UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE ......Tabela 3 - Deslocamento químico de RMN 13 C ( δ) (125 MHz, CDCl 3) para PGD-1, com padrão de hidrogenação obtido por comparação

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA E INORGÂNICA

Contribuição para a Padronização Química de Espécies do Gênero Plectranthus: Derivatização e Validação de Métodos

Analíticos para a Quantificação de Marcadores Químicos

LEANDRO BEZERRA DE LIMA

Tese Submetida à Coordenação do Curso de Pós Graduação em Química como Requisito

Parcial para a Obtenção do Título de Doutor.

Orientador: Profa. Dra. Maria Goretti de Vasconcelos Silva

FORTALEZA –CE 2013

Dedico

Aos meus pais,

Raimundo Bezerra de Lima e

Francisca J. P. Bezerra

AGRADECIMENTOS

À professora Dra. Maria Goretti, pela valiosa orientação, confiança depositada,

pela liberdade dada para o desenvolvimento deste trabalho, pelo conhecimento

compartilhado e pela amizade, o que foi de grande importância para meu crescimento

pessoal e profissional.

Aos professores Dr. Marcos Carlos e Dr. Maria Conceição por todos os

ensinamentos, atenção, colaboração e pelo espaço que me foi cedido e que tornaram

possível a conclusão dos meus experimentos.

Aos professores Dr. Alberto J. Cavalheiro e Dra. Eveline S. B. Cavalcanti por

participarem da banca examinadora e por contribuírem com a conclusão deste trabalho.

Ao professor Dr. Daniel Esdras pela atenção e auxílio na obtenção dos espectros

de ressonância magnética nuclear das minhas amostras.

À professora Dra. Maria Teresa por toda atenção e colaboração.

A todos os amigos do Laboratório de Produtos Naturais e do Laboratório de

Biotecnologia e Síntese Orgânica em especial ao Edângelo, Tiago Augusto, Tiago

Correia, Thiago Fonseca, Ricardo Marques, Ricardo Araújo, Emanuela, Reinaldo,

Carol, Daniely, Natália, Tasso Gabriel, Bárbara, Caroline, Juliana, Elayne, Daniel

Marcos, Francisco Sales, Amélia, Rogério e Roberto, por terem me ajudado e

incentivado ao longo da minha vida acadêmica na UFC.

Aos meus pais, Raimundo e Francisca, aos meus irmãos, Douglas e Danilo, por

todo o amor, suporte, compreensão, dedicação e atenção, por estarem sempre do meu

lado em todos os momentos, principalmente nos mais adversos.

À Fernanda, por todo apoio, compreensão, incentivo e amor, tornando os

momentos mais difíceis apenas em pequenos obstáculos.

Ao Fernando, Regina e Samuel, pelo apoio, confiança e amizade, desde o meu

ingresso na graduação até a conclusão do meu doutorado.

A CAPES e FUNCAP, pelo apoio financeiro.

A Deus, pois sem ELE nada seria possível.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Diterpenos abietanos - perfil químico-farmacológico de Labiatae ............... 12

Tabela 2 - Representação estrutural dos diterpenos abietanos identificados em Labiatae nos últimos 40 anos (numeração referente à Tabela 1) ................................................. 23

Tabela 3 - Deslocamento químico de RMN 13C (δ) (125 MHz, CDCl3) para PGD-1, com padrão de hidrogenação obtido por comparação com DEPT-135° ............................... 35

Tabela 4 - Comparação dos dados de RMN 1H e de 13C de PGD-1 com valores da literatura (Albuquerque, 2007) para a substância barbatusina. ..................................... 36

Tabela 5 - Comparação dos dados de RMN 1H e de 13C de PGD-2 com valores da literatura (Albuquerque, 2004). ................................................................................... 40

Tabela 6 - Comparação dos dados de RMN 1H e de 13C de DB-1 com valores da literatura (Albuquerque, 2004). ................................................................................... 42

Tabela 7 - Deslocamento químico de RMN 13C (δ) (125 MHz, CDCl3) para OXB, com padrão de hidrogenação obtido por comparação com DEPT-135°. .............................. 45

Tabela 8 - Comparação dos dados de RMN 1H e de 13C de OXB com valores da literatura (Albuquerque et al, 2007) para a substância barbatusina. .............................. 46

Tabela 9 - Recuperação do analito em função da concentração. ................................... 65

Tabela 10 - Coeficientes de variação em função da concentração do analito. ............... 66

Tabela 11 – Condições de eluição estabelecidas para cada marcador químico............. 68

Tabela 12 - Concentrações dos analitos injetados em triplicadas e as áreas correspondentes para cada curva analítica. .................................................................. 75

Tabela 13 - Resultados da regressão linear para as duas curvas analíticas. ................... 75

Tabela 14 - Teores dos marcadores químicos nos extratos etanoicos das folhas de P.

grandis, P. barbatus, P. ornatus e P. amboinicus. ....................................................... 76

Tabela 15 - Percentuais de recuperação de BARB e DEBARB em P. grandis, P.

barbatus, P. ornatus e P amboinicus. .......................................................................... 77

Tabela 16 – Determinação da precisão intradia............................................................ 78

Tabela 17 - Terminação da precisão interdias para três níveis de concentração de BARB e DEBARB. ................................................................................................................ 79

Tabela 18 - Limite de detecção dos marcadores químicos obtido pelos parâmetros da curva analítica. ............................................................................................................ 80

Tabela 19 - Limite de detecção obtida pela injeção em decaplicata. ............................. 80

Tabela 20 - Limite de quantificação dos marcadores químicos obtido pelos parâmetros da curva analítica. ....................................................................................................... 81

Tabela 21 - Limite de quantificação obtida pela injeção em decaplicata. ..................... 81

Tabela 22 - Inibição do crescimento celular (IC%) das amostras em três linhagens tumorais testadas na dose única de 25µM. ................................................................... 83

Tabela 23 - IC50 para a barbatusina, 3-β-hidroxi-3-deoxobarbatusina e OXB. .............. 84

Tabela 24 - Número de larvas mortas para as espécies de Plectranthus. ...................... 85

Tabela 25 - Valores de concentração letal para a mortalidade de 50 e 99% das larvas do mosquito Aedes aegypti para as espécies de Plectranthus. ........................................... 86

Tabela 26 - Fracionamento de PGE por partição líquido-líquido. ................................ 90

Tabela 27 - Fracionamento de PGEPD em coluna de sílica gel .................................... 90

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representação estrutural dos compostos isolados e identificados de Plectranthus barbatus e Plectranthus forskohlii ............................................................ 2

Figura 2 - Representação estrutural de compostos com atividade gastroprotetora .......... 3

Figura 3 - Representação estrutural dos constituintes químicos do óleo essencial de Plectranthus grandis ...................................................................................................... 4

Figura 4 - Registro fotográfico de espécies do gênero Plecthanthus: P grandis (a), P.

barbatus (b), P. ornatus (c) e P amboinicus (d) (Fonte: MGVSilva) .............................. 7

Figura 5 - Representação estrutural dos esqueletos abietanos ...................................... 23

Figura 6 - Espécies de Labiatae produtoras de diterpenos abietanos............................. 33

Figura 7 - Espectro de massas de alta resolução de PGD-1 .......................................... 35

Figura 8 – Representação estrutural do diterpeno barbatusina ...................................... 36

Figura 9 - Espectro de RMN 1H de PGD-1 .................................................................. 37

Figura 10 - Espectro de RMN 13C de PGD-1 ............................................................... 37

Figura 11 - Espectro de RMN 13C DEPT-135º de PGD-1 ............................................ 38

Figura 12 - Espectro na região do infravermelho de PGD-1 ......................................... 38

Figura 13 - Representação estrutural do diterpeno 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina ...... 39

Figura 14 - Espectro de massas de alta resolução de PGD-2 ........................................ 39

Figura 15 - Espectro de RMN 1H de PGD-2 ................................................................ 40

Figura 16 - Espectro de RMN 13C de PGD-2 ............................................................... 41

Figura 17 - Representação estrutural do diterpeno 3-hidroxi-3-deoxobarbatusina ........ 42

Figura 18 - Espectro de RMN 1H de DB-1 .................................................................. 43

Figura 19 - Espectro de RMN 13C de DB-1 ................................................................. 43

Figura 20 - Espectro de RMN 13C DEPT de DB-1 ....................................................... 44

Figura 21 - Espectro de massas de alta resolução de OXB ........................................... 45

Figura 22 - Representação estrutural de OXB .............................................................. 46

Figura 23 - Espectro de RMN 1H de OXB ................................................................... 48

Figura 24 - Espectro de RMN 13C BB de OXB ............................................................ 48

Figura 25 - Espectro de RMN 13C DEPT-135° ............................................................ 49

Figura 26 - Espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C HSQC de OXB ........................................................................................................................... 49

Figura 27 - Expansão 1 do espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C HSQC de OXB. .......................................................................................................... 50

Figura 28 - Expansão 2 do espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C HSQC de OXB. .......................................................................................................... 50

Figura 29 - Espectro bidimensional de correlação homonuclear 1H x 1H COSY de OXB ................................................................................................................................... 51

Figura 30 - Expansão 1 do espectro bidimensional de correlação homonuclear 1H x 1H COSY de OXB. .......................................................................................................... 52

Figura 31 - Espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C à longa distancia (HMBC) de OXB ......................................................................................... 53

Figura 32 – Expansão 1 do espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C à longa distancia (HMBC) de OXB. ............................................................................ 54

Figura 33 - Expansão 2 do espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C à longa distancia (HMBC) de OXB. ............................................................................ 55



Figura 36 - Expansão 5 do espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C à longa distancia (HMBC) de OXB ............................................................................. 58


Figura 38 - Espectro de RMN 1H de PDB ................................................................... 60

Figura 39 - Espectro de RMN 1H da Barbatusina (PGD-1) .......................................... 61

Figura 40 - Cromatograma de BARB na concentração de 25 ppm ............................... 72

Figura 41 - Cromatograma de BARB na concentração de 50 ppm ............................... 72

Figura 42 - Cromatograma de BARB na concentração de 100 ppm ............................. 72



Figura 45 - Cromatograma de DEBARB na concentração de 25 ppm .......................... 73

Figura 46 - Cromatograma de DEBARB na concentração de 50 ppm .......................... 74

Figura 47 - Cromatograma de DEBARB na concentração de 100 ppm ........................ 74



Figura 50 – Registro fotográfico dos cristais obtidos da fração diclorometano de PGEPD ....................................................................................................................... 91

Figura 51 – Registro fotográfico dos cristais de PGD-1 ............................................... 92

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1 - Esquema biossintético via mevalonato de terpenoides (SIMÕES, 2001).. 10

Esquema 2 - Semi-rota biossintética para formação do esqueleto abieta-7,13-dieno (MACMILLAN, 1999). .............................................................................................. 11

Esquema 3 - Reação de redução da barbatusina. .......................................................... 94

Esquema 4 - Reação de hidrólise ácida da Barbatusina ............................................... 94

Esquema 5 - Reação de hidrólise alcalina, em metanol, da Barbatusina ....................... 94

Esquema 6 - Reação de hidrólise ácida, em metanol, da Barbatusina ........................... 95

Esquema 7 - Reação de metilação da Barbatusina com base fraca ............................... 95

Esquema 8 - Reação de metilação da Barbatusina com base forte ................................ 96

Esquema 9 - Reação de metilação da Barbatusina com éter coroa................................ 96

Esquema 10 - Reação de benzilação da Barbatusina .................................................... 97

Esquema 11 - Reação de produção da oxima ............................................................... 97

LISTA DE FLUXOGRAMAS Fluxograma 1 - Obtenção e fracionamento do extrato etanoico das folhas de P. grandis (PGE) ......................................................................................................................... 92

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 - Evolução dos relatos científicos para diterpenos abietanos de Labiatae ...... 11

Gráfico 3 - Curva analítica de BARB .......................................................................... 76

Gráfico 2 - Curva analítica de DEBARB ..................................................................... 76

Gráfico 4 - Concentração x percentual de mortalidade das larvas de Aedes aegypti. .... 85

LISTA DE ABREVIATURAS

BARB Barbatusina BB - Broudband

CCD - Cromatografia em Camada Delgada CDCl

3 - Clorofórmio

CLAE-DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada a Detector de Arranjo de Diodos

COSY - Correlation Spectroscopy DB-1 Substância derivada da barbatusina

DEBARB 3β-hidróxi-3-deoxobarbatusina DEPT - Distortionless Enhancement by

Polarization Transfer DPE Desvio Padrão Relativo

HMBC - Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HPM/FJAM - Horto de Plantas Medicinais Francisco José Abreu Matos.

HSQC - Heteronuclear Single Quantum Correlated

J - Constante de Acoplamento LD Limite de Detecção

LPN - Laboratório de Produtos Naturais LQ Limite de Quantificação

OXB Substância derivada da barbatusina P.F. - Ponto de Fusão

PGD-1 Substância obtida da fração diclorometano de P. grandis

PGD-2 Substância obtida da fração diclorometano de P. grandis

PGEPA Fração acetato de etila da partição do extrato etanoico de P. grandis

PGEPB Fração n-butanol da partição do extrato etanoico de P.grandis

PGEPD Fração diclorometano da partição do extrato etanoico de P. grandis

PGEPH Fração hexano da partição do extrato etanoico de P. grandis

RMN-13

C - Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13

RMN-1

H - Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RSD Relative Standard Deviation UFC - Universidade Federal do Ceará δ - Deslocamento Químico

RESUMO

Plectranthus grandis (Cramer) R. H. Willense é uma planta medicinal conhecida

popularmente no Ceará como boldo-grande, utilizada pela população em substituição a

P. barbatus (boldo), que apresenta atividade gastroprotetora já comprovada para a

planta, atividade esta, atribuída a diterpenos que foram isolados desta planta, validando

cientificamente seu uso popular. Este trabalho descreve alguns procedimentos analíticos

visando contribuir para a padronização química de quatro espécies de Plectranthus. Os

diterpenos barbatusina e 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina foram isolados através de

técnicas cromatográficas, sendo possível desenvolver um método de extração seletiva

para a barbatusina, o que possibilitou obter quantidade significativa desta substância.

Foram realizadas reações de derivatização, obtendo-se a 3-hidroxi-3-deoxobarbatusina,

que possui atividade gastroprotetora, in vivo, já reportada na literatura, e a oxima da

barbatusina, inédita na literatura, com atividade citotóxica mais potente do que sua

precursora. As elucidações estruturais foram realizadas através de espectroscopia na

região do infravermelho (IV), RMN 1H, RMN 13C, DEPT-135º, COSY, HMBC e

HSQC em comparação com dados da literatura. Utilizando a técnica de cromatografia

líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD) desenvolveu-

se métodos para a quantificação de barbatusina e 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina, em

que foram encontrados parâmetros adequados de linearidade (r2 > 0,99), para as duas

substâncias analisadas. O método foi validado e apresentou linearidade (r2 = 0,9931

para a barbatusina e r2 = 0,9966 para a 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina), seletividade,

precisão intra-dia (DPR (desvio padrão relativo) < 2,8% para a barbatusina e DPR <

3,5% para a 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina), exatidão (recuperação entre 81,7% e

115,1%). Os métodos então desenvolvidos foram aplicados aos extratos etanoicos das

folhas de P grandis, P. barbatus, P. amboinicus, P. ornatus. Foi também avaliada a

reatividade biocatalítica da barbatusina frente a enzimas e fungos, e observou-se não

ocorrer nenhuma modificação estrutural na molécula. O potencial larvicida e citotóxico

das quatro espécies de Plectranthus foram avaliados, bem como dos compostos puros,

apresentando promissora atividade citotóxica para três linhagens de células tumorais.

ABSTRACT

Plectranthus grandis (Cramer) Willense is a medicinal plant popularly known in

Ceará as boldo-grande, used by population in substitution of P. barbatus (boldo). It

shows gastroprotective activity and this activity is attributed to diterpenes have been

isolated from this plant, scientifically validating its popular use. This work describes the

analytical procedures used and obtained results, aiming to contribute for chemical

standardization of four Plectranthus species. Barbatusin and 3β-hydroxy-3-

deoxobarbatusin diterpenes were isolated by chromatographic techniques, being

possible to develop selective extraction method of barbatusin, which enabled to obtain

significant amount of this substance. Derivatization reactions were performed, getting 3-

hydroxy-3-deoxobarbatusin, having gastroprotective activity, in vivo, already reported

in the literature, and oxyimine product of barbatusin, unpublished in the literature, with

cytotoxic activity more potent than its precursor. Structural elucidation were performed

by infra-red spectroscopy, NMR 1H and NMR 13C, compared with literature data. Using

HPLC-DAD, methods were developed for quantification of barbatusin and 3β-hydroxy-

3-deoxobarbatusin, in wich suitable parameters have been found of linearty (r2 > 0,99),

for both analytes. The method was validated and presented linearity (r2 = 0.9931 for

barbatusin and r2 = 0.9966 for 3β-hydroxy-3-deoxobarbatusin), selectivity, within-day

precision (RSD < 2.8% for barbatusin and RSD < 3.5% for 3β-hydroxy-3-

deoxobarbatusin), accuracy (recovery between 81,7% a 115,1%). The methods so

developed, was applied to the leaves extracts of P. grandis, P. barbatus, P. amboinicus

and P. ornatus. It was also evaluated the reactivity for biocatalysis of barbatusina in

enzymes and fungi, and it was not observed any structural modification in the

molecule.The larvicidal and cytotoxic potentials of the four Plectranthus species were

evaluated, as well as the pure compounds, showing promising cytotoxic activity for

three strains of tumor cells.

Sumário

CAPíTULO 1............................................................................................................................ 1

INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 1

CAPÍTULO 2: .......................................................................................................................... 6

CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS ........................................................................................... 6

2.1 - A Família Lamiaceae. .................................................................................................. 6

2.2 - Considerações Botânicas sobre Plectranthus grandis. ................................................ 8

2.3 - Considerações Botânicas sobre Plectranthus barbatus. .............................................. 8

2.4 - Considerações Botânicas sobre Plectranthus amboinicus. .......................................... 8

2.5 - Considerações Botânicas sobre Plectranthus ornatus. ................................................ 9

CAPÍTULO 3 ......................................................................................................................... 10

DITERPENOS ABIETANOS DE LABIATAE NOS ÚLTIMOS 40 ANOS (revisão bibliográfica) .......................................................................................................................... 10

CAPÍTULO 4 ......................................................................................................................... 34

RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................. 34

4.1- Determinação Estrutural ........................................................................................... 34

4.1.1--Obtenção e Determinação Estrutural de PGD-1 ..................................................... 34

4.1.2 - Obtenção e Determinação Estrutural de PGD-2..................................................... 38

4.1.3–Produtos de derivatização da Barbatusina ............................................................... 41

4.1.3.1 – Obtenção e Determinação Estrutural de DB-1 ................................................... 41

4.1.3.2 – Obtenção e Determinação Estrutural de OXB-1 ................................................. 44

4.1.3.2 – Produtos de hidrólise, metilação e benzilação da barbatusina ............................. 60

4.1.3.3 – Avaliação do produto de Degradação da Barbatusina em Meio Alcalino (PDB). 60

4.2 – Reatividade biocatalítica da barbatusina................................................................. 61

4.2.1-Triagem com Enzimas ............................................................................................ 61

4.2.2-Triagem com Fungos .............................................................................................. 61

CAPÍTULO 5 ......................................................................................................................... 62

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA COM DETECTOR DE ARRANJO DE DIODOS PARA DETERMINAÇÃO DOS MARCADORES QUÍMICOS, BARBATUSINA (BARB) E 3-Β-HIDROXI-3-DEOXOBARBATUSINA (DEBARB) EM

QUATRO ESPÉCIES DO GÊNERO PLECTRANTHUS ......................................................... 62

5.1 - Validação e Parâmetros de Validação ...................................................................... 62

5.2 - Parâmetros de Validação .......................................................................................... 63

5.2.1 - Linearidade .......................................................................................................... 63

5.2.2 - Exatidão ............................................................................................................... 63

5.2.3 - Precisão ................................................................................................................ 65

5.2.4 - Limite de Detecção ............................................................................................... 66

5.2.5 - Limite de Quantificação ....................................................................................... 67

5.3- Análise Quantitativa por CLAE-DAD para os marcadores (BARB) e (DEBARB) em quatro espécies do gênero Plectranthus: P. grandis, P. barbatus, P. ornatus e P.

amboinicus. ........................................................................................................................ 67

5.3.1- Desenvolvimento do método .................................................................................. 67

Condições cromatográficas utilizadas .............................................................................. 67

Preparação das amostras .................................................................................................. 68

Preparação das soluções padrões ..................................................................................... 68

Estimativa das Faixas de Concentração de Trabalho ........................................................ 69

Construção das Curvas Analíticas .................................................................................... 69

5.3.2- Validação do método ............................................................................................. 69

Seletividade .................................................................................................................... 69

Linearidade ..................................................................................................................... 70

Limite de Detecção (LD) ................................................................................................. 70

Limite de Quantificação (LQ) .......................................................................................... 70

Exatidão .......................................................................................................................... 71

Precisão .......................................................................................................................... 71

5.4 - RESULTADOS .......................................................................................................... 71

5.4.1-Desenvolvimento do método ................................................................................... 71

Obtenção das Curvas Analíticas ...................................................................................... 71

5.4.2- Validação do método ............................................................................................. 76

Exatidão .......................................................................................................................... 76

Precisão .......................................................................................................................... 78

Precisão intradia............................................................................................................. 78

Precisão interdias ........................................................................................................... 79

Limite de Detecção (LD) ................................................................................................. 80

Limite de quantificação (LQ)........................................................................................... 81

CAPÍTULO 6 ......................................................................................................................... 83

ATIVIDADES BIOLÓGICAS DOS EXTRATOS DE Plectranthus E BARBATUSINA ........ 83

6.1.-Avaliação da Citotoxicidade In Vitro ......................................................................... 83

6.2-Potencial larvicida dos extratos de Plectranthus frente a Aedes aegypti.......................... 85

CAPíTULO 7.......................................................................................................................... 87

PARTE EXPERIMENTAL ..................................................................................................... 87

7.1 – Métodos Cromatográficos ........................................................................................ 87

7.2 – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H) e Carbono (RMN13C). 88

7.3 – Ponto de Fusão.......................................................................................................... 89

7.4 – Coleta das Plantas Estudadas. .................................................................................. 89

7.5 - Isolamento dos Constituintes Químicos de Plectranthus grandis. ............................ 89

7.5.1 - Obtenção do Extrato Etanoico das Folhas de Plectranthus grandis. ....................... 89

7.5.2-Fracionamento do Extrato Etanoico (PGE) ............................................................. 90

7.5.3-Isolamento de PGD-1. ............................................................................................ 91

7.5.4 - Isolamento de PGD-2 ........................................................................................... 93

7.6 - Derivatização da Barbatusina ................................................................................... 93

7.6.1 - Obtenção de 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina (DB-1) ............................................. 93

7.6.2 – Obtenção do produto de hidrólise ......................................................................... 94

7.6.3 – Obtenção do produto de metilação ...................................................................... 95

7.6.4 – Obtenção do produto de benzilação ...................................................................... 97

7.6.5- Reação de Formação da oxima (OXB) ................................................................... 97

7.6.6 – Avaliação da Decomposição da Barbatusina em Meio Alcalino ............................ 97

7.6.7.- Reatividade da Barbatusina em Reações Biocatalisadas e de Biotransformações ....... 98

I - Triagem com enzimas ................................................................................................. 98

II - Triagem com fungos .................................................................................................. 98

7.7 - Atividades Biológicas ................................................................................................ 98

7.7.1 - Avaliação da Citotoxicidade in vitro da Barbatusina ............................................. 98

7.7.2 - Avaliação do Potencial Larvicida (utilizando as larvas de Aedes aegypti) .............. 99

CAPITULO 8 ....................................................................................................................... 100

CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 100

CAPÍTULO 9 ....................................................................................................................... 102

CONSTANTES FÍSICAS E DADOS ESPECTROMÉTRICOS DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS OBTIDOS DE Plectranthus grandis .............................................................. 102

PGD-1 .............................................................................................................................. 102

PGD-2 .............................................................................................................................. 103

DB-1 ................................................................................................................................. 104

OXB ................................................................................................................................. 105

CAPÍTULO 10 ..................................................................................................................... 106

REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 106

1

1 - INTRODUÇÃO

CAPíTULO 1

INTRODUÇÃO

O gênero Plectranthus (sin. Coleus) pertencente à família Labiatae (sin.

