes patogênicos nos alimentos, pois os mesmos são

responsáveis por surtos alimentares que dependendo do nível de contaminação

pode chegar a causar a morte de quem os consome. Na industria há uma

necessidade de que essa identificação de contaminantes seja rápida e rentável.

Este estudo mostra a aplicação e utilidade de medidas espectrais de

transflectância no infravermelho próximo (NIR) como um método alternativo para

a identificação e classificação de Escherichia coli e Salmonella Enteritidis em

polpa de fruta comercial (abacaxi). Análise de Componentes Principais (PCA),

Modelagem Independente por Analogia Classe (SIMCA) e Análise Discriminante

por Mínimos Quadrados Parciais (PLS-DA) foram utilizados na análise. Não foi

possível obter uma separação total entre as amostras usando PCA e SIMCA. O

PLS-DA apresentou bom desempenho na capacidade de predição alcançando

87,5% para E. coli e 88,3% para S. Enteritides, respectivamente. Os melhores

modelos obtidos para o PLS-DA com os espectros tratados com segunda

derivada apresentaram sensibilidade e especificidade de 0,87 e 0,83,

repectivamente. Estes resultados sugerem que a espectroscopia NIR e PLS-DA

podem ser usados para discriminar e detectar bactérias na polpa da fruta.

Palavras-chave: Transflectância NIR. Escherichia coli. Salmonella Enteritidis.

SIMCA. PLS-DA.

7

ABSTRACT

Aiming to consumer’s safety the presence of pathogenic contaminants in

foods must be monitored because they are responsible for foodborne outbreaks

that depending on the level of contamination can ultimately cause the death of

those who consume them. In industry is necessary that this identification be fast

and profitable. This study shows the utility and application of near-infrared (NIR)

transflectance spectroscopy as an alternative method for the identification and

classification of Escherichia coli and Salmonella Enteritidis in commercial fruit pulp

(pineapple). Principal Component Analysis (PCA), Independent Modeling of Class

Analogy (SIMCA) and Discriminant Analysis Partial Least Squares (PLS-DA) were

used in the analysis. It was not possible to obtain total separation between

samples using PCA and SIMCA. The PLS-DA showed good performance in

prediction capacity reaching 87.5% for E. coli and 88.3% for S. Enteritides,

respectively. The best models were obtained for the PLS-DA with second

derivative spectra treated with a sensitivity and specificity of 0.87 and 0.83,

respectively. These results suggest that the NIR spectroscopy and PLS-DA can be

used to discriminate and detect bacteria in the fruit pulp.

Keywords: NIR Transflectance. Escherichia coli. Salmonella Enteritidis.

SIMCA. PLS-DA.

8

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Estrutura celular de organismos gram-positivos e gram-

negativos.......................................................................................

18

Figura 2- Imagem ampliada de Escherichia coli

O157:H7.............................

19

Figura 3- Imagem ampliada da Salmonella

entérica.....................................

20

Figura 4- Crescimento de microrganismos fermentadores de lactose

(colônias rosadas) em ágar

VRBA.................................................

22

Figura 5- Presença de gás e leve turbidez em tubos contendo caldo

Escherichia coli após 24h de

incubação........................................

23

Figura 6- Ágar SIM, (A) ágar sem contaminação, (B) teste de Indol

positivo, (C) teste de Indol negativo e (D) produção de H2S com

aparecimento de precipitado negro...............................................

24

Figura 7- Esquema reativo de (A) produção do Indol e (B) reação do Indol

com o reativo de

Kovacs................................................................

25

Figura 8- Procedimento de inoculação em ágar

TSI.....................................

26

Figura 9- Ágar TSI, (1) sem inoculação e (2) inoculado com Escherichia

coli.................................................................................................

27

9

Figura 10- Reação de descarboxilação da Lisina através da enzima Lisina

Descarboxilase (LDC), produzindo Cadaverina e dióxido de

carbono..........................................................................................

28

Figura 11- Crescimento de Salmonella em ágar XLD com aparecimento de

centros escuros devido a precipitação do H2S.

............................

28

Figura 12- Crescimento de colônias rasadas em ágar Rambac, possível

contaminação por

Salmonella........................................................

29

Figura 13- Ágar TSI, (1) contaminação por Salmonella, (2) não

inoculado.....

30

Figura 14- Regiões do espectro eletromagnético com ênfase na região do

Infravermelho.................................................................................

31

Figura 15- Tipos de vibrações

moleculares.....................................................

32

Figura 16- Transições eletrônicas entre níveis

vibracionais............................

34

Figura 17- Diagrama de energia potencial de um oscilador: (A) harmônico e

(B) anarmônico..............................................................................

35

Figura 18- Representação de bandas de absorção na região do

infravermelho próximo...................................................................

37

Figura 19- Esquema de um

espectrofotômetro...............................................

38

10

Figura 20- Espectro obtido na região do infravermelho

próximo.....................

38

Figura 21- Representação da simplificação de variárias por

PCA...................

42

Figura 22- Decomposição das matrizes X eY em matriz

menores..................

45

Figura 23- DFA dos espectros NIR de E.coli ATCC 25922 e E.coli K12 com

diferentes concentrações de

células..............................................

46

Figura 24- Espectros do ‘Extato B’ do repolho picado, (a) espectro original

e (b) espectro com MSC + segunda

derivada...................................

47

Figura 25- Representação dos espectros de L.innocua ATCC 51742,

B.cereus ATCC 10876, E.coli O157:H7 ATCC 35150 e E.coli

O157:H7 ATCC 25522, diferenças na região de 2000-1000 cm-1

pode ser observado.......................................................................

48

Figura 26- Representação de PC1xPC3 dos escores obtidos por regressão

PLS1 de amostras com L.plantarum, L.mesenteroides e L.sakei

a níveis de concentração 3-9 log de

ufc/mL...................................

48

Figura 27- Etapas de obtenção dos espectros. (a) fibra ótica na posição

inicial, para a obtenção do Background, (b) posicionamento da

sonda sobre a amostra para coleta dos espectros e (c)

armazenamento de dados.............................................................

49

Figura 28- Espectros NIR originais das suspensões de bactérias E. coli e

11

S. Enteritidis de 50 amostras, sendo 25 para E. coli e 25 para S.

Enteritidis.......................................................................................

55

Figura 29- Espectros NIR das suspensões de bactérias E.coli e S.

Enteritidis pré-processada com MSC e segunda derivada de

Savitzky-Golay com janela de 15 pontos com atribuição das

possíveis estruturas presentes na parece celular dos gram-

negativos................................................................

56

Figura 30- Escores de PCA dos espectros NIR das suspensões de E.coli e

S.

Enteritidis...................................................................................

57

12

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Modelo SIMCA com segunda derivada na região de 1111-

2000nm..........................................................................................

58

Tabela 2- Modelos PLS_DA com primeira e segunda derivada nas regiões

(A) espectro puro e (B) 1111-

2000nm............................................

59

13

LISTA DE ABREVIATURAS

BHI- Ágar de infusão de cérebro e coração (do inglês, Brain Heart Infusion Agar)

EC- Eschecichia coli

FIR- infravermelho distante (do inglês, Far Infrared)

HUS- Síndrome Hemolítica-urêmica (do inglês, Hemolytic-uremic Sindrome)

ICMSF- Comissão Internacional de Especificações Microbiológicas em Alimentos

(do inglês, International Comission on Microbiological Specifications for Food)

INCQS00258- Salmonella Enteritidis

INSCQ00171- Escherichia coli O157:H7

IR- infravermelho (do inglês, infrared)

LPS- Lipopolissacarídeo

MATLAB- software para cálculos numéricos (Matrix Laboratory)

MIR- infravermelho médio (do inglês, mid-infrared)

MSC- Correção do espalhamento multiplicativo (do inglês, Multiplicative Scatter

Correction)

NIR- infravermelho próximo (do inglês, near infrared)

OMS- Organização Mundial de Saúde

PCA- análise por componentes principais (do inglês, principal component

analysis)

PLS- Mínimos Quadrados Parciais (do inglês, Partial Least Square)

PLS-DA- Análise Discriminante por Mínimos Quadrados Parciais (do inglês,

Partial Least Square for Discriminant Analysis)

RMSECV- Raiz Quadrada do Erro Médio de Validação Cruzada (do inglês, Root

Mean Square Error of Cross Validation)

14

RMSEP- Raiz Quadrada do Erro Médio de Previsão (do inglês, Root Mean Square

Error of Prediction)

SIMCA- Modelagem Independente por Analogia de Classes (do inglês, Soft

Independent Modelling of Class Analogy)

STEC-EHEC- Escherichia coli Enteroemorrágica

TSB- Caldo soja tríptica (do inglês, Tryptic Soy Broth)

TSI- Ágar três açúcares ferro (do inglês, Triple Sugar Iron Ágar)

VRBA- Ágar vermelho violeta bile (do inglês, Violet Red Bile Agar)

XLD- Ágar Xilose, Lisina, Deoxicolato (do inglês, Xilose, Lisina, Deoxicolate Agar)

15

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................ 17

1.1 O ABACAXI..................................................................................... 17

1.2 MICROORGANISMOS PATOGÊNICOS E DOENÇAS

TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS .............................................

