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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA
PEDRO DELCY TORRES SINDEAUX FILHO
ALCOOLISMO CRÔNICO COMO UM POSSÍVEL FATOR DE RISCO PARA A
LEISHMANIOSE CUTÂNEA DISSEMINADA
FORTALEZA
2017
PEDRO DELCY TORRES SINDEAUX FILHO
ALCOOLISMO CRÔNICO COMO UM POSSÍVEL FATOR DE RISCO PARA A
LEISHMANIOSE CUTÂNEA DISSEMINADA
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Patologia. Orientador: Profa. Dra. Margarida Maria de Lima Pompeu
FORTALEZA
2017
_____________________________________________________________________
S622a Sindeaux Filho, Pedro Delcy Torres.
Alcoolismo crônico como um possível fator de risco para a Leishmaniose Cutânea Disseminada / Pedro Delcy Torres Sindeaux Filho. – 2017.
118 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia, Fortaleza, 2017.
Orientação: Prof. Dr. Margarida Maria de Lima Pompeu.
Coorientação: Prof. Dr. Anastácio de Queiroz Sousa.
1. Leishmaniose Cutânea Localizada. 2. Leishmaniose Cutânea Disseminada. 3. Leishmania braziliensis. 4. Alcoolismo. 5. Imunossupressão. I. Título.
CDD 571.9
__________________________________________________________________________
PEDRO DELCY TORRES SINDEAUX FILHO
ALCOOLISMO CRÔNICO COMO UM POSSÍVEL FATOR DE RISCO PARA A
LEISHMANIOSE CUTÂNEA DISSEMINADA
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Patologia.
Aprovada em: 27/07/2017
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Profa. Dra. Margarida Maria de Lima Pompeu (Orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Prof. Dr. José Ajax Nogueira Queiroz
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Prof. Dra. Maria Jânia Teixeira
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Prof. Dr. José Wellington de Oliveira Lima Universidade Estadual do Ceará (UECE)
A Deus.
Aos meus pais, Pedro Delcy e Regina Célia.
Para todos que já tiveram um momento de
fraqueza. Não vai doer para sempre, então não
deixe isso afetar o que há de melhor em você.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelo dom da vida e por sempre colocar pessoas especiais no meu caminho;
Aos pacientes que colaboraram com a dissertação;
À Prof. Dra. Margarida Maria de Lima Pompeu, por toda instrução, disponibilidade,
acolhimento maternal, orientações, oportunidades e amizade. Um exemplo de amor a profissão.
Gratidão!;
Ao Prof. Dr. Anastácio de Queiroz Sousa, exemplo de dedicação à ciência e ética, obrigado
pela oportunidade que me proporcionou de conhecer o dia a dia dos pacientes com leishmaniose e de
alguma forma poder ajudá-los;
À Prof. Dra. Diane Isabelle Magno Cavalcante, pelas sugestões sempre enriquecedoras,
conselhos, leitura histológica e amizade. Uma grande cientista!;
À querida professora Dra. Maria Jânia Teixeira pelo exemplo de simplicidade, humildade e
respeito ao aluno. Sou fã número 1! #teamJania;
Ao Prof. Dr. José Wellington de Oliveira Lima, pela realização das análises estatísticas e
sugestões enriquecedoras;
À minha prima Prof. Dra. Mércia Frutuoso Sindeaux, pelos ensinamentos, dicas, treinamentos,
revisão deste trabalho, caronas, cascudos e puxões de orelha (literalmente), agora já posso contar tudo
a tia Vilma! Te amo!;
Aos professore do Programa de Pós-Graduação em Patologia, em especial aos queridos José
Ajax Nogueira Queiroz, Paulo Roberto Carvalho de Almeida, Conceição Aparecida Dornelles e
Fernando Schemelzer de Moraes Bezerra;
Aos professores participantes da banca examinadora pelo tempo, pelas valiosas colaborações
e sugestões. Gratidão!;
Aos amigos (mestrandos e I.Cs) do Laboratório Multiusuário de Patologia (LAMP), Laécio
Paulo Sousa dos Santos, Francisco Vinícius Ferreira da Silva, Antônia Taynara Lima de Sousa, Mariela
Vera Roa, Juliana Azevedo, por serem pessoas maravilhosas, bondosas, amigas, unidas e que sempre
me trataram com um carinho especial. Saibam que amo todos vocês e estou na torcida para que todos
realizem seus anseios profissionais e pessoais;
Aos amigos do laboratório de Parasitologia do DPML, em especial aos queridos Webertty
Mayk Eufrásio de Figueiredo, Claudênia Costa Praciano, Francisco Rafael Marciano Fonseca, Naya
Lúcia de Castro Rodrigues e Rafaelle de Paula Freire. Obrigado pela convivência, companheirismo,
ensinamentos e ajuda psicológica na realização deste trabalho;
Aos colegas do mestrado, pelo convívio e troca de experiências. Agradeço em especial aos que
se tornaram amigos queridos, Cássia Rodrigues Roque e Adriana Estela Flores Valiente (Nicarágua);
Aos amigos que o mestrado me trouxe, José Gleysson Pereira Moura e Pedro Gustavo Oliveira
de Carvalho;
Agradeço imensamente ao Sr. José Artur Camurça Torres pela disponibilidade de nos ajudar
na aplicação dos questionários em vários distritos da zona rural de Baturité e municípios vizinhos.
Gratidão!;
Agradeço aos técnicos da UFC, Kélvia Miranda Sá, Suzana Moreira de Souza e Adalberto
Nascimento de Lima Júnior, devo a vocês praticamente tudo o que sei sobre histotécnicas e imuno-
histoquímica; Gratidão!
Agradeço aos técnicos da UFC, Glauce Rabelo do Amaral, Débora Cavalcante e Francisco
Deomar Maciel da Silva que por muitas vezes me socorreram quando precisei de cortes histológicos.
Amigos maravilhosos!
A todos da secretaria do DPML e do Mestrado, especialmente aos que se tornaram amigos:
Valéria Oliveira Cordeiro, Karoline Lima do Nascimento, Francisca Maria da Conceição Pereira,
Cássia Lílian Soares de Almeida e Maria de Fátima Maia de Andrade. Grandes exemplos de eficiência,
gentileza e disponibilidade. Amo vocês!
A todos os funcionários do DPML, em especial aos queridos Sebastião da Silva Lima,
Michele Pereira Queiroz, Amilton Jorge Lopes Pereira e a todos da equipe de higienização e
portaria. Sempre simpáticos e prestativos;
À minha amada família pelo apoio e carinho. Aos meus avós, tios, tias, primos e primas.
Sindozada!
À minha amada mãe, Regina Célia Holanda Sindeaux, exemplo de dedicação à família, de
força e de coragem! Obrigada pelo amor incondicional! Obrigada pelo esforço na minha educação e
pelo carinho. Não há palavra alguma que expresse a minha gratidão e amor por você;
Ao meu pai e irmãos pela compreensão e apoio durante esses últimos três anos. Sentir a
presença de vocês sempre é motivo de grande alegria em meu coração;
À Universidade Federal do Ceará pela oportunidade desta Pós-Graduação;
À CAPES, pelo apoio financeiro com a manutenção da bolsa de auxílio;
A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
“ Quanto mais sabemos, mais fácil é admitir o que não sabemos. ”
(Leonid S. Sukhorukov).
RESUMO
A Leishmaniose Cutânea Disseminada (LCD) é forma clínica grave de Leishmaniose
Tegumentar Americana (LTA), caracterizada pelo aparecimento de múltiplas lesões
pleomórficas (10), em mais de 2 segmentos corporais não contíguos. O número de casos no
nordeste brasileiro vem aumentando significantemente nas últimas duas décadas, mostrando a
necessidade de se investigar os fatores associados a este aumento. Objetivos: Avaliar a relação
entre alcoolismo crônico e a ocorrência de leishmaniose cutânea disseminada.
Especificamente, descrever as características clínico-demográficas, histopatológicas e
caracterizar a frequência e a quantidade de ingestão de bebida alcoólica dos pacientes com
LCD comparando com os de leishmaniose cutânea localizada (LCL). Material e métodos:
Foi conduzido um estudo caso-controle, constituído por 12 pacientes com LCD e 36 com LCL,
pareados por sexo e idade. Foi biopsiada a lesão ulcerada e as amostras submetidas à análise
histológica, morfométrica e imunohistoquímica para leishmania. Para o levantamento de dados
demográficos e investigação sobre o consumo alcoólico, foi aplicado questionário específico
(AUDIT). Resultados e discussão: No período de 2013 a 2016, na região do maciço de
Baturité, Ceará, Brasil, de 120 pacientes com LTA, foram diagnosticados doze (10%) com
LCD. Sua prevalência foi maior entre homens, em sua maioria lavradores, residentes na zona
rural. O número de lesões por paciente variou de 11 a 184, distribuídas em mais de um
segmento do corpo e acometendo principalmente as extremidades. O tempo de evolução, do
início até a disseminação, foi em média 14 semanas. Na derme dos pacientes LCD, observou-
se moderado a acentuado infiltrado inflamatório crônico linfohistioplasmocitário, com
presença de granulomas imaturos. Amastigotas foram identificadas em 87.5% dos pacientes
com LCD. Foi observado uma correlação positiva entre a carga parasitaria e a intensidade do
infiltrado inflamatório (R2= 0,682 e p=0,0115) bem como com a frequência de plasmócitos
(R2 = 0.99 e p0,0001). Foi constatado que os pacientes com LCD apresentavam um consumo
abusivo de álcool (>60g/dia) (OR= 15; IC 95% = 2,8 - 82; p<0,001) e dependência (AUDIT
≥ 20) (OR = 35, IC 95% = 3,6 - 345, p<0,001). Conclusão: A ingestão abusiva de álcool pode
ser um fator desencadeador da LCD. Palavras chaves: 1. Leishmaniose Cutânea Localizada; 2. Leishmaniose Cutânea Disseminada; 3. Leishmania braziliensis; 4. Alcoolismo; 5. Imunossupressão
ABSTRACT Disseminated cutaneous leishmaniasis (DCL) is an agressive clinical form of tegumentar leshmaniasis
and is characterised by multiple ulcers and papules (>10) present in more than two noncontiguos body
part. There have been a significant increasing in DCL cases in the brazilian northeast region over the
past two decades which indicate the need for research in this increment related factors. Objectives: To
evaluate if there is a relationship between chronic alcoholism and occurrence of disseminated
leishmaniasis. Specifically characterize clinical and epidemiological data, histopathological findings,
amount and frequency of alcohol intake in patients with DL. Patients with localized cutaneous form of
leismaniasis (LCL) were used as control group. Material and methods: Case-control study conducted
with 12 patients with DCL and 36 patients with LCL paired by sex and age. Histopathological,
morphometric and immunohistochemical for leishmania analysis was performed in biopsies from
ulcerated lesions. A specific questionnaire was used to collect demographic data ando to investigate
alcohol consumption. Results and Discussion: Of the 120 patients with cutaneous leismaniasis
dignosed in Baturité, Ceará, from the period from 2013 to 2016, 10% of them presented with DCL.
The prevalence of DCL was higher among men, agricultural workers, living in countryside. The
number of lesions of the patients ranged from 11 to 184, distributed in more than one body segment
with main involvement of the extremities. The mean time of disease evolution from the initial
symptoms to dissemination stage was 14 weeks. Was observed in the dermis, a moderate to severe
chronic inflammatory lymphohistioplasmocytic infiltrate, displaying immature granulomas.
Amastigotes were identified in 87.5% of DCL patients. A positive correlation was observed between
the parasite load and the intensity of the inflammatory infiltrate (R2 = 0.682 and p = 0.0115) as well as
the plasmacyte frequency (R2 = 0.99 and p <0.0001). It was found that patients with DCL presented
an abusive consumption of alcohol (> 60g / day) (OR = 15, 95% CI = 2.8 - 82, p <0.001) and
dependence (AUDIT ≥ 20) 95% CI = 3.6-345, p <0.001). Conclusion:Abusive alcohol intake can be a
triggering factor for LCD.
Key words: 1. Localized Cutaneous Leishmaniasis; 2. Disseminated Cutaneous Leishmaniasis; 3.
Leishmania braziliensis; 4. Alcoholism; 5. Immunosuppression
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Distribuição das espécies de Leishmania spp, causadoras da LTA no
Brasil............................................................................ ............................... 21
Figura 2 Características estruturais das formas Promastigotas e Amastigotas de
Leishmania spp........................................................................................... 23
Figura 3 Ciclo de vida da Leishmania dentro do inseto vetor................................... 24
Figura 4 Ciclo de vida digenético do protozoário Leishmania spp........................... 24
Figura 5 Perfil epidemiológico de leishmaniose cutânea no mundo........................ 25
Figura 6 Formas clínicas da LTA ............................................................................. 30
Figura 7 Formas clínicas da LTA e perfil de resposta imune predominante............. 36
Figura 8 Resposta imunológica na LTA.................................................................. 39
Figura 9 Aparelho Dako® PT Link ........................................................................... 49
Figura 10 Gráfico de recuperação antigênica - Dako® PT Link ................................ 50
Figura 11 Microscópio AXIO Scope A1 Zeiss®........................................................... 51
Figura 12 Fluxograma de biópsias e métodos ............................................................ 53
Figura 13 Fluxograma de seleção de amostras avaliadas .......................................... 54
Figura 14 Fotomicrografia de lâmina de imuno-histoquímica.................................... 65
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 Série histórica de casos de Leishmaniose Tegumentar Americana no Brasil
– 1980 a 2015................................................................................................ 27
Gráfico 2 Série histórica de casos de Leishmaniose Tegumentar Americana no Brasil
por região geográfica– 2000 a 2015.............................................................. 27
Gráfico 3 Distribuição percentual dos pacientes com leishmaniose cutânea localizada
(n=36) e leishmaniose cutânea disseminada (n=12), da área endêmica da
serra de Baturité, Ceará, Brasil, de acordo com a profissão ........................ 56
Gráfico 4 Distribuição percentual dos pacientes com leishmaniose cutânea localizada
(LCL) (n=36) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD) (n=12), da área
endêmica da serra de Baturité, Ceará, Brasil, de acordo com o envolvimento
mucoso................................................................................... 58
Gráfico 5 Pontuação obtida através da avaliação do questionário AUDIT (Alcohol Use
Disorder Identification Test) dos pacientes com leishmaniose cutânea
localizada (LCL) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD) da área
endêmica da serra de Baturité, Ceará, Brasil................................................ 60
Gráfico 6 Área de infiltrado inflamatório (%) e número de amastigotas (mediana)
numa amostra de pacientes portadores de leishmaniose cutânea localizada
(LCL) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD), da área endêmica da
serra de Baturité, Ceará, Brasil.................................................................... 63
Gráfico 7 Representação gráfica do número de granulomas e plasmócitos numa amostra de
pacientes portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL) e leishmaniose
cutânea disseminada (LCD), da área endêmica da serra de Baturité, Ceará,
Brasil..........................................................................................................................
64
Gráfico 8 Correlação entre número de amastigotas e percentual da área do infiltrado
inflamatório numa amostra de pacientes portadores de leishmaniose cutânea
localizada (LCL) (A) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD) (B), da
área endêmica da serra de Baturité, Ceará,
Brasil. ........................................................................................................ 66
Gráfico 9 Correlação entre o número de amastigotas e o de granulomas numa amostra
de pacientes portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL) (A) e
leishmaniose cutânea disseminada (LCD) (B), da área endêmica da serra de
Baturité, Ceará, Brasil.................................................................... 66
Gráfico10
-Correlação entre o número de amastigotas e o de plasmócitos numa amostra de
pacientes portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL) (A) e leishmaniose
cutânea disseminada (LCD) (B), da área endêmica da serra de Baturité, Ceará, Brasil
........................................................................................................................