Lamiaceae) engloba cerca de 300 espécies, das quais muitas são usadas como

ornamentais e ou medicinais, ocorrendo de forma nativa na África, Ásia e Austrália

(Ascensão et al, 1998).

Espécies do gênero Plectranthus apresentam capacidade biossintética para

produzir metabólitos secundários em diversidade, destacando-se entre estes, os

diterpenos, inclusive alguns com propriedades biológicas comprovadas (Marques et al,

2006; Buznego e Perez-Saad, 1999; Abdel-mogib et al, 2002; Hagiwara et al, 2003).

São constituintes identificados em P. barbatus (falso boldo), Ciclobutatusina (Zelnik et

al, 1977), 6β-hidroxicarnosol (Kelecom, 1983), barbatusol (Kelecom, 1983), plectrina

(Kubo, 1984), cariocal (Kelecom, 1985), coleon E, coleon F, plectrinona A e

plectrinona B (Ruedi, 1986), e apresentam importância farmacológica. Por sua vez, o

estudo do óleo essencial da parte aérea e raízes da espécie P. barbatus apresentou β-

cariofileno, α-pineno, β-felandreno, β-(z)-ocimeno, manool e abietatrieno (Kerntopf,

2002; Albuquerque, 2006).

Dentre as várias espécies de Plectranthus de interesse químico-biológico

podemos citar também Plectranthus forskohlii, cuja análise cromatográfica forneceu um

diterpeno labdano de alta importância farmacológica, que foi denominada forskolina

(7β-acetoxi-8,13-epoxi-1α, 6β,9α-triidroxi-labd-14-en-11-ona), que apresenta atividade

anti-hipertensiva, anti-glaucoma, antiinflamatória, inibidor da agregação plaquetária,

bronco dilatador e ativador da adenilase ciclase (SHAH, 1980). Assim, só em 2001

foram encontradas mais de 1500 citações no Chemical Abstracts (HAGIWARA, 2003)

sobre forskolina, que é disponível comercialmente na concentração de 10% a U$ 49,00

(60 cápsulas), para uso humano sem comprovação, como auxiliar na queima de

gorduras e aumento da testosterona.

A Figura 1 (página 2) apresenta as estruturas com propriedades biológicas

citadas para P. barbatus e P. forskohlii.

2

1 - INTRODUÇÃO

Figura 1 - Representação estrutural dos compostos isolados e identificados de Plectranthus barbatus e Plectranthus forskohlii

CH2

β-Cariofileno

OAc

OAc

O OH

O

HO

H

OH

H

Ciclobutatusina

O

HO

OH

OH

O

6β-Hidroxi-carnosol

OHHO

Barbatusol

CHO

O

O

OH

OH

Cariocal

O

O

OAc

OH

OH

Plectrina

O

H

O

OH

OAc

Coleon E

O

H

O

OAc

Coleon F

O

O

HO

OH

OH

OH

Plectrinona A

O

O

HO

OH

OH

Plectrinona B α-Pineno β-Felandreno β-(z)-Ocimeno

HO

H

Manool Abietatrieno

O

O

OH

OH

H

OH

O

O

Forskolina

3

1 - INTRODUÇÃO

Plectranthus grandis (Cramer) Willense é uma planta aromática

morfologicamente semelhante à P. barbatus (malva santa), diferindo basicamente no

tamanho do porte arbustivo e das partes aéreas sendo popularmente conhecida como

boldo grande. Entre os fatores divergentes marcantes das duas espécies, está o fato de

que P. grandis florescer até duas vezes ao ano em regiões não serranas e apresentar

amargor de caules e folhas enquanto P. barbatus apresenta amargor apenas nas folhas e

floresce apenas uma única vez por ano (MATOS, 2000). A semelhança entre as duas

espécies é suficiente para que, algumas pesquisas encontradas na literatura sobre P.

barbatus, especialmente aquelas baseadas em estudos etnofarmacológicos, possam ter

sido realizadas com P. grandis, por engano de identificação botânica (MATOS, 2000).

A população utiliza P. grandis em substituição a P. barbatus, planta que

apresenta atividade hipossecretora gástrica já comprovada (LAPA et al, 1991) e estudos

anteriores demonstraram propriedade gastroprotetora de vários diterpenos isolados da

planta (SCHMEDA-HIRSCHMANN et al, 2002; MELO et al, 2003; RODRÍGUEZ et

al, 2006), validando desta forma o uso popular desta planta, no combate às doenças

relacionadas ao aparelho digestivo. O óleo essencial de Plectranthus grandis é rico em

β-cariofileno, e relatos recentes comprovam a atividade antioxidante do óleo

(ALBUQUERQUE et al, 2006).

A busca realizada utilizando a ferramenta de busca Scifinder, em março de

2013, apresenta apenas dez artigos publicados sobre a espécie Plectranthus grandis, dos

quais somente quatro versam sobre sua constituição química. Albuquerque e col. (2010)

relatam o efeito protetor contra lesões gástricas induzidas pela ingestão de etanol em

ratos, com a administração oral de 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina (5 e 10 mg/kg) e

barbatusina (5 e 10 mg/kg) (figura 2). Para as respectivas doses empregadas, a redução

da lesão foi de 53, 58 e 96% para a 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina e 32 e 76% para

barbatusina.

Figura 2 - Representação estrutural de compostos com atividade gastroprotetora

OAc

OAc

OHO

O

O

H

OAc

OAc

OHHO

O

O

H

Barbatusina 3β-Hidroxi-3-deoxobarbatusina

4

1 - INTRODUÇÃO

A composição volátil, responsável pela atividade antioxidante dos óleos

essenciais das folhas de P. grandis cultivada no Ceará, apresenta majoritariamente

trans-β-cariofileno (31,3-40,2%), germacreno-D (12,5-24,5%) e eugenol (15,4%)

(figura 3). O ensaio do DPPH que mede a capacidade sequestrante de radicais livres do

substrato realizado com o óleo essencial das folhas desta planta, apresentou um índice

de varredura de DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) de 83,28% (ALBUQUERQUE,

2006).

Figura 3 - Representação estrutural dos constituintes químicos do óleo essencial de Plectranthus grandis

As investigações em busca de biocompostos oriundos de plantas herbáceas,

tais como as espécies de Plectranthus, apresentam a vantagem da disponibilidade do

material vegetal, sem impacto das floras nativas, pois muitas se propagam facilmente

permitindo cultivos, inclusive para fins comerciais. A variabilidade qualitativa e

quantitativa dos constituintes bioativos pode influenciar a ação terapêutica apresentada

pela planta, sendo necessário um conhecimento mais completo possível, dos parâmetros

que envolvem e promovem esta quimiodiversidade.

Para Plectranthus grandis, os dados encontrados na pesquisa bibliográfica,

até então, são insuficientes para promover o uso racional desta planta e validar seu uso

medicinal popular de modo que esta espécie foi selecionada para o desenvolvimento

deste trabalho. A presença relatada de diterpenos de esqueleto abietanos em P. grandis,

que são conhecidos por sua diversidade de atividades farmacológicas, notadamente

barbatusina, justifica a continuação de estudo da espécie, com o desenvolvimento de

extração seletiva de barbatusina, desenvolvimento e validação de métodos analíticos

para a quantificação dos marcadores químicos barbatusina e 3β-hidroxi-3-

deoxobarbatusina visando contribuir para a padronização química de espécies do gênero

Plectranthus.

CH2

O

HO

Trans-β-Cariofileno Germacreno-D Eugenol

5

1 - INTRODUÇÃO

Foram utilizadas no desenvolvimento deste trabalho, técnicas cromatográficas

como cromatografia em coluna aberta, cromatografia em camada delgada, CLAE

(cromatografia líquida de alta eficiência), além de técnicas de determinação estrutural

como ressonância magnética nuclear (RMN 1H), carbono (RMN

13C) e 1H x 1H COSY,

HMBC, HMQC e espectroscopia de infravermelho.

A apresentação escrita deste trabalho segue as normas do Programa de Pós-

Graduação em Química da Universidade Federal do Ceará e os capítulos são divididos

em: 1 - Introdução; 2- Considerações botânicas; 3 - Diterpenos abietanos de Labiatae

nos últimos 40 anos (revisão bibliográfica); 4- Resultados e discussão; 5-

Desenvolvimento e validação de métodos analíticos por CLAE-DAD para determinação

dos marcadores químicos barbatusina (BARB) e 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina

(DEBARB) em quatro espécies do gênero Plectranthus; 6 -Atividades biológicas dos

extratos de Plectranthus e barbatusina; 7- Parte experimental; 8-Conclusão; 9 -

Constantes físicas e dados espectrométricos dos constituintes químicos obtidos de

Plectranthus grandis e 10- Referências.

6

2 - CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS

CAPÍTULO 2:

CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS 2.1 - A Família Lamiaceae.

A família Lamiaceae possui quase 4000 espécies contidas em aproximadamente

220 gêneros, entre eles estão Salvia, Ocimum, Mentha e Plectranthus, com uma rica

diversidade de usos etnobotânicos, ampla diversidade morfológica e uma distribuição

quase cosmopolita.

As espécies desta família evitam, em geral, florestas tropicais e os trópicos, e

igualmente as regiões frias. Preferem os habitat livres, abertos, declives secos e

pedregosos, matas da Córsega, ilhas mediterrâneas e cumes de montanhas ensolaradas.

Nestes locais habitam as espécies mais características e mais nobres, enquanto variantes

menos nobres são encontradas nas áreas mais úmidas dos prados à beira dos regatos e

na sombra das florestas. As folhas das plantas são odoríferas, opostas duas a duas, mas a

planta não se detém na fase vegetativa foliar, pois tendem a produzir flores o mais

rápido possível. Flores são abundantes, têm formas marcantes, caracteres específicos e

variados, próprio da família. Os frutos são pequenos do tipo aquênio, separando-se

caracteristicamente em quatro frutículos parciais (núculas), onde cada um é uma

pequena noz. Os tricomas glandulares multicelulares são responsáveis pela presença e o

teor do óleo essencial, presentes principalmente nas folhas e nos cálices das flores.

(LUKHOBA et al, 2006; HEDGE, 1992)

Plectranthus é um dos gêneros que compõem a família , e possui aproximadamente

300 espécies distribuídas na África tropical, apesar de as espécies da família Lamiaceae

evitarem as regiões tropicais, Ásia e Austrália (LUKHOBA et al, 2006). O táxon

Plectranthus inclui plantas ricas em diterpenos, que são substâncias responsáveis por

variadas e importantes propriedades medicinais tais como antiviral, antifúngica, anti-

hipertensiva, antioxidante, citotóxica entre outras. No Brasil, várias destas espécies

foram introduzidas pelos colonizadores europeus a partir da África, provavelmente

seguindo a rota do tráfego de escravos.

Algumas espécies do gênero Plectranthus são de difícil identificação por causa da

ausência de claros critérios morfológicos para discriminar não somente espécies dentro

do gênero, mas também entre gêneros intimamente relacionados. Entre as espécies de

7

ocorrência mais comum no Brasil são P. grandis, P. barbatus, P. ornatus e P.

amboinicus (Figura 4)

Figura 4 - Registro fotográfico de espécies do gênero Plecthanthus: P grandis (a), P.

barbatus (b), P. ornatus (c) e P amboinicus (d) (Fonte: MGVSilva)

a) b)

d) c)

8


2.2 - Considerações Botânicas sobre Plectranthus grandis.

A espécie Plectranthus grandis é popularmente conhecida no Brasil como boldo-

grande, boldão, boldo-da-folha-grande, falsa malva-santa e boldo mexicano, sendo

designado na literatura por Plectranthus grandis (Cramer) Willense.

Conforme dados da literatura (CRAMER, 1977), Plectranthus grandis é um arbusto

com até 3 m de altura com folhas maiores do que 4,7 cm, racemo com 56 cm de

comprimento, caule subquadrangular espesso e com pelos; inflorescência racemosa,

com racemo simples erétil, 26 - 56 cm, pedúnculo rígido, portando flores com corola

maior do que 2,0 cm de comprimento de coloração azul. Esta espécie é capaz de

florescer no Nordeste nas regiões serranas, litorâneas ou sertão central, no que diferem

das outras espécies que necessitam de clima mais ameno ou temperado como ocorre em

regiões serranas com clima úmido.

2.3 - Considerações Botânicas sobre Plectranthus barbatus.

Popularmente conhecida no Brasil pelas denominações de malva-santa, boldo-

nacional, boldo-falso ou sete-dores. Na literatura cientifica seu nome botânico é

Plectranthus barbatus Andr., tendo sido referida anteriormente pela designação de

Coleus barbatus.

Plectranthus barbatus é uma grande e ereta erva ou subarbusto flexível, atingindo

até 1,75 m de altura, ramos densamente tormentosos, de folhas aromáticas pecioladas,

limbo semissuculento, oval e largamente elíptico, densamente tormentoso, face inferior

com glândulas, ápice obtuso e arredondado, base acuneada, margem regularmente

crenado-denteada, pecíolo 10 - 20 mm de comprimento, bráctea oval acuminada,

caduca, corola azul claro, 17 - 20 mm de comprimento no fruto tubo geniculado mais ou

menos no meio e expandindo-se na base por 3 mm. Não floresce no Nordeste a não ser

em regiões serranas com clima mais ameno (KERNTOPF, 1998).

2.4 - Considerações Botânicas sobre Plectranthus amboinicus.

A planta é popularmente conhecida no Brasil pelas designações de malvariço,

malva do reino e hortelã da folha grande. Na literatura cientifica é referida pelo nome

botânico de Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng..

P. amboinicus é uma erva perene, tortuosa, piloso-tormentosa e suculenta que pode

atingir 50 cm de altura com folhas oval-deltoides, crenadas de ápice agudo e quebradiço

9


ao ser dobrado. As folhas são muito aromáticas e carnudas e se dispõem em pares

opostos, duas a duas. No Nordeste não produz flores, a não ser em regiões serranas que

apresentem climas mais amenos. É uma erva nativa da Índia, sendo encontrada em toda

América tropical, desde as Antilhas até o sul do Brasil, onde são cultivadas em

pequenos canteiros e jardins para fins medicinais e muitas vezes para como condimento

em culinária. Apresenta ação antibacteriana e expectorante e são facilmente

multiplicadas por estaquia.

P. amboinicus difere basicamente de Plectranthus barbatus Andr. por possuir

folhas duras e quebradiças e sem sabor amargo. (MATOS, 1994)

2.5 - Considerações Botânicas sobre Plectranthus ornatus.

No Brasil esta espécie é popularmente conhecida pelos nomes populares boldo-

gambá, boldo-pequeno ou boldo-miúdo e novalgina e cientificamente é designado como

Plectranthus ornatus Codd.. As vezes é confundida com Plectranthus neochilus Schld

espécie muito semelhante morfologicamente.

Plectranthus ornatus, originário do oeste da Índia, porém encontra-se amplamente

distribuída em todo mundo. Apresenta folhas pequenas, aromática, suculentas e

deltoides que a diferencia das outras três, porém bastante semelhante com as folhas de

P. neochilus. O caule por sua vez é fino herbáceo, no qual se observa a presença de

raízes adventícias. Cresce amplamente na forma de pequenas ervas esparramada em

canteiros, tornando-se bastante perenes nos habitat naturais. Sua flor se expõe na

coloração azul em forma de espigão com um intenso odor, porém sua florescência

somente ocorre em regiões de clima serrano (ALBUQUERQUE, 2004).

10

3 – LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO

CAPÍTULO 3

DITERPENOS ABIETANOS DE LABIATAE NOS ÚLTIMOS 40 ANOS (revisão bibliográfica)

Os diterpenos são metabólitos secundários formados via mevalonato, em que o

mevalonato é formado da condensação de uma unidade da acetoacetil- CoA com uma

molécula da acetil-CoA. Após a condensação aldólica, ocorre uma hidrólise originando

a 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA, que é reduzida a mevalonato numa reação irreversível.

O mevalonato é então convertido em isopentenil-pirofosfato (IPP), ou isopreno ativo, a

unidade básica na formação dos terpenos e esteroides. A polimerização do mevalonato

origina moléculas de cadeias crescentes de cinco em cinco átomos de carbono. A

molécula de isopentenil-pirofosfato e seu isômero dimetilalil-pirofosfato (DMAPP)

formam trans-geranil-pirofosfato (GPP), a partir do qual se formam os demais terpenos

(Esquema 1). Novas ligações cabeça-cauda entre o trans-geranil-pirofosfato e o

isopentenil-pirofosfato resultarão em sesquiterpeno (C15) e diterpenos (C20). (Simões,

2001).

Esquema 1 - Esquema biossintético via mevalonato de terpenoides (SIMÕES, 2001)

S

C o A

O O

S

C o A

O

C o A -S H

O O

O S C o A

O O

O H

3 - h i d r ó x i -3 -m e t i l -g l u t a r il C o A

O HO H

O P P

m e v a l o n a t o

g e ra n i l p i ro f o s fa t o ( G P P )

M O N O T E R P E N O S ( C 1 0 )

O P P

f a r n e s i l p i ro f o s f a t o ( F P P )

S E S Q U I T E R P E N O S ( C 1 5 )

O P P

g e r a n i l g e ra n i l - p ir o fo s fa t o (G G P P )

D IT E R P E N O S (C 2 0 )

E S T E R Ó I D E S ( C 2 7 ) T R I T E R P E N O S ( C 3 0 )

11


A partir do pirofosfato de geranil-geranila, a enzima abietadieno sintase catalisa

a formação de abieta-7,13-dieno (Esquema 2) por uma série de etapas de ciclização,

iniciada por uma ciclização próton-induzida e concluída pela saída do difosfato

(MACMILLAN, 1999).

Esquema 2 - Semi-rota biossintética para formação do esqueleto abieta-7,13-dieno (MACMILLAN, 1999).

A presença dos diterpenos abietanos é frequentemente detectada em espécies da

família Labiatae. A pesquisa bibliográfica realizada nos últimos quarenta anos (1972 a

2013) com as palavras-chave “abietane” e “Labiatae” indicou 110 e 175 registros,

utilizando o software de busca SciFinder® e www.scopus.com, respectivamente. Todas

as referências foram relatadas na forma de artigos publicados em jornais e revistas, e

nenhuma patente foi encontrada. Observou-se uma modesta evolução no número de

publicações (Gráfico 1), com um incremento no ano de 2010, mas com resultados bem

expressivos com relação ao teor das publicações que relatam diversas atividades

biológicas para as substâncias relatadas.

Gráfico 1 - Evolução dos relatos científicos para diterpenos abietanos de Labiatae

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

19

72

19

77

19

87

19

90

19

91

19

93

19

94

19

96

19

97

19

98

19

99

20

00

20

01

20

02

20

03

20

04

20

05

20

06

20

07

20

08

20

09

20

10

20

11

20

12

20

13

12


A Tabela 1 contém os dados encontrados na pesquisa bibliográfica. Eles foram

dispostos por ordem alfabética da espécie, seguido pelo nome dos compostos encontrados

para cada planta, o órgão vegetal utilizado no estudo, a atividade farmacológica relatada e

a referência bibliográfica.

