UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS

ANDERSON HENRIQUE FRANÇA FIGUEREDO LEÃO

RATOS ESPONTANEAMENTE HIPERTENSOS (SHR) SÃO RESISTENTES A

UM MODELO ANIMAL PROGRESSIVO DA DOENÇA DE PARKINSON: UM

ESTUDO NEUROQUÍMICO E COMPORTAMENTAL.

NATAL-RN, 2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS

ANDERSON HENRIQUE FRANÇA FIGUEREDO LEÃO

RATOS ESPONTANEAMENTE HIPERTENSOS (SHR) SÃO RESISTENTES A

UM MODELO ANIMAL PROGRESSIVO DA DOENÇA DE PARKINSON: UM

ESTUDO NEUROQUÍMICO E COMPORTAMENTAL.

Tese apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Neurociências da

Universidade Federal do Rio Grande do

Norte como requisito parcial para

obtenção do título de Doutor em

Neurociências.

Orientadora: Profª Drª Regina Helena

Silva

NATAL-RN, 2016

Dedico este trabalho aos meus pais e

professores, que no empirismo do dia-

a-dia me encorajaram a duvidar e

questionar a natureza que me cerca.

AGRADECIMENTOS

Toda uma vida de formação educacional formal culmina para este

momento. Nunca tive dúvida, mesmo quando ainda muito jovem, que alcançaria

e encerraria esta etapa em minha vida. Mas mesmo quando o prenunciado

momento chega, parece difícil de acreditar. Um sonho de criança se torna

realidade com este trabalho, e mais do que nunca sinto o desejo de celebrá-lo.

Desejo celebrar este mérito que cabe a mim, mas que não seria possível sem a

coleção de experiências acumuladas pela vivência coletiva. Como um primata

social, devo muito do que sou e do que aprendi aos meus pares. “Do que sou”

porque se há algo definitivo e importante para o nosso self, este algo é a coleção

de memórias autobiográficas que formam a nossa identidade. “Do que aprendi”

porque aprender através da linguagem e empatia a experiência do próximo

talvez esta seja a característica mais humana de todas. A todos, que de alguma

forma contribuíram para a minha experiência nesta vida, dedico estes

agradecimentos. Mas não antes de retomar em minha memória autobiográfica

alguns momentos e pessoas marcantes.

Começando pela minha juventude, não sou adepto do saudosismo que a

maioria das pessoas alimentam e compartilham a respeito deste período de vida.

Sim, foram tempos importantes, sobretudo porque foi neste período de minha

vida que a minha identidade se firmou e o gosto pela ciência me foi despertado.

Se é que é possível despertar algo que já era tão vívido por natureza. Afinal,

nas palavras de Carl Sagan, toda criança nasce como um cientista inato, movido

por um apetite natural de explorar e aprender. Talvez a melhor forma de colocar

isto seja nos seguintes termos: fui afortunado por cruzar com educadores que

não me inibiram.

Por culpa e carma próprios, os primeiros personagens e modelos a quem

devo agradecimentos são meus pais, Zuleide Maria e Francisco de Assis. Apesar

da indignação e incompreensão do porque todo brinquedo que ganhava merecia

ser desmontado, nunca me privaram do enriquecimento ambiental necessário

para o meu amadurecimento nesta fase. Para a sorte deles, foi o que escolhi

fazer por carreira. Por outro lado, para o azar, nunca os consegui montar de

volta. Continuo “desmontando” cérebros para tentar entender as engrenagens

que o movimentam, mas ainda não consegui montar nenhum de volta. Portanto,

não posso questionar em nada as oportunidades que tive. Boa nutrição, bons

brinquedos, boa escola, bom ambiente familiar. Ainda que minhas solicitações

fossem incompreendidas (como um livro em uma língua que ainda era incapaz

de ler), ou mesmo impraticáveis (como quando me dei conta cuidando e

reproduzindo aproximadamente 25 hamsters de estimação), meus pais nunca

mediram esforços para investir em quem somos (aqui falo por mim e por meu

irmão, Arthur). A vocês, dedico e agradeço este trabalho. Obrigado por todo

investimento parental, e espero que este trabalho traga um pouco de retorno ao

que depositaram em mim. Esta é a concretização da “herança” que vocês me

deixaram.

Na escola também tive a oportunidade de cruzar com educadores que

alimentaram o meu ímpeto por perguntas e pela natureza. Agradeço à minha

professora de Biologia, Profª Karen, que uma vez ao me introduzir ao

microcosmos sob as lentes de um microscópio óptico e a história de Antonie van

Leeuwenhoek, ampliou as margens do meu mundo além de fronteiras que ainda

era incapaz de conceber. Naquele momento uma pequena mente se abriu para

um novo mundo e nunca mais retornou ao seu tamanho original. Não apenas

tive a oportunidade de ser estimulado à investigação, mas também cruzei com

educadores que me ensinaram a refinar a forma correta de se questionar a

natureza. Em especial, agradeço ao meu professor de História, Profº Eudes, que

conseguiu despertar novas formas de se encarar a natureza e o homem através

do método científico. A todos os meus professores, agradeço pelos

ensinamentos e zelo pela transmissão do conhecimento.

Em resumo, este é o histórico que me conduziu até a academia. De fato,

foi na universidade que me descobri como indivíduo e cientista. Sim, para mim a

entrada na universidade foi um marco que definiu minha personalidade em

muitos aspectos. Enquanto na escola, como de costume, qualquer criança com

interesses atípicos para aquela geração era considerada motivo de escárnio, na

universidade adquiri a segurança necessária para compreender que todo este

tempo estive seguindo o caminho correto e encontrei a motivação para busca-

lo. Como uma vez disse Steve Jobs em um de seus discursos “Não é possível

conseguir conectar os pontos olhando para frente; você apenas pode conectá-

los olhando para trás. Portato, precisamos confiar que os pontos irão se conectar

de alguma forma no futuro”. Descobri no ambiente da universidade que os meus

interesses atípicos se tornariam ferramentas importantes para a carreira que

escolhi. Aquele livro em uma língua que ainda não sabia ler estava escrito na

língua padrão utilizada para o registro ciêntífico. Aquela numerosa criação de

roedores em minha casa calhou por ser útil na manipulação e manutenção de

animais de experimentação. E, sobretudo e pela primeira vez, o meu interesse

pela natureza foi apreciado e valorizado. Portanto, devo muito à atmosfera

acadêmica parte do que sou. Agradeço, portanto, à instituição da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, representada por seus docentes, discentes, e

servidores, por toda a experiência vivenciada em seus espaços.

Dentre estes, agradeço duplamente à Profª Drª Regina Silva e à minha

co-orientadora “informal” mais do que formal Profª Drª Alessandra Ribeiro, por

terem me dado seus votos de confiança e engajado em minha formação

científica. Pela primeira vez quando ainda aluno da graduação em Biomedicina,

recém-chegado na universidade, e completamente inexperiente a respeito da

academia. Pela segunda vez, quando confiaram na proposta que aqui se

concretiza na forma de tese ao me aceitar como seu aluno de doutorado. Não

posso negar que esta relação deu certo. Afinal, foram oito anos produtivos de

orientação que fizeram toda a minha formação acadêmica. Obrigado por todos

ensinamentos, e espero que esta relação possa se estender por muitos mais

anos sob outras formas.

Devo agradecimentos sobretudo também aos colegas de pós-graduação

veteranos, que me conduziram e orientaram neste tempo e que, além disto tudo,

se revelaram verdadeiros amigos preocupados com minha formação. Tenho

tanta confiança no que aprendi com vocês que hoje os tenho como exemplos.

Devo adminitir que me traz um certo orgulho saber que fui acompanhado por

pessoas que hoje estão muito bem encaminhadas, alguns em seus grupos de

pesquisa próprios como professores, outros ainda trilhando este caminho com

afinco. Meus eternos agradecimentos aos professores Ronaldo Santos, Geison

Izídio, e Flávio Barbosa, e doutores Ramón Hypólito, Alícia Cabral, e Valéria

Fernandes.

Agradeço também aos amigos que me acompanharam nesta jornada, em

especial aos colegas de curso e laboratório, André Medeiros, Raí Eufrásio, e

Isabella Pontes, que participaram e acompanharam de forma muito próxima

todas as principais etapas de minha vida acadêmica. Obrigado pelo

companheirismo ao longo destes anos. Aos demais amigos e colegas que

integraram o Laboratório de Estudos da Memória do Departamento de Fisiologia

da UFRN – Luiz Eduardo, Diana, Thieza, Éclinton, Carlos, Sophia, Aline, Aldair,

Bozena, Ivon, Ezequiel, Fernanda, Clarissa, Luane, Fernando, Priscila, Phiética,

Gênedy, Vanessa, Hermany, Diego – obrigado por nunca se levarem

excessivamente a sério e por tornarem o ambiente de trabalho tão agradável.

Definitivamente não compartilhamos apenas experimentos, mas também

risadas, histórias e memórias. No entanto, gostaria de dar destaque a algumas

pessoas desta equipe. Meus agradecimentos àqueles com quem pude contar

intimamente para a realização deste trabalho. Ywllianne Meurer, braço direito e

esquerdo do laboratório, e grande fonte de inspiração pessoal e profissional.

Uma das pessoas mais lindas que já conheci, capaz de te falar tudo só com um

olhar. Obrigado pelo cuidado, sobriedade e apoio. André Medeiros, a pessoa

mais doce que já tive oportunidade de conhecer, com quem pude sempre contar

nas dificuldades passadas em solo potiguar ou bandeirante. Obrigado pelos

momentos de sinceridade e cuidado, meu amigo. Anatildes Feitosa, uma força

da natureza quanto a questão é trabalho pesado. Parceira não somente quando

o trabalho pesado é no laboratório, mas também fora dele. Obrigado a todos

vocês pelo carinho e companheirismo. Grande parte do mérito desta tese cabe

a vocês.

Agradeço também aos colegas externos e colaboradores, cuja

participação e empenho foram fundamentais para o volume de dados aqui

apresentado. Sobretudo aos Profº Jeferson Cavalcante e Profª Rovena

Engelberth, do Dept. de Fisiologia da UFRN, que cederam espaço e expertise

para execução das imunohistoquímicas aqui apresentados. Ao Profº Isaltino

Conceição e à MSc Thalma Ariani, do Instituto Butantan, que forneceram o

espaço e auxílio técnico necessários para as dosagens de monoaminas aqui

apresentadas. À Profª Rosana Ribeiro e à Drª Claudenice Santos, pela expertise

e auxílio com as dosagens de peróxidos de lipídios. E finalmente, à Profª

Vanessa Abílio e seu grupo de pesquisa, pelo apoio neste projeto e por me

receberam muito bem em São Paulo.

Por fim, agradeço aos amigos e companheiros de vida, que dividiram bons

e maus momentos dessa jornada, mas que foram sobretudo meu porto seguro

nos momentos de insegurança, dúvida e frustração. Agradeço à Felipe Fiuza,

meu amigo companheiro para todos os momentos, a quem devo a leveza e a

ludicidade do dia-a-dia, assim como as discussões científicas estimulantes. À

Eugênia de Sá Freire, que nesta reta final foi minha companheira, terapeuta,

amiga, e a única capaz de tranquilizar meu coração nos momentos de ansiedade

e cansaço extremos. Seu apoio foi fundamental nesta reta final. À Thamara Melo,

que me acompanhou por uma longa jornada desde o curso de formação REUNI,

por ser uma amiga para todas as horas, em especial para os momentos que

requeriam desabafo, alívio, e uma boa dose de puxão de orelha. Obrigado a

vocês por todo apoio emocional e pessoal que me ofereceram ao longo destes

anos. A vocês reservo um lugar especial e bem protegido lá no fundo do meu

sistema límbico.

Por fim, agradeço às agências e programas de fomento federais e

estaduais CNPq, CAPES, REUNI, FAPERN e FAPESP, que financiaram o

trabalho aqui desenvolvido, e àqueles que viabilizaram todos os experimentos

aqui descritos, aos anônimos animais de experimentação que ofereceram suas

vidas para acrescentar uma pequena peça para a compreensão de uma

patologia que aflinge tantos seres humanos. Que esta tese também sirva de

homenagem e memória ao merecido bem-estar de animais de experimentação.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ............................................................................ i

LISTA DE TABELAS ........................................................................... ii

ABREVIATURAS ................................................................................. iii

RESUMO .............................................................................................. iv

ABSTRACT .......................................................................................... v

1. APRESENTAÇÃO ..................................................................... 1

2. INTRODUÇÃO GERAL ............................................................. 5

3. OBJETIVO GERAL ................................................................... 19

4. CAPÍTULO I .............................................................................. 20

4.1. Introdução ..................................................................... 21

4.2. Objetivos específicos ................................................... 24

4.3. Artigo de revisão ........................................................... 25

Abstract .................................................................... 26

1. Introduction ............................................................... 26

2. Animal models of PD ................................................ 27

3. Motor and nonmotor behavioral impairment in the

reserpine model ………………………………………..

27

4. Pharmacological and predictive quality of the

reserpine model ………………………………………..

28

5. Molecular and neurochemical features of the

reserpine model ………………………………………..

28

6. Final considerations …………………………………... 31

7. References …………………………………………….. 33

5. CAPÍTULO II ……………………………………………………….. 40

5.1. Introdução ………………………………………………..... 41

5.2. Objetivos específicos ……………………………………. 43

5.3. Manuscrito formatado para submissão …………........ 44

Abstract ………………………………………………………… 45

1. Introduction ……………………………………………….. 46

2. Material and Methods ……………………………………. 48

2.1. Animals ………………………………………………. 48

2.2. Drugs and general procedures …………………….. 48

2.3. Experimental design ………………………………… 48

2.4. Motor behavior ………………………………………. 50

2.4.1. Catalepsy test ………………………………………. 50

2.4.2. Spontaneous activity in the open field …………… 50

2.4.3. Oral movements ……………………………………. 50

2.5. TH and α-syn immunohistochemistry ……………… 50

2.6. Immunohistochemistry quantification ……………… 51

2.7. Data analysis ………………………………………… 52

3. Results ……………………………………………………... 53

3.1. Motor behavior ………………………………………. 53

3.1.1. Catalepsy test ………………………………………. 53

3.1.2. Spontaneous locomotion in the open field ………. 53

3.1.2.1. Total Distance Travelled …………………… 53

3.1.2.2. Speed above 0.05 m/s …………………….. 53

3.1.2.3. Time in the center zone ……………………. 54

3.1.3. Oral movements ……………………………………. 56

3.1.3.1. Vacuous chewing …………………………... 56

3.1.3.2. Tongue protrusion ………………………….. 56

3.2. Neurochemistry …………………………………….. 57

3.3. Correlations ………………………………………… 60

4. Discussion ………………………………………………… 61

5. References ………………………………………………… 69

6. CAPÍTULO III ………………………………………………………. 78

6.1. Introdução ……………………………………………... 79

6.2. Objetivos específicos ……………………………….. 82

6.3. Materiais e métodos …………………………………. 83

6.3.1. Animais …………………………………………...…. 83

6.3.2. Drogas ……………………………………..………... 83

6.3.3. Dosagem de dopamina, serotonina e metabólitos

por cromatografia líquida de alta eficiência (high

performance liquid chromatography – HPLC) ...........

83

6.3.4. Ensaio de Peroxidação Lipídica ........................... 84

6.3.5. Teste de catalepsia em barra ............................... 84

6.3.6. Delineamento experimental .................................. 85

6.3.6.1. Experimento I - Efeitos do tratamento

crônico com reserpina (0,1 mg/kg) em ratos

Wistar e SHR .......................................................

85

6.3.6.2. Experimento II - Efeitos do tratamento

agudo com reserpina (1 mg/kg) em ratos Wistar

e SHR ...................................................................

85

6.3.7. Análise estatística ................................................. 86

6.4. Resultados ............................................................... 87

6.4.1. Experimento I - Efeitos do tratamento crônico

com reserpina (0,1 mg/kg) em ratos Wistar e SHR ...

87

6.4.1.1. Dosagem de dopamina, serotonina e

metabólitos por Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (High Performance Liquid

Chromatography – HPLC) ....................................

87

6.4.1.2. Catalepsia em barra ................................... 89

6.4.2. Experimento II - Efeitos do tratamento

agudo com reserpina (1 mg/kg) em ratos Wistar e

SHR ...........................................................................

90

6.4.2.1. Dosagem de dopamina, serotonina e

metabólitos por HPLC ..........................................

90

6.4.2.2. Catalepsia em barra ................................... 93

6.5. Discussão ................................................................. 94

6.6. Conclusão ................................................................ 100

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................... 101

8. REFERÊNCIAS ....................................................................... 105

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação esquemática dos circuitos dos núcleos da

base e alças córtico-subcorticais em indivíduos (A)

saudáveis e com (B) Doença de Parkinson ........................ 8

Figura 2:

Neurochemical and molecular events after reserpine

treatment ……………………………………………………… 32

Figura 3: Motor deficits of repeated low-dose reserpine treatment in

male and female mice ……………………………………….. 33

Figura 4: Schematic representation of the experimental design ……. 49

Figura 5: Effects of repeated administration of 0.1 mg/kg reserpine

on (A) total distance travelled, (B) time in speed above 0.05

m/s, and (C) time in the center zone in the open field test

in Wistar and SHR rats ………………………………………. 55

Figura 6: Effects of repeated administration of 0.1 mg/kg reserpine

on (A) vacuous chewing movements, and (B) tongue

protrusions in oral movement test in Wistar and SHR rats . 57

Figura 7: Effects of repeated administration of 0.1 mg/kg reserpine

on immunostaining for tyrosine hysdroxylase and α-

synuclein in the substantia nigra pars compacta (SNpc)

and dorsal striatum (dSTR) in Wistar and SHR rats ……… 58

Figura 8: Representative photomicrographs of brain coronal

sections of dorsal striatum and substantia nigra of rats

repeatedly treated with vehicle (CTR) or 0.1 mg/kg

reserpine euthanized 48h after last injection (RESt) or 15

days (RESw/d) after the last injection ………………………. 59

Figura 9: Correlation matrix for neurochemical and behavioral

parameters in WIS (upper tier) and SHR (lower tier) rats … 61

Figura 10: Delineamento experimental do Experimento reserpina

crônico (0,1 mg/kg) em ratos Wistar e SHR ........................ 85

Figura 11: Delineamento experimental do Experimento reserpina

agudo (1.0 mg/kg) em ratos Wistar e SHR ......................... 86

Figura 12: Dosagem de dopamina (DA), ácido 3,4-diidroxifenilacético

(DOPAC) e ácido homovanílico (HVA) por HPLC, e

turnover de dopamina [DOPAC+HVA/DA] no estriado de

ratos Wistar (WIS) e SHR tratados com baixas doses de

reserpina (0.1 mg/kg) ......................................................... 88

Figura 13: Dosagem de serotonina (5-HT) e ácido 5-

Hidroxiindoleacético (5HIAA) por HPLC, turnover de

serotonina [5-HIAA/5-HT], e Dosagem de malondialdeído

(MDA) por fluorimetría formado a partir da peroxidação

lipídica no estriado de ratos Wistar (WIS) e SHR tratados

com baixas doses de reserpina (0.1 mg/kg) ........................ 89

Figura 14: Latência para descer da barra no teste de catalepsia em

barra ao longo do tratamento repetido com baixas doses

de reserpina (0.1 mg/kg) ..................................................... 90

Figura 15: Dosagem de dopamina (DA), ácido 3,4-diidroxifenilacético

(DOPAC) e ácido homovanílico (HVA) por HPLC, e

turnover de dopamina [DOPAC+HVA/DA] no estriado de

ratos Wistar (WIS) e SHR tratados com uma dose aguda

de reserpina (1.0 mg/kg) ao longo do intervalo de 96h ...... 92

Figura 16: Dosagem de dopamina (DA), ácido 3,4-diidroxifenilacético

(DOPAC) e ácido homovanílico (HVA) por HPLC, e

turnover de dopamina [DOPAC+HVA/DA] no estriado de

ratos Wistar (WIS) e SHR tratados com uma dose aguda

de reserpina (1.0 mg/kg) ao longo do intervalo de 96h ........ 93

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Predictive validity of reserpine Parkinson’s disease (PD)

model effectiveness for symptomatic treatment of diferente

motor disturbances in PD ……………………………………. 29

Tabela 2:

Monoamine content depletion induced by different

reserpine treatment regimens in rodents …………………… 30

Tabela 3: Molecular changes related to oxidative stress induced by

different reserpine treatment regimens in rodents ………… 31

ABREVIATURAS

5-HIAA Ácido 5-Hidroxiindoleacético

5-HT Serotonina

6-OHDA 6-hidroxidopamina

AADC L-aminoácido aromático descarboxilase

ALDH Aldeído desidrogenase

α-syn α-sinucleína

ANOVA Análise de variância

ATP Trifosfato de adenosina

Bcl-2 (B-cell lymphoma 2)

BLA Amígdala basolateral

CA Catecolamina

CAT Catalase

CEUA Comissão de ética no uso de animais

COMT Catecol-o-metiltransferase

CPF Córtex pré-frontal

CPu Núcleo Caudado-Putamen

CTR Grupo Controle

CTX Córtex

D1 Receptor de dopamina tipo 1

D2 Receptor de dopamina tipo 2

DA Dopamina

DAB Diaminobenzidina

DAT Transportador de dopamina

DOPAC Ácido 3,4-diidroxifenilacético

DOPAL 3,4-dihidroxifenilacetaldeído

DP Doença de Parkinson

dSTR Estriado dorsal

E.P.M. Erro padrão da média

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

GABA Ácido gama-amino-butírico

GLM Modelo Linear Geral

GP Globo pálido

Gpe Globo pálido externo

GPi Globo pálido interno

GPX Glutationa peroxidase

GSH Glutationa reduzida

GSSG Glutationa oxidada

HPA Eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal

HPC Hipocampo

HPLC Cromatografia líquida de alto desempenho

HVA Ácido homovanílico

L-DOPA L-3,4-dihidroxifenilalanina (Levodopa)