17

1.1.1 Gênero Escherichia....................................................................... 18

1.1.2 Gênero Salmonella........................................................................ 20

1.3 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO DE ANÁLISES

MICROBIOLÓGICAS NA INDÚSTRIA DE

ALIMENTOS.................

21

1.3.1 Gênero Escherichia coli................................................................ 21

1.3.1.1 Prova presuntiva.............................................................................. 21

1.3.1.2 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes....................... 22

1.3.1.3 Identificação bioquímica.................................................................. 23

1.3.1.3.1 Motilidade e Indol............................................................................ 23

1.3.1.3.2 Triagem para fermentação de glicose, lactose e sacarose............. 25

1.3.2 Gênero Salmonella........................................................................ 27

1.3.2.1 Pré-enriquecimento seletivo............................................................ 27

1.3.2.2 Isolamento e seleção...................................................................... 27

1.3.2.3 Identificação bioquímica.................................................................. 29

1.3.2.3.1 Motilidade, Indol e produção de H2S............................................... 29

1.3.2.3.2 Triagem para a fermentação de glicose, lactose e sacarose.......... 29

1.4 ESPECTROSCOPIA....................................................................... 30

1.4.1 Espectroscopia no infravermelho............................................... 31

1.4.1.1 Fundamentação teórica.................................................................. 32

1.4.1.2 Instrumentação............................................................................... 37

1.5 QUIMIOMETRIA.............................................................................. 39

1.5.1 Pré-processamento de dados...................................................... 39

1.5.2 Técnicas quimiométricas.............................................................. 3941

1.5.2.1 Análise de Componentes Principais (PCA)..................................... 41

1.5.2.2 Modelagem Independente por Analogia de Classe (SIMCA).......... 43

1.5.2.3 Análise Discriminante por Mínimos Quadrados Parciais (PLS-DA) 44

16

1.6 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................ 45

2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS..................................................... 50

2.1 OBJETIVOS GERAIS...................................................................... 50

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................... 50

3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.............................................. 51

3.1 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS.................................................. 51

3.1.1 Polpa de fruta................................................................................. 51

3.1.2 Cultura de bactérias e preparação do

inóculo............................

51

3.1.3 Preparação do inóculo.................................................................. 51

3.2 INSTRUMENTAÇÃO....................................................................... 51

3.3 QUIMIOMETRIA.............................................................................. 52

3.3.1 PCA e

SIMCA..................................................................................

52

3.3.2 PLS-DA........................................................................................... 53

3.4 AVALIAÇÃO DA PERFORMANCE DO MODELO.......................... 53

3.5 SOFTWARE.................................................................................... 53

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................... 55

4.1 ESPECTRO ORIGINAL................................................................... 55

4.2 PCA E SIMCA................................................................................. 57

4.3 PLS-DA........................................................................................... 59

5 CONCLUSÕES............................................................................... 61

REFERÊNCIAS…………………………….………………………… 62

APÊNDICES................................................................................... 66

17

1 INTRODUÇÃO

1.1 O ABACAXI

O Abacaxi, de espécie Ananas comosus, é uma planta tropical com

múltiplas frutas comestíveis que pode ser consumido fresco, enlatado ou em

forma de suco, também é encontrado em uma grande variedade de alimentos,

tais como: sobremesas, salada de frutas, geléia, iogurte, sorvete, doces. Esta

fruta possui baixa acidez, entre 0,6 a 1,62%, com uma média de pH acima de

4,51. A polpa apresenta cor branca, amarela ou laranja-avermelhada2.

Visando a segurança do consumidor, é de extrema importância

compreender todas as respostas fisiológicas de microorganismos patogênicos a

fatores de estresse sofridos durante o transporte, armazenamento e

processamento da polpa dos frutos. E, diante destes fatores, aliar-se a uma

combinação de diferentes barreiras para controlar a atividade microbiana,

podendo, desta forma, aumentar a eficiência na preservação e diminuir o impacto

sobre a qualidade do alimento.

1.2 MICRO-ORGANISMOS PATOGÊNICOS E DOENÇAS TRANSMITIDAS POR

ALIMENTOS

Compreende-se micro-organismos patogênicos, aqueles que, dependendo

das predisposições intrínsecas do hospedeiro, podem gerar ou não um estado

patológico manifesto, denominado doença infecciosa, que também é

transmissível3. De acordo com a ICMSF (Comissão Internacional de

Especificações Microbiológicas em Alimentos), os organismos patogênicos são

agrupados em três grupos: I – Micro-organismos que oferecem risco direto,

moderado e com difusão limitada, II- Micro-organismos que oferecem risco direto,

moderado e com difusão potencialmente extensa e III- Micro-organismos que

oferecem um risco direto e grave4.

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), milhões de pessoas

adoecem a cada ano devido à ingestão de alimentos contaminados. As infecções

causadas pela ingestão de alimentos contaminados por micro-organismos

patogênicos se multiplicaram, dentre os principais micro-organismos causadores

18

de toxinfecções alimentares estão a Escherichia coli e a Salmonella enterica5.

Ambas pertencem à família Enterobacteriaceae, que possui estrutura de

bastonetes gram-negativos, anaeróbios facultativos, são móveis e com flagelos

peritríquios e possuem como habitat natural o trato intestinal de humanos e

animais. Os micro-organismos desta família são aeróbios e anaeróbios

facultativos, fermentam a glicose e reduzem o nitrato ao nitrito. A principal

característica que os tornam gram-negativos é a presença da parede celular, que

é constituída de fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos6.

Figura 1- Estrutura celular de organismos gram-negativos.

(Fonte:www.biomania.com.br, acessado em 5 de agosto de 2013.)

O lipopolissacarídeo (LPS) é o principal antígeno dessa família, ele é

constituído por um oligossacarídeo em um lipídeo A. As enterobactérias podem

ser classificadas sorologicamente de acordo com o componente do seu LPS:

polissacarídeo somático (O). O antígeno somático (O) é um polissacarídeo

termoestável e forma a parte do lipopolissacarídeo presente na membrana

externa das bactérias Gram-negativas6,7.

1.2.1 Gênero Escherichia

Esse gênero é composto por bactérias móveis, que podem crescer

anaeróbica ou aerobicamente. Todos são fermentadores de glicose e lactose.

http://pt.wikipedia.org/wiki/Lipopolissacar%C3%ADdeohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Fam%C3%ADliahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Lipopolissacar%C3%ADdeo

19

A Escherichia coli (Figura 2) é uma das espécies de Escherichia, suas

cepas estão presentes naturalmente no trato intestinal, em organismos

debilitados/imunossuprimidos ou quando são introduzidas em outros tecidos após

um trauma ou cirurgia, a sua forma não patogênica pode causar infecções. No

entanto, a Escherichia coli geralmente é transmitida através da ingestão de

alimentos ou água que entraram em contato com material fecal, sendo assim, um

indicador de contaminação fecal.

Figura 2- Imagem ampliada de Escherichia coli O157:H7.

(Fonte: www.molecularstation.com)

A espécie E.coli patogênica é subdividida em duas subcategorias, a

extraintestinal e a intraintestinal ou diarreiogênicas, sendo esta última subdividida

em pelo menos cinco categorias. Dentre estas está a E.coli enterohemorrágica

(STEC - EHEC) que é caracterizada pelas toxinas que produz sorotipos de E.coli

O157:H7, também chamada de O157 STEC, produzem uma ou mais Shiga-

toxinas e são frequentemente encontradas na América do Norte e Europa. Nos

Estados Unidos a cada ano cerca de 73 mil casos de doenças e 60 mortes são

causados por O157 STEC. Os sintomas principais variam entre diarréia leve sem

sangue, diarréia severa com sangue e síndrome hemolítica urêmica (HUS).