Tabela 1 - Diterpenos abietanos - perfil químico-farmacológico de Labiatae

Planta Compostos isolados Fonte Atividade Referência Ajuga decumbens Ajudecumina A (1) Partes aéreas Citotóxica WANG et al, 2012

Ajudecumina B (2) Partes aéreas Citotóxica WANG et al, 2012

Ajudecumina C (3) Partes aéreas Citotóxica WANG et al, 2012

Ajudecumina D (4) Partes aéreas Citotóxica WANG et al, 2012

Ajuforrestina A (5) Partes aéreas Citotóxica WANG et al, 2012

Ajuforrestina B (6) Partes aéreas Citotóxica WANG et al, 2012

Coleus

xanthanthus

11-16-Diacetoxi-coleon U (9)

Partes aéreas - MEI et al, 2002

11-Acetoxi-coleon U (10) Partes aéreas Citotóxica MEI et al, 2002

16-O-acetil coleon C (7) Partes aéreas - MEI et al, 2002

8a,9a-Epoxicoleon U-quinona (8)

Partes aéreas Citotóxica MEI et al, 2002

Coleon U (11) Partes aéreas - MEI et al, 2002

Oxo-coleon U (12) Partes aéreas Citotóxica MEI et al, 2002

Xantatusina E (13) Partes aéreas Citotóxica MEI et al, 2002

Xantatusina F (14) Partes aéreas - MEI et al, 2002

Xantatusina G (15) Partes aéreas - MEI et al, 2002

Xantatusina H (16) Partes aéreas Citotóxica MEI et al, 2002

Xantatusina I (17) Partes aéreas - MEI et al, 2002

Xantatusina J (18) Partes aéreas - MEI et al, 2002

Xantatusina K (19) Partes aéreas - MEI et al, 2002

Dracocephalum

komarovi

Dracocephalona A (20) Planta inteira Tripanomicida UCHIYAMA et al, 2003

Fuerstia africana Ferruginol (21) Partes aéreas Antimalárica e Citotóxica

KOCH et al, 2006

Hyptis carvalhoi 7α-Etoxi-rosmanol (22) Partes aéreas - LIMA et al, 2012

7α-Metoxi-rosmanol (23) Partes aéreas - LIMA et al, 2012

Galdosol (24) Partes aéreas - LIMA et al, 2012

Hyptis martiusii 7α-Acetoxi-12-hidroxi-11,14-dioxoabieta-8,12-dieno (25)

Raízes Genotóxica CAVALCANTI et al, 2008

7β-Hidroxi-11,14-dioxoabieta-8, 13-dieno (26)

Raízes Genotóxica CAVALCANTI et al, 2008

Hyptis suaveolens Deidro-abietinol (27) Partes aéreas Antimalárica ZIEGLER et al, 2002

Hyssopus

cuspidatus

19,20-Epoxi-12,19-dimetoxi-11,14,diidroxi-7-oxo-8,11,13-abietatrieno (28)

Planta inteira - FURUKAWA et al, 2011

19,20-Epoxi-12,metoxi-11,14,19-triidroxi-7-oxo-8,11,13-abietatrieno (29)

Planta inteira Citotóxica FURUKAWA et al, 2011

19,20-epoxi-12-metoxi-11,14,19-triidroxi-7-oxo-8,11,13-abietatrieno (30)

Planta inteira Antialérgica FURUKAWA et al, 2011

13


Tabela 1 – Diterpenos abietanos - perfil químico-farmacológico de Labiatae – cont.

Hyssopus

cuspidatus

19,20-Epoxi- 11, 14-diidroxi-12, 20-dimetoxi-7-oxo-8, 11, 13-abietatrieno (31)

Planta inteira Antialérgica FURUKAWA et al, 2011

19,20-Epoxi- 11, 14-diidroxi-12-metoxi-7-20-dioxo-8, 11, 13-abietatrieno (32)

Planta inteira Citotóxica FURUKAWA et al, 2011

Isodon inflexus 3α,6β-Diidroxi-7,17-dioxo-ent-abieta-15(16)-eno (34)

Partes aéreas Antiinflamatória LEE et al, 2008

Isodon

lophanthoides

var. graciliflorus

15-hidroxi-1-oxosalvibretol (35)

Partes aéreas Citotóxica ZHOU et al, 2013

15-hidroxi-20-Desoxi-carnosol (36)


15-O-Metilgraciliflorina F (37)

Partes aéreas - ZHOU et al, 2013

16-Acetoxil-sugiol (38) Partes aéreas Citotóxica ZHOU et al, 2013

3α-Hinokiol (39) Partes aéreas Citotóxica ZHOU et al, 2013

3β-Hidroxi-sempervirol (40)


6,12,15-Triidroxi-5,8,11,13-abietatetraen-7-ona (41)


Abieta-8,11,13-trieno-14,19-diol (42)


Graciliflorina E (43) Partes aéreas Citotóxica ZHOU et al, 2013

Graciliflorina F(44) Partes aéreas - ZHOU et al, 2013

Isodon

lophanthoids var.

micranthus

16-acetoxi-7-α-hidroxi-royleanona (33)

Não informado

- ZHOU et al, 2013

16- Acetoxi-7 α-metoxi-royleanona (45)

Não informado

- ZHOU et al, 2013

Hiptol (46) Não informado

- ZHOU et al, 2013

Micranthina C (47) Não informado

- ZHOU et al, 2013

Isodon rubescens Hebeiabinina A (48) Folhas Citotóxica HUANG et al, 2007

Hebeiabinina B (49) Folhas - HUANG et al, 2007

Hebeiabinina C (50) Folhas - HUANG et al, 2007

Hebeiabinina D (51) Folhas Citotóxica HUANG et al, 2007

Hebeiabinina E (52) Folhas Citotóxica HUANG et al, 2007

Rubescensina I (53) Folhas - HUANG et al, 2007

Rubescensina J (54) Folhas - HUANG et al, 2007

Rubescensina P (55) Folhas - HUANG et al, 2007

Isodon xerophilus Xeropilusins R (56) Folhas -

Xeropilusins S (57) Folhas - NIU, 2004

Leucas cephalotes Leucastrina C (58) Planta inteira - MYIAICHI, 2006

Lycopus

europaeus

Euroabienol (59) Frutos Antibacteriana, antifúngica

RADULOVIC, 2010

Meriandra

benghalensis

Cryptotanshinona (60) Não informado

- RODRÍGUEZ, 2003

17-Hidroxi-cryptotanshinona (61)

Não informado

- RODRÍGUEZ, 2003

14



Peltodon longipes 12-Hidroxi-11-metoxiabieta-8,11,13-trien-7-ona (62)

Raízes Citotóxica FRONZA et al, 2011

7α-Acetoxi-royleanona (63)


7α-Etoxi-royleanona (64) Raízes Citotóxica FRONZA et al, 2011

7α-Hidroxi-royleanona (65)


7-Oxo-royleanona (66) Raízes Citotóxica FRONZA et al, 2011

Cryptojaponol (67) Raízes Citotóxica FRONZA et al, 2011

Deoxi-neocriptotanshinona (69)


Iguestol (70) Raízes Citotóxica FRONZA et al, 2011

Inuroileanol (71) Raízes Citotóxica FRONZA et al, 2011

Ortosifonol (72) Raízes Citotóxica FRONZA et al, 2011

Royleanona (73) Raízes Citotóxica FRONZA et al, 2011

Sugiol (74) Raízes Citotóxica FRONZA et al, 2011

Perovskia

abrotanoides

7-Epi-7-O-metilrosmanol (75)

Partes aéreas Citotóxica AOYAGI et al, 2006

7-O-Metil-rosmanol (76) Partes aéreas Citotóxica AOYAGI et al, 2006

Ácido 11-O-acetil-carnósico (77)


Ácido 12-O-metil-carnosico (78)


Ácido carnósico (79) Partes aéreas Citotóxica AOYAGI et al, 2006

Carnosol (80) Partes aéreas Citotóxica AOYAGI et al, 2006

Isorosmanol (81) Partes aéreas Citotóxica AOYAGI et al, 2006

Rosmanol (82) Partes aéreas Citotóxica AOYAGI et al, 2006

Perovskia

scrophularifolia


Partes aéreas - TAKEDA et al, 2007

Carnosol (80) Partes aéreas - TAKEDA et al, 2007

Epirosmanol (83) Partes aéreas -

Rosmanol (82) Partes aéreas - TAKEDA et al, 2007

Plectranthus aff.

puberulentus

Coleon A (84) Folhas Inseticida, bactericida

WELLSOW et al, 2006

Coleon B (85) Folhas Inseticida, bactericida

WELLSOW et al, 2006

Plectranthus

barbatus

Coleon O (68) Folhas ALASBAHI et al, 2010

(+)-Allil-roileanona (86) Folhas ALASBAHI et al, 2010

11-Hidroxi-sugiol (87) Raízes ALASBAHI et al, 2010

14-Deoxi-coleon U (88) Raízes ALASBAHI et al, 2010

20-Desoxi-carnosol (185) Ramos ALASBAHI et al, 2010

3β-Hidroxi-3-deoxibarbatusina (89)

Folhas ALASBAHI et al, 2010

6,7-Secoabietano I (90) Ramos ALASBAHI et al, 2010

6,7-Secoabietano II (91) Ramos ALASBAHI et al, 2010

6β-Hidroxi-carnosol (92) Ramos ALASBAHI et al, 2010

15



Plectranthus

barbatus

7β-Acetil-12-deacetoxi-ciclobutatusina (93)

Folhas - ALASBAHI et al, 2010; ALBUQUERQUE, 2007

Abietatrieno (94) Raízes - ALASBAHI et al, 2010

Barbatusina (95) Folhas Citotóxica ALASBAHI et al, 2010; ALBUQUERQUE, 2007

Barbatusol (96) Ramos Anti-hipertensiva ALASBAHI et al, 2010

Cariocal (97) Ramos - ALASBAHI et al, 2010

Ciclobutatusina (98) Folhas - ALASBAHI et al, 2010; ALBUQUERQUE, 2007

Coleon C (99) Planta inteira Citotóxica ALASBAHI et al, 2010

Coleon E (100) Folhas Antiacetilcolines-terásica

FALÉ et al, 2011

Coleon F (101) Folhas - ALASBAHI et al, 2010

Coleon S (102) Folhas - ALASBAHI et al, 2010

Coleon T (103) Folhas - ALASBAHI et al, 2010

Ferruginol (21) Hastes - ALASBAHI et al, 2010

Plectrina (104) Folhas Antialimentar para insetos

ALASBAHI et al, 2010

Plectrinon a (105) Folhas Gastroprotetora ALASBAHI et al, 2010

Plectrinona B(106) Folhas - ALASBAHI et al, 2010

Plectrinone A Folhas Gastroprotetora SCHULTZ et al, 2007

Sugiol (74) Planta inteira - ALASBAHI et al, 2010

Plectranthus

bishopianus

6,7-Deidro-royleanona (107)

Partes aéreas - SYAMASUNDAR et al, 2012

6β,7α-Diidroxi-royleanona (108)


6β-Didroxi-7α-metoxi-royleanona (109)


Plectranthus

elegans

11-hidroxi-12-oxo-7,9(11),13-abietatrieno (110)

Partes aéreas Antibacteriana DELLAR et al, 1996

7,11-diidroxi-12-metoxi-8,11,13-abietatrieno (111)

Partes aéreas Antibacteriana DELLAR et al, 1996

Plectranthus

grandidentatus

14-O-Acetil-coleon U

(112) Partes aéreas - RIJO et al, 2007

Plectranthus

ornatus

Sugiol (74) Partes aéreas - RIJO et al, 2011

Plectranthus

porcatus

(13S,15S)-6b,7ª,12ª,19-tetraidroxi-13b,16-ciclo-8-abieteno-11,14-diona (113)

Partes aéreas Antibacteriana

SIMÕES et al, 2010

16



Plectranthus

puberulentus

Coleon A lactona (114) Folhas Inseticida, bactericida

WELLSOW et al, 2006

Oxo-coleon U (12) Folhas Inseticida, bactericida

WELLSOW et al, 2006

Coleon U (11) Folhas Inseticida, bactericida, fungicida

WELLSOW et al, 2006

Rosmarinus

officinalis

7-O-Metil-rosmanol (76) Planta inteira Antioxidante MASUDA et al, 2002


Folhas Antioxidante DEL BAÑO et al, 2003

Ácido carnósico (79) Planta inteira Antioxidante, Citotóxica

Hipolipemiante Antiinflamatória

MUNNÉ-BOSCH et al, 2003; HUANG, et al 2005; POECKEL et al, 2008; IBARRA et al, 2011, MASUDA et al, 2002

Ácido dioxo-carnósico (115)

Planta inteira Antioxidante MASUDA et al, 2002

Carnosico 8-lactona (116) Planta inteira Antioxidante MASUDA et al, 2002

Carnosol (80) Folhas Citotóxica; Antioxidante,

Antiinflamatória

HUANG et al, 2005; DEL BAÑO et al, 2003; POECKEL et al, 2008;

Rosmanol (82) Planta inteira Antioxidante MASUDA et al, 2002

Seco-hinokiol (117) Folhas - CANTRELL et al, 2005

Salvia aegyptiaca 6-Metilcriptotanshinona (121)

Planta inteira - YOUSUF et al, 2002

Salvia africana-

lutea

Ácido carnósico (79) Partes aéreas Antimicobacteriano, Citotóxica

HUSSEIN et al, 2007

Carnosol (80) Partes aéreas - HUSSEIN et al, 2007

Rosmadial (122) Partes aéreas - HUSSEIN et al, 2007

Salvia

anastomosans

6-Epidemetil-esquirolina D (123)

Raízes - ESQUIVEL et al, 2005

Arucadiol (124) Raízes - ESQUIVEL et al, 2005

Cariocal (97) Raízes - ESQUIVEL et al, 2005

Deacetilnemorona (125) Raízes - ESQUIVEL et al, 2005

Deacetoxi-nemorona (126)

Raízes - ESQUIVEL et al, 2005

Royleanona (73) Raízes - ESQUIVEL et al, 2005

Salvia barrelieri 7a-Acetoxi-royleanone-12-metil eter (127)

Raízes Antioxidante KABOUCHE et al, 2007

7-epi-Salviviridinol (128) Raízes Antioxidante KOLAK et al, 2009

7-O-Acetil-horminona (129)


7-Oxoroyleanona-12-metil eter (130)


Barreliol (131) Raízes Antioxidante KOLAK et al, 2009

17



Salvia barrelieri Cryptojaponol (67) Raízes Antioxidante KABOUCHE et al, 2007

Demetil-inuroileanol (132)

Raízes Antioxidante KOLAK et al, 2009

Ferruginol (21) Raízes Antioxidante KOLAK et al, 2009

Horminona (133) Raízes Antioxidante KABOUCHE et al, 2007

Iguestol (70) Raízes Antioxidante KOLAK et al, 2009

Inuroyleanol (134) Raízes Antioxidante KABOUCHE et al, 2007

Royleanona (73) Raízes Antioxidante KABOUCHE et al, 2007

Royleanona-12-metil eter (135)

Raízes Antioxidante KOLAK et al, 2009

Taxodiona (136) Raízes Antioxidante KOLAK et al, 2009

Viridona (137) Raízes Antioxidante KOLAK et al, 2009

Salvia castanea Castanol A (138) Planta inteira Citotóxica PAN et al, 2012

Castanol B (139) Planta inteira Citotóxica PAN et al, 2012

Castanol C (140) Planta inteira Citotóxica PAN et al, 2012

Castanolideo (141) Planta inteira - PAN et al, 2012

Cryptotanshinona (60) Planta inteira Citotóxica PAN et al, 2012

Danshenspirocetallactona (142)

Planta inteira Citotóxica PAN et al, 2012

Diidro-tanshinona I (118) Planta inteira Citotóxica PAN et al, 2012

epi-Castanolideo (143) Planta inteira - PAN et al, 2012

epi-Danshenspirocetallactona (144)


Ferruginol (21) Planta inteira Citotóxica PAN et al, 2012

Metil-enetanshinquinona (145)


Metileno diidrotanshinquinona (146)


Metil-tanshinoato (147) Planta inteira Citotóxica PAN et al, 2012

Neo-tanshinlactona (148) Planta inteira Citotóxica PAN et al, 2012

Przewalskina (149) Planta inteira Citotóxica PAN et al, 2012

Salvicanol (150) Planta inteira Citotóxica PAN et al, 2012

Tanshinona I (151) Planta inteira Citotóxica PAN et al, 2012

Tanshinone IIA (152) Planta inteira Citotóxica PAN et al, 2012

Tanshinone IIB (153) Planta inteira Citotóxica PAN et al, 2012

Salvia chionantha 7-O-Acetil-horminona (154)

Partes aéreas - OZTEKIN et al, 2010

Horminona (133) Partes aéreas - OZTEKIN et al, 2010

Salvia deserta 7-O-Acetil-horminona (154)

Raízes - TEZUKA et al, 1998

Deidro-royleanona (156) Raízes - TEZUKA et al, 1998

Ferruginol (21) Raízes - TEZUKA et al, 1998

Horminona (133) Raízes - TEZUKA et al, 1998

Metil-horminona (157) Raízes - TEZUKA, 1998

Royleanona (73) Raízes - TEZUKA, 1998

Taxodiona (136) Raízes - TEZUKA, 1998

Salvia

digitaloides

Salviatalin A (158) Raízes Antiinflamatória WU et al, 2010

Salvitrijudin A (159) Raízes Antiinflamatória WU et al, 2010

18



Salvia dorrii 7α-Metoxi-rosmanol (23) Partes aéreas - AHMED et al, 2006

7β-Metoxi-rosmanol (160) Partes aéreas - AHMED et al, 2006

Salvidorol (161) Partes aéreas - AHMED et al, 2006

Salvia eriophora 12-Hidroxisapriparaquinona (162)

Raízes - ULUBELEN et al, 2002

3,12-Diidroxisapriparaquinona-1-eno (163)

Raízes - ULUBELEN et al, 2002

4,12-Diidroxisapriparaquinona (164)

Raízes Cardioprotetora ULUBELEN et al, 2002

4,14-Diidroxisapriortoquinona (165)


6,7-Deidro-royleanona (107)


Aethiopinona (166) Raízes Cardioprotetora ULUBELEN et al, 2002

Ferruginol (21) Raízes Cardioprotetora ULUBELEN et al, 2002

Salvilimbinol (167) Raízes - ULUBELEN et al, 2002

Salvipisona (168) Raízes - ULUBELEN et al, 2002

Salvia hydrangea 6,7-Deidro-royleanona (107)

Raízes - SAIRAFIANPOUR et al, 2003

7α-Acetoxi-royleanona (63)


7,8-Dimetil-2-(1-metiletil) fenantren-3-ol (169)


9,10-Diidro-7,8-dimetil-2-(1-metiletil) fenantren-3-ol (170)


Salvia hypargeia 14-Deoxi-coleon U (88) Raízes Citotóxica TOPCU et al, 2008

Ácido salvicanarico (171) Raízes - TOPCU et al, 2008

Dideidro-7-hidroxitaxodona (172)

Raízes - TOPCU et al, 2008

Salvia

kronenburgii

7-O-Acetil-horminona (154)

Partes aéreas - OZTEKIN et al, 2010

Horminona (133) Partes aéreas - OZTEKIN et al, 2010

Salvia

milthiorriza

Cryptotanshinona (60) Raízes, Rizoma

Hipolipemiante, Citotóxica,

Antiosteoporose, Antialérgica, Antidiabética,

Hepatoprotetora, Antiamnésica,

Citotóxica,

JANG et al, 2012; TRINH et al, 2010; JUNG et al, 2009; MANOLESCU et al, 2009; PARK et al, 2007; KIM et al, 2007;LEE et al, 2005

Ferruginol (21) Raízes - LEE et al, 2005

Tanshinona IIA (152) Raízes Citotóxica, Antialérgica,

Cardioprotetora, Neuroprotetora, Antioxidante,

Hepatoprotetora

FRONZA et al, 2011; TRINH et al, 2010; ZHU et al, 2010; WANG et al, 2005; LEE et al, 2005; CHOI, 2004; LAM, 2003


19


Salvia

milthiorriza

Isocriptotanshinona (119) Raízes Inibidor de PTP1B (Antidiabética tipo

2)

HAN et al, 2005

Isotanshinona (120) Raízes Inibidor de PTP1B (Antidiabética tipo

2)

HAN et al, 2005

1,2-Diidro-tanshinona (173)


15, 16- Diidrotanshinona I (174)

Raízes Antidiabética, Antiamnésica, Antialérgica,

Antiosteoporose, Antioxidante,

Vasorrelaxante, Hipolipemiante,

Citotóxica

JANG et al, 2012;TRINH et al, 2010; JUNG et al, 2009; LAM et al, 2008; KIM et al, 2007; LEE et al, 2005, CHOI et al, 2004

1-Oxo-miltirona (175) Raízes Citotóxica FRONZA et al, 2011

Cripto-tanshinona (176) Raízes Citotóxica, Cardioprotetoraa,

Antioxidante

FRONZA et al, 2011; WANG et al, 2005; CHOI et al, 2004

Danshenspirocetallactona (177)

Raízes Hipolipemiante, Citotóxica

JANG et al, 2012

Diidro-isotanshinona I (118)

Raízes Inibidor de PTP1B

(Antidiabética tipo 2), Citotóxica

MANOLESCU et al, 2009; HAN et al, 2005

Miltiodiol (178)


Miltirona (179) Raízes Citotóxica FRONZA et al, 2011

Sibiriquinona A (180) Raízes Citotóxica MANOLESCU et al, 2009

Sibiriquinona B (181) Raízes Citotóxica MANOLESCU et al, 2009

Tanshinona I (151) Raízes Hipolipemiante, Citotóxica,

Antialérgica, Cardioprotetora, Antidiabética,

Antiosteoporose, Antioxidante,

Hepatoprotetora; Antiamnésica

JANG et al, 2012; FRONZA et al, 2011; TRINH et al, 2010; PARK et al, JUNG et al, 2009; KIM et al, 2007; WANG et al, 2005; LEE et al, 2005; CHOI et al, 2004

TanshinonaVI (182) Raízes Cardioprotetora ARINO et al, 2008

Salvia montbretii 14-Deoxi-coleon U (88) Não informado

- RODRÍGUEZ, 2003

Salvia nipponica

var. formosana

Taxodiona (136) Raízes e folhas

Anticolinesterá-sica

CHAN et al, 2011

Salvia officinalis 7-O-Metil-rosmanol (76) Planta inteira Antioxidante MASUDA et al, 2002


Hastes e folhas

Antidiabética CHRISTENSEN et al, 2010

Ácido 12-O-metil-carnosico-epirosmanol ester (183)

Hastes e folhas

- CHRISTENSEN et al, 2010

20



Ácido carnósico (79) Planta inteira Antioxidante, Hipolipemiante

CHRISTENSEN et al, 2010; NINOMIYA et al, 2004; MUNNÉ-BOSCH et al, 2003

Ácido dioxo-carnósico (115)

Planta inteira Antioxidante MASUDA et al, 2002

Carnosico8-lactona (116) Planta inteira Antioxidante MASUDA et al, 2002

Rosmanol (82) Planta inteira Antioxidante MASUDA et al, 2002

11,12,20-Triidroxi-abieta-8,11,13-trieno (184)

Hastes e folhas


20-Desoxi-carnosol (185) Hastes e folhas


20-HidroxiFerruginol (186)