LPO Peróxido de Lipídio

MAO Monoamino oxidase

MDA Malondialdeído

MPP+ 1-metilfenilpiridina

MPTP 1-Metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina

mRNA Ácido ribonucleico mensageiro

MSN Medium Spiny Neuron

NA Noradrenalina

NAT Transportador de noradrenalina

NMDA N-Metil-D-Aspartato

NO Óxido Nítrico

PBS Solução tampão fosfato

PCA Ácido perclórico

PD Parkinson's Disease

PFC Córtex pré-frontal

RES Grupo tratado com reserpina

RESt Grupo em tratamento com reserpina

RESw/d Grupo em retirada do tratamento com reserpina

ROD Densitometria óptica relativa

ROS Espécies reativas do oxigênio

S.E.M. Standard error of mean

SDS Dodecil sulfato de sódio

SHR Spontaneously Hypertensive Rat

SN Substantia nigra

SNpc Substantia nigra pars compacta

SNpr Substantia nigra pars reticulada

SOD Superóxido dismutase

STN Núcleo subtalâmico

TBA Ácido tiobarbitúrico

TH Tirosina Hidroxilase

THA Tálamo

TNF Fator de necrose tumoral

VEI Grupo veículo

VMAT2 Transportador vesicular de monoaminas - 2

VTA Área tegmental ventral

WKY Wistar-kyoto

RESUMO

A Doença de Parkinson (DP) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo caracterizado por sintomas motores e não motores relacionado ao envelhecimento que atualmente acomete de 1-2% da população mundial acima dos 60 anos. No Brasil, estima-se que esta acometa aproximadamente 600 mil indivíduos, configurando-se como uma enfermidade de importância para países em processo de incremento da expectativa de vida. A epidemiologia da DP revela fatores de risco intrínsecos e extrínsecos ao paciente que definem a chance de desenvolvimento do distúrbio. Mutações pontuais e polimorfismos com significado funcional são tidos como fatores genéticos predisponentes, enquanto a exposição a pesticidas e toxinas destacam-se como fatores ambientais. No entanto, poucos estudos em modelos animais focam em investigar a interação entre estes fatores. Isto pode ser alcançado comparando-se os efeitos de substâncias indutoras de parkinsonismo em linhagens de ratos com diferentes contextos genéticos. Recentemente, o tratamento repetido com baixas doses de reserpina – um inibidor irreversível do transportador vesicular de monoaminas (VMAT2) – foi proposto como um modelo progressivo para a DP. Sob este regime de tratamento, roedores apresentam, de forma progressiva, comprometimento motor, cognitivo, e alterações neuroquímicas compatíveis com a fisiopatologia da DP. Em paralelo, comparados a ratos Wistar, animais da linhagem SHR (Spontaneously Hypertensive Rats) são resistentes à indução da discinesia oral pelo tratamento agudo com reserpina e apresentam diversas altarações neuroquímicas nas vias dopaminérgicas de relevância para a DP. Em vista destes achados, nós buscamos avaliar se ratos SHR seriam resistentes aos déficits motores e alterações neuroquímicas quando submetidos ao modelo progressivo para DP induzido por reserpina. Portanto, nós submetemos ratos Wistar e SHR ao tratamento agudo (1 mg/kg) ou repetido (15 injeções de 0,1 mg/kg, em dias alternados) com reserpina e investigamos a progressão dos déficits motores nas tarefas de catalepsia em barra, discinesia oral, e atividade espontânea em campo aberto. Observamos então que, para ambos os regimes de tratamento, animais SHR se mostram resistentes ao prejuízo motor em todas as dimensões motoras avaliadas. Ainda, estas diferenças se manifestaram tanto na latência para o surgimento do comprometimento motor como para a magnitude deste. Estas alterações foram ainda acompanhadas por decréscimo na densidade óptica para a imunomarcação por imunohistoquímica da tirosina hidroxilase (TH) e incremento na de α-sinucleína na via nigro-estriatal de ambas linhagens submetidas ao tratamento com reserpina. Estas alterações neuroquímicas resultantes do tratamento com reserpina também se refletiram nos níveis de monoaminas – dopamina e serotonina – na via nigro-estriatal destes animais. De modo geral, como no comportamento motor, animais SHR apresentaram atraso para a depleção de monoaminas e menor magnitude deste efeito. Em conclusão, os resultados aqui apresentados claramente evidenciam a resiliência de ratos SHR ao modelo progressivo da DP. Estes achados expõem novos alvos potenciais para as diferenças neuroquímicas, moleculares e genéticas na linhagem SHR relevantes para o estudo da susceptibilidade à DP.

ABSTRACT

Parkinson’s disease (PD) is an aging-related progressive neurodegenerative

disorder characterized by motor and non-motor symptoms, which affects 1-2% of

the world population above 60 years old. In Brazil, this approximately 600

thousand people live with this disorder. Thus, PD is an important burden to

countries with increasing life expectancy. The epidemiology of PD highlight

intrinsic and extrinsic risk factors that are stochastic to the development of the

disorder. Predisposing genetic factors comprise punctual mutations and

polymorphisms with functional significance, while exposition to toxins is

emphasizedas environmental factors. Nevertheless, few animal studies focus on

the investigation of the interaction between these factors. Such may be

accomplished by comparing the effects of substances that cause parkinsonism

on rat strains with different genetic backgrounds. Recently, the repeated

treatment with a low-dose of reserpine – an irreversible inhibitor of the vesicular

monoamine transporter (VMAT2) – was suggested as a progressive model of PD.

Rats under this treatment regimen show progressive catalepsy behavior, oral

dyskinesia and spontaneous motor activity decrement. In parallel, compared to

Wistar rats, SHR (Spontaneously Hypertensive Rat) are resistant to acute

reserpine-induced oral dyskinesia. In view of these findings, we aimed to assess

whether SHR would be resistant to repeated reserpine-induced motor and

neurochemical deficits when submitted to the progressive model of PD. Thus, we

submitted Wistar and SHR rats to the acute (1 mg/kg) or repeated (0,1 mg/kg,

15x, every other day) treatment with reserpine and investigated the progression

of motor deficits in the catalepsy bar, oral dyskinesia, and spontaneous activity

on the open field. Our results revealed that, for both treatment regimens, SHR

rats were resistant to the motor impairment for all motor parameters assessed.

Moreover, these differences were detected for both the latency to instauration

and the magnitude of the impairment. The alterations were concomitant to a

decrement in the optical density of tyrosine hydroxylase and an increment in α-

synuclein immunostaining by immunohistochemistryin the nigro-striatal pathway

of both strains submitted to reserpine treatment. These neurochemical alterations

resulted from reserpine treatment also reflected in the levels of monoamines –

dopamine and serotonin – in the nigro-striatal pathway of these animals.

Altogether, similarly to the motor behavior, SHR rats displayed lower magnitude

and a delay to monoamine depletion. In conclusion, the current results clearly

evidence the resilience of SHR to the repeated low-dose reserpine protocol.

These findings uncover new potential underlying neurochemical, molecular and

genetic differences in the SHR strain relevant to the study of susceptibility to PD.

1

1. APRESENTAÇÃO

A Doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa

mais frequente, atrás apenas da Doença de Alzheimer. Sabe-se que atualmente

este distúrbio afeta 1-2% da população mundial acima dos 60 anos (Elbaz et al.,

2002). Por se tratar de um distúrbio progressivo e associado ao envelhecimento,

ela ocorre raramente antes dos 50 anos, apresentando um aumento agudo na

incidência apenas após os 60 anos de idade. Apesar da DP desconhecer fronteiras

raciais, territoriais, de sexo, ou socioeconômicos, esta ocorre com uma maior frequência

em homens e em indivíduos de etnia branca (Eeden, Van Den, 2003). Poucos

estudos fazem uma avaliação adequada da prevalência da DP no Brasil. No

entanto, em um estudo realizado em Bambuí-MG, estimou-se uma prevalência

de 3.3% em indivíduos acima de 65 anos (Barbosa et al., 2006). Ainda, sabe-se

que entre o período de 1960 e 2014 a expectativa de vida do brasileiro aumentou

em 25,4 anos, com indivíduos acima dos 65 anos passando a representar 7,4%

(20.590.597 indivíduos) da população (IBGE, 2010). Podemos então estimar que

a DP afeta aproximadamente 680 mil indivíduos no Brasil, configurando-se como

um importante fardo socioeconômico para países com crescente expectativa de

vida.

Descrições reminiscentes do distúrbio são encontradas em tratados

médicos egípcios, indianos, e chineses que datam de até 1000 A.C. No entanto,

a DP passou a ser estudada, caracterizada e batizada com este nome apenas

em 1887 pelo famoso fisiologista e cientista francês Jean-Martin Charcot (Goetz,

2011). Em seus tratados, Charcot fez a primeira descrição de como dissociar

clinicamente a DP de outros distúrbios motores, como a esclerose múltipla. O

nome foi escolhido em homenagem ao médico inglês James Parkinson, autor de

"Um ensaio sobre a Paralisia Agitante" (Parkinson, 1817), no qual descreve pela

primeira vez a doença na literatura médica moderna e cujo trabalho foi resgatado

por Charcot depois de aproximadamente 70 anos sob esquecimento. De forma

sucinta, Parkinson capturou o quadro clínico da doença em seus transcritos

como “Movimentos tremulosos involuntários, com poder muscular reduzido, em

membros em repouso e mesmo quando apoiados; com a propensão à curvatura

do tronco para frente, e para transpor de um ritmo de caminhada pra corrida:

estando os sentidos e intelectos não prejudicados." (Parkinson, 1817). No

2

entanto, hoje sabe-se que sua sintomatologia envolve disfunções motoras e

alterações cognitivas importantes para a qualidade de vida do paciente (Munhoz

et al., 2015).

O interesse e os esforços de Charcot fundaram o terreno para a

compreensão da fisiopatologia do distúrbio motor por Brissaud em 1895 e

Greenfield e Bosanquet em 1953, que associaram a doença, respectivamente, a

lesões do mesencéfalo e então especificamente à neurodegeneração da

substantia nigra (SN). Em 1951, a dopamina foi descoberta, porém esta não era

capaz de levar a alterações comportamentais por não atravessar a barreira

hemato-encefálica, descobrindo-se então que a L-dopa era capaz de aumentar

os seus níveis no sistema nervoso central. Em seguida, em 1952, a ocorrência

corpúsculos de Lewy na SN - formações histopatológicas resultante do acúmulo

de agregados proteicos descritas pela primeira vez por Frederic Lewy, em 1912

- tornou-se um marco fisiopatológico a DP. Estas formações junto à

neurodegeneração da substância nigra passaram então a integrar o critério

diagnóstico e a definição neurológica da DP. Finalmente, em 1958, demonstrou-

se que a reserpina (bloqueador da captação vesicular de monoaminas) é capaz

de reduzir os níveis encefálicos de dopamina e causar bradicinesia em coelhos;

ambos sendo revertidos por L-DOPA (precursor da dopamina) (Carlsson,

Lindqvist e Magnusson, 1957; Factor e Weiner, 2007). Sendo assim, a reserpina

foi a primeira droga utilizada para a obtenção de um modelo animal da DP,

permitindo o estabelecimento da relação causal entre os níveis de dopamina e o

distúrbio motor, e permitindo a investigação de intervenções farmacológicas para

a DP.

A reserpina é um alcaloide extraído da Rauwolfia serpentine capaz de

depletar o conteúdo de monoaminas no sistema nervoso central e periférico,

levando a efeitos hipotensores relevantes para o tratamento da hipertensão. O

uso clínico da reserpina foi seguido da observação de que pacientes

cronicamente tratados com esta substância desenvolviam letargia, depressão e

discinesias. Posteriormente, a reserpina foi utilizada em roedores para reproduzir

prejuízos motores e não-motores relacionados à DP, e estudar a relação destes

com o dano oxidativo causado pela depleção e metabolismo de catecolaminas.

3

Deste modo, o modelo da reserpina foi útil para esclarecer elementos

importantes da sintomatologia, neuroquímica e farmacologia da DP.

Somando-se à elevada variabilidade sintomatológica, a DP é um distúrbio

com grande suscetibilidade a fatores ambientais (Kim et al., 2005). Estudos

epidemiológicos relacionaram a exposição a agentes ambientais, incluindo

pesticidas, com o aumento no risco de desenvolvimento desta doença (Godeiro

et al., 2010; Langston et al., 1983; Noyce et al., 2012). Com isto se fortaleceu a

hipótese de que a exposição a substâncias químicas poderia produzir morte

seletiva de neurônios dopaminérgicos e contribuir para o desenvolvimento da

DP. Todavia, esta hipótese ainda preconiza uma cascata multifatorial de

interações entre exposição a elementos ambientais deletérios e predisposições

genéticas que contribuem para o estabelecimento do fenótipo parkinsoniano.

A constatação destes fatores epidemiológicos permitiu que diversos

modelos animais que mimetizassem tais exposições ambientais a toxinas

fossem sugeridos como candidatos à investigação dos mecanismos subjacentes

a progressão da DP. Produziu-se então modelos animais de neurodegeneração

com toxinas tais como a 6-hidroxidopamina (6-OHDA). 1-Metil-4-fenil-1,2,3,6-

tetrahidropiridina (MPTP), e rotenona (Deumens, Blokland e Prickaerts, 2002;

Duty e Jenner, 2011; Panov et al., 2005; Yazdani et al., 2006). No entanto, nossa

compreensão a respeito destas interações permanece ainda em estágios inciais.

Sabe-se, por exemplo, que a superexpressão através de vetores virais ou a

expressão de α-sinucleína mutada (E46K) exacerba a toxicidade e degeneração

induzida pelo tratamento sistêmico com rotenona (Mukcahy, 2012, 2013; Cannon

2013). O mesmo é válido para modelos em animais não-mamíferos, como na

Drosophila melanogaster (Varga et al. 2014). Ainda, a neuroinflamação parece

ser um fator externo importante, uma vez que a administração de

lipopolissacarído em camundongos com mutação na α-sinucleína produziu

efeitos sinérgicos sobre a neurodegeneração dopaminérgica (Gao et a. 2011).

Por outro lado, knockout para os genes LRRK2 e Parkina em camundongos não

conferiu maior sensibilidade à toxicidade do MPTP (MacLeod, 2006; Aguiar Jr.,

2013), enquanto o knockout para α-sinucleína e o gene 5-LOX – envolvido na

cascata de síntese de leucotrienos e amplificação da resposta inflamatória –

conferiu proteção à 6-OHDA e MPTP, respectivamente (Alvarez et al, 2008;

4

Chou et al., 2014). Portanto, todos estes estudos adincionam informação

importante sobre a interação gene-ambiente presente na DP.

No entanto, estes estudos focaram-se na expressão de um único gene,

que exclui a possibilidade de interações gênicas de importância para a DP. Por

exemplo, a susceptibilidade à morte neuronal pelo tratamento com MPTP estaria

associada a alelos autossômicos dominantes da linhagem C57BL/J6 de

camundongos, um achado importante para situar a importância do contexto

genético da espécie e linhagem para a produção da neurodegeneração (Hamre

et al., 1999).Em ratos, por sua vez, foi descrito que a linhagem de ratos

espontaneamente hipertensos (spontaneously hypertensive rats – SHR) é

resistente à discinesia oral induzida pelo tratamento com reserpina quando

comparados a ratos da linhagem Wistar. Estes achados foram relacionados com

diferenças celulares importantes para o sistema de proteção contra o estresse

oxidativo entre estas linhagens (Abílio et al., 2004; Queiroz, Piovezan e Frussa-

Filho, 1998).

Em síntese, a utilização do modelo crônico progressivo de DP induzido

por reserpina recentemente proposto por Fernandes et al. (2012) em animais de

diferentes linhagens (Wistar e SHR) servirá para elucidar a importância de

diferentes perfis genéticos, neuroquímicos e comportamentais para a

predisposição às alterações motoras induzidas pela exposição a substâncias

indutoras de parkinsonismo. A identificação das etapas celulares que conferem

esta resistência será futuramente útil para a prospecção de drogas candidatas

que modulem a atividade destas vias com o objetivo de conferir proteção contra

a progressão da DP.

5

2. INTRODUÇÃO GERAL

A doença de Parkinson (DP) é a doença neurodegenerativa com a

segunda maior prevalência mundial, estimada a afetar 1-2% da população

mundial acima dos 60 anos (Elbaz et al., 2002).. Dependendo do local de estudo,

a sua taxa de incidência anual varia de 110 a 330 por 100,000 indivíduos acima

dos 50 anos, aumentando para 400 a 500 depois dos 80 anos (Bower et al.,

1999). Sabe-se, porém, que a DP acomete com maior frequência homens,

quando comparados a mulheres, e indivíduos de etnia branca (Eeden, Van Den,

2003). Evidências epidemiológicas como estas apontam para a importância de

aspectos genéticos populacionais importantes para a incidência desta doença.

Estas estatísticas, portanto, definem a DP como um importante fardo

socioeconômico para países com crescente expectativa de vida.

A doença foi batizada com este nome pelo famoso fisiologista e cientista

francês Jean-Martin Charcot (Goetz, 2011). O nome foi escolhido em

homenagem ao médico inglês James Parkinson, autor de "Um ensaio sobre a

Paralisia Agitante" (Parkinson, 1817), que descreve pela primeira vez a doença

na literatura médica moderna. Entretanto, descrições semelhantes do distúrbio

são encontradas em tratados médicos egípcios, indianos e chineses que datam

de 1000 A.C. (Ruiz, 2004). Como descrito e caracterizado por Charcot, o

diagnóstico da DP é orientado pelos sinais motores que compreendem fraqueza

muscular, instabilidade postural, tremores em repouso e bradicinesia (Duty e

Jenner, 2011; Klockgether, 2004). No entanto, ainda que pouco destacadas,

alterações cognitivas também são descritas, compreendendo sintomas de

ansiedade, apatia, depressão, perda progressiva de memória e/ou demência

(Barone, 2011; Bowers et al., 2006; Ishihara e Brayne, 2006; Klockgether, 2004;

Schneider et al., 2003; Voon, Mehta e Hallett, 2011). Além destas, ainda pode-

se destacar distúrbios relacionados ao sono, tais como insônias (Comella, 2003;

Gómez-Esteban et al., 2011; Monderer e Thorpy, 2009), presença de tônus

muscular durante a fase de REM (rapid eye movement) e aumento da latência

para o sono (Medeiros et al., 2007), e anosmia ou hiposmia (Munhoz et al.,

2015).

6

A presença de déficits cognitivos é uma complicação não motora comum

na DP, e frequentemente compõe uma condição incapacitante para os

pacientes. Similarmente aos sinais motores, as características dos déficits

cognitivos na DP podem ser bastante variáveis, tanto em termos dos domínios

cognitivos prejudicados, como na ocasião de início e progressão (Klockgether,

2004; Watson e Leverenz, 2010). A DP com demência apresenta uma

prevalência de aproximadamente 30% e um risco ao longo da vida de 80%

(Aarsland, Zaccai e Brayne, 2005; Aarsland et al., 2003), enquanto que a

depressão se apresenta em comorbidade em 30-40% dos casos de DP (Barone,

2011). Do mesmo modo, estes déficits podem se apresentar em qualquer estágio

da doença, incluindo nas fases pré-motoras da DP (Mehndiratta, Garg e Pandey,

2011). Tais alterações cognitivas podem estar associadas ao fato de que áreas

envolvidas com cognição também recebem projeções dopaminérgicas (Ferro et

al., 2005; Salgado-Pineda et al., 2005; Tadaiesky et al., 2008), as quais,

conforme descrito a seguir, estão diretamente envolvidas com a fisiopatologia da

doença.

As alterações motoras são uma consequência da perda neuronal na

substância nigra pars compacta (SNpc) (Klockgether, 2004), que origina a

principal projeção dopaminérgica para os núcleos da base reguladores da

motricidade (Lotharius e Brundin, 2002). A morte desses neurônios está

associada com o surgimento de inclusões proteicas intracelulares ricas em α-

sinucleína e positivas para ubiquitina denominadas de corpos de Lewy

(Lotharius e Brundin, 2002; Mcnaught et al., 2001). Paralelamente, parte dos

déficits não motores supracitados ocorrem por dano a neurônios em outros

núcleos dopaminérgicos, como a área tegumentar ventral (VTA) – que projeta

para áreas límbicas e o córtex pré-frontal (Uhl, Hedreen e Price, 1985) – bem

como de outras neurotransmissões, como núcleos de neurônios serotonérgicos,

noradrenérgicos e colinérgicos (Tredici, Del e Braak, 2012; Uhl, Hedreen e Price,

1985). Não obstante, as manifestações motoras na DP tornam-se notórias

apenas quando há uma perda substancial (50-80%) dos neurônios

dopaminérgicos da SNpc (Gao e Hong, 2011; Hornykiewicz, 1998; Tissingh et

al., 1998). Estes, por sua vez, são a principal fonte tônica de dopamina (DA) ao

7

estriado, o núcleo de entrada em um sistema de alças cortico-subcorticais para

a regulação do programa motor denominado de núcleos da base.

As conexões intrínsecas dos núcleos da base foram elucidadas nos anos

80 e início dos anos 90, com a formulação do modelo das vias “direta” e “indireta”

(Alexander, Crutcher e DeLong, 1990; Wichmann et al., 2011). Neste modelo o

estriado e o núcleo subtalâmico (STN) recebem aferências do córtex cerebral,

enquanto o segmento interno do globo pálido (GPi) e a substância nigra pars

reticulada (SNpr) fornecem projeções para o tálamo e tronco encefálico (DeLong

e Wichmann, 2007). Os núcleos da base funcionam, portanto, como uma alça

córtico-subcortical para a focalização e mensuração da saída motora cortical.

Estas, por sua vez, são originadas a partir de diferentes populações de neurônios

estriatais (MSN – Medium Spiny Neurons) cuja atividade é diferencialmente

modulada pela DA. A via direta é uma projeção inibitória monossináptica

(GABAérgica) entre os MSNs - que contem receptores tipo D1 acoplados à

proteína G estimulatória - e neurônios GPi/SNpr. A via indireta, por sua vez, é

uma conexão polissináptica também GABAérgica, mas que por envolver duas

projeções inibitórias em série, produz efeito líquido estimulatório sobre o

GPi/SNpr. Brevemente, esta via se origina a partir de MSNs que expressam

receptores tipo D2 - acoplado à proteína G inibitória - para neurônios no

segmento externo do globo pálido (GPe), e projeções inibitórias subsequentes

entre GPe e GPi/SNpr, tanto diretamente quanto via núcleo subtalâmico (STN)

(Figura 1A). Finalmente, uma terceira via que pode ter um papel substancial no

controle dos núcleos da base é a denominada via hiperdireta, que inclui

conexões cortico-subtalâmicas. A ativação desta via resultaria no aumento da

atividade dos núcleos de saída (GPi/SNpr), levando a um tônus inibitório

aumentado sobre as vias tálamo-corticais. Ainda que estas ações estejam em

acordo com aquelas da via indireta, esta é considerada muito mais rápida que a

via indireta por contornar o processamento relativamente lento que ocorre no

estriado e GPe (Figura 1A) (DeLong e Wichmann, 2007; Rouse et al., 2001;

Wichmann et al., 2011).