69
Gráfico11 Correlação entre o número de amastigotas e o grau diário de ingesta de
álcool numa amostra de pacientes portadores de leishmaniose cutânea
localizada (LCL) (A) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD) (B), da
área endêmica da serra de Baturité, Ceará, Brasil..................................... ... 68
LISTA DE TABELAS
Tabela 1A Síntese das características clínicas de pacientes com leishmaniose cutânea localizada
(LCL) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD), da área endêmica da serra de
Baturité, Ceará, Brasil ................................................................................ 57
Tabela 1B Frequência das variáveis clínicas relatadas por pacientes com leishmaniose cutânea
localizada (LCL) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD), da área endêmica da
serra de Baturité-Ceará-Brasil .................................................................................. 58
Tabela 2 Relação entre ingestão diária de álcool (mL) e ocorrência de leishmaniose cutânea
disseminada numa amostra de pacientes portadores de leishmaniose tegumentar
americana, da área endêmica da serra de Baturité, Ceará, Brasil. ............................ 59
Tabela 3 Relação entre indicadores de ingestão de álcool e ocorrência de leishmaniose cutânea
disseminada numa amostra de pacientes portadores de leishmaniose tegumentar
americana, da área endêmica da serra de Baturité, Ceará,
Brasil........................................................................................................................ 62
Tabela 4 Relação entre ingestão de álcool e ocorrência de leishmaniose cutânea disseminada,
estimada através de regressão logística, numa amostra de pacientes portadores de
leishmaniose tegumentar americana, da área endêmica da serra de Baturité, Ceará,
Brasil ........................................................................... .............................................. 64
Tabela 5 Número absoluto de granulomas e plasmócitos e percentual da intensidade do
infiltrado inflamatório numa amostra de pacientes portadores de leishmaniose
cutânea localizada (LCL) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD), da área
endêmica da serra de Baturité, Ceará, Brasil .......................................................... 65
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMPc Monofosfato de Adenosina Cíclica
APC Células Apresentadoras de Antígenos
BAAR Bacilo Álcool Ácido Resistente
CD Clusters of Differentiation – Grupamentos de Diferenciação
CD4+ Marcador de Linfócito T CD4
CD8+ Marcador de Linfócito T CD8
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CTLA Cytotoxic T Lymphocyte Associated Antigen - Antígeno Associado ao
Linfócito T Citotóxico
DAB Diamino-benzidina
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay - Ensaio de Imunoabsorção
Enzimática
EROS Espécies Reativas de Oxigênio
H&E Hematoxilina e Eosina
FOXP3 Do inglês Forkhead box P3- Fator de Transcrição para diferenciação de
células T reguladoras
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IDRM Intradermorreação de Montenegro
IFI Imunofluorescência Indireta
IFN-γ Interferon Gama
iNOS Óxido Nítrico Sintetase Induzida
IL Interleucina
IQH Imuno-Histoquímica
LCL Leishmaniose Cutânea Localizada
LCD Leishmaniose Cutânea Disseminada
LD Leishmaniose Difusa
LM Leishmaniose Mucosa
LTA
LRV1
Leishmaniose Tegumentar Americana
Leishmania RNA vírus 1
LV Leishmaniose Visceral
LIT Liver Infusion Triptose – Infusão Fígado e Triptose
MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade
MS
NNN
Ministério da Saúde
McNeil, Novy e Nicolle – Meio ágar sangue modificado
OPAS Organização Pan-Americana da Saúde
OMS Organização Mundial da Saúde
PCR Polymerase Chain Reaction
RORα Do inglês Retinoic Acid Related Orphan Receptor α- Fator de Transcrição
para diferenciação de células Th17
RORC Do inglês Retinoic Acid Related Orphan Receptor C- Fator de Transcrição
para diferenciação de células Th17
RORγt Do inglês Retinoic Acid Related Orphan Receptor gT- Fator de Transcrição
para diferenciação de células Th17
SFM Sistema Fagocítico Mononuclear
SVS
SIDA
Secretaria de Vigilância em Saúde
Síndrome da imunodeficiência adquirida
SisLeish Sistema Regional de Informações de Leishmanioses
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Th1 Subgrupo funcional de linfócito T auxiliar do tipo 1
Th2 Subgrupo funcional de linfócito T auxiliar do tipo 2
Th17 Subgrupo funcional de linfócito T auxiliar do tipo 17
Treg Células T regulatórias
TGF-β Do inglês Transforming growth factor beta
TNF-α Do inglês Tumor necrosis factor alpha
WHO World Health Organization – Organização Mundial da Saúde
LISTA DE SÍMBOLOS
% Porcentagem
<
>
Menor que
Maior que
μL Microlitros
mL Mililitro
mm Milímetro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 21
1.1 Leishmaniose tegumentar americana e agente etiológico................................. 21
1.2 Transmissão e ciclo biológico........................................................................... 22
1.3 Epidemiologia da leishmaniose tegumentar..................................................... 24
1.4 Formas clínicas com ênfase na leishmaniose tegumentar causada por
Leishmania braziliensis..................................................................................... 28
1.5 Diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana ....................................... 30
1.6 Padrão histológico na leishmaniose tegumentar americana ............................. 33
1.7 Resposta imune na leishmaniose tegumentar americana ................................. 35
1.8 Álcool e resposta imune ................................................................................... 39
2.0 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA............................................................. 43
3.0 OBJETIVOS ................................................................................................... 44
3.1 Objetivo geral ................................................................................................... 44
3.2 Objetivos específicos.......................................................... ............................... 44
4.0 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 45
4.1 Tipo de estudo.................................................................................................... 45
4.2 Aspectos éticos................................................................................................... 45
4.3 Local de estudo.................................................................................................. 45
4.4 Seleção das amostras e coleta de dados............................................................. 44
4.5 Diagnóstico ........................................................................................................ 46
4.6 Análise morfométrica ....................................................................................... 51
4.7 Questionário para avaliação da ingestão de álcool ........................................... 52
4.8 Metodologia de análise dos dados .................................................................... 52
4.9 Desenho experimental do estudo ..................................................................... 53
5.0 RESULTADOS ............................................................................................... 55
5.1 Descrição dos aspectos epidemiológicos........................................................... 55
5.2 Descrição dos aspectos clínicos .............................................................................. 56
5.3 Análise morfométrica das lesões ...................................................................... 62
5.4 Correlação da ingestão diária de álcool com a carga parasitaria ................................. 67
6.0 DISCUSSÃO ................................................................................................ .............. 69
7.0 CONCLUSÕES ............................................................................................. ............ 77
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 78
APÊNDICE I – FICHA DE INVESTIGAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA…............ 92
APÊNDICE II – FICHA DE ADMISSÃO.............................................................. 93
APÊNDICE III – FICHA DE ACOMPANHAMENTO CLÍNICO..................... 96
APÊNDICE IV – TCLE ........................................................................................... 98
ANEXO I – AUDIT .................................................................................................. 101
21
1 INTRODUÇÃO
1.1 Leishmaniose tegumentar americana e agente etiológico
A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença com ampla distribuição
geográfica e apresenta diversidade clínica e epidemiológica, envolvendo várias espécies de
vetores flebotomíneos proximamente associadas com diferentes parasitos do gênero
Leishmania e hospedeiros reservatórios, que propiciam ciclos de transmissão distintos e
complexos (BRITTO et al, 2014).
É uma doença infecciosa, antropozoonótica, não contagiosa, causada por mais de 20
espécies de protozoários do gênero Leishmania, capaz de acometer pele, vísceras e mucosas.
Nas Américas, são atualmente reconhecidas 11 espécies dermotrópicas de Leishmania
causadoras de doença humana e 8 espécies descritas somente em animais (BRASIL, 2009).
No entanto, no Brasil, já foram identificadas 7 espécies, sendo 6 do subgênero Viannia e 1 do
subgênero Leishmania. As principais espécies são: Leishmania (Leishmania) amazonensis, L.
(V) guyanensis e L. (V.) braziliensis. Mais recentemente, L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi, L. (V.)
lindenberg e L. (V.) shawi foram identificadas nas regiões norte e nordeste (OPAS/OMS,
2014).
Figura 1- Distribuição das espécies de Leishmania sp, causadoras da LTA no Brasil. Fonte; Brasil, 2010.
22
Registram-se como possíveis reservatórios naturais, algumas espécies de roedores,
marsupiais, edentados e canídeos silvestres (BRASIL, 2010). No entanto, não há nenhuma
evidência científica demonstrando o papel de animais de estimação como reservatórios de
espécies de Leishmania, sendo estes considerados hospedeiros acidentais. No Brasil, as
principais espécies de vetores envolvidos na transmissão da LTA são Lutzomyia whitmani, Lu.
intemedia, Lu. umbratilis, Lu. Wellcomei, Lu. flaviscutellata, e Lu. migonei (OPAS/OMS,
2014).
1.2 Transmissão e ciclo biológico
As leishmanias possuem um ciclo de vida digenético (heteroxênico), exigindo um
hospedeiro vertebrado e um inseto vetor (hospedeiro invertebrado), sendo capazes de infectar
animais, humanos e os seus vetores, os flebotomíneos (CECÍLIO et al., 2014).
Os dípteros, da subfamília Phlebotominae, são os vetores de várias espécies de
Leishmania considerando-se as 93 espécies envolvidas na transmissão (WHO/OMS, 2010). A
transmissão vetorial ocorre por dois principais gêneros: Phlebotomus, no Velho Mundo e
Lutzomyia, no Novo Mundo (ABDELLATIF; EL-MABROUK; EWIS, 2013). Os hospedeiros
vertebrados incluem cerca de 60 espécies de reservatórios mamíferos como, roedores,
edentados, marsupiais e o homem (CHAARA et al., 2014).
Os parasitos ocorrem sob duas formas evolutivas principais: promastigota e amastigota
(Figura 2). As promastigotas são extracelulares flageladas, medindo de 15-20 µm e são
encontradas no trato digestivo dos vetores flebotomíneos (BESTEIRO et al., 2007; PACE,
2014). Por outro lado, as amastigotas medem cerca de 3-5µm, e são obrigatoriamente
intracelulares e sem flagelo externo, localizadas em células da linhagem fagocítica
mononuclear dos hospedeiros vertebrados (BESTEIRO et al., 2007; PACE, 2014).
No trato digestivo das fêmeas dos flebotomíneos, a forma promastigota procíclicla
se liga à parede do intestino, sofrendo várias mudanças na expressão gênica, na morfologia e
na estrutura da LPG presente na superfície do parasito, metaciclogênese (SACKS & DA
SILVA 1989), resultando na forma infectante do parasito: promastigota metacíclica. Nessa
fase, perde a capacidade de se fixar ao intestino médio e migra para a região da probóscida. A
infecção ocorre quando, durante o repasto sanguíneo do inseto, as formas infectantes do
23
parasito, de 1 a 1000 promastigotas metacíclicas, são liberadas na derme do hospedeiro
mamífero (ALMEIDA; BARRAL; BARRAL-NETO, 2003). Em seguida, os parasitos são
rapidamente captados por células do sistema fagocítico mononuclear (SFM), onde se
diferenciam em formas amastigotas dentro de um compartimento denominado vacúolo
parasitóforo, onde fusionam-se com o lisossomo, formando os fagolisossomos, onde se replica
por divisão binária em meio ácido rico em enzimas hidrolíticas. Logo depois, o macrófago se
rompe, liberando para o meio extracelular formas amastigotas que serão novamente
fagocitadas por outras células do hospedeiro vertebrado, continuando assim o ciclo do parasito
no hospedeiro vertebrado. A continuidade do ciclo se dá quando o flebotomíneo torna a se
alimentar de hospedeiros vertebrados infectados, adquirindo as formas amastigotas (CECÍLIO
et al., 2014).
Figura 2: Características estruturais das formas (A) Promastigotas e (B) Amastigotas de Leishmania sp. Figura “adaptada de Besteiro et al, 2007”. Corpos multivesiculares (MVBs) e Retículo endoplasmático (RE).
Uma vez que o vetor se alimenta novamente de um hospedeiro infectado, o sangue
ingerido contem macrófagos infectados com leishmania, na forma amastigota, começando
aqui o ciclo de vida do parasito dentro do vetor. Assim, amastigotas são liberadas no intestino
após a ruptura dos macrófagos onde se diferenciam em vários estágios, desde promastigotas
procíclicas flageladas não infectantes, localizadas no intestino do vetor até promastigotas
metacíclicas infectantes, localizadas no intestino médio torácico, as quais serão inoculadas em
24
um novo hospedeiro vertebrado durante um repasto subsequente, fechando assim o ciclo.
(Figura 3) (OLIVEIRA et al., 2009; BESTEIRO et al., 2007) e (Figura 4) (CDC, 2014).
Figura 3: Ciclo de vida da Leishmania dentro do inseto vetor. 1- Amastigotas; 2-Prociclica; 3-Nectomonas; 4-Heptomonas; 5- Leptomonas; 6- Promastigota metacíclica.
Figura 4: Ciclo de vida digenético do protozoário Leishmania spp. Adaptado (CDC), 2014.
1.3 Epidemiologia da leishmaniose tegumentar
1.3.1 Cenário mundial
25
A leishmaniose tegumentar é considerada pela Organização Mundial da Saúde (OMS)
importante problema de saúde pública em 98 países, com registro anual de 1 a 1,5 milhões de
casos (GOTO et al, 2012); (WHO, 2013). A doença é amplamente distribuída nas Américas,
no Mediterrâneo e na Ásia. Os dez países que juntos são responsáveis por 70 a 75% da
estimativa de incidência global são: Afeganistão, Argélia, Brasil, Colômbia, Costa Rica,
Etiópia, Irã, Peru, Sudão e Síria (WHO, 2016) (Figura 5). No continente americano existem
registros do sul dos Estados Unidos ao norte da Argentina.
Estimativas da OMS é de que cerca de 0,2 a 0,4 milhão de novos casos de leishmaniose
visceral (LV) e 0,7 a 1,2 milhões de novos casos de Leishmaniose Tegumentar (LT) ocorrem
a cada ano em todo o mundo (WHO, 2013).
Figura 5: Perfil epidemiológico de leishmaniose cutânea no mundo (WHO, 2013).
As leishmanioses sempre foram um problema de saúde pública em destaque, ocorrendo
em países da Europa, África, Ásia e América, apresentando um alto grau de impacto
econômico (ANDRADE et al., 2007; BRELAZ et al., 2012). Dentro desse contexto, a doença
26
é considerada pela OMS como uma das seis mais importantes doenças infecciosas, pelo seu
alto coeficiente de detecção e capacidade de produzir deformidades (BRASIL, 2010).
Nas Américas, as leishmanioses são um problema de saúde pública devido a sua
magnitude, distribuição geográfica e por produzir formas clínicas que podem causar morte,
incapacidade ou mutilações. A doença é endêmica em 18 países americanos, estando os casos
distribuídos desde o México à Argentina (OPAS/OMS, 2015). No período de 2001 a 2013
foram registrados 743.970 casos, com uma média anual de 57.228 casos. Em 2013, 16 países
da região registraram no Sistema Regional de Informações de Leishmanioses da OPS/OMS
(SisLeish), 47.492 casos de leishmanioses cutânea e mucosa, não estando reportados os dados
de Venezuela e Guiana Francesa. Os casos ocorreram em 149 Estados e em 2.701 municípios
das Américas. Do total de casos, 78,8% (37.402) estão concentrados no Brasil e em países da
sub-região Andina (OPAS/OMS, 2015).
Nos últimos anos, a Organização Pan-Americana da Saúde/Organização Mundial da
Saúde (OPAS/OMS) vem apoiando estes países endêmicos e trabalhando em esforço conjunto
para fortalecer as ações de vigilância e controle, com o objetivo de reduzir as formas graves
da doença, através do acesso ao diagnóstico precoce, tratamento adequado e redução do
contato do homem com o vetor. As notificações dos casos vêm diminuindo nestes países e
principalmente no Brasil (OPAS/OMS, 2015).
1.3.2 Cenário local
O Brasil é o terceiro país com o maior número de casos novos registrados no mundo,
com uma média anual de aproximadamente 21.000 casos, no período de 2009 a 2013, 10%
dos casos registrados no mundo, superado apenas por Síria e Afeganistão (WHO, 2016). A
doença atinge todas as Unidades Federativas do país. Em 2014 foram notificados 20.418 casos
novos (BRASIL, 2016).
A forma tegumentar nas Américas é denominada LTA e nas últimas duas décadas, a
incidência no Brasil vem mostrando expansão geográfica, com relatos de casos autóctone em
todos os Estados a partir de 2003. Além de representar um problema de saúde pública, a LTA
reveste-se de grande importância, pelo risco de produzir deformidades no indivíduo, levando
a repercussões na esfera psicológica, social e econômica, observando-se que a maioria dos
casos tem caráter ocupacional (BRASIL, 2007; BRASIL, 2016).