Sintomas adicionais incluem cólicas abdominais e febre alta. Os vínculos

conhecidos de transmissão incluem leite, linguiça, carne assada, frutas e

derivados, vegetais crus e água não clorada8.

20

1.2.2 Gênero Salmonella

O gênero Salmonella também pertence à família Enterobacteriaceae.

Espécies desse gênero são móveis e gram-negativos. As Salmonellas são

tipicamente definidas pela sua capacidade de utilização de citrato com única fonte

de carbono e a lisina como única fonte de nitrogênio e por serem produtoras de

H2S em ágar três açúcares, exceções a estas características são utilizadas para

definir seus sorotipos específicos.

O gênero Salmonella é composto de duas espécies, a Salmonella entérica

(Figura 3) e a Salmonella bongori, sendo a S. entérica subdividida em seis outras

subespécies. Este gênero teve seu genoma analisado e foi encontrada uma alta

variabilidade genética. Os membros deste gênero podem ser isolados a partir de

alimentos ou água contaminados com fezes, eles não são organismos de vida

livre no meio ambiente.

Figura 3- Imagem ampliada da Salmonella entérica.

(Fonte: Volker Brinkmann)

A sorotipagem é baseada na caracterização de três estruturas de

superfícies: o antígeno S, que é a porção mais externa da camada que cobre a

célula bacteriana, o antígeno H, que é a porção flagelar bacteriana e o antígeno

Vi, que é um polissacarídeo capsular presente em sorotipos específicos. A

Salmonella sorotipo Salmonella Enteritidis é frequentemente associada com

infecções transmitidas por frangos e produtos frescos, este é um dos dois mais

comuns sorotipos tornando-se de 35 a 40% de infecções confirmadas por cultura.

21

As estirpes de Salmonella são classificadas como tifoide ou não tifoide que

corresponde à doença que está associada. Cepas de Salmonella não tifoide

normalmente causam infecções intestinais, acompanhados por diarreia, febre e

cólicas abdominais que normalmente duram uma semana ou mais, podendo

também causar infecções extra intestinais como bacteremia ou osteomielite.

O contágio humano está comumente ligado aos alimentos, podendo ser

transmitido pelo contato direto com animais, água contaminada e por contato

humano. Cerca de 1,4 milhões de casos da doença e 600 mortes são causadas

por salmonelose não tifoide nos Estados Unidos9.

1.3 PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO DE ANÁLISES

MICROBIOLÓGICAS NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS

1.3.1 Gênero Escherichia coli

1.3.1.1 Prova presuntiva

Para a identificação de Escherichia coli inicialmente realiza-se uma prova

presuntiva por meio da inoculação de 1mL de diluições da amostra (10 -1, 10-2,10-

3...) em placas de Petri cobertas com duas camadas de Ágar Cristal Violeta

Vermelho Neutro Bile (VRBA) seguindo de incubação em 36±1°C por 24h. O

VRBA apresenta em sua composição sais biliares e cristal violeta responsável

pela inibição de microrganismos Gram positivos e vermelho neutro, um indicador

de pH que revela a fermentação da lactose pelos micro-organismos presentes

formando colônias rosadas (Figura 4). O objetivo de se adicionar duas camadas é

para impedir que colônias cresçam na superfície do ágar10.

22

Figura 4- Crescimento de microrganismos fermentadores de lactose (colônias

rosadas) em ágar VRBA.

(Fonte:www.pvl.pt, acessado em 07 de Junho de 2013).

1.3.1.2 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes

As colônias presentes na prova presuntiva passam, então, pela etapa de

confirmação, nesta etapa as colônias suspeitas são inoculadas em tubos

contendo Caldo Escherichia coli (EC) e incubadas a 45°±0,2°C por 24 a 48h. O

caldo EC apresenta em sua composição uma mistura de fosfatos que lhe confere

um poder tamponante impedindo a sua acidificação. A seletividade é dada através

de sais biliares responsáveis pela inibição de micro-organismos Gram positivos10.

A presença de coliformes termotolerantes se dá pela presença de gás ou leve

efervescência ao agitar os tubos (Figura 5).

23

Figura 5- Presença de gás e leve turbidez em tubos contendo caldo Escherichia

coli após 24h de incubação.

(Fonte: A autora).

1.3.1.3 Identificação bioquímica

As amostras que apresentarem-se positivas para a prova confirmativa, são

submetidas à identificação bioquímica, que se baseia na evidenciação das

propriedades fisiológicas e metabólicas das culturas suspeitas caracterizando o

microrganismo11.

1.3.1.3.1 Motilidade e Indol

O ágar SIM (Figura 6-A) é um meio semi-sólido utilizado para avaliar se o

micro-organismo é móvel, e para determinar se o mesmo é produtor ou não de

Indol. A amostra é inoculada através de uma picada com alça de platina no ágar

SIM e incubada a 36±1°C por 24h.

24

Figura 6- Ágar SIM, (A) ágar sem contaminação, (B) teste de Indol positivo, (C)

teste de Indol negativo e (D) produção de H2S com aparecimento de precipitado

negro.

(Fonte : Adaptado de www.microbiology.scu.edu.tw, acessado em 27 de Junho de 2013).

O meio é composto por peptonas que são fontes de triptofano, o principal

intermediário da degradação do triptofano é o ácido indolpirúvico que pode formar

Indol (resultado positivo) por desaminação e Escatol (resultado negativo) por

descarboxilação do ácido idolacético. A presença de Indol é detectada pela

realização do teste colorimétrico (Figura 7), adicionando-se o reativo de Kovacs,

que é composto de p-dimetilaminobenzaldeído, álcool amílico e ácido clorídrico. A

Escherichia coli possui motilidade e Indol positivos10.

(A) (B) (C) (D)

25

Figura 7- Esquema reativo de (A) produção do Indol e (B) reação do Indol com o

reativo de Kovacs.

(Fonte: A autora).

1.3.1.3.2 Triagem para fermentação de glicose, lactose e sacarose

O meio de triagem utilizado é o Ágar TSI, que é composto de nutrientes,

como a peptona, o cloreto de sódio e o extrato de carne e leveduras, possuindo

sistema indicador os carboidratos: glicose (1g/L), lactose (10g/L) e sacarose

(10g/L), o tiossulfato de sódio, o sulfato ferroso e o vermelho de fenol. A

inoculação (Figura 8) é realizada através de uma picada com a alça de platina

(avaliação da anaerobiose) e estrias na rampa (avaliação da aerobiose) e

incubada a 36±1°C por 24h11.

26

Figura 8- Procedimento de inoculação em ágar TSI.

(Fonte: A autora).

Como a glicose é um monossacarídeo e está em baixa concentração, será

rapidamente fermentada anaerobiamente, formando ácido no fundo do tubo, o

que torna o meio amarelo pela viragem do indicador vermelho de fenol (todos os

membros da família Enterobacteriaceae fermentam a glicose com produção de

ácido). A fermentação aeróbia da glicose, que ocorre na superfície do tubo,

resulta em ácido pirúvico. A Escherichia coli é capaz de fermentar a glicose e a

lactose, produzindo gás e atribuindo coloração amarelada à base e a rampa do

tubo (Figura 9)10.

27

Figura 9- Ágar TSI, (1) sem inoculação e (2) inoculado com Escherichia coli.

(Fonte: A autora).

1.3.2 Gênero Salmonella

1.3.2.1 Pré-enriquecimento seletivo

Esta etapa tem o objetivo de minimizar os efeitos do processamento do

alimento que podem promover stress nas células de Salmonella. É utilizada uma

solução salina peptonada que mantém o pH, evitando que a microbiota

acompanhante acidifique o meio, prejudicando a recuperação das células de

Salmonella. Adiciona-se 225 mL da solução a 25 g da amostra e incuba-se a 36±1

°C por 24 h11.

1.3.2.2 Isolamento e seleção

Após a etapa de pré-enriquecimento, realiza-se a seleção das colônias de

Salmonella em dois meios sólidos: o ágar XLD e o ágar Rambac pelo método de

estriamento de superfície.

O ágar XLD possui em sua composição os nutrientes: extrato de levedura e

cloreto de sódio, um sistema inibidor: deoxicolato de sódio, um sistema indicador:

xilose, lactose e sacarose, um indicador de pH: vermelho de fenol, indicadores de

H2S: tiossulfato de sódio, Citrato de Ferro (III) e amônia e a Lisina. A Salmonella

28

não fermenta a lactose e a sacarose, mas fermenta a xilose, mudando sua cor de

vermelho para amarelo devido a presença do vermelho de fenol. Em seguida o pH

aumenta devido a descarboxilação da Lisina (Figura 10), tornando o vermelho de

fenol novamente vermelho. A produção de H2S produz colônias com um centro

negro (Figura 11)11.