8

Figura 1. Representação esquemática dos circuitos dos núcleos da base e alças córtico-subcorticais em indivíduos (A) saudáveis e com (B) Doença de Parkinson. Setas em vermelho representam projeções inibitórias, enquanto setas em verde projeções excitatórias. Figura adaptada de DeLong e Wichmann (2007), e Rouse et al. (2001). GP: globo pálido; GPi: globo pálido interno; GPe: globo pálido externo; STN: núcleo subtalâmico; SNpc: substância nigra pars compacta; SNpr: substância nigra pars reticulada.

De modo geral, a saída tônica inibitória deste circuito, originada no GPi e

SNpr, é capaz de regular a quantidade total de movimento. Portanto, uma

acentuação na atividade de resposta dos núcleos da base resultaria em redução

do movimento através da inibição dos neurônios de projeção tálamo-corticais,

enquanto a saída reduzida destes produziria aumento do movimento por

desinibição tálamo-cortical (DeLong e Wichmann, 2007; Wichmann et al., 2011).

Sendo assim, a presença das vias direta, indireta, e hiperdireta nos núcleos da

base podem ser traduzidas em consequências funcionais de importância para a

regulação da saída motora.

Tem-se proposto que a ação combinada da informação das vias direta e

indireta permite a mensuração e/ou focalização de movimentos. Por exemplo,

para alcançar a iniciação e o encerramento de um programa motor, a saída

estriatal a princípio inibiria populações neuronais específicas no GPi e SNpr

através da via direta, facilitando deste modo o movimento. Em seguida, a via

direta atuaria por desinibição dos mesmos neurônios de saída do GPi e SNpr,

resultando na terminação do movimento em execução. Em um modelo

alternativo que focaliza o programa motor, a inibição de neurônios palidais e

9

nigras relevantes através da via direta permitiria a iniciação do movimento

desejado, enquanto movimentos indesejados seriam suprimidos por aumento

concomitante da entrada excitatória para outros neurônios da GPi e SNpr pela

via indireta. Sendo assim, o equilíbrio entre as vias direta e indireta regulado pela

ação diferencial da DA fornecida pela SNpc em MSNs estriatais (DeLong e

Wichmann, 2007). Este modelo está de acordo com o proposto por Da Cunha et

al. (2009), que sugere que diferentes populações de neurônios do estriado

atuariam para selecionar a execução de programas motores corticais a partir de

estímulos que suscitam a resposta motora. Sendo assim, seria necessário a

seleção seguida de inibição e desinibição em paralelo dos diferentes programas

motores corticais. Portanto, a diminuição do tônus dopaminérgico em porções

motoras do putâmen na DP resulta em alterações funcionais compatíveis com a

modelo proposto acima. O efeito global da redução de DA no estriado é,

respectivamente, o aumento e a diminuição da atividade na via indireta e na via

direta, que ampliam o tônus inibitório sobre as projeções tálamos-corticais

reprimindo o programa motor e dificultando a iniciação do movimento (Figura 1B)

(Blandini et al., 2000; DeLong e Wichmann, 2007; Rouse et al., 2001).

Avançando além das implicações funcionais resultantes da perda de

neurônios na SNpc, a biologia molecular e genética elucidaram mecanismos

celulares de importância para a instauração da DP. Estes atribuem 5-10% dos

casos de DP à herança genética familiar, subsequentemente permitindo a

identificação de genes que orientam formas familiares raras da doença (Wood-

Kaczmar, Gandhi e Wood, 2006). Esta abordagem permitiu a identificação de

genes envolvidos em vias celulares implicadas na função sináptica (SNCA: α-

sinucleína); degradação proteica através do sistema ubiquitina-proteasoma

(Parkin e UCHL1); cadeia respiratória (PINK1); fosforilação proteica (LRRK2); e

resposta ao estresse oxidativo (DJ-1) (Wood-Kaczmar, Gandhi e Wood, 2006).

Associado a estas descrições, histórico de ansiedade e depressão, exposição a

pesticidas, vida rural, traumas cranianos, e consumo de água de poço são

frequentemente descritos como fatores de risco para o desenvolvimento do

distúrbio. (Godeiro et al., 2010; Noyce et al., 2012).

Em síntese, ainda que caracterizados separadamente, os dados

experimentais obtidos de estudos que investigam tanto a DP hereditária como

10

esporádica apontam para o metabolismo mitocondrial, estresse oxidativo,

sinalização, conformação e degradação proteica defeituosa através do sistema

ubiquitina-proteassoma como as vias finais para a degeneração dopaminérgica

(Beal, 2001; Gao & Hong, 2011; Kim et al., 2005; Lotharius & Brundin, 2002).

Finalmente, o acúmulo de proteínas defeituosas resultantes destes processos

gera agregados proteicos que definem a histopatologia da DP – constituídos

sobretudo por α-sinucleína, parkina e ubiquitina (Venderova e Park, 2012) – e

morte neuronal. Portanto, a patogênese da DP está fundamentalmente

relacionada à geração de substâncias oxidantes e acúmulo de proteínas

defeituosas. Achados como estes sugerem que exista uma interação entre

fatores intrínsecos (genéticos) e extrínsecos (ambientais) ao paciente que se

somam de forma estocástica para a expressão da doença (Kim et al., 2005).

Sendo assim, o tratamento farmacológico clínico utilizado em pacientes

portadores da DP buscar reverter as alterações funcionais decorrentes da perda

de projeções dopaminérgicas. No entanto, ainda é necessário estabelecer uma

intervenção terapêutica capazde reduzir e/ou retardar a progressão da

neurodegeneração instalada. Dentre os tratamentos sintomatológicos –

buscando a reversão dos prejuízos funcionais aos núcleos da base – podemos

destacar a administração de 3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), um precursor da

DA que promove controle das alterações motoras por aumento da

disponibilidade de DA nos neurônios DAérgicos remanescentes (Pezzoli e Zini,

2010). No entanto, outras abordagens complementares também são utilizadas,

como: inibidores da monoamino oxidase-B (MAO-B); antagonistas de receptores

colinérgicos; agonistas dopaminérgicos; inibidores da catecol-o-metiltransferase

(COMT), como tolcapona e entacapona (Canesi et al., 2008); e amantadina, que

ainda não possui seu mecanismo de ação bem estabelecido, mas que pode ter

suas ações terapêuticas pelo antagonismo do receptor N-Metil-D-Aspartato

(NMDA) (Chaná, 2009; Duty e Jenner, 2011; Ferger et al., 2010; Gottwald e

Aminoff, 2011), reversão dos transportadores de recaptação de noradrenalina

(Sommerauer et al., 2012), potencialização da transmissão GABA (Bido, Marti e

Morari, 2011) e bloqueio da recaptação de serotonina (Paquette et al., 2012).

Apesar dos pacientes apresentarem melhora em sintomas clínicos específicos

apenas com a L-DOPA, é muito comum a combinação de alguns destes

11

tratamentos buscando compreender a diversidade dos sintomas motores e não

motores, assim como reduzir ou minimizar efeitos colaterais da L-DOPA.

Contudo, embora tais tratamentos sejam eficazes em controlar inicialmente os

sintomas, nenhum deles é capaz de deter a progressão da enfermidade (Chaná,

2009), sendo inclusive, no caso da L-DOPA, supostamente tóxicos para os

neurônios dopaminérgicos remanescentes e possivelmente contribuindo para

progressão da doença. No entanto, esta ação ainda não é definitiva, sendo tópico

de profundo debate na literatura por falta de evidências em modelos in-vivo e

estudos clínicos, e com estudos in-vitro sugerindo tanto neuroproteção quanto

toxicidade dopaminérgica a depender da metodologia empregada (Lipski et al.,

2011).

Alternativas para o tratamento da DP têm sido sugeridas e desenvolvidas

com base nos últimos achados em biologia celular e molecular da DP. Estas

novas estratégias incluem a busca por drogas neuroprotetoras ou intervenções

que sejam capazes de impedir a progressão da doença e reverter os déficits

celulares presentes. Dentre os tratamentos candidatos podem-se destacar

inibidores da MAO-B, antioxidantes, fatores tróficos, terapia genética e celular, e

antidiabéticos neuroprotetores, como a pioglitazona (Duty e Jenner, 2011; Kim

et al., 2005; Ulusoy et al., 2011). Neste contexto, novas abordagens para

produzir modelos animais progressivos da DP que reflitam a evolução da

patologia de forma mais aproximada à doença humana se tornam necessárias

para a avaliação do potencial terapêutico de novas estratégias farmacológicas

(Duty e Jenner, 2011). Além disso, estes mesmos modelos também serviriam de

alicerce para a melhor compreensão da fisiopatologia da DP, em especial dos

casos idiopáticos (Sonsalla, Zeevalk e German, 2008).

Com efeito, os modelos animais de doenças neuropsiquiátricas surgiram

com o objetivo de auxiliar a busca de fármacos com ação terapêutica de uma

determinada neuropatologia, mesmo quando os mecanismos fisiopatológicos

fossem pouco compreendidos. Para a DP existe uma grande variedade de

modelos animais, compreendendo desde roedores (Meredith, Sonsalla e

Chesselet, 2008; Sonsalla, Zeevalk e German, 2008) a primatas não-humanos

(Emborg, 2007; Li et al., 2014). Esses modelos contribuíram e ainda contribuem

para o desenvolvimento de técnicas e uso de fármacos para a melhoria da

12

qualidade de vida do portador de DP, sendo, no cenário atual, excelentes

ferramentas de investigação.

Contudo, como sugerido por Paul Willner (1984), estes estudos devem ser

classificados por critérios hierárquicos conforme o tipo de validade que

apresentam. Em ordem crescente são eles: a validade preditiva, em que as

manipulações farmacológicas – especialmente as terapêuticas, que

sabidamente influem na doença – devem ter efeito similar no modelo; a validade

de face, que requer isomorfismo sintomático entre a doença e o modelo; e a

validade de constructo, que requer a existência de constructos teóricos que

relacionem o modelo à fisiopatologia da doença. Neste sentido, ainda não foi

produzido nenhum modelo animal da DP que atenda todos os critérios de

validação, tornando-se necessário a busca por novos delineamentos que

reproduzam a multiplicidade de aspectos da DP. Atualmente, para a produção

de modelos animais da DP em roedores, em geral, duas abordagens são

adotadas: modelos que utilizam fármacos e/ou toxinas para reproduzir a

neurodegeneração e/ou depleção dopaminérgica observada na DP (Duty e

Jenner, 2011; Meredith, Sonsalla e Chesselet, 2008); e modelos que utilizam

técnicas moleculares e genéticas para alterar a expressão de um determinado

gene envolvido na DP (Dawson et al., 2010; Maries et al., 2003). Não obstante,

conforme anteriormente exposto, poucos estudos buscam estudar a interação

entre exposição a toxinas e fatores ambientais ao perfil genético do animal.

Uma das substâncias utilizadas no estudo da DP é a reserpina, um

alcaloide inibidor do transportador vesicular de monoaminas (VMAT2) extraído

da Rauwolfia serpentine capaz de depletar o conteúdo de monoaminas no

sistema nervoso central e desencadear efeitos hipotensores importantes. No

entanto, o uso clínico da reserpina foi seguido da observação de que pacientes

cronicamente tratados com esta substância desenvolviam letargia, depressão e

discinesia. Posteriormente, a reserpina foi utilizada em roedores para reproduzir

prejuízos motores e não-motores relacionados à DP, e estudar a relação destes

com o dano oxidativo causado pela depleção e metabolismo de catecolaminas

(Kim et al., 1999; Silva et al., 2002; Skalisz et al., 2002). Deste modo, o modelo

da reserpina resume elementos importantes da sintomatologia, neuroquímica e

farmacologia da DP.

13

Assim como a maioria dos modelos tóxico-farmacológicos da DP, estudos

com reserpina primeiramente utilizaram a administração aguda de uma dose alta

da substância, induzindo prontamente um comprometimento motor severo

(Baskin e Salamone, 1993; Salamone e Baskin, 1996; Steinpreis e Salamone,

1993), diferente do que ocorre ao longo da progressão da patologia em

humanos. Porém, recentemente, estudos de nosso laboratório propuseram a

administração crônica de reserpina em pequenas doses como um modelo sólido

para a produção do fenótipo parkinsoniano (Fernandes et al., 2012; Santos et

al., 2013). Até então, o tratamento repetido com baixas doses repetidas de

reserpina (Fernandes et al., 2012; Santos et al., 2013) mostrou-se capaz de

produzir déficits motores progressivos, sintomas não motores, dano oxidativo a

lipídios de membrana, depleção de monoaminas e redução na imunoreatividade

para tirosina hidroxilase (TH). Tais fatores sugeriram fortemente a validade de

face e constructo desse modelo frente à fisiopatologia da DP TH.De fato, dados

mais recentes de nosso grupo de pesquisa sugerem que tal modelo é também

útil para o estudo de novas abordagens terapêuticas que retardem a progressão

da manifestação sintomatológica da patologia, como intervenções ambientais e

agentes neuroprotetores (Brandão, 2015; Campêlo, 2013; Sarmento-Silva et al.,

2015). Estes aspectos relativos ao modelo da DP induzido por reserpina serão

explorados com maior escrutíneo no capítulo I desta tese.

Apesar da administração repetida com reserpina causar

comprometimento da função neuronal dopaminérgica na via nigro-estriatal , os

prejuízos motores produzidos por esse protocolo (com a duração de tratamento

e dose até agora testadas) são parcialmente revertidos quando a administração

é interrompida (Santos et al., 2013). Nesse sentido, o processo de recuperação

dos prejuízos motores após a interrupção do tratamento torna-se também um

alvo interessante para o estudo de possíveis intervenções terapêuticas, bem

como a investigaçãode possíveis mecanismos de adaptação plástica dos

sistemas envolvidos na DP. Por outro lado, torna-se também interessante

complementar os estudos com a administração repetida (em baixas doses) de

substâncias que induzam um comprometimento motor gradativo, porém

permanente, tal qual a patologia em humanos. Tal perfil vem sendo abordado

14

com o uso de neurotoxinas, como a 6-hidroxidopamina (6-OHDA) e o 1-metil-4-

fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP).

A 6-OHDA é um análogo hidroxilado da DA que possui uma alta afinidade

por neurônios catecolaminérgicos, que resulta de sua recaptação preferencial

por moléculas transportadoras de DA e noradrenalina (NA). No interior dessas

células, a 6-OHDA reduz a atividade de antioxidantes endógenos, como

glutationa (GSH) e superóxido dismutase (SOD), e inibe o complexo I da cadeia

respiratória, aumentando o estresse oxidativo celular e induzindo reações de

oxidação (Schober, 2004). Após a administração da 6-OHDA observam-se

alterações motoras semelhantes às apresentadas na DP (Crofts et al., 2001;

Roeling et al., 1995; Soares-da-Silva e Azevedo, 1988). Como esta toxina é

incapaz de atravessar a barreira hematoencefálica, sua administração deve

ocorrer diretamente no sistema nervoso central. Curiosamente, a 6-OHDA

endógena é encontrada como um metabólito acumulado na urina de pacientes

que sofrem de DP (Andrew et al., 1993). Recentemente, nosso grupo avaliou os

efeitos do tratamento repetido com 6-OHDA em concentrações menores que as

usuais (10µg/µl). Neste regime de administração, foram observados

comprometimento neuronal dopaminérgico associado a uma alteração motora

progressiva, a qual foi precedida por déficits cognitivos (Santos, 2012), conforme

também observado por outros grupos (Matheus et al., 2015, 2016). Ainda, as

alterações neuronais e motoras não foram recuperadas com a interrupção do

tratamento, sugerindo que o protocolo com 6-OHDA pode ser útil para a

investigação de alterações irreversíveis na DP.

Outra toxina frequentemente utilizada é a MPTP, que apresenta ação

seletiva em neurônios dopaminérgicos. O MPTP foi descoberto em uma tentativa

malsucedida de sintetizar heroína em laboratório, que acabou por produzi-la

acidentalmente com o contaminante MPTP. Os indivíduos que se administraram

a substância passaram então a apresentar sintomas da DP três dias após o

contato com a droga. Em 1983, um grupo de jovens também fez uso dessa

droga, ocasionando sintomas semelhantes aos apresentados por portadores da

DP (Langston et al., 1983).

15

Por ser altamente lipossolúvel, a MPTP atravessa facilmente a barreira

hematoencefálica e em células gliais é oxidada à 1-metilfenilpiridina (MPP+) pela

MAO-B. O MPP+ possui grande afinidade pelo transportador de DA, sendo

facilmente conduzido ao interior de neurônios dopaminérgicos, nos quais inibirá

o complexo I da cadeia respiratória mitocondrial, interrompendo assim a cadeia

respiratória (Abou-Sleiman, Muqit e Wood, 2006). Esse processo impede a

produção de ATP, acarretando a elevação do nível de concentração de cálcio e

a liberação de radicais livres que resultará em processos apoptóticos (Hasegawa

et al., 1990; Sriram et al., 1997). Em relação aos demais modelos

farmacológicos, o uso da MPTP é o mais específico porque atua apenas em

neurônios dopaminérgicos (Beal, 2001). Entretanto, seu alto grau de toxicidade,

inclusive para o experimentador, é um importante fator limitante no seu uso em

modelos experimentais. Deste modo, os protocolos que empregam o MPTP em

ratos frequentemente utilizam a administração intracerebral, em vez de

sistêmica, para evitar a liberação de metabólitos tóxicos (Bové et al., 2005) e

também por resultarem em menor toxicidade dopaminérgica quando

administrado de forma sistêmica nesta espécie (Kalaria, Mitchell e Harik,

1987).Por fim, quando a MPTP foi descrita como substância capaz de produzir

degeneração do trato nigro-estriatal através de sua ação sobre o complexo I

mitocondrial, vários pesquisadores foram impulsionados a procurar outras

toxinas com ação mitocondrial que pudessem ser utilizadas como modelo da DP.

A partir disso foi descoberta a rotenona, o paraquat e o maneb, que atuam

inibindo o complexo I e III da cadeia respiratória (Duty e Jenner, 2011). Destes,

a rotenona é o mais amplamente utilizado por produzir lesões dopaminérgicas,

serotoninérgicas e colinérgicas nigro-estriatais, assim como lesões

noradrenérgicas no locus coeruleus (Höglinger et al., 2003) associadas a

prejuízos motores (Betarbet et al., 2000; Cannon et al., 2009; Sherer et al., 2003).

Diferentemente de todos os demais modelos com toxinas, as lesões induzidas

por essa substâncias na SNpc de ratos são acompanhadas por inclusões

citoplasmáticas pálidas e positivas à α-sinucleína e à ubiquitina, que lembram as

formações de corpos de Lewy descritas em cérebros de pacientes com a DP

(Betarbet et al., 2000; Sherer et al., 2003).

16

Genes associados a formas raras de DP hereditário e os processos

regulados por estes são alvos terapêuticos potenciais. Desta forma, a

manipulação genética dos sistemas celulares em animais representa uma

abordagem para a produção de um modelo animal que permita a avaliação de

tratamentos ou intervenções que revertam a atividade celular prejudicada.

Animais com formas mutantes ou superexpressão de genes autossômicos-

dominantes tais como a α-sinucleína e o LRRK2, e knockouts ou knockdown de

genes autossômicos-recessivos como a Parkina, DJ-1 e PINK1 podem ser

utilizados para o estudo da DP, apesar destes modelos representarem apenas

uma porção (5-10%) da população acometida pela doença (Dawson, Ko e

Dawson, 2010; Gao e Hong, 2011).

Uma limitação importante destes modelos é a ausência de degeneração

dos neurônios dopaminérgicos. A superexpressão de α-sinucleína em neurônios

dopaminérgicos (Matsuoka et al., 2001), expressão de α-sinucleína com a região

C-terminal truncada (Wakamatsu et al., 2008) e knockouts dos genes parkina,

PINK1 e DJ-1 (Tohru et al., 2010) são exemplos de tentativas neste âmbito que

não obtiveram sucesso. Contudo, estudos que produziram superexpressão de

α-sinucleína utilizando vetores virais em ratos e primatas não-humanos foram

capazes de desencadear tal neurodegeneração (Bianco et al., 2002; Kirik et al.,

2003).

Tais resultados controversos levantam questões quanto aos mecanismos

que tornam os neurônios dopaminérgicos sensíveis à superexpressão de α-

sinucleína por vetor viral, mas não em abordagens transgênicas. Possíveis

explicações envolvem a presença de fatores de resistência intrínsecos aos

neurônios dopaminérgicos de camundongos à superexpressão de α-sinucleína,

ou o contexto genético da espécie como requisito para tornar os neurônios

dopaminérgicos sensíveis às propriedades tóxicas da superexpressão (Dawson,

Ko e Dawson, 2010). Deste modo, a investigação de diferentes susceptibilidades

para indução do parkinsonismo em linhagens de roedores poderia ajudar a

esclarecer como o perfil genético destas contribuiria para a manifestação das

alterações motoras. Diferente dos estudos que utilizam animais transgênicos ou

vetores virais, a relação de variações naturais entre as linhagens - assim como

o efeito global destas variações - poderia representar melhor a diversidade

17

multigênica da doença em humanos. Portanto, abordagens como esta ajudariam

a esclarecer como fármacos e/ou toxinas podem interagir com o perfil molecular

e genético de uma determinada linhagem para culminar na manifestação das

alterações motoras.

Sabe-se, ainda, que diferentes linhagens de camundongos apresentam

susceptibilidades diferentes à lesão dopaminérgica por MPTP. Logo observou-

se que esta resistência está associada a alelos autossômicos da linhagem

C57BL/J6 (Hamre et al., 1999). Nesse contexto, a expressão de α-sinucleína na

SNpc através de um vetor viral torna ratos sensíveis à rotenona, outra toxina

ambiental que atua sobre a cadeia respiratória (Mulcahy et al., 2013). Deste

modo, torna-se evidente que a interação entre fatores genéticos e exposições a

toxinas podem se mostrar determinantes para a expressão dos déficits motores

e alterações celulares característicos da DP.