No Brasil, nos últimos 5 anos, foram registrados em média 21.000 casos/ano (gráfico
1), com coeficiente de incidência de 11,3 casos/100.000 habitantes. A região que apresenta o
27
maior coeficiente é a região Norte (54,4 casos/100.000 habitantes), seguida das regiões Centro-
Oeste (22,9 casos/10.000 habitantes) e Nordeste (14,2 casos/100.000 habitantes) (SVS/MS,
2016). No entanto, o Nordeste é a segunda com maior número de casos (gráfico 2).
Considerando as dificuldades de registro, devido a vários fatores, é provável que o número
real de casos seja muito maior do que o registrado pelos serviços de saúde.
Gráfico 1: Série histórica de casos de Leishmaniose Tegumentar Americana no Brasil – 1980 a 2015. Fonte: SVS/ Ministério da Saúde do Brasil, 2016.
Gráfico 2: Série histórica de casos de Leishmaniose Tegumentar Americana no Brasil por região geográfica– 2000 a 2015. Fonte: SVS/ Ministério da Saúde do Brasil, 2016.
28
De acordo com dados do Ministério da Saúde, o Ceará está entre os três estados de
maior detecção da doença no Nordeste, estando atrás apenas da Bahia e do Maranhão (MS,
2014). No período de 2005 a 2015 foram registrados 9.965 casos de LTA, uma média de 905
casos anuais (SVS, 2016). As microrregiões de maior incidência em ordem decrescente são:
Tianguá, Baturité, Itapipoca, Sobral, Crato e Juazeiro do Norte (CEARÁ, 2012).
A Macrorregião Administrativa de Baturité é composta de 13 municípios, ocupando
uma área de 3.750,1 Km², ou 2,6% do território cearense, com população de 239.000
habitantes (IBGE, 2014). Em 2015, houve 151 casos de LTA nesta região e um total de 529
casos no Estado, sendo esta área responsável por 28,54 % dos casos no Ceará (DATASUS,
2015). Os municípios com maior número de casos foram: Pacoti (95), Guaramiranga (18),
Baturité (12) e Mulungu (11) (DATASUS/2015). Esses dados mostram que o maciço de
Baturité é uma área endêmica importante de transmissão da leishmaniose tegumentar, no
Ceará.
1.4 Formas clínicas com ênfase na leishmaniose tegumentar causada por Leishmania braziliensis
A LTA, no Brasil, apresenta peculiaridades clínicas, segundo a área geográfica onde
houve a transmissão para o homem, contribuindo para a forma clínica a espécie do parasita,
do vetor, do reservatório e as características dos ecossistemas. São descritas quatro formas
clínicas principais: Leishmaniose Cutânea Localizada (LCL), Leishmaniose de Mucosa (LM),
Leishmaniose Cutânea Disseminada (LCD) e Leishmaniose Difusa (LD) (MARSDEN et al,
1986; JONES et al, 1987; MARZOCHI et al, 1994; SCORZA et al, 2017).
A LCL é a forma mais comum, caracterizando-se pela presença de uma ou várias
úlceras de bordas elevadas e fundo granuloso com predileção por áreas expostas (Figura 7-A).
As lesões na pele têm início no sítio da picada do vetor, geralmente em áreas corpóreas
expostas de indivíduos procedentes de zonas endêmicas, onde ocorre a inoculação das formas
infectantes (FURTADO, 1994). O período de incubação pode variar de duas semanas a vários
meses pós picada do inseto vetor infectado (PESSOA; BARRETO, 1944; WALTON, 1987;
PEARSON; SOUSA, 1987). Após esse período, no local da picada, surge pápula eritematosa
que evolui para nódulo. A lesão clássica é a úlcera indolor com bordas elevadas, emolduradas
e com fundo contendo tecido de granulação grosseiro (MARZOCHI, 1994; SCORZA et al,
2017).
29
A LM ocorre em cerca de 3% dos casos e pode progredir para intensa destruição
tecidual da mucosa nasal, tornando-se doença grave (MARSDEN, 1986; LESSA et al., 2007)
(Figura 7-B). O acometimento mucoso pode ser simultâneo ou não com lesões cutâneas,
surgindo por extensão da infecção pela disseminação do parasito através das vias
hematogênica e/ou linfática, após um período de latência de vários meses ou anos. O quadro
mucoso manifesta-se sob a forma de pólipo, úlcera, lesão infiltrativa ou perfurante, entre
outras. Na grande maioria dos casos, a LM atinge a mucosa nasal, a oral e, raramente, outros
sítios mucosos, levando à possibilidade de deformidades permanentes (BARRAL-NETTO,
1997; PEARSON, 2000; SCORZA et al, 2017).
A LCD é forma grave de LTA (TURETZ et al, 2002) (Figura 7-C). A história natural
da doença nestes pacientes inicia com uma ou várias lesões localizadas com as características
clássicas de úlceras de fundo granuloso e bordas elevadas. Posteriormente ao desenvolvimento
das lesões primárias, acontece um fenômeno provavelmente por disseminação do parasito por
via hemática ou via linfática, mais ou menos aguda, que se estabelece em poucos dias, às vezes
em 24 horas, causando lesões distantes do local da picada. Apresenta peculiaridades no quadro
clínico: múltiplas lesões pleomórficas em diversos segmentos corporais, elevado índice de
associação com lesão mucosa (38-48%), presença de sintomas sistêmicos no momento da
disseminação e a ausência de comorbidades imunossupressoras (COSTA et al., 1986;
CARVALHO et al., 1994; TURETZ et al., 2002; MACHADO et al., 2011; SCORZA et al,
2017). A LCD é uma apresentação clínica incomum de LTA descrita inicialmente por Gaspar
Vianna, em 1911 (SOUSA, 2009), em um paciente de Minas Gerais. Em 1986, COSTA e
colaboradores definiram LCD como sendo uma forma caracterizada por múltiplas lesões
pleomórficas (acneiforme, nodular, papular e ulcerada), localizadas em duas ou mais partes do
corpo. TURETZ e colaboradores (2002) refinaram a definição - a presença de 10 ou mais
lesões, acometendo dois ou mais segmentos do corpo. No Ceará a única espécie até então
identificada por causar este quadro é a L.(V)braziliensis (SCHRIEFER et al., 2008). Não há
informações sobre a real prevalência da LCD no Estado, diferentemente da Bahia, mas pelos
dados disponíveis em prontuários e fichas clínicas, esta apresentação representa menos de 1%
do total de casos de leishmaniose cutânea.
A leishmaniose difusa (LD) manifesta-se pela presença de nódulos não ulcerados e
lesões infiltradas distribuídas por todo tegumento, em pacientes anérgicos a antígenos de
leishmania (SILVEIRA et al., 2004, SILVEIRA et al., 2009) (Figura 7-D). É uma forma menos
comum de LT, tendo comumente como agente etiológico a L. amazonensis (CARVALHO,
1994).
30
A LCD também deve ser diferenciada da Leishmaniose Difusa, forma anérgica de
LTA, associada à L. amazonensis, apresentando-se com múltiplas lesões não ulceradas e
riqueza de parasitos nessas lesões, que não responde aos tratamentos convencionais.
Figura 6: Formas Clínicas da Leishmaniose Tegumentar Americana. A - Forma Cutânea Localizada. B - Forma Mucosa. C - Forma Cutânea Disseminada. D - Forma Difusa.
A
B
C
D
1.5 Diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana
O diagnóstico precoce e correto da LTA é de fundamental importância para o
estabelecimento de um tratamento efetivo, evita o desenvolvimento de uma doença crônica,
por vezes com lesões desfigurantes (VAN DER MEIDE et al., 2005).
Fonte: Dr. Anastácio de Queiroz Sousa (A, B, C) e Dra. Aldina Barral (D)
31
Diferentes técnicas são empregadas no diagnóstico da LTA, e muitas vezes, diferentes
métodos são associados para se chegar ao diagnóstico final (CARVALHO, 2000), como: (1)
observação clínica e epidemiológica; (2) detecção em material de biópsia, com pesquisa direta
do parasito em esfregaços de pele, imprints, corados pelo método de May-Grunwald-Giemsa
(Giemsa solução a 10%), (3) estudo histopatológico de secções de fragmentos de pele corados
pela Hematoxilina-Eosina (H&E); (4) pesquisa indireta do parasito por meio de isolamento
em cultura e inoculação em animais susceptíveis como o Mesocricetus auratus (hamster); (5)
intradermorreação de Montenegro (IDRM); (6) Imunohistoquímica; (7) detecção do DNA do
parasito pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (SHIRIAN et al., 2014; VERNAL et al.,
2016).
A sensibilidade de cada método diagnóstico pode variar de acordo com a experiência
de cada serviço, a qualidade dos equipamentos e insumos utilizados, o tempo de evolução das
lesões, as formas clínicas da LTA avaliadas e as diferentes espécies de Leishmania envolvidas
na doença (BRASIL, 2010).
O diagnóstico clínico da LCL pode ser feito com base nas características da lesão
associadas à anamnese, onde os dados epidemiológicos são de grande importância,
especialmente se o paciente é proveniente de áreas endêmicas ou esteve presente em lugares
onde há transmissão. A leishmaniose produz um amplo espectro de lesões, o que torna o
diagnóstico clínico nem sempre simples ou imediato. Entretanto, a confirmação do diagnóstico
pela observação do parasito é fundamental, tendo em vista o número de doenças que,
clinicamente podem se assemelhar à LTA, tais como esporotricose, blastomicose, hanseníase,
neoplasias (GOTO & LINDOSO, 2010). O diagnóstico de certeza da LTA requer a detecção
do parasito em sítios de infecção, antes do início do tratamento (BRASIL, 2010; WHO, 2011).
1.5.1 Diagnóstico laboratorial da LTA
Os métodos diagnósticos que permitem a detecção direta do parasito são atualmente os
métodos de escolha para diagnóstico de LTA por serem de mais fácil execução, resultado
relativamente rápido e custo baixo. Dentre esses métodos estão o histopatológico, o esfregaço
para imprint e a cultura em meio NNN (McNeil, Novy e Nicolle). A sensibilidade destes
métodos, de uma maneira geral, decresce de acordo com o tempo de evolução da doença,
lesões mais antigas apresentam menos parasitos. (FABER et al., 2003).
A biópsia da borda da lesão, um teste parasitológico, é realizada com punch de 2 ou de
3 mm em segmento livre de infecção secundária. O fragmento é fixado em formol tamponado
32
a 10%, processado e os cortes corados com giemsa e/ou hematoxilina-eosina e examinados ao
microscópio. A chance de se encontrar o parasito é inversamente proporcional ao tempo de
duração da lesão e a sensibilidade do método nos casos produzidos por L. braziliensis está em
torno de 100% nos dois primeiros meses de evolução, 75% aos seis meses e 20% acima dos
12 meses (GONTIJO; CARVALHO, 2003).
O meio de cultura utilizado para diagnóstico de LTA é o NNN (ágar sangue
modificado) e LIT (Liver Infusion Triptose), entre 24ºC e 26ºC. As amastigotas crescem
relativamente bem nesses meios, obtendo-se uma sensibilidade em torno de 68.2%. Embora
permita a determinação da espécie de Leishmania sp. envolvida, a cultura é um método
dispendioso e muitas vezes prejudicado pela falta de cuidado na coleta, necessita ser realizada
de maneira estéril, apresentando uma taxa de contaminação por fungos e bactérias da própria
pele de 5,9% (CHOUIHI et al., 2009).
Outros métodos podem ser usados no diagnóstico de LTA de forma complementar,
como a inoculação em animal experimental, a intradermorreação de Montenegro, testes
sorológicos e moleculares. A inoculação em animal experimental é um método complexo e de
alto custo, sendo mais aplicado a estudos sobre a evolução da doença e desenvolvimento da
forma mucosa (MOURA et al., 2005).
A Intradermorreação de Montenegro (IDRM) expressa a reação de hipersensibilidade
celular retardada (reação de hipersensibilidade tipo IV) ao antígeno da Leishmania sp.
(NOGUEIRA et al., 2008). Resultados falsos positivos podem significar aplicação anterior de
antígeno da própria IDRM, exposição ao parasito sem doença (comum em áreas endêmicas),
alergia ao diluente do teste ou reação cruzada com outras doenças, como tuberculose (SOUZA
et al., 1992). A IDRM persiste positiva indefinidamente, mesmo após a cura da lesão, não
sendo um teste diagnóstico de escolha para diagnóstico de doença ativa, entretanto, funciona
como indicador de sensibilização com Leishmania.
Os testes sorológicos detectam anticorpos anti-leishmania circulantes no soro dos
pacientes, com títulos geralmente baixos. A técnica de ELISA (Ensaio Imuno Enzimático)
apresenta uma sensibilidade de 84.6% e especificidade de 96.2% para diagnóstico da forma
cutânea mucosa da LTA causada pela L. (V.) brasiliensis (GIL et al., 2011). Esse método ainda
não está disponível comercialmente, tendo seu uso restrito à pesquisa.
A Imunofluorescência indireta (IFI) tem sensibilidade em torno de 78% e
especificidade de 85% no diagnóstico de LTA causada pela L.(V.) braziliensis (DE
OLIVEIRA et al., 2013). Alguns pacientes apresentam resposta persistentemente negativa,
mas aqueles com lesões cutâneas múltiplas ou mucosas estão associados à presença de títulos
33
mais altos (DE OLIVEIRA et al., 2013). A IFI não deve ser utilizada como critério isolado
para diagnóstico de LTA, pois apresenta muitos resultados falsos negativos e reações cruzadas
(DE OLIVEIRA et al., 2013).
As técnicas de imunohistoquímica (IHQ), para detecção de amastigotas, foram
previamente descritas em cães (LIVNI et al., 1983; FERRER et al., 1988; BOURDOISEAU
et al., 1997; TAFURI et al., 2004) e no homem (LIVNI et al., 1983; BARBOSA et al. 1988;
SALINAS et al., 1989; KENNER et al., 1999; QUINTELLA et al., 2009). Sua utilização tem
obtido sucesso no diagnóstico de LTA (WEIGLE et al., 1987; SALINAS et al., 1989;
KENNER et al., 1999; SCHUBACH et al., 2001; QUINTELLA et al., 2009). A detecção de
amastigotas de Leishmania, em cortes fixados por formalina tamponada e incluídos em
parafina, tanto de tecidos humanos como em cães, tornou-se rotina, pela sua simplicidade, por
não necessitar de equipamentos especiais, e ser altamente sensível e específico (LIVNI et al.,
1983; FERRER et al., 1988; BOURDOISEAU et al., 1997; TAFURI et al., 2004). A
introdução da Imunohistoquímica trouxe grande avanço na histopatologia, o que motiva seu
uso cada vez mais frequente, para o diagnóstico de doenças infecto-parasitárias (PEREIRA et
al., 2008).
Por fim, o PCR (Reação em Cadeia de Polimerase) é um método que vem sendo
utilizado para fins de pesquisa, acrescentando muito a sensibilidade quando associada aos
métodos parasitológicos tradicionais, apresentando sensibilidade de 98,41% e especificidade
de 95,59% no diagnóstico da LTA (SATOM et al., 2013). Esse método está indicado na
investigação dos pacientes suspeitos de LTA com testes parasitológicos convencionais
negativos. Vale ressaltar que, em áreas endêmicas, esta técnica precisa ser utilizada com
cautela, pois muitos pacientes podem ter DNA do parasito sem doença, mas sim, por infecção
prévia.
1.6 Padrão histológico na leishmaniose tegumentar americana
O perfil histológico da LCL pode variar desde um infiltrado inflamatório inespecífico
de células mononucleares com neutrófilos de permeio, até reação granulomatosa com ou sem
necrose. Essas variações dependem da virulência da cepa do parasito, do tamanho no inóculo
inicial e do perfil imunológico do indivíduo. Segundo alguns autores, essas variações não se
correlacionam com o prognóstico e nem com a resposta terapêutica (BITTENCOURT E
BARRAL, 1991; MEHREGAN et al., 1999).