Hastes e folhas


Carnosol (80) Hastes e folhas


Salvia phlomoides 14-Deoxi-coleon U (88) Não informado

- RODRÍGUEZ, 2003

Cryptojaponol (67) Não informado

- RODRÍGUEZ, 2003

Royleanona (73) Não informado

- RODRÍGUEZ, 2003

Sugiol (74) Não informado

- RODRÍGUEZ, 2003

Taxodiona (136) Não informado

- RODRÍGUEZ, 2003

Taxodona (187) Não informado

- RODRÍGUEZ, 2003

Salvia prionitis Bisprioterona A (188) Raízes - XU et al, 2006

Bisprioterona B (189 Raízes - XU et l, 2006

Bisprioterona C (190) Raízes - XU et al, 2006

Prionoid A (191 Raízes - CHANG et al, 2005

Prionoid B (192) Raízes - CHANG et al, 2005

Prionoid C (193) Raízes - CHANG et al, 2005

Prionoid D (194) Raízes Citotóxica CHANG et al, 2005

Prionoid E (195) Raízes Citotóxica CHANG et al, 2005

Prionoid F (196) Raízes - CHANG et al, 2005

Salvia sahendica Ferruginol (21) Raízes Citotóxica FRONZA et al, 2011

Sahandinona (197) Raízes Citotóxica FRONZA et al, 2011

Salvia sclarea 1-Oxoaethiopinona (198) Raízes Antibiótica KUZMA et al, 2007

Aethiopinona (199) Raízes Antibiótica KUZMA et al, 2007

Ferruginol (21) Raízes Antibiótica KUZMA et al, 2007

Salvipisona (168) Raízes Antibiótica KUZMA et al, 2007

Salvia semiatrata 20-Nor-inuroyleanol (200) Raízes - ESQUIVEL et al, 2005

Horminona (133) Raízes - ESQUIVEL et al, 2005

Salvifolanona (201) Raízes Citotóxica ESQUIVEL et al, 2005

Salvia silicia 12-Deoxi-royleanona (202)

Raízes Leishmanicida TAN et al, 2002

Ferruginol (21) Raízes Leishmanicida TAN et al, 2002

21



Salvia silicia Cryptanol (204) Raízes - TAN et al, 2002

7-Hidroxi-12-metoxi-20-nor-abieta-1,5(10),7,9,12-pentaen-6,14-diona (203)

Raízes - TAN et al, 2002

Inuroyleanol (134) Raízes - TAN et al, 2002

Salvia

yunnanensis

Salviamine A (205) Raízes - LIN et al, 2006

Salviamine B (206) Raízes - LIN et al, 2006

Salviamine C (207) Raízes - LIN et al, 2006

Salviamine D (208) Raízes - LIN et al, 2006

Sideritis

canariensis

Deidro-abietano (209) - - GIANNONI et al, 2010

Sideritis discolor Deidro-abietano (209) - - GIANNONI et al, 2010

Sideritis lotsyi Deidro-abietano (209) - - GIANNONIet al, 2010

Sideritis

massoniana

Deidro-abietano (209) - - GIANNONI et al, 2010

Sideritis soluta Deidro-abietano (209) - - GIANNONI et al, 2010

Teucrium

fruticans

Teuvincenona E (210) Raízes - RODRÍGUEZ, 2002;CUADRADO et al, 1992

Teuvincenona F (211) Raízes - CUADRADO et al, 1992

Teuvincenona G (212) Raízes - CUADRADO et al, 1992

Teucrium

lanigerum

Teuvincenona A (213) Raizes - RODRÍGUEZ et al, 2009

Teucrium

lanigerum

Teuvincenona B (214) Raízes - RODRÍGUEZ et al, 2009

Teuvincenona C (215) Raízes - RODRÍGUEZ et al, 2009

Teuvincenona D (216) Raízes - RODRÍGUEZ et al, 2009

Teuvincenona J (217) Raízes - RODRÍGUEZ et al, 2009

Teucrium polium 12,16-Epoxi-6,11,14,15-tetraidroxi-17(15→16)-abeo-3a,18-ciclo-5,8,11,13-abietatetraen-7-ona (218)

Raízes Antioxidante FIORENTINO et al, 2010

12,16-Epoxi-6,11,14,15-tetraidroxi-17(15→16)-abeo-5,8,11,13-abietatetraen-7-ona (219)


12,16-Epoxi-6,11,14,17-tetraidroxi-17(15→16)-abeo-3a,18-ciclo-5,8,11,13,15-abietapentaen-7-ona (220)


12,16-epoxi-6,11,14,17-tetraidroxi-17(15→16)-abeo-5,8,11,13,15-abietapentaen-7-ona (221)


12,16-epoxi-6,11,14-triidroxi-17(15→16)-abeo-3a,18-ciclo-5,8,11,13,15-abietapentaen-7-ona (222)


22



Teucrium polium 12,16-Epoxi-6,11,14-triidroxi-17(15→16)-abeo-5,8,11,13,15-abietapentaen-7-ona (223)


Deidro-hidroxi-teuvincenona A (224)


Diidro-hidroxi-teuvincenona J (225)


Teuvincenona A (213) Raízes Antioxidante FIORENTINO et al, 2010

Teuvincenona B (214) Raízes Antioxidante FIORENTINO et al, 2010

Teuvincenona C (215) Raízes Antioxidante FIORENTINO et al, 2010

Teuvincenona D (216) Raízes Antioxidante FIORENTINO et al, 2010

Villosin C (226) Raízes Antioxidante FIORENTINO et al, 2010

Teuvincenona A 11,14-diona (227)

Raízes - RODRÍGUEZ, 2002

Teuvincenona D (216) Raízes - RODRÍGUEZ, 2002

Teucrium polium

subsp. expansum

Ferruginol (21) Raízes - CUADRADO et al, 1992

Teuvincenona A (213) Raízes - CUADRADO et al, 1992

Teuvincenona B (214) Raízes - CUADRADO et al, 1992

Teuvincenona H (228) Raízes - CUADRADO et al, 1992

Teuvincenona I (229) Raízes - CUADRADO et al, 1992

Teucrium polium

subsp.

uincentinum

Di-deidroxi-dioxo-teuvincenona A (230)

Derivado - CUADRADO et al, 1992

Teuvincenona A (213) Raízes - CUADRADO et al, 1992

Teuvincenona B (214) Raízes - CUADRADO et al, 1992

Os diterpenos abietanos apresentam muitas variações no número de oxigenações

e oxidações dos anéis e também originam outros cinco esqueletos, considerados

abietanos modificados, que se encontram na Figura 5. Nesta pesquisa foram detectadas

230 substâncias estruturalmente diferentes, isoladas de 63 espécies de Labiatae, e a

representação estrutural destas, se encontra na Tabela 2. A maioria, cerca de 50% possui

esqueleto abietano, 16,9% abeo-abietano e 13,9% norabietano. Também foram

encontrados diterpenos classificados como seco-abietanos (9,1%), abeo–norabietanos

(3,9%) e seco-norabietanos (3,5%). Alguns dímeros foram localizados e apresentam

diferentes esqueletos estruturais, dependendo do monômero presente.

23


Figura 5 - Representação estrutural dos esqueletos abietanos

Tabela 2 - Representação estrutural dos diterpenos abietanos identificados em Labiatae nos últimos 40 anos (numeração referente à Tabela 1)

O

O

O

OH

HO

(1)

O

OHC O

OH

HO

(2)

O

O

OH

HO

HO

(3)

OMe

O

OH

HO

(4)

O

OH

HO

O

(5)

O

OH

HO

O

(6) OH

OH

OH

HO

O

OAc

(7)

OH

O

OH

O

O

O

(8)

O

OH

OH

OH

AcO

OAc

(9)

O

OH

OH

OH

AcO

(10)

OH

OH

OH

HO

O

(11)

OH

O

OH

O

O

(12)

24


Tabela 2 - Representação estrutural dos diterpenos abietanos identificados em Labiatae nos últimos 40 anos – cont.

O

O

OH

O

COOH

(13)

O

OH

OH

OH

AcO

AcO OH

(14)

O

OH

OH

OH

AcO

AcO O

(15)

O

OH

O

OH

O

OAc

(16)

O

OH

O

OAc

O

AcO

(17)

O

O

OAc

O

AcO

OH

(18) O

O

OAc

O

OH

(19)

OMe

HO

OH

O

H

O

(20)

H

OH

H

(21)

(22)

HO

OH

H

OH

H

O

O

OMe

(23)

H

O

O

O

HO

OH

(24)

H

O

O

O

HO

OH

(24)

O

O

OAc

H (25)

O

O

OH

H (26)

CH2OHH

(27)

HO

OH

OCH3

O

O

H3CO (28)

HO

OH

OCH3

O

O

HO (29)

HO

OCH3

O

OH

O

HO (30)

HO

OCH3

O

OH

O

H3CO (31)

HO

OH

OCH3

O

O

O (32)

O

O

H

OH

OH CH2OAc

(33)

HO

H

OH

O

H

H

CHO

(34)

O

HO O

OH

(35)

25



HO

OH

OH

O

H (36)

O

OH

OMe

OH

O

O

(37) H

O

OH

O

O

(38)

HO

H (39)

H

OH

(40)

OH

O

OH

OH

(41')

HHO

OH

(42)

O

OH

OCH3

OH (43)

O

OH

OH

OH

O

O

(44)

O

O

H

OMe

OH CH2OAc

(45)

O

OH

HO

O

H (46)

O

H

OH

HOH

O

O

(47)

CHO

CHO

OH

H

OH

O

H

(48)

H

OH

OH

OH

H

HO

HO (49)

OHCH

H

HO

O

(50)

H

H

HO

OH

OH

OH

O

H

OH

OH

OH

O

H

O

OH

(51)

H

H

HO

O

H

OH

OH

OH

O

H

O

OH

O

(52)

HO

HOH

H

OH

OH

(53)

HO

HOH

H

O

(54)

HO

HOH

H

OH

OH

(55)

CHO

OH

O

H

O

O

(56)

CHO

OH

O

H

O

O

CH2OH

(57)

COOHH

H

OH

OH

(58)

HO

OH

CH

OH

OAc

OH3CO

OAc

(59)

26



(60)

(61)

O

OH

O

(62)

O

O

OH

O

O

(63)

O

O

OH

O

(64)

O

O

OH

OH

(65)

O

O

OH

O

(66)

O

O

HO

(67)

O

OH

H

OAc

OH

H

O

(68)

O

OH

OH

O

(69)

HO

O

OH (70)

HO

O

O

OH

(71)

OH

O

O

OH

(72)

O

O

OH

(73)

OH

O

(74)

HO

OH

H

O

O

OMe

(75)

HO

OH

H

O

O

OMe

(76)

AcO

COOH

OH

H (77)

HO

COOH

OMe

(78)

HO

COOH

OH

(79)

HO

OH

H

O

O

(80)

HO

OH

H

O

O

OH (81)

HO

OH

H

O

O

OH

(82)

O

HO

OH

O

OH

(83)

O

CH3

O

O

H3C CH

3

O

OHO

O

H3C CH

3

27



O

H

HO OH

O

OOH

(84)

O

HO

H OH

O

OOH

(85)

O

OH

H

OH

OAc

O

O

(86)

O

HO

OH

(87)

HO

OH

O

OH (88)

O

OAc

H

OH

OAc

O

HO

(89)

O

OHC

OH

OH

H

(90)

O

OHC

OH

OH

H

(91)

OH

H

O

OH

OHO

(92)

HO

OH

H

OAc

OAc

O

O

H

H

(93)

(94)

O

OAc

H

OH

OAc

O

O

(95)

OHHO

H (96)

O

OH

OH

H

O

OH

CHO

OH

(97)

HO

OAc

H

OH

OAc

O

O

H

OH

(98)

HO

OH

O

OH

OH

OH

(99)

O

OH

O

HO

OH

(100)

HO

O

OH

O

(101)

O

OH

H

OH

OH

H

O

OEt

(102)

O

OH

H

OH

OH

H

O

(103)

O

OH

H

OH

OAc

O

O

(104)

HO

OH

OH

O

O

OH

H

(105)

HO

OH

OH

O

O

(106)

H

O

O

OH

(107)

H

O

O

OH

OH

OH

(108)

H

OH

OMe

O

O

OH

(109)

(110)

(111)

CH3

CH3

HO

H3CCH3

OCH

3

CH3

OH

HO

O

CH3

H3C CH

3

28



OH

O

HO

OH

OAc

(112)

O

O

OH

CH2

H

OH

OHHO

H

(113)

O OH

O

OOH

O (114)

COOH

O

O

(115)

O

O

HO

O

(116)

HOOC

H

OH

(117)

O

O

O

(119)

O

O

O

(120)

O

O

O

(121)

CHO

CHO

O

O

OH

(122)

OH

HO

HO

OH

H

O

(123)

OH

HO

O

(124)

OH

O

O

OH

O

H (125)

OH

O

O

O

H (126)

O

O

OCOCH3

OMe

(127)

OCH3

HO

OH

OH (128)

O

O

OCOCH3

OH

(129)

O

O

O

OMe

(130)

O

O

HO

OH

(131)

OH

HO

OH

O

(132)

O

OH

H

OH

O

(133)

(134)

OMe

O

O

(135)

HO

O

H

H

O (136)

CH3

CH3

OH

O

HO

CH3

H3C CH3

O

CH3

29



O

HO

OMe (137)

O

O

O

O

OH

(138)

OH

(139)

OH

OH O

(140)

O

O

O

O

(141)

O

O

O

(142)

O

O

O

O

(143)

O

O

O

(144)

O

O

O

(145)

O

O

O

(146)

O

O

O

H3COOC (147)

O

O

O

(148)

O

OH

(149)

HO OMe

H (150)

O

O

O

(151)

O

O

O

(152)

(153)

O

OH

H

OCOCH3

O

(154)

O

OH

H

OH

O

(155)

O

O

OH

H (156)

O

OH

H

OMe

O

(157) H

O

O

O

(158)

H

O

O

O

H

(159)

HO

OH

H

OH

H

O

O

OMe

(160)

O

CH3

O

O

H3C CH

3

30



O

OHC

OH

HOH

(161)

O

O

OH

(162)

O

O

OH

HO

(163)

O

OH

OH

O

(164)

OH

O

OH

O

(165)

O

O

(166)

HO

OH

O

OH

HO

(167)

O

OH

(168)

OH

(169)

OH

(170)

O OH

HOOC

OH (171)

OH

HO

OH

O

(172)

O

O

O

(173)

O

O

O

(174)

O

O

O

(175)

O

O

O

(176)

O

O

O

(177)

OH

HO

O

(178)

O

O

(179)

O

O

(180)

O

O

(181)

O

O

CH2OH

OH

(182)

H

HO

OMe

O

O

H

O

HO

OH

O

(183)

OH

HO

HO

(184)

31



HO

OH

H

O

(185)

OH

HO

(186)

HOHH

HO

O

(187)

O

OH

H

H

H

HO

O

(188

O

H

H

H

O

OH

OH

(189) O

O

O

O

O

HO

(190)

HO

OH

O

H

O

(191)

O

OH

O

(192)

O

OHO

(193)

O

O

O

OH

(194)

O

O

O

OH

(195

O

OH

OH

OH

O

(196)

O

O

(197)

O

O

O

(198)

O

O

(199)

H

OH

O

OMe

OH

HO

(200)

O

OH

O

O

OMe

(201)

O

O

(202)

O

O

OMe

O

OH

(203)

HO

OH

H

OH

(204)

N

O

O

(205)

N

O

OH

O

(206)

N

O

OH

O

(207)

N

O

OH

O

H3COOC

(208)

32



(209)

O

OH

HO

O

H

O

(210)

O

OH

HO

O

O

(211)

O

OH

HO

O

O

H (212)

O

OH

HO

O

O

OH

H

(213)

O

OH

HO

O

OH

H

(214)

O

OH

HO

O

OH

H

(215)

O

OH

HO

O

H

H (216)

H

O

OH

HO

O

(217)

O

O

OH

OH

HO OH

(218)

O

O

OH

OH

HO OH

(219)

HO

O

OH

OH

O

OH

(220)

HO

O

OH

OH

O

OH

(221)

HO

O

OH

OH

O

(222)

HO

O

OH

OH

O

(223)

O

O

OH

HO OH

O

OH (224)

O

O

OH

HO OH

(225)

O

O

OH

OH

HO OH

OH

(226)

O

O

O O

OH

O

(227)

O

OH

HO

O

O

OH (228)

O

O

O

O

O

OH (229)

O

O

O

O

O

OH (230)

33

Apesar da ocorrência dos

230 diterpenos abietanos em 63

espécies de Labiatae, algumas

destas espécies foram mais

frequentemente produtoras desta

classe de substância, como

mostra a Figura 5, onde se

observa a predominância

absoluta do gênero Salvia,

embora a planta com mais

citações seja Plectranthus

barbatus com 26 diferentes

diterpenos abietanos isolados.

A maioria dos compostos isolados foi obtida das raízes das plantas em estudo

(44,1%), embora possam ocorrer em todos os órgãos tais como parte aérea (20,8%),

planta inteira (13,3%), folhas (12,7%) e outros (9,1%).

Cerca de uma dezena de diferentes atividades farmacológicas foram relatadas

para os diterpenos abietanos encontrados nesta pesquisa, sendo que a atividade

citotóxica contra várias linhagens tumorais foi relatada em 85 dos 230 diterpenos e a

segunda atividade mais citada foi antioxidante com 45 registros, corroborando assim,

com o alto potencial farmacológico desta classe de substância, notadamente antitumoral

e antioxidante.

Figura 6 - Espécies de Labiatae produtoras de diterpenos abietanos.

34

4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

CAPÍTULO 4

RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1- Determinação Estrutural

4.1.1--Obtenção e Determinação Estrutural de PGD-1

A substância denominada de PGD-1, obtida da fração diclorometano do

extrato etanoico (Fluxograma 1, página 93), apresentou-se como um sólido cristalino,

incolor, solúvel em clorofórmio e de ponto de fusão 215-216°C e rotação óptica [α]D20 =

104,3 (1 mg/mL, CHCl3).

O espectro de RMN13C BB, (125 MHz, CDCl3) (Figura 10, página 37) de

PGD-1, exibe 24 sinais entre os quais os sinais em δC 214,9; δC

196,0; δC

194,4; δC

170,2; δC 169,8; δC

153,5 e δC

141,2 correspondem, de acordo para a regra do

deslocamento químico descrito na literatura (SILVERSTEIN, 2000), a carbono do tipo

carbonílico cetônico e cetônico conjugado, carbonila de éster e olefínicos. Além destes

sinais, observaram-se os deslocamentos em δC 77,8, δC

70,7 e δC

64,0 correspondentes a

carbonos sp3 oxigenados e sinais de carbonos metílicos, metilênicos, metínicos e

carbonos não hidrogenados.

A análise comparativa do espectro de RMN13C (Figura 10) com o espectro

de RMN13C–DEPT 135 ° (Figura 11, página 38) permitiu reconhecer a presença de

sinais para carbonos metílicos (6CH3), metilênicos (3CH2), metínicos (5CH) e carbonos

não hidrogenados (10C), que permitiu propor a fórmula parcial, devido ao fato do

gênero Plectranthus ser rico em diterpenos, C24 H 29O8 (Tabela 3). De acordo com os

espectros de RMN

13C de PGD-1 e juntamente com o espectro de massas de alta

resolução (m/z 469,1919, [M+Na]+) (Figura 7) foi possível ajustar a fórmula parcial

acima para C24H30O8, devido à presença de hidroxila, evidenciado pela banda em 3490

cm-1 no espectro de infravermelho (Figura 12, página 38). A fórmula molecular obtida

C24H30O8 apresenta índice de deficiência de hidrogênio igual a dez, correspondendo a

cinco carbonilas na faixa de 216-170 ppm, uma olefina em δ 153,5 e δ 141,2 e a

presença de quatro anéis. Com os dados obtidos, sugerimos que o composto PGD-1

trata-se de um diterpeno tetracíclico abietano com anel espirociclopropânico.

35


Figura 7 - Espectro de massas de alta resolução de PGD-1

Tabela 3 - Deslocamento químico de RMN 13C (δ) (125 MHz, CDCl3) para PGD-1, com padrão de hidrogenação obtido por comparação com DEPT-135°

C CH CH2 CH3 a214,90 a77,78 35,05 28,04 a196,01 a70,68 33,81 22,45 a194,40 a63,97 26,05 21,57 a170.18 46,90 21,09 a169,80 22,26 20,84 153,50 13,15 141,20 46,93 39,29 34,92 Total 10C 5H 6H 18H C24H29O8

(C=O)3 5CH 3CH2 6CH3 +1H (RC=OR’)2 3O C24H30O8

aSinal de carbono oxigenado

O espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) (Figura 9, página 37), indicou a

presença de três singletos, correspondentes a grupos metilas ligados a carbono não

hidrogenado, em δ 1,24 (s); δ 1,17 (s) e δ 1,67 (s) e um grupo metila ligado a carbono

metínico em δ 1,15 (sl). Apresentou ainda sinais de hidrogênios correspondendo a grupo

metila ligado a carbonila em δ 2,03 (3H, s) e δ 2,11 (3H, s), caracterizando dois

grupamentos acetila, além de hidrogênio ligado a carbono oxigenado associado ao

grupamento acetila (CHOAc) e outro hidrogênio ligado a um carbono hidroxilado

(HCOH) em δ 5,30 (s), δ 5,03 (s) e 4,62 (d, 2,2 Hz). Diante dos dados, foi estabelecida

uma comparação dos deslocamentos químicos de RMN 1H e RMN 13C de PGD-1 com

os dados da literatura (Albuquerque, 2007) (Tabela 4) que revelou semelhança entre

PGD-1 e o diterpeno do tipo abietano com um anel espirociclopropânico, denominado

barbatusina.

A análise dos dados espectroscópicos juntamente com os dados da literatura

permitiu sugerir que PGD-1 tratava-se do diterpeno barbatusina (Figura. 8, página. 36).

Apesar de ser conhecido na literatura, há apenas um relato de atividade biológica que é

36


a atividade gastroprotetora para esta substância (Albuquerque, et al 2010), tendo muito

ainda por explorar farmacologicamente esta substância.

Figura 8 – Representação estrutural do diterpeno barbatusina

Tabela 4 - Comparação dos dados de RMN 1H e de 13C de PGD-1 com valores da literatura (Albuquerque, 2007) para a substância barbatusina.