Consoante ao exposto anteriormente, por apresentarem algumas

diferenças intrínsecas relacionadas à transmissão dopaminérgica, ratos da

linhagem SHR (Spontaneously Hypertensive Rat) tem sido empregados para o

estudo de doenças relacionadas a alterações dopaminérgicas, como transtorno

do déficit de atenção e hiperatividade e a esquizofrenia (Calzavara et al., 2009;

Viggiano, Vallone e Sadile, 2004). Deste modo, ratos SHR adultos apresentam

maior quantidade de receptores para dopamina D1 e DAT no estriado

(Watanabe, Yoshiyuki et al., 1997), mas função reduzida deste último (Russell,

2003). Ainda, estes apresentam expressão reduzida de TH no córtex pré-frontal

(King et al., 2000) dentre outras alterações (para revisão, ver Viggiano et al,

2004). No entanto, deve-se destacar que os estudos supracitados foram

conduzidos pela comparação com a linhagem normotensa controle para o SHR,

o Wistar-Kyoto (WKY). Ainda que esta seja a linhagem apropriada como controle

para estudos de hipertensão inata, o WKY apresenta desregulação do eixo

hipotalâmico-pituitário-adrenal (HPA) e resposta exacerbada ao estresse. Sendo

assim, as individualidades comportamentais do WKY compreendem aumento de

imobilidade no teste de natação forçada, atividade reduzida no campo aberto, e

pior desempenho na tarefa de enterramento defensivo em comparação a outras

linhagens (Will, Aird e Redei, 2003). Portanto, o WKY passou a ser proposto como

um bom modelo para depressão, e a sua validade como controle para estudos

18

neuroquímicos de implicação comportamental para SHR passou a ser

questionada. Sendo assim, outros grupos passaram a empregar a linhagem

heterogênica Wistar como controle para estudos comportamentais com o SHR

(Abílio et al., 2004; Calzavara et al., 2009; Dommett e Rostron, 2013;

Gauthier et al., 2014; Queiroz, Piovezan e Frussa-Filho, 1998). Nestes

estudos já se evidenciou que a linhagem SHR apresenta maior liberação e

metabolização basal de dopamina na região shell do núcleo accumbens

(Santos et al., dados não publicados), e resistência à indução de discinesia oral

por reserpina, associada a um aumento da atividade da catalase, enzima de

proteção oxidativa contra o aumento do peróxido de hidrogênio resultante do

metabolismo de catecolaminas (Abílio et al., 2004; Queiroz, Piovezan e Frussa-

Filho, 1998).

Sendo assim, em vista do exposto, se aspectos genéticos são

importantes para a expressão das alterações comportamentais e

neuroquímicas relacionados à DP, esperamos que diferentes linhagens de

ratos apresentem susceptibilidade diferenciada para a indução destas

alterações por um modelo tóxico-farmacológico da DP. Deste modo, a

comparação para a indução de modelos tóxico-farmacológicos da DP em ratos

Wistar e SHR pode ser útil para a investigação das bases celulares, genéticas

e neuroquímicas de uma possível diferença de susceptibilidade à DP, com

importantes implicações para futuras estratégias preventivas e/ou terapêuticas.

A seguir, apresentaremos a aplicação do modelo progressivo para a DP

induzido pela administração de baixas doses repetidas de reserpina em ratos

Wistar e SHR. Este estudo compreenderá alterações comportamentais e

neuroquímicas de importância para a DP, que serão discutidas em termos de

valor potencial para compreensão da fisiopatologia e/ou intervenção

terapêutica.

19

3. OBJETIVO GERAL

O seguinte trabalho tem o objetivo de avaliar se diferentes linhagens de

ratos (Wistar e SHR) se comportam diferentemente quanto à susceptibilidade

para a indução de alterações comportamentais e neuroquímicas frente a um

modelo progressivo da Doença de Parkinson pela administração de uma dose

baixa de reserpina, capaz de causar depleção de monoaminas e a diminuição

da imunoreatividade para tirosina hidroxilase em áreas cerebrais de interesse

para o estudo da DP. Pretendeu-se, ao longo do tratamento, avaliar o

desenvolvimento dos prejuízos motores nas diferentes linhagens de ratos,

comparando-as para a sua susceptibilidade ao desenvolvimento dos déficits

esperados. Os testes motores aqui empregados buscaram compreender

paradigmas clássicos para a avaliação de diferentes dimensões motoras em

modelos animais de doenças neurodegenerativas. Após as avaliações motoras

os encéfalos destes animais foram destinados a análises neuroquímicas para a

investigação das diferenças celulares intrínsecas e/ou resultantes do tratamento

entre estas linhagens. O produto deste estudo será compilado em três capítulos,

que apresentarão as metodologias e objetivos específicos de cada estudo. Em

resumo, o Capítulo I – “Molecular, Neurochemical, and Behavioral Hallmarks

of Reserpine as a Model for Parkinson’s Disease: New Perspectives to a

Long-Standing Model”, consistirá em um artigo de revisão já publicado que

buscou fornecer um panorama detalhado dos principais achados clássicos e

recentes a respeito do uso da reserpina para o estudo da DP em modelos

animais. Esta revisão também buscou compilar possíveis vias neuroquímicas

pelas quais a reserpina produziria as alterações celulares e comportamentais

evidenciadas. O Capítulo II – “Spontaneously hypertensive rats (SHR) are

resistant to a reserpine-induced progressive model of Parkinson’s disease:

role of tyrosine hydroxylase and α-synuclein expression.”, será apresentado

em forma de manuscrito em formato destinado a publicação. Neste capítulo

comparamos ratos Wistar e SHR sob o tratamento com baixas doses de

reserpina e caracterizamos as alterações motoras e a expressão de tirosina

hidroxilase e α-sinucleína para o tratamento com reserpina nestas linhagens de

ratos. O Capítulo III – “Efeitos do tratamento crônico e agudo com reserpina

sobre parâmetros motores, conteúdo total de monoaminas, e peroxidação

lipídica em ratos Wistar e SHR.”, é uma extensão da caracterização das

alterações neuroquímicas encontradas no Capítulo II. Aqui buscamos ampliar as

bases neuroquímicas para as diferenças comportamentais descritas,

investigando o conteúdo total de monoaminas e seus metabólitos e a produção

de peróxidos de lipídios, um indicador de estresse oxidativo, resultante do

tratamento com reserpina nas linhagens Wistar e SHR.

20

4. CAPÍTULO I

Molecular, Neurochemical, and Behavioral Hallmarks of

Reserpine as a Model for Parkinson’s Disease: New

Perspectives to a Long-Standing Model.

“Man in his arrogance thinks himself a great

work worthy the interposition of a deity. More

humble and I think truer to consider him

created from animals.” Charles Darwin

21

4.1. INTRODUÇÃO

A administração de reserpina – um inibidor do transportador vesicular de

monoaminas (VMAT2) – a roedores foi um dos primeiros modelos animais

utilizados para investigar a fisiopatologia e potenciais tratamentos para a Doença

de Parkinson (DP). A reserpina é um alcaloide extraído da Rauwolfia serpentine,

e foi primeiramente utilizada como uma potente droga anti-hipertensiva por sua

capacidade em depletora de monoaminas (Freis, 1954; McQueen, Doye e Smirk,

1954; Peter et al., 1994). O uso crônico da reserpina para a tratamento da

hipertensão levou à observação de que pacientes cronicamente tratados

desenvolviam letargia, depressão, e discinesias motoras, implicando o sistema

monoaminérgico na patofisiologia de distúrbios motores e afetivos (Freis, 1954;

Kane e Smith, 1982). Por esta razão a reserpina foi utilizada para emular

prejuízos motores e não-motores na DP, assim como a eficiência dos atuais

tratamentos para a DP, tais como L-DOPA e agonistas dopaminérgicos (Baskin

e Salamone, 1993; Carlsson, Lindqvist e Magnusson, 1957; Carlsson e Carlsson,

1989; Colpaert, 1987; Fernagut et al., 2002; Salamone e Baskin, 1996; Skalisz

et al., 2002). No entanto, com a introdução de modelos animais tóxico-

farmacológicos e genéticos da DP, a reserpina passou a ser subutilizada para

este fim sob o argumento de uma suposta ausência de validade de constructo

com a DP (Duty e Jenner, 2011).

Apesar da robusta validade de face e preditiva, este abandono é baseado

nas observações experimentais de que (1) a reserpina não induz

neurodegeneração e agregação de proteínas (Duty e Jenner, 2011; Yadav et al.,

2012); (2) o desempenho motor, conteúdo de monoaminas, e imunoreatividade

para TH são parcialmente restaurados após interrupção do tratamento (Oe,

Tsukamoto e Nagakura, 2010; Santos et al., 2013), e (3) a reserpina é desprovida

de especificidade quanto à neurotransmissão acometida (Arora e Chopra, 2013;

Arora et al., 2011; Liu et al., 2014; Neisewander, Lucki e McGonigle, 1991).

No entanto, uma revisão detalhada da literatura clássica e moderna a

respeito das alterações celulares resultantes do tratamento com reserpina

revelam que esta reproduz elementos chave da neuroquímica e fisiopatologia da

DP. Do modo sucinto, o tratamento com reserpina é capaz de induzir (1)

depleção de monoaminas, (2) estresse oxidativo, (3) neuroinflamação, (4)

22

comprometimento com vias pró-apoptóticas, (5) redução da imunorreatividade

para tirosina hidroxilase, e aumento para α-sinucleína, (6) e supra-regulação de

receptores de DA (Fernandes et al., 2012; Lee et al., 2015; Santos et al., 2013)

(Arora e Chopra, 2013; Arora et al., 2011; El-Ghazaly et al., 2013; Liu et al., 2014;

Neisewander, Castañeda e Davis, 1994; Neisewander, Lucki e McGonigle, 1991;

Traub et al., 1986). Apesar de ainda não haver nenhuma evidência de alguns

elementos importantes da patofisiologia da DP em modelos animais de roedores

– tais como agregação proteica, dano celular permanente, e neurodegeneração

– evidências recentes apontaram para a perda de neurônios dopaminérgicos,

inibição do fluxo-autofágico, e acúmulo de proteínas em vesículas autofágicas

em um modelo animal com Drosophila melanogaster (Lee et al., 2015). Ainda, a

maioria das alterações neuroquímicas induzidas pela reserpina são claramente

reminiscentes da patofisiologia da DP e, portanto, possuem uma semelhança

satisfatória com a fenomenologia da DP.

Por outro lado, evidências experimentais com o tratamento a longo-prazo

com reserpina (1 mg/kg de reserpina em dias alternados por seis semanas)

resultaram em alterações comportamentais e neuroquímicas persistentes – por

exemplo, discinesia oral, depleção de DA, e supra-regulação de receptores D1

e D2 - até 60 dias após interrupção do tratamento (Neisewander, Lucki e

McGonigle, 1991). Portanto, não podemos descartar a possibilidade de algum

nível de dano ou morte celular irreversível após o tratamento com reserpina,

dependendo da dose e/ou duração do tratamento.

Em conformidade com o exposto, camundongos geneticamente

deficientes para o VMAT2 – que expressam apenas 5% de VMAT2 funcional –

apresentam neurodegeneração, seguido de acúmulo de α-sinucleína e redução

da imunoreatividade para o TH e o transportador de tiramina. Este camundongo

deficiente para VMAT2 também apresenta prejuízos motores sensíveis ao

tratamento do L-DOPA, aumento em duas vezes na concentração de DA no

citosol, redução na fosforilação de TH associada com o feedback

catecolaminérgico, 95% de depleção de DA, e aumento do metabolismo

(turnover) de DA (Colebrooke et al., 2006; Mooslehner et al., 2001; Taylor et al.,

2009). Ainda mais, estas alterações são acompanhadas por prejuízos não-

motores, tais como déficit em discriminação olfatória, esvaziamento gástrico

atrasado, alteração da latência para o sono, comportamento tipo ansioso e

23

depressivo dependente da idade (Taylor et al., 2009). Em resumo, todas as

alterações comportamentais e neuroquímicas em camundongos deficientes para

VMAT2 retomam os efeitos do tratamento com reserpina. Como ambos os

modelos são similares em termos de constructo funcional, nós especulamos que

algum nível de neurodegeneração é plausível com o bloqueio a longo-prazo do

VMAT2 com o tratamento com reserpina.

O prospecto exposto das alterações comportamentais, farmacológicas e

neuroquímicas induzidas pela reserpina reafirmam o seu uso como um modelo

valioso e promissor para o estudo da DP. Portanto, a subutilização da reserpina

para investigar elementos da DP deve ser reconsiderada. Ainda, é importante

destacar que o uso da reserpina tem relevância importante para a compreensão

da funcionalidade do VMAT2 na DP em humanos. Como já demonstrado,

polimorfismos em regiões promotoras do gene que aumenta a transcrição deste

transportador são protetores contra a DP (Brighina et al., 2013; Glatt et al., 2006)

e a redução em VMAT2 e o seu mRNA em neurônios nigroestriatais foram

descritos em pacientes acometidas pela DP (Harrington et al., 1996; Miller et al.,

1999). Ainda, o VMAT2 está presente em corpos de Lewy na SN de pacientes

(Yamamoto et al., 2006) e neurônios dopaminérgicos da VTA poupados na DP

carregam níveis maiores de VMAT2 (Miller et al., 1999). Finalmente, o aumento

citoplasmático de DA influencia o estado conformacional da α-sinucleína,

promovendo a estabilização de sua forma patogênica (Follmer et al., 2007; Li et

al., 2005). Portanto, a expressão funcional de VMAT2 é protetora contra a

neurodegeneração dopaminérgica, enquanto o bloqueio a longo prazo pode

representar uma abordagem interessante para a produção de modelos animais

da DP.

Esta revisão se destinará a destacar as novas perspectivas para o

modelo, e argumentar contra o consenso atual para a sua subutilização. Aqui,

nós destacamos achados experimentais que apoiam a validade de face,

preditiva, e de constructo do modelo de DP induzido por reserpina e

argumentamos contra o consenso atual para a sua subutilização. Nós também

focamos em fornecer nova perspectivas sobre o modelo pela discussão dos

principais desafios e potenciais para este modelo.

24

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

A seguinte revisão bibliográfica teve o propósito de reunir os achados

moleculares, neuroquímicos, e comportamentais produzidos pela administração

de reserpina da literatura clássica e moderna. A compilação destas evidências

nos permitiu traçar potenciais vias celulares para a progressão do dano celular,

assim como propor alvos celulares para a investigação de novos agentes

terapêuticos para a DP. Estas evidências foram também discutidas nos termos

de validade preditiva, de face, e constructo de Paul Willner (1984), permitindo a

o delineamento de um paralelo com outros modelos toxico-farmacológicos da

Doença de Parkinson.

25

4.3. ARTIGO DE REVISÃO (DOI: 10.1111/bpa.12253) PUBLICADO NO

PERIÓDICO BRAIN PATHOLOGY (ISSN: 1750-3639).

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5. CAPÍTULO II

Spontaneously hypertensive rats (SHR) are resistant to a

reserpine-induced progressive model of Parkinson’s disease:

role of tyrosine hydroxylase and α-synuclein expression.

“We are storytelling animals, and cannot bear to acknowledge the

ordinariness of our daily lives.” Stephen Jay Gould

41

5.1. INTRODUÇÃO

Conforme anteriormente exposto, a reserpina se mostrou um fármaco útil

para o estudo das alterações neuroquímicas e investigação de tratamentos para

a DP. No entanto, parte substancial dos estudos conduzidos com esta substância

utilizaram regimes agudos de tratamento com doses altas da substância (1,0 à

5,0 mg/kg) (Baskin & Salamone, 1993; Salamone & Baskin, 1996; Steinpreis &

Salamone, 1993), diferente do que ocorre ao longo da progressão desta

patologia em humanos.

Desde modo, nosso grupo de pesquisa têm-se empenhado em um

esforço para a validação da administração repetida de reserpina em pequenas

doses (0,1 mg/kg) como um modelo sólido para a produção do parkinsonismo

em roedores. Neste regime de administração, a reserpina produziu aumento nos

níveis de peroxidação lipídica; diminuição dos níveis de tirosina hidroxilase no

estriado e substância nigra; e um perfil progressivo de comprometimento motor,

antecedido por alterações cognitivas (memória de reconhecimento) (Fernandes

et al., 2012; Santos et al., 2013). Ainda, uma única administração de reserpina

na referida dose também foi capaz de produzir déficits de medo condicionado

(Fernandes et al., 2008). Do mesmo modo, dados recentes de nosso grupo

sugerem que tal modelo também é útil para o estudo de novas abordagens

terapêuticas que retardem a progressão da manifestação sintomatológica da

patologia, como o uso de anti-oxidantes (Sarmento-Silva et al., 2015) e

enriquecimento ambiental (Campêlo, 2013).

Utilizando o protocolo agudo de administração da reserpina, Queiroz et al.

(1998) demonstrou que ratos SHR não desenvolvem a discinesia oral. Essa

alteração motora em ratos modela um distúrbio motor característico do

envelhecimento, tratamento crônico com neurolépticos ou efeito colateral do

tratamento da DP com L-dopa (Jenner, 2008; Steinpreis & Salamone, 1993).

Entretanto, a discinesia também é componente importante da DP (Jicha &

Salamone, 1991; Paillé et al., 2004). Abílio et al. (2004), então, relacionaram

essa resistência dos SHR a um aumento da atividade da catalase nesta linhagem

quando comparada a linhagem Wistar. Paralelamente, anti-oxidantes conferem

proteção contra a discinesia oral induzida por reserpina (Faria et al., 2005). O

42

tratamento repetido com baixas doses de reserpina também é capaz de induzir

um aumento progressivo na discinesia oral em ratos Wistar, que surge associado

a aumento da peroxidação lipídica no estriado (Fernandes et al., 2012).

Como anteriormente discutido, ratos SHR também apresentam diversas

alterações quanto a sua transmissão dopaminérgica (Viggiano, Vallone e Sadile,

2004). Portanto, os efeitos da reserpina sobre esta linhagem pode não estar

somente limitada a diferenças no sistema de proteção contra estresse oxidativo,

mas também quanto a diferenças na resposta farmacológica à depleção de

dopamina.

Portanto, neste trabalho propomos investigar se ratos da linhagem SHR

também se mostrarão resistentes aos efeitos motores do tratamento repetido

com baixas doses de reserpina, conforme estabelecido por Fernandes et al.

(2012). Ainda, também será estudado se diferenças para expressão dos

prejuízos motores e cognitivos estão relacionados à expressão da tirosina

hidroxilase (TH), a enzima responsável pela etapa limitante da síntese de

dopamina (Feve, 2012), e da α-sinucleína, proteína de importância

fisiopatológica para a DP e função sináptica dopaminérgica (Wood-Kaczmar,

Gandhi e Wood, 2006).

43

5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Comparar a susceptibilidade das linhagens Wistar e SHR para o

desenvolvimento das alterações induzidas pelo tratamento repetido com uma

dose baixa de reserpina (0,1 mg/kg).

Objetivos específicos

a) Avaliar possíveis diferenças temporais e de magnitude para a expressão

das alterações motoras (catalepsia, atividade espontânea em campo aberto, e

discinesia oral) entre as linhagens Wistar e SHR ao longo e após o tratamento

repetido com reserpina.

b) Comparar os efeitos do tratamento com reserpina sobre os níveis de

tirosina hidroxilase (TH), α-sinucleína em áreas cerebrais de importância

(estriado e substantia nigra) entre as linhagens Wistar e SHR.

c) Investigar possíveis correlações entre as alterações motoras e os níveis

de TH e α-sinucleína em ambas as linhagens

44

5.3. MANUSCRITO FORMATADO PARA SUBMISSÃO.

Spontaneously hypertensive rats (SHR) are resistant to a reserpine-

induced progressive model of Parkinson’s disease: role of tyrosine

hydroxylase and α-synuclein expression.

Anderson H.F.F.Leão¹,², Ywlliane S. R. Meurer¹, Anatildes F. da Silva², André M.

Medeiros³, Clarissa L.C. Campêlo¹, Vanessa C. Abílio4, Rovena C.G.K.

Engelberth5, Jeferson S. Cavalcante5, Geison S. Izídio6, Alessandra M. Ribeiro7,

Regina H. Silva1,³.

¹Memory Studies Laboratory, Department of Physiology, Federal University of

Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.

²Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.

3Behavioral Neuroscience Laboratory, Department of Pharmacology, Federal

University of São Paulo, São Paulo, SP, Brazil.

4Clinical Neuroscience Interdisciplinary Laboratory (LiNC), Department of

Psychiatry, Federal University of São Paulo, São Paulo, Brazil

5Neurochemical Studies Laboratory, Department of Physiology, Federal

University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.

6Laboratory of Behavioral Genetics, Department of Cellular Biology, Embryology

and Genetics, Federal University of Santa Catarina, Florianopolis, SC, Brazil

7Department of Biosciences, Federal University of São Paulo, Santos, SP, Brazil

*Corresponding Author

Departamento de Farmacologia– UNIFESP

Rua Botucatu, 862, Edifício Leal Prado, 1º.andar

CEP 04023062 - São Paulo, SP, Brasil

Email: reginahsilva@gmail.com

45

ABSTRACT

Reserpine is an irreversible inhibitor of VMAT2 that has been used to study

Parkinson’s disease (PD) and screening for antiparkinsonian treatments in

rodents. Recently, the repeated treatment with a low-dose of reserpine was

proposed as a progressive model of PD because rats under this treatment show

progressive catalepsy behavior, oral movements and spontaneous motor activity

decrement. In parallel, compared to Wistar rats, Spontaneously Hypertensive

Rats (SHR) are resistant to acute reserpine-induced oral dyskinesia. In view of

these findings, we aimed to assess whether SHR would present differential

susceptibility to repeated reserpine-induced deficits in the progressive model of

PD. We submitted male Wistar and SHR rats to repeated-reserpine treatment (15

s.c. injections of 0.1 mg/kg, every other day) and assessed motor activity in the

catalepsy test, oral movements test and spontaneous activity on the open field.

Only reserpine-treated Wistar rats presented increased latency to step down on

the catalepsy test and impaired spontaneous activity in the open field. On the

other hand, oral movements test revealed increase in oral movements in both

reserpine-treated strains, but reduced magnitude and latency to impairment

instauration in the SHR strain. We also allowed a 15-day withdrawn period to

assess motor impairment recovery. Both strains recovered motor impairment, but

SHR animals expressed reduced latencies to reach control levels. Finally, we

performed immunohistochemistry for tyrosine hydroxylase (TH) and α-synuclein

(α-syn) 48h after the last injection or 15 days after withdrawn. Reserpine-treated

animals presented a reduction in TH and an increase in α-syn immunoreactivity

in the substantia nigra and dorsal striatum, which were both recovered after 15

days of withdraw. Furthermore, SHR rats were resistant to TH decrement in the

substantia nigra, and presented reduced immunoreactivity to α-syn in the dorsal

striatum relative to Wistar rats. In conclusion, the current results show that SHR

are resilient to motor and neurochemical impairments induced by the repeated

low-dose reserpine protocol. These findings indicate that the neurochemical,

molecular and genetic differences in the SHR strain are potential relevant targets

to the study of susceptibility to PD.