34
Nos fragmentos de tecido obtidos das bordas das lesões de pacientes com LTA
observam-se uma resposta inflamatória tecidual à infecção. Esta inflamação tissular em parte
reflete diferenças nas respostas imunológicas do hospedeiro à Leishmania. Os achados
histológicos são inespecíficos, e estão correlacionados com a apresentação clínica, sendo que
nas lesões agudas o principal sítio da reação é a derme. O exsudato geralmente é constituído
predominantemente por macrófagos associados à linfócitos e plasmócitos, podendo ter células
gigantes. Além disso, são observadas áreas de necrose na epiderme, na derme e na parede
vascular, com vasculite, que parecem resultar de uma reação do tipo antígeno-anticorpo com
excesso de antígenos. Amastigotas nos macrófagos podem ser detectadas principalmente nas
papilas dérmicas e próximo às áreas de necrose. Podem ser visualizadas pequena quantidade
de neutrófilos e eosinófilos (MAGALHÃES et al., 1986; MEHREGAN et al., 1999). A reação
granulomatosa pode ocorrer sob forma de granulomas tuberculóides ou por vezes parcialmente
desorganizados em conjuntos de células epitelióides e gigantes tangenciando áreas de necrose
e depósitos fibrinóides (MAGALHÃES et al, 1986; VIEIRA et al, 2002). Granulomas são por
vezes bem delimitados, constituídos por células epitelióides, encontrando-se mais raramente
algumas células gigantes; outras vezes esses granulomas são mal delimitados perivasculares
ou em torno de anexos. Mais tardiamente, ocorre regressão do infiltrado inflamatório celular,
surgindo fibrose e ocorrendo a redução do número de parasitas. Os anexos cutâneos sofrem
hipotrofia ou atrofia, com alterações epidérmicas constituídas de acantose e papilomatose,
conhecida como hiperplasia pseudo-epiteliomatosa (WEIGLE & SARAVIA, 1996; NYLEN
& EIDSMO, 2012).
Amastigotas são raramente detectadas (DE MAGALHÃES et al, 1986;
BITTENCOURT; BARRAL, 1991). Nos casos em que é observado, é principalmente um
infiltrado histiolinfoplasmocitário, sem parasitos, o que corresponde à maioria e a
plasmocitose constitui um elemento sugestivo (RIDLEY et al., 1980).
Na forma disseminada, a histopatologia exibe um infiltrado mononuclear
linfoplasmocitário na derme (ROSA, MACHADO, 2011). Pacientes podem apresentar uma
reação tissular com ou sem a formação de granulomas e poucos parasitos (amastigotas) são
observados. As lesões acneiformes mostram um intenso infiltrado inflamatório em torno dos
folículos pilosos com predominância de macrófagos, linfócitos e células plasmáticas
(CARVALHO et al., 1994).
Exame histopatológico pode ser útil no diagnóstico diferencial da LTA com doenças
que se assemelham clinicamente, como a paracoccidioidomicose, hanseníase e neoplasias.
Além disso, o estudo histopatológico das lesões cutâneas é relevante para fornecer dados que,
35
associados aos achados clínicos e epidemiológicos, podem sugerir o diagnóstico de
leishmaniose (SCHECHTER et al., 1998; D’ÁVILA et al., 2004).
1.7 Resposta imune na leishmaniose tegumentar americana
Diferentemente dos modelos murinos isogênicos experimentais com L.major, que
apresentam dicotomia da resposta imune, com perfil de respostas Th1 (C57B-6) ou Th2
(BALB-c) bem definidas, em pacientes com LTA existe uma misto das respostas Th1 e Th2
(DE MOURA, 2005). De modo geral, os pacientes com LCL manifestam resposta imune
celular contra Leishmania, avaliada pelo teste de Montenegro, bem como resposta imune
humoral (CONVIT et al. 1993). Na fase ativa da LCL, há predominância de linfócitos TCD4+
com produção tanto de citocinas de perfil Th1 (IFN-y, TNF-α) quanto do tipo Th2 (IL-4, IL-
10). Em indivíduos que apresentam regressão espontânea da lesão há maior produção de IFN-
γ e baixos níveis de IL-4 (COUTINHO et al. 1998). A predominância de citocinas Th1 sobre
as de Th2 parece ser o perfil mais comumente encontrado na LCL (PIRMEZ et al. 1993,
CONVIT et al. 1993).
Na LM, polo de hipersensibilidade da LTA, causada por L. (V.) braziliensis, os
pacientes apresentam forte resposta imune celular, concomitante a uma progressiva lesão
tecidual. As concentrações de IFN-γ, IL-2, IL-5, IL-17 e TNF-α são maiores quando
comparadas com a forma LCL. Nas lesões, há um intenso infiltrado inflamatório abundante
em linfócitos e plasmócitos, com poucos macrófagos contendo escassos parasitos. Existe um
misto da resposta Th1 e Th2 com elevados níveis de IL-2, IL-4, IL-5 e TNF-α e baixa
expressão do receptor intralesional de IL-10. A maioria dos linfócitos são LTCD4+ com perfil
Th1, havendo elevada expressão de TNF-α nas lesões, o que pode ser acompanhado ou não da
expressão de IL-4 (SILVEIRA et al, 2004). Recentemente, demonstrou-se que lesões de LM
tendem a ter também uma maior expressão de IL-17 e células Th17, do que as lesões de LCL,
uma citocina que induz inflamação e pode estar envolvida na patogênese da doença (SCORZA
et al, 2017). Embora ocorra a síntese de IFN-γ durante a infecção por esta espécie, necessário
para o controle da infecção, não está esclarecido o porquê dos pacientes desenvolverem a
doença.
Pacientes com LCD sintetizam menos IFN-y e TNF-α (TURETZ et al., 2002) e
apresentam níveis de anticorpos mais elevados quando comparados com pacientes de LCL
(LEOPOLDO et al., 2006). Por apresentarem um perfil predominante Th2, os indivíduos com
LCD demonstram uma menor capacidade de contenção da infecção do que pacientes com a
36
forma cutânea simples (VIEIRA et al., 2002). Essa resposta poderia ser explicada por estes
pacientes desenvolverem uma resposta imune inicial não protetora, favorecendo a
disseminação hematogênica do parasito. A parasitemia explica o fato de alguns pacientes
apresentarem sintomas prodrômicos como febre, calafrios, mal-estar e dores no corpo
(TURETZ et al., 2002). Pacientes com LCD são também comumente não reatores ao teste de
intradermorreação de Montenegro - IDRM (LEOPOLDO et al., 2006). Mesmo com a maioria
dos pacientes apresentando uma resposta imune celular menos efetiva, a maioria apresenta
uma boa resposta ao tratamento e evoluem para a cura, com conversão da IDRM.
Na forma difusa produz-se lesões crônicas e disseminadas, as quais se assemelham às
da hanseníase e são mais difíceis de curar. Estas lesões múltiplas contêm elevado número de
parasitos e são causadas pela L. amazonensis, em nosso país. Ao contrário da forma mucosa,
que induz um aumento da imunidade celular do hospedeiro, a leishmaniose difusa é
caracterizada por ausência de resposta celular e não reatividade ao teste de Montenegro
(LAINSON, 1983). Durante a infecção, pacientes acometidos por esta forma falham em
produzir uma resposta imune mediada por células. Devido a falta da expressão de mRNA para
IFN-γ e baixa expressão para IL-12 e iNOS, são incapazes de controlar a multiplicação
parasitária e a progressão da doença. Além disso, altos títulos de anticorpos específicos contra
o parasito são exibidos, bem como uma resposta quase exclusivamente do tipo Th2, com
elevados níveis de IL-4 (SHARMA et al., 2009) e de IL-10 (SCORZA et al, 2017) . Em suma,
tem se o seguinte cenário imunológico para as formas clínicas da LTA (Figura 8).
Figura 7: Formas clínicas da LTA e perfil de resposta imune predominante. Adaptado de Sousa, MA, 2014.
37
1.7.1 Atualizações na resposta imune na LTA
Hoje, sabe-se que o desfecho clínico da LTA é oriundo da diferenciação das distintas
subpopulações de células TCD4+ (Th1, Th2, Th17 e células T regulatórias) direcionando para
diferentes tipos de resposta imunológica e manifestações clínicas (Figura 9) (FOWELL, 2009).
Recentemente uma outra subpopulação de células TCD4+ vem sendo alvo de intensas
pesquisas que especulam sua função como reguladoras das respostas imunes fisiológicas e sua
participação em diversas enfermidades. Entre as células T com esta função temos as células T
regulatórias. As células T regulatórias (Tregs) representam uma subpopulação de linfócitos T
caracterizados pela elevada expressão da molécula CD25+ (uma cadeia alfa de IL-2) e do fator
nuclear FOXP3. Induzem a supressão das células T efetoras, bloqueando a ativação e a função
destes linfócitos, sendo importantes na modulação da resposta imunológica a antígenos
próprios e não-próprios (CAMPBELL, 2007; SOJKA, 2008).
Tem sido demonstrado que as Tregs reduzem a ativação, proliferação e produção de
citocinas das células T efetoras (THORNTON, 1998; JONULEIT, 2001; PICCIRILLO, 2001),
bem como a apresentação de antígenos pelas células dendríticas. E este perfil imunoregulatório
pode corroborar com a resposta imunológica menos eficaz contra os antígenos de Leishmania
na LCD. A característica central das células Tregs é a sua função imune supressora, mediada
através de um conjunto de mecanismos diversos, como a inibição através do contato célula-
célula, onde a supressão da célula-alvo ocorre devido a liberação de fatores de supressão
incluindo o monofosfato de adenosina cíclica (AMPc), citocinas supressivas como o TGF –β,
citólise direta (Fas e granzima B) ou sinalização negativa através da molécula CTLA-4. Outro
mecanismo supressor utilizado pelas Tregs é a expressão e liberação de fatores de supressão
solúveis como citocinas IL-10, TGF-β e IL-35 ou secreção de fatores supressivos pelas APC
como adenosina. Uma outra forma de atuação destas seria através da competição por fatores
de crescimento, citocinas que sinalizam através de receptores da cadeia γ comum (IL-2, IL-4
e IL-7), isto levaria a célula alvo a apoptose por privação destas citocinas (SOJKA et al.,2008).
Outra importante característica das células T regulatórias inclui a sua dependência da
interleucina (IL-2), e a ausência de expressão de citocinas efetoras que estão associadas com
outras linhagens de células Th, tais como o IFN-γ, IL-4, IL- 17, e regulação distinta do seu
metabolismo intracelular (WILLIAMS-RUDENSKY, 2007). Autores como Campanelli et al
(2006) e Rodrigues et al. (2013) detectaram células com fenótipo Treg em lesões de pacientes
com LTA causada por L. braziliensis. A presença dessas células nas lesões, ocorreu em baixa
densidade, sendo responsáveis pelo controle da resposta inflamatória exacerbada em
38
indivíduos com LCL (RODRIGUES et al, 2013). Estudos experimentais murinos sugeriram
que as células Treg têm um papel de controle nas respostas imunológicas excessivas mediadas
por células Th1 / Th2. Neste estudo, no modelo de susceptibilidade (BALB/c), as células Treg
são responsáveis pela supressão das respostas imunes Th2 exacerbadas, enquanto que em
modelos resistentes (C57Black-6), essas células promovem o controle da resposta Th1,
permitindo a persistência de baixo parasitismo, o que ajuda a manter a resposta imune para
evitar a reinfecção (MENDEZ, RECKLING, PICCIRRILO, 2004).
Por mais de duas décadas, a maioria dos fenômenos relacionados à imunidade
adaptativa foi explicada unicamente pelo paradigma Th1 x Th2. Todavia, uma outra
subpopulação de célula T, produtora de IL-17 - citocina proinflamatória, foi descrita como
uma linhagem celular que se desenvolve de forma independente (KIMURA & KISHIMOTO,
2010). As células Th17 foram primeiramente associadas à indução de doenças autoimunes e
inflamação tissular, sendo capazes de produzir principalmente IL-17A, IL-17F e outras
citocinas inflamatórias (BASSO, CHEROUTRE, MUCIDA, 2009).
Diferentemente dos perfis Th1 e Th2, cuja diferenciação é dependente de suas citocinas
efetoras, a diferenciação de linfócitos Th17 não requer a presença de IL-17. Duas outras
citocinas – IL-6 e TGF-β – atuam induzindo sinergicamente a expressão do gene RORC. Este
codifica o receptor nuclear RORγt, fator de transcrição necessário para a diferenciação do
perfil Th17 (MANEL et al., 2008). A IL-21 parece ser necessária para a expansão deste perfil,
enquanto que IL-23 promove sua manutenção (BETTELLI et al., 2008).
Nas leishmanioses, o papel do perfil Th17 ainda não foi totalmente esclarecido.
Bacellar et al. (2009) demonstraram que a IL-17 é produzida in situ durante a fase ativa da
LTA, estando diretamente correlacionada à produção de TNF-α. Além disso, a intensidade do
infiltrado inflamatório está associada ao número de células que expressam IL-17, levando os
autores a acreditarem que a citocina pode estar envolvida na patogênese da LTA. Em
compensação, detectaram IL-17 em indivíduos infectados, mas que não desenvolveram a
doença. Similarmente, IL-22 também já foi associada tanto à proteção quanto ao dano tecidual
em infecções. Sonnenberg et al. (2010) sugerem que a ação pró- ou anti-inflamatória dessa
citocina esteja associada aos níveis de IL-17 presentes no microambiente. Pitta et al. (2009)
observaram células Th17 produtoras de IL-17 e IL-22 em pacientes resistentes ao Calazar, e
essas citocinas parecem ter um papel complementar de proteção juntamente com os membros
do perfil Th1.
Acredita-se que entre os perfis Treg e Th17 exista uma relação dicotômica, onde a
ativação de um ou outro subtipo depende dos níveis de IL-6 e TGF-β existentes no
39
microambiente (BETTELLI et al., 2006, 2008; BASSO, CHEROUTRE, MUCIDA, 2009). A
combinação de IL-6 e TGF- β induz os receptores (ROR)γt e (ROR)α que são fatores de
transcrição chaves para a determinação da diferenciação da linhagem Th17 (IVANOV et al.,
2006). Um equilíbrio entre Th17 e Treg é crucial para a homeostase imunológica. TGF- β é
necessária para a diferenciação das linhagens Th17 e Treg e pode induzir expressão de Foxp3
e RORγt (ZHOU et al., 2008). No entanto, TGF-β leva exclusivamente a uma diferenciação
Treg, uma vez que Foxp3 é capaz de se associar com RORγt inibindo sua atividade de
transcrição (ZHOU et al., 2008).
Na presença de IL-6, entretanto, esta inibição é revogada e a diferenciação da linhagem
Th17 é iniciada (BETELLI et al., 2006; MANGAN et al., 2006). Assim, a IL-6 atua como
uma potente citocina pró-inflamatória promovendo a diferenciação Th17 e inibindo a
diferenciação Treg, indicando que o controle de IL-6 normaliza o equilíbrio entre Th17 e Treg
(Figura 9).
Figura 8: Resposta imune na LTA. Adaptado de Rodrigues et al, 2012. Resposta imune do hospedeiro vertebrado frente à infecção por Leishmania sp. Após inoculação do parasita, as células apresentadoras de antígeno (APC), processam o antígeno e apresentam para células da imunidade específica, nesta fase participam elementos celulares e humorais. Nos linfonodos regionais, estas células apresentam o antígeno processado, via MHC-II, para os linfócitos T, que podem resultar em uma resposta TCD4+Th1, com perfil de resistência ou TCD4+Th2, com perfil de suscetibilidade à infecção, de acordo com o perfil de citocinas sintetizadas localmente. LTCD4+ pode se diferenciar também em células Treg e Th17 com produção de citocinas específicas para cada subpopulação. A apresentação de antígenos através do MHC-I promove a estimulação dos linfócitos T CD8, que modulam a resposta, promovendo controle e resolução da infecção (RODRIGUES, 2012).
1.8 Álcool e Resposta Imune
Segundo a Organização Mundial da Saúde, em 1990, mais de 750.000 mortes foram
atribuídas ao consumo de álcool, sendo que 80% dessas ocorreram em países
subdesenvolvidos. Em 2002, o número de mortes relacionadas ao consumo de álcool subiu
40
para 1, 8 milhões em todo o mundo. Embora já tenham sido demonstrados em vários estudos
os efeitos benéficos do consumo moderado de álcool, o consumo de mais de três doses por dia
está associado ao aumento do risco de mortalidade (WHO, 2002). Estima-se que os custos à
saúde mundial, devido ao consumo de álcool, sejam similares àqueles atribuídos ao sexo
desprotegido, ao sarampo e à malária (NELSON & KOLLS, 2002).
