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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
LUIZ CARLOS PEREIRA ALMEIDA FILHO
SEMENTES DE Lonchocarpus sericeus (Poir) Kunth ex DC COMO REPOSITÓRIO DE INIBIDORES DE PROTEASES: PURIFICAÇÃO E SEUS EFEITOS SOBRE O
CICLO DE VIDA DO MOSQUITO Aedes aegypti
FORTALEZA
2017
LUIZ CARLOS PEIREIRA ALMEIDA FILHO
SEMENTES DE Lonchocarpus sericeus (Poir) Kunth ex DC COMO REPOSITÓRIO DE INIBIDORES DE PROTEASES: PURIFICAÇÃO E SEUS EFEITOS SOBRE O CICLO DE
VIDA DO MOSQUITO Aedes aegypti
FORTALEZA
2017
Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal
Orientadora: Profa. Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará
Biblioteca UniversitáriaGerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
A448s Almeida Filho, Luiz Carlos Pereira. Sementes de Lonchocarpus sericeus (Poir) Kunth ex DC como repositório de inibidores de proteases :purificação e seus efeitos sobre o ciclo de vida do mosquito Aedes aegypti / Luiz Carlos Pereira AlmeidaFilho. – 2017. 90 f. : il. color.
Tese (doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Programa de Pós-Graduação emBioquímica , Fortaleza, 2017. Orientação: Profa. Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho.
1. Inibidor de quimotripsina. 2. Lonchocarpus sericeus. 3. Dengue. 4. Zika. I. Título. CDD 572
LUIZ CARLOS PEREIRA ALMEIDA FILHO
SEMENTES DE Lonchocarpus sericeus (Poir) Kunth ex DC COMO REPOSITÓRIO DE INIBIDORES DE PROTEASES: PURIFICAÇÃO E SEUS EFEITOS SOBRE O CICLO DE
VIDA DO MOSQUITO Aedes aegypti
Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal
Aprovada em _____/______/______.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________________
Profa. Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________________
Profa. Dra. Daniele de Oliveira Bezerra de Sousa
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________________
Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Olivera
Universidade Federal do Ceará (UFC
_________________________________________________
Dra. Carla Freire Celedonio Fernandes
Fundação Oswaldo Cruz (FioCruz)
_________________________________________________
Prof. Dr. Renato de Azevedo Moreira
Universidade de Fortaleza (Unifor)
Dedico este trabalho à memória do meu homem, meu Y, que hoje, não está mais ao meu lado fisico.
Luiz Carlos P. Almeida
AGRADECIMENTOS
Ao meu pai Luiz Carlos P. Almeida, pelo amor, pelo carinho, pelas palavras duras auferidas
em momentos certos, pelo cuidado, por ter deixado em mim o desejo de ser tão grande quanto
foi, por ter me ensinado a andar pelos bons caminhos, por ter me orientado (...) por ter deixado
em mim algo que não há palavras para descrever. Aonde quer que o sr. esteja, sempre te amarei
meu “gorduchinho”. Multíssimo obrigado papai!
Ao meu avô Jerônimo Sousa, por ter me propiciado uma infância tão rica e, hoje, saudosa, por
ter cuidado, por ter sido exemplo de dedicação para com os compromissos assumidos, pelo
amor. Pela saudade que hoje sinto. Multíssimo obrigado vovô!
Ao meu avô Pedro Henrique, por assumir tão prontamente o papel de pai e de avô, diante do
que ocorrera nesta minha jornada. Por ter me edificado e se tornado um porto, ainda, mais
seguro para o seu neto, seu “pingo-preto”. Muito obrigado vovô!
Às minhas avós Maria Nilce e Luiza Pereira, pelo cuidado e carinho voltados a mim desde
pequeno e nesses últimos anos, pelo amor de vó, pelos ensinamentos. Pelo sempre presente seio
materno/parteno a acalentar nossas perdas. Vocês fazem parte da sólida base do meu caráter.
Muito obrigado vovós!
À minha mãe Lúcia Cristyanne, por todo o amor, carinho e confiança durante todos esses anos,
em que crescemos juntos, amadurecemos ideias e aprendemos com nossos erros. Mesmo
estando longe, a sra. sempre se fez presente em minha vida. Obrigado pela vida, pelo carinho
incondicional, pelo “amor de mãe”. Multíssimo obrigado mamãe!
Ao meu irmão Lucas Holanda, pela paciência e calma, pela diária convivência mesmo essa
sendo rara, pelas saídas, pelo apoio. Obrigado, irmão!
À minha irmã Luiziane Holanda, por ter se tornado um pilar de sustentação em minha vida,
pelas saudáveis brigas de irmãos, pelo carinho, pela dedicação em cuidar do “irmãozinho”, pelo
companheirismo e palavras confortantes em momentos difíceis, por ser minha amiga e fiel
confidente, pelo amor. Obrigado pequena, obrigado irmã!
À professora Dra. Ana de Fátima Fontenele U. Carvalho, pela orientação em seu laboratório,
por ter me ensinado nesses últimos seis anos valororos saberes, pelas sábias palavras, pelos
conselhos sempre bem postulados, pelos ensinamentos de vida e confiança a mim creditada,
pelas histórias, pelas risadas, sim RISADAS!, por sempre propiciar um ambiente de trabalho
amistoso e por despertar o desejo de seguir seus passos como mestra e tutora. À minha mãe
cientifica, o meu muitíssimo obrigado!
À professora Dra. Érika Mota Freitas, pela sempre serena convivência e energia, pelas
conversas e conselhos, pelo amor à Imunologia, por me orientar no ensino me fazendo crescer
desde a graduação. A ela, meu muito obrigado!
Aos professores Dra. Ilka Maria Vasconcelos e Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira, por terem
de tamanha prontidão aberto as portas dos seus laboratórios, pelas orientações e contribuições
em meus trabalhos de purificação, pelos valiosos conselhos e por terem de maneira tão
substancial feito parte da minha formação acadêmica. A eles, meu muito obrigado!
À professora Dra. Denise Hissa Cavalcante, pela alegria e sorriso contagiantes de todos os
encontros, pela ajuda com parte da caracterização molecular, pelas dicas e conselhos. Muito
obrigado, Denise!
À professora Daniele Sousa, pela amizade, pelo auto astral sempre presente em seu sorriso e
sua fala, pelo apoio, pelas discussões em torno dos trabalhos e por aceitar fazer parte da
avaliação desse trabalho contribuindo com ótimas sugestões. Muito obrigado!
Ao professor Renato Moreira, por aceitar participar da avalição deste trabalho e pelas valiosas
contribuições proferidas, pela alegria constante e por saber como “quebrar o gelo”. Muito
obrigado!
À Dra. Carla Celedônio, pela prontidão ao aceitar participar da avalição deste trabalho e pelas
valiosas contribuições proferidas. Muito obrigado!
Aos integrantes e amigos do Bioprospec, Davi Farias, Nathanna Mateus, Gabrielle Freire,
Leonardo Vieira, Jackeline Medeiros, Thaís Borges, Thiago Almeida, Joaquim Lopes,
Cláudio Dahne, Emanuel Francelino, Chayenne Sá, pela convivência sempre harmoniosa,
pelas risadas, pelos coffee breaks na copa, momentos esses sempre muito relaxantes, pelas
ajudas em experimentos ou mesmo discussão de resultados. Obrigado a todos vocês!
À doutora Lady Clarissa B. da Rocha Bezerra, por me mostrar que dois teimosos podem ser
bons amigos, pelas discussões sobre purificação, pela caracterização, pela convivência
amorosa, pelas confidencias, pela amizade sincera. Muito obrigado, Ladyinha!
Ao mestrando Pedro Matheus Sousa Tabosa, por ter me permitido crescer junto a ele no
mundo científico como seu coorientador de graduação, pelas ajudas em meus experimentos,
pela paciência, pelas dúvidas, pela convivência harmoniosa, pelas saídas relaxantes. Muito
obrigado, Pedrinho!
À Berenice Alves, pelos cuidados e carinho com todos nós, integrantes do Bioprospec e ao Sr.
Valdenor, por sempre manter o limpo nosso ambiente de trabalho, pelas risadas e por deixar
tudo 100! À eles, muito obrigado!
Aos amigos e integrantes do Labtox, Paulo Carvalho, Lucas Dias, Tiago Deivesson, Mariana
Reis, Helen Paula, Tarcymara Garcia, por todas as risadas que fizeram esses anos mais leves,
pela companhia de laboratório e encontros nos corredoress do departamento. Obrigado a todos!
À Luína Benevides e Gabriela Fernandes, por serem essas amigas e companheiras que levarei
por toda a minha vida, pela fiel amizade, pelas risadas. Não nego ao dizer que vocês fazem
parte do meu tesouro da graduação, meu muito obrigado!
Aos AMIGOS, por todos os momentos felizes que vivemos juntos, em especial a Cristiano
Regis Freitas e Ivan Sampaio, por serem aqueles irmãos que vida me trouxe, por sempre me
fazerem sentir feliz, pelos cuidados, por me fazerem rir mesmo em momentos tristes, por não
me deixarem desistir, pelos abraços amigos, pela amizade e amor sinceros. O meu muito
obrigado a vocês.
Obrigado a todos!
“É tão estranho os bons morrem jovens assim parece ser quando me lembro de você que acabou indo embora cedo demais...” (Renato Russo) “O sucesso é ir de fracasso em fracasso sem perder entusiasmo.” Winston Churchill
Este trabalho foi realizado graças ao auxílio das seguintes Instituições e Unidades:
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, Ceará
Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza,
Ceará.
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Centro de Ciências, Universidade Federal
do Ceará, Fortaleza, Ceará.
Departamento de Biologia, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza,
Ceará.