Figura 10- Reação de descarboxilação da Lisina através da enzima Lisina

Descarboxilase (LDC), produzindo Cadaverina e dióxido de carbono.

(Fonte: A autora).

Figura 11- Crescimento de Salmonella em ágar XLD com aparecimento de

centros escuros devido a precipitação do H2S.

(Fonte: A autora).

No ágar Rambac a diferenciação entre Salmonella e outros microrganismos

é promovida pela presença de propilenoglicol, e também por um cromógeno que

evidencia a hidrólise da beta-galactosidase. A Salmonella fermenta o

propilenoglicol que em combinação com um indicador de pH produz uma

coloração vermelha (Figura 12) 11.

29

Figura 12- Crescimento de colônias rosadas em ágar Rambac, possível

contaminação por Salmonella.

(Fonte: http://www.chromagar.com/p-Chromogenic_agar_Technology, acessado em 15 de Junho de 2013)

1.3.2.3 Identificação bioquímica

1.3.2.3.1 Motilidade, Indol e produção de H2S

Para a Salmonella o ágar SIM se apresenta, quase sempre, escuro devido

a reação do H2S com Citrato de Ferro e amônio (presentes do meio), formando

um precipitado negro, que dificulta a visualização da motilidade, que é positiva

para a maior parte das Salmonellas. Enquanto que a presença de Indol é negativa

(Figura 6-C)11.

1.3.2.3.2 Triagem para a fermentação de glicose, lactose e sacarose.

No ágar TSI ocorre a fermentação da glicose por aerobiose com produção

de CO2, água e energia e fermentação da glicose por anaerobiose com produção

de ácidos orgânicos, aldeídos, álcoois, CO2, H2 e energia. A glicose está em

concentração dez vezes menor que os outros carboidratos e quando acaba o

microrganismo começa a utilizar as peptonas e produzir compostos alcalinos.

Como na superfície não há produção de ácidos o meio fica alcalino. Neste,

também há o aparecimento de precipitado negro devido a produção de H2S pela

redução do tiossulfato presente no meio (Figura 13)10.

http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&source=images&cd=&cad=rja&docid=MNSNqHVIXgGXNM&tbnid=NfRgJTucvPjTtM:&ved=0CAUQjRw&url=http://www.chromagar.com/p-Chromogenic_agar_Technology.html?PHPSESSID=f312d95cdb1b7a6d96a498a6c554f83a&ei=OKDIUavSJYLu8QTjl4GADQ&bvm=bv.48293060,d.dmg&psig=AFQjCNGYuAV5phlXrbxOf3L7zWtg6OAUsA&ust=1372189057713999

30

Figura 13- Ágar TSI, (1) contaminação por Salmonella, (2) não inoculado.

(Fonte: A autora).

1.4 ESPECTROSCOPIA

A espectroscopia mede interações da radiação com a matéria para obter

informações sobre uma amostra. Inicialmente o analito encontra-se em seu

estado de energia mais baixo (estado fundamental), depois de estimulado,

algumas espécies no analito sofrem uma transição para um estado de energia

maior (estado excitado).

Cada espécie molecular possui a capacidade de absorver frequências

características. À medida que a luz atravessa o analito ela é absorvida e sua

intensidade decresce a medida que o analito é excitado.

A transmitância, ou seja, a fração da radiação incidente transmitida pela

solução é representada na equação 1.

(1)

Onde:

T = Transmitância;

P = Potência radiante transmitida;

Po = Potência radiante incidente.

2 1

31

A absorbância A de uma solução está relacionada com a transmitância de

forma logarítmica, como mostrado na equação 2.

(2)

Quando excitadas, as moléculas são submetidas a três tipos de transições,

as transições eletrônicas, as transições vibracionais e transições rotacionais. Não

obstante, em fase condensada apenas as transições eletrônicas e vibracionais

apresentam contribuições relevantes.

1.4.1 Espectroscopia no infravermelho

A espectroscopia na região do infravermelho possui uma ampla faixa

espectral que é dividida em Infravermelho Próximo (NIR, 780 – 2500 nm),

Infravermelho Médio (MIR, 2500 – 5x104) e Infravermelho Distante (FIR, 5x104 –

1x106). Como pode ser observada na Figura 14, essa radiação geralmente não é

suficiente para causar transições eletrônicas, podendo apenas induzir a

transições vibracionais e rotacionais12.

Figura 14- Regiões do espectro eletromagnético com ênfase na região do

Infravermelho.

(Fonte: a autora)

32

1.4.1.1 Fundamentação teórica

Para que uma molécula diatômica absorva radiação na região do

infravermelho ela precisa possuir um momento de dipolo permanente, podendo o

campo elétrico alternado da radiação interagir com a molécula e causar variações

na amplitude de seus movimentos.

Se a frequência da radiação coincidir com a frequência da molécula, ocorre

uma transferência de energia e uma variação na amplitude da vibração é

alcançada, consequentemente ocorre a absorção.

As vibrações se encaixam na categoria dos estiramentos e deformações

angulares (Figura 15). A vibração de estiramento inclui uma variação constante na

distância interatômica ao longo de um eixo da ligação entre dois átomos,

enquanto que a vibração de deformação angular é caracterizada pela variação do

ângulo entre duas ligações13.

Figura 15- Tipos de vibrações moleculares.

(Fonte: a autora)

Considerando uma molécula diatômica com duas massas esféricas (m1 e

m2) unidas por uma mola com constante de força (k), através do modelo do

oscilador harmônico simples e da Lei de Hooke, a energia (E) do sistema é dada

por:

33

(3)

√

Onde:

μ = massa reduzida m1xm2/m1+m2

A lei de Hooke aplicada a energia potencial (V) pode ser representada pela

equação 4.

(4)

Onde:

k= constante de força;

x= coordenada de deslocamento.

A curva de energia potencial possui forma de parábola e é simétrica sob o

comprimento da ligação, este modelo leva a frequência da ligação V0.

(5)

√

A mecânica quântica prevê que para esse modelo as transições entre os

diferentes níveis vibracionais adjacentes só podem acontecer quando Δ = ± 1.

Ainda, essa diferença de energia entre os níveis é sempre a mesma. E, para que

uma molécula absorva energia e, consequentemente, seja promovida até um

nível vibracional excitado, a radiação incidente deve corresponder exatamente à

diferença entre os dois níveis energéticos adjacentes. Portanto, a energia do fóton

deve ser:

34

(6) –

Apesar de a mecânica quântica explicar as bandas de absorção

observadas no Infravermelho originárias os modos fundamentais de vibração

molecular, ela não consegue prever a presença de forças repulsivas entre

átomos, a possibilidade de dissociação quando o comprimento da ligação excede

a sua extensão e a presença de sobretons nos espectros NIR14. A região do NIR

gera espectros que apresenta sobreposições e bandas de combinação das

ligações CH, NH e OH de vários grupos funcionais15, outras ligações podem

contribuir para o espectro NIR, sendo CC, CO, CN e PO, embora possuam sinal

fraco quando comparados com as anteriormente citadas, atribuindo uma

contribuição pouco significativa16.

O NIR baseia-se em absorção de energia por parte das ligações

existentes nas moléculas de uma amostra que são causadas por três

mecanismos diferentes: sobreposição de vibrações fundamentais, combinação de

vibrações fundamentais e ainda absorções eletrônicas, gerando bandas de baixa

seletividade15,16. Essas bandas são originadas de transições com ∆v=±2, ∆v=±3...,

não obedecendo a regra de seleção, como pode ser observado na Figura 16.

Figura 16- Transições entre níveis vibracionais.

(Fonte: A autora)

35

Quando dois átomos de aproximam a repulsão coulombiana entre seus

núcleos aumenta mais rapidamente que o previsto pelo modelo harmônico, e

quando a distancia interatômica se aproxima daquela onde ocorre a dissociação

dos átomos, um decréscimo de energia potencial ocorre, comportando-se

anarmonicamente (Figura 17).

Figura 17- Diagrama de energia potencial de um oscilador: (A) harmônico e

(B) anarmônico.