KEYWORDS

Reserpine, Parkinson’s Disease, SHR, α-synuclein, tyrosine hydroxylase.

46

1. INTRODUCTION

Parkinson disease (PD) is the second most prevalent neurodegenerative

disease, estimated to affect 1-2% of those older than 60 years, and seven to ten

million people worldwide (Mayeux, 2003; Van Den Eeden, 2003). Most

importantly, it is a disorder with progressive onset and escalating deterioration of

life quality (Braak et al., 2003). Therefore, the resulting social and economic

burden to countries with increasing life expectancy nourish a growing scientific

effort to understand its physiopathology.

The disease is characterized by motor impairments including muscular

weakness, rigidity, postural instability, tremors and bradykinesia (Duty and

Jenner, 2011; Klockgether, 2004). However, non-motor alterations such as

anxiety, depression, anhedonia, deficit in executive function, dementia and sleep

disturbances are also present (Barone, 2011; Bowers et al., 2006; Comella, 2003;

Gómez-Esteban et al., 2011; Ishihara and Brayne, 2006; Schneider et al., 2003;

Voon and Dalley, 2011). The symptoms are mostly the result of the progressive

and irreversible loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars

compacta (SNpc) and other dopaminergic nuclei (Wood-Kaczmar et al., 2006).

Such loss of dopaminergic inputs concurrently progresses with the accumulation

of intracellular α-synuclein-rich protein inclusions, known as Lewy bodies

(Lotharius and Brundin, 2002; Mcnaught et al., 2001).

The scientific literature highlight a number of genes associated to the

heritance of PD, such as α-synuclein, parkin, PINK1, DJ-1 and LRRK.

Nevertheless, explicit inheritage explains only 10-15% of the cases (Gao and

Hong, 2011). The majority of cases are reported as idiopathic or sporadic forms,

which are associated to environmental factors, such as exposition to pesticides,

rural life, infection, head trauma, and emotional dysfunctions such as anxiety and

depression (Godeiro et al., 2010; Noyce et al., 2012). Nonetheless, these

epidemiological findings suggest that there are cumulative interactions between

genetic and environmental factors that lead to the disease instauration (Kim et

al., 2005).

Despite many animal studies approach the genetic and environmental factors of

PD, few of them investigate the interaction between those factos upon the

47

expression of the parkinsonian phenotype. A study associated the resistance to

the dopaminergic insult by MPTP to autosomic alleles of the C57BL/J6 mice

strain (Hamre et al., 1999). Similarly, SHR (Spontaneously Hypertensive Rat)

rats are resistant to the reserpine-induced oral dyskinesia. Further, this

resistence was suggested to be related to the activity of the reactive oxygen

species (ROS) protective enzyme catalase (Abílio et al., 2004; Queiroz et al.,

1998).

Reserpine is a vesicular monoamine transporter-2 (VMAT2) inhibitor

extracted from Rauwolfia serpentine, which is able to deplete monoamines in the

central nervous system and produce lethargy, depression and dyskinesia (Leão

et al., 2015). Due to these properties, the reserpine was employed to model the

motor and non-motor deficits related to PD in rodents and screen for candidate

pharmacological treatments to PD (Fernandes et al., 2012; Leão et al., 2015;

Santos et al., 2013). Briefly, the reserpine model recapitulates substantial

features of symptomatology, neurochemistry and pharmacology of the disease

(for a review, see Leão et al. 2015). Recently, we have proposed a repeated low-

dose of reserpine protocol able to produce progressive motor and non-motor

symptoms, oxidative damage to membrane lipids, monoamine depletion and

reduction in tyrosine hydroxylase staining (Fernandes et al., 2012; Leão et al.,

2015; Santos et al., 2013).

In view of these findings, we suggest that the comparison between SHR

and Wistar rats provides understanding of susceptibility mechanisms of PD.

Thus, we aimed to compare the development of motor alterations and the

neurochemical expression of tyrosine hydroxylase and α-synuclein between SHR

and Wistar rats submitted to the repeated low-dose reserpine treatment protocol.

48

2. MATERIAL AND METHODS

2.1. Animals

We used 7-month-old male Wistar and SHR rats. All animals were housed

in groups of 4–5 per cage (30 cm × 37 cm × 16 cm) under conditions of acoustic

isolation and controlled airflow and temperature (23 ± 1◦ C), with a 12 h light/12

h dark cycle (lights on 6:30 a.m.). Food and water were available ad libitum.

Animals used in this study were handled in accordance with the guidelines of the

Brazilian law for the use of animals in research (Law Number 11.794). All

procedures were approved by the local ethics committee (CEUA-UFRN,

#005/2014) and conducted to minimize animal pain, suffering or discomfort.

2.2. Drugs and general procedures

Reserpine (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) was dissolved in two

drops of glacial acetic acid and diluted in distilled water (0.1 mg/ml). Vehicle

consisted of the same amount of acetic acid and water as in the reserpine

solution. These solutions were injected subcutaneously (s.c.). We briefly handled

animals for 2 min during 3 days before the beginning of the experimental

procedures.

2.3. Experimental design

The rats from each strain (Wistar and SHR) were randomly assigned to

one of three groups: control (WIS-CTR: n = 8; SHR-CTR: n = 10), reserpine-

treated (WIS-RESt: n = 8; SHR-RESt: n = 10) and reserpine-withdrawn (WIS-

RESw/d: n = 8; SHR-RESw/d: n = 10) groups. The animals received 15

subcutaneous injections of vehicle (CTR) or 0.1 mg/kg of reserpine (RESt and

RESw/d) at a volume of 1 ml/kg body weight, every other day. The rats of the

RESt group were euthanized 48 h after the 15th injection, while CTR and RESw

animals were euthanized 15 days after the 15th injection, for

immunohistochemmical procedures. Motor behavior data from RESt and RESw/d

were considered together for analysis until RESt group was euthanized (RES

group). Rats were submitted to the following behavioral procedures (from 8h00

49

to 16h00): (1) catalepsy test before the 1st injection and every other day (8h00-

9h00) throughout the treatment and for 15 days after the last injection; (2)

evaluation of spontaneous activity in the open field after the 2nd, 6th, and 15th

injections, and 15 days after withdraw (9h00-12h00); and (3) oral movements

quantification after the 2nd, 6th, 10th and 15th injection, and 10 and 15 days after

withdraw (13h00-16h00). The behavioral tests listed were performed

approximately 48 h after the referred injection, before the animals received the

following injection (16h00-17h00). Experimental design is shown in Fig. 1A.

Figure 1

Figure 1. (A) Schematic representation of the experimental design. (B) Effects of

repeated administration of 0.1 mg/kg reserpine on catalepsy behavior in Wistar

and SHR rats. Data are expressed as mean ± SEM relative to WIS-CTR group. *

p < 0.05 comparing WIS-RES to WIS-CTR (GLM with repeated measures

followed by Sidak’s post-hoc test).

50

2.4. Motor behavior

2.4.1. Catalepsy test

The catalepsy behavior was assessed by placing the animal’s forepaws

on a horizontal bar positioned at 9 cm above the bench surface. The duration of

catalepsy, which was defined as an immobile posture, keeping both forepaws on

the bar, was measured up to a maximum of 180 s. Three trials were carried out

for each animal in each observation day and the results were analyzed

considering the mean value of the three trials.

2.4.2. Spontaneous activity in the open field

The apparatus was a circular open field arena (84 cm in diameter) with 32

cm high walls, made of wood and covered in black laminated plastic. Animals

were placed in the center of the apparatus and allowed to explore for 5 min. A

digital camera above the apparatus recorded the sessions and an animal tracking

software (ANY-maze, Stoelting, USA) registered the behavioral parameters. We

quantified the distance traveled in the arena (in meters), the time in the center of

the open field (in seconds), and the time moving above the speed of 0.05 m/s in

the apparatus (in seconds).

2.4.3. Oral movements

We individually placed rats in a wired cage (40 cm x 40.5 cm x 20 cm) with

mirrors positioned under the floor and behind the back wall of the cage to allow

behavioral quantification when the animal faced away from the observer. The

number of tongue protrusions (projection of the tongue out of the oral cavity), and

the frequency of vacuous chewing movements (mouth openings in the vertical

plane not directed toward physical material), were measured continuously for 10

min.

2.5. TH and α-syn immunohistochemistry

Upon completion of the behavioral procedures, all animals were deeply

anesthetized with intraperitoneal injection of sodium thiopental (40 mg/kg) and

51

perfused transcardially with 200 ml phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4,

containing 500 IU heparin (Liquemin, Roche, Brazil), followed by 300 ml 4.0%

paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4. The brains were removed

from the skull, postfixed in the same fixative solution for 2–4 h, and transferred to

a solution containing sucrose 30% in 0.1 M PBS, pH 7.4. Each brain was serially

cut in the coronal plane into 50-µm thick sections with a cryostat microtome

(Leica, Germany) at a temperature of −20◦C. The sections were placed

sequentially in five compartments (one section per compartment), with the

distance between one section and the next in the same compartment being

approximately 250-µm. All sections in the five compartments were stored in

antifreeze solution. Free-floating sections were incubated for 18–24h with a

polyclonal anti-TH (cat # AB152 Chemicon, USA, 1:10,000, as described by [24])

or anti-α-syn (cat # sc-7011-R, Santa Cruz Inc., USA, 1:500) primary antibody

raised in rabbits, containing 2% goat normal serum diluted in 0.3% Triton X-100

and 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4. Afterwards, we incubated the sections with

the biotinylated secondary antibody anti-rabbit (1:1000; cat # S-1000 Vector

Labs, USA) obtained in goat for 2 h at room temperature, washed, and incubated

with avidin–biotin-peroxidase solution (ABC Elite kit, Vector Labs, Burlingame,

USA) for 90 min. The reaction was developed by the addition of diaminobenzidine

tetrahydrochloride (Sigma, USA) and 0.01% H2O2 in 0.1 M phosphate buffer, pH

7.4. The sections were washed (4×, 5 min) with 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4,

between each step and at the end of the procedure. Then, the sections were

dried, dehydrated in a graded alcohol series, cleared in xylene, and cover slipped

with Entellan (Merck). The immunostainings were performed in four sessions with

balanced number of animals per group in each session, minimizing possible

differences in background between the groups due to small variations in

immunostaining. Sections were examined under brightfield illumination (Olympus

Microscope, BX-41), images were captured using a CCD camera (Nikon, DXM-

1200) and the locations of areas were determined using the atlas of Paxinos and

Watson (Paxinos and Watson, 2009).

2.6. Immunohistochemistry quantification

In order to estimate the number of dopaminergic cells in the SNpc four

sections of each animal were selected: one at the rostral level, two at medium

52

level and one at caudal level, representative of the rostrocaudal extension of each

area of interest. The exact location of the regions was determined on the basis of

the Paxinos and Watson rat brain atlas (2009). The TH+ cell count was performed

for the whole extension of the evaluated regions within each section as described

by Santos et al. (2013).

Additionally, TH and α-syn levels were assessed by analysis of relative

optical densitometry (ROD) in the dorsal striatum (dSTR) and substantia nigra

pars reticulada (SNpr) using the software Image J (Version 1.46i, NIH). Four

representative sections of the rostrocaudal extension of each region were

chosen. In each section, 5 fields evenly distributed throughout the areas of

interest and control region were analyzed. The medium pixels in the target area

were subtracted from de medium values of a control region (areas that should not

have specific TH staining) of the same tissue (cortex or corpus calosum). Finally,

all values were normalized considering the control group, in order to evaluate

proportional alterations (Santos et al., 2013).

2.6. Data analysis

All data were tested for normality by Kolmogorov-Smirnov’s test and

homogeneity of variance by Levene’s test. Parametric tests were used

accordingly to data distribution and homogeneity of variance. GLM (General

Linear Model) with repeated measures - with treatment and strain as between

subject factors and sessions as within factor - was applied to catalepsy, open

field and oral movement motor parameters to assess effects throughout

treatment and withdraw phases. A GLM was applied to immunohistochemistry

parameters with treatment and strain as between-subject factors. Both tests were

followed by Sidak’s post-hoc test to highlight differences between strain and

treatment groups. We also conducted a Pearson’s correlation test between all

motor and neurochemical parameters in each rat strain. We expressed results as

mean ± S.E.M. and p < 0.05 was considered to reflect significant differences.

53

3. RESULTS

3.1. Motor Behavior

3.1.1. Catalepsy test

GLM with repeated measures revealed effects of session

[F(15,750)=3.187; p<0.001], session*strain [F(15,750)=2.766; p<0.001],

session*treatment [F(15,750)=3.162; p<0.001], time*treatment*strain

[F(15,750)=1.950; p=0.016] interactions, and treatment [F(1,50)=4.151);

p=0.047] during the treatment phase. The same analysis to the withdraw phase

found effect of time [F(6,192)=2.120); p=0.053], and treatment [F(1,32)=3.342);

p=0.077]. Sidak’s post-hoc test yielded differences only to WIS-RES group, with

animals spending more time in the bar than any other group from 48h after the

7th injection (day 17) to 48h after the 15th injection (day 31) of reserpine (Figure

1B).

3.1.2. Spontaneous locomotion in the open field

3.1.2.1. Total Distance Travelled

GLM with repeated measures to total distance travelled in the treatment

phase revealed effects of treatment [F(1,50)=6.18; p=0.016], session

[F(2,100)=69.17; p<0.001], session*treatment [F(2,100)=3.37; p=0.038],

session*strain interactions [F(2,100)=3.21; p=0.044]. The GLM to the withdraw

phase did not found significant effects. Differences between groups in each time

point is yielded by Sidak’s post-hoc test and shown in Figure 2A. Briefly, only

WIS-RES group travelled a shorter distance relative to WIS-CTR group 48h after

the 15th injection.

3.1.3.2. Speed above 0.05 m/s

GLM with repeated measures in the treatment phase to time with speed

above 0.05 m/s revealed effects of session [F(2,100)=29.26; p<0.001], and

session*strain interaction [F(2,100)=3.08; p=0.05]. The GLM to the withdraw

phase did not found significant effects. Differences between groups in each time

54

point is yielded by Sidak’s post-hoc test and shown in Figure 2B. Briefly, only

WIS-RES group spent less time moving above 0.05 m/s relative to WIS-CTR and

SHR-RES groups 48h after the 15th injection.

3.1.3.3. Time in the center zone

GLM with repeated measures in the treatment phase to time in the center

zone of the open field revealed effects of session [F(2,100)=11.42; p<0.001], and

strain [F(1,50)=16.62; p<0.001]. The GLM to the withdraw phase did not found

significant effects. Differences between groups in each time point is yielded by

Sidak’s post-hoc test and shown in Figure 2C. Briefly, WIS-RES group spent less

time in the center of the apparatus relative to WIS-CTR and SHR-RES groups

48h after the second injection.

55

Figure 2

Figure 2. Effects of repeated administration of 0.1 mg/kg reserpine on (A) total

distance travelled, (B) time in speed above 0.05 m/s, and (C) time in the center

zone in the open field test in Wistar and SHR rats. Data are expressed as mean

± SEM relative to WIS-CTR group. * p < 0.05 compared to respective CTR group;

56

# p < 0.05 compared to respective treatment in WIS strain (GLM with repeated

measures followed by Sidak’s post-hoc test).

3.1.3. Oral movements

3.1.3.1. Vacuous chewing

GLM with repeated measures in the treatment phase to vacuous chewing

revealed effects of session [F(3,150)=13.81; p<0.001], treatment [F(1,50)=23.33;

p<0.001], session*strain interaction [F(3,150)=3.16; p=0.026]and

session*treatment interaction [F(3,150)=11.33; p<0.001], as well as a marginal

effect of session*treatment*strain [F(3,150)=2.42; p=0.068], and strain*treatment

[F(1,50)=3.17; p=0.081] interactions. The same analysis to the withdraw phase

revealed effect of session [F(1,32)=12.56; p<0.001], treatment [F(1,32)=12.56;

p=0.001], and session*treatment*strain [F(1,32)=4.83; p=0.035] and

strain*treatment [F(1,32)=4.42; p=0.043] interactions.

Differences between groups in each time point is yielded by Sidak’s post-

hoc test and shown in Figure 3A. WIS-RES presented increase in the vacuous

chewing movements relative to respective strain control from the 6th injection to

10 days after withdraw, while SHR-RES presented increase in vacuous chewing

only after the 10th injection. As well, differences in the magnitude of increase in

vacuous chewing between reserpine-treated strains occured from the 10th

injection to 15 days after withdraw, with WIS-RES presenting higher values than

SHR-RES group.

3.1.3.2. Tongue protrusion

GLM with repeated measures in the treatment phase to tongue protrusion

revealed effects of session [F(3,150)=5.15; p<0.05], treatment [F(1,50)=18.59;

p<0.001] and session*treatment interaction [F(3,150)=5.94; p<0.001], as well as

a marginal effect of strain*treatment interaction [F(1,50)=3.86; p=0.055]. The

same analysis to the withdraw phase revealed effect of time [F(1,32)=8.17;

p<0.05] and treatment [F(1,32)=8.48; p<0.05].

Differences between groups in each time point is yielded by Sidak’s post-

hoc test and shown in Figure 3B. WIS-RES groups presented increase in the

57

tongue protrusion relative to WIS-CTR from the 6th injection to 10 days after

withdraw, while SHR-RES (relative to SHR-CTR) presented increases values

only after the 10th and 15th injections. As well, no differences in the magnitude

of increase in tongue protrusion between reserpine-treated strains was detected.

Figure 3

Figure 3. Effects of repeated administration of 0.1 mg/kg reserpine on (A)

vacuous chewing movements, and (B) tongue protrusions in oral movement test

in Wistar and SHR rats. Data are expressed as mean ± SEM. * p < 0.05 compared

to respective CTR group; # p < 0.05 compared to respective treatment in WIS

strain (GLM with repeated measures followed by Sidak’s post-hoc test).

3.2. Neurochemistry

GLM to the number of TH positive neurons in the SNpc revealed effects of

treatment [F(2,54)=3.39; p=0.041] and strain [F(1,54)=7.44; p=0.009] (Figure

58

4A). All other analyses where carried with the ROD (Relative Optical Density)

values of TH and α-syn expression in the fibers of dSTR and SNpr. GLM to TH

expression in the dSTR revealed effects of treatment [F(2,54)=7.61; p=0.001] and

strain [F(1,54)=2.48; p=0.068] (Figure 4B). Differences between groups revealed

by Sidak’s post-hoc test are shown in Figure 4A,B. Sidak’s post-hoc test to the

numbe of neurons in the SNpc rvealed that only WIS-RESw/d group presented

reduction in the number of TH+ neurons in the SNpc relative to WIS-CTR.

Moreover, SHR-RESt and RESw/d groups did not present any differences to TH+

neuron count relative to SHR-CTR, and SHR-RESw/d displayed more TH+

neurons in the SNpc than WIS-RESw/d group. That is, only WIS rats presented

reductions in TH expression in the SNpc after reserpine treatment, differently

from TH expression profile in the dSTR. Moreover, WIS-RESt and SHR-RESt

groups presented a reduction in TH expression in the dSTR compared to

respective CTR groups. Nevertheless, despite there was a tendency, RESw/d

groups did not differ from CTR or RESt groups in both strains.

Figure 4

59

Figure 4. Effects of repeated administration of 0.1 mg/kg reserpine on

immunostaining for tyrosine hysdroxylase in the (A) substantia nigra pars

compacta (SNpc) and (B) dorsal striatum (dSTR), and α-synuclein in the (C)

SNpc and (D) dSTR in Wistar and SHR rats. Data are expressed as mean ± SEM

relative to WIS-CTR group. * p < 0.05 compared to respective CTR group; # p <

0.05 compared to respective treatment in WIS strain; & p < 0.05 compared to

respective RESt group (GLM with repeated measures followed by Sidak’s post-

hoc test).

GLM to the ROD values to α-syn expression in the dSTR revealed effects

of treatment [F(2,54)=5.39; p=0.008] and strain [F(1,54)=9.59; p=0.003]. α-syn

expression in the SN, on the other hand, did not reveal any protein inclusion,

fibrils or neuron body staining. For this reason, we conducted an analysis to the

ROD values to soluble α-syn expression of the SNpr, which revealed effects of

treatment [F(2,54)=5.48; p=0.007] and strain [F(1,54)=4.27; p=0.045].

Differences between groups revealed by Sidak’s post-hoc test and shown in

Figure 4C,D. Shortly, both RESt groups displayed an increase of α-syn

immunostaining in the SNpr relative to respective RESw/d groups. Data to α-syn

expression in the dSTR also revealed that both RESt groups presented an

increase in α-syn immunostaining relative to respective CTR and RESw groups.

Equally important, SHR-CTR and SHR-RESt group presented a reduction of

expression compared to respective treatment groups in the WIS strain.

Representative sections of each region analyzed are presented in Figure 5.

60

Figure 5

Figure 5. Representative photomicrographs of brain coronal sections of dorsal

striatum and substantia nigra of rats repeatedly treated with vehicle (CTR) or 0.1

mg/kg reserpine euthanized 48h after last injection (RESt) or 15 days (RESw/d)

after the last injection. Scale bar in dorsal striatum: 1000 µm; and substantia

nigra: 200 µm.

3.3. Correlations

Pearson’s correlation test was applied to all motor and neurochemical

parameters for Wistar and SHR strains. The following correlations were found to

the WIS strain: TH (dSTR) vs TH (SNpc) [r = 0.403; p = 0.037]; TH (dSTR) vs

speed > 0.05 m/s [r = 0.460; p = 0.016]; TH (dSTR) vs tongue protrusion [r = -

0.437; p = 0.037]; TH(SNpc) vs tongue protrusion [r = - 0.387; p = 0.048]; α-syn

(SNpr) vs α-syn (dSTR) [r = 0.782; p < 0.001]; catalepsy vs vacuous chewing [r

= 0.497, p = 0.008]; catalepsy vs tongue protrusion [r = 0.583; p = 0.003]; and

distance vs time in the center of the open field [r = 0.397; p = 0.001]. While for

the SHR strain, we detected correlation between: α-syn (SNpr) vs α-syn (dSTR)

[r = 0.817; p < 0.001]; distance vs α-syn (SNpr) [r = - 0.471; p = 0.013]; distance

vs catalepsy [r = 0.540; p = 0.002]; distance vs speed > 0.05 m/s [r = 0.604; p <

0.001]; and tongue protrusion vs vacuous chewing [r = 0.657; p < 0.001].