RESUMO
Arboviroses como a chikungunya, dengue e zika representam um problema sério em saúde
pública devido à ausência de uma vacina aprovada ou medicamentos antivirais específicos para
sua prevenção e tratamento. Uma das maneiras de evitar a ocorrência dessas doenças é através
do combate ao mosquito vetorial, Aedes aegypti. Este inseto pertence à ordem Diptera que
comumente possui enzimas digestivas similares à tripsina e quimotripsina. Os inibidores de
protease são moléculas que podem promover o bloqueio da atividade enzimática prejudicando
a digestão e a nutrição. Juntos, esses fatores podem levar à morte de insetos. Neste contexto,
purificamos um inibidor de protease de sementes de uma planta sub-explorada, Lonchocarpus
sericeus. Este inibidor foi submetido a caracterização bioquímica e avaliado quanto a atividade
inibitória sobre as proteases digestivas do intestino médio das larvas Ae. aegypti e seu efeito
inseticida sobre a eclodibilidade de ovos, desenvolvimento desse mosquito. O inibidor
purificado (LsCTI) mostrou uma única banda de proteína em SDS-PAGE, a massa molecular
determinada por MALDI-TOF-MS foi de 8.870,45 Da. LsCTI foi capaz de inibir mais de uma
protease serínica. As análises cinéticas revelaram o tipo de inibição não competitivo e o Ki
baixo para a quimotripsina (8,24 x 10-8 M). A resistência térmica do inibidor foi notável,
suportando aquecimento a 100 °C durante 180 min, sem perda de atividade. O valor da CI50 de
LsCTI para as enzimas do intestino médio das larvas de Ae. aegypti foi 4,7 x 10-7 M. O LsCTI
não afetou a eclodibilidade dos ovos quando testado a 0,3 mg.mL-1, mas causou alta taxa de
mortalidade larval (77%) e atraso no desenvolvimento (37%). Assim o LsCTI é um novo
inibidor de protease com características bioquímicas notáveis e uma nova ferramenta potencial
para controlar o desenvolvimento do mosquito Ae. aegypti.
Palavras-chave: Inibidor de quimotripsina. Lonchocarpus sericeus. Leguminosa. Dengue.
Zika.
ABSTRACT
Arboviroses such as chikungunya, dengue and zika represent a serious issue in public health
due to the absence of an approved vaccine or specific antiviral drugs for its prevention and
treatment. One of the ways to avoid the occurrence of these diseases is by combating the
mosquito vector, Aedes aegypti. This insect belongs to Diptera order, which commonly has
digestive enzymes similar to trypsin and chymotrypsin. Protease inhibitors are molecules that
can block enzymatic activity leading to an impairment of digestion and nutrition. Together,
these factors can lead the insects to death. In this context, we purified a new protease inhibitor
from seeds of an underexploited plant, Lonchocarpus sericeus. This inhibitor was subjected to
a biochemical characterization, evaluated for the inbitory activity upon the digestive proteases
from Aedes aegypti larvae and its insecticidal effect upon egg hatchability and larvae
development. The purified inhibitor (LsCTI) showed a single protein band on SDS-PAGE, the
molecular mass determined by MALDI-TOF-MS was 8,870.45 Da. LsCTI was able to inhibit
more than one serine protease. Kinetics analyzes revealed the type of noncompetitive inhibition
and a low Ki for chymotrypsin (8.24 x 10-8 M). The stability of the inhibitory activity was
remarkable for the thermal resistance, LsCTI supported heating at 100 ° C for 180 min without
losing its activity. The IC50 value of LsCTI was 4.7 x 10-7 M. for Ae. aegypti midgut enzymes.
LsCTI did not affect egg hatchability when tested at 0.3 mg.mL-1, but caused a high larval
mortality rate (77%) and developmental delay (37%). Thus, LsCTI is a novel protease inhibitor
with remarkable biochemical characteristics and a novel potential tool to control the Ae. Aegypti
development.
Keywords: Chymotrypsin inhibitor. Lonchocarpus sericeus. Legume seeds. Dengue. Zika.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Distribuição geográfica dos mosquitos Aedes aegypti..................................... 23 Figura 2 Distribuição geográfica do mosquito Aedes aegypti e probabilidade de
epidemias no Brasil em 2013........................................................................... 24 Figura 3 Caracterização esquemática do ciclo de vida de mosquitos pertencentes ao
gênero Aedes.................................................................................................... 26
Figura 4 Planta Lonchocarpus sericeus. (A) porte arbóreo; (B) flor dotada de
estandarte (pétala modificada); (C) fruto característico, legume seco
indeiscente e (D) sementes reniformes de coloração marrom......................... 36
Figura 5 Chromatographic profile of LsF5 from Lonchocarpus sericeus on trypsin
agarose column equilibrated with 0.05 M Tris-HCl pH 7.5 buffer. Non-
adsorbed proteins were eluted by washing with equilibration buffer.
Adsorbed proteins were eluted with by adding 0.05 M HCl (arrow tip).
Fractions of 1.0 mL were collected at flow rate of 0.5 mL.min-1 and subjected
to chymotrypsin inhibition assay…………………………………. 84
Figura 6 Mass spectrum (MALDI-TOF-MS) of Lonchocarpus sericeus chymotrypsin
and trypsin inhibitor (LsCTI) under native conditions revealed a major peak
at 8,870.45 Da; Inset: SDS-PAGE (15% w/v) profile of LsCTI, 1- molecular
mass markers (kDa), 2- LsCTI…………………….. 85
Figura 7 Electrophoretic profile on SDS-PAGE (15% w/v) of LsCTI after isoelectric
focalization on a 7 cm gel strip with immobilized pH range (3-10). Arrows
indicate the isoelectric point for observed isoforms………………………… 86
Figure 8 Inhibition kinetics. Lineweaver-Burk plot analysis of LsCTI toward (A)
chymotrypsin and (B) trypsin. Dixon plot for determination of LsCTI
dissociation constant (Ki) at different substrate concentration for (C)
chymotrypsin and (D) trypsin. Ki was 8.24 x 10-8 M and 7.61 x 10-7 M for
chymotrypsin and tryspin, respectively…………………………………….. 87
Figure 9 LsCTI inhibitory stability. (A) and (B) after incubation with different DTT
concentrations and times at 37 °C; (C) and (D) after pH incubation at
different pH for 16 h at 4 °C; (E) thermal stability after 30 min incubation at
different temperatures and (F) after 100 °C in different times. Bars
correspond to SD from triplicate measurements…………………………….. 88
Figura 10 Inhibition of Aedes aegypti midgut digestive proteases by different
concentrations of LsCTI. The inhibition percentage was calculated regarding
to midgut proteases in the absence of LsCTI……………………. 89
Figura 11 External morphology of Aedes aegypti larvae after 96 h incubation with (A)
distilled water; (B) Lonchocarpus sericeus protein fraction (LsF5); (C)
soybean Bowman-Birk inhibitor and (D) LsCTI. All protein samples were
used at 0.3 mg.mL-1. Larva cuticle (LC) and larva siphon (LS) were pointed
by arrows. The bar size equals 1 mm………………………………………... 90
LISTA DE TABELAS Tabela 1 Purification steps of Lonchocarpus sericeus chymotrypsin/trypsin inhibitor
(LsCTI) from 1000 mg defatted seed flour…………………………………... 64 Tabela 2 Enzyme specific inhibitory activity of LsCTI toward different enzymes
classes………………………………………………………………………… 66 Tabela 3 Effect of LsCTI on the development of Aedes aegypti larvae arising from eggs
treated with aqueous solution (0.3 mg.mL-1). The mortality, number of
individuals at different stages and delay on development were determined
after eleven days of exposure. Bovine serum albumin, Soybean Bowan-Birk
inhibitor and LsF5 were used at the same conditions. Distilled water was used
as control. The mortality values are present as means and standard deviation
of ten replicates. The different letters indicate significant difference assessed
by Tukey (p <0.05)…………………………………………………………… 73
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BSA Albumina sérica bovina
BANA N-benzoil-arginina-naftilamida
BApNA Benzoil arginina nitroanilida
SAAVpNA N-succinyl-ala-ala-val-p-nitroanilide
CHAPS 3-[(3-Colamidopropil)-dimetil amônio]-propano- sulfonato
EDTA Ácido etilenodiaminotetra acético
SDS Dodecil sulfato de sódio
TCA Ácido tricloroacético
DTT Ditiotreitol
IAA Iodoacetamida
DMAB ρ-dimetilaminobenzaldeido
pI Ponto isoelétrico
LsCTI Inibidor de quimotripsina e tripsina de Lonchocarpus sericeus
SUMÁRIO
1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA..................................................................... 17 1.1 Insetos vetores de doenças................................................................................. 17 1.2 Arboviroses transmitidas por mosquitos Aedes sp......................................... 18 1.2.1 Chikungunya....................................................................................................... 18 1.2.2 Zika...................................................................................................................... 19 1.2.3 Dengue ................................................................................................................ 21 1.3 Aedes sp. e o ciclo de vida................................................................................... 22 1.4 Controle dos vetores........................................................................................... 27 1.4.1 Inseticidas químicos............................................................................................ 27 1.4.2 Bioinseticidas....................................................................................................... 29 1.5 Proteínas vegetais com potencial inseticida..................................................... 30 1.5.1 Inibidores de proteinases.................................................................................... 31 1.5.1.1 Inibidores de proteinases serínicas...................................................................... 32 1.6 Lonchocarpus sericeus........................................................................................ 34 2 OBJETIVOS....................................................................................................... 37 2.1 Objetivo geral..................................................................................................... 37 2.2 Objetivos específicos.......................................................................................... 37 3 CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................ 38 REFERÊNCIAS................................................................................................. 39 APÊNDICE A - ARTIGO DA TESE................................................................. 48
17 1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
1.1 Insetos vetores de doenças
Insetos vetores de doenças (moscas, mosquitos, piolhos e pulgas) são os organismos
intermediários no ciclo de vida de alguns patógenos e também os responsáveis pela sua
disseminação aos organismos hospedeiros. Esses insetos podem ser apenas um veículo ao
patógeno ou participar no seu desenvolvimento e/ou reprodução (REY, 2011).
As doenças transmitidas por insetos vetores representam um dos maiores desafios para
o bem-estar humano atual e futuro. Vários insetos são responsáveis pelas transmissões da
malária, da febre amarela, da encefalite japonesa, bem como de um grupo assim chamado
"doenças tropicais negligenciadas", tais como a dengue, a leishmaniose e a doença de Chagas
(HOTEZ et al., 2007; KOODALINGAM; MULLAINADHAN; ARUMUGAM, 2013).
Atualmente, 3,9 bilhões de pessoas em mais de 120 países estão nas áreas de risco.