(Fonte: a autora)

Esse comportamento anarmônico é aproximado através da equação de

Morse (7), que descreve a energia potencial da molécula diatômica, como:

(7) ( )

Onde:

a = constante molecular;

De = energia de dissociação;

re = distância interatômica de equilíbrio;

r = distância interatômica a um dado instante.

36

Desta forma, a equação resultante que descreve os níveis vibracionais é:

(8) (

) (

)

Onde:

Xn = constante de anarmonicidade da vibração.

Assim, o modelo anarmônico explica a ocorrência de transições com Δ ± 2

ou maior (sobretons) e bandas de combinação entre vibrações, que são, ambos,

os tipos de bandas com maior predominância na região espectral NIR. Outra

contribuição importante é que o modelo prevê que a separação entre dois níveis

vibracionais adjacentes diminui com o aumento do número quântico vibracional, υ,

não sendo mais igualmente espaçadas, como previa o modelo harmônico17.

As bandas de absorção do NIR são largas, sobrepostas e mais fracas que

suas bandas fundamentais, como mostra a Figura 18, embora baixa, essa

absortividade permite uma maior profundidade de penetração, sendo uma

vantagem analítica, permitindo análises diretas de fortes absorventes e nivelando

amostras com espalhamento, favorecendo a realização de análises químicas e

físicas em uma única medida18.

37

Figura 18- Representação de bandas de absorção na região do infravermelho

próximo.

(Fonte: A autora)

1.4.1.2 Instrumentação

Um espectrofotômetro é um instrumento espectroscópico que utiliza um

monocromador ou policromador que dispersa a radiação em seus comprimentos

de onda constituintes, podendo variar o comprimento de onda sobre uma faixa

espectral considerável, juntamente com um transdutor que converte as

intensidades radiantes em sinais elétricos.

Os espectrofotômetros utilizam uma variedade de métodos para produzir

espectros de radiação NIR, podendo ser instrumentos de filtro, instrumentos

dispersivos ou interferômetros (transformada de Fourier), sendo este último o

mais aplicado por atribuir precisão e exatidão no comprimento de onda, alta razão

sinal/ruído e velocidade de varredura, podendo ser utilizado tanto para análises

qualitativas quanto para quantitativas12.

Os componentes básicos presentes em instrumentos NIR são a fonte de

luz, seletor de comprimento de onda, porta amostra, detector e registrador (Figura

19).

38

Figura 19- Esquema de um espectrofotômetro.

(Fonte: a autora)

Para obter o espectro, primeiro obtém-se um espectro de fundo

(Background), e em seguida é obtido o espectro da amostra, então a razão entre

os dois espectros é calculada e a absorbância ou transmitância versus o

comprimento de onda é registrado, como na Figura 20.

Figura 20- Espectro obtido na região do infravermelho próximo.

(Fonte: A autora)

39

1.5 QUIMIOMETRIA

A quimiometria é uma área de estudo que aplica métodos matemáticos e

estatísticos às ciências químicas, de modo a delinear procedimentos

experimentais, obter a máxima informação química através dos dados obtidos,

permitindo o desenvolvimento de modelos que estimam propriedades através da

análise de outras propriedades19.

Graças à quimiometria foi possível empregar dados analíticos da região NIR,

sendo a técnica considerada parte hardware (instrumento) e software

(quimiometria).

1.5.1 Pré-processamento de dados

Inicialmente, os dados brutos gerados são tratados na etapa de pré-

processamento. Isto deve-se ao fato de os dados analíticos de uma medida

instrumental representarem uma propriedade físico-química em função de uma

variável (pH, tempo, temperatura,...), e isto gera ruído, diferentes ordens de

grandezas, variações sistemáticas de linha base e etc., o que dificulta a

interpretação e modelagem destes sinais.

A apresentação de dados de natureza multivariada é feita, geralmente, em

forma de tabelas, podendo ser representada por uma matriz de dimensões i x j

sendo ‘i’ amostras e ‘j’ medidas experimentais.

Os pré-processamentos podem ser aplicados a variáveis ou as variações

existentes entre as amostras. Quando aplicado a variáveis pode ser utilizado de

três formas: centralização de dados na média, que consiste em subtrair o valor de

cada elemento do vetor coluna (variável) pelo valor médio dos elementos dessa

coluna; escalonamento, onde cada elemento de uma linha é dividida pelo desvio

padrão e sua respectiva variável, ficando cada uma com a mesma influencia no

modelo; e o auto escalonamento que consiste em centralizar os dados na média e

em seguida efetuar o escalonamento, ficando a média igual a zero e o desvio

padrão igual a 120. Quando aplicado às variações das amostras os métodos mais

utilizados são as derivadas e as suavizações.

40

Os métodos de derivações são aplicados quando deseja-se corrigir

problemas relacionados com a variação da linha base, permitindo uma melhor

visualização de picos existentes nos sinais originais. O cálculo da derivada pode

ser representado por um modelo linear, como na Equação 11.

(11)

Na 1ª derivada o termo ‘b’ é removido do modelo linear, ela é utilizada para

remover deslocamentos constantes da linha base.

(12)

Enquanto que na segunda derivada o termo ‘a’ é excluído da equação,

nesta há uma eliminação de uma variação linear na linha base, normalmente

devido a efeitos de espalhamento.

(13)

A utilização das derivadas torna a relação sinal/ruído maior devido ao seu

cálculo fazer diferenças entre valores adjacentes de conjuntos de dados, sendo

mais comumente aplicada a suavização. O algoritmo mais utilizado é o de

Savistky-Golay, este algoritmo utiliza uma regressão polinomial com a finalidade

de atenuar a presença de ruídos instrumentais aleatórios. Ele define a origem do

sinal, a largura do intervalo e o ponto central do intervalo, em seguida remove

esse ponto central, ajusta o polinômio através dos mínimos quadrados, utiliza

41

esse polinômio para estimar o ponto removido e desloca-se para o ponto seguinte

repetindo o processo21.

1.5.2 Técnicas quimiométricas

1.5.2.1 Análise de Componentes Principais (PCA)

Uma vez que as respostas instrumentais carregam informações químicas e

físicas das amostras, a análise exploratória é usada para detecção de padrões de

associação nos conjuntos de dados e, a partir destes padrões, é possível se

estabelecer relações entre as amostras e variáveis, descobrir amostras anômalas

(outliers) ou agrupa-las conforme determinadas características. Um dos métodos

mais utilizados é a análise por componentes principais (PCA) que baseia-se na

transformação ortogonal de um conjunto de observações em um conjunto de

valores chamados componentes principais. Trata-se de um método que reduz a

dimensionalidade através da representação do conjunto de dados em um novo

sistema de eixos (componentes principais) preservando o máximo de informação

útil à análise. O conjunto de dados resultante da PCA é muitas vezes utilizado

como base para construção de diversos modelos multivariados e fornecem

resultados mais satisfatórios quando comparados àqueles obtidos através do

conjunto de dados originais22.

Uma trasfomação é realizada em que a matriz original é decomposta como

o produto de duas outras matrizes, os escores e os loadings:

(9)

Onde:

X = Matriz de dados I x J;

T = Matriz de escores I x A;

P = Matriz de loadings J x A;

E = Matriz residual I x J;

42

J = Número de variáveis;

A = Número de componentes calculados;

I = Número de objetos ou amostras.

Sabendo que os vetores escore ta são ortogonais (isto é, TtT = diag(a) e a

são autovalores da matriz XtX)23, Figura 21.

Figura 21- Representação da simplificação de variárias por PCA.

(Fonte: A autora)

Cada vetor gerado representa um componente principal (PC) que carrega

informações diferentes sobre as amostras e variáveis originais, e são calculadas

através de um processo interativo, em que a Equação 8 é usada para extrair o

primeiro termo da matriz X. A matriz residual E é submetida ao mesmo cálculo

para a obtenção do segundo, dando origem a uma nova matriz residual que, por

sua vez, contém menos informação. Esse processo se repete até que a matriz

residual contenha uma quantidade de informação comparável ao nível de ruído

instrumental. Desse modo, a maior parte da variabilidade presente no conjunto de

43

dados estará contida na primeira PC; a segunda PC terá mais informação que a

terceira, e assim por diante22.

O número ideal de componentes a ser utilizado deve ser encontrado no

ponto médio entre os valores máximos do erro e estimativa de erro do modelo

multivariado24. Para selecionar o número correto de componentes se utiliza uma

ferramenta chamada de validação cruzada (Cross Validation), ela calcula um erro

estimado que um modelo multivariado apresenta frente a amostras

desconhecidas na previsão de um parâmetro de interesse, para isso as mesmas

amostras de calibração são utilizadas e suas respectivas respostas instrumentais

que foram usadas para a construção do modelo.