C PGD-1a LITERATURAa δC δH δC δH

1 35,05 2,27 (m) 1,60 (m)

34,29 2,2 (m) 1,6 (m)

2 33,81 2,61-2,63 (m) 33,20 2,6-2,5 (m) 3 214,90 214,61 4 46,93 46,23 5 46,90 2,30 (m) 46,01 2,28 (s) 6 70,68 5,30 (d, 4,8 Hz) 70,27 5,23 (sl) 7 63,97 4,62 (d, 2,2 Hz) 62,97 4,57 (dd, 5,0-1,8 Hz) 8 141,20 140,59 9 153,50 152,74 10 38,29 37,61 11 194,40 193,92 12 77,78 5,03 (d, 4,8 Hz)) 77,23 4,94 (s) 13 34,92 34,15 14 196,01 195,13 15 22,26 2,12 (m) 21,57 2,11 (m) 16 26,05 1,40 (dd, 8,80-4,03 Hz)

1,06 (dd, 7,34-4,02 Hz) 25,71 1,31 (dd, 8,9-4,1 Hz)

0,99 (m) 17 13,15 1,15 (sl) 12,56 1,08 (d, 6,0 Hz) 18 28,04 1,24 (s) 27,43 1,15 (s) 19 22,45 1,17 (s) 21,63 1,09 (s) 20 21,09 1,67 (s) 20,24 1,58 (s)

AcO-6 21,57 2,03 (s) 21,47 1,95 (s) AcO-12 20,84 2,11 (s) 20,01 2,03 (s) AcO-6 170,18 169,81

AcO-12 169,80 169,32

aOs espectros de RMN foram obtidos em CDCl3 (1H: 500 MHz; 13C: 125 MHz)

OAc

OAc

OHO

O

O

12

34 5

67

8

9

10

1112

1314

15

16 17

18

20

19

HH

H

H

HHH

37

Figura 9 - Espectro de RMN 1H de PGD-1

Figura 10 - Espectro de RMN 13C de PGD-1

OAc

OAc

OHO

O

O

12

34 5

67

8

9

10

1112

1314

15

16 17

18

20

19

OAc

OAc

OHO

O

O

12

34 5

67

8

9

10

1112

1314

15

16 17

18

20

19

38

Figura 11 - Espectro de RMN 13C DEPT-135º de PGD-1

Figura 12 - Espectro na região do infravermelho de PGD-1

4.1.2 - Obtenção e Determinação Estrutural de PGD-2

PGD-2, sólido amarelo, solúvel em diclorometano, foi isolada a partir de

cromatografia de camada delgada preparativa de cristais de barbatusina (Fluxograma 1,

página 93), apresentou ponto de fusão entre 205-207 °C e rotação óptica [α]D20 =

+249,56 (1 mg/mL, CHCl3).

O espectro de RMN 13C BB (75 MHz em CDCl3) (Figura 16) de PGD-2,

apresenta sinais de carbonila cetônica conjugada em δC 196,38 e δC 194,40, dois sinais

OAc

OAc

OHO

O

O

12

34 5

67

8

9

10

1112

1314

15

16 17

18

20

19

39

de carbonila de éster em δC 170,14 e δC 169,85 e carbonos sp2 δC 155,57 e δC 140,68.

Observam-se também sinais de carbono sp3 oxigenado em δC 78,35, δC 78,35, δC 71,08 e

δC 65, e sinais de carbonos metílicos, metilênicos, metínicos e não hidrogenados entre

48,0 e 13,0 ppm

A partir dos dados obtidos dos espectros RMN 13C (Figura 16) e RMN 1H

(Figura 15), além do espectro de massas de alta resolução (m/z 471,2066, [M+Na]+)

(Figura 14), sugere-se a fórmula molecular de C24H32O8 com índice de deficiência de

hidrogênio igual a oito, correspondente com quatro cabonilas na faixa de 196-169 ppm,

uma olefina em δC 155,6 e δC 140,7 em um sistema tetracíclico. A comparação com

dados da literatura sugere que se trata da 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina (Tabela 5).

Figura 13 - Representação estrutural do diterpeno 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina

Figura 14 - Espectro de massas de alta resolução de PGD-2

OAc

OAc

OH

O

O

12

34 5

67

8

9

10

1112

1314

15

16 17

18

20

19

HO

40

Tabela 5 - Comparação dos dados de RMN 1H e de 13C de PGD-2 com valores da literatura (Albuquerque, 2004).

C PGD-2a LITERATURAb

δC δH δC δH 1 35,61 2,03 (m)

1,06 (m) 35,77 2,02 (m)

1,06 (dd, 11,5-3,4 Hz) 2 27,51 1,80 (m)

1,26 (m) 27,63 1,78 (dd, 16,5-3,5 Hz)

1,24(dd, 16,5-3,0 Hz) 3 76,78 3,30 (m) 78,52 3,29(dd, 16,5-7,8 Hz) 4 38,67 38,46 5 47,22 1,56 (sl) 47,25 1,57 (sl) 6 71,08 5,52 (s) 71,49 5,49 (sl) 7 65,42 4,53 (sl) 65,28 4,52 (sl) 8 140,68 140,90 9 155,57 155,72 10 39,32 38,84 11 194,40 194,68 12 78,35 5,31 (s) 78,56 5,30 (s) 13 35,01 35,10 14 196,38 196,18 15 21,56 2,18 (m) 21,84 2,16 (m) 16 26,70 1,35 (dd, 9,0-3,0 Hz)

1,04 (m) 27,09 1,34 (dd, 15,2-3,0 Hz)

1,05 (dd, 15,2-2,8 Hz) 17 13,08 1,14 (d, 6,0) 13,32 1,14 (d, 7,1 Hz) 18 28,04 1,17 (s) 28,24 1,17 (s) 19 17,11 1,02 (s) 17,38 0,99 (s) 20 22,00 1,70 (s) 22,21 1,68 (s)

AcO-6 20,86 2,07 (s) 21,08 2,03 (s) AcO-12 21,59 2,10 (s) 21,85 2,05 (s) AcO-6 170,14 170,63

AcO-12 169,85 170,19 aOs espectros de RMN foram obtidos em CDCl3 (

1H: 300 MHz; 13C: 75 MHz) bOs espectros de RMN foram obtidos em CDCl3 (

1H: 500 MHz; 13C: 125 MHz)

Figura 15 - Espectro de RMN 1H de PGD-2

OAc

OAc

OH

O

O

12

34 5

67

8

9

10

1112

1314

15

16 17

18

20

19

HO

41

Figura 16 - Espectro de RMN 13C de PGD-2

4.1.3–Produtos de derivatização da Barbatusina

4.1.3.1 – Obtenção e Determinação Estrutural de DB-1

A partir da redução de 500 mg de PGD-1 (barbatusina) com NaBH4, obteve-

se 30 mg de DB-1 purificados em cromatografia de coluna em sílica flash (3β -hidroxi-

3-deoxobarbatusina), com rendimento de 6 %.

A 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina é reportada na literatura científica como

potente agente gastroprotetor capaz de recuperar até 96 % das lesões no trato

gastrointestinal provocadas por ingestão de etanol, enquanto que a barbatusina recupera

76 %. Como é possível a obtenção da 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina, tanto como

produto natural quanto como produto reacional, as folhas de P. grandis podem ser

consideradas como uma fonte de compostos bioativos.

DB-1 (derivado da barbatusina) é um sólido amarelo, solúvel em

diclorometano foi obtida a partir da redução da barbatusina com NaBH4, apresentou

ponto de fusão entre 205-207 °C.

O espectro de RMN 13C BB (125 MHz em CDCl3) (Figura 19) de DB-1, não

apresenta o sinal de carbonila (C-3) em torno de δC 215 que havia na barbatusina antes

da reação de redução, mas apresenta sinais de carbonila cetônica conjugada em δC

196,28 e δC 194,46, dois sinais de carbonila de éster em δC 170,32 e δC 169,94 e

OAc

OAc

OH

O

O

12

34 5

67

8

9

10

1112

1314

15

16 17

18

20

19

HO

42


carbonos sp2 δC

155,53 e δC 140,71. Observa-se também sinais de carbono sp3

oxigenado em δC 78,36, δC 76,98, δC 71,22 e δC 65,18 e sinais de carbonos metílicos,

metilênicos, metínicos e não hidrogenados entre 48,0 e 13,0 ppm.

O espectro de RMN 13C DEPT – 135º (Figura 20).

A comparação entre os espectros RMN 13C (Figura 19) e RMN 1H (Figura

18) com dados da literatura e com os dados de PGD-2 (Tabela 6) sugere que o produto

reacional se trata da 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina (Figura 17).

Figura 17 - Representação estrutural do diterpeno 3-hidroxi-3-deoxobarbatusina

Tabela 6 - Comparação dos dados de RMN 1H e de 13C de DB-1 com valores da literatura (Albuquerque, 2004).

C DB-1a LITERATURAb

δC δH δC δH 1 35,60 2,03 (m)

1,06 (m) 35,77 2,02 (m)

1,06 (dd, 11,5-3,4 Hz) 2 27,48 1,77 (dd,8,05-3,2 Hz)

1,24 (m) 27,63 1,78 (dd, 16,5-3,5 Hz)

1,24(dd, 16,5-3,0 Hz) 3 76,98 3,29 (m) 78,52 3,29(dd, 16,5-7,8 Hz) 4 38,65 38,46 5 47,08 1,57 (sl) 47,25 1,57 (sl) 6 71,22 5,50 (s) 71,49 5,49 (sl) 7 65,18 4,52 (sl) 65,28 4,52 (sl) 8 140,71 140,90 9 155,53 155,72 10 39,31 38,84 11 194,46 194,68 12 78,36 5,30 (s) 78,56 5,30 (s) 13 34,93 35,10 14 196,28 196,18 15 21,60 2,18 (m) 21,84 2,16 (m) 16 26,82 1,35 (dd, 7,15-4,15 Hz)

1,04 (dd, 7,15-4,15 Hz) 27,09 1,34 (dd, 15,2-3,0 Hz)

1,05 (dd, 15,2-2,8 Hz) 17 13,11 1,14 (d, 6,4 Hz) 13,32 1,14 (d, 7,1 Hz) 18 28,04 1,17 (s) 28,24 1,17 (s) 19 17,16 1,02 (s) 17,38 0,99 (s) 20 22,01 1,70 (s) 22,21 1,68 (s)

AcO-6 20,88 2,06 (s) 21,08 2,03 (s) AcO-12 21,59 2,10 (s) 21,85 2,05 (s) AcO-6 170,32 170,63

AcO-12 169,94 170,19 aOs espectros de RMN foram obtidos em CDCl3 (

1H: 300 MHz; 13C: 75 MHz) bOs espectros de RMN foram obtidos em CDCl3 (

1H: 500 MHz; 13C: 125 MHz)

OAc

OAc

OH

O

O

12

34 5

67

8

9

10

1112

1314

15

16 17

18

20

19

HO

43

Figura 18 - Espectro de RMN 1H de DB-1

Figura 19 - Espectro de RMN 13C de DB-1

OAc

OAc

OH

O

O

12

34 5

67

8

9

10

1112

1314

15

16 17

18

20

19

HO

44

Figura 20 - Espectro de RMN 13C DEPT de DB-1

4.1.3.2 – Obtenção e Determinação Estrutural de OXB-1

A substância denominada de OXB foi obtida pela derivatização da barbatusina

com hidroxilamina (NH2OH) em metanol com 83,3% de rendimento, sendo um sólido

levemente amarelado e solúvel em clorofórmio com rotação óptica [α]D20 = +57,3 (1

mg/mL, CHCl3).

O espectro de RMN 13C BB (125 MHz em CDCl3) (Figura 20), de OXB, exibe

24 sinais, entre os quais os sinais em δC 196,34, δC 194,45, δC 170,25, δC 169,90, δC

164,97, δC 154,61 e δC 140,93 correspondem à carbonilas cetônicas conjugadas,

carbonilas de éster, carbono de oxima e sinais de duplas ligações, de acordo com os

deslocamentos químicos (SILVERSTEIN, 2000). Os sinais observados em δC 77,96, δC

70,70 e δC 64,23 são correspondentes de carbonos sp3 oxigenados e os sinais entre δC

13,14 e δC 47,19 são de carbonos metílicos, metilênicos, metínicos e não hidrogenados.

OAc

OAc

OH

O

O

12

34 5

67

8

9

10

1112

1314

15

16 17

18

20

19

HO

45


Tabela 7 - Deslocamento químico de RMN 13C (δ) (125 MHz, CDCl3) para OXB, com padrão de hidrogenação obtido por comparação com DEPT-135°.

C CH CH2 CH3 a196,34 a77,96 35,03 29,03 a194,45 a70,70 26,44 24,77 a170.25 a64,23 17,76 21,60 a169,90 47,19 21,28 b164,97 22,05 20,88 154,61 13,14 140,93 40,11 38,69 34,99 Total 10C 5H 6H 18H C24H29O8

(C=O)3 5CH 3CH2 6CH3 +2H (RC=OR’)2 3O C24H31NO8

(C=N) aSinal de carbono oxigenado bSinal de carbono nitrogenado

A análise comparativa do espectro de RMN 13C BB (Figura 24) com o espectro

de RMN 13C-DEPT135° (Figura 25), juntamente com os deslocamentos químicos,

permitiram identificar a presença de sinais para carbono metílicos, metilênicos,

metínicos e não hidrogenados (Tabela 7). Com o espectro de massas de alta resolução

(m/z 484,20, [M+Na]+) (Figura 21) foi possível estabelecer a fórmula molecular de OXB

como C24H31NO8. Não foi encontrada correlação na literatura consultada para esta

molécula, que está, portanto, sendo relatada pela primeira vez.

Figura 21 - Espectro de massas de alta resolução de OXB

46


N

O

O

OAc

OAc

OH

HO

1

3 5 7

910

11 13

16

15

17

18 19

20

Figura 22 - Representação estrutural de OXB

A partir do espectro de correlação heteronuclear 1H x 13C HSQC (Figura 26) foi

possível atribuir os hidrogênios aos respectivos carbonos (Tabela 8).

Tabela 8 - Comparação dos dados de RMN 1H e de 13C de OXB com valores da literatura (Albuquerque et al, 2007) para a substância barbatusina.

C OXBa (HSQC) LITERATURAa (barbatusina) δC δH δC δH

1 17,76 2,92 (m) 2,66 (m)

34,29 2,2 (m) 1,6 (m)

2 35,03 2,16 (m) 1,25 (m)

33,20 2,6-2,5 (m)

3 164,97 214,61 4 40,11 46,23 5 47,19 2,00 (s) 46,01 2,28 (s) 6 70,70 5,42 (s) 70,27 5,23 (sl) 7 64,23 4,59 (s) 62,97 4,57 (dd, 5,0-1,8 Hz) 8 140,93 140,59 9 154,61 152,74 10 38,69 37,61 11 194,45 193,92 12 77,96 4,99 (s) 77,23 4,94 (s) 13 34,99 34,15 14 196,34 195,13 15 22,05 2,10 (m) 21,57 2,11 (m) 16 26,44 1,38 (dd)

1,06 (m) 25,71 1,31 (dd, 8,9-4,1 Hz)

0,99 (m) 17 13,14 1,15 (d) 12,56 1,08 (d, 6,0 Hz) 18 29,03 1,32 (s) 27,43 1,15 (s) 19 24,77 1,25 (s) 21,63 1,09 (s) 20 21,28 1,71 (s) 20,24 1,58 (s)

AcO-6 21,60 2,04 (s) 21,47 1,95 (s) AcO-12 20,88 2,92 (s) 20,01 2,03 (s) AcO-6 170,25 169,81 AcO-12 169,90 169,32

aOs espectros de RMN foram obtidos em CDCl3 (1H: 500 MHz; 13C: 125 MHz)

47


Considerando a substância OXB como produto de derivatização da barbatusina

em que o objetivo foi de converter a carbonila do carbono 3 em uma oxima não

alterando o restante da molécula, fica evidente o êxito da reação ao observar a ausência

do sinal em δC 214,61 (C-3) e o surgimento do sinal em δC 164,97 no espectro de RMN 13C (Figura 24), além dos outros sinais não sofrerem alterações significativas, exceto

para os núcleos adjacentes C-1, C-3 e C-4. O núcleo C-2, apesar de ser β-carbonila, não

apresentou alteração significativa no deslocamento químico.

O espectro de RMN 1H (Figura 23) apresenta três singletos na região de δH 5,5-

4,5, correspondente de hidrogênio ligado a carbono oxigenado; dois singletos em δH 2,1

e δH 2,0 referentes aos hidrogênios das metilas dos grupos acetilas 12 e 6,

respectivamente; os grupos metilas C-20, C-18 e C-19 estão em δH 1,7; 1,3 e 1,2;

respectivamente, além da metila C-17 em δH 1,15.

O espectro bidimensional de correlação homonuclear 1H x 1H COSY (Figuras 29

e 30) mostra a correlação do H-6 com H-5 e H-7, logo se conclui que estes H-5 e H-7

são hidrogênios de carbonos vizinhos ao C-6, sendo ainda os hidrogênios H-6 e H-7

com deslocamento químico na região de hidrogênios de carbono oxigenado. Pode-se

identificar, também, o sinal de H-12 em δH 5,0, haja vista que não há correlação para

este núcleo, logo, é mais uma evidência de que os carbonos vizinhos ao C-12 não são

hidrogenados. O espectro de 1H x 1H COSY mostra ainda, as correlações entre os

hidrogênios H-1 e H-2, além de correlação entre H-15 e H-16.

O espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C HMBC (Figura

31), dividido em seis expansões (Figuras 32-37), apresenta correlações que evidenciam

acoplamentos à distância entre hidrogênios e carbonos (2JC-H e 3JC-H) que permitem

determinar inequivocamente a estrutura de OXB. A expansão 1 (Figura 32) evidencia as

correlações de C-3 com os hidrogênios H-1α, H-1β, 3H-18 e, 3H-19. Estas correlações

permitem elucidar a parte da molécula que sofreu alterações nos deslocamentos

químicos em comparação com a sua precursora, barbatusina. Outras correlações

importantes podem ser observadas tais como: H-6 e H-7 com C-8; H-12 e H-7 com C-9

(Figura 33); H-6 com C-10, C-4, C-5 e C-7; H-7 com C-6 e C-5; H-12 com C13 (Figura

34); H-12 com C-15 e C-16 (Figura 35); H-2α e H-2β com C-1 (Figura 36); C-2 com H-

1α, H-1β e H-5 (Figura 37).

48


Figura 23 - Espectro de RMN 1H de OXB

Figura 24 - Espectro de RMN 13C BB de OXB

49


Figura 25 - Espectro de RMN 13C DEPT-135°

Figura 26 - Espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C HSQC de OXB

50


Figura 27 - Expansão 1 do espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C HSQC de OXB.

Figura 28 - Expansão 2 do espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C HSQC de OXB.

51

Figura 29 - Espectro bidimensional de correlação homonuclear 1H x 1H COSY de OXB

HON

H

H

HH

HOAc

OH

H

H

O

O

OAc

52

Figura 30 - Expansão 1 do espectro bidimensional de correlação homonuclear 1H x 1H COSY de OXB.

HON

H

H

HH

HOAc

OH

H

H

O

O

OAc

53

Figura 31 - Espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C à longa distancia (HMBC) de OXB

HON

HH

HOAc

OH

H

H

O

O

OAcH H

H

1

3 5 7

9

11 1315

17

1819

20

54

Figura 32 – Expansão 1 do espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C à longa distancia (HMBC) de OXB.

HON

HH

HOAc

OH

H

H

O

O

OAcH H

H

1

3 5 7

9

11 1315

17

55

Figura 33 - Expansão 2 do espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C à longa distancia (HMBC) de OXB.

HON

HH

HOAc

OH

H

H

O

O

OAcH H

H

1

3 5 7

9

11 1315

17

56


HON

HH

HOAc

OH

H

H

O

O

OAcH H

H

1

3 5 7

9

11 1315

17

57


HON

HH

HOAc

OH

H

H

O

O

OAcH H

H

1

3 5 7

9

11 1315

17

58

Figura 36 - Expansão 5 do espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C à longa distancia (HMBC) de OXB

HON

HH

HOAc

OH

H

H

O

O

OAcH H

H

H

H1

3 5 7

9

11 1315

17

59


HON

HH

HOAc

OH

H

H

O

O

OAcH H

H

H

H1

3 5 7

9

11 1315

17

60


4.1.3.2 – Produtos de hidrólise, metilação e benzilação da barbatusina. Além da obtenção de DB-1 e OXB por via química, realizou-se outras

reações na tentativa de obterem-se derivados inéditos na literatura. Entretanto, não

houve êxito em nenhuma das reações de hidrólise, metilação e benzilação descritas nos

itens 7.6.2 a 7.6.4. Observou-se, também, que não houve qualquer indício de reação em

condições ácidas ou brandamente alcalinas (seções 7.6.2.A, 7.6.2.C, 7.6.3.A e 7.6.4.A),

já nas reações com base forte (seções 7.6.2.B, 7.6.3.B e 7.6.3.C) houve brusca mudança

de coloração de amarelo para vermelho intenso e o produto reacional ficou altamente

polar, levando a crer que se trata de degradação da barbatusina em meio alcalino, logo

foi proposta uma investigação deste fenômeno em que os resultados estão citados no

item 2.4.3.

4.1.3.3 – Avaliação do produto de Degradação da Barbatusina em Meio Alcalino (PDB).

Ao submeter a barbatusina ao meio alcalino (Item 7.6.6) a solução passa de

amarelo a vermelho intenso bruscamente, então este produto vermelho foi denominado

de PDB (Produto de Degradação da Barbatusina) e o espectro de RMN 1H foi obtido a

300 MHz para que se pudesse observar as alterações na estrutura do diterpeno (Figura

31) em comparação com a barbatusina.

Figura 38 - Espectro de RMN 1H de PDB

61

Figura 39 - Espectro de RMN 1H da Barbatusina (PGD-1)

A partir da comparação entre os espectros de PDB e PGB-1, pode-se dizer

apenas que os hidrogênios ligados aos carbonos 6, 7, e 12 estão mais deslocados em

PDB do que em PGB-1, assim como todo o restante do espectro sofreu alterações, mas a

comparação entre os espectros é inconclusiva.

4.2 – Reatividade biocatalítica da barbatusina

4.2.1-Triagem com Enzimas

Dos seis meios reacionais preparados para avaliar a reatividade da barbatusina

com RMIM, lipase de B. cepaceae, Cal-B, lipase PS-IM, PPL, lipase de Candida

rugosa após as 48 h em incubadora shaker, não houve reação com qualquer uma das

enzimas (Item 7.6.7.I)

4.2.2-Triagem com Fungos

Assim como na triagem das enzimas, não houve qualquer modificação química

na barbatusina ao ser submetida à reação com os micélios de fungos de origem

ambiental (Item 7.6.7.II, página xx).