Contabilizando, as doenças transmitidas por esses insetos são responsáveis por 17% das
doenças infecciosas, causando a morte de mais de 1 milhão de pessoas todos os anos (WHO,
2017)
Nas últimas décadas esses tipos de doenças estão se tornando uma séria preocupação de
saúde para os países mais desenvolvidos (HOTEZ, 2008), devido à migração dos vetores para
áreas antes não habitadas em resposta às mudanças climáticas e ao desmatamento. Assim,
insetos que tinham como hábitat as florestas migraram e adaptaram-se às cidades (GONZÁLEZ
et al., 2010). Além disso, o aumento da migração humana internacional e das trocas comerciais
promoveram a introdução acidental de vetores e/ou patógenos entre os continentes (ALTIZER
et al., 2011). Dentre os insetos de importância médico-sanitária, os mosquitos dos gêneros
Anopheles sp., Aedes sp. e Culex sp. são considerados os principais vetores de doenças como a
malária, chikungunya, dengue, febre amarela, zika e filariose (RACLOZ et al., 2012; MUSSO;
GUBLER, 2016).
Comparados a outros animais hematófagos, os mosquitos são hematófagos opcionais,
pois também podem se alimentam do néctar de frutas e de outros fluidos biológicos. Contudo,
para a ovoposição, as fêmeas necessitam realizar o repasto sanguíneo, uma vez que as proteínas
do sangue, após a digestão geram compostos que servem para produção do vitelo dos ovos. É
durante o processo de repasto que há a transferência de saliva e organismos patógenos ao
homem (REITER, 2001).
18 Um grande número de estudos empíricos e teóricos sobre doenças humanas transmitidas
por vetores tem contribuído para o entendimento da importância ecológica e evolução dos
vetores na transmissão da doença, na evolução do patógeno e para desenho de estratégias de
controle eficientes. Esses trabalhos geralmente se concentram em áreas altamente endêmicas,
onde as populações dos vetores fundamentais, quer sejam de mosquitos (Anopheles, Aedes ou
Culex), moscas (Glossina), flebotomíneos ou triatomíneos (Triatoma infestans e Rhodnius
prolixus) são auto-sustentáveis (RASCALOU et al., 2012). Em áreas como essas, o controle
do vetor é realizado com auxílio de produtos químicos ou de controle biológico e consiste em
uma estratégia fundamental para diminuir o impacto dessas doenças em seres humanos. No
entanto, campanhas de combate são inevitavelmente limitadas a sua eficácia local (VAN DEN
BERG, 2011; PEDRINI et al., 2011).
1.2 Arboviroses transmitidas por mosquitos Aedes sp.
Mosquitos são vetores para muitas doenças importantes, isso significa que podem levar
os agentes etiológicos de um hospedeiro para outro. Geralmente, as enfermidades causadas têm
ampla distribuição global, altas taxas de mortalidade e elevada incidência. São chamadas de
arboviroses as doenças causadas pela picada de artrópodes, como os mosquitos (‘ARthropod-
BOrne viruses’). Existem cerca de 30 vírus de maior importância para a saúde pública que são
transmitidos por mosquitos. Febre amarela, chikungunya, dengue e zika são as principais
doenças transmitidas pelos mosquitos do gênero Aedes, essas ultimas merecem detaque devido
à ausência de vacinas aprovadas para sua prevenção, bem como o número de recentes surtos
virais que acomete a população (SAWAR, 2015).
1.2.1 Chikungunya
A febre chikungunya é uma arbovirose causada pelo CHIKV (vírus Chikungunya)
pertencente à família Togaviridae, transmitido através da picada de fêmeas de mosquitos do
gênero Aedes infectadas. Esse vírus é tipicamente encontrado na África e Sudeste Asiático,
desde sua descoberta em 1952, tendo causado várias epidemias nesses locais. (GALAN-
HUERTA et al., 2015). Os sintomas mais frequentes durante a infecção humana são febre, dor
de cabeça, dor muscular, erupções cutâneas e artralgia incapacitante (DUPUIS-MAGUIRAGA
et al., 2012). Tanto que a palavra chikungunya significa "aqueles que se dobram" no dialeto
19 africano Makonde, fazendo referência ao efeito da artralgia incapacitante vista nos pacientes
afetados (ENSERINK, 2006).
O vírus CHIKV possui dois ciclos de transmissão distintos: enzoótico e urbano. Na
África, o primeiro ocorre em hábitats florestais onde mosquitos arbóreos, principalmente Aedes
spp, servem como vetores. As evidências apontam os primatas não humanos como os
reservatórios principais e os hospedeiros de amplificação no ciclo enzoótico. CHIKV é, por sua
vez, capaz de iniciar um ciclo de transmissão urbano a partir de pessoas que moram próximo a
áreas enzoóticas, sendo esse dependente apenas de mosquitos Ae. aegypti e/ou Ae. albopictus e
hospedeiros de amplificação humana (WEAVER; REISEN, 2010).
Estudos realizados em pacientes infectados durante o surto na ilha La Réunion (ilha
situada no Oceano Índico, a leste de Madagascar) indicaram que a artralgia era bilateral e
simétrica em 78,4% dos pacientes, sendo capaz de afetar principalmente tornozelos, joelhos,
mãos, pulsos, pés, ombros e cotovelos. A erupção cutânea estava presente em 54% dos
pacientes, predominantemente no tronco e nos braços. O edema periarticular foi relatado em
45% dos pacientes, afetando os tornozelos em maior proporção. Mialgia e cefaleia ocorreram
em 72 e 63% dos pacientes, respectivamente. Sinais hemorrágicos como gengivorragia e
epistaxe manifestaram-se em apenas 10,6% dos pacientes (STAIKOWSKY et al., 2009;
THIBERVILLE et al., 2013)
Para essa doença ainda não há tratamento antiviral específico. Em virtude disso, as
recomendações terapêuticas são para alívio sintomático e de suporte, sendo compostas de
repouso e uso de agentes anti-inflamatórios não esteroidais (AINE) em fase aguda e corticoides
para aliviar o componente artrítico crônico da doença. Todavia, este é indicado após a exclusão
de diagnóstico para doenças mais graves, como a malária, dengue e infecções bacterianas
(CAGLIOTI et al., 2013). Na pendência do desenvolvimento da vacina, o controle dos
mosquitos vetores é, ainda, o melhor método disponível para prevenir a infecção por CHIKV
aliado a individual contra picadas de mosquitos.
1.2.2 Zika O vírus Zika (ZIKV) é um arborvírus pertencente aos Flavivirus e o responsável por
causar a arbovirose que leva o mesmo nome. Foi isolado pela primeira vez em 1947 a partir do
soro de macacos Rhesus utilizados como sentinelas na Floresta Zika (Uganda) durante um
estudo sobre a transmissão da febre amarela. O segundo isolamento foi feito a partir de um pool
de mosquitos Ae. africanus da mesma floresta em 1948 (WEAVER et al., 2016). A ocorrência
20 da infecção em humanos foi inicialmente evidenciada pela presença de anticorpos
neutralizantes nos soros de residentes da África Oriental nas décadas seguintes (ZANLUCA;
DOS SANTOS, 2016).
Desde então, ZIKV tem sido descrito como causador de infecções humanas esporádicas
na África e na Ásia. Contudo, em 2007, um surto dessa doença foi notificado em Yap Island,
Micronésia. Este foi o primeiro surto registrado fora dos continentes africano e asiático. No
início de 2015, o Ministério da Saúde do Brasil confirmou um novo surto junto à transmissão
autóctone de ZIKV no país. Os primeiros casos foram identificados na região Nordeste do país,
onde foram relatados casos de doença exantemática associada a febre, conjuntivite e artralgia.
Em 2016, foram notificados casos de zika em mais de 40 países das América e Caribe e, em
2017, foi registrado o primeiro caso na Flórida, Estados Unidos, retratando a dispersão da
doença por toda Ámerica continental (ZANLUCA et al., 2015; CAMPOS, BANDEIRA,
SARDI, 2015; BAUD et al., 2017)
Assim como ocorre na chikungunya , a transmissão do vírus Zika se dá pela picada de
mosquitos, principalmente do gênero Aedes, durante o repasto sanguíneo realizado pelas
fêmeas. Apesar do primeiro vetor documentado para ZIKV ser Ae. Africanus, outras espécies
de mosquitos como o Ae. aegypti e Culex quinquefasciatus já foram capazes de transmitir esse
vírus, mostrando que os surtos podem não estar relacionados apenas aos mosquitos do gênero
Aedes (GUO et al., 2016).
Um ponto de extrema preocupação em saúde pública é a associação desse vírus à
ocorrência de casos de microcefalia em neonatos. Isso se deve à capacidade do ZIKV em
atravessar a barreira transplacentária e se alojar no sistema nervoso dos fetos, acarretando não
apenas microcefalia, como também, problemas de visão, surdez, artrogripose e disfagias
(DUARTE et al., 2017). Outro ponto alarmante sobre a transmissão do vírus Zika diz respeito
à sua habilidade de se instalar em tecidos imunoprivilegiados, como os tecidos germinativos
presente nos testículos. Tal fato foi corroborado pela presença desse vírus no sêmen de um
paciente várias semanas após a fase aguda da doença, tornando a zika uma potencial infecção
sexualmente transmissível (MUSSO et al., 2015).
A infecção pelo vírus Zika é caracterizada por manifestações clínicas leves e
autolimitadas. Os sintomas variam de assintomáticos a uma doença semelhante a dengue,
compreendendo erupção cutânea maculopapular (regularmente pruriginosa), febre, artrite ou
artralgia, dores de cabeça e conjuntivite não purulenta. Outros sintomas relatados incluem
calafrios, astenia, mal-estar, edema das extremidades, dor retro orbital, vertigem, mialgia,
21 distúrbios digestivos, linfadenopatia cervical, hematúria e hematospermia (ZANLUCA; DOS
SANTOS, 2016).
Até o presente momento, a vacina para esse vírus está em fase clinica I. Outras
estratégias de prevenção para ZIKV incluem as medidas de controle e eliminação de focos de
reprodução de mosquitos, bem como o uso de repelentes para proteção pessoal.
1.2.3 Dengue Dengue é uma doença flaviviral causada por um dos quatro sorotipos do vírus DENV
que ocorrem principalmente em áreas tropicais e subtropicais. Seus vetores predominantes são
os mosquitos do gênero Aedes, capazes de carrear qualquer um dos sorotipos desse vírus e
transmitir a doença através do repasto sanguíneo em seres humanos (SHEPARD et al., 2011).