O método de validação cruzada leave-one-out realiza esse cálculo

removendo uma amostra por vez, e calculando o modelo na sua ausência. A

habilidade de previsão deste modelo é, então, testada utilizando a amostra que foi

mantida fora da construção do mesmo. Este procedimento é repetido até que

todas as amostras de calibração disponíveis tenham sido excluídas uma vez e

reincorporadas no modelo, individualmente. A estimativa de erro é dada pela raiz

quadrada do erro médio de validação cruzada (RMSECV) que é definido como25:

(10) ∑ ( ) ⁄

Onde:

Ycv,i = Estimativa de Yi com a amostra i excluída

N = Número de amostras do conjunto de calibração

1.5.2.2 Modelagem Independente por Analogia de Classe (SIMCA)

O método de análise SIMCA considera que as variáveis tenham

distribuição normal e uniforme. Cada classe do conjunto de amostras conhecidas

é submetida a uma análise de componentes principais, o número de componentes

principais necessário pra descrever cada classe é estabelecido e então é

construída uma hipercaixa envolvendo as amostras de cada classe, na qual os

limites são definidos como um intervalo de confiança. A capacidade de

44

diferenciação entre as classes é dada pela distancia e pelo resíduo entre elas. As

amostras desconhecidas são comparadas com os modelos das classes e

atribuídas as classes de acordo com a sua semelhança com as amostras de

treinamento. Uma nova amostra será reconhecida como um membro de uma

classe que seja suficientemente semelhante para os outros membros se não ela

irá ser rejeitada. Cada classe é modelada usando modelos separados de PCA. O

limite de distância do modelo Smax é utilizado para classificar as amostras novas e

Smax é calculado para o modelo da classe m como se segue:

(11) cFmSmS )()( 0max

Onde:

S0 = distância média dentro do modelo;

Fc = (Critério de Fisher) é o valor crítico fornecido pelas tabelas de Fisher-

Snedecor. O valor Fc depende da percentagem de risco, geralmente fixada em

5%. A associação de classe é definida em um nível de significância de 2,5% do

Smax15,19.

1.5.2.3 Análise Discriminante por Mínimos Quadrados Parciais (PLS-DA)

O método dos mínimos quadrados parciais correlaciona dados

espectroscópicos (matriz X) com uma ou mais propriedade(s) química(s) ou

física(s) de interesse (matriz Y). O PLS é baseado em variáveis latentes uma vez

que a decomposição da matriz X durante a regressão é correlacionada a variação

na matriz Y, ou seja, a covariância entre X e Y é maximizada. Nesse caso,

ocorrem distorções nas direções dos loadings, de forma que estes perdem sua

ortogonalidade, diferente da análise de PCA, onde os valores são ortogonais

entre si. Esta diferença leva a variáveis latentes que são mais diretamente

relacionadas à variabilidade em Y do que são as componentes principais (PC). As

matrizes X e Y são relacionadas através de operações lineares algébricas entre

45

seus scores, T. Estes são obtidos pela decomposição de X e Y em matrizes

menores, de acordo com a figura 2217.

Figura 22- Decomposição das matrizes X e Y em matrizes menores.

(Fonte: A autora)

A regressão PLS pode ser adaptada para o reconhecimento de padrões,

dando origem ao método PLS-DA. O PLS-DA é realizado usando um código

binário exclusivo. Durante o processo de calibração, o método PLS-DA é treinado

para calcular os valores de "adesão", um para cada classe, quando o valor estiver

acima de um limiar específico de predição a amostra é, então, atribuída a uma

única classe, Este método, adaptado das regresões PLS1 ou PLS2, utiliza

variáveis espectrais X como preditores e variáveis q (0 ou 1) como variáveis de

resposta26.

1.6 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Estudos têm sido desenvolvidos aplicando a técnica NIR e a quimiometria

a amostras biológicas. Siripatrawan, em 2010, desenvolveu uma técnica rápida e

precisa com base em espectroscopia NIR integrada com quimiometria para

46

identificar e quantificar duas cepas de E. coli ATCC 25922 e K12 crescido em

meio líquido. Os autores empregaram a análise de componentes principais (PCA),

análise de fator discriminante (DFA) e rede neural artificial (ANN) como

ferramentas quimiométricas. Os modelos de PCA não conseguiram diferenciar as

espécies. Para dados de classificação o DFA apresentou-se satisfatório, e

mostrou diferenças entre grupos da mesma espécie e relacionou estas diferenças

à concentração. Para relacionar dados qualitativos com quantitativos modelos de

ANN foram construídos, estes apresentaram bons resultados de predição, com

coeficiente de regressão de 0,9827.

Figura 23- DFA dos espectros NIR de E.coli ATCC 25922 e E.coli K12 com

diferentes concentrações de células.

(Fonte: Siripatrauan, 2010)

Suthiluk (2008) estudou o uso do NIR como um procedimento rápido e não

destrutivo para medir a quantidade de contaminação por bactérias em repolho

picado usando regressão por mínimos quadrados parciais (PLS). Resultados

suficientemente precisos foram obtidos com o erro de polarização corrigida para o

padrão de previsão (PTS) de 0,46 log ufc/g para a solução Stomacher e 0,44 log

ufc/g para a solução de lavagem28.

47

Figura 24- Espectros do ‘extato b’ do repolho picado, (a) espectro original e (b)

espectro com msc + segunda derivada.

(Fonte: Suthiluk, 2008).

Al-Holy, em seu trabalho,utilizou a espectroscopia NIR com transformada

de Fourier para discriminar Escherichia coli O157:H7 ATCC 35150 de outras

bactérias (E.coli ATCC 25522, Bacillus cereus ATCC 10876, Listeria innocua

ATCC 51742) em suco de maçã. Análises de Componentes principais (PCA) e

Modelagem Independente por Analogia de Classe (SIMCA) foram utilizados. As

amostras foram classificadas com 82% de limite de confiança para diferenciar

E.coli O157:H7 ATCC 35150 de E.coli O157:H7 ATCC 25522, e 77% para

diferenciar E.coli O157:H7 de outras bactérias29.

48

Figura 25. Representação dos espectros de L.innocua ATCC 51742, B.cereus ATCC 10876, E.coli

O157:H7 ATCC 35150 e E.coli O157:H7 ATCC 25522, diferenças na região de 2000-1000. cm-1

pode ser observado.

(Fonte: Al-Holy, 2006)

Também foram utilizadas a espectroscopia NIR e modelos de calibração

multivariada na identificação de bactérias ácido láticas (Lactobacillus plantarum,

Leuconostoc mesenteroides e Lactobacillus sakei) em matriz aquosa. PCA e PLS

foram utilizados para obter modelos de previsão. A PCA mostrou claramente a

distinção entre as espécies. A PLS só conseguiu quantificar corretamente em

níveis de 3-9 log de ufc/mL30.

49

Figura 26- Representação de PC1xPC3 dos escores obtidos por regressão

PLS1 de amostras com L.plantarum, L.mesenteroides e L.sakei a níveis de

concentração 3-9 log de ufc/mL.

(Fonte: Martos, 2012).

50

2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS

2.1 OBJETIVOS GERAIS

O objetivo do presente trabalho foi avaliar a eficiência da espectroscopia

NIR na determinação dos micro-organismos (Escherichia coli e Salmonella

Enteritidis) inoculados em polpa de fruta (abacaxi), os quais apresentam um

histórico de surtos associados a alimentos.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Desenvolver uma metodologia de análise que atribua rapidez e precisão no

controle de qualidade microbiológico de polpa de abacaxi industrial;

Utilizar a técnica da Espectroscopia da região do Infravermelho Próxima (NIR)

como um método alternativo na determinação de Escherichia coli e Salmonella

Enteritidis em polpa de abacaxi;

Desenvolver modelos quimiométricos de classificação, utilizando a Análises de

Componentes Principais (PCA), Modelagem Independente por Analogia Classe

(SIMCA) e Análise Discriminante por Mínimos Quadrados Parciais (PLS-DA);

Contribuir para o desenvolvimento de métodos quimiométricos que possam ser

utilizados no controle de qualidade de alimentos para criar barreias que

contenham possíveis riscos de contaminação microbiológica.

51

3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

3.1 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS

3.1.1 Polpa de fruta

A polpa de fruta de abacaxi foi obtida de um supermercado em Natal,

estado do Rio Grande do Norte, Brasil.