O abuso no consumo de álcool afeta a maioria dos sistemas orgânicos (NAGY, 2004;
ROOM et al., 2005). O efeito desse consumo, seja de forma aguda ou crônica em humanos,
modelos animais ou sistemas in vitro, gera na imunidade do hospedeiro anormalidades
funcionais nos linfócitos T e B, nas células NK e nos monócitos / macrófagos resultando numa
resposta imunológica alterada, com consequências nos componentes do sistema imune inato e
adaptativo (NELSON & KOLLS, 2002; MURALIDHARAN et al, 2014). E isso e
acompanhado por um aumento da frequência e da gravidade das infecções (COOK, 1998;
ROSELLE et al, 1995; PARLET & SCHLUETER, 2013; PARLET et al, 2014).
O abuso do álcool é considerado como sendo um fator que interfere na atividade
imunológica, causa atrofia do baço e do timo, além de um impacto na redistribuição de
leucócitos do sangue periférico devido a uma diminuição da habilidade de migração destes
após injúria ou infecção (ALOMAN, 2005; PARLET & SCHLUETER, 2013). Provoca ainda
anormalidades funcionais em células Natural Killer (NK) e em linfócitos T e B, causando uma
diminuição das respostas imunes celular e humoral (COOK, 1998). Dentre as principais
alterações no sistema imune, podem ser citadas aquelas observadas nas células apresentadoras
de antígeno ou APCs (antigen presenting cells), que têm seus aspectos fenotípicos e funcionais
modificados pela exposição ao álcool (MANDREKAR et al. 2009; D’SOUZA et al, 2013;
PARLET et al, 2014). As APCs, nomeadamente as células dendríticas, são componentes
especializados da resposta imune inata, possuem um importante papel na ativação da resposta
imune adaptativa, visto que apresentam o antígeno para os linfócitos T levando à ativação
dessa população celular e desencadeando o início de uma resposta imune específica efetiva
(SAALMULLER, 2006; PARLET et al, 2014).
Além disso, estudos prévios têm demonstrado vários efeitos do etanol na modulação
das respostas imune humoral e celular. Como os diversos efeitos do consumo de álcool sobre
as células dendríticas, no modelo experimental (SZABO et al. 2004; ANDRADE, M. C et al.
2009). O consumo agudo de álcool (1 dia) resultou em uma diminuição funcional significativa
das células dendríticas, que apresentam expressão reduzida das moléculas coestimuladoras
B7.1 e B7.2, bem como uma produção reduzida de IL-12 e aumentada de IL-10 (SZABO et
al. 2004). Ainda com relação a alterações em células dendríticas, LAU e colaboradores (2006)
41
demonstraram que a exposição prolongada ao etanol (8 dias) interfere na geração de
precursores de células dendríticas mielóides in vitro. Interessantemente, LASO e
colaboradores (2007) também observaram uma diminuição seletiva da população de células
dendríticas mielóides no sangue de pacientes considerados alcoólatras crônicos. ANDRADE
e colaboradores (2009) concluíram que a administração de etanol, em altas doses e a curto
prazo, tem um impacto relevante nas populações de APCs, diminuindo a atividade de
macrófagos esplênicos bem como das células dendríticas. São diversos os efeitos do consumo
de álcool sobre células apresentadoras de antígenos encontrados na literatura.
Durante o processo inflamatório em condições infecciosas, fagócitos como neutrófilos
e macrófagos têm um papel fundamental em localizar, internalizar e destruir microrganismos
que conseguiram se estabelecer em um determinado tecido do corpo (SPRINGER, 1995). Essa
dinâmica envolve o recrutamento de células fagocitárias da corrente sanguínea para o sítio
inflamatório, através de uma complexa interação entre fatores solúveis produzidos no local.
Em humanos, até mesmo adição aguda (15 minutos a 3 dias) de álcool in vitro foi capaz de
inibir a função fagocítica, a atividade antimicrobiana e a expressão de receptores envolvidos
na fagocitose de partículas opsonizadas (MORLAND & MORLAND, 1989; ZUIABLE et al.,
1992), além disso uma função fagocítica deficiente foi demonstrada em monócitos de
pacientes com cirrose alcoólica (SILVAIN et al., 1995). Em camundongos, tanto a ingestão
aguda (4 dias) quanto a ingestão crônica (14 dias) de álcool resultaram em uma diminuição da
capacidade de fagocitose em macrófagos peritoneais (CASTRO et al., 1993), soma-se a isso
o interessante achado de um famoso modelo experimental (HEINZ & WALTENBAUGH,
2007) que demonstrou que o consumo de etanol prejudica a apresentação de antígenos por
parte das células dendríticas.
A capacidade fagocítica está diretamente relacionada à produção de metabólitos da
explosão respiratória, como as espécies reativas de oxigênio (EROs) e óxido nítrico (NO) que
são importantes mediadores leishmanicidas (HORTA e cols., 2011). Os macrófagos alveolares
de camundongos alimentados com etanol sejam de forma aguda ou de forma crônica
apresentam uma diminuição na síntese de espécies reativas do oxigênio, ânion superóxido e
peróxido de hidrogênio (ANTHONY et al., 1993). Segundo D´Souza e colaboradores, o etanol
também pode inibir a expressão gênica do óxido nítrico-sintase induzida (iNOS), enzima
responsável pela geração de óxido nítrico em macrófagos alveolares e neutrófilos em resposta
à estimulação bacteriana. Neste estudo, tanto o tratamento agudo com álcool como o crônico
inibiram a secreção de óxido nítrico alveolar em camundongos, sugerindo que a diminuição
42
da geração de espécies reativas do oxigênio por macrófagos expostos ao etanol pode contribuir
para uma defesa antimicrobiana prejudicada após o uso de álcool (D'SOUZA et al.,1996).
Em geral, as respostas de tipo Th1 com citocinas (por exemplo, IL-6, IL-12, IL- 17A,
e IFN-y) são inibidas por consumo de álcool, e citocinas do perfil Th2 (por exemplo, IL-10 e
IL-13) são aumentadas (MANDREKAR et al, 2004) (ISHIKAWA et al, 2011). O álcool parece
agir indiretamente sobre a função da célula efetora LT CD4+ atuando diretamente sobre as
APCs (ALOMAN et al, 2007; LAU et al, 2006; MANDREKAR et al., 2004; OSTROVIDOV
et al., 2002; PETERSON et al., 1998. HEINZ & WALTENBAUGH, 2007; PARLET et al,
2014). Assim, alcoólatras crônicos têm uma resposta imune celular prejudicada. Além disso,
o equilíbrio entre as respostas Th1 e Th2 é deslocado em direção a uma predominância da
resposta imune de perfil Th2 (FAN et al., 2011, LAU et al., 2006, SZABO, 1999).
Em suma, o consumo de álcool, seja agudo ou crônico, exerce um considerável impacto
sobre aspectos fenotípicos e funcionais de células do sistema imune. Embora possa alterar as
ações de todas as populações de células envolvidas nas respostas imunes, o efeito em muitos
casos é uma imunossupressão que se torna clinicamente relevante após um estimulo
secundário (por exemplo, infecção bacteriana, viral ou outro dano ao tecido).
43
2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
Na LCD ocorre uma imunossupressão transitória na resposta de mononucleados do
sangue periférico a antígenos de leishmania in vitro, com inibição da produção de IFN-γ e
TNF-α, que é restaurada após o tratamento. Ocorre uma menor capacidade de contenção da
infecção, ocorrendo disseminação hematogênica, com múltiplas lesões cutâneas, podendo
apresentar até mesmo comprometimento de mucosas.
No município de Tancredo Neves na Bahia, há um centro de referência nacional em
pesquisa e tratamento da leishmaniose tegumentar, o Posto de Saúde de Corte de Pedra. Nele,
a LCD foi descrita inicialmente por Torres em 1920. Entre os anos de 1978-1984 os casos de
LCD correspondiam a apenas 0,2 % do total de pacientes com LTA. Nos anos 2004-2008 já
correspondiam a 3,9%. Em consonância, nos casos atendidos no Ambulatório de Leishmaniose
de Baturité, no período entre novembro de 2013 a setembro de 2015, verificou-se que a
ocorrência de LCD já correspondia a 6,6% dos casos, na macrorregião de Baturité.
Chamou a atenção o fato de que 87,5% desses pacientes eram consumidores frequentes
de grandes volumes de bebidas alcoólicas, em média 1L por dia, sugerindo uma possível
associação do alcoolismo com a ocorrência da forma disseminada.
A investigação de que o consumo crônico de álcool possa contribuir na patogênese da
LCD é de fundamental importância para uma melhor compreensão desta doença. Por isto,
objetivamos avaliar se existe uma relação entre alcoolismo crônico e a ocorrência de LCD.
44
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar a relação entre alcoolismo crônico e a ocorrência de leishmaniose cutânea
disseminada.
3.2 Objetivos específicos
1. Descrever as características clínico-demográficas de pacientes com LCD e LCL na
macrorregião de Baturité e caracterizar a frequência e a quantidade de ingestão de
bebida alcoólica, nesses dois grupos;
2. Determinar a carga parasitária das lesões e correlacionar com a intensidade do
exsudato inflamatório, de granulomas, de plasmócitos e com o grau de ingestão de
álcool.
45
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Tipo de estudo
Foi conduzido um estudo caso-controle. O grupo controle foi constituído por pacientes
com LCL e para cada caso, foram incluídos três controles, pareados por sexo e idade.
4.2 Aspectos éticos
O projeto foi submetido à Plataforma Brasil para registro da pesquisa e apreciação
ética. Sendo aprovado sob o número de parecer 1.552.232 e CAAE 53919816.2.0000.5054.
4.3 Local de estudo
O estudo foi realizado no Ambulatório de Leishmaniose de Baturité, um projeto de
extensão da UFC, coordenado pelo médico infectologista Dr. Anastácio de Queiroz Sousa, que
funcionou com atendimento semanal, no Centro de Especialidade de Atenção à Saúde,
Baturité-CE.
As amostras de biopsia de pele oriundas dos pacientes do projeto, foram analisadas no
Laboratório Multiusuário de Patologia (LAMP) do Departamento de Patologia e Medicina
Legal (DPML) da FAMED (Faculdade de Medicina) da Universidade Federal do Ceará (UFC).
4.4 Seleção das amostras e coleta de dados
Numa clínica dedicada ao atendimento exclusivo de portadores de Leishmaniose
Tegumentar Americana (LTA), localizada na cidade de Baturité, que é a cidade pólo da área
endêmica de LTA da Serra de Baturité, no período de novembro de 2013 a outubro de 2016,
foram atendidos 120 pacientes de LTA. Após aplicar os CI e CE foram selecionados 48 destes.
Neste estudo, foram incluídos todos os pacientes portadores de LCD (casos), e como
controles, os portadores de LCL que tinham a idade dentro do intervalo de variação da idade
dos casos.
Após parecer favorável do comitê de ética da UFC e a assinatura do TCLE, os dados
clínicos, demográficos, epidemiológicos e diagnósticos foram coletados de prontuários dos
pacientes selecionados e que aceitaram participar deste estudo. Todos os pacientes foram
46
interrogados a respeito do hábito de ingerir bebidas alcoólicas, dos tipos de bebidas usadas, da
frequência e quantidade mensal do uso. A partir destas informações, foi estimada a quantidade
de álcool, em grama, ingerido por dia. Os pacientes também foram interrogados a respeito da
presença de outros membros da família que tivessem o hábito de ingerir bebidas alcoólicas. A
quantidade diária de álcool referida foi categorizada com um ponto de corte de 60 gramas, que
corresponde aproximadamente a quatro porções típicas das bebidas alcoólicas mais
frequentemente usadas no Brasil e que caracteriza consumo abusivo (VIGITEL).
Adicionalmente o questionário AUDIT que avalia dependência alcoólica foi aplicado
aos pacientes, por dois entrevistadores. A Escala AUDIT produz um escore total que varia de
0 a 40, e são recomendados os pontos de corte de 15 e 20 para definir níveis de gravidade de
adição pelo álcool (Manual do AUDIT/WHO).
4.4.1 Critérios de inclusão
Pacientes com diagnóstico de Leishmaniose, confirmado por dois dos três métodos
aplicados e sem tratamento prévio;
Pacientes com idade acima de 18 anos;
Ter dados suficientes no prontuário para a pesquisa;
Biopsia com material representativo e ausência de artefatos de fixação;
4.4.2 Critérios de exclusão
Pacientes portadores de SIDA;
Em uso de drogas imunossupressoras ou de quimioterápicos para câncer;
Com história de doença hepática, cardíaca, renal;
Mulheres grávidas ou em fase de aleitamento;
Que já tenha desenvolvido a forma mucosa de LTA.
4.5 Diagnóstico
O diagnóstico foi baseado na clínica, na epidemiologia e/ou testes laboratoriais. Entre
estes foram realizados imprint, cultura, histopatológico e imunohistoquímica.
47
4.5.1. Diagnóstico clínico e epidemiológico
Para o diagnóstico clínico de LCL os pacientes foram submetidos a uma avaliação
clínica por um médico infectologista. Foi contado o número de lesões, descritas suas
características, realizada a pesquisa de linfadenopatia e de envolvimento mucoso, além da
avaliação de sinais sistêmicos.
Foi considerado LCL todo indivíduo com presença de menos de 10 lesões, acometendo
até dois segmentos. Para a forma LCD aplicou-se o conceito de TURETZ e cols (2002), que
define LCD pela presença de ao menos 10 lesões distribuídas em dois ou mais segmentos
corporais não contíguos.
O diagnóstico epidemiológico levou em consideração o local da residência do paciente,
sua procedência ou deslocamento em/para área com confirmação de transmissão de
leishmania, áreas endêmicas (Apêndice 01).
4.5.2 Diagnóstico laboratorial
4.5.2.1 Imprint
Após antissepsia e anestesia local, um fragmento da biopsia, obtido com punch
descartável de 2 mm, foi pressionado entre duas lâminas de vidro, com movimentos circulares
para esmagar o tecido. Em seguida, fez-se o deslizamento de uma lâmina sobre a outra, para
distender a amostra conforme método de Sousa et al (2014). As lâminas foram coradas com
Giemsa e examinadas ao microscópio óptico, para pesquisa de amastigotas.
4.5.2.2 Cultura
Da borda da lesão, foi retirado um pequeno fragmento com punch, que foi inoculado
em meio NNN contendo Schneider suplementado com 20% de soro bovino fetal, 2% de urina
humana estéril, e 100 µg de gentamicina/mL. As culturas foram incubadas a 26°C por 6
semanas e examinadas semanalmente para detecção da presença das formas promastigotas de
Leishmania.
4.5.2.3 Histopatologia
48
As biopsias das lesões foram fixadas em formalina a 10%, submetidas a processamento
histológico de rotina e emblocadas em parafina. Cortes com espessura de 4 μm, obtidos em
micrótomo digital Leica, processados e corados com Hematoxilina & Eosina, Wade (para
pesquisa de BAAR) e Grocott (para pesquisa de fungos). Os preparados foram examinados em
microscópio óptico, para pesquisa de amastigotas, BAAR e fungos.
4.5.2.4 Imunohistoquímica para leishmaniose
Padronização da reação imunohistoquímica
Para a realização da técnica de imunohistoquímica, os blocos de parafina contendo os
fragmentos de pele foram cortados em micrótomo, na espessura de 4 μm e montados em
lâminas silanizadas. Foi confeccionado uma lâmina de cada amostra contendo dois cortes cada.
Para a pesquisa das formas amastigotas de leishmania, empregou-se como anticorpo primário
soro hiperimune (policlonal) de camundongos BALB/c infectados com L. braziliensis.
Para a padronização da reação, foi feito a titulação do anticorpo primário, visando obter
uma melhor visualização das formas amastigotas, sem a ocorrência de colorações inespecíficas
(background). Foram testadas as seguintes diluições do soro hiperimune: 1/300 e 1/600 em
amostras de controle positivo. Como controle positivo, foram empregados fragmentos de pele
de pacientes não incluídos no estudo, comprovadamente positivos para LCL. A diluição do
soro selecionada foi a de 1/600, em que as formas amastigotas foram devidamente
identificadas nos fragmentos de pele humana, sem a ocorrência de coloração de fundo. Como
controle negativo, foi utilizada a mesma amostra do controle positivo, sem a adição do
anticorpo primário durante a reação.
Técnica de Imunohistoquímica
Recuperação antigênica
Esta etapa possibilita, através do calor e da solução tampão, a quebra das pontes e
ligações induzidas pela formalina, recuperando assim os epítopos antigênicos, promovendo
também a reidratação dos cortes histológicos, permitindo, uma melhor ligação dos anticorpos
aos epítopos (SHI; SHI; TAYLOR, 2011).