A incidência da dengue cresceu dramaticamente em todo o mundo nas últimas décadas. Esse
aumento pode ser atribuído a vários fatores, que incluem o crescimento da população aliado à
urbanização não planejada (e consequente sobrecarga dos sistemas de água e saneamento),
aumento das movimentações nacionais e internacionais, o transporte de mercadorias, tais como
pneus, além de recursos financeiros limitados para implementação de medidas eficazes de
controle dos vetores (SIMMONS et al., 2012).
Estudos recentes indicam que ocorrem cerca de 400 milhões de infecções por
dengue/ano e que 3,9 bilhões de pessoas vivem em áreas de risco à infecção. Tais dados fazem
desta arbovirose transmitida por mosquitos, a mais difundida, afetando 128 países em todo o
mundo (WHO, 2017; BHATT et al., 2013). Contudo, esses números podem aumentar nos
próximos anos, pois os mosquitos vetores que antes habitavam as regiões em países de latitudes
tropicais e subtropicais passaram a ocorrer em regiões de latitudes temperadas devido ao
aumento da temperatura mundial (BOWMAN, DONEGAN, MCCALL, 2016).
As infecções pelos sorotipos da dengue levam os indivíduos a quadros clínicos tanto
sintomáticos quanto assintomáticos. O período de incubação pode variar de 3 -15 dias, iniciando
com um quadro de febre aguda e repentina que pode ser seguida por dor de cabeça, dor retro-
orbital, dores musculares e articulares e leucopenia (BACK; LUNDKVIST, 2013). Diferente
das infecções provocadas por CHIKV e ZIKV, as infecções por DENV são categorizadas em 3
tipos dependentes da sua severidade. Na dengue clássica (DF), dos sintomas anteriormente
mencionados, estão presentes e exacerbados a dor muscular e articular, fazendo com que esta
seja também conhecida com febre quebra ossos. Já a dengue hemorrágica (DHF) é caracterizada
por um aumento da permeabilidade vascular levando à redução do volume plasmático e
22 elevação do hematócrito (aumento de 20%), podendo causar ascite, derrame pleural e
trombocitopenia (<100.000 plaquetas/mm3), este último pode levar o indivíduo a episódios
hemorrágicos. Por fim, a dengue síndrome de choque (DSS) difere da DHF, principalmente,
pelo comprometimento do sistema cardiovascular, rápida elevação do hematócrito, dor
abdominal intensa, vômitos persistentes e redução da pressão arterial (ZHANG et al., 2014).
Diferente da zika e chikungunya, a dengue possui uma vacina aprovada para uso em
áreas endêmicas, sendo esta, uma composição tetravalente de vírus vivos atenuados
(Dengvaxia®) capaz de induzir resposta imunológica robusta para os 4 sorotipos da dengue
(SCOTT, 2016). Em áreas onde a vacina ainda não é autorizada, o tratamento sintomático é
realizado com auxílio de analgésicos e antipiréticos (deve-se evitar o uso de aspirina e outros
salicilatos devido ao risco de hemorragias), e é adotada como medida para prevenção desta
infecção o controle dos mosquitos e o uso de repelentes para proteção individual
(BOWMAN, DONEGAN, MCCALL, 2016). 1.3 Aedes sp. e o ciclo de vida
Os principais vetores da chikungunya, zika e dengue são fêmeas de mosquitos do gênero
Aedes (Diptera:Culicidae), sendo apontados Ae. aegypti, e Ae. albopictus. O primeiro constitui
o principal vetor, enquanto o segundo, mostra-se mais importante em algumas regiões asiáticas.
O mosquito Ae. aegypti é adaptado ao ambiente urbano e utiliza os recipientes mais frequentes
no domicílio ou peridomicílio – tanques de armazenamento de água e vasilhames temporários,
dentro e fora das casas, como potes, barris, pneumáticos usados, latas, garrafas e vasos de
plantas – para o desenvolvimento de sua fase larvária. Já o Ae. albopictus prefere o hábitat
natural da floresta, como buracos em árvores, axilas de folhas, e cascas de coco. Cria-se, mais
frequentemente, fora das casas, em jardins (BRAGA; VALE, 2007).
Provavelmente, esses mosquitos foram introduzidos nas Américas a bordo de navios
vindos da Europa, que cruzavam o Atlântico durante as primeiras explorações e colonizações
europeias (BISSET, 2002). Atualmente, são encontrados em uma larga faixa latitudinal global
ocorrendo em todos os continentes, com ênfase ao americano no qual se estende da Argentina
ao sul dos Estados Unidos da América (EUA) (Figura 1). No Brasil, o Ae. aegypti está presente
nos 26 Estados e no Distrito Federal (Figura 2).
23
A intensidade de cor vermelha indica densidade populacional de mosquitos Ae. aegypti.
Fonte: Santos; Meneses, 2017.
Figura 1: Distribuição geográfica dos mosquitos Aedes aegypti
24
Fonte: Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), 2013
Figura 2: Distribuição geografica do mosquito Aedes aegypti no Brasil em 2013
25 Os mosquitos do gênero Aedes são insetos holometábolos, o que significa que passam
por metamorfose completa: ovo, larva, pupa e fase adulta (Figura 3). A duração da vida adulta
pode variar de duas semanas a um mês, dependendo das condições ambientais (PONTUAL et
al., 2014). Esses mosquitos possuem hábitos alimentares distintos, já que os machos se
alimentam apenas de seiva de folhas e frutos, enquanto que as fêmeas, por sua vez, podem se
alimentar tanto de seiva quanto de sangue de animais (ZARA et al., 2016).
Após o repasto sanguíneo, as fêmeas produzem em média de 100-200 ovos. No entanto,
este número está diretamente ligado à quantidade de sangue ingerida. As fêmeas podem
ovopositar até cinco vezes durante a vida. Os ovos são colocados em superfícies úmidas em
zonas susceptíveis de inundação temporária, como buracos de árvores e/ou recipientes feitos
pelo homem. A ovoposição pode ser distribuída ao longo de horas ou dias, dependendo da
disponibilidade de substratos apropriados. Na maioria das vezes, os ovos são colocados em
diferentes distâncias acima da linha de água em dois ou mais locais (FOSTER; WALKER,
2002).
As larvas são providas de grande mobilidade e não selecionam alimentos, podendo
filtrar até dois litros de água por dia. Passam por quatro estádios (L1, L2, L3 e L4) e a duração
do desenvolvimento larval depende da temperatura, da disponibilidade de nutrientes e da
densidade de larvas. Sob condições ótimas, o tempo necessário para completar o ciclo pode ser
de somente 7 dias, incluindo os dois dias da fase de pupa (ALMEIDA FILHO, 2013).
A etologia do Ae. aegypti beneficia sua ampla dispersão, favorecida nos ambientes
urbanos, preferencialmente no intra- e no peridomicílio humano. Essa espécie de mosquito,
raramente é encontrada em ambientes semissilvestres ou onde não há presença intensa do
homem, pois mesmo havendo outras fontes de alimentação, tais como cães, suínos, bovinos,
roedores e aves, as fêmeas de Ae. aegypti se alimentam preferencialmente de sangue humano.
Devido à inquietude do hospedeiro humano durante a alimentação sanguínea, a fêmea consegue
fazer ingestões múltiplas de sangue durante um único ciclo gonadotrófico, o que amplia a sua
capacidade de se infectar e de transmitir os vírus. Este comportamento torna o Ae. aegypti um
vetor eficiente na propagação das arboviroses (ZARA et al. 2016).
Assim, em face do atual cenário de surtos e epidemias de chikungunya, zika, e dengue, é
necessário entender as principais estratégias de controle do Ae. Aegypti.
26 Figura 3 – Caracterização esquemática do ciclo de vida de mosquitos pertencentes ao gênero Aedes
Fonte: Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz).
27 1.4 Controle dos vetores
Os pesticidas ou inseticidas utilizados, atualmente, podem ser classificados em 2 grupos:
convencionais e alternativos (seletivos). Os inseticidas convencionais são substâncias químicas
que pertencem às classes dos organoclorados, organofosforados, carbamatos e piretroides. Já
os alternativos ou biopesticidas são produtos de origem natural que podem ser microorganismos
(ex: Bacillus thuringiensis var. israelenses) ou compostos bioquímicos capazes de induzir a
morte ou retardar o desenvolvimento dos insetos (ex: lectinas, inibidores de proteases)
(REDDY; TANGTRAKULWANICH, 2014). 1.4.1 Inseticidas químicos
O controle químico, com inseticidas sintéticos de origem orgânica ou inorgânica, é uma
das metodologias mais adotadas como parte do manejo sustentável e integrado para o controle
de vetores em Saúde Pública. Os inseticidas pertencentes aos organoclorados, organofosforados
e piretroides são os mais utilizados e agem sobre o sistema nervoso dos insetos
(BALDACCHINO et al., 2015).
Os organoclorados são inseticidas que contêm carbono, hidrogênio e cloro. São
classificados em quatro grupos: difenil-alifáticos; hexaclorociclohexanos; ciclodienos; e
policloroterpenos. Esses são os mais antigos pesticidas químicos utilizados. Dentre esses
encontra-se o DDT (diclorodifeniltricloroetano), o inseticida mais notório do século passado.
Esse composto atua sobre os canais de sódio, causando um desequilíbrio no balanço entre os
íons sódio e potássio dos axônios impedindo a propagação dos impulsos nervosos em insetos e
mamíferos (BRAGA; VALLE, 2007). Embora esses tenham sido largamente adotados pelos
programas de controle de mosquitos vetores, tiveram seu uso descontinuado e chegaram,
inclusive, a ser proibidos em vários países devido a sua persistência no ambiente e ao acúmulo
em tecidos do organismo de animais e de humanos (VENIER; HITES, 2014).