61

All correlation tests performed are summarized in Figure 6. Data for

statistically significant r values (p < 0.05) to the Wistar strain are presented in the

upper tier, while SHR strain in the lower tier, of the correlation matrix. Values for

non-significant correlations were omitted.

Figure 6

62

Figure 6. Correlation matrix for neurochemical and behavioral parameters in WIS

(upper tier) and SHR (lower tier) rats. Pearson’s r values are displayed for each

significant correlation . *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.

4. DISCUSSION

We found that SHR are resistant to catalepsy, spontaneous locomotion

and oral movement impairment in a reserpine-induced progressive animal model

of PD. As expected, reserpine-treated Wistar rats presented a progressive

increase in the latency to step down the catalepsy bar, which was significant from

the 8th injection onwards, corroborating previous studies (Fernandes et al., 2012;

Santos et al., 2013) (Figure 1B). Nevertheless, the SHR reserpine-treated rats

presented no increase in the latency to stepdown whatsoever. That is, the SHR

63

strain revealed to be resistant to the difficulty to start a movement in the low-dose

reserpine treatment protocol. As follows, the same profile of motor impairment

was evident in the spontaneous locomotion in the open field. Despite both strains

significantly reduced locomotion and speed throughout sessions due to

habituation, only reserpine-treated Wistar rats presented impaired spontaneous

locomotion 48h after the 15th injection – to both total distance traveled and time

in speed above 0.05 m/s (Figure 2A,B). These findings corroborate our previous

studies, which found reduced spontaneous activity in the open field 48h after the

6th injection in Wistar rats as well (Santos et al., 2013).

Despite not presenting expressive motor impairment in the catalepsy and

spontaneous locomotion test, reserpine-treated SHR rats revealed some extent

of oral dyskinesia. Overall profile of motor impairment was evident in the oral

movement test as well, but SHR-RES group presented an increase in oral

movements only after the 10th injection, which remained until the 10th day of

withdraw, while WIS-RES group revealed the motor impairment after the 6th

injection until the 15th day of withdraw (Fig. 3A,B). Moreover, the magnitude of

effects on oral movements was higher in Wistar rats than in SHR rats. In a

previous study, we also report that Wistar rats submitted to such treatment

regimen present increase of oral movements after the 10th injection (Fernandes

et al., 2012). Taken together, the motor profile of both strains after reserpine

treatment revealed that the resilience to the motor impairing effect of reserpine

treatment is extended to the low-dose repeated regimen and to other motor

parameters in the SHR strain – namely, catalepsy and spontaneous activity

(Abílio et al., 2004; Queiroz et al., 1998). However, this resilience is not absolute,

and seems to progress throughout the treatment in the SHR strain.

Regarding the neurochemical analysis, we found a progressive reduction

in TH staining in the SNpc that revealed to be significant only to WIS-RESw/d

group, despite a tendency to reduction in WIS-RESt (p = 0.069) (Figure 4A).

Oppositely, the reserpine treatment did not result in any reduction of TH staining

in the SNpc of SHR rats. On the other hand, both strains presented a reduction

in the TH staining after treatment with reserpine in the dSTR, as well as a partial

recovery relative to CTR and RESt group in RESw/d groups (Figure 4B). That is,

RESw/d groups in both strains did not differ from both CTR and RESt groups.

64

The same profile of recovery is reported by Santos et al. (2013), which found total

and partial recovery of motor deficits and immunoreactivity of TH in various brain

areas, respectively, after withdrawn for 30 days of reserpine (10 injections of 0.1

mg/kg every other day).

Accordingly, Freitas et al. (2015) found that TH immunoreactivity in

reserpine treated mice (four injections of 1 mg/kg every other day) is reduced

after 2 and 20 days of withdraw, but not 60 days, in the striatum. However, no

alterations were found in TH immunoreactivity of the region comprising the SN.

This profile of progression is described for other chemically induced PD models

as well (Korecka et al., 2013; Zhu et al., 2004). Collectively, these findings

suggest a path of progression on the reserpine-induced TH decrement from the

fibers (dSTR) to the nucleus (SNpc). The study of the mechanisms envolved in

such progression is useful to investigate early PD pathology and

symptomatology, as previously proposed (Korecka et al., 2013; Santos et al.,

2013). Moreover, the progression trend here stablished recapitulates the one

observed in PD patients. That is, contemporary evidences for early PD

progression suggest that the dopaminergic function loss begins in the projection

sites, and subsequently advances to the nucleus (Cheng et al., 2010).

Furthermore, the findings highlight some degree of dissociation between

the motor impairment and the neurochemical alterations in the Wistar and SHR

strains. The reduction in TH staining in the dSTR of SHR strain was not enough

to result in the observed motor impairments. Thus, it is likely that the motor

impairing effects of reserpine treatment requires the decrement of TH in the

SNpc, as in the Wistar strain (Figure 4A,B) (Santos et al., 2013). That is in

accordance with the motor progression of PD, as the motor impairments are

observed only after the loss of a quarter of neurons in the SNpc (Arkadir et al.,

2014). Nevertheless, we do not disregard other adaptative mechanisms, because

WIS-RESw/d group, despite reduced TH+ neuron count in the SNpc, presented

recovery of motor impairment (Figure 4A). We propose that other neurochemical

alterations – than the TH expression – preclude the motor deficit in this model.

Recently, we have found that motor deficit in the reserpine-induced progressive

model of PD is time-coupled to dopamine, but not serotonin, depletion in the

striatum of both Wistar and SHR strains. Moreover, magnitude of motor deficit

65

was dependent on the extent of dopamine depletion, as Wistar rats exhibited

more severe dopamine depletion and motor impairment compared to SHR (Leão

et al., data not published). Thus, recovery of different functions may require

distinguished time intervals and depend on other neurotransmission systems. For

instance, despite full motor recovery after 30 days of reserpine withdrawn,

cognitive deficits were still current in Wistar rats (Santos et al., 2013).

In this sense, such neurochemical findings could be secondary to

alterations in catecholamine levels and metabolism imbalances. Indeed,

catecholamines regulate TH activity and expression in the cytoplasm (Dickson

and Briggs, 2013). That is, the resulting increase of DA in the cytoplasm by

reserpine treatment may reduce the TH activity in the nigrostriatal pathway.

Alternatively, NO and nitrite formation in the cytoplasm also regulates the

expression of TH (Daubner et al., 2011; Nakashima et al., 2011). In this respect,

reserpine treatment results in oxidative stress and accumulation of reactive

oxygen and nitrogen specimens, which ultimately may result in the decrement TH

expression (Arora and Chopra, 2013; Arora et al., 2011; Santos et al., 2013).

Further investigations of which phosphorylated site of TH is involved in the

regulation of TH expression in response to the treatment with reserpine is

required to clarify the mechanisms of TH downregulation. Likewise, epigenetic

studies could also help to clarify how such cellular oxidative imbalance would

modulate the expression of TH (Yang et al., 2011).

Neurochemical data for the α-syn expression in the SN did not reveal any

protein inclusion, fibrils or neuron body staining. On the other hand, an analysis

to the ROD values of soluble α-syn expression of the SNpr revealed overall

effects for treatment and strain in the dSTR and SNpr. Briefly, RES group

presented an increase in the expression of α-syn relative to CTR and RESw/d

groups in both strains, particularly in the dSTR (Figure 4C,D). In addition, SHR

rats presented a reduction of α-syn expression relative to WIS rats in the dSTR

(Figure 4D). It is well known that α-syn is localized in membranes and vesicles of

presynaptic terminals in its stable form, which occurs in a dynamic equilibrium

with its soluble form and a stable membrane-bound state (Burré, 2015). The

soluble cytosolic α-syn is a monomeric and natively unfolded protein that can

convert into β-sheet containing oligomers (protofibrils) which eventually form

66

amyloid fibrils and Lewy bodies (Burré et al., 2013). Thus, an increase in the

soluble cytosolic form of α-syn is detrimental to catecholaminergic neurons by

favoring the formation of β-sheet and protofibrils. Nevertheless, despite the

increase in α-syn immunostaining, we did not detect any sign of protein inclusions

or fibrils formation with the length of repeated reserpine treatment used here

(Figure 5).

Regardless, this is the first study to investigate the expression of α-syn in

reserpine-treated mammals. To our knowledge, only one study investigated the

effects of reserpine treatment upon α-syn expression in a Droshophila

melanogaster model which, in accordance to our findings, reported inhibition of

the autophagic flux, disruption in protein degradation, and accumulation of α-syn

rich protein aggregates (Lee et al., 2015). Likewise, VMAT2-deficient mice also

present age-dependent neurodegeneration in the SNpc, followed by α-syn

accumulation and TH immunostaining reduction (Caudle et al., 2007; Taylor et

al., 2009). Despite overall motor and neurochemical results points to a reversible

insult to the nigrostriatal pathway (Fernandes et al., 2012; Santos et al., 2013),

we do not discard some extent of neurodegeneration and α-syn rich protein

inclusions or fibrilsin longer treatment regimens. As follows, long-term VMAT2

blockade or loss of function results in irreversible neurochemical and behavioral

alterations (Neisewander et al., 1991), as well as neurodegeneration (Taylor et

al., 2011). Thus, investigation on neurodegenative markers and defective protein

accumulation are still required to clarify this matter. For instance, reserpine

treatment results in increased expression of caspase-3 (Arora and Chopra, 2013;

Liu et al., 2014) and reduction of Bcl-2 (El-Ghazaly et al., 2013; Liu et al., 2014),

which are important markers of apoptotic pathways commitment. Finally, the

increase in the α-syn found in reserpine-treated animals is a putative secondary

mechanism by which TH is downregulated. For instance, α-syn reduces TH

expression through repression of phosphorylation at Ser40 of TH (Peng et al.,

2005; Wu et al., 2011).

Regarding the strain differences, here we report that SHR strain exhibits

lower levels of α-syn in the nigro-striatal pathway (Figure 4C,D), as SHR-CTR

and SHR-RESt animals, respectively, presented reduced levels of α-syn

compared to WIS-CTR and WIS-RESt groups in the dSTR (Figure 4D). That is to

67

say, overall results for α-syn expression suggests that SHR strain expresses

reduced levels of α-syn compared to Wistar strain (Figure 4C,D). This finding

denotes a mechanism by which reserpine-treated SHR rats may cope with DA

imbalances and TH downregulation, and corroborate the findings of Chiavegatto

et al. (2009) that report reduced expression of α-syn in the hippocampus, but not

hypothalamus, of SHR rats compared to the Lewis strain.

Furthermore, α-syn is also involved in the homeostasis of DA by inhibiting

the expression and activity of TH and VMAT2 (Baptista et al., 2003; Guo et al.,

2008), and interrupting dopamine balance by causing increased cytosolic

dopamine levels (Perez et al., 2002). Conversely, catecholamine metabolites,

such as 5-S-Cysteinyldopamine, modulate α-syn expression through oxidative

stress (Aureli et al., 2014). Thus, reserpine-induced increases in catecholamine

metabolites and oxidative imbalances (Leão et al., 2015) may be in the core of

the neurochemical alterations reported here. Accordingly, SHR rats, which show

decreased imunostainning for α-syn (Figure 4D), present reduced levels of lipid

peroxide (Leão et al., unpublished data). Further, this strain’s resilience to

reserpine-induced oral movements is associated to increased catalase activity in

the striatum (Abílio et al., 2004). Thus, SHR rats appear to be better suited to

cope with oxidative imbalances resulting from reserpine treatment, which in this

study seems to reflect in different expression profiles of TH and α-syn expression

between Wistar and SHR strain.

In summary, even though we do not report any sign of α-syn positive

protein inclusions, we speculate that the behavioral and neurochemical

alterations here reported resembles a closer relationship to early PD molecular

alterations. Nonetheless, other chemically induced PD models also do not

account for this histopathological hallmark (Blesa et al., 2012; Meredith et al.,

2008). Importantly, the differences between the two strains could shed light on

these initial cellular alterations.

Correlation analyses for WIS rats showed several correlations between

neurochemical and motor parameters. For instance, TH expression in the dSTR

and SNpc negatively correlated with number of tongue protrusions, and positively

correlated with time moving above 0.05 m/s. That is, animals that presented

68

reduced TH expression spent less time moving above 0.05 m/s and displayed

more tongue protrusions. TH and α-syn expression in the SN also respectively

correlated with the expression in the dSTR, which indicates a relationship

between the expressions of these proteins in both regions of the nigrostriatal

pathway. Additionaly, duration of catalepsy correlated with both oral movement

parameters,while total distance traveled correlated with time in the center zone

of the open field (Figure 6).

These correlations suggest the dissociation of the motor behavior

parameters assessed in this study. For example, catalepsy and oral movements

may comprise a motor dimension related to the reserpine-induced dyskinesias,

while total distance traveled and time in the center zone are parameters related

to motivation to explore and anxiety rather than a strinctly motor dimension

(Jähkel et al., 2000; Shoval et al., 2016). Indeed, we report a reduction in the

exploration of the center of the open field in WIS-RES animals 48h after the 2º

injection of reserpine, and an overall increase in the exploration of this zone in

SHR strain throughout experiment (Figure 2C). These findings were expected

because SHR have consistently shown to exhibit increased exploration of

unprotected areas (Viggiano et al., 2004), as well as reserpine has shown

anxiogenic actions (Labuda and Fuchs, 2002). In a principal component analysis

study by Jähkel et al.(2000), time in the center zone was dissociated from

horizontal activity and associated to the serotonergic rather than dopaminergic

neurotransmission in mice. Thus, these behaviors may reflect the differential

action of reserpine upon monoaminergic systems. To support this rationale,

recently we have described that such treatment regimen results in a more

pronounced depletion of DA compared to 5-HT (serotonin) in the striatum of both

Wistar and SHR rats (Leão et al., data not published).

On the other hand, only one neurochemical parameter correlated

withmotor behavior in SHR rats. Specifically, α-syn expression in the SNpr

negatively correlated with total distance traveled in the open field. That is to say,

low levels of α-syn expression in the SNpr of the SHR seems to be beneficial to

the horizontal activity in this strain. The SNpr is an output nucleus of the basal

ganglia to the thalamus, with direct implication to motor behavior gating (DeLong

and Wichmann, 2007). Thus, the reported reduced expression of α-syn in this

69

strain may reflect a significant relevance to the motor profile exhibited by SHR

animals. In addition, this neurochemical parameter positively correlated with α-

syn expression in the dSTR, which – as previously found in the Wistar strain as

reported here – suggests a relationship between the expressions of these

proteins in both regions of the nigrostriatal pathway. Moreover, total distance

traveled also positively correlated with time spent moving above 0.05 m/s and

catalepsy time, while tongue protrusions positively correlated with vacuous

chewing movements. As in the Wistar strain, this finding seems to point out

distinct motor dimensions to the SHR strain. However, alternatively to the Wistar

strain, total distance taveled correlated with catalepsy time. Nevertheless, SHR

animals did not present increment in the catalepsy bar test as result of reserpine

treatment (Figure 1B). Thus, such correlation does not contradict the previous

finding, as in the SHR strain the catalepsy parameter may represent the

readiness to step down the bar, rather than difficulty to start a movement.

Therefore, overall correlations in the SHR strain points to a dissociation between

neurochemical and behavioral effects of reserpine treatment, corroborating the

different neurochemical and motor behavior profiles presented by both strains.

Likewise, TH expression in SNpc and dSTR did not correlate, suggesting a

differential effect of reserpine treatment upon the nucleus and projection site of

the nigrostriatal pathway (Figure 6). Such absence of correlation between

neurochemical and behavioral parameters are expected, because SHR strain

exhibited the neurochemical alterations compatible with PD, but not the motor

impairment. That is, the different profiles described here may result from

compensatory and/or plastic mechanisms, as previously discussed by the

reduced α-syn exprepession, resilience to the TH decrement in the SNpc, and

reduced oxidative damage exhibited by the SHR strain.

In view of such findings, it is clear that the interaction between genetic and

environmental factors is substantial to the expression of motor and cellular

alterations related to PD. Regardless of the aforementioned evidences, SHR rats

present several other cellular features to the dopaminergic system that are

relevant to the understanding of PD. For instance, SHR rats express more D1

and DAT in the striatum (Watanabe et al., 1997), but presents reduced function

of the latter (Russell, 2003). Besides, they seem to bear less TH in the pre-frontal

70

cortex (King et al., 2000) among other neurochemical alterations (For a review,

see Viggiano et al., 2004). Nevertheless, these studies were conducted with

normotensive control strain for the SHR, the Wistar-Kyoto rat (WKY). Despite the

WKY strain being the most appropriate control strain to innate hypertension

studies, this strain presents deregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal

(HPA) axis and increased response to stress (Will et al., 2003). Thus, the WKY

was suggested as a model for depression, and its validity to behavioral studies

with SHR rats is questionable. Due to these findings, we adopted the heterogenic

Wistar rat strain, which is suggested as a more suitable control for behavioral

studies with SHR (Abílio et al., 2004; Calzavara et al., 2009; Dommett and

Rostron, 2013; Gauthier et al., 2014; Queiroz et al., 1998). Thus, the investigation

of the SHR strain neurochemical differences to the catecholaminergic system

should be extended to other parameters and rat strains.

In conclusion, here we demonstrate that SHR rats are resistant to

reserpine-induced motor impairment for a number of motor and neurochemical

parameters. Moreover, the motor impairments were followed by compatible

neurochemical alteration that reflected PD progression in Wistar strain. Motor and

neurochemical data for theSHR strain, on the other hand, revealed a dissociation

of neurochemical alterations and motor behavior. Here we highlight some of the

neurochemical differences between these strains that may be adaptative to PD

resilience. In view of these findings, we suggest the use of the SHR strain and

the reserpine protocol as valuable tools to investigate the relevance of genetic,

cellular and behavioral differences between rat strains to the of progression of

PD in animal models. Ultimately, the understanding of these differences may

endorse the discovery of novel therapeutic or preventive strategies to PD.

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79

6. CAPÍTULO III

Efeitos do tratamento crônico e agudo com reserpina sobre

parâmetros motores, conteúdo total de monoaminas, e

peroxidação lipídica em ratos Wistar e SHR.

“An experiment is a question which science poses to Nature, and a

measurement is the recording of Nature’s answer.” Max Planck

80

6.1. INTRODUÇÃO

Retomando os achados neuroquímicos e comportamentais do capítulo II,

encontramos que ratos SHR são resistentes às alterações motoras induzidas

pelo tratamento com baixas doses de reserpina – especificamente, discinesia

oral, catalepsia em barra, e atividade espontânea em campo aberto. De modo

geral, animais de ambas as linhagens apresentaram alterações neuroquímicas

compatíveis com a DP (Moreira et al., 2012; Santos et al., 2013; Testa, Sherer e

Greenamyre, 2005; Yazdani et al., 2006). Isto é, ambas as linhagens

apresentaram redução e aumento da imunoreatividade, respectivamente, para

TH e α-sinucleína no estriado dorsal em resposta ao tratamento repetido com

reserpina.

Os perfis neuroquímico e comportamental para as linhagens apontam

para uma dissociação das alterações motoras e neuroquímicas de modo que,

apesar de apresentarem as alterações compatíveis com a DP, os animais SHR

ainda assim revelaram-se resistentes aos efeitos sobre o comportamento motor.

Parte destas diferenças podem ser atribuídas a diferenças constitutivas entre as

linhagens para a expressão de TH e α-sinucleína. Isto é, apenas animais Wistar

apresentaram redução da imunoreatividade para TH na SNpc, enquanto ratos

SHR revelaram uma tendência para aumento no estriado dorsal na condição

controle. Ainda, a α-sinucleína, também se presentou reduzida no estriado dorsal

da linhagem SHR independente do tratamento.

A expressão de genes e proteínas relacionadas ao sistema

dopaminérgico de SHR tem sido extensamente estudado em relação à sua

linhagem controle normotensa Wistar-Kyoto (WKY). A partir destes estudos é

possível enumerar e propor mecanismos neuroquímicos para as alterações

comportamentais expressas pela linhagem SHR. Por exemplo, temos que

animais SHR apresentam redução da expressão de TH no córtex pré-frontal

(CPF), mas não no estriado, de ratos adultos. Entretanto, animais SHR

apresentam uma redução da expressão TH no estriado apenas entre o período

P7 e P14 pós-natal (King et al., 2000; Leo et al., 2003). Além de alterações na

expressão de TH, animais SHR também exibem maior quantidade do receptor

D1 e seu mRNA no estriado e CPF (Kirouac e Ganguly, 1993; Lim et al., 1989;

81

Papa et al., 2002; Sadile, 2000; Watanabe, Y et al., 1997). A expressão do

receptor D2, por outro lado, não é ainda bem definida. Diferentes estudos relatam

hiper-, hipo- ou expressão normal no estriado (Kirouac e Ganguly, 1993; Lim et

al., 1989; Linthorst et al., 1993; Russell, Allie e Wiggins, 2000; Sadile, 2000;

Vaughan, Buuse, van den e Roland, 1999; Watanabe, Y et al., 1997). No entanto,

parece que a função inibitória auto-receptora de D2 está aumentada nesses

animais (Linthorst et al., 1991; Russell et al., 1995). Alterações para expressão

e função também são descritas para o transportador de DA (DAT), de modo que

ratos SHR expressam mais DAT no estriado e CPF (Watanabe, Y et al., 1997),

porém com redução da função de recaptação de DA deste (Leo et al., 2003).

A alteração na expressão e função das referidas proteínas refletem-se nos

níveis de neurotransmissores nestas regiões. Por exemplo, animais SHR

apresentam aumento da liberação de DA estimulada por glutamato na

substância nigra (Warton, Howells e Russell, 2009), aumento nos níveis de DA

no estriado de ratos juvenis, e diminuição em adultos (Viggiano, Vallone e Sadile,

2004), menor liberação e metabolismo de DA no estriado (Jong, de, Linthorst e

Versteeg, 1995; Villiers, de et al., 1995), aumento da liberação tônica de DA

(Carboni et al., 2003; Howes et al., 1984), e diminuição da liberação de DA no

estriado por estimulação elétrica e níveis elevados de K+ (Jong, de, Linthorst e

Versteeg, 1995; Linthorst et al., 1990, 1991; Miller et al., 2012; Russell et al.,

1995, 1998).