OAc

OAc

OHO

O

O

12

34 5

67

8

9

10

1112

1314

15

16 17

18

20

19

62

5 – VALIDAÇÃO DE MÉTODOS DE ANÁLISE

CAPÍTULO 5

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA COM DETECTOR DE ARRANJO DE DIODOS PARA DETERMINAÇÃO DOS MARCADORES QUÍMICOS, BARBATUSINA (BARB) E 3-Β-HIDROXI-3-DEOXOBARBATUSINA (DEBARB) EM QUATRO ESPÉCIES DO GÊNERO PLECTRANTHUS

5.1 - Validação e Parâmetros de Validação

A validação de um método analítico é o ato de tornar válido, legítimo ou legal. Visa

diminuir ou controlar os fatores que levam à imprecisão ou inexatidão de um dado

gerado. Geralmente, estes fatores são a variabilidade da amostra, eventual

contaminação, reagentes inadequados, medidas erradas, variações de temperatura,

variações e descuidos na manutenção dos equipamentos, além de calibração ineficiente,

analista sem adequado treinamento e perdas durante a análise, (Lanças, 2004).

A validação deve avaliar a relação entre os resultados experimentais e as questões

que o método se propõe a responder, ou seja, o objetivo da validação consiste em

demonstrar que o método analítico é adequado para o seu propósito. A validação deve

ser considerada em várias situações do procedimento analítico: quando se desenvolve

uma nova metodologia, se efetua adaptações em metodologias já validadas, na inclusão

de novas técnicas ou uso de diferentes equipamentos. Determinado método é

considerado validado se suas características estiverem de acordo com os pré-requisitos

estabelecidos ao fim que se propõe (Brito, 2003)

A literatura científica dispõe de trabalhos que abordam os critérios de validação

para métodos analíticos empregados em diversas áreas, tais como biologia, farmácia,

química, engenharia de alimentos e outras. Dentre estes critérios, os mais comuns

encontrados na literatura são a especificidade/seletividade, função de resposta, intervalo

de trabalho, linearidade, sensibilidade, exatidão, precisão (repetitividade, precisão

intermediária e reprodutividade), limite de detecção (LD), limite de quantificação (LQ)

e robustez. (Brito, 2003). Cada um destes critérios pode ser determinado de mais de

uma forma, dependendo de fatores como origem das amostras, complexidade da matriz,

63


natureza dos padrões empregados, instrumentos disponíveis, tempo, custo financeiro e

propriamente o objetivo da análise.

Não há ainda um senso comum a respeito de quais parâmetros devem ser validados,

variando de uma área para outra, porém existem resoluções e guias de diferentes

instituições que podem ser seguidos para cada área de aplicação entre eles tem-se USA-

FDA, IUPAC, AOAC, ICH, ANVISA além outros de âmbito nacional e internacional.

5.2 - Parâmetros de Validação

5.2.1 - Linearidade A linearidade de um método expressa a faixa na qual o sinal analítico, que é

variável dependente (y), é linearmente proporcional à sua concentração, que é uma

variável independente (x), e a equação matemática que descreve esta dependência é

conhecida como curva analítica ou curva de calibração (Ribeiro, 2008).

Uma variação do procedimento de calibração consiste na adição do padrão analítico

à matriz em estudo (similar a um procedimento de fortificação empregado em estudos

de recuperação) com o objetivo de eliminar possíveis interferentes da matriz.

5.2.2 - Exatidão A exatidão é o grau de concordância entre o valor encontrado na análise e o valor

real do analito e constitui a chave para o propósito da validação. Os quatro métodos

principais, propostos para o estudo da exatidão, são baseados no uso de material de

referência certificado (MRC) na comparação do método proposto com um método de

referência, no uso de ensaios de recuperação na matriz e em estudos colaborativos.

Estes materiais certificados, quando disponíveis, são os materiais de controle preferidos,

pois estão diretamente relacionados com padrões internacionais. O processo de

avaliação por meio de MRC consiste em analisar um número suficiente de replicatas

desse material e comparar os resultados obtidos com o valor certificado. Entretanto, o

alto custo do MRC e a abrangência limitada de matrizes e analitos restringem seu uso.

A exatidão também pode ser estabelecida mediante comparação entre os valores obtidos

pelo método proposto com os valores obtidos para as mesmas amostras com outro

método validado (método com precisão e exatidão avaliadas). Após análise de

diferentes amostras com ambos os métodos, as diferenças obtidas para cada amostra são

calculadas e comparadas com o valor desejado (nesse caso, zero). Estabelece-se, então,

64


o nível de confiança de acordo com o intervalo de concentração (menores valores de

concentração causam maior dispersão dos dados aumentando o limite de confiança).

Entretanto, nem sempre se encontra método de referência preexistente, impossibilitando

a utilização desse tipo de proposta. Estudos colaborativos implicam na aceitação de pelo

menos oito laboratórios (número mínimo) em desenvolver determinado método.

Somente quando for impossível reunir tal número de laboratórios, o estudo poderá ser

conduzido com o mínimo absoluto de cinco participantes. A maior dificuldade

frequentemente encontrada quando se tenta estabelecer a exatidão do método por meio

de estudos colaborativos envolve a garantia de estabilidade do analito (assegurar que a

concentração do analito, a ser determinada na amostra, permaneça estável durante o

decorrer do estudo). Isso se torna particularmente difícil com compostos lábeis. Por fim,

o ensaio de recuperação constitui o método mais utilizado para validação de processos

analíticos. A recuperação está relacionada com a exatidão, pois reflete a quantidade de

determinado analito, recuperado no processo, em relação à quantidade real presente na

amostra. A exatidão é expressa como erro sistemático percentual, inerente ao processo.

O erro sistemático ocorre pela perda da substância devido à baixa recuperação da

extração, medidas volumétricas imprecisas ou substâncias interferentes na amostra

(entre outros). O estudo da recuperação consiste na "fortificação" da amostra, ou seja,

na adição de soluções com diferentes concentrações do analito de interesse seguida pela

determinação da concentração do analito adicionado (Brito, 2003).

Calcula-se a quantidade percentual recuperada pelo processo usando a fórmula:

Na qual: Rec = a média das recuperações obtidas para n repetições; 100 = a

recuperação percentual desejada; n = o número de determinações (trabalha-se com no

mínimo 5 repetições).

Existem valores críticos aceitáveis de acordo com a concentração do analito em

estudo. Esses valores são estimados considerando-se que análises de elementos

majoritários costumam apresentar erros sistemáticos relativos muito inferiores àqueles

obtidos para analitos em concentrações muito pequenas. Tais valores, sugeridos pelo

65


manual da Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 2011) são apresentados

na Tabela 9.

Tabela 9 - Recuperação do analito em função da concentração.

Analito (%) Razão Analito/Matriz

Unidade Recuperação (%)

≥ 100 1 100% 98-102 ≥ 10 10-1 10% 98-102 ≥ 1 10-2 1% 97-103 ≥ 0,1 10-3 0,1% 95-105 ≥ 0,01 10-4 100 ppm 90-107 ≥ 0,001 10-5 10 ppm 80-110 ≥0,0001 10-6 1 ppm 80-110 ≥0,00001 10-7 100 ppb 80-110 ≥0000001 10-8 10 ppb 60-115 ≥0,0000001 10-9 1 ppb 40-120

5.2.3 - Precisão A precisão é a expressão da concordância entre vários resultados analíticos obtidos

para uma mesma amostra. Pode ser determinada em condições de repetibilidade ou em

condições de reprodutibilidade.

Condições de repetibilidade são aquelas em que resultados independentes são

obtidos usando o mesmo método, para a mesma amostra, no mesmo laboratório, pelo

mesmo operador, usando o mesmo equipamento, em um curto intervalo de tempo.

Condições de reprodutibilidade são aquelas em que resultados são obtidos usando:

o mesmo método, para a mesma amostra, em diferentes laboratórios, por diferentes

operadores, usando diferentes equipamentos (Lanças, 2004).

A precisão pode também ser expressa como precisão intradia (between-day ou

within-day), quando medida em um mesmo dia, ou como precisão interdias (inter-days

ou between-days), quando medida ao longo de vários dias. Apesar de empregadas em

muitos processos de validação, essas determinações são particularmente importantes no

caso de amostras biológicas (Lanças, 2004).

66


A precisão em cromatografia é sempre determinada por intermédio da injeção de

padrões analíticos, não de amostras desconhecidas. O guia ICH (International

Conference on Harmonisation, 1996) recomenda um mínimo de 9 determinações

cobrindo a faixa especificada para o procedimento (3 concentrações/3 replicatas cada);

ou um mínimo de 6 determinações à 100 por cento da concentração teste.

A precisão tem sido medida por meio do desvio-padrão ou do coeficiente de

variação. Os coeficientes de variação aceitáveis (ou desvio-padrão relativo) estão

relacionados com o nível de concentração do analito na amostra, definido pela equação

de Horwitz:

CV (%) = 2(1-0,5logC)

Desse modo, substituindo-se os níveis de concentração nessa equação obtêm-se

os valores de Horwitz, apresentados na tabela 10, que correspondem aos maiores

valores aceitáveis de CV (%). Estes valores são independentes da natureza da matriz e

do analito (Wood, 1999; AOAC, 2011).

Tabela 10 - Coeficientes de variação em função da concentração do analito.

Analito (%) Razão analito/matriz

Unidade CV (%)

100 1 100% 1,3 10 10-1 10% 1,9 1 10-2 1% 2,7

0,1 10-3 0,1% 3,7 0,01 10-4 100 ppm 5,3

0,001 10-5 10 ppm 7,3 0,0001 10-6 1 ppm 11

0,00001 10-7 100 ppb 15 0,000001 10-8 10 ppb 21

0,0000001 10-9 1 ppb 30

5.2.4 - Limite de Detecção O limite de detecção (LD) corresponde à menor quantidade de um analito que pode

ser detectada, porém, não necessariamente quantificada como um valor exato.

Na prática, o limite de detecção é determinado como a menor concentração do

analito que pode ser diferenciada do ruído do sistema com segurança. O ruído (N, do

67


inglês noise) é a amplitude esperada em volts, amperes ou unidades de absorbância do

envelope da linha de base, a qual inclui todas as variações randômicas do sinal do

detector cuja frequência esteja na ordem de um ou mais ciclos por minuto.

A exigência para distinguir ruído de um sinal analítico varia entre os laboratórios.

Um procedimento comum é aceitar como limite de detecção (LD) a concentração ou

massa do analito que gera um sinal três (3) vezes maior do que o ruído do sistema, ou

seja, LD=3S/N. Outra forma é definir o LD como a concentração ou massa do analito

que produz um sinal igual a 3s, em que s é o desvio-padrão do ruído medido

empregando-se um branco em vez do sinal do equipamento, apenas (Lanças, 2004).

5.2.5 - Limite de Quantificação O limite de quantificação (LD) corresponde à menor quantidade de um analito que

pode ser quantificada com exatidão e com uma fidelidade determinada. Essa fidelidade,

na prática, é aceita como um coeficiente de variação de até 10% e uma exatidão de 10%.

Pode também ser definida em relação ao ruído empregando-se o branco como

referência; semelhante ao limite de detecção o limite de quantificação pode ser dado por

LQ = 10S/N.

Neste trabalho, apresentam-se dados obtidos na quantificação e validação dos

métodos de análise dos dois quimiomarcadores em extratos etanoicos das folhas de

quatro espécies do gênero Plectranthus.

5.3- Análise Quantitativa por CLAE-DAD para os marcadores (BARB) e

(DEBARB) em quatro espécies do gênero Plectranthus: P. grandis, P. barbatus, P.

ornatus e P. amboinicus.

5.3.1- Desenvolvimento do método

Condições cromatográficas utilizadas

Cromatógrafo líquido de alta eficiência, Shimadzu UFLC, com detector de arranjo

de diodos, SPD-M20A; coluna analítica Phenomenex® Luna 5u C18(2) 100A (250 x

4,60 mm, 5 µm); Pré-coluna Phenomenex®; Temperatua do forno de 40º C; Fase móvel

(BARB) H2O:Acetonitrila 30:70%; Fase móvel (DEBARB) H2O : Acetonitrila 55:45%;

68


Fluxo de 0,8 mL/min; Comprimento de onda de detecção de 254 nm; Volume de

injeção de 20 µL. A aquisição e processamento dos dados cromatográficos foram

realizadas pelo software LCSolutions® (Shimadzu) e o tratamento estatístico foi feito

nos softwares Microsoft Excel® (Microsoft, 2003) e GraphPad Prism®, versão 5.03

(Graphpad software, 2009).

Tabela 11 – Condições de eluição estabelecidas para cada marcador químico.

Marcador Tempo (min) Eluente A (%) Eluente B (%) Modo de eluição

BARB 4,9 30 70 Isocrático

DEBARB 9,6 55 45 Isocrático

Preparação das amostras

Pesou-se 1,000g de folhas pulverizadas e secas à 40º em estufa de cada uma das

quatro espécies analisadas: Plectranthus grandis, P. barbatus, P. ornatus e

P.amboinicus. As folhas de cada uma das espécies foram, separadamente, submetidas à

extração em etanol 100 mL P.A. à temperatura ambiente durante 1 hora em

equipamento de ultrassom. Em seguida os extratos foram filtrados em papel de filtro e

secos em evaporador rotativo sob pressão reduzida até a completa remoção do solvente

à temperatura de 40º C. Os extratos secos foram dissolvidos em metanol (grau CLAE) e

avolumados em balões de 25 mL na concentração de 0,5 mg/mL (500 ppm; n = 3 para

cada amostra).

Preparação das soluções padrões As substâncias usadas como padrões nas curvas analíticas e na validação dos

métodos analíticos, barbatusina e 3β-3-hidróxi-deoxobarbatusina (BARB e DEBARB),

obtidas através do fracionamento cromatográfico do extrato das folhas Plectranthus

grandis, foram dissolvidas em metanol (grau CLAE) e aferidas para a concentração de

69


1,0 mg/mL (1000 ppm). O grau de pureza dos padrões foi avaliado por CLAE-DAD e

comparado com um branco constituído apenas de metanol grau CLAE.

Estimativa das Faixas de Concentração de Trabalho

A faixa de concentração empregada para construção das curvas analíticas foi

estimada de acordo com dados da literatura, com base nos percentuais de diterpenoides

obtidos em espécies do gênero Plectranthus e espécies de outros gêneros da família

Lamiaceae (Yin, 2012; Hu, 2005).

Construção das Curvas Analíticas

A partir da solução estoque de cada substância padrão a 1000 µg/mL, foram

preparadas soluções de 25, 50, 100, 250 e 500 µg/mL, separadamente para BARB e

DEBARB, cada concentração corresponde a um ponto da curva analítica obtida por

injeções de 20 µL em triplicata.

5.3.2- Validação do método

As validações dos métodos de análise quantitativa de BARB e DEBARB em folhas

de quatro espécies do gênero Plectranthus foram realizadas de acordo com resoluções

do guia ICH (International Conference on Harmonisation) (ICH, 1996), da resolução da

ANVISA RE nº 899, de 29 de maio de 2003 e dos critérios estabelecidos pela

Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 2011). Estes parâmetros foram

selecionados, porque considerou-se adequados a matriz a ser analisada (biológica) e o

tipo de analito a ser determinado (princípio ativo).

Seletividade

A seletividade foi observada de acordo com a sobreposição dos cromatogramas

obtidos, avaliando-se as regiões apicais, ascendente e descente dos picos

correspondentes às respectivas substâncias padrões, considerando-se puras com a

ocorrência da exata sobreposição.

70


Linearidade As curvas analíticas foram construídas com cinco concentrações distintas, cada

ponto da curva foi obtido pela injeção em triplicata nas concentrações de 25, 50, 100,

250 e 500 µg/mL. A análise de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados

forneceu os coeficientes de correlação (r2) correspondentes à cada curva analítica.

Limite de Detecção (LD)

A partir da curva analítica obteve-se uma estimativa do LD de acordo com a

equação que utiliza os parâmetros da curva:

LD = 3,3 s/S

LD = limite de detecção; s = desvio padrão do intercepto e S = inclinação da curva analítica.

A partir da estimativa obtida com os dados da curva analítica pôde-se obter o

limite de detecção pela injeção de concentrações decrescentes de cada padrão, até

encontrar um valor de sinal de resposta 3,3 maior do que a relação sinal do ruído (3,3 x

S/N) medido com o branco. O limite de detecção foi determinado pela injeção em

decaplicata.

Limite de Quantificação (LQ)

De forma similar ao LD, o LQ também foi inicialmente determinado com

parâmetros da curva obtendo-se uma estimativa, normalmente superestimada, de acordo

com a equação:

LQ = 10 s/S

LQ = limite de quantificação; s = desvio padrão do intercepto e S = inclinação da curva analítica

Em seguida, de posse da estimativa obtida pelos parâmetros da curva analítica,

os limites de quantificação foram determinados pelas injeções de concentrações

decrescentes até chegar à relação sinal/ruído maior do que 10 (10 x S/N), em que o

ruído é obtido pela injeção do branco.

71


Exatidão

Os extratos foram fortificados com concentrações conhecidas de cada padrão,

separadamente, em três níveis de fortificação, as injeções foram realizadas em

quintuplicata para cada nível de fortificação e também para os extratos não fortificados.

Os percentuais de recuperação foram determinados de acordo com a equação:

Rec (%) = 100 (Cf)/(Ce + Ca)

Rec (%) = percentual de recuperação;

Cf = concentração do extrato fortificado

Ce = concentração do extrato não fortificado

Ca = concentração do analito adicionado ao extrato

Precisão

A precisão foi avaliada em dois níveis, intradia e interdias. A precisão intradia

foi avaliada com nove determinações, sendo a triplica em três concentrações distintas.

Os padrões foram injetados nas concentrações de 50, 125 e 500 µg/mL (ppm),

separadamente (n = 9).

A precisão interdias, foi avaliada também em três concentrações distintas, 50,

125 e 500 µg/mL), em dois dias consecutivos, variando-se o operador (n = 18), a análise

foi realizada para cada substância padrão separadamente. Os respectivos desvios-padrão

relativos foram obtidos a partir das replicatas em cada concentração.

5.4 - RESULTADOS

5.4.1-Desenvolvimento do método

Obtenção das Curvas Analíticas

Duas curvas analíticas foram obtidas, uma para cada marcador químico, BARB e

DEBARB nas concentrações de 25, 50, 100, 250 e 500 µg/mL (ppm), separadamente. A

Tabela 12 apresenta, para cada substância padrão, as concentrações injetadas e a média

72


das áreas correspondentes, obtidas dos respectivos cromatogramas), com os desvios-

padrão relativos (DPR).

Figura 40 - Cromatograma de BARB na concentração de 25 ppm



73




Figura 45 - Cromatograma de DEBARB na concentração de 25 ppm

74






75


Tabela 12 - Concentrações dos analitos injetados em triplicadas e as áreas correspondentes para cada curva analítica.

Concentrações (ppm)

Área média DPR (%)

BARB 25 433839,6667

1,31

50 805103,6667

4,10

100 2043319,6667

2,51

250 3709115,3333

2,79

500 7289376,3333

0,91

DEBARB 25 393266,6667

0,45

50 814264,6667

2,92

100 2515620,0000

3,11

250 5402594,0000

0,82

500 10656203,3333

1,15

As curvas analíticas (Gráficos 2 e 3) obtidas apresentaram boa linearidade com

r2 > 0,99. Os dados da análise de regressão linear são apresentados na Tabela 13.

Tabela 13 - Resultados da regressão linear para as duas curvas analíticas.

Parâmetros estatísticos BARB DEBARB Coeficiente de correlação 0,9931 0,9966

DPR da curva (%) 2,31 1,63 Inclinação (104) 1,4145 2,1496

Erro padrão da inclinação 326,8 349,7 Intercepto (105) 2,39256 -0,20448

Erro padrão do intercepto (105) 0,83406 0,89239

76


0 200 400 6000

5.0××××106

1.0××××107

1.5××××107

Concentração (ppm)

Áre

a

0 200 400 6000

2.0××××106

4.0××××106

6.0××××106

8.0××××106

Concentração (ppm)

Áre

a

O método de quantificação desenvolvido foi aplicado aos extratos etanoicos das

folhas das quatro espécies de Plecthanthus, fornecendo os teores de BARB e DEBARB

apresentados com seus respectivos desvios-padrão relativos (Tabela 14). BARB não foi

detectada nos extratos de P. ornatus e P. amboinicus nas condições experimentais

utilizadas.

Tabela 14 - Teores dos marcadores químicos nos extratos etanoicos das folhas de P.

grandis, P. barbatus, P. ornatus e P. amboinicus.

Planta\Marcador BARB (µg/mL)

DPR (%) DEBARB (µg/mL)

DPR (%)

P. grandis 126,7 2,28 33,4 3,34 P. barbatus 59,6 3,45 7,5 5,86 P. ornatus ND* - 5,8 5,10

P amboinicus ND* - 1,3 72,25 *ND – Não detectado

5.4.2- Validação do método

Exatidão

A exatidão foi avaliada pelos testes de recuperação realizados pela fortificação

dos extratos etanoicos das folhas de cada uma das quatro espécies com quantidades

conhecidas de cada substância de referência. A Tabela 15 apresenta os percentuais de

recuperação obtidos para ambas as substâncias nos extratos das quatro espécies de

Plectranthus.

Gráfico 3 - Curva analítica de DEBARB

y = 14145x + 239256 y = 21496x - 20448

Gráfico 2 - Curva analítica de BARB

77


Tabela 15 - Percentuais de recuperação de BARB e DEBARB em P. grandis, P.

barbatus, P. ornatus e P amboinicus.