Os organofosforados, por sua vez, surgiram para substituir os organoclorados. Nesse
grupo, os compostos possuem fósforo na sua composição e podem ser classificados em três
subgrupos: os alifáticos (ex: malation, vapona e vidrin), os derivados de fenil (ex: fenitrotion,)
e os heterocíclicos (ex: clorpirifós, clorpirifós-metil). Esses inseticidas são amplamente
utilizados em saúde pública por apresentarem muitas vantagens sobre os organoclorados, como
serem biodegradáveis e não se acumularem nos tecidos. Apresentam, porém, como principal
desvantagem, a instabilidade química, o que torna obrigatória a renovação periódica de sua
28 aplicação. Além disso, são mais tóxicos para os vertebrados que os organoclorados, mesmo em
doses relativamente baixas (WARE; WHITACRE, 2004).
Os organofosforados têm como mecanismo de ação a ligação irreversível com a
acetilcolinesterase, enzima responsável pela quebra do neurotransmissor acetilcolina. O
acúmulo de acetilcolina na fenda sináptica impede a interrupção do impulso nervoso causando
paralisia seguida de morte (PAILAN et al., 2015). O Temefós é um organofosforado, registrado
nos EUA em 1965 para utilização em agricultura e controle de mosquitos, é o único larvicida
desse grupo com uso generalizado no controle de larvas de mosquitos, recomendado pela OMS.
Contudo, populações resistentes aos organofosforados também foram detectadas, levando à
substituição por novos inseticidas, agora da classe dos piretroides (OCAMPO et al., 2011;
MAESTRE-SERRANO et al., 2014).
Os piretroides sintéticos, atualmente bastante estáveis, são produzidos em laboratório a
partir de uma substância natural, o piretro, extraído de crisântemos. São biodegradáveis, não
cumulativos e raramente provocam intoxicações agudas em aves e mamíferos, embora possam
causar irritação das mucosas nesses animais. Para os animais aquáticos, entretanto, são
extremamente tóxicos (BRAGA; VALE, 2007). Possuem ainda como vantagens, o fato de
serem muito ativos (necessidade de pequenas doses) e repelentes. Esses compostos apresentam
modo de ação similar ao do DDT, que mantêm abertos os canais de sódio das membranas dos
neurônios. Este fenômeno afeta o sistema nervoso dos insetos, fazendo com que as células
nervosas produzam descargas repetitivas e, eventualmente, causem a paralisia do inseto (JAN
et al., 2015).
Apesar do surgimento de novos compostos químicos, o manejo de forma inadequada
ocasionou o surgimento de população de insetos resistentes, e por causa do aumento da
resistência dos insetos-praga aos inseticidas químicos, a pesquisa por inseticidas naturais e
biodegradáveis tem aumentado, com o objetivo de minimizar o impacto ao ambiente, encontrar
novos compostos que promovam a mortalidade das larvas e prevenir surgimento de linhagens
resistentes. Alguns extratos de plantas podem ser considerados fitoinseticidas e servir como
alternativas para realizar o controle dos mosquitos (PONTUAL et al., 2012).
Uma das vantagens do uso de extratos vegetais é que esses possuem diferentes
princípios ativos (metabólitos secundários, inibidores de tripsina, lectinas etc), capazes de
impedir o desenvolvimento de larvas por atuar em vários pontos de seu metabolismo
(BARBOSA et al., 2014).
29 1.4.2 Bioinseticidas
Os bioinseticidas são desenvolvidos a partir de organismos vivos que ocorrem
naturalmente, como animais, plantas e microorganismos. Podem controlar insetos-praga
prejudiciais por meio de seu modo de ação eco-friendly, ou seja, baixa toxicidade ao ambiente.
Os bioinceticidas e os seus produtos são utilizados, principalmente, para o manejo de pragas
prejudiciais às plantas, todavia, podem também ser empregados no combate de insetos vetores
de doenças (MAZID; KALIDA; RAJKHOWA et al. 2011). Eles são frequentemente alvo
específicos, inócuos para insetos não-alvo e não causam problemas na qualidade do ar e água no
ambiente. Além disso, o uso desses produtos tem outras vantagens, por exemplo, baixa
capacidade de indução à resistência das pragas alvo (SENTHIL-NATHAN, 2015).
Esses compostos foram usados nas indústrias comerciais, agrícolas e hortícolas para
reduzir o risco gerado pelos pesticidas químicos sobre organismos não-alvo, por possuírem baixa
atividade residual para trabalhadores/aplicadores e para os inimigos naturais (ex: parasitoides e
predadores) (KHATER, 2012). Quando utilizados como constituintes no manejo de insetos-
praga, sua eficácia pode ser igual àquela dos inseticidas convencionais (químicos),
particularmente, para culturas como frutas, vegetais, nozes e flores. Ao ponderar o desempenho
de inseticidas sintéticos e a segurança ambiental, os bioinseticidas executam de modo eficaz o
controle e o surgimento de pragas resistentes (SENTHIL-NATHAN, 2013).
Inseticidas botânicos são compostos resultantes do metabolismo primário ou secundário
das plantas. Esses, por sua vez, podem apresentar mecanismos de ação diversos para causar a
morte dos insetos, pois podem atuar sobre o sistema nervoso central, dificultando o crescimento
e o desenvolvimento e/ou interferindo no metabolismo celular (CORRÊA; SALGADO, 2011).
Dentre as moléculas do metabolismo primário de plantas, as proteínas relacionadas à
patogenicidade constituem um arsenal de moléculas capazes de atuar contra diversos tipos de
agentes patogênicos e são potenciais inseticidas (LANNO; VAN DAMME, 2014). Entre essas
proteínas estão as lectinas, as proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) e os inibidores de
enzimas proteolíticas ou glucosidases. Essas classes de proteínas estão frequentemente
relacionadas à proteção de órgãos e tecidos reprodutivos contra herbivoria (CARLINI; GROSSI-
DE-SA, 2002; VAN DAMME; LIUYI DANG, 2015).
30 1.5 Proteínas vegetais com potencial inseticida
As plantas, por serem organismos sésseis, estão expostas a uma grande quantidade de
fatores de estresse do meio ambiente. Além das influências impróprias de seus arredores,
também estão sujeitas a constante ameaça de predadores e patógenos. Para transpor essa
diversidade de condições desfavoráveis, as plantas passaram por adaptações evolutivas que
culminaram no desenvolvimento de sofisticadas estratégias de defesa e a síntese de uma
impressionante gama de compostos bioativos, sendo alguns tóxicos e/ou capazes de alterar os
padrões químicos e físicos das plantas vizinhas (MAAG et al., 2014).
Entre os diferentes compostos tóxicos produzidos pelas plantas, podemos destacar um
grande grupo de compostos de baixa massa molecular, como por exemplo, alcaloides,
terpenoides, taninos e glicosídeos (MITHÖFER E BOLAND, 2012) e moléculas de alta massa
molecular, que incluem proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs), lectinas, inibidores de
alfa-amilase e inibidores de proteinases (VIRGILIO et al., 2010). Essas classes de proteínas
são, particularmente, abundantes em órgãos de reserva tais como tubérculos e sementes e
possuem diferentes mecanismos de ação sobre os seres fitófagos, podendo atuar dificultando
a absorção de nutrientes ou clivagem de proteínas, bem como interferindo na síntese de
proteínas do predador (JABER; HAUBRUGE.; FRANCIS, 2010).
As lectinas são uma classe de proteínas que possuem atividade de ligação a
carboidratos com pelo menos um domínio não catalítico, que se liga reversivelmente com
mono- ou oligossacarídeos específicos. Embora a maioria das lectinas tenha sido caracterizada
a partir de plantas, essas proteínas também foram relatadas em animais, insetos, vírus, fungos
e bactérias, podendo atuar como moléculas de reconhecimento do sistema imune, proteínas de
reserva e proteínas de adesão da superfície celular (VAN DAMME; LIUYI DANG, 2015).
Além disso, também têm sido implicadas nos mecanismos de defesa contra agentes
patogênicos invasores e predadores. Em geral, a toxicidade exercida pelas lectinas, para
algumas espécies, é devido à sua ligação a estruturas específicas de carboidratos presentes nas
células epiteliais do trato digestório do predador. Essa ligação pode causar alterações drásticas
na morfologia celular e metabolismo do trato digestório dos animais herbívoros, além de ativar
cascatas de sinais bioquímicos que alteram seu metabolismo (YAMAMOTO et al. , 2013).
A toxicidade de lectinas a diferentes ordens de insetos tem sido relatada nas últimas
décadas, incluindo Coleoptera, Lepidoptera (CZAPLA; LANG, 1990) e Homoptera
(SAUVION et al., 1996). Os efeitos prejudiciais de lectinas sobre parâmetros biológicos de
insetos incluem perda de peso larval, mortalidade, inibição da alimentação, atraso no
31 desenvolvimento e redução na fecundidade das primeira e segunda gerações. Há estudos
recentes da toxicidade de lectinas a insetos-praga de importância econômica como o afídeo da
ervilha (Acyrthosiphon pisum) (SAUVION et al., 2004), larva da beterraba (Spodoptera
exigua), (SHAHIDI-NOGHABI et al., 2009) e contra o mosquito vetor da dengue (Aedes
aegypti) (SANTOS et al., 2012).
As proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) constituem um grupo de proteínas que
são capazes de inativar os ribossomos tanto de procariotos quanto eucariotos. Por conta disso,
compreendem uma classe de enzimas citotóxicas que possuem atividade específica de rRNA
N-glicosidase (PEUMANS; HAO, VAN DAMME, 2001). As RIPs desempenham um papel
importante na defesa vegetal, pois, uma vez inativados os ribossomos, a síntese de proteínas é
comprometida e, consequentemente, há um desbalanço bioquímico no predador que pode
afetar seu desenvolvimento ou ocasionar sua morte. Ricina e abrina constituem exemplos de
proteínas que inativam irreversivelmente ribossomos, possuindo efeito tóxico contra uma
variedade de insetos, mesmo que esses efeitos sejam variáveis em diferentes ordens de insetos
(JABER et al., 2010; AKKOUH et al, 2015).
Os inibidores de alfa-amilase são moléculas conhecidas como bloqueadores de amido.
Impedem a quebra desse em moléculas de maltose, amilopectina e glucose, capazes de serem
absorvidas pelo organismo tanto do vegetal, desempenhando funções regulatórias endógenas,
quanto do predador, atuando como moléculas de defesa. Esses inibidores são extraídos de
várias famílias de plantas, em especial, a família Fabaceae. Já há relatos do uso da
biotecnologia para a transformação de plantas, tais como a ervilha (Pisum sativum L.) e feijão
azuki (Vigna anguralis L.), a fim de que essas expressem esses inibidores com efeito inseticida
(KLUH et al., 2005).