3.1.2 Cultura de bactérias e preparação do inóculo

As cepas de Escherichia coli – INCQS00171 e Salmonella Enteritidis –

INCQS00258, utilizadas neste estudo, foram fornecidas pelo Laboratório de

Microbiologia Médica, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN,

Brasil. A cepas estavam sob congelamento em uma mistura de leite, BHI (Brain

Heart Infusion; Oxoid Ltd. Basingstoke, England) e glicerol para manter o

suprimento de nutrientes e a crioproteção.

3.1.3 Preparação do inóculo

As cepas foram inoculadas em 1 ml de Caldo TSB (Triptic Soy Broth,

Becton, EUA), a 35 ° C durante 24 h. A suspensão bacteriana foi padronizada

para 0,5 na escala de MacFarland (~ 108 ufc / mL) em solução salina estéril.

Posteriormente, cada cultura foi centrifugada (4000 rpm, durante 5 min). O

sobrenadante foi descartado e o precipitado resultante foi ressuspenso em 1 ml

de solução salina a 0,9% e centrifugado novamente. Este processo foi repetido

mais duas vezes para remover os componentes do meio. O precipitado obtido foi

ressuspenso em 1 ml de polpa de abacaxi (~ 10 ° C).

3.2 INSTRUMENTAÇÃO

Como mostrado da Figura 27, os espectros foram medidos utilizando um

Espectrofotômetro Antaris MX FT-NIR (Thermo Fisher Scientific Inc., EUA),

equipado com sonda de fibra ótica de transflectância. Os espectros NIR foram

obtidos ao longo de um gama de 10,000-4000 cm-1, ou 1000-2500 nm, e foram

registados com uma resolução espectral de 32 cm-1, com 32 varreduras. O tempo

52

de medição foi de 26 s (32 scans) por espectro. Os espectros de absorbância das

amostras da suspensão bacteriana foram obtidos contra o espectro da sonda em

repouso. Seringas descartáveis de 1 mL foram utilizadas para adicionar uma gota

da amostra, aproximadamente 0,1 ml, em uma superfície de alumínio com

aproximadamente 0,1 mm de espessura. A sonda de trasflectância foi

posicionada sobre a superfície da amostra. Após cada amostra a sonda de

transflectância foi lavada com etanol (70% v / v) e seca com papel. Cinqüenta

espectros (N = 50) foram carregados seguindo a sequência de cada espécie à

temperatura ambiente.

Figura 27- Etapas de obtenção dos espectros. (a) fibra ótica na posição

inicial, para a obtenção do Background, (b) posicionamento da sonda sobre a

amostra para coleta dos espectros e (c) armazenamento de dados.

(Fonte: A autora).

3.3 QUIMIOMETRIA

3.3.1 PCA e SIMCA

Neste estudo, foi utilizado um total de 50 espectros NIR, divididos em

E.coli (15 amostras) e S. Enteritidis (21 amostras). Para validar os modelos

SIMCA obtidos, 8 e 6 amostras dos grupos E. coli e S. Enteritidis,

53

respectivamente, foram analisados. O desempenho do modelo SIMCA foi

avaliado, comparando os valores de sensibilidade e especificidade.

3.3.2 PLS-DA

O método PLS-DA foi utilizado para diferenciar entre as duas classes

diferentes de bactérias, e que foram divididas em dois conjuntos um de calibração

e outro de validação. A análise PLS-DA foi realizada utilizando um conjunto de

calibração com 15 e 21 amostras de E. coli e S. Enteritidis, respectivamente. Para

a validação externa, 8 e 6 amostras de E.coli e S. Enteritidis, respectivamente. A

validação cruzada foi realizada utilizando subconjuntos aleatórios, o que significa

que cada conjunto de teste foi formado a partir de uma seleção de objetos, de

forma que um único objeto é incluído em apenas um conjunto de testes. O

número de variáveis latentes selecionados para cada modelo foi determinado

utilizando o menor erro quadrático de previsão (RMSEP).

3.4 AVALIAÇÃO DA PERFORMANCE DO MODELO

A avaliação do desempenho do modelo foi efetuada através da análise de

sensibilidade e especificidade. Sensibilidade é a estimativa percentual

experimental de amostras classificadas corretamente em sua própria classe, e

especificidade é a estimativa percentual experimental de amostras de outra classe

que a classe modelo rejeita. Um modelo perfeito de classe tem 100% de

sensibilidade e especificidade de 100%31.

3.5 SOFTWARE

A importação dos dados, pré-tratamentos e a construção dos modelos de

classificação quimiométricos (PCA, SIMCA, PLS-DA) foi realizada na versão

MATLAB 6.5 (Math-Works, Natick, EUA), utilizando o PLS-toolbox (Pesquisa

Eigenvector, Inc., Wenatchee , WA, EUA, versão 5.8.2). Diferentes métodos de

pré-processamento foram usados, incluindo a derivada e a suavização de

Savitzky-Golay, utilizando um polinômio de primeira e segunda ordem, e variando

o número da janela de pontos (3, 5, 7 e 15 ) e correção de dispersão (MSC).

54

Todos os modelos foram construídos com validação cruzada, utilizando-se o

método ‘leave-one-out’. o número ótimo de componentes PLS foi considerado

como sendo, pelo menos, aquele que minimiza a diferença de quadrados entre o

valor de referência e os parâmetros medidos (raiz quadrada média do erro de

validação cruzada, RMSECV).

55

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 ESPECTRO ORIGINAL

A Figura 28 mostra os espectros NIR das suspensões de bactérias de duas

classes (E. coli e S. Enteritidis). Como pode ser observado há dificuldade, e até

mesmo impossibilidade de encontrar diferenças significativas entre as duas

classes apenas observando seus espectros puros, isto deve-se ao alto grau de

sobreposição de bandas. Estas bandas são originadas do segundo sobretom do

estiramento O–H (982 nm), do primeiro sobretom do estiramento O–H (1456 nm),

e a combinação de bandas do estiramento assimétrico e deformação angular das

vibrações do O–H (1940 nm). Também pode-se observar que houve um desvio da

linha de base e bias consistente, que é muito comum para espectros NIR

adquiridos por técnica de reflectância difusa devido ao alto espalhamento de luz32.

Figura 28- Espectros NIR originais das suspensões de bactérias E. coli e S.

Enteritidis de 50 amostras, sendo 25 para E.coli e 25 para S. Enteritidis.

(Fonte: a Autora).

Para resolver este problema, alguns pré-tratamentos foram aplicados. O

primeiro pré-tratamento utilizado foi uma correção de espalhamento de luz (MSC),

56

realizada para corrigir o efeito de dispersão da luz no espectro de absorção. Esta

etapa foi essencial para a aplicação dos outros pré-processamentos. Foram

construídos modelos com primeira e segunda derivada de Savitzky-Golay com

janelas de 3 a 15 pontos (Apêndice A) nos espectros puros e em regiões

específicas. Foi utilizada a derivada porque esta torna as características

espectrais das diferentes cepas de bactérias mais proeminentes e por ser muito

usada para processar dados espectrais, pois separa sobreposições de bandas de

absorção, elimina desvios de linha de base e aumenta a resolução espectral

aparente. Estes efeitos são mostrados na Figura 29.

Figura 29- Espectros NIR das suspensões de bactérias E.coli e S. Enteritidis

pré-processada com MSC e segunda derivada de Savitzky-Golay com janela de

15 pontos com atribuição das possíveis estruturas presentes na parece celular

dos gram-negativos.

(Fonte: a Autora).

57

4.2 PCA E SIMCA

Após os pré-processamentos, a faixa de 1000 a 1111 nm foi removida com

a intenção de eliminar o ruído espectral e, em seguida, realizou-se a análise de

PCA. Um modelo PCA foi construído a partir do conjunto de calibração usando 3

componentes principais, explicando juntos 98,62% do total de variância nos dados

após a aplicação do pré-processamento (MSC e primeira derivada Savitzky-Golay

com janela de 15 pontos). Como pode ser visto na Figura 30, não há separação

clara entre as duas classes. Neste caso, a figura mostra que os escores de PCA

resultantes da aplicação desta técnica, para os dados de espectroscopia NIR, não

foram capazes de diferenciar as classes de bactérias.

Figura 30- Escores de PCA dos espectros NIR das suspensões de E.coli e S.

Enteritidis.

(Fonte: a Autora).