49
As lâminas com as amostras foram colocadas em suporte vertical para lâminas e
levadas para a estufa, com temperatura estabilizada a 60°C, durante uma hora, com o objetivo
de derreter o excesso de parafina e melhorar a aderência dos tecidos à lâmina.
Ao mesmo tempo, iniciou-se a preparação do tampão de recuperação antigênica.
Utilizou-se o tampão Envision Flex Target Retrieval Solution, pH=9, código de referência
K8000 - Dako®, diluição 1:50. O tampão foi conservado na geladeira à temperatura de 2-8°C.
Em seguida, essa solução de 1500 ml (30 ml de tampão de recuperação antigênica + 1470 ml
de água destilada) foi colocada em um tanque de módulo pré-tratamento Dako® PT Link. Foi
realizado o pré-aquecimento do sistema até 65°C durante trinta minutos.
As lâminas foram retiradas da estufa a 60°C, colocadas em suportes de lâminas do
aparelho (“pentes”), os quais foram posicionados no tanque do Dako® PT Link (Figura 10-B),
onde foi acionado o segundo “run”, iniciando o aquecimento do sistema para a temperatura de
97°C, permanecendo nessa temperatura por trinta minutos. A seguir, o sistema foi novamente
resfriado até 65°C, com o tempo total de processamento de aproximadamente uma hora e meia
(Figura 11).
Figura 9: Aparelho PT Link - A foto A ilustra o aparelho Dako® PT Link, interligado ao computador, onde é realizado a recuperação antigênica com temperatura monitorizada e controlada automaticamente. A foto B mostra o aparelho aberto, onde é possível visualizar os 2 tanques de módulo pré-tratamento independentes, com capacidade de 24 lâminas por tanque. Fonte: Kélvia Miranda Sá.
50
Figura 10– Gráfico de Recuperação Antigênica - Dako® PT Link. Fonte: Kélvia Miranda Sá
Marcação por Imunohistoquímica
O material foi retirado dos tanques e as lâminas foram colocadas em um borrel
contendo tampão de lavagem, durante 3 minutos. Essa lavagem foi feita três vezes
consecutivas. Para a lavagem utilizou-se o tampão do kit (Envision Flex, pH=7,6, Dako®), na
diluição de 1:20.
Os cortes histológicos foram demarcados, com caneta hidrofóbica (Dako® Pen –
referência S2002), na área em torno do corte histológico, para impedir o vazamento de
reagentes. Em seguida, foram retiradas do tampão e submetidas ao bloqueio com peroxidase
endógena, utilizando EnVisionTM Flex Peroxidase-Blocking Dako® por 10 minutos.
Posteriormente, as lâminas foram lavadas com tampão, por três vezes consecutivas de 3
minutos. Seguiu-se a incubação com anticorpo primário (soro hiperimune de camundongo
BALB/c), na diluição 1:600. As lâminas foram incubadas por um pernoite, em câmara úmida
sob refrigeração. Depois, foram realizadas três lavagens de 3 minutos cada, com o tampão de
lavagem, diluído 1:20 (Wash Buffer Envision Flex, pH=7,6, Dako®). Em seguida, as lâminas
foram incubadas com o polímero livre de biotina EnVisionTM Flex/HRP Dako® por 30 minutos;
foi realizado três lavagens de 3 minutos com tampão de lavagem, e logo após, foi feita a
coloração com a incubação do cromógeno Dako® DAB durante cinco minutos e posterior
51
lavagem das lâminas em água corrente. Foi feita a contra-coloração com hematoxilina de
Meyer por 1 minuto, seguida de banhos em água destilada e água corrente. Após essa etapa,
foram realizadas três passagens em álcool absoluto, para desidratação e três passagens em
xilol, para diafanização ou clareamento. Por último, foram realizadas as montagens das
lâminas, através da fixação das lamínulas, utilizando Bálsamo do Canadá.
4.6 Análise Morfométrica
Foram capturadas imagens das micro secções em microscópio ótico AXIO Scope A1
Zeiss® acoplado à câmera digital, no aumento de 200 e 400X (Figura 12).
Intensidade da inflamação – Foi determinada, considerando a medida da área total da
derme do fragmento e da extensão do exsudato em μm2, utilizando o software ImageJ (NIH).
O resultado foi definido dividindo a área do exsudato pela área total e expresso em percentual.
Assim foi possível determinar a intensidade da inflamação (DANTAS 2012).
Determinação da carga parasitária – Foram contados manualmente 15 campos em
aumento de 400X, em toda extensão da derme, nas lâminas marcadas com imunohistoquímica
para leishmania. O resultado foi expresso em No de amastigotas /15 campos.
Frequência de granulomas e plasmócitos – Foram fotografadas 15 imagens aleatória
de campos da derme, sequenciais em aumento de 400X. Os plasmócitos foram contados
manualmente, usando as ferramentas de seleção pontuais (Point selection tools) do software
ImageJ (NIH). O mesmo foi feito com os granulomas.
Figura 11: Microscópio AXIO Scope A1 Zeiss®. Fonte: Dados do autor
52
4.7 Questionário para avaliação da ingestão de álcool
Foi aplicado um questionário para avaliar o consumo de álcool, intitulado Alcohol Use
Disorder Identification Test (AUDIT). Foi desenvolvido pela OMS, como instrumento de
rastreamento para uso problemático de álcool. É composto por 10 itens, cada um com margem
de 0 a 4 pontos, possibilitando um espectro de pontuação de 0 a 40. A pontuação permite a
classificação do uso da substância da seguinte forma: Zona I (baixo risco) – 0 a 7 pontos; Zona
II (uso de risco) – 8 a 15 pontos; Zona III (uso nocivo) – 16 a 19 pontos; Zona IV (provável
dependência) – 20 a 40 pontos. (ANEXO 1).
4.8 Metodologias de análise de dados
A análise exploratória dos dados foi realizada através de frequências das variáveis
clínicas relatadas. As distribuições da ingestão diária de álcool de Casos e Controles foram
comparadas através do Teste da Soma dos Postos de Wilcoxon (Mann-Whitney). A associação
entre variáveis independentes relacionadas ao uso de álcool e a ocorrência de LCD foi também
avaliada através de regressão logística simples, utilizando o software Data Analysis and
Statistic Sofftware (STATA). Na análise dos dados morfométricos foi aplicado o Teste Mann
Whitney utilizando o software GraphPad Prism version 5.00 para Windows (GraphPad
Software, San Diego, CA, USA). A significância mínima foi aceita quando p < 0,05.
53
4.9 Desenho experimental do estudo
Figura 12: Fluxograma de biópsias e métodos elaborado pelo autor
54
Figura 13: Fluxograma de seleção de amostras avaliadas elaborado pelo auto
55
5 RESULTADOS
5.1 Descrição dos aspectos epidemiológicos
Os prontuários selecionados foram subdivididos em dois grupos de acordo com as
formas clínicas. Após uma triagem rigorosa, num montante de 120 pacientes pré selecionados,
onde foram aplicados os critérios de inclusão e exclusão, houve uma diminuição da amostra
para 48 pacientes. Foram incluídos 12 indivíduos de LCD (Casos) e 36 de LCL (Controles).
Entre os casos foi observado 1 (8,3%) indivíduo do sexo feminino e 11 (91,7%) do sexo
masculino; entre os controles, 3 (8,3%) do sexo feminino e 33 (91,7%) do sexo masculino. A
média e o desvio padrão da idade dos casos foi respectivamente 37,8±14,2 anos e dos controles
foi 41,1±14,3 anos, e esta diferença não foi significativa (p = 0,504).
Quanto ao local de residência, os participantes do estudo foram distribuídos de acordo
com seu município de origem, no maciço de Baturité, sendo a grande maioria deles
proveniente das cidades de Mulungu (35,42%), Baturité (18,75%), Aratuba (16,67%) e Pacoti
(8,3%). Quanto a profissão, tanto no grupo de pacientes com LCL (20/34) quanto no grupo
com pacientes de LCD (9/12), predominou a de agricultor, ocorrendo em 80,5% (29/36) do
total de pacientes. As ocupações de prestador de serviço no setor terciário da economia (n=6),
de desempregado (n=4) e autônomo (n=2) foram relatadas no grupo LCL. Dois pacientes com
LCD eram serventes de obras na construção civil (Gráfico 3).
Quanto a renda, os ganhos médios mensais dos pacientes com LCL foram de R$915,00.
Por outro lado, os pacientes com LCD possuíram uma renda bem inferior, em média de
R$441,00. Em relação a escolaridade, aproximadamente 58 % (31/47) dos pacientes possuíam
o ensino fundamental ou não estudaram e 42% possuíam o ensino médio ou superior (16/47).
A baixa escolaridade (não estudaram ou fundamental) parece possuir relação com a ocorrência
da LCD, uma vez que 90,91% (10/11) destes pacientes possuíam este perfil escolar. Entre as
formas clínicas estudadas, tanto no grupo de pacientes com LCL quanto no grupo com
pacientes com LCD, predominou a baixa escolaridade. No entanto, na LCL observou-se
também um razoável número de pacientes com ensino médio e um caso com ensino superior
(dados não mostrados).
56
Gráfico 3- Pacientes com leishmaniose cutânea localizada (LCL) (N=36) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD) (N=12), da área endêmica da serra de Baturité, Ceará, Brasil, de acordo com a profissão.
5.2 Descrição dos aspectos clínicos
5.2.1. Características clínicas da doença
Foram acompanhados clinicamente 12 pacientes com diagnóstico de LCD, entre
novembro de 2013 e outubro de 2016, correspondendo a 10% dos casos de LTA
acompanhados no serviço ambulatorial nesse período, uma das maiores prevalências já
relatadas. Onze (91.7%) eram do gênero masculino e uma (8.3%), do gênero feminino. A
idade variou de 19 a 73 anos, com idade média de 37.8±14.2 anos. Nove pacientes (75%) eram
lavradores e 1 (8.3%) pedreiro, 1 (8.3%) servente e 1 (8.3%) vendedor.
Quanto às lesões cutâneas, os 48 (100%) apresentaram lesões de pele típicas,
distribuídas da seguinte maneira: 22 (45.8%) tinham lesão única, 11 (22.9%) duas e 12 (25%)
possuíam mais que dez e em dois ou mais segmentos corpóreos. Dentre essas, a grande maioria
encontrava-se localizada nos membros inferiores e superiores, entretanto também foi possível
encontrá-las no tronco, na cabeça e inclusive na região genital. O número de lesões para cada
paciente variou entre 1 e 184 (2 pacientes com mais de 100). O tempo de surgimento das
lesões, até a procura do ambulatório apresentou grande variação, desde 3 semanas até mais de
57
1 ano e meio. O tempo de evolução desde o aparecimento da primeira até a disseminação foi
em média 14 semanas (Tabela 1A). Não houve correlação em nenhum grupo entre o tamanho
da lesão (mm) e a duração da doença (sem). A mediana do número de feridas nos pacientes
com LCL e LCD foi de 1 e 39 respectivamente.
Tabela 1A – Síntese das características clínicas de pacientes com leishmaniose cutânea localizada (LCL) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD), da área endêmica da serra de Baturité, Ceará, Brasil.
IDRM = Intrademorreação de Montenegro
Na maioria dos pacientes, a lesão primária foi uma pápula eritematosa que progrediu
para nódulo e por fim úlcera. Acompanhada de adenopatia regional, em muitos casos. As
lesões secundárias (disseminadas) foram polimórficas: nodulares, crostosas, acneiformes,
verrucosas e pustulares. Os pacientes com LCD apresentaram no mínimo dois aspectos de
lesão, sendo mais prevalente o dueto nodular e ulcerada. Destes pacientes, 16% apresentaram
quatro aspectos de lesões, além disso, 16,6% tiveram comprometimento de quatro segmentos
corpóreos com lesões ao mesmo tempo. Os pacientes apresentaram a lesão típica ulcerada,
apresentando área de úlcera em média maior do que o dobro da área da úlcera dos pacientes
LCL. As lesões estavam presentes principalmente nos membros inferiores, superiores, tronco
e cabeça. Em relação a infecção secundária, esteve presente em 42.5% dos pacientes, 38.9%
na LCL e 54.5% na LCD. Cinco pacientes com LCD (41.6%) apresentaram envolvimento da
mucosa nasal, consistindo de úlceras, crostas ou perfuração septal p<0,05 (Gráfico 4).
LCL LCD p
Média Min. - Max. Média Min. - Max.
Tempo de doença (sem)
10.1
03-72
14.3
05-24
0.026
No de lesões 1.6 01-06 59.4 11-184 0.0001
No de segmentos afetados 2 01-02 4 02-04 -
Diâmetro da úlcera 13.92 3 - 40 23.0 8 – 56.5 0.088
IDRM 13 3.5 - 38 24 8 - 57 0.315
58
Gráfico 4- Pacientes com leishmaniose cutânea localizada (LCL) (N=36) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD) (N=12), da área endêmica da serra de Baturité, Ceará, Brasil, de acordo com o envolvimento mucoso.
Doze (25%) dos pacientes relataram queixas clinicas sistêmicas, como a presença de
sensação de febre, fadiga e anorexia durante o período de evolução da doença. Perda de peso
foi referida em seis (12.5%) dos pacientes. Não houve entre os grupos diferença estatística
significante entre nenhuma destas variáveis clínicas (Tabela 1B).
Tabela 1B – Frequência das variáveis clínicas relatadas por pacientes com leishmaniose cutânea localizada
(LCL) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD), da área endêmica da serra de Baturité-Ceará-Brasil.
59
5.2.2 Caracterização do hábito de ingestão de álcool
5.2.2.1 Quantificação do consumo diário de álcool
A quantidade diária de álcool ingerida foi significativamente mais elevada (p=0,0002)
nos pacientes LCD (Tabela 2). Tabela 2. Relação entre ingestão diária de álcool (ml) e ocorrência de LCD numa amostra de pacientes portadores de LTA, da área endêmica da serra de Baturité, Ceará, Brasil.
Pacientes N Mínimo Média Desvio
Padrão
Mediana Máximo Valor-pΨ
LCL
LCD
36
12
0
0
97
950
264
663
0
1000
1285
2000
0,0002
ΨTeste da Soma dos Postos de Wilcoxon (Mann-Whitney) 5.2.2.2 Análise do hábito de ingestão alcoólica, segundo AUDIT (Alcohol Use Disorders
Identification Test)
O questionário AUDIT foi aplicado em todos pacientes analisados neste estudo. Os
escores médios do AUDIT foram de 18 pontos no grupo LCD e de 4 pontos no LCL (p<0,0001)
(Gráfico 5).
Elaborado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) por BABOR et al (1992), o
AUDIT é composto de 10 questões e tem por finalidade identificar possíveis dependentes de
álcool. Foi validado no Brasil por LIMA et al. (2001). As questões referem-se aos últimos 12
meses, sendo que as três primeiras medem a quantidade e frequência do uso regular ou
ocasional de álcool, as três questões seguintes investigam sintomas de dependência e as quatro
finais são a respeito de problemas recentes na vida relacionados ao consumo do álcool. O
escore varia de 0 a 40. BABOR & HIGGLEBIDDLE (2003) propõem quatro níveis de escore
para o AUDIT, que sugeririam fazer uma intervenção breve, inserida na atenção primária e
dirigida aos profissionais de saúde. O escore, então, seria classificado como consumo de baixo
risco ou abstêmios de 0 a 7 pontos; consumo de risco 8 a 15 pontos; uso nocivo ou consumo
de alto risco 16 a 19 pontos e provável dependência 20 ou mais pontos (máximo = 40 pontos).
60
Gráfico 5- Pontuação obtida através da avaliação do questionário AUDIT (Alcohol Use Disorder Identification
Test) dos pacientes com leishmaniose cutânea localizada (LCL) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD) da
área endêmica da serra de Baturité, Ceará, Brasil.
61
Tabela 3 - Relação entre indicadores de ingestão de álcool e ocorrência de LCD numa amostra de pacientes portadores de LTA, da área endêmica da serra de Baturité, Ceará, Brasil. Leishmaniose cutânea localizada (LCL) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD).