O potencial inseticida dos inibidores de alfa-amilase é relatado principalmente sobre
insetos pertencentes à subfamília dos bruquídeos (Coleoptera: Bruchidae), como os gorgulhos
Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus, uma vez que durante o seu
desenvolvimento larval utilizam como fonte de alimentação majoritária o amido (GUPTA;
SHARMA; NATH, 2014).
1.5.1 Inibidores de proteinases
Os inibidores de proteinases são proteínas ou peptídeos capazes de interagir com
enzimas proteolíticas e inibir suas atividades catalíticas (LINGARAJU; GOWDA, 2008).
Essas moléculas são encontradas em todas as formas de vida, no entanto, os inibidores de
32 proteinase de origem vegetal, principalmente os encontrados em órgãos vegetativos,
reprodutivos e de reserva das famílias Fabaceae, Poacea e Solanaceae são os mais estudados
(MACEDO et al., 2009).
Estudos apontam que essas moléculas possuem variadas funções, podendo atuar como
reguladores de proteinases endógenas, proteínas de reserva e como agentes na defesa vegetal
a microrganismos, insetos e outros animais herbívoros. Essas proteínas são classificadas de
acordo com as classes enzimáticas, podendo ser, inibidores de proteinases serínicas,
cisteínicas, aspárticas ou inibidores de metaloproteinases (MACEDO et al., 2007).
Os inibidores são tradicionalmente agrupados em famílias conhecidas como Kunitz,
Bowman-Birk, Batata I e II, Abóbora, Cevada, Cistatinas, Thaumatin-like e Ragi A1. Dentre
estas, as famílias Kunitz e Bowman-Birk são as mais estudadas e melhor caracterizadas
(OLIVA et al., 2010).
1.5.1.1 Inibidores de proteinases serínicas
Inibidores de proteinases serínicas são amplamente distribuídos no reino vegetal e já
foram descritos em muitas espécies de plantas, principalmente as pertencentes às famílias
Brassicaceae, Curcubitaceae, Fabaceae, Salicaceae, Leguminosae e Solanaceae. O papel
fisiológico desses inibidores nas plantas inclui a regulação das proteinases endógenas durante
a dormência das sementes, imobilização das proteínas de reserva (como forma de preservar os
tecidos), proteção contra as enzimas proteolíticas de parasitas e insetos, e como proteínas de
reserva (SANTAMARIA et al., 2014).
As famílias do tipo Kunitz e Bowman-Birk constituem as famílias de inibidores de
proteinases serínicas mais estudadas. Parte disso, deve-se à descoberta dos inibidores presentes
na soja (Glycine max), o SbTI (Soy bean trypsin inhibitor) e BBI (Bowman-Birk inhibitor).
Inibidores do tipo Kunitz, em geral, possuem massa molecular entre 18 a 22 kDa e apresentam
estrutura primária constituída por 181 resíduos de aminoácidos, um único sítio reativo que se
liga à tripsina, com uma ou duas cadeias polipeptídicas. Esses inibidores usualmente contêm
quatro resíduos de cisteína (cys39 – cys86 e cys136 – cys145) em duas pontes dissulfeto que,
uma vez rompidas, acarretam a perda de sua atividade biológica (OLIVA et al., 2010). Já os
inibidores do tipo Bowman-Birk apresentam baixa massa molecular, variando de 8 a 10 kDa,
um alto conteúdo de cistina e dois sítios reativos por molécula, cada um com especificidade
para uma faixa de proteinases serínicas: tripsina, quimiotripsina e elastase. Essas moléculas
podem apresentar atividade inibitória de forma simultaneamente e/ou independentemente das
33 proteinases serínicas devido à presença de mais de um sítio reativo (CARLINI; GROSSI DE
SÁ, 2002).
Durante as últimas décadas, os inibidores de proteinases ganharam bastante atenção
devido ao seu envolvimento na defesa vegetal e possíveis aplicações na engenharia de plantas
para aumentar a resistência a insetos e outro patógenos. Com relação aos insetos, isso ocorreu
devido ao fato de que suas enzimas digestivas passaram a ser um potencial alvo para o seu
controle populacional (SENTHILKUMAR; CHENG; YEH, 2010).
Os mecanismos de ação desses inibidores são variáveis entre as diferentes classes de
insetos. Essas moléculas podem se ligar às enzimas proteolíticas dos insetos e impedir a
digestão de proteínas, acarretando assim um déficit na absorção de aminoácidos essenciais para
o desenvolvimento e reprodução dos insetos. Algumas classes de insetos, para compensar o
efeito dos inibidores, aumentam a produção de proteinases na tentativa de manter a taxa de
digestão e absorção de aminoácidos, porém essa estratégia pode levar à limitação de
aminoácidos como cisteina e metionina presentes nas enzimas serínicas. Essa limitação na
biodisponibilidade de aminoácidos essenciais pode causar redução da síntese de proteínas
utilizadas no crescimento e desenvolvimento, levando o inseto à morte (ANDERSON et al.,
2012).
Assim como os insetos possuem mecanismos bioquímicos de escape à ação dos
inibidores, as plantas por sua vez, durante essa co-evolução presa-predador, desenvolveram
estratégias para contrapor às adaptações dos insetos. Embora as enzimas digestivas dos insetos
sejam abundantes em proteinases do tipo tripsina e quimotripsina, sua exposição aos inibidores,
por longo prazo, induz os insetos a promoção da síntese de novas isoformas dessas enzimas
digestivas que são menos inibidas ou mais eficientes para digerir o inibidor. Essa adaptabilidade
dos insetos exige inibidores mais potentes e efetivos. Assim, as plantas desenvolveram a
capacidade de produzir diferentes isoformas de um mesmo inibidor, através de modificações
pós-traducionais ou por fenômenos de duplicação gênica. Essas isoformas, apesar de bastantes
similares, possuem características distintas como ponto isoelétrico, capacidade inibitória e
resistência à digestão, podendo ser mais eficazes ao combate das pragas (MACEDO et al., 2002;
MORRISON et al., 2007; JAMAL et al., 2013).
O potencial inseticida desses inibidores sobre diferentes classes de insetos vem sendo
relatado nas ultimas décadas, como por exemplo, os inibidores das sementes Adenanthera
pavonina (ApTI), Cassia leiandra (ClTI) e Leucaena leucocephala (LTI) sobre as larvas do
mosquito Ae. aegypti (Diptera) (ALMEIDA FILHO, et al., 2017; DIAS et al., 2017; SASAKI
et al., 2015;), os inibidores de Inga vera (IVTI) e de Poincianella pyramidalis (PpyTI) sobre
34 neonatos do lepidóptero Anagasta kuehniella (DA SILVA BEZERRA et al., 2016;
GUIMARÃES et al., 2015) e o inibidor de Dimorphandra mollis (DMTI-II) sobre o inseto
Callosobruchus maculatus (Coleoptera) (MACEDO et al., 2002).
1.6 Lonchocarpus sericeus A família Fabaceae é a segunda maior família de plantas, possuindo cerca de 600
gêneros e 12.000 espécies. Esta família é dividida em três subfamílias: Mimosoideae,
Caesalpinoideae e Faboideae, contendo cerca de 60, 150 e 430 gêneros, respectivamente.
Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth ex DC é uma leguminosa pertencente às Faboideae.
(EVANS, 2002). No Brasil, pode ser encontrada do norte do estado do Pará ao sul do estado do
Rio de Janeiro. Além disso, distribui-se geograficamente na África, América Central, Ásia,
Austrália, Colômbia e Caribe (INTERNATIONAL LEGUME DATABASE &
INFORMATION SERVICE, 2017).
L. sericeus é comumente conhecida no sertão nordestino por “ingazeiro”, e em
Fortaleza, no Ceará, por “ingá” ou “ingá-bravo”. É encontrada com frequência à margem de
cursos d’água e em formações florestais, como mata de galeria e mata costeira (MARTINS DE
SOUSA, 2003). É uma árvore caducifólia que atinge 10 a 16 metros de altura, com caule de
coloração amarela e copa ampla e densa. Suas inflorescências são racemos pendentes de flores
roxas, seu fruto é verde ou marrom e revestido por indumento ferruginoso, apresentando
constrições de tamanhos variados entre as sementes, de formato reniforme e coloração
amarronzada (Figura 4) (AZEVEDO-TOZZI, 1989).
Na literatura cientifica, é possivel perceber que a planta L. sericeus é bem estudada
quanto a seus metabólitos secundários e suas aplicabilidades. Fitoquímicos como alcaloides,
saponinas, carotenoides, flavonoides, taninos, triterpenos e esteroides já foram detectados nos
extratos metanólicos da casca do caule, sementes e raiz (OYEDEJI et al., 2015). Estudos mais
detalhados mostram que L. sericeus contém os seguintes flavonoides (chalconas): derricina e
lonchocarpina (FONTENELE et al., 2005) que apresentaram atividade citotóxica sobre
diversos tipos celulares (CUNHA et al., 2003).
Além de se apresentar como uma boa fonte de metabólitos secundários, L. sericeus
constitui, também, uma boa fonte de proteínas e lipídios, pois as suas sementes possuem cerca
de 40 e 30% desses macronutrientes para nutrição animal, respectivamente. Dentre as proteínas,
classes com potencial inseticida como lectinas, inibidores de proteases e ureases foram
identificadas (CARVALHO et al., 2011). Dessas, apenas para as lectinas há relatos na literatura
35 que incluem sua habilidade em inibir o edema de pata e a migração de neutrófilos para a
cavidade peritoneal de ratos (ALENCAR et al., 1999) e a atividade anti-inflamatória e
antimicrobiana em modelo de peritonite infecciosa em ratos (ALENCAR et al., 2005).
Tendo em vista que as sementes de L. sericeus possuem 3 classes de proteínas biotivas
que podem desempenhar atividade inseticida, e que, ainda não há relatos na literatura sobre essa
atividade, é válido investigar o potencial dessas proteínas.
36 Figura 4 – Planta Lonchocarpus sericeus. (A) porte arbóreo; (B) flor dotada de estandarte (pétala modificada); (C) fruto característico, legume seco indeiscente e (D) sementes reniformes de coloração marrom.