No entanto, como já discutido anteriormente, ainda que a linhagem WKY

seja a apropriada como controle para estudos de hipertensão inata, o mesmo

não é verdade para estudos comportamentais, uma vez que o WKY apresenta

diversas outras alterações em relação a linhagens de ratos heterogênicas (Will,

Aird e Redei, 2003). Sendo assim, a caracterização neuroquímica e

comportamental da linhagem SHR requer a extensão para outras linhagens,

como a Wistar (Abílio et al., 2004; Calzavara et al., 2009; Dommett e Rostron,

2013; Gauthier et al., 2014; Queiroz, Piovezan e Frussa-Filho, 1998).

Portanto, neste capítulo, buscamos estender a caracterização

neuroquímica conduzida no capítulo anterior avaliando o grau de depleção

de monoaminas (dopamina e serotonina), seus metabólitos, e produção de

82

peróxidos de lipídios no estriado de ratos SHR e Wistar submetidos ao

tratamento repetido ou agudo com reserpina. Uma melhor compreensão da

relevância destas alterações neuroquímicas será fundamental para definir os

mecanismos de resistência ao prejuízo motor induzido pelo tratamento com

reserpina em animais SHR. Ainda, essa investigação permitirá situar a relevância

do metabolismo de monoaminas para a expressão dos déficits motores e danos

celulares resultantes.

83

6.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS DESTE CAPÍTULO

a) Avaliar os efeitos da administração repetida de uma dose baixa de

reserpina sobre a progressão na depleção de monoaminas (dopamina e

serotonina) no estriado de ratos das linhagens Wistar e SHR.

b) Avaliar os efeitos da administração repetida de uma dose baixa de

reserpina sobre a progressão na formação de peróxidos de lipídio e dano

oxidativo no estriado de ratos das linhagens Wistar e SHR.

c) Investigar o efeito de uma administração aguda de reserpina sobre a

evolução temporal dos déficits motores na tarefa de catalepsia em barra

em ratos das linhagens Wistar e SHR.

d) Investigar o efeito de uma administração aguda de reserpina sobre a

evolução temporal na depleção de monoaminas (dopamina e serotonina)

no estriado de ratos das linhagens Wistar e SHR.

84

6.3. MATERIAIS E MÉTODOS

6.3.1. Animais

Foram utilizados ratos machos das linhagens Wistar e SHR, com idade de

6 meses (400-500g), os quais foram mantidos no biotério setorial do Laboratório

de Estudos de Memória/Departamento de Fisiologia/UFRN acondicionados em

gaiolas plásticas (máximo 5 animais), medindo 33 x 40 x 17 cm, sob ventilação

e temperatura controladas (22 ± 1 ºC), com ciclo claro/escuro de 12h/12h (luzes

acesas às 06h30) e acesso livre à água e comida. Antes do início dos

procedimentos experimentais o projeto foi submetido e aprovado pela Comissão

de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte

sob o número de protocolo 005/2014.

6.3.2. Drogas

Reserpina (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) foi dissolvida em uma gota

de ácido acético glacial e diluída para a concentração correta em água destilada.

Veículo consistiu na mesma quantidade de ácido acético e água que na solução

de reserpina. Estas soluções foram injetadas pela via subcutânea (S.C.).

6.3.3. Dosagem de dopamina, serotonina e metabólitos por cromatografia

líquida de alta eficiência (high performance liquid chromatography –

HPLC).

Após eutanásia por decapitação foram removidos os encéfalos dos

animais dos distintos grupos experimentais, e isoladas amostras do estriado. Os

tecidos foram imediatamente pesados e homogeneizados em PCA 0,1 M

contendo isoproterenol 30 ng/ml. Os homogeneizados foram filtrados utilizando

membrana de 0,45 µM e um volume de 100 µl de cada amostra foram injetados

no equipamento. A quantificação de dopamina foi feita por HPLC acoplado a um

detector eletroquímico. As amostras foram injetadas e a separação foi feita com

uma coluna de fase reversa (Supelcosil LC-18, 100 mm x 3 mm, Supelco). Se

utilizou como fase móvel um tampão fosfato 100 mM, metanol (15% v/v), 230

85

mg/L de ácido 1-octanossulfônico e 50 mg/L EDTA, que foi perfundida a uma

taxa de 1 mL/min. Para a detecção, utilizou-se um detector amperométrico com

eletrodo de carbono, com o potencial definido em 0,7 V em relação a um eletrodo

Ag/AgCl.

6.3.4. Ensaio de Peroxidação Lipídica

Após eutanásia por decapitação foram removidos os encéfalos dos

animais dos distintos grupos experimentais, e isoladas amostras do estriado. Os

tecidos foram imediatamente pesados e homogeneizados em tampão fosfato 0.1

M (proporção 1:5), que então foram centrifugados por 15 minutos a 3500 rpm e

4-5 ºC para a obtenção de pelo menos 150 µL de sobrenadante do homogenato.

A quantificação de peróxidos de lipídios foi realizada através de uma adaptação

dos métodos de (Tanizawa, Sazuka e Takino, 1981). A reação foi iniciada pela

adição de 250 µl de SDS 3%, 1,5 ml de tampão ácido acético 2M, e 1,5 ml de

ácido tiobarbitúrico (TBA) 0.8% a 50 µl de homogenato do tecido. Finalmente, o

volume foi completado com 4 ml de água Milli Q e então aquecido 95 ºC por 60

minutos em banho maria e esfriado em água com gelo. Então, 2,5 ml de uma

mistura n-butanol:piridina (15:1) foi adicionada e agitada vigorosamente. A

quantidade de malondialdeído (MDA) formado foi medido pela reação com o

ácido tiobarbitúrico à 532 nm a partir da fase superior formada com a mistura de

n-butanol:piridina. A quantidade de MDA formada foi então medida e os

resultados expressos em nanomoles de MDA por grama (g) de tecido úmido,

pela regressão contra uma curva de concentração conhecida de MDA.

6.3.5. Teste de catalepsia em barra

O comportamento de catalepsia foi avaliado colocando-se o animal com

ambas as patas dianteiras sobre uma barra horizontal de vidro elevada 9 cm da

superfície de apoio das patas traseiras. O tempo que cada animal permaneceu

nessa posição foi quantificado em segundos, até um limite de 180 s. Foi utilizado

o valor da média de três exposições realizadas consecutivamente.

86

6.3.6. Delineamento experimental

6.3.6.1. Experimento I - Efeitos do tratamento crônico com reserpina (0,1

mg/kg) em ratos Wistar e SHR.

Os animais foram aleatoriamente distribuídos em quatro grupos: Wistar-

Veículo (WIS-VEI; n=12), Wistar-Reserpina (WIS-RES; n=26), SHR-Veículo

(SHR-VEI; n=12), SHR-Reserpina (SHR-RES; n=26). Os animais receberam 15

injeções subcutâneas de veículo (VEI) ou 0,1 mg/kg de Reserpina (RES) nos

volumes de 1ml/kg de peso corporal a cada dois dias. Durante o tratamento os

ratos foram submetidos ao teste de catalepsia em barra antes da primeira injeção

e a cada dois dias ao longo do tratamento para acompanhamento das alterações

motoras resultantes do tratamento com reserpina.

Metade dos animais pertencentes aos grupos WIS-RES e SHR-RES

foram eutanasiados 48h após a 8ª injeção (grupos: WIS-RES 8ª, e SHR-RES 8ª).

Enquanto os demais apenas 48h após a última injeção (grupos: WIS-VEI, SHR-

VEI, WIS-RES 15ª, e SHR-RES 15ª). Os experimentos foram realizados em duas

etapas, sendo a primeira e segunda etapas destinadas, respectivamente, ao

processamento para análise do conteúdo total de monoaminas e peróxido de

lipídios estriatais (ntotal=38 por etapa; WIS-VEI=6; WIS-RES 8ª=6; WIS-RES

15ª=7; SHR-VEI=6; SHR-RES 8ª=6; SHR-RES 15ª=7). Os resultados para o

teste de catalepsia em barra para ambas etapas serão apresentados

conjuntamente. A descrição do delineamento experimental segue na Figura 10.

Figura 10

Delineamento experimental do Experimento reserpina crônico (0,1 mg/kg) em ratos Wistar

e SHR.

6.3.6.2. Experimento II - Efeitos do tratamento agudo com reserpina (1

mg/kg) em ratos Wistar e SHR.

87

Ratos Wistar (n=24) e SHR (n=24) foram avaliados no teste de catalepsia

em barra nos intervalos de 3h, 6h, 12h, 24h, 48h e 96h após uma injeção s.c.

aguda de reserpina 1mg/kg, que ocorreu imediatamente após a medida basal de

catalepsia em barra (0h). Estes animais foram aleatoriamente alocados em oito

grupos - um por linhagem nos intervalos 0h, 6h, 24h e 96h (n=6 por grupo) de

avaliação da catalepsia. Imediatamente após a avaliação no teste de catalepsia

nesses intervalos, os animais foram eutanasiados por decapitação e foi

dissecado o estriado para posterior dosagem de monoaminas. A descrição do

delineamento experimental segue na Figura 11.

Figura 11

Delineamento experimental do Experimento reserpina agudo (1.0 mg/kg) em ratos Wistar e

SHR.

6.3.7. Análise estatística.

Todos os dados foram testados quanto à homogeneicidade de variância

(teste de Levene) e à normalidade (teste de Kolmogorov-Smirnov), e análises

paramétricas foram realizadas para todos os dados. Os dados referentes à

catalepsia para o experimento I foram analisados pela análise de variância

(ANOVA) com medidas repetidas, com tratamento e linhagem como fatores entre

sujeitos e o tempo como fator dentre sujeitos. Os demais dados comportamentais

e neuroquímicos foram analisados por uma ANOVA duas vias, com tratamento

e linhagem, e tempo e linhagem, como fatores entre sujeitos, respectivamente,

para os experimentos I e II. Diferenças pontuais entre os grupos foram

determinadas através do teste pós-hoc de Sidak. Os resultados foram expressos

em médias ± E.P.M. O nível de significância considerado, em todos os testes foi

de p<0,05.

88

6.4. RESULTADOS

6.4.1. Experimento I - Efeitos do tratamento crônico com reserpina (0,1

mg/kg) em ratos Wistar e SHR.

6.4.1.1. Dosagem de dopamina, serotonina e metabólitos por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High Performance

Liquid Chromatography – HPLC).

Para as dosagens de dopamina e seus metabólitos, uma ANOVA 2x3 –

com linhagem e tratamento como fator entre sujeitos – revelou efeitos dos

fatores: tratamento [F(2,36)=13.559, p<0.001] e linhagem [F(2,36)=16.374,

p<0.001] para os níveis de dopamina (DA) (Figura 12A); tratamento

[F(2,36)=23.372, p<0.001] para os níveis de ácido 3,4-diidroxifenilacético

(DOPAC) (Figura 12B); tratamento [F(2,36)=23.372, p<0.001] para os níveis de

ácido homovanílico (HVA) (Figura 12C); e tratamento [F(2,36)=11.359, p<0.001]

para o turnover de dopamina [DOPAC+HVA/DA] (Figura 12D). O pós-hoc de

Sidak revelou que os grupos WIS-RES 8ª e RES 15ª apresentaram depleção de

DA e DOPAC a partir de 48h após a 8ª injeção de reserpina. No entanto, animais

SHR apresentam depleção de DA e DOPAC apenas após a 15ª injeção. Ainda,

animais SHR-VEI exibiram aumento de DA e diminuição de HVA em relação ao

grupo WIS-VEI, enquanto o turnover de DA está aumentado apenas no grupo

WIS-RES 8ª. Todas as significâncias para o pós-hoc de Sidak são apontadas na

Figura 12.

89

Figura 12.

Dosagem de (A) dopamina (DA), (B) ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC) e (C) ácido

homovanílico (HVA) por HPLC, e turnover de dopamina [DOPAC+HVA/DA] no estriado de

ratos Wistar (WIS) e SHR tratados com baixas doses de reserpina (0.1 mg/kg). *p < 0.05, e

***p < 0.001 comparado ao respectivo grupo VEI na linhagem. #p < 0.05, e ###p < 0.001

comparado ao respectivo grupo WIS no tratamento. &p < 0.05 comparado ao respectivo grupo

RES 8ª na linhagem (ANOVA 2x3; pós-hoc de Sidak).

Para as dosagens de serotonina e seus metabólitos, uma ANOVA 2x3 –

com linhagem e tratamento como fator entre sujeitos – revelou efeitos para os

fatores: tratamento [F(2,36)=4.443, p=0.020] e linhagem [F(2,36)=21.705,

p<0.001] para os níveis de ácido 5-Hidroxiindoleacético (5HIAA) (Figura 13B); e

tratamento [F(2,36)=3.644, p=0.038] e linhagem [F(2,36)=3.644, p=0.038] para

o turnover de serotonina [5-HIAA/5-HT] (Figura 13C). Nenhum efeito para a

ANOVA 2x3 foi encontrado para os níveis de serotonina (5-HT) (Figura 13A). O

pós-hoc de Sidak revelou que animais SHR apresentaram níveis reduzidos de

5-HIAA em relação aos seus respectivos tratamentos na linhagem Wistar (Figura

13B). Ainda, o turnover de serotonina revelou-se aumentado no grupo WIS-RES

8ª em relação aos grupos WIS-VEI, WIS-RES 15ª, e SHR-RES 8ª.

90

Para a formação do produto da peroxidação de lipídios MDA, obtivemos

efeitos para o tratamento [F(2,36)=4.396, p=0.021] e a linhagem

[F(2,36)=12.426, p=0.001] (Figura 13D). No entanto, apenas o grupo SHR-RES

8ª exibiu aumento na formação de MDA em relação ao WIS-VEI. Ainda, os

animais SHR-VEI e SHR-RES 15ª apresentaram, respectivamente, menores

níveis de MDA em relação aos grupos WIS-VEI e WIS-RES 15ª (Figura 13D).

Todas as significâncias para o pós-hoc de Sidak são apontadas na figura 13.

Figura 13.

Dosagem de (A) serotonina (5-HT) e (B) ácido 5-Hidroxiindoleacético (5HIAA) por HPLC, (C)

turnover de serotonina [5-HIAA/5-HT], e (D) Dosagem de malondialdeído (MDA) por

fluorimetría formado a partir da peroxidação lipídica no estriado de ratos Wistar (WIS) e SHR

tratados com baixas doses de reserpina (0.1 mg/kg). *p < 0.05 comparado ao respectivo grupo

VEI na linhagem. #p < 0.05, e ###p < 0.001 comparado ao respectivo grupo WIS no tratamento.

&p < 0.05 comparado ao respectivo grupo RES 8ª na linhagem (ANOVA 2x3; pós-hoc de

Sidak).

6.4.1.2. Catalepsia em barra

Uma ANOVA 2x2 de medidas repetidas – com linhagem e tratamento

como fator entre sujeitos e tempo como fator dentre sujeitos – revelou efeito para

os fatores tempo [F(15,675)=13.980, p<0.001], tratamento [F(1,45)=17.297,

91

p<0.001], linhagem [F(1,45)=9.061, p=0.004], e interações tempo*tratamento

[F(15,675)=11.688, p<0.001], tempo*linhagem [F(15,675)=5.677, p<0.001],

tratamento*linhagem [F(1,45)=10.785, p=0.002], e tempo*tratamento*linhagem

[F(15,675)=6.180, p<0.001]. O pós-hoc de Sidak revelou que o grupo WIS-RES

apresentou aumento do tempo na barra a partir de 48h após a 7ª injeção até o

fim do tratamento em comparação aos grupos WIS-VEI e SHR-RES (p < 0.05)

(Figura 14).

Figura 14.

Latência para descer da barra no teste de catalepsia em barra ao longo do tratamento repetido

com baixas doses de reserpina (0.1 mg/kg). * p < 0.05 comparado ao grupo WIS-VEI; #p <

0.05 comparado ao grupo SHR-RES (ANOVA 2x2 de medidas repetidas; pós-hoc de Sidak).

6.4.2. Experimento II - Efeitos do tratamento agudo com reserpina (1

mg/kg) em ratos Wistar e SHR.

6.4.2.1. Dosagem de dopamina, serotonina e metabólitos por HPLC.

Para as dosagens de dopamina e seus metabólitos, uma ANOVA 2x4 –

com linhagem e tempo como fator entre sujeitos – revelou efeitos para os fatores:

tempo [F(3,47)=40.926, p<0.001], linhagem [F(3,47)=19.030, p<0.001], e

interação tempo*linhagem [F(3,47)=4.872, p=0.006] para os níveis de dopamina

(DA) (Figura 15A); tempo [F(3,47)=13.000, p<0.001] e interação

tempo*linhagem [F(3,47)=4.773, p=0.006] para os níveis de ácido 3,4-

diidroxifenilacético (DOPAC) (Figura 15B); tempo [F(3,47)=5.329, p=0.004] e

92

linhagem [F(3,47)=10.309, p=0.003] para os níveis de ácido homovanílico (HVA)

(Figura 15C); e tratamento [F(2,36)=11.359, p<0.001] para o turnover de

dopamina [DOPAC+HVA/DA] (Figura 15D).

O pós-hoc de Sidak revelou que todos os grupos 6h, 24h e 96h

apresentaram depleção de dopamina em comparação ao grupo 0h em sua

respectiva linhagem. No entanto, os animais SHR dos grupos 6h, 24h e 96h

expressaram maiores níveis de dopamina no estriado em comparação à

linhagem Wistar nos respetivos intervalos de tempo após injeção aguda de

reserpina (Figura 15A). Ainda, apenas os ratos Wistar apresentaram redução de

DOPAC após a injeção de reserpina, enquanto os animais SHR não

apresentaram redução em função do tratamento. No entanto, estes partiram de

uma condição basal baixa de DOPAC em comparação ao grupo WIS-0h (Figura

15B). Ainda, nenhuma das linhagens apresentaram efeito do tempo após o

tratamento para os níveis de HVA. Porém ratos WIS, nos intervalos de 6h e 24h,

apresentaram níveis aumentados de HVA comparado aos respectivos intervalos

de tempo na linhagem SHR e comparado ao grupo WIS-96h (Figura 15C).

Finalmente, o turnover de dopamina revelou-se aumentado nos grupos WIS-6h

e WIS-24h em comparação aos animais SHR em seus respectivos intervalos de

tempo, e em comparação aos grupos WIS-0h e WIS-96h (Figura 15D). Todas as

significâncias para o pós-hoc de Sidak são apontadas na figura 15.

93

Figura 15.

Dosagem de (A) dopamina (DA), (B) ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC) e (C) ácido

homovanílico (HVA) por HPLC, e turnover de dopamina [DOPAC+HVA/DA] no estriado de

ratos Wistar (WIS) e SHR tratados com uma dose aguda de reserpina (1.0 mg/kg) ao longo do

intervalo de 96h. *p < 0.05, e ***p < 0.001 comparado ao respectivo grupo 0h na linhagem. #p

< 0.05, e ###p < 0.001 comparado ao respectivo grupo WIS no tempo. &p < 0.05 comparado ao

respectivo grupo 6h e 24h na linhagem (ANOVA 2x4; pós-hoc de Sidak).

Para as dosagens de serotonina e seus metabólitos, uma ANOVA 2x4 –

com linhagem e tempo como fator entre sujeitos – revelou efeitos para os fatores:

tempo [F(3,47)=4.534, p=0.008] para os níveis de serotonina (5-HT) (Figura

16A); tempo [F(3,47)=5.921, p=0.002] para os níveis de ácido 5-

hidroxiindoleacético (5HIAA) (Figura 16B); e tempo [F(3,47)=3.355, p=0.028]

para o turnover de serotonina [5-HIAA/5-HT] (Figura 16C). O pós-hoc de Sidak

revelou que os grupos WIS-24h e WIS-96h apresentaram redução de 5-HT em

relação ao grupo WIS-0h (Figura 16A), enquanto que para os níveis de 5-HIAA

foi encontrado aumento apenas para o grupo WIS-24h em comparação aos

grupos WIS-0h e WIS-96h, e aumento no grupo SHR-96h em comparação ao

WIS-96h (Figura 16B). No entanto, o pós-hoc não foi capaz de detectar

diferenças entre os grupos para o turnover de serotonina (Figura 16C).

94

6.4.2.2. Catalepsia em barra

Finalmente, uma ANOVA 2x7 - com linhagem e tempo como fator entre

sujeitos – para tempo na barra no teste de catalepsia em barra revelou efeitos

para tempo [F(3,47)=12.382, p<0.001], linhagem [F(3,47)=10.006, p=0.002] e

interação tempo*linhagem [F(3,47)=5.785, p<0.001]. O pós-hoc de Sidak revelou

que houve um aumento na latência para descer da barra em relação ao

respectivo grupo 0h na linhagem para o intervalo de 12h e 24h para a linhagem

Wistar, e 12h para a linhagem SHR. Ainda, animais Wistar apresentaram maior

latência para descer da barra em relação ao grupo SHR no intervalo de 24h

(Figura 16D). Estes achados denotam um deslocamento para a direita na

duração e aumento da magnitude dos efeitos motores da reserpina em ratos

Wistar comparados ao SHR. Todas as significâncias para o pós-hoc de Sidak

são apontadas na figura 16.

Figura 16.

Dosagem de (A) dopamina (DA), (B) ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC) e (C) ácido

homovanílico (HVA) por HPLC, e turnover de dopamina [DOPAC+HVA/DA] no estriado de

ratos Wistar (WIS) e SHR tratados com uma dose aguda de reserpina (1.0 mg/kg) ao longo do

95

intervalo de 96h. *p < 0.05, e ***p < 0.001 comparado ao respectivo grupo 0h na linhagem. #p

< 0.05, e ###p < 0.001 comparado ao respectivo grupo WIS no tempo. &p < 0.05 comparado ao

respectivo grupo 6h e 24h na linhagem (ANOVA 2x4; pós-hoc de Sidak).