Analito Nível de

fortificação

Conc. no extrato

(µg/mL)

Conc. fortificada (µg/mL)

Conc. teórica

(µg/mL)

Conc. experimen

tal (µg/mL)

DPR (n=5) (%)

Recuperação (%)

Plectranthus grandis

BARB

1 124,0 62,5 186,5 152,3 1,74 81,7 2 124,0 125,0 249,0 259,1 2,10 104,0 3 124,0 250,0 374,0 384,0 3,39 102,7

DEBARB

1 22,8 15,0 37,8 40,3 3,60 107,6 2 22,8 25,0 47,8 50,4 2,94 105,4 3 22,8 40,0 62,8 64,1 2,73 102,1

Plectranthus barbatus

BARB

1 36,5 30,0 66,5 74,9 6,36 112,6 2 36,5 62,5 99,0 114,8 3,65 115,1 3 36,5 125 161,5 166,9 5,83 103,3

DEBARB

1 6,7 30,0 36,7 37,2 4,90 101,4 2 6,7 62,5 69,2 75,5 3,02 109,1 3 6,7 125 131,7 152,6 1,42 115,9

Plectranthus ornatus

DEBARB

1 4,5 15,0 19,5 17,7 1,26 90,8 2 4,5 30,0 34,5 33,8 6,75 98,0 3 4,5 62,5 67 70,5 2,53 112,8

Plectranthus amboinicus

DEBARB

1 2,2 25,0 27,2 25,7 2,16 94,5 2 2,2 50,0 52,2 48,3 2,04 92,5 3 2,2 100,0 102,2 101,9 2,80 99,7

Os percentuais de recuperação de BARB no extrato de P. grandis são

condizentes com exatidão adequada, exceto para o nível 1 de fortificação que

apresentou baixo percentual (81,7), entretanto os níveis 2 e 3 apresentaram exatidão

excelente de acordo com os critérios do manual AOAC, sendo que o exigido para a

concentração obtida é entre 90 e 107%. A DEBARB apresentou exatidão adequada nos

três níveis de fortificação, uma vez que para as concentrações obtidas, os percentuais

exigidos são entre 80 e 110%.

Os percentuais de recuperação no extrato de P. barbatus para BARB

apresentaram boa exatidão, sendo que o nível 1 ficou fora do limítrofe, porém muito

próximo, sendo o exigido entre 80 e 110% e o obtido 112,6. A DEBARB apresentou

percentuais dentro do exigido nos níveis 1 e 2, mas fora no nível 3.

78


A recuperação de DEBARB apresentou percentuais adequados nos níveis 1 e 2,

e muito próximo no nível 3 para no extrato das folhas de P. ornatus, mostrando também

percentual adequado nos três níveis de fortificação no extrato das folhas de P.

amboinicus . A análise dos dados obtidos permite considerar os métodos desenvolvidos

exatos para os dois marcadores (BARB e DEBARB) em P. grandis e P. barbatus e para

DEBARB em P. ornatus e P. amboinicus, uma vez que os valores estão muito próximos

dos limites

Precisão

Precisão intradia

A precisão intradia foi avaliada pela injeção em triplicata de três níveis de

concentração para BARB e DEBARB, separadamente. Os desvios padrão relativos

foram calculados com base nas concentrações observadas (Tabela 16).

Tabela 16 – Determinação da precisão intradia

Amostra Nível de concentração

BARB Concentração

(ppm)

DEBARB Concentração

(ppm) 1 1 87,69 71,12 2 82,81 66,57 3 88,12 70,07

DPR (%) 3,42 3,,44 1 2 172,28 131,60 2 170,53 123,11 3 177,52 127,06

DPR (%) 2,10 3,34 1 3 666,93 326,16 2 678,68 317,76 3 693,02 319,93

DPR (%) 1,92 1,36

Os desvios-padrão relativos (DPR) da precisão intradia para BARB variam de

1,92 a 3,42%, estes valores percentuais são considerados precisos de acordo com os

critérios estabelecidos pela AOAC, em que para o nível de concentração 1 o valor aceito

deve ser menor do que 7,3% e deve ser menor do que 5,3% para os níveis 2 e 3. As

análises com DEBARB também apresentaram boa precisão, uma vez que seus desvios

padrão relativos variam entre 1,36 e 3,44%, estando todos de acordo com os critérios

AOAC, que estipula 7,3% no nível 1 de concentração e 5,3% para os níveis 2 e 3, que

79


estão no mesmo patamar de concentração, de acordo com a Tabela 12 que correlaciona

os desvios padrão relativos com a concentração do analito.

Precisão interdias

A precisão interdia foi avaliada pela injeção em triplicata de três concentrações

distintas de BARB e DEBARB ao longo de dois dias de análise (n = 18). Os teores e os

desvios padrão relativos foram calculados para cada substância de referência.

Tabela 17 - Terminação da precisão interdias para três níveis de concentração de BARB e DEBARB.

Dia Amostra

Nível de conc.

BARB (ppm)

DEBARB (ppm)

1 1 1 117,96 95,72 2 103,14 98,06 3 108,72 97,71

2 1 116,68 102,39 2 107,44 98,28 3 104,26 102,15

DPR (%) 5,70 2,68 1 1 2 202,86 152,09

2 207,35 150,04 3 202,55 150,22

2 1 215,39 169,43 2 219,35 169,17 3 213,44 167,84

DPR (%) 3,31 6,21 1 1 3 666,933 401,37

2 678,68 410,13 3 693,02 399,41

2 1 712,89 491,51 2 736,14 499,23 3 783,10 487,52

DPR (%) 6,01 10,95

A precisão interdias, naturalmente, apresentou desvios padrão relativos maiores

do que a precisão intradia, sendo que para a BARB apenas o nível 2 de concentração

ficou dentro do recomendado (≤ 5,3%) sendo que os níveis 1 e 3 ficaram próximos do

ideal, 5,70% e 6,01%, respectivamente. A precisão nas injeções interdias para DEBARB

apresentou o nível 1 de concentração dentro do recomendado, 2,68%, o nível 2 e 3 não

apresentaram boa precisão, estando acima do critério estabelecido pela AOAC,

entretanto, apenas o nível 3 ficou distante dos 5,3%.

80


Limite de Detecção (LD) A princípio, os limites de detecção (LD) de BARB e DEBARB foram estimados

pela equação que utiliza os parâmetros da regressão linear (LD = 3,3 σ/S; σ = Desvio

padrão do intercepto da curva analítica; S = Inclinação da curva analítica) (Tabela 18).

Tabela 18 - Limite de detecção dos marcadores químicos obtido pelos parâmetros da curva analítica.

Marcador Químico LD (µg/mL) BARB 19,5

DEBARB 13,7 LD = 3,3σ/S

Posteriormente, injetou-se concentrações decrescentes, em decaplicata, até obter

uma relação sinal ruído maior do que 3, S/N ≥ 3. A Tabela 19 apresenta os valores de

LD obtidos experimentalmente em decaplicata.

Tabela 19 - Limite de detecção obtida pela injeção em decaplicata.

Marcador químico

Conc. injetada (µg/mL)

Área DPR (%)

Branco 2546 (média)

BARB

0,015

11727

3,62

12392 12993 12023 12444 11522 11924 12142 11717 12383

Branco 2497 (média)

DEBARB

0,22

10972

2,31

11231 10704 11529 11280 11173 10932 11348 11510 11193

81


Limite de quantificação (LQ) A partir da equação de regressão, estimou-se os valores de limite de

quantificação para BARB e DEBARB, utilizando-se o desvio- padrão do intercepto e a

inclinação de cada curva analítica para estimar os respectivos limites (Tabela 20).

Tabela 20 - Limite de quantificação dos marcadores químicos obtido pelos parâmetros da curva analítica.

Marcador químico LQ (µg/mL) BARB 59,0 DEBARB 41,5

LQ = 10σ/S

O limite de quantificação foi determinado estabelecido experimentalmente pela

injeção em decaplicata da concentração que apresentou uma relação sinal/ruído maior

do que 10 (LQ = 10 S/N). A Tabela 21 expressa os valores dos limites de quantificação

para cada substância padrão e os desvios padrão relativos correspondentes.

Tabela 21 - Limite de quantificação obtida pela injeção em decaplicata.

Marcador químico

Conc. injetada (µg/mL)

Área (mAU) DPR (%)

BARB

0,1

18862

8,29

15650 15602 15180 15753 16205 17754 15644 14490 17535

DEBARB

0,6

39685

2,45

39257 40580 40066 40818 41037 38307 40203 41150 41575

82


A determinação dos limites de quantificação (LQ) e dos limites de detecção

(LD) pelas equações que se baseia nos parâmetros de curva analítica permitem estimar

valores de concentração em que se possam iniciar sucessivas diluições até chegar às

relações sinal/ruído desejadas para cada limite, obtendo-se, experimentalmente, o LQ e

o LD com mais precisão e exatidão.

83

6 – ATIVIDADES BIOLÓGICAS

CAPÍTULO 6

ATIVIDADES BIOLÓGICAS DOS EXTRATOS DE Plectranthus E BARBATUSINA

6.1.-Avaliação da Citotoxicidade In Vitro

A análise de citotoxicidade da barbatusina e dos extratos etanoicos de

Plectranthus grandis, Plectranthus barbatus, Plectranthus amboinicus e Plectranthus

ornatus foi avaliada pelo método do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-tiazolil)-

2,5-difenil-2H tetrazolina) para linhagem de células tumorais de MDA-MB435 (mama -

humano), HCT-8 (cólon - humano); e SF-295 (Glioblastoma – Humana). O ensaio

produziu os resultados reportados na Tabela 22. Este experimento foi realizado pelo

Laboratório de Oncologia Experimental da UFC (LOE), Departamento de Farmacologia

sob a coordenação da Profa. Dra. Letícia Lotufo.

Tabela 22 - Percentual de inibição do crescimento celular (IC%) das amostras em três linhagens tumorais testadas na dose única de 25µM.

Amostra SF 295 DPR MDA 435 DPR HCT-8 DPR

IC%

(média)

IC% (média)

IC%

(média)

Extrato de P.grandis (10mg/mL) 30,77% 1,59% 23,46% 3,18% 38,47% 5,87%

Extrato de P. barbatus (10mg/mL) 11,86% 0,88% 25,00% 2,99% 21,88% 1,05%

Extrato de P.

amboinicus (10mg/mL) 19,19% 2,63% 0,00% 0,00% 31,66% 5,37%

Extrato de P. ornatus (10mg/mL) 16,82% 1,28% 22,82% 2,27% 0,00% 0,00%

Barbatusina (5mg/mL) 100,00% 0,22% 94,74% 0,54% 99,21% 1,48%

84


A análise de citotoxicidade foi efetuada segundo o método MTT (Mosmann,

1983) se baseia em uma reação colorimétrica resultante da conversão do sal de MTT em

azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas células

metabolicamente ativas. Nesse método são selecionadas as frações com percentual de

inibição do crescimento tumoral (IC) maior que 90 % sobre todas as linhagens

utilizadas (IC% > 90 %).

Das amostras testadas, somente a barbatusina se mostrou promissora por seu

elevado percentual de inibição de crescimento das células tumorais de mama (94,74 %),

cólon (99,21 %) e glioblastoma (100,00 %) (Tabela 22), justificando também a

considerável atividade do extrato etanoico das folhas de P. grandis que contém

barbatusina em grande quantidade, 126,7 ppm em extrato diluído a 500 ppm, ou seja,

25,34% em massa do extrato.

As substâncias barbatusina, 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina e OXB foram

submetidas ao teste de citotoxicidade para a linhagem de células HCT-116 (Carcinoma

de cólon humano), os resultados estão apresentados na Tabela 23.

Tabela 23 - Valores de IC50 para a barbatusina, 3-β-hidroxi-3-deoxobarbatusina e OXB.

Amostra IC50 (CI95%) µg/mL R2

barbatusina 7.46 (3.01 - 18.50) 0.8009

deoxobarbatusina 12.58 (4.74 - 33.38) 0.8865

OXB 1.53 (0.08 - 29.53) 0.6048

OXB – Oxima da barbatusina

Observa-se um aumento da atividade da OXB com relação à sua precursora,

barbatusina, evidenciado pela redução do IC50 de 7,46 µg/mL para 1,53 µg/mL, o que

faz crer em uma relação de estrutura e atividade ao modificar quimicamente o carbono 3

da barbatusina de cetona para oxima.

85


6.2-Potencial larvicida dos extratos de Plectranthus frente a Aedes aegypti

Os ensaios de atividade larvicidas foram realizados no Laboratório de Produtos

Naturais da UFC. As larvas de Aedes aegypti foram cedidas pelo NUVET (Núcleo de

Vetores do Estado do Ceará) e foram utilizados dois tipos: Rockfeller (controle) e Pan.

O ensaio foi realizado em triplicata utilizando-se 25 larvas em cada replicata.

Tabela 24 - Número de larvas mortas para as espécies de Plectranthus nas concentrações estudadas.

Número de larvas mortas

100 ppm 250 ppm 500 ppm 1000 ppm

P. amboinicus 0, 0, 0 1, 0, 0 0, 0, 0 14, 24, 4

P. barbatus 4, 0, 1 3, 4, 3 15, 22, 17 22, 25, 24

P. grandis 2, 1, 1 6, 1, 0 3, 7, 11 24, 24, 25

P. ornatus 1, 0, 1 8, 6, 5 25, 1, 23 24, 20, 24

O Gráfico 4 ilustra os resultados da atividade larvicida dos extratos apresentados

na Tabela 24.

Gráfico 4 - Concentração x percentual de mortalidade das larvas de Aedes aegypti.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

100 250 500 1000

P. amboinicus

P. barbatus

P. grandis

P. ornatus

86


A partir do gráfico obtido (Gráfico 4), foi possível encontrar a concentração letal que

ocasiona morte em 50% das larvas e em 99% larvas através do método da regressão

linear. Os valores obtidos estão listados na Tabela 25, abaixo.

Tabela 25 - Valores de concentração letal para a mortalidade de 50 e 99% das larvas do mosquito Aedes aegypti para as espécies de Plectranthus.

CL50 (ppm) CL99 (ppm)

P. amboinicus 721,26 1269,85

P. barbatus 566,65 1051,13

P. grandis 637,98 1076,24

P. ornatus 561,07 1080,96

De acordo com Cavalcanti (2004), somente extratos com CL50 abaixo de

100ppm são considerados importantes para a atividade larvicida, Silva et al (2004)

propõe que os testes sejam feitos com as frações do extrato, pois estas apresentam

melhores resultados que os extratos brutos. Todas as espécies de Plectranthus estudadas

apresentaram mortalidade eficaz das larvas para concentrações acima de 1000 ppm, o

que indica baixo potencial larvicida destas amostras.

87

7 – PARTE EXPERIMENTAL

CAPíTULO 7

PARTE EXPERIMENTAL 7.1 – Métodos Cromatográficos

As cromatografias de adsorção em colunas foram desenvolvidas utilizando-

se gel de sílica 60 da VETEC (φ mm 0,063 – 0,200). Os comprimentos e diâmetros das

colunas variaram de acordo com as alíquotas das amostras a serem cromatografadas e

com as quantidades de adsorventes a serem utilizados.

Nos processos cromatográficos em camada delgada analítica (CCD) foram

utilizadas placas de vidro nas dimensões de 10 X 5 cm, sendo uma das faces recobertas

por camada com 0,5 mm de espessura constituída de gel de sílica 60G da VETEC, além

de, cromatoplacas de gel de sílica 60 (φ mm 0,002 – 0,0250) sobre alumínio.

As revelações das substâncias nas cromatografias em camadas delgadas

foram realizadas através da exposição destas à radiação ultravioleta (UV) em dois

comprimentos de onda (254ηm - 365ηm), emitidas por lâmpada modelo UVLS – 28 da

Sovereign Computer Systems Usou-se também a câmara saturada com vapores de iodo

e ainda as soluções reveladoras que variaram de acordo com o comportamento químico

das substâncias analisadas, utilizando-se desta forma os seguintes reveladores:

*Solução de Vanilina – vanilina (C8H8O3), ácido perclórico (HClO4) e

etanol (C2H6O). Na seguinte proporção - etanol: ácido perclórico (9:1) mais uma

pequena porção de vanilina (meia espátula).

*Solução Universal – ácido sulfúrico (H2SO4), anidrido acético (C4H6O3) e

etanol (C2H6O). Na seguinte proporção - (0,5:0,5:9) respectivamente

Efetuada a escolha do revelador adequado, as placas foram pulverizadas, e

submetidas em aquecimento em estufa a 100°C por aproximadamente 4 minutos.

Os solventes utilizados para eluição das amostras nas colunas e placas

cromatográficas foram: hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol, puros ou em

misturas binárias numa ordem crescente de polaridade. Os solventes eram de qualidade

P.A ou foram destilados antes do uso.

Os extratos e frações das colunas cromatográficas foram concentrados sob

pressão reduzida em rotavapor Buchi, modelo R – 114, conectado a banho maria Buchi

Waterbath, modelo B – 480, com condensador resfriado por resfriador circulatório

88


Polyscience, modelo 911, e condensador acoplado a bomba de vácuo Brinkmann,

modelo B – 169.

7.2 – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN

1H) e Carbono

(RMN13C).

Os espectros de RMN 1H e de RMN 13C foram registrados em

espectrômetros Bruker modelo Avance DPX - 300 e modelo Avance DRX – 500,

operando na frequência do hidrogênio a 300 MHz e 500 MHz e na frequência do

carbono a 75 MHz e 125 MHz, respectivamente.

O solvente utilizado nas dissoluções das amostras para obtenção dos

espectros foi: clorofórmio deuterado (CDCl3). Os deslocamentos (δ) foram expressos

em parte por milhão (ppm) e referenciados no caso dos espectros de RMN 1H, pelos

picos dos hidrogênios pertencentes às moléculas residuais não deuteradas do solvente

deuterado utilizado: clorofórmio δ 7,27. Nos espectros de carbono – 13C, os

deslocamentos químicos (δ) foram referenciados pelos picos dos carbonos – 13C dos

solventes: clorofórmio (δ 77,23).

As multiplicidades das bandas de absorção dos hidrogênios nos espectros de

RMN 1H foram indicadas segundo a convenção: s (singleto), sl (singleto largo), d

(dupleto), dd (duplo dupleto) t (tripleto), dt (dupleto de tripleto).qd (quarteto de dupleto)

m (multipleto), td (tripleto de dupleto)

O padrão de hidrogenação dos carbonos em RMN

13C foi determinado

através do emprego da técnica DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization

Transfer) com ângulo de nutação de 135°, CH e CH3 com amplitude em oposição aos

CH2, e foi descrito conforme a convenção: C (carbono não hidrogenado), CH (carbono

metínico), CH2 (carbono metilênico), e CH3

(carbono metílico). Os carbonos não

hidrogenados foram caracterizados pela subtração do espectro DEPT 135 do espectro

BB.

Os ensaios de quantificação e validação dos métodos analíticos de

barbatusina de 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina foram realizados em Cromatógrafo

líquido de alta eficiência, Shimadzu UFLC, com detector de arranjo de diodos, SPD-

M20A; coluna analítica Phenomenex® Luna 5u C18(2) 100A (250 x 4,60 mm, 5 µm);

Pré-coluna Phenomenex®.

89


7.3 – Ponto de Fusão

Os pontos de fusão foram determinados no equipamento da Microquímica

modelo APF – 301. As determinações foram realizadas a uma velocidade de

aquecimento de 2°C/min.

7.4 – Coleta das Plantas Estudadas.

Para o estudo fitoquímico do gênero Plectranthus foi selecionada uma

espécie, Plectranthus grandis (Cramer) Willense, para estudo dos constituintes fixos.

As folhas e caule de P. grandis foram coletados em 10 de agosto de 2010 as 10 h no

Horto de Plantas Medicinais Francisco José de Abreu Matos da Universidade Federal

do Ceará (HPM-FJAM/UFC), pelos técnicos agrícolas Francisco Sales e Diego Dias,

ambos da equipe do Horto de Plantas Medicinais Francisco José de Abreu Matos –

UFC. As outras três espécies estudadas, Plectranthus barbatus, Plectranthus ornatus e

Plectranthus amboinicus, foram coletadas em novembro de 2012 pelo técnico agrícola

Francisco Sales.

As quatro espécies tiveram suas exsicatas depositadas no Herbário Prisco Bezerra-UFC

com os seguintes números de registro:

Plectranthus grandis (Cramer) Willense: 28377

Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng: 28601

Plectranthus barbatus Andr: 24408

Plectranthus ornatus Codd: 31929

7.5 - Isolamento dos Constituintes Químicos de Plectranthus grandis.

7.5.1 - Obtenção do Extrato Etanoico das Folhas de Plectranthus grandis.

As folhas frescas (17,6 kg, 88,6 % de umidade) foram coletadas no Horto de

Plantas Medicinais Francisco José de Abreu Matos em Agosto de 2010, secas em

temperatura ambiente obtendo-se 3,6 Kg de folhas secas e trituradas, submetidas à

extração exaustiva em temperatura ambiente com etanol durante 15 dias, obteve-se 297

90


g de extrato de coloração escura, denominado PGE, após destilação do solvente, sob

pressão reduzida.

7.5.2-Fracionamento do Extrato Etanoico (PGE)

O extrato etanoico PGE (297 g) foi dissolvido em 3000 mL de mistura de

Água/Metanol (40/60) e a solução submetida a extrações líquido-líquido em funil de

separação de 1000 mL, usando como solventes hexano, diclorometano e acetato de etila

e n-butanol. O rendimento das partições está descrito na Tabela 26.

Tabela 26 - Fracionamento de PGE por partição líquido-líquido.

Solvente Frações Peso

Hexano PGEPH 16 g

Diclorometano PGEPD 60 g

Acetato de etila PGEPA 10g

n-Butanol PGEPB 42g

Total

Rendimento

128 g

43 %

A fração diclorometano PGEPD (60 g), obtida da partição líquido-líquido

do extrato PGE, foi adsorvida em 95 g de sílica gel e submetida à cromatografia filtrante

em coluna de 55 mm de diâmetro com 115 g de sílica, durante 28,5 horas ininterruptas,

utilizando-se como eluentes o hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol. Em

seguida os eluentes foram destilados em evaporador rotativo, sob pressão reduzida,

gerando os resultados apresentados na Tabela 27.

Tabela 27 - Fracionamento de PGEPD em coluna de sílica gel

Eluente Frações Peso

Hexano PGDPH 0g

Diclorometano PGDPD 15 g

Acetato de etila PGDPA 25 g

Metanol PGDPM 8 g

Total

Rendimento

48 g

80 %

91


7.5.3-Isolamento de PGD-1. A fração diclorometano obtida da coluna de PGEPD, após um repouso de

cinco dias, apresentou cristais presos ao vidro no fundo do recipiente em que foi

coletada a fração. Os cristais foram coletados com uma pinça, obtendo-se 193 mg dos

cristais translúcidos (Figura 50), porém impregnados de extrato.

Figura 50 – Registro fotográfico dos cristais obtidos da fração diclorometano de PGEPD

Os cristais foram lavados com cinco porções de 1 mL de éter dietílico e em

seguida lavados com cinco porções de 1 mL de metanol, o que resultou em 130 mg de

amostra com aspecto cristalino em forma de agulhas de coloração levemente amarelada

(Figura 51). A amostra apresentou apenas uma mancha em CCD com Rf 0,60 em

diclorometano/acetato de etila 30%, o ponto de fusão foi determinado em 215-216° C,

sendo denominado de PGD-1, identificada por métodos espectroscópicos de

Ressonância Magnética Nuclear como sendo a barbatusina, diterpeno do tipo abietano

(Fluxograma 1, página 93).