Fonte: Elaborado pelo autor.
A B
C
D
37 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral
Purificar um inibidor de proteinase serínica das sementes de Lonchocarpus sericeus e
avaliar seu efeito sobre o desenvolvimento do mosquito Aedes aegypti.
2.2 Objetivos específicos Este trabalho teve como objetivos específicos:
Purificar o inibidor de quimotripsina/tripsina presente nas sementes de L.
sericeus;
Caracterizar o inibidor purificado quanto à massa molecular, numero de
subunidades, ponto isoelétrico e existência de isoformas;
Determinar a especificidade inibitória; cinética de inibição enzimática e
constante de inibição frente às enzimas quimotripsina e tripsina;
Avaliar a manutenção da atividade inibitória após exposição a diferentes valores
de pH, temperatura e concentrações de ditiotreitol (DTT)
Analisar a capacidade inibitória deste inibidor in vitro sobre as enzimas de larvas
de 3º estádio de Ae. aegypti;
Verificar o efeito deste inibidor sobre o desenvolvimento do mosquito Aedes
aegypti;
38 3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Neste estudo foi abordada a espécie Lonchocarpus sericeus, uma planta que apesar de
exótica, adaptou-se às condições, drásticas tanto hídrica quanto térmica da Caatinga. Esta planta
já possui alguns estudos na literatura sobre o potencial de seus metabólitos secundários. Nosso
grupo de pesquisa já realizou algumas investigações sobre o seu potencial nutricional e
biotecnológico, mostrando que as sementes dessa planta podem servir como fonte dos
macronutrientes proteínas e lipídeos para a alimentação humana e que possui proteínas biotivas
com potencial de uso na engenharia de planta, tais como ureases e inibidores de protease.
Neste trabalho foi realizada a purificação de um inibidor de quimotripsina a partir das
proteínas presente nas sementes dessa espécie. Este inibidor possui características similares
àquelas da família dos inibidores Bowman-Birk, como baixa massa molecular (8,7 kDa),
presença de isoformas, habilidade de inibir mais de uma enzima proteolítica, elevada resistência
a temperatura e variações de pH. Da mesma forma foi também mostrado o potencial
biotecnológico desse inibidor, que foi capaz de atuar sobre o desenvolvimento das larvas do
mosquito Ae. aegypti causando elevada taxa de mortalidade. Os inibidores de proteases já vêm
sendo estudados quanto a sua capacidade inseticida para servirem como formas alternativas ao
combate de insetos-praga. Essas moléculas inseticidas, além de atuarem diretamente sobre os
insetos, ainda podem atuar como potencializadores de inseticidas já comercializados, como é o
caso dos produtos à base de proteínas Cry.
Este trabalho pode servir como base para o estudo do potencial inseticida do inibidor de
proteases presente nas sementes de L. sericeus. Além de se somar aos outros trabalhos que
abordam plantas ocorrentes na Caatinga e evidenciam o potencial biotecnológico presente neste
bioma, valorizando-o para que possam ser desenvolvidas estratégias de manejo e conservação
de modo a evitar a extinção desse bioma já em risco.
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48 APÊNDICE A – ARTIGO DA TESE
A novel Bowman-Birk inhibitor purified from Lonchocarpus sericeus seeds has insecticidal activity toward Aedes aegypti Manuscrito formatado e submetido a revista Pest Management Science (Impact Factor: 3.253)
A novel Bowman-Birk inhibitor purified from Lonchocarpus sericeus
seeds has insecticidal activity toward Aedes aegypti
Running title: Effect of protease inhibitor from Lonchocarpus sericeus upon Aedes aegypti
Luiz C P Almeida Filhoa, Pedro M S Tabosaa, Denise C Hissab, Ilka M Vasconcelosa, Ana F U
Carvalhob*
aFederal University of Ceará, Biochemistry and Molecular Biology Department, Pici Campus, 60440-
970, Fortaleza, Ceará, Brazil.
b Federal University of Ceará, Biology Department, Pici Campus, 60440-900
* Corresponding author:
Prof. Dr. Ana F. U. Carvalho
E-mail: [email protected]
49 ABSTRACT
BACKGROUND: Arboviroses such as dengue, zika and chikungunya represent a serious issue
in public health due to the absence of approved vaccine or specific antiviral drugs. One way to
prevent these diseases is by combating the vector mosquito, Aedes aegypti (Diptera), which has
serine proteases in the midgut. Protease inhibitors are molecules that can block enzyme activity
impairing digestion and nutrition that can lead to death. Thus, we purified and characterized a
novel protease inhibitor from Lonchocarpus sericeus seeds and investigated its effect upon Ae.
aegypti egg hatching, larval development and digestive proteases.
RESULTS: The purified inhibitor (LsCTI) showed a single protein band in SDS-PAGE, the
molecular mass by MALDI-TOF-MS was 8,870.45 Da. Kinetics analyzes revealed the
noncompetitive type of inhibition and low Ki for chymotrypsin (8.24 x 10-8 M). The inhibitor
thermal resistance was remarkable, suporting heating at 100 °C for 180 min. The IC50 of LsCTI
was 4.7 x10-7 M for Ae. aegypti midgut larvae enzymes. LsCTI did not affect hatchability of
eggs when tested at 0.3 mg.mL-1, but caused a high larval mortality rate (77%) and delayed
development (37%).
CONCLUSIONS: LsCTI is a BBI inhibitor with remarkable biochemical characteristics and
represents a potential tool to control Ae. aegypti development.
Keywords: Chymotrypsin inhibitor, Lonchocarpus sericeus, legume seeds, dengue, zika,
midgut enzymes
50 1 INTRODUCTION
Arboviruses (ARthropod-Borne VIRUS) are a large group of viruses carried and spread
by several arthropods, most commonly blood-sucking insects and represent one of the greatest
challenges to current and future human well-being. Among the arbovirosis are malaria, yellow
fever, Japanese encephalitis, as well as a group of so-called "neglected tropical diseases" like
chikungunya, dengue, leishmaniasis and Chagas' disease.1,2 In addition, the increase in
international trade and human migration have been promoting the accidental introduction of
vectors and/or pathogens across continents.3
Mosquitoes transmit about 30 arboviruses of great importance to global public health,
among which Aedes aegypti (Ditera: Culicidae), an anthropophilic mosquito spread throughout
the wide world and the main vector of Chikungunya, Dengue and Zika virus. The latter deserves
a special attention due to its ability to cross the transplacental barrier and to lodge in the fetal
nervous system, causing not only microcephaly, but also vision problems, deafness,
arthrogryposis and dysphagia.4 The Zika virus also settle and survive in immunoprivileged
tissues, such as the germ tissues present in the testicles, making zika fever a potential sexually
transmitted infection.5 These Ae. aegypti-related diseases are noteworthy due to the absence of
specific antiviral drugs or vaccines approved for their prevention.6 Epidemiological studies
suggest that about 3.9 billion people in more than 120 countries live in risk areas for these
diseases, which along with other arbovirosis represent about 20% of infectious diseases,
causing the death of more than 1 million people every year.7,8 So combating the vector is a
crucial strategy to reduce the incidence of these diseases.9
One of the strategies to eliminate this mosquito is the use of synthetic insecticides
belonging to organochlorines, organophosphates and pyrethroids, which generally act on the
nervous system of insects.10 Although effective, the inadequate management of these
insecticides led to the emergence of resistant insect populations, and due to increased resistance
51 of pests to chemical insecticides, research on natural and biodegradable insecticides that
promote larval mortality and avoid emergencies of resistant strains has increased.11,12
Bioinsecticides are eco-friendly pesticides which do not cause problems in air and water
quality, often targeting only specific insects without causing negative effects to non-target
insects. They can be used in the management of pests harmful to plants and also to combat
vectors of diseases.13,14
Among the molecules of the primary metabolism of plants, pathogen-related proteins
are often associated to protection of organs and reproductive tissues against herbivory. These
proteins constitute an arsenal capable of acting against several types of pathogens and are
potential insecticides; among them are lectins, ribosome-inactivating proteins (RIPs) and
inhibitors of proteolytic enzymes or of glucosidases.15-17
Protease inhibitors are proteins or peptides capable to interact with proteolytic enzymes
and inhibit their catalytic activities.18 These molecules can play various biological roles in
plants, acting as regulators of endogenous proteases, reserve proteins and as plant defense
agents for microorganisms, insects and other herbivorous animals.19 During the last decades,
protease inhibitors have gained much attention due to their involvement in plant defense and
possible applications in plant bioengineering to increase resistance to insects, once their
digestive enzymes became a potential target for their population control.20
The insecticidal potential of protease inhibitors upon different insect classes has been
reported, as for example those from Adenanthera pavonina (ApTI)11, Cassia leiandra (ClTI)21
and Leucaena leucocephala (LTI)22 on larvae of Ae. aegypti (Diptera), the inhibitors from Inga
vera (IVTI)23 and Poincianella pyramidalis (PpyTI)24 upon Anagasta kuehniella neonates and
the inhibitor from Dimorphandra mollis (DMTI-II)25 against Callosobruchus maculatus
(Coleopteran).
52 Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth ex DC is a legume belonging to the Fabaceae
(subfamily Faboideae) that occurs in the semi-arid region of Brazil and is present in America,
Africa, Asia and Oceania. It has been reported the presence of phytochemicals such as alkaloids,
saponins, carotenoids, flavonoids, tannins, triterpenes and steroids in its stem bark, seeds and
root.26 Other studies have shown cytotoxic activity of its flavonoids derricin and lonchocarpine
on several cell types.27,28
In addition to being a good source for secondary metabolites, L. sericeus is also a good
source of proteins and lipids, since its seeds contain about 35 and 30% of these macronutrients,
respectively. Among the proteins, protease inhibitors were identified.29 The present study
reports the purification and partial biochemical characterization of a novel low molecular mass
protease inhibitor from L. sericeus seeds (LsCTI) as well as its ability to promote negative and
deleterious effects on the growth and development of Ae. aegypti larvae.
2 MATERIALS AND METHODS
2.1 Chemicals reagents
Bovine serum albumin (BSA) and enzymes were purchased from Sigma-Aldrich Co.