Os dados deste estudo contêm informações espectrais NIR complexas com

diversas fontes de variação (por exemplo, taxa de crescimento, a temperatura e o

tempo de incubação, o processo metabólico, as propriedades ópticas da sonda

utilizada na obtenção dos espectros, etc.). Os procedimentos para a preparação

das amostras deste estudo foram padronizados para minimizar essas influências,

gerar informações espectrais consistentes e obter dados reprodutíveis. A

58

concentração média de células bacterianas foi consistentemente 1 × 108 ufc / ml,

que forneceu sinais intensos na região NIR. Por isso que o PCA, que é

freqüentemente usado como um método de classificação não-supervisionado, não

foi capaz de fornecer uma separação suficiente entre as classes, e também pelo

fato do mesmo não ser eficaz quando a variação dentro do grupo é maior do que

a diferença entre os grupos. Em tais situações, a utilização de métodos de

classificação supervisionados deve ser considerada.

Para reduzir o efeito da água nos modelos supervisionados foi removido o

pico principal da água (1900 nm), removendo, assim, a banda de estiramento O-H

da água.

Antes da construção dos modelos, as amostras foram selecionadas

utilizando o gráfico de PCA, pois mostrou-se mais satisfatório em relação à

seleção de amostras utilizando o algorítmo Kennard-Stone (Apêndice B). O último

não conseguiu diferenciar amostras por grupos, reconhecendo as amostras como

sendo de um único grupo, este fato pode ser explicado pela alta variabilidade das

amostras.

Foram costruídos modelos SIMCA para cada uma das duas classes

usando um total de 50 amostras. Os modelos SIMCA apresentaram um baixo

desempenho, como pode ser visto na Tabela 1 que mostra o melhor modelo

obtido. Isto deve-se ao fato do modelo SIMCA ser baseado na Análise de

Componentes Principais, não sendo capaz de identificar diferenças entre as

classes e similaridades dentro de cada classe.

Tabela 1- Modelo SIMCA com segunda derivada na região de 1111-2000nm.

Bactéria

Calibração Previsão

Acertos %Variância Falsos

Negativos

Acertos %Variância Falsos

Negativos

E.coli 14 93,33 1 8 100 0

S.enteritidis 4 19,04 17 0 0 6

59

Atendo ao fato de que os modelos de PCA e SIMCA não foram capazes de

diferenciar as duas classes de bactérias, modelos PLS-DA foram construídos. O

PLS-DA foi escolhido por levar em consideração valores de X e Y, fornecendo

mais informações ao modelo.

4.3 PLS-DA

O conjunto de dados com 256 variáveis (região selecionada) foi utilizado

para o modelo de classificação PLS-DA. Durante a construção do modelo,

algumas amostras foram removidas, tais como outliers com base na avaliação

dos resíduos e T2 de Hotelling (Apêndice C). Modelos de classificação foram

construídos para todas as combinações de E. coli e S. Enteritidis. Os modelos

foram validados por validação cruzada. Foi realizada a seleção dos dados de

calibração para encontrar as variáveis ideais para a classificação. O modelo PLS-

DA foi calculado e validado. O R2, e RMSEC RMSECV para os modelos PLS-DA

de calibração foram 0,87, 0,46 e 0,69, respectivamente, para a E. coli. Para S.

Enteritidis os valores R2, RMSEC e RMSECV foram 0,87, 0,60 e 0,68,

respectivamente. O PLS-DA apresentou um bom desempenho, atingindo uma

capacidade de predição de 87,5% para a E. coli e de 88,3% para S. Enteritidis,

respectivamente. A Tabela 2 apresenta o resumo dos resultados obtidos para

vários modelos de PLS-DA.

Tabela 2- Modelos PLS_DA com primeira e segunda derivada nas regiões (A) espectro puro e (B) 1111-2000nm.

Bacterium

Calibração Previsão

Acertos Variância Falsos

Negativos

Acertos Variância Falsos

Negativos

E.coli(A)¹ 12 77,70 3 6 75,00 2

S.enteritidis(A)¹ 18 85,70 3 3 58,30 3

E.coli(B)¹ 14 88,88 1 6 85,70 2

S.enteritidis(B)¹ 7 33,33 14 4 75,00 2

E.coli(B)² 13 86,66 2 7 87,50 1

60

S.enteritidis(B)² 19 90,47 2 5 83,33 1

Os resultados dos diferentes modelos com os valores de sensibilidade e

especificidade para a validação cruzada e os modelos testados foram calculados.

Para os modelos PLS-DA os valores ideais obtidos para a sensibilidade e

especificidade foram de 0,87 e 0,83, respectivamente, em modelos de

diagnósticos um elevado valor de especificidade é muitas vezes preferido dado

que tal reduz o número de falsos positivos.

Os resultados dos modelos PLS-DA sugerem que também é possível a

utilização de técnicas quimiométricas e que estas são adequadas para a detecção

de bactérias inoculadas em polpa de fruta.

Comparando os resultados obtidos em trabalhos anteriores29,33, pode ser

observado que para construção de modelos com bactérias o SIMCA apresenta

resultados altos na classificação, porém quando amostras de validação são

testadas o modelo torna-se falho. Enquanto que, o PLS-DA, apresenta-se uma

boa ferramenta para solucionar problemas de variabilidade dentro da classe,

conseguindo bons modelos de validação.

O presente trabalho mostra-se promissor para solucionar deficiencias na

indústria de polpa de fruta quanto à análises microbiológica das espécies

Salmonella e Escherichia coli, proporcionando rapidez na análise, podendo o

produto ser encaminhado para o consumidor final assim que produzido.

61

5 CONCLUSÕES

Tendo em vista os resultados obtidos, podemos concluir que é possível

utilizar os métodos quimiométricos para diferenciar colônias de bactérias

(Escherichia coli e Salmonella Enteritidis) a partir da espectroscopia NIR (1000–

2500 nm). Foi avaliado que o método PLS-DA apresentou melhores resultados.

Os resultados mostraram-se satisfatórios, porém apresentaram falhas na

aquisição dos espectros que sofreu variações físicas (temperatura, tempo, etc) e

baixa sensibilidade do equipamento. Para solucionar este problema técnicas

quimiométricas tem sido desenvolvidas.

Futuramente, o desenvolvimento desta técnica poderá ter um grande

potencial na determinação de contaminantes em alimentos, atribuindo rapidez e

precisão nas análises de controle de qualidade.

62

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66

APÊNDICE A - Modelos PLS-DA com MSC e 1ª e 2ª derivada com variação de

janela de 3 a 15 pontos.

Modelo¹ Sensibilidade Especificidade R² Cal RMSEC R² Prev RMSEP

PLS-DA S(1D)3Pts

0,000 0,750 0,990 0,046 0,065 0,717

PLS-DA S(1D)5Pts

1,000 0,200 0,972 0,062 0,011 0,757

PLS-DA S(1D)7Pts

0,000 1,000 0,977 0,070 0,069 0,965

PLS-DA S(1D)15Pts

1,000 0,200 0,968 0,066 0,005 0,645

PLS-DA S(2D)3Pts

1,000 1,000 0,917 0,138 0,784 0,302

PLS-DA S(2D)5Pts

0,000 0,667 0,790 0,160 0,024 0,622

PLS-DA S(2D)7Pts

1,000 0,667 0,806 0,211 0,557 0,768

PLS-DA S(2D)15Pts

0,875 0,883 0,870 0,460 0,871 0,680

¹ Pts, Pontos; 1D, 1ª derivada; 2D, 2ª derivada.

Apêndice B: Modelos PLS-DA com seleção de amostras utilizando o algoritmo

Kennard-Stone.

Modelo² Sensibilidade Especificidade R² Cal RMSEC R² Prev RMSEP

PLS-DA(1) KS(1D)

0.000 1.000 0.986 0.040 0.044 0.431

PLS-DA(1) KS(2D)

1.000 1.000 0.999 0.005 0.999 0.005

PLS-DA(2) KS(1D)

1.000 1.000 0.999 0.010 0.999 0.010

PLS-DA(2) KS(2D)

1.000 1.000 0.998 0.018 0.998 0.018

PLS-DA(3) KS(1D)

1.000 1.000 0.997 0.016 0.997 0.016

PLS-DA(3) KS(2D)

0.000 1.000 0.958 0.096 0.958 0.096

² KS, Kennard-Stone; 1D, 1ª derivada; 2D, 2ª derivada.

67

Apêndice C: Gráfico de resíduo e T² Hotelling

CAPA_PPGQ_Mestrado.pdf1: Capa Mest PPGQ