Variável Independente
LCL
n=36
LCD
n=12
Valor-pΨ
n % n %
Hábito de ingerir bebidas alcoólicas:
-Não
-Sim
19
17
53
47
2
10
17
83
0,029
Ingestão diária de 60 gramas de álcool:
-Igual ou menor
-Maior
27
9
75
25
2
10
17
83
0,001
Ingestão na família€
-Não
-Sim
21
11
66
34
2
10
17
83
0,004
Escore AUDIT:
-0 a 15
-16 a 37
34
2
94
6
4
8
33
67
<0,001
Escore AUDIT:
-0 a 19
-20 a 37
35
1
97
3
6
6
50
50
<0,001
€Informação disponível de apenas 32 controles; ΨTeste Exato de Fisher
A frequência de indicadores de ingestão de bebidas alcoólicas foi significativamente
mais elevada entre casos do que entre controles: hábito de ingestão de bebidas alcoólicas: 83%
versus 47% (p=0,029); ingestão diária de mais que 60 gramas de álcool: 83% versus 25%
(p=0,001); ingestão de bebidas alcoólicas por outros membros da família: 83% versus 34%
62
(p=0,004); AUDIT maior que 15: 67% versus 6% (p<0,001); AUDIT maior que 19: 50%
versus 3% (p<0,001) (Tabela 3).
Modelos de Regressão Linear simples foram usados para se avaliar a precisão das
estimativas da associação entre variáveis relacionadas com a ingestão de álcool e a ocorrência
de LCD. Todas as medidas de ingestão de álcool usadas neste estudo mostraram uma
associação significativa (Valor-p entre 0,041 e 0,001), com uma Razão de Odds variando de
5,6 (ingestão na família) e 35 (AUDIT ≥ 20) (Tabela 4).
Tabela 4 - Relação entre ingestão de álcool e ocorrência de LCD, estimada através de regressão logística, numa amostra de pacientes portadores de LTA, da área endêmica da serra de Baturité, Ceará, Brasil.
Variável Independente Odds
Ratio
Erro
Padrão
I.C. 95% Valor-p
Hábito de ingerir (Sim/NãoΨ) 5,6 4,7 1,1-29 0,041
Ingestão diária (>60g/≤60gΨ) 15 13 2,8-82 0,002
Ingestão na família (Sim/NãoΨ) 9,5 8,2 1,7-51 0,009
AUDIT (≥16/<16Ψ) 34 32 5,3-219 <0,001
AUDIT (≥20/<20Ψ) 35 40 3,6-345 <0,001
ΨCategoria de Referência
5.3 Análise morfométrica das lesões
Porcentagem maior de inflamação foi observada nos casos de LCD, com média de
24.2% ± 16 de desvio, comparada com as lesões dos pacientes com LCL, média de 17.8% ±
12. (Tabela 5). Apesar de no grupo caso, em média, a porcentagem de exsudato ter obtido
valores superiores, não houve significância estatística entre os grupos (Gráfico 6).
63
Gráfico 6 – Área de exsudato inflamatório (%) e número de amastigotas (mediana) numa amostra de pacientes portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD), da área endêmica da serra de Baturité, Ceará.
0
20
40
60
80
100
1
10
100
1000LCD
LCL
5.3.1 Características da resposta inflamatória
A formação de granulomas ocorreu em ambos os grupos (gráfico 7), estando mais
presentes nas lesões localizadas. Frequência no grupo controle, média de 4.6 ± 5.8 de desvio.
Frequência no grupo caso, média de 2.5 ± 1.9 (Tabela 5).
Os plasmócitos foram frequentemente observados nos infiltrados inflamatórios
teciduais de ambos os grupos (gráfico 7). Com frequência maior no grupo controle, média de
214 ± 377 de desvio, comparado com as lesões dos casos, média de 177 ± 419 (Tabela 5).
64
Tabela 5 – Quantificação de granulomas e plasmócitos e percentual da intensidade do infiltrado inflamatório em 15 campos com aumento de 400X, numa amostra de pacientes portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD), da área endêmica da serra de Baturité, Ceará, Brasil.
Granuloma
Plasmócitos
Infiltrado inflamatório
(%)
LCL LCD
p Mediana Média Min-Max
Mediana Média Min-Max
2 4.6 0 – 18 2 2.5 0 - 5 0.793
41 214 0 – 1390 7 177 1 - 1208 0.832
16.7 17.8 2 - 41.5 23.7 24.2 7.6 - 57.3 0.539
O número de granulomas e plasmócitos foi ligeiramente maior no grupo controle
(LCL) (mediana e média), mas sem significância estatística.
Gráfico 7- Representação gráfica do número de granulomas e plasmócitos numa amostra de pacientes portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD), da área endêmica da serra de Baturité, Ceará, Brasil. Foram fotografadas 15 imagens aleatória de campos da derme, sequenciais em aumento de 400X.Os plasmócitos foram contados manualmente, usando as ferramentas de seleção pontuais (Point selection tools) do software ImageJ (NIH). O mesmo foi feito com os granulomas.
65
5.3.2 Determinação da carga parasitária
O exame de imunohistoquímica com soro hiperimune anti- L. braziliensis foi realizado
em apenas 22 amostras (14 LCL e 8 LCD), devido ao reduzido número de pacientes com
biópsia de pele e também devido a problemas no corte histológico de algumas biópsias,
impossibilitando a realização da técnica. A visualização do amastigota íntegro foi considerada
como evidência de positividade (Figura 15). Desse modo, a técnica de imunohistoquímica
apresentou um alto índice de sensibilidade, com 12 (85.7%) detecções no grupo controle e 7
(87.5%) no grupo caso. Das amostras avaliadas 86.3% foram positivas.
O número de amastigotas foi maior no grupo caso em comparação com o controle
(mediana e média), mas sem significância estatística. Média de 73.5 versus 38.9 e mediana de
4.5 versus 2.5 amastigotas/15campos, respectivamente (gráfico 7) (p=0,783).
Figura 14: Fotomicrografia de lâmina de imunohistoquímica de biópsia de pele ulcerada de paciente com leishmaniose cutânea disseminada (LCD) apresentando diversas amastigotas em evidência no campo (seta). (Aumento 1000x).
Fonte: autor
5.3.3 Correlação da carga parasitária com a intensidade da resposta inflamatória, com a
resposta granulomatosa, com a plasmocitose
Comparando o número de amastigotas com a intensidade da resposta inflamatória
presente em cada biópsia, foi possível constatar que, no grupo LCD, a intensidade do exsudato
inflamatório é maior com o aumento de amastigota, com correlação positiva significativa entre
66
a intensidade do exsudato e número de amastigota, R2=0,68 e p= 0,01. No grupo LCL, essa
correlação não foi observada (gráfico 8).
Gráfico 8- Correlação entre número de amastigotas e percentual da área do exsudato inflamatório numa
amostra de pacientes portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL) (A) e leishmaniose cutânea
disseminada (LCD) (B), da área endêmica da serra de Baturité, Ceará.
A B
Gráfico 9- Correlação entre número de amastigotas e granulomas numa amostra de pacientes portadores
de leishmaniose cutânea localizada (LCL) (A) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD) (B), da área endêmica
da serra de Baturité, Ceará.
A
B
Comparando o número de amastigotas com a frequência de granuloma presente em
cada biópsia, foi possível constatar que em ambos os grupos não houve correlação positiva
entre as variáveis. Pelo contrário, os valores do coeficiente de determinação (R2) foram baixos,
indicando que não houve correlação entre a quantidade de amastigotas e de granulomas.
(Gráfico 9).
Ao se comparar o número de amastigotas com a população de plasmócitos presente em
cada biópsia, verificou-se no grupo LCD, uma correlação positiva significativa entre o número
LCL
0 10 20 30 40 501248
163264
128256512 R2=0,244
p=ns
Área de Exsudato (%)
No A
mas
tigot
as
0 20 40 60 80248
163264
128256512
1024 R2=0,682p=0,0115
LCD
Área de Exsudato (%)
No A
mas
tigot
as
LCL
0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 5120.5
1
2
4
8
16
32 R2= 0,035p= ns
No Amastigotas
No
Gra
nulo
ma
LCD
0.03125 1 32 10240.5
1
2
4
8 R2=0,013p=ns
No Amastigotas
No
Gra
nulo
ma
67
de plasmócitos de amastigota (R2 = 0.99 e p< 0,0001). Ou seja, há uma correlação positiva
maior que 99%, indicando que a variável número de amastigotas é capaz de explicar o
quantitativo de plasmócitos. O mesmo ocorreu quando se analisou estatisticamente, em coluna
única, todos os dados referentes a estas duas variáveis (r2 = 0.22 e p= 0,02). No grupo LCL,
essa correlação não é presente (r2 = 0.01 e p= 0,84) (Gráfico 10).
Gráfico 10- Correlação entre o número de amastigotas e o de plasmócitos numa amostra de pacientes portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL) (A) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD) (B), da área endêmica da serra de Baturité, Ceará.
A
B
5.4 Correlação da ingestão de álcool com a carga parasitária
Correlacionando o número de amastigotas presente em cada biópsia com o grau diário
de ingesta de álcool pelos pacientes, foi possível constatar que, no grupo LCD, o número de
amastigotas é maior à medida que se eleva o valor numérico do grau de álcool (r2 = 0.608 e p=
0,02). Ou seja, há uma correlação positiva de 60%, indicando que a variável grau de álcool é
capaz de explicar o quantitativo de amastigotas. O mesmo ocorreu quando se analisou
estatisticamente, em coluna única, todos os dados referentes a estas duas variáveis (r2 = 0.318
e p= 0,006). No grupo LCL, essa correlação não é presente (r2 = 0.116 e p= 0,233) (Gráfico
11).
LCL
0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 5121
32
1024
32768 R2=0,003p=ns
No Amastigotas
No P
lasm
ócito
s
LCD
0.03125 1 32 10240.03125
1
32
1024
32768
R2=0,991p<0,0001
No Amastigotas
No P
lasm
ócito
s
68
Gráfico 11- Correlação entre o número de amastigotas e o grau diário de ingesta de álcool numa amostra de pacientes portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL) (A) e leishmaniose cutânea disseminada (LCD) (B), da área endêmica da serra de Baturité, Ceará.
A
B
C
69
6 DISCUSSÃO
A Leishmaniose Cutânea Disseminada é uma forma clínica emergente e
frequentemente mal diagnosticada da Leishmaniose Tegumentar Americana. É uma forma
grave, caracterizada pelo aparecimento de múltiplas lesões pleomórficas, comprometendo
várias partes do corpo. No Brasil, ocorre principalmente no Nordeste com destaque para a
Bahia. A LCD também já foi relatada no Maranhão (GALVÃO et al, 1993), Ceará (SOUSA
et al, 2006), Minas Gerais (OGAWA et al, 2006), São Paulo (VERNAL et al, 2015) e mais
recentemente no Paraná (MEMBRIVE et al, 2017). Na América, há relatos na Guiana
Francesa (COUPPIÉ et al, 2004), Equador (CALVOPINA et al, 2005) e Colômbia (RINCÓN
et al, 2009) (VÉLEZ et al, 2015).
Várias espécies de Leishmania já foram associadas à LCD, como L. braziliensis
(COSTA et al, 1986; CARVALHO et al, 1994; SOUSA et al, 2006), L. amazonensis (COSTA
et al, 1986; CARVALHO et al, 1994), L. panamensis (VÉLEZ et al, 2015; CALVOPINA et
al, 2005) e L. guyanensis (COUPPIÉ et al, 2004). Todos os casos descritos no Ceará foram
causados pela L. braziliensis (SOUSA et al, 2006).
No presente estudo, nos pacientes do grupo LCD a média de lesões foi de 59 (Min-
Max = 11-184) distribuídas em dois a quatro segmentos do corpo. As lesões eram acneiformes,
papulares, nodulares, ulceradas e vegetantes. Além disso, 44% deles apresentavam lesão de
mucosa, contrastando com o grupo LCL onde nenhum paciente apresentou comprometimento
de mucosa (p=0,001). Estes achados estão de acordo com trabalhos já descritos, como VÉLEZ
et al (2015) (25%), VERNAL et al (2015) (38,8%) e TURETZ et al (2002) (29%). Lesões
mucosas em pacientes com LCD apresentam menor gravidade que as da LM, isto é, elas
apresentam menor comprometimento, sem a tanto exsudato e a necrose comumente
observados na LM (MARSDEN et al, 1994; LESSA et al, 2012), sugerindo que a mucosa seria
mais um local de envolvimento, sem denotar necessariamente maior intensidade da resposta
inflamatória. Questiona-se como a L.(V.) braziliensis chegaria à mucosa nasal. Contudo, desde
que a doença passou a ser estudada, houve a hipótese de que deveria haver disseminação
linfática ou hematogênica (LESSA, 2007) (SCORZA et al., 2017). No presente estudo, não foi
viável avaliar o alargamento dos linfonodos.
A disseminação hematogênica da leishmania está possivelmente associada a uma
imunossupressão transitória da resposta imune celular Th1, que na sua ausência, não promove
a destruição das amastigotas. Foi demonstrado que em relação aos pacientes com LCL,
70
pacientes com LCD apresentaram uma redução de células CD4+ e ausência de resposta a
antígeno de leishmania na estimulação in vitro, associado a maiores títulos de anticorpos anti-
leishmania (CARVALHO et al., 1994). Além disso, eles produzem menor quantidade de IFN-
γ e TNF-α (TURETZ et al., 2002) e maior quantidade de IL-4 e IL-10 (LEOPOLDO, 2006).
Por apresentarem um perfil predominante Th2, com parcial imunossupressão a antígenos de
Leishmania, indivíduos com LCD demonstram uma menor capacidade de contenção da
infecção do que pacientes com LCL (VIEIRA et al., 2002). Essa resposta poderia ser explicada
por eles desenvolverem uma resposta imune inicial não protetora, favorecendo a disseminação
hematogênica ou linfática do parasito. No entanto, ainda não foi demonstrado causas desta
imunossupressão transitória, a não ser nos pacientes com coinfecção HIV-leishmania
(BORGES et al. 1999; LINDOSO et al. 2009).
No presente estudo, os pacientes do grupo LCD apresentaram consumo abusivo de
bebidas alcoólicas. De acordo com o VIGITEL (Vigilância por Inquérito Telefônico, 2012),
caracteriza-se como consumo abusivo de bebidas alcoólicas a ingestão de quatro ou mais
doses, para mulheres, ou cinco ou mais doses, para homens, em uma mesma ocasião dentro
dos últimos 30 dias, tal medida equivale a ultrapassar a quantidade de 60g em uma mesma
ocasião no mês. Oitenta e três por cento (83%) dos pacientes ultrapassaram este limiar
diariamente, enquanto que no grupo LCL apenas 25% ultrapassaram este limiar de consumo
(p=0,001).
Considera-se que o consumo aceitável de bebidas alcoólicas é aquele que não é diário
e não ultrapassa a quantidade de 20 gramas de álcool em um único dia para mulheres e pessoas
idosas ou 30 gramas de álcool por dia para os homens. Portanto, podemos dizer que o consumo
aceitável de álcool preenche os seguintes critérios, não beber todos os dias, devendo haver
pelo menos 2 dias da semana em que não haja consumo de álcool, homens não devem beber
mais do que 2 drinks em um único dia, e pessoas acima de 65 anos não devem beber mais do
que 1 drink por dia. (WHO, 2001).
Os pacientes LCD, em média, ingeriram diariamente 950 ml de bebidas alcoólicas,
predominantemente cachaça e cerveja, valores que chamam a atenção já que a recomendação
diária de ingestão de água é por volta de 2-3 L. Considerou-se como dose de bebida alcoólica
40 ml de bebida destilada, uma lata de cerveja (350ml) ou uma taça de vinho (150ml), essas
medidas equivalem a cerca de 12 a 14 gramas de álcool (WHO, 2001). Ressalta-se que a
necessidade de água depende de muitos fatores, lembrando que não é possível definir um valor
71
único de ingestão que assegure uma hidratação adequada para a saúde de todas as pessoas
aparentemente saudáveis em todas as condições ambientais, já que os diferentes níveis de
atividade física e de metabolismo, são determinantes óbvios (ACDGA, 2010).
O consumo abusivo de álcool está significativamente associado à ocorrência de LCD.
Todas as medidas de ingestão de álcool utilizadas neste estudo mostraram uma associação
significativa entre consumo abusivo de álcool e ocorrência de LCD (Valor-p entre 0,041 e
0,001), com uma Razão de Odds variando de 5,6 (Ingestão da Família), 15 (Ingestão Diária) e
35 (AUDIT ≥ 20).