6.5. DISCUSSÃO

Neste capítulo abordamos as alterações motoras e neuroquímicas

durante e após o tratamento agudo (1 mg/kg) ou repetido (0,1 mg/kg, 15 injeções,

em dias alternados) com reserpina. Nossos resultados revelam que as

diferenças para as alterações comportamentais observadas entre as linhagens

podem ser explicadas em grande medida pela dinâmica de depleção de

monoaminas resultante do tratamento com reserpina. Isto é, de modo geral, ratos

SHR apresentaram diferenças temporais e de magnitude para a depleção de

monoaminas no estriado e em comparação a ratos Wistar consoantes com o

comprometimento motor em ambos os regimes de tratamento.

Para o tratamento repetido com baixas doses de reserpina descrevemos

uma depleção substancial 48h após a 8ª injeção de reserpina em ratos Wistar

que se manteve até o fim do tratamento. Animais SHR, por sua vez, desde a

condição controle apresentaram maiores níveis de DA no estriado, passando a

apresentar redução dos níveis de DA em relação ao grupo controle apenas após

a 15ª injeção (Figura 12A). Este resultado revela um atraso na ação depletora

de DA pelo tratamento com reserpina em ratos SHR relativo à linhagem Wistar.

Conforme o descrito no capitulo II e em estudos anteriores (Fernandes et al.,

2012; Santos et al., 2013), esta depleção é compatível com a expressão temporal

do prejuízo motor na tarefa de catalepsia em barra em animais Wistar. Deste

modo, apenas animais Wistar apresentaram aumento na latência para descer da

barra após a 7ª administração de reserpina, enquanto animais SHR, ainda que

não tenham apresentado nenhuma diferença estatisticamente significativa,

passaram a expressar tendência ao prejuízo motor apenas ao fim do tratamento

– aproximadamente após a 14ª injeção de reserpina (Figura 14).

Ainda, o mesmo perfil de depleção de DA foi observado para os

metabólitos DOPAC e HVA em ambas as linhagens (Figura 12B,C). Não

obstante, o turnover de DA apresentou-se intensificado apenas em ratos Wistar

96

48h após a 8ª injeção (Figura 12D). O aumento do turnover de dopamina é um

resultado frequente em animais tratados por reserpina (Brighina et al., 2013;

Gołembiowska e Dziubina, 2012; Neisewander, Castañeda e Davis, 1994), que

reflete o estado do metabolismo de dopamina aumentado pela elevação dos

níveis citoplasmáticos de DA (Asanuma, Miyazaki e Ogawa, 2003; Meiser,

Weindl e Hiller, 2013; Qi, Miller e Voit, 2008). Também descrevemos aqui uma

diminuição do metabólito HVA em animais SHR controle (Figura 12C),

compatível com outros estudos que descrevem menores níveis de HVA e

metabolismo de DA (Jong, de, Linthorst e Versteeg, 1995; Villiers, de et al.,

1995). Portanto, a associação de maiores níveis de DA com a redução da

metabolização desta pode estar na fundação das bases celulares que conferem

resistência aos prejuízos motores induzidos pela reserpina.

A literatura que investiga as bases neuroquímicas das alterações

comportamentais entre as linhagens WKY e SHR revela que esta última

apresenta aumento da liberação tônica de DA (Carboni et al., 2003; Howes et

al., 1984), diminuição da função de recaptação de DA pelo DAT (Leo et al.,

2003), armazenamento de DA prejudicado (Russell et al., 1998), e redução do

metabolismo de DA (Jong, de, Linthorst e Versteeg, 1995; Villiers, de et al.,

1995). Portanto, todas estas alterações neuroquímicas junto ao perfil de

depleção aqui apresentado corroboram a resiliência desta linhagem aos

prejuízos motores induzidos pela reserpina. Isto é, a conjetura de um cenário

celular de metabolização de DA reduzida associado à liberação constante de DA

dificultaria a depleção desta.

Adicionalmente, os níveis de DA aqui descritos estão de acordo com a

expressão de TH descrita no capítulo II. Temos que animais SHR expressaram

maior quantidade de TH na SNpc, e tendência a aumento no estriado dorsal. A

maior expressão de TH pode representar uma capacidade de maior síntese de

DA, uma vez que esta enzima é a etapa limitante da síntese de catecolaminas

(Dickson e Briggs, 2013). Reciprocamente, os níveis de TH podem também

refletir o estado dos níveis de DA citoplasmáticos, uma vez que TH é

negativamente regulado por DA (Dickson e Briggs, 2013), e é inativada por

produtos da metabolização de DA (Kuhn, Aretha e Geddes, 1999; Tekin et al.,

2014). Para esclarecer o mecanismo e estabelecer uma relação causal entre os

97

estes eventos será necessário investigar os níveis dos diferentes tipos de TH

fosforilados expressos nestas linhagens sob o tratamento com reserpina

(Dickson e Briggs, 2013; Salvatore et al., 2012; Tekin et al., 2014). A investigação

desta questão será fundamental para estabelecer um mecanismo que clarifique

como o metabolismo de DA pode ser importante para os danos celulares

produzidos na DP (Salvatore et al., 2012).

Ainda assim, nem todas as alterações observadas estão de acordo com

a literatura para as diferenças entre ratos SHR e WKY. Por exemplo, aqui

descrevemos que desde a condição basal ratos SHR apresentam aumento de

DA no estriado (Figura 12A). Este é um achado divergente para as diferenças

entre SHR e WKY, que parecem apresentar aumento dos níveis de DA apenas

na fase juvenil, mas níveis reduzidos na fase adulta (Jong, de, Linthorst e

Versteeg, 1995; Linthorst et al., 1991; Viggiano, Vallone e Sadile, 2004). Ainda,

apesar de apresentarem uma liberação tônica de DA aumentada (Carboni et al.,

2003; Howes et al., 1984), animais SHR liberam menos DA no estriado por

estimulação elétrica ou níveis elevados de K+ (Jong, de, Linthorst e Versteeg,

1995; Linthorst et al., 1990, 1991; Miller et al., 2012; Russell et al., 1995, 1998,

2000). Estas alterações parecem também estarem associadas a uma atividade

inibitória aumentada da função dos auto-receptores D2 (Linthorst et al., 1991;

Russell, 2000; Russell et al., 1995). Deve-se destacar que estas diferenças foram

encontradas em comparação com a linhagem WKY. Portanto, pontuar as

diferenças celulares em outras linhagens, como a Wistar, podem expor novos

alvos no mecanismo celular de ratos SHR para a resiliência ao tratamento com

reserpina.

Em relação ao conteúdo de 5-HT, é pouco provável que este tenha

influenciado o comportamento motor observado, uma vez que a sua medida não

foi significativamente alterada em resposta ao tratamento com reserpina em

ambas as linhagens (Figura 13A). Por outro lado, o tratamento com reserpina foi

capaz de reduzir o conteúdo estriatal do metabólito 5-HIAA apenas em animais

SHR (Figura 13B). O turnover de 5-HT, por sua vez, revelou perfil semelhante

ao de DA, com apenas animais Wistar tratados após a 8ª injeção, apresentando

aumento (Figura 13C). Até então, pouco se investigou a neurotransmissão

serotonérgica na linhagem SHR. No entanto, os resultados aqui descritos estão

98

de acordo com o descrito para as diferenças entre as linhagens SHR e WKY,

que apresentam conteúdo de 5-HT e metabólitos equivalente para o estriado

(Fan, Bruno e Hess, 2012; Fuller et al., 1983). Portanto, os efeitos do tratamento

com reserpina sobre o metabolismo de 5-HT parece resultar do efeito depletor

global da reserpina sobre as monoaminas no estriado, porém sem significado

importante para o comportamento motor.

Por fim, o ensaio para quantificação de peróxidos de lipídios demonstrou

que, de modo geral, animais Wistar não apresentaram aumento nos produtos da

peroxidação de lipídios de membrana em resposta ao tratamento com reserpina.

Não obstante, ratos SHR exibiram maiores níveis de produtos da peroxidação

de lipídios (malondialdeído - MDA) em relação à condição controle (Figura 13D).

Ainda assim, estes partiram de uma condição basal reduzida de MDA,

compatível com a maior capacidade protetora contra radicais reativos do

oxigênio como descrito por Abílio et al. (2004). Estes achados são importantes

para a expressão de alguns comportamentos motores, como por exemplo a

discinesia oral, que está relacionada à extensão do dano oxidativo produzido

pelo tratamento com reserpina (Abílio et al., 2003, 2004; Teixeira et al., 2008).

Ainda, estes dados refletem o quadro global de metabolização de monoaminas,

uma vez que a decomposição destas pela monoamino oxidase (MAO) e catecol

O-metiltransferase (COMT) resulta na produção de espécimes reativas do

oxigênio (Asanuma, Miyazaki e Ogawa, 2003; Leão et al., 2015; Meiser, Weindl

e Hiller, 2013; Qi, Miller e Voit, 2008). Sendo assim, a menor depleção e redução

do metabolismo da DA na linhagem SHR pode estar relacionada às alterações

para danos oxidativos observados entre as linhagens. Não obstante, neste

estudo não foi possível reproduzir o aumento em produtos da peroxidação de

lipídios em ratos Wistar descrita por Fernandes et al. (2012).

Para o regime agudo, por outro lado, não se confirmou o aumento nos

níveis de DA na condição controle encontrada no estudo crônico para os animais

SHR. Estas diferenças podem ser explicadas pelas diferenças nos protocolos e

regime de tratamento. De fato, ratos SHR sob condições de estresse liberam

maior quantidade de DA e expressam maior atividade de TH no estriado em

relação a animais WKY (Ikeda et al., 1984). No entanto, todas as demais

alterações de níveis de monoaminas se confirmaram e são compatíveis com o

99

previamente observado. Desta forma, ratos Wistar se mostraram mais sensíveis

à depleção de DA por uma dose aguda de reserpina tanto no aspecto temporal,

quanto na magnitude da depleção, desde 6h até 96h após a injeção (Figura 15A).

Não somente, o vale da depleção de DA se apresentou aproximadamente no

mesmo intervalo de tempo para as duas linhagens – 24h após o tratamento –

como também foi acompanhada pelo metabólito DOPAC na linhagem Wistar,

enquanto animais SHR exibiram menores níveis de DOPAC desde a condição

basal (0h) (Figura 15B). Conforme o experimento anterior, animais SHR

expressaram menores níveis de HVA, porém estes não foram alterados pelo

tratamento (Figura 15C). Ainda, o turnover de DA também foi acentuado apenas

na linhagem Wistar, 6h e 24h após o tratamento com reserpina (Figura 15D).

Deste modo, os resultados encontrados para a administração aguda de

reserpina reforçam aqueles encontrados no regime repetido, revelando menores

níveis de metabólitos e metabolização de DA em animais SHR (Jong, de,

Linthorst e Versteeg, 1995; Villiers, de et al., 1995).

Finalmente, a depleção de 5-HT ocorreu apenas na linhagem Wistar,

apesar desta apresentar-se qualitativamente reduzida na linhagem SHR em

resposta ao tratamento com reserpina (Figura 16A). Ainda, o grau de depleção

de 5-HT descrito para os animais Wistar refletiu sobre os níveis do metabólito 5-

HIAA, que foram incrementados 48h após o tratamento na linhagem Wistar

(Figura 16B), enquanto nenhuma diferença foi encontrada para o turnover de 5-

HT (Figura 16C).

Deste modo, os resultados para o comportamento de catalepsia em barra

refletem as alterações neuroquímicas encontradas. Ambas as linhagens

apresentaram aumento da latência para descer da barra com o tratamento

agudo, porém com intervalos de tempo e magnitudes de efeitos diferentes

(Figura 16D). Deste modo, ratos Wistar apresentaram o pico do efeito motor da

reserpina 24h após a injeção, enquanto animais SHR o apresentaram logo após

12h. Ainda, a magnitude do prejuízo motor foi maior na linhagem Wistar

comparada a linhagem SHR, correspondente ao grau de depleção de

monoaminas produzido nestas linhagens.

100

Os resultados derivados do regime agudo acrescentam uma informação

farmacocinética importante em relação ao tratamento repetido com baixas doses

de reserpina. O deslocamento temporal do efeito motor para a direita em ratos

Wistar pode representar respostas farmacocinéticas diferentes para estas

linhagens, de tal modo que outros mecanismos não podem ser descartados,

como uma menor ação da reserpina sobre o VMAT2 ou uma maior

metabolização da reserpina por animais SHR. Em acordo com o descrito neste

capítulo, uma menor densidade de VMAT2 no estriado já foi descrita em ratos

juvenis SHR em relação à linhagem WKY (Simchon, Weizman e Rehavi, 2010).

Portanto, para o esclarecimento definitivo desta questão ainda se torna

necessário estudos que investiguem o comportamento dose-resposta destas

linhagens ao tratamento com reserpina, assim como a investigação da

funcionalidade e ligação da reserpina ao VMAT2.

Por fim, a comparação entre os efeitos dos tratamentos agudo e crônico

aqui apresentada não se limita apenas a questões farmacocinéticas. O estudo

agudo conduzido buscou investigar o perfil temporal da ação da reserpina e

magnitude dos efeitos comportamentais entre as diferentes linhagens sob uma

condição de depleção severa de monoaminas. Já o tratamento crônico, com uma

dose dez vezes menor, serviu ao propósito de investigar as consequências de

uma condição de bloqueio contínuo e moderado do VMAT2. Neste desenho

experimental, todas as avaliações comportamentais e neuroquímicas foram

realizadas 48h após o tratamento, em uma condição de baixa nos níveis séricos

e teciduais da reserpina. Sendo assim, o aspecto temporal do efeito da reserpina

neste protocolo se torna menos relevante em detrimento da ação cumulativa e

de longo prazo do tratamento, como as alterações neuroquímicas para

parâmetros de estresse oxidativo (peroxidação lipídica) e expressão de

proteínas (TH e α-sinucleína, apresentadas no Capítulo II). Deste modo, o estudo

agudo serve para compreensão das diferenças farmacológicas e

farmacocinéticas do tratamento com reserpina nas linhagens Wistar e SHR,

enquanto o estudo crônico ao efeito cumulativo e duradouro do tratamento com

reserpina sobre parâmetros neuroquímicos e comportamentais, com base nos

resultados previamente encontrados para esse protocolo em ratos Wistar.

101

6.6. CONCLUSÃO

Em síntese, as magnitudes das alterações motoras em ambos regimes de

tratamento são compatíveis ao grau de depleção de monoaminas expresso por

animais Wistar e SHR. Ainda, a expressão do prejuízo motor e da depleção de

monoaminas estão acopladas temporalmente em ambos regimes, de modo a

sugerir fortemente que os níveis destes neurotransmissores definem o

comportamento motor apresentado. Não somente, a depleção de monoaminas

também resultou em um aumento breve correspondente do metabolismo destas,

que se extinguiu após uma condição de depleção duradoura. Estas alterações

de metabolismo, por sua vez, refletiram sobre o dano oxidativo a lipídios de

membranas apenas na linhagem SHR.

Sendo assim, a compreensão da dinâmica temporal da expressão do

conteúdo de monoaminas fornece indícios fortes para os mecanismos de

resistência ao prejuízo motor induzido pelo tratamento com reserpina na

linhagem SHR. Este estudo, portanto, situa a relevância do metabolismo de

monoaminas para a expressão dos déficits motores e danos celulares

resultantes do tratamento com reserpina, acrescentando informações relevantes

para a compreensão das alterações neuroquímica para a expressão de TH e α-

sinucleína previamente descritas. Ainda, mais uma vez as diferenças para a

expressão do comportamento motor e depleção de monoaminas confirma as

diferentes susceptibilidades aos déficits induzidos pelo tratamento repetido com

reserpina em diferentes linhagens de ratos, como anteriormente conjeturado.

Finalmente, este também serve à validação do modelo progressivo da DP

induzido pelo tratamento repetido com baixas doses de reserpina (Fernandes et

al., 2012; Leão et al., 2015; Santos et al., 2013). Neste estudo pudemos

demonstrar um comprometimento progressivo da neurotransmissão de

monoaminas – depleção de dopamina e serotonina – importante para a

expressão de alterações motoras e cognitivas relevantes para DP.

102

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS

No presente estudo, sugerimos utilização de diferentes linhagens de ratos

(Wistar e SHR) para a investigação da susceptibilidade a um modelo animal

progressivo para a DP. Ainda, propomos a investigação da progressão das

alterações motoras e neuroquímicas resultantes do tratamento nestas linhagens

para a compreensão das diferenças celulares intrínsecas e/ou resultante do

tratamento entre estas linhagens.

No capítulo I, a partir de uma minunciosa revisão da literatura,

enumeramos as variadas alterações comportamentais e neuroquímicas

resultantes do tratamento com reserpina em roedores. A compilação destes

estudos permitiu que propuséssemos mecanismos e vias celulares para o insulto

sobre a transmissão dopaminérgica produzida pelo tratamento com reserpina.

De modo geral, evidências sólidas sustentam a capacidade da reserpina em

produzir supra-regulação de receptores de dopamina, depleção de monoaminas,

estresse e dano celular, sinalização pró-inflamatória e pró-apoptótica, e

diminuição e/ou aumento na expressão de proteínas de importância para a DP.

Não somente, estas alterações são acompanhadas por déficits motores e não-

motores que refletem a sintomatologia da DP. Sendo assim, validamos o regime

de tratamento repetido com baixas doses de reserpina como uma abordagem

importante para a compreensão da progressão destas referidas alterações em

modelos animais.

Ainda, estas evidências foram discutidas nos termos de validade de face,

preditiva e constructo proposta por Paul Wilner (1984), traçando paralelos com

evidências clínicas e epidemiológicas para os déficits descritos na DP e

argumentando contra a atual subutilização desta. Deste modo, o tratamento com

reserpina tem-se mostrado útil para a investigação de tratamentos anti-

parkinsonianos, importância do metabolismo de monoaminas e o papel do

VMAT2 para a fisiopatologia, e compreensão da diversidade sintomática motora

e não-motora da DP.

Utilizamos, então, no capítulo II o regime de tratamento repetido com

baixas doses de reserpina para caracterizar a progressão motora e expressão

de TH e α-sinucleína em ratos das linhagens Wistar e SHR. O produto desta

103

investigação revelou diferenças importantes para a susceptibilidade ao

desenvolvimento dos prejuízos motores entre estas linhagens. Neste sentido,

ratos SHR se mostraram resistentes ao prejuízo motor em todas as dimensões

avaliadas – catalepsia, discinesia oral, e atividade espontânea – tanto para a

magnitude, quanto para o tempo de instauração destas. No entanto, estes

animais ainda assim apresentaram alterações neuroquímicas para a expressão

de TH e α-sinucleína compatíveis com as expressas em animais Wistar em

resposta ao tratamento com reserpina.

Não obstante, neste capítulo descrevemos diferenças constitutivas

importantes para a expressão das referidas alterações neuroquímicas na

linhagem SHR. Estes animais apresentaram maior expressão de TH na SNpc,

assim como tendência para o aumento no estriado dorsal, em comparação à

linhagem Wistar. Ainda, enquanto o tratamento foi capaz de reduzir os níveis de

TH no estriado dorsal de ambas as linhagens, esta conseguiu resultar em

decremento da expressão de TH na SNpc apenas na linhagem Wistar. Este

achado ajuda a situar uma possível ordem de comprometimento da via nigro-

estriatal neste modelo. Isto é, a regulação negativa de TH no estriado por si só

não foi suficiente para a expressão do prejuízo motor observado na linhagem

SHR. Sendo, deste modo, necessário o comprometimento dos níveis de TH na

SNpc para a obtenção do comprometimento motor, como observado em animais

Wistar. Finalmente, animais SHR ainda apresentaram redução na expressão de

α-sinucleína no estriado, apesar desta revelar-se aumentada em animais

tratados com reserpina em ambas as linhagens. Apesar da α-sinucleína ainda

ser uma proteína com função completamente não elucidada, evidências

importantes apontam para o papel desta no metabolismo de DA e função

sináptica. Portanto, a redução na expressão desta observada em animais SHR

parece conferir proteção aos prejuízos motores produzidos pelo tratamento com

reserpina.

Finalmente, no capítulo III, exploramos as alterações para os níveis de

monoaminas – DA e 5-HT – e produtos da peroxidação de lipídios nas linhagens

Wistar e SHR sob o regime agudo e repetido de tratamento com reserpina. De

modo geral, encontramos que animais SHR são resistentes à depleção de

monoaminas. Esta resistência, assim como para o comportamento motor,

104

revelou-se tanto para a magnitude quanto para o tempo até a depleção desta.

Isto é, animais SHR apresentaram menor depleção de monoaminas, assim como

levaram mais tempo para expressar esta. Estes achados estão de acordo e

parecem refletir a expressão do prejuízo motor observado nas linhagens Wistar

e SHR. Isto é, para ambos os regimes de tratamento houve um acoplamento

temporal para os efeitos de depleção de monoaminas e comprometimento motor

observado nas linhagens Wistar e SHR. Esta investigação também acrescentou

informação importante a respeito de danos a lipídios de membrana pelo

tratamento com reserpina, de modo que animais SHR apresentaram níveis

reduzidos de produtos da peroxidação lipídica desde a condição controle. Estes

dados situam a relevância do metabolismo de monoaminas para a produção e

progressão de danos celulares sob o regime de tratamento com reserpina como

mecanismos secundários e complementares à depleção de monoaminas.

Ainda, os achados obversados no capítulo III se relacionam diretamente

com aqueles descritos no capítulo II, uma vez que um cenário de aumento do

metabolismo de monoaminas pela carga citoplasmática de monoaminas é

compatível com as alterações para expressão de TH e α-sinucleína. Como

discutido no capítulo II, ambas as proteínas de interesse para a DP são

reguladas tanto pelos produtos finais destas vias, como por produtos reativos do

oxigênio produzidos pelo metabolismo de DA. No entanto, a investigação da

relação mecanicística entre estes eventos ainda permanece por ser esclarecida

e requer estudos complementares.

Em conclusão, as evidências apresentadas ao longo deste estudo

reforçam a validade e utilidade do modelo progressivo para a DP induzido pelo

tratamento repetido com baixas doses de reserpina para a melhor compreensão

das alterações neuroquímicas e comportamentais subjecentes à DP. Podemos

destacar como elementos sólidos deste modelo a capacidade de abordar a

progressão destas alterações, assim como modelar fases ou insultos prematuros

na DP. Não somente, o emprego de diferentes linhagens de ratos e a

investigação das diferenças neuroquímicas intrínsecas e/ou induzidas em

resposta a um insulto tóxico-farmacológico também se revelou uma abordagem

interessante para a identificação de passos celulares relevantes para a

105

compreensão da susceptibilidade à DP, com implicações para futuras

estratégias preventivas e/ou terapêuticas.

106

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