92

Figura 51 – Registro fotográfico dos cristais de PGD-1

Fluxograma 1 - Obtenção e fracionamento do extrato etanoico das folhas de P. grandis (PGE)

Secas em temperatura ambiente, trituradas (3,5 Kg) e extraídas com etanol

PGDPH

0 g

PGDPD

15 g

PGDPA

25 g

PGDPM

8 g

PGE-297g

PGEPH

16 g

PGEPD

60 g

PGEPA

10 g

PGEPB

Fracionamento cromatográfico

Folhas frescas

(17,640 Kg)

Partição com hexano, diclorometano, acetato de etila e n-butanol

PGD-1

3,3745 g

DB-1

30 mg

PGD-2

39 mg

NaBH4

OXB

25 mg

93


A fração PGEPD foi concentrada e dissolvida novamente em

diclorometano, deixada em repouso por cinco dias e dessa forma houve a cristalização

de mais substância, repetindo-se as lavagens com éter dietílico e metanol, obteve-se um

total de 3,3745 g de barbatusina. Esta considerável quantidade possibilitou a

derivatização da barbatusina como forma de obtenção de substâncias inéditas na

literatura e a avaliação de atividades biológicas da barbatusina e de seus derivados.

7.5.4 - Isolamento de PGD-2

Além da barbatusina foi possível isolar também a PGD-2 por CCD

preparativa de 150 mg da mistura barbatusina/PGD-2, utilizando como eluente a

mistura de diclorometano e acetato de etila 0,7:0,3. A substância PGD-2 foi retirada na

altura de R.F. 0,2-0,5 e a barbatusina foi parcialmente recuperada retirando-a da placa

preparativa na região de R.F. 0,5-0,8. Este procedimento permitiu o isolamento de 8 mg

de PGD-2. Posteriormente, o fracionamento cromatográfico de PGPD forneceu mais 31

mg, totalizando 39 mg de PGD-2.

A partir dos espectros de RMN 1H e RMN 13C de PGD-2 foi possível

determinar sua estrutura (Determinação estrutural PGD-2, página 38) como sendo a 3β-

hidroxi-3-deoxobarbatusina, também obtida por redução da barbatusina antes de seu

isolamento como produto natural.

7.6 - Derivatização da Barbatusina

7.6.1 - Obtenção de 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina (DB-1)

A barbatusina foi submetida a reação com NaBH4 em metanol para a

redução do carbono na posição 3, da carbonila ao álcool correspondente. Reagiu-se 500

mg de barbatusina com 40 mg de NaBH4 em 10 mL de metanol a temperatura ambiente

(25 °C – 30 °C), sob agitação durante 3 horas. Após a reação, adicionou-se 1 mL de

HCl 1 mol.L-1 para neutralizar o meio, o solvente foi evaporado a vácuo em evaporador

rotativo, o produto foi purificado em coluna cromatográfica de gel de sílica e

identificado por RMN 1H e RMN 13C (Determinação estrutural DB-1, página 41), o

esquema 3 ilustra a reação.

94


Esquema 3 - Reação de redução da barbatusina.

7.6.2 – Obtenção do produto de hidrólise A – Em 25 mL de água, adicionou-se 1,25 ml de HCl concentrado em

seguida submeteu-se 50 mg de barbatusina a este meio reacional sob agitação por 18

horas. O produto reacional foi extraído do meio por partição líquido-líquido com 3

porções de 10 mL de diclorometano. Em seguida o produto reacional foi submetido à

coluna cromatográfica para purificação dos constituintes da mistura (Esquema 4).

Esquema 4 - Reação de hidrólise ácida da Barbatusina

B – Em 60 mL de metanol foi adicionado 92 mg de NaOH e 50 mg de

barbatusina. A reação procedeu-se durante 6 horas e sob agitação e refluxo a 75-80° C.

Ao final da reação adicionou-se 0,2 mL de HCl para neutralizar o meio, em seguida o

metanol foi evaporado em evaporador rotativo (Esquema 5).

Esquema 5 - Reação de hidrólise alcalina, em metanol, da Barbatusina

OAc

OAc

OHO

O

O

H

NaBH4/MeoH

OAc

OAc

OHHO

O

O

H

3hrs, temperatura ambiente

O

OAc

OAc

OH

O

O

50 mg

O

OH

OH

OH

O

O

H2O/H+

18 hrs, sob agitação

O

OAc

OAc

OH

O

O

50 mg

O

OH

OH

OH

O

O

MeOH/MeO-

6 hrs, sob agitação e refluxo

95


C – Para esta hidrólise ácida utilizou-se 1 mL de HCl concentrado, em

quantidade catalítica, em 20 mL de metanol, durante 3 horas, sob refluxo a 75-80° C.

Em seguida o metanol foi evaporado em evaporador rotativo (Esquema 6).

Esquema 6 - Reação de hidrólise ácida, em metanol, da Barbatusina

7.6.3 – Obtenção do produto de metilação

A – Partindo-se de 200 mg de barbatusina, adicionou-se 28 µL de CH3I

(63,9 mg) e 48 mg de Na2CO3 em acetona. A barbatusina ficou submetida por 3 horas

sob agitação e refluxo na temperatura de 65-70° C. O solvente foi evaporado a

temperatura ambiente (Esquema 7).

Esquema 7 - Reação de metilação da Barbatusina com base fraca

O

OAc

OAc

OH

O

O

O

OH

OH

OH

O

O

MeOH/H+

3 hrs, sob agitação e refluxo

O

OAc

OAc

OH

O

O

200 mg

O

OAc

OAc

OCH3

O

O

CH3I, Na2CO3

3 hrs, sob agitação e refluxo65° C, Acetona

96


B – Em 20 mL de DMSO foi adicionado 6,97 µL de CH3I (16 mg), 6,3 mg

de KOH e 50 mg de barbatusina. Durante 3 horas, sob 30° C, a reação foi mantida sob

agitação e ao final da reação adicionou-se 50 mL de água e foi efetuada uma partição

líquido-líquido com 3 porções de 20 mL de diclorometano (Esquema 8).

Esquema 8 - Reação de metilação da Barbatusina com base forte

C – Partindo-se de 50 mg de barbatusina, 2,38 µL de éter coroa (18-crown-

6), 12,58 mg de terc-ButO-K+ e utilizando 20 mL de tolueno como solvente, a reação se

procedeu por 6 horas sob agitação e temperatura de 65° C. O tolueno foi evaporado em

evaporador rotativo (Esquema 9).

Esquema 9 - Reação de metilação da Barbatusina com éter coroa

O

OAc

OAc

OH

O

O

50 mg

O

OAc

OAc

OCH3

O

O

CH3I, KOH

3 hrs, sob agitação30° C, DMSO

O

OAc

OAc

OH

O

O

50 mg

O

OAc

OAc

OCH3

O

O

CH3I, tert-ButO-, 18-crown-6

6 hrs, sob agitação65° C, Tolueno

97


7.6.4 – Obtenção do produto de benzilação A – Em 20 mL de acetona adicionou-se 200 mg de barbatusina, 48 mg de

Na2CO3, 54 µL de brometo de benzila. Manteve-se a temperatura de 65° C para refluxar

o solvente e manteve-se o meio reacional sob agitação durante 3 horas. O solvente foi

evaporado em temperatura ambiente (Esquema 10).

Esquema 10 - Reação de benzilação da Barbatusina

7.6.5- Reação de Formação da oxima (OXB)

Em um balão reacional foram adicionados 30 mg de barbatusina, 108 mg (0,116

mmol) de cloridrato de hidroxilamina a 25°C, usando metanol anidro (3,0 mL) como

solvente e peneira molecular 3A. A mistura reacional foi mantida sob agitação por 6

horas. A extração dos produtos foi feita com acetato de etila, após adição de água

gelada.

NHO

OAc

OH

O

O

OAc

NH2OH.HCl

MeOHO

OAc

OH

O

O

OAc

Esquema 11 - Reação de produção da oxima

7.6.6 – Avaliação da Decomposição da Barbatusina em Meio Alcalino

Em 1 mL de D2O foram adicionados 30 mg de barbatusina e o meio foi

alcalinizado com 1 mg de NaOH. Durante duas semanas, sob agitação e à temperatura

O

OAc

OAc

OH

O

O

200 mg

O

OAc

OAc

O

O

O

C7H7Br, Na2CO3

3 hrs, sob agitação e refluxo65° C, Acetona

83,3%

98


ambiente. A reação foi acompanhada através de espectroscopia de RMN 1H com

obtenção do espectro em equipamento Bruker DPX 300 MHz.

7.6.7.- Reatividade da Barbatusina em Reações Biocatalíticas

Foram realizadas duas triagens, monitoradas por CCD, para avaliar a

reatividade da barbatusina com enzimas comerciais e fungos ambientais. Os

experimentos consistem em submeter o substrato a meios reacionais e observar se

ocorrem reações com enzimas e/ou fungos testados.

I - Triagem com enzimas

Preparou-se seis meios reacionais, em cada um deles continha 3 mg de

barbatusina dissolvida em 40 µL de acetona e 160 µL de tampão fosfato 0,1 mol.L-1 de

ph 7,0. A cada um dos meios reacionais foi adicionado uma enzima diferente, RMIM,

lipase de B. cepaceae, Cal-B, lipase PS-IM, PPL, lipase de Candida rugosa e um branco

contendo a barbatusina, acetona e o tampão fosfato nas mesmas quantidades. A reação

ocorreu durante 48 h em equipamento de incubadora shaker a temperatura de 30 °C.

II - Triagem com fungos

A avaliação da reatividade da barbatusina foi realizada com oito fungos

ambientais, não identificados, e em cada meio reacional utilizou-se 250 mg do micélio

de cada fungo, 3 mg da barbatusina dissolvida em 1 mL de DMSO e 4 mL de tampão

fosfato 0,1 mol.L-1 de pH 7,0, além de um branco contendo a barbatusina, DMSO e

tampão nas quantidades citadas. A reação ocorreu durante 72 h em incubadora shaker a

temperatura de 30 °C.

7.7 - Atividades Biológicas

7.7.1 - Avaliação da Citotoxicidade in vitro da Barbatusina

Em experimento realizado pelo Laboratório de Oncologia Experimental da

UFC (LOE), avaliou-se a citotoxicidade, pelo método do MTT, as atividades da

barbatusina e dos extratos etanoicos de Plectranthus grandis, Plectranthus barbatus,

Plectranthus amboinicus e Plectranthus ornatus. Trata-se de uma análise colorimétrica

baseada na conversão do sal brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-

tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes

99


somente nas células metabolicamente ativas. O estudo citotóxico pelo método do MTT

permite definir facilmente a citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação (BERRIDGE

et al., 1993).

A barbatusina e os extratos de Plectranthus estudados foras testados para as

seguintes linhagens tumorais: MDA-MB435 (mama - humano), HCT-8 (cólon -

humano); e SF-295 (Glioblastoma – Humana), foram cedidas pelo Instituto Nacional do

Câncer (EUA), tendo sido cultivadas em meio RPMI 1640, suplementados com 10 % de

soro fetal bovino e 1 % de antibióticos, mantidas em estufa a 37 °C e atmosfera

contendo 5% de CO2.

7.7.2 - Avaliação do Potencial Larvicida (utilizando as larvas de Aedes aegypti)

Neste teste avaliou-se o potencial larvicida dos extratos etanoicos de

Plectranthus grandis, P. barbatus, P. amboinicus e P. ornatus. Para isto, foram

utilizados dois tipos de larvas; as denominadas Rockfeller, que funcionaram como

grupo controle, e as denominadas PAN, que é uma população de larvas resistentes

obtidas no bairro Panamericano em Fortaleza-Ce. Essas larvas foram cedidas pelo

NUVET (Núcleo de Vetores) da Secretaria de Saúde do Estado do Ceará.

De acordo com Cavalcanti et al (2004), foram preparadas soluções de 100,

250, 500 e 1000 ppm dos extratos com água e DMSO. Essas amostras foram colocadas

em recipientes de vidro de 50 mL e logo após, foram colocadas 25 larvas de Aedes

aegypti de 3º estágio dos dois grupos em contato com as soluções por 24h. Logo após

esse período foram feitas as contagens das larvas que morreram. Os testes foram feitos

em triplicata.

100

8 - CONCLUSÃO

CAPITULO 8

CONCLUSÃO A variabilidade qualitativa e quantitativa dos constituintes bioativos pode

influenciar a ação terapêutica apresentada pela planta, sendo necessário um

conhecimento mais completo possível, dos parâmetros que envolvem e promovem esta

quimiodiversidade.

A presença relatada de diterpenos de esqueleto abietanos em P. grandis, que são

conhecidos por sua diversidade de atividades farmacológicas, notadamente barbatusina,

justifica a continuação de estudo da espécie, com o desenvolvimento de extração

seletiva de barbatusina, desenvolvimento e validação de métodos analíticos para a

quantificação dos marcadores químicos barbatusina e 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina

visando contribuir para a padronização química de espécies do gênero Plectranthus.

A substância denominada de PGD-1 foi identificada, através de métodos

espectrométricos e comparação com dados da literatura, como sendo a barbatusina, já

conhecida na literatura.

A substância denominada de PGD-2 também foi identificada através de métodos

espectrométricos como sendo o diterpeno 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina.

Através da derivatização da barbatusina foi obtida a substância denomina de

DB-1, obtida através da reação de redução com NaBH4, com baixo rendimento (6%)

que é também o diterpeno 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina.

A substância denominada OXB (oxima da barbatusina) foi obtida pela

derivatização da barbatusina com cloridrato de hidroxilamina com excelente rendimento

(83%) e foi identificada através de vários métodos espectrométricos. Não foi encontrada

correlação na literatura para esta molécula que está sendo relatada pela primeira vez.

Reações de hidrólise, metilação e benzilação da barbatusina também foram

realizadas, utilizando-se condições ácidas e brandamente alcalinas, mas não se obteve

êxito nestas reações, embora nas reações realizadas com base forte um produto de

degradação da barbatusina denominado PDB que não identificado tenha sido obtido.

101

8 - CONCLUSÃO

Foi realizado um estudo da avaliação da reatividade biocatalítica da barbatusina

com enzimas e com fungos, mas não ocorreu nenhuma modificação química na

barbatusina com estes bioensaios.

Desenvolveu-se um método analítico de validação, através de CLAE-DAD, dos

marcadores químicos, barbatusina e 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina, com as quatro

espécies do gênero Plectranthus (P. grandis, P. barbatus, P. ornatus e P. amboinicus),

de acordo com resoluções do guia ICH, da resolução da ANVISA N899 e dos critérios

estabelecidos pela AOAC (2011). Observou-se que os percentuais de recuperação de

BARB e DEBARB nos extratos da quatro espécies analisadas apresentaram exatidão

adequada de acordo com os critérios estabelecidos pela AOAC.

Avaliou-se a citotoxicidade in vitro dos extratos de Plectrantus e da barbatusina

para linhagem de células tumorais de mama, cólon e glioblastoma. Somente a

barbatusina se mostrou promissora por seu elevado percentual de inibição de

crescimento das células tumorais, justificando a atividade do extrato etanoico das folhas

de P. grandis, que contêm barbatusina (25,34%).

Avaliou-se também a citotoxicidade da barbatusina, 3β-hidroxi-3-

deoxobarbatusina e OXB (oxima da barbatusina), com as linhagens de células HCT-116

e observou-se um aumento da atividade da OXB em relação à barbatusina de acordo

com os valore de IC50 obtidos para cada substância.

Realizou-se também a avaliação do potencial larvicida dos extratos de

Plectranthus frente ao Aedes aegypti, onde se observou que todas as espécies de

Plectranthus estudadas apresentaram mortalidade eficaz das larvas para concentrações

acima de 1000 ppm, o que indica baixo potencial larvicida destas amostras.

102

9 – CONSTANTES FÍSICAS

OAc

OAc

OHO

O

O

CAPÍTULO 9 CONSTANTES FÍSICAS E DADOS ESPECTROMÉTRICOS DOS

CONSTITUINTES QUÍMICOS OBTIDOS DE Plectranthus grandis

PGD-1

Aspectos Gerais

Nome = barbatusina

Fórmula Molecular = C24H30O8

Peso Molecular = 446

Ponto de Fusão = 215-216 °C

Aspecto Físico = sólido cristalino, sutilmente amarelado

Solubilidade = clorofórmio (CHCl3)

Espectrometria de RMN 1H(500 MHz, CDCl3) - δ (Multiplicidade Constante de

Acoplamento em Hz, Correlação estrutural ).

2,27 e 1,60 (m, H-1); 2,61-2,63 (m, H-2); 2,31(sl, H-5); 5,30 (sl, H-6); 4,62 (d, J 2,2; H-

7); 5,03 (s, H-12), 2,12 (m, H-15); 1,40 (dd, J 8,8-4,0; Hα-16); 1,06 (dd, J 7,3-4,0; Hβ-

16); 1,15 (sl, H-17); 1,24 (s, H-18); 1,17 (s, H-19); 1,67 (s, H-20); 2,03 (s, AcO-6); 2,11

(s, AcO-12).

Espectrometria de RMN 13C (125 MHz, CDCl3) - δ (Padrão de hidrogenação,

Correlação estrutural ).

214,9 (C,C3); 46,93 (C, C4); 141,20 (C, C8); 153,50 (C, C9); 38,29 (C, C10); 194,40 C,

C11) 34,92 (C, C13); 196,01 (C, C14); 170,18 (AcO-6); 169,80 (AcO-12); 46,90 (CH,

C5); 70,68 (CH, C6); 63,97 (CH, C7); 77,78 (CH, C12); 22,26 (CH, C15); 35,05 (CH2,

C1); 33,81 (CH2, C2); 26,05 (CH2, C16); 13,15 (CH3, C17); 28,04 (CH3, C18); 22,45

(CH3, C19); 21,09 (CH3, C20); 21,57 (AcO-6); 20,84 (AcO-12).

103


PGD-2 Aspectos Gerais

Nome = 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina Fórmula Molecular = C24H32O8



Aspecto Físico = sólido cristalino, sutilmente amarelado



Acoplamento em Hz, Correlação estrutural ) (fig. 44, pág. 95).

2,03 e 1,06 (m, H-1); 1,80-1,26 (m, H-2); 1,56 (sl, H-5); 5,52 (sl, H-6); 4,53 (d, J 2,2;

H-7); 5,31 (s, H-12), 2,18 (m, H-15); 1,35 (dd, J 9,0-3,0; Hα-16); 1,04 (m; Hβ-16); 1,14

(d, J 6,0, H-17); 1,17 (s, H-18); 1,02 (s, H-19); 1,70 (s, H-20); 2,07 (s, AcO-6); 2,10 (s,

AcO-12).


Correlação estrutural ).

76,78 (C,C3); 38,67 (C, C4); 140,68 (C, C8); 155,57 (C, C9); 39,32 (C, C10); 194,40 C,

C11) 35,01 (C, C13); 196,38 (C, C14); 170,14 (AcO-6); 169,85 (AcO-12); 47,22 (CH,


C1); 27,51 (CH2, C2); 26,70 (CH2, C16); 13,08 (CH3, C17); 28,04 (CH3, C18); 17,11

(CH3, C19); 22,00 (CH3, C20); 20,86 (AcO-6); 21,59 (AcO-12).

OAc

OAc

OH

O

O

HO

104


DB-1

Aspectos Gerais

Nome = 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina

Fórmula Molecular = C24H32O8



Aspecto Físico = sólido cristalino, amarelado




2,03 e 1,06 (m, H-1); 1,77-1,24 (m, H-2); 1,57 (sl, H-5); 5,50 (sl, H-6); 4,52 (sl; H-7);

5,30 (s, H-12), 2,18 (m, H-15); 1,35 (dd, J 8,95-4,1; Hα-16); 1,04 (dd; J 7,15-4,15 Hβ-

16); 1,14 (d, J 6,4, H-17); 1,17 (s, H-18); 1,02 (s, H-19); 1,70 (s, H-20); 2,06 (s, AcO-

6); 2,10 (s, AcO-12).


Correlação estrutural).

76,98 (C,C3); 38,65 (C, C4); 140,71 (C, C8); 155,53 (C, C9); 39,31 (C, C10); 194,46 C,

C11) 34,93 (C, C13); 196,28 (C, C14); 170,32 (AcO-6); 169,94 (AcO-12); 47,08 (CH,


C1); 27,48 (CH2, C2); 26,82 (CH2, C16); 13,11 (CH3, C17); 28,04 (CH3, C18); 17,16

(CH3, C19); 22,01 (CH3, C20); 20,88 (AcO-6); 21,59 (AcO-12).

OAc

OAc

OH

O

O

HO

105


OXB

Aspectos Gerais

Nome = 3-hidroxiimina-3-deoxobarbatusina

Fórmula Molecular = C24H31NO8


Aspecto Físico = sólido cristalino, suavemente amarelado




2,92 e 2,66 (m, H-1); 2,16-1,25 (m, H-2); 2,00 (sl, H-5); 5,42 (sl, H-6); 4,59 (sl; H-7);

4,99 (s, H-12), 2,10 (m, H-15); 1,38 (dd, H-16); 1,06 (dd, H-16); 1,15 (d, H-17); 1,32 (s,

H-18); 1,25 (s, H-19); 1,71 (s, H-20); 2,04 (s, AcO-6); 2,92 (s, AcO-12).


Correlação estrutural )

17,72 (CH2, C1); 35,03 (CH2, C2); 164,97 (C, C3); 40,11 (C, C4); 47,19 (C, C5); 70,70

(CH, C6); 64,23 (CH, C7); 140,93 (C, C8); 154,61 (C, C9); 38,69 (C, C10); 194,45 (C,

C11); 77,96 (CH, C12); 34,99 (C, C13); 196,34 (C, C14); 22,05 (CH, C15); 26,44 (CH2,

C16 13,14 (CH3, C17); 29,03 (CH3, C18); 24,77 (CH3, C19); 21,28 (CH3, C20); 21,60

(CH3, OAc6); 20,88 (CH3, OAc12); 170,25 (C, OAc6); 169,90 (C, OAc12)

OAc

OAc

OHN

O

O

HO

106

10 - REFERÊNCIAS

CAPÍTULO 10

REFERÊNCIAS ABDEL-MOGIB, M.; ALBAR, H. A.; BATTERJEE, S. M.Chemistry of genus

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