Esta associação foi observada tanto com indicadores simples de ingestão de álcool,
assim como através de uma medida padronizada de ingestão de álcool como o AUDIT.
Medidas simples de ingestão foram obtidas por perguntas feitas aos pacientes, se eles tinham
ou não costume de ingerir bebidas alcoólicas; quais eram os tipos de bebidas que ele ou ela
usava; quantas vezes por mês ele ou ela usava bebidas alcoólicas; e qual era a quantidade de
bebida que ele ou ela usava “num dia que ele ou ela bebia”. Em relação aos hábitos de ingestão
de bebidas alcoólicas, percebeu-se que é uma atividade predominantemente masculina,
naquela região, onde há todo um preconceito e estigma relativo a tal hábito ser desenvolvido
por mulheres
Neste trabalho, estratificamos os pacientes, em dois intervalos de escore AUDIT, de
acordo com suas respectivas pontuações, o primeiro de 0 a 15 e 16 a 37, onde 67% dos
pacientes do grupo caso pontuaram com valores acima de 16, versus 6% dos pacientes
controles (p<0,001). O segundo intervalo de escore aumenta ainda mais a “nota” para o
diagnóstico de dependências 0 a 19 e de 20 a 37, AUDIT maior que 19 ocorreu em 50% dos
pacientes LCD versus 3% LCL (p<0,001). Mostrando uma possível dependência em no
mínimo 50% dos pacientes que evoluíram para LCD.
Na literatura tem sido demonstrado que consumo abusivo e crônico de álcool é
considerado como um fator que interfere na resposta imunológica, afetando a resposta T,
levando a um desequilíbrio na resposta Th1 e Th2, com predomínio da resposta Th2 (FAN et
al., 2011; LAU et al., 2006; SZABO et al., 1999; MANDREKAR et al., 2004 e 2009;
ICHIKAWA et al., 2011; MURALIDHARAN et al, 2014). O álcool interfere, reduzindo: a
apresentação de antígenos pelas células dendríticas (SAALMULLER et al., 2006; SZABO et
al., 2004; LAU et al., 2006; D’SOUZA et al, 2013; PARLET et al, 2014; ANDRADE et al.,
72
2017); a quimiotaxia, fagocitose e ação bactericida dos fagócitos (BRAYTON et al., 1970;
ALOMAN et al., 2005; PARLET & SCHLUETER, 2013). Estes dados reforçam nosso
achado, onde foi observado uma correlação positiva, estatisticamente significante, entre o grau
de álcool e a carga parasitária nos pacientes LCD. Merece ser ressaltado que no grupo LCL,
os dois pacientes que apresentaram carga parasitária alta (340 e 137 amastigotas/15 campos)
faziam uso abusivo de álcool, com 27 e 380 mL grau de álcool/dia, respectivamente.
No entanto, é importante ressaltar que outros fatores, além do álcool, podem estar
associados, interferindo nesta resposta, como o tipo de bebida (fermentada, destilada, contendo
flavonoides), background genético, e estado nutricional. Este último pode ter contribuído de
forma significante na geração da imunossupressão transitória que é característica dos pacientes
LCD, tendo em vista que a renda média relatada por este grupo era menor do que meio salário
mínimo brasileiro de 2017 e também porque alcoolismo induz desnutrição (MARSANO,
1994) (BADAWY, 2014). Além do exposto, Turetz e colaboradores (2002) já haviam descrito
que indivíduos do sexo masculino e com idade superior a 20 anos estariam mais predispostos
a desenvolver LCD. No presente estudo, 91,7% dos pacientes LCD eram do gênero masculino.
Sabe-se que a desnutrição é um fator de imunossupressão e que poderia interferir na
evolução das doenças infecciosas e parasitárias. Anstead e Colaboradores (2003) investigaram
a produção de citocinas pró-inflamatórias produzidas por macrófagos peritoniais de
camundongos BALB/c infectados por L. (L.) donovani e submetidos à desnutrição proteico-
energética (DPC). Os autores demonstraram que os animais desnutridos apresentaram baixa
síntese de TNF-α, IL-10 e NO após a estimulação com IFN-γ + LPS, correlacionada com o
déficit na ativação de fator-κB, essencial na indução da síntese de NO e de citocinas pró-
inflamatórias.
É fato que o comprometimento do estado nutricional pode gerar DPC. Caracterizado
por deficiência proteica, calórica e de vários micronutrientes, como folato, zinco, ferro, cobre,
selênio e as vitaminas A, E e B6 (BLOSSNER, 2005) (GREDEL, 2012). Como consequências
dessa desnutrição, alterações imunológicas podem ser observadas, incluindo a perda da função
de barreira da mucosa epitelial, atrofia de tecido linfoide (diminuição do número de células e
órgãos linfoides mal desenvolvidos), leucopenia e redução da resposta imune celular e humoral
(afetando várias funções como fagocitose, diferenciação de células T, ativação de macrófagos,
produção de citocinas, entre outros), além do aumento no dano oxidativo na membrana de
células imunes (AMBRUS JL, 2004)(GREDEL, 2012).
73
Alterações neurológicas (efeito deletério na biossíntese e atividade neuronal de
glutamato e GABA) e físicas (dermatite) também podem ser oriundas do consumo excessivo
de álcool, como na pelagra alcoólica (LOPÉZ et al., 2013). Sabidamente, o álcool pode induzir
ou agravar a pelagra por provocar desnutrição ao causar distúrbios gastrointestinais e
deficiência de vitamina B, inibindo a conversão de triptofano em niacina e promovendo a
acumulação de ácido aminolevulínico (5-ALA) e porfirinas (BADAWY, 2014) (BRUNO et
al., 2013), além de insuficiência de outros oligonutrientes, como o zinco. Portanto, o
alcoolismo pode ser considerado um fator de risco para algumas dermatoses, tais como
pelagra, psoríase, eczema numular e púrpura pigmentosa crônica e ser considerado como
indicador de alcoolismo (BRUNO et al., 2013). Vale ressaltar que um paciente LCD etilista
apresentou pelagra durante o curso da doença.
Do ponto de vista socioeconômico, há necessidade de se considerar a influência das
condições de vida das populações no agravamento das doenças infectoparasitárias, uma vez
que estas se potencializam. Assim, diante da importância do estado nutricional para a
manutenção da homeostasia do sistema imune e ao se considerar que os pacientes com LCD
em sua maioria eram agricultores da zona rural com baixa escolaridade e renda, pressupõe-se
a ocorrência de sinergismo entre o comprometimento nutricional e o alcoolismo na geração da
imunossupressão transitória caraterística da LCD. Dessa forma, é fundamental que se
considere, na abordagem dos indivíduos com leishmaniose, a restauração do estado nutritivo,
para que haja redução da suscetibilidade e desta forma, aumento da resistência à infecção e se
minimizem a geração de fatores confundidores ao se estudar a imunopatogênese da doença.
A redução da carga parasitária nos pacientes LCL é devido ao tipo de resposta imune
Th1 predominante nesta forma clínica, onde há maior produção de IFN-γ e TNF-α pelos
linfócitos circulantes (MACHADO et al., 2011), ocorrendo uma depuração mais eficaz do
parasito. Indivíduos com LCD demonstram uma menor capacidade de conter a infecção do
que os pacientes com LCL (VIEIRA et al., 2002), devido ao perfil imunológico. Tais pacientes
fazem uma resposta imune inicial não protetora, menos IFN-γ e TNF-α (CARVALHO et
al.,1994), propiciando a invasão de parasitos na corrente sanguínea e disseminação via
hematogênica (SCORZA et al., 2017). Um dado que corrobora essa hipótese é que esses
pacientes apresentam com bem mais frequência sintomas sistêmicos (CARVALHO et al.,
1994; TURETZ et al., 2002; MACHADO et al., 2011; SCORZA et al, 2017), o que foi pouco
relatado neste estudo.
74
No presente estudo, o uso do soro hiperimune policlonal de camundongo BALB/c
infectado com Leishmania braziliensis, como anticorpo primário, quando comparado aos
anticorpos monoclonais ou policlonais anti-Leishmania comerciais, tornou a técnica de menor
custo e mostrou-se igualmente sensível. Devido ao fato de ter sido utilizado um anticorpo não
purificado com produção “ in house”, foi necessário testar várias diluições e tempos de
reagentes. A diluição de 1/600 foi que conferiu menor ocorrência de coloração de fundo
“background” oriundas de reações cruzadas. O parasito foi observado, sobretudo no interior
de macrófagos, na derme superficial e profunda.
A formação de granuloma pode estar associada com a indução de resposta mediada por
células, resposta Th1 (AOKI et al., 1991). CASTRO e colaboradores (1993) avaliaram o efeito
da ingestão crônica de etanol na modulação da inflamação granulomatosa na esquistossomose
experimental em torno de ovos de S. mansoni no fígado de camundongos albinos (Mus
musculus), que receberam 7% de etanol como única fonte de líquido. Os animais que
receberam etanol aos 60 e 90 dias após a infecção apresentaram granulomas menores do que
os controles, quando sacrificados aos 120 dias após a infecção. Concluíram que a modulação
da inflamação granulomatosa varia de acordo com o tempo e a duração da ingestão do etanol.
No presente estudo, granulomas foram observados em ambos os grupos, sem diferença
significativa. No entanto, infelizmente a maturação deles não foi avaliada, já que granulomas
maduros, típicos de resposta imune celular, poderiam estar sinalizando a favor de uma resposta
imune tipo Th1 mais intensa no sítio inflamatório (AOKI et al., 1991).
Outro achado do presente estudo, que se correlaciona com o predomínio da resposta
Th2 descrito previamente (FAN et al., 2011; LAU et al., 2006) foi uma forte correlação
positiva entre a quantidade de plasmócitos na lesão e a carga parasitária no grupo LCD (R2 =
0.99 e p< 0,0001). Esta observação é consistente com estudos prévios que mostram que as
células B são encontradas em alta frequência no tecido de pacientes com LCL (VIEIRA, 2002;
BOMFIM, 2007), além disso, a maioria dessas células são maduras no local da lesão e são
responsáveis pela produção de imunoglobulinas in situ (MAGALHÃES et al., 1986, VIEIRA
et al., 2002). Ademais, KROLEWIECKI e colaboradores (2001) concluíram que
camundongos mantidos em uma dieta líquida contendo etanol manifestaram alterações em sua
capacidade de produzir respostas imunológicas Th1 e Th2. As respostas aos anticorpos foram
alteradas de maneira a sugerir um aumento na imunidade Th2 e uma diminuição na imunidade
Th1 nos camundongos que consomem álcool cronicamente.
75
O teste de hipersensibilidade tardia para Leishmania (IDRM) varia conforme as
diferentes formas clínicas de LTA; sendo positiva em 84 a 100% dos casos de LCL e LM, até
negativa nos pacientes com LCD (SHAW et al, 1975; GUIMARÃES et al, 2005). No presente
estudo, a frequência de IDRM positiva foi em 95,8% do total de pacientes. No grupo LCL a
IDRM média foi de 13 mm e de 24 mm no LCD. A proporção de indivíduos com IDRM
positivo em uma população que mora em uma área endêmica deve ser maior com o aumento
da idade (CUNHA, 2006). A resposta de IDRM nos pacientes com LCD foi diferente da
descrita na literatura, este achado poderia estar relacionado com a possibilidade de reação
alérgica ao conservante do antígeno ou erro na leitura do teste (CENTRO DE PRODUÇÃO E
PESQUISA DE IMUNOBIOLÓGICOS, 2005), uma vez que nos pacientes que moravam em
áreas distantes, a leitura dos testes foi feita por técnico de enfermagem dos Postos de Saúde
mais próximos deles.
O AUDIT revelou ser um teste de fácil aplicação e boa aceitação entre os pacientes do
ambulatório, fatos que são corroborados pela consistência das respostas e por observações dos
pesquisadores. Uma limitação deste contexto é que não foi feito um exame clínico neurológico
específico para diagnosticar alcoolismo ou intoxicação por álcool. Por isso, escolhemos o
AUDIT por se tratar de um instrumento que avalia com precisão e rapidez o grau de
comprometimento das pessoas com o álcool.
Em todas as formas de LTA o padrão de resposta imune do hospedeiro desempenha
papel central na apresentação clínica da doença. No entanto, há uma falta de consenso sobre o
mecanismo molecular pelo qual o álcool medeia a imunossupressão. Um dos modelos
descritos na literatura é o de MURALIDHARAN e colaboradores (2014) onde os autores
sugerem que moderada a alta quantidade de álcool regula positivamente as proteínas de
estresse celular HSF1 e hsp70 desempenhando um papel central na inibição da resposta imune
inata, via TLR4 / MyD88. Os autores sugerem que hsp70 e HSF1 possuem características anti-
inflamatórias e regulam negativamente a síntese de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-6,
IL-1β) por macrófagos murinos ou monócitos humanos in vitro, através da sinalização
TLR4/MyD88 ao inibir a atividade do fator de transcrição NF-kB pós estimulação com LPS.
Todavia, mais estudos ainda são necessários para fornecer um melhor entendimento de como
o álcool medeia a imunossupressão.
É possível vislumbrar como perspectivas estudos que investiguem o papel do parasito
no desenvolvimento da LCD, pois várias pesquisas têm demonstrado a existência de diferentes
clones de L. braziliensis e que esses polimorfismos genéticos poderiam estimular graus
76
variados de resposta imune (LEOPOLDO et al, 2006) que estariam associados às diferentes
formas clínicas de LTA (SCHRIEFER et al, 2004). Assim, seriam interessantes a pesquisa e
a identificação de clones (técnica de PCR) de Leishmania associados à LCD na macrorregião
de Baturité. Soma-se a este circuito, o estudo do papel do vírus Leishmania RNA Vírus 1
(LRV1) na LTA, sabe-se que ele pode infectar algumas espécies de protozoários envolvidos
na transmissão da doença. O LRV1 está sendo associado ao agravamento clinico impactando
sobre as metástases e as manifestações da forma mucocutânea. A presença do vírus ativaria
uma resposta imunológica hiperinflamatória no paciente (IVES et al., 2011) (ITO et al., 2015).
Entretanto, o vírus ainda não foi identificado em amostra coletada nas áreas endêmicas para a
doença no Sudeste e Nordeste, bem como ainda não há relatos científicos associando o LRV1
com a forma clínica LCD. Ainda há muito por elucidar sobre o impacto do LRV1 nas
manifestações clinicas da LTA.
Além disso, propõe-se a avaliação do papel das células T regulatórias (Treg) e seus
mediadores na patogênese da LCD, uma vez que tem sido demonstrado que tais células
reduzem a ativação, proliferação e produção de citocinas das células T efetoras (THORNTON,
1998; JONULEIT, 2001; PICCIRILLO, 2001), bem como a apresentação de antígenos pelas
células dendríticas. E este perfil imunorregulatório parece corroborar com a resposta
imunológica menos eficaz contra os antígenos de leishmania na LCD.
Como apêndice deste trabalho, encontra-se em fase de conclusão a mensuração in situ
através da técnica de IHQ da expressão das citocinas inflamatórias (IFN-γ e IL-6) e anti-
inflamatórias (TGF-β e IL-10) em amostras de biópsias de pele oriundas dos pacientes com
LCD e LCL. E estes achados serão correlacionados com a carga parasitária já obtida. Tal
abordagem poderá fornecer um painel da resposta imunoinflamatória exibida pelos pacientes
com LCD atendidos no ambulatório de Baturité.
Portanto, devido à complexidade natural da doença, em que são diversas as
manifestações clínicas e os agentes que as influenciam, é provável que mais de um fator
contribua para o desenvolvimento da LCD e é possível que a imunossupressão induzida pelo
alcoolismo seja um deles, no entanto há uma falta de consenso sobre os mecanismos
moleculares ou vias pelo qual o álcool medeia essa imunossupressão.
77
7 CONCLUSÕES
A ingestão abusiva de álcool pode ser um fator predisponente para a ocorrência de
leishmaniose disseminada;
A correlação positiva entre a carga parasitaria e o grau de álcool foi um forte indicador
da imunossupressão induzida pelo uso abusivo do álcool;
A correlação positiva e significativa entre o número de amastigotas e o número de
plasmócitos, nos pacientes com leishmaniose cutânea disseminada, pode indicar um
predomínio de resposta Th2 in situ.
78
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APÊNDICE I
93
APÊNDICE II
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95
96
APÊNCIE III
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98
APÊNDICE IV
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ANEXO I
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