(St. Louis, USA). The synthetic substrates BApNA (Nα-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide),
BTpNA (N-Benzoyl-L-tyrosine p-nitroanilide), SAAVpNA (n-succinyl-ala-ala- val-p-
nitroanilide), BANA (Na-benzoyl-DL-arg β-naphthylamide) and the protein substrate
azocasein were purchased from Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, USA). Molecular mass markers
for electrophoresis, immobilized pH gel strips and ampholites were obtained from GE
Healthcare Life Sciences (GE ®, USA).
53 2.2 Purification of a protease inhibitor (LsCTI) from Lonchocarpus sericeus seeds
L. sericeus seeds were collected in Fortaleza, State of Ceará, Northeastern Brazil
(3°44'34.5"S 38°34'34.4"W). The seeds were ground using an electric mill, then sieved to
generate a homogeneous flour, which was defatted by hexane extraction (1:3 w/v). Seed
proteins were extracted by using 0.05 M Tris-HCl pH 7.5 buffer (1:10 w/v) under constant
stirring for 2 h at room temperature (24 ± 2 °C) followed by centrifugation for 15 min at 15.000
x g to obtain the supernatant (crude protein extract - CPE). To CPE a solution of trichloroacetic
acid (TCA) was added so that the final concentration was 5%, that mixture was then left at 4 °C
for 30 min to precipitate high molecular mass proteins. The resulting suspension was
centrifuged at 15.000 x g for 10 min, the supernatant was collected (LsF5) and dialyzed four
times against distilled water during 48 h before lyophilization.
To purify the protease inhibitor present in LsF5, one-step chromatography was
performed. Six milligrams of LsF5 were solubilized in 3 mL of 0.05 M Tris-HCl pH 7.5 buffer
and loaded into a trypsin-agarose affinity chromatography column (1 mL of beaded agarose
matrix) equilibrated with the same buffer. After loading, the column was washed with the buffer
at 0.5 mL.min-1 flow rate of until absorbances at 280 nm were less than 0.005 [Spectronic™
Genesys™ 10 VIS Spectrophotometer 335900 (Thermo Fisher Scientific Inc., Wisconsin,
USA)]. The adsorbed proteins were eluted applying 0.05 M HCl solution and the protein elution
was monitored by measuring absorbance at 280 nm. The chromatographic fractions showing
the highest absorbances were pooled together (LsCTI), dialyzed against distilled water for 36 h
and lyophilized. Along the inhibitor purification procedure, all samples were subjected to
protein quantification and chymotrypsin assay.
54 2.3 Protein quantification and chymotrypsin activity
Protein concentration was estimated by Pierce® BCA (Thermo Fischer Scientific,
Massachusetts, USA) protein assay kit using soybean trypsin inhibitor (25 – 2,000 μg.mL-1) as
standard. Chymotrypsin inhibitory activity was performed using BTpNA as substrate.30 Two
hundred microliters of bovine chymotrypsin (EC 3.4.21.1) (0.01 mg.mL-1 in 0.001 M HCl
solution containing 0.002 M of CaCl2 ) were incubated for 2 min with 300 µL of 0.05 M Tris-
HCl pH 7.5 containing 0.02 M CaCl2 and 100 µL of different samples. Next, 200 µL of 5 x 10-
3 M BTpNA (50% dimethyl sulfoxide in 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 7.5) were added and the
mixture incubated at 37 °C. After 30 min, reaction was stopped adding 100 µL of 30% (v/v)
acetic acid in distilled water. BTpNA hydrolysis was monitored at 410 nm. One unit of
chymotrypsin inhibitor activity was defined as the amount of inhibitor capable of decreasing
0.01 of absorbance in regard to standard control. Blank reactions and enzymatic standard
activity were performed in parallel. Results were expressed as mean of three independent assays.
2.4 Characterization of LsCTI
2.4.1 Determination of purity, isoforms and isoeletric point
To verify the purity of purified protein we applied 10 g of LsCTI in an electrophoretic
gel containing 15% of polyacrylamide and sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE). This process
was performed according the methodology proposed by Laemmli.31 After electrophoresis, the
gel containing LsCTI and molecular mass markers [GE lifesciences™; Phosporylase b (97 kDa);
bovine albumin (66 kDa); ovalbumin (45 kDa); bovine carbonic anidrase (30 kDa); soybean
trypsin inhibitor (20.1 kDa); bovine α -lactalbumin (14.4 kDa)], was stained with a solution of
0.08% (w/v) Coomassie Brilliant Blue, 1.6% (w/v) ortho-phosphoric acid and 8% (w/v)
ammonium sulfate in methanol 20% (v/v).
55 Isoelectric focalization was carried out using Ettan™ IPGPhor II™ system (GE Healthcare Life
Sciences, New Jersey, USA). Immobilized pH gradient (IPG) 3–10 gel strip (7 cm) were first
rehydrated overnight at 25 °C by adding 60 μg of LsCTI diluted in 125 μL of rehydration buffer
composed for 7 M urea, 2 M thiourea, 10 μg.μL−1 of 3-[(3-
cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), 10 μg.μL−1 of
dithiothreitol (DTT), 0.01 μg.μL−1 of bromophenol blue, and 0.6 % (v/v) of ampholites (IPG
buffer) and covered with mineral oil in a reswelling tray. The IEF was performed in a stepwise
mode: 300 V for 30 min, 500 V for 30 min, 1000 V for 1 h and 5000 V until reaching 10000 V
h−1. Focused gel strip was placed in a tube with 5 mL equilibration buffer (50 mM Tris–HCl,
pH 8.8, containing 6 M urea, 30% (v/v) glycerol, 2% (w/v) SDS, and 1% (w/v) bromophenol
blue containing DTT 1% (w/v) and gently shaken for 15 min. After that, the strips was placed
in an equilibration solution containing 2.5% (w/v) iodoacetamide. For the second dimension, a
SDS-PAGE was conducted in a vertical system (MiniVE; GE Healthcare Life Sciences) under
20 mA constant current per gel and 200 V of maximum tension. Two gels with identical
dimension (100 × 100 × 1 mm) and were performed using 15% polyacrylamide gels without a
stacking gel. Staining process was conducted as previous describe. Gels images were scanned
using an Imager Scanner (GE Healthcare Life Sciences) and LabScan software. The number of
isoforms were determined by acquired images and isoelectric point was analyzed by
ImageMaster 2D Platinum Software (GE Healthcare Life Sciences).
2.4.2 Mass determination
The purified protein (10 mg.mL-1) was analyzed by matrix-assisted laser desorption
ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The protein solution was
mixed with 1 mL of matrix solution (5 mg 1 –acetil- 2,4- dihydroxybenzene, 2’-4’-
dihydroxyacetophenone dissolved in 250 mL acetonitrile, 0.5 mL trifluoroacetic acid and 250
56 mL water). This mixture (1 mL) was spotted onto a MALDI target plate and left at 25 °C for
drying. The protein masses were obtained in positive linear mode of a Bruker Microflex LT
MALDI-TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA) equipped with a 337-
nm nitrogen laser operated by FlexControl 3.3 software (Bruker Daltonics). The spectra were
acquired in the mass range of m/z 2,000 to 25,000 and external mass calibration was performed
using Protein Standard II (Bruker Daltonics).
2.4.3 Assessement of the inhibitory specificity of LsCTI
2.4.3.1 On Serine proteases
The inhibitory activity of LsCTI on human leucocyte elastase (EC 3.4.21.37) was
evaluated using SAAVpNA as substrate.32 Ten microliters of enzyme (0.5 mg.mL-1 in 0.05 M
sodium phosphate buffer pH 7.4) were incubated for 15 min at 37 ° C with 390 µL of 0.1 M
sodium phosphate buffer pH 7.4 and 100 µL of LsCTI (49.6 x 10-8 M). The reaction was started
adding 100 µL of 0.125 M SAAVpNA in 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7.4. The enzymatic
reaction was proceed for 30 minutes and stopped adding 300 µL 2% (w/v) citric acid in distilled
water. The absorbance was measured at 405 nm. The inhibitory activity toward pancreatic
porcine elastase (EC 3.4.21.36) was evaluated using azocasein as substrate. Fifth microliters of
enzyme (0.2 mg.mL-1 in buffer) were incubated for 15 min at 37 ° C with 350µL of 0.05M Tris-
HCl buffer containing 0.02 M CaCl2, pH 7.5 and 100 µL of LsCTI (49.6 x 10-8 M). The reaction
was initiated adding 200 µL of 1% (w/v) azocasein in 0.05M Tris-HCl buffer. The enzymatic
reaction was carried out for 30 minutes and stopped adding 300 µL of 20% (w/v) TCA solution
in distilled water. Resulting mixture was centrifuged for 10 min at 10.000 xg at 25 °C and 2 M
of NaOH in distilled water was added to supernatant 1:2 (v/v). The absorbance at 440 nm was
measured. Trypsin inhibitor activity was performed using BApNA as substrate for reaction.33
Two hundred microliters of enzyme (EC 3.4.21.4) (0.01 mg.mL-1 in 0,001 M HCl) were
57 incubated for 10 min with 250 µL of 0.05 M Tris-HCl pH 7.5 containing 0.02 M CaCl2 and 100
µL of LsCTI (49.6 x 10-8 M). The reaction was started adding 250 µL of 1.25 mM BApNA in
0.05 M Tris-HCl pH 7.5 and carried out for 15 min until was stopped by addition of 0.1 mL of
30% acetic acid in distilled water (v/v). The absorbance at 410 nm was measured. All tests were
accompanied by standard enzymatic and blank tests and performed in triplicate and results were
expressed as mean of three independent assays.
2.4.3.2 On Cysteine proteases
The inhibitory activity of LsCTI on bromelain (EC 3.4.22.32) was evaluated using
azocasein as substrate prepared in 0.05 M sodium acetate buffer pH 5.5. One hundred
microliters of enzyme (0.01 mg.mL-1 in 0.05 M sodium acetate buffer pH 5.5) were incubated
for 15 min at 37 °C with 360 µL of 0.3 M sodium acetate buffer pH 5.5, 40 µL of activator
solution [0.003 M of Dithiothreitol (DTT) and 0.002 M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)
in 0.3 M sodium acetate buffer pH 5.5] and 49.6 x 10-8 M of LsCTI. The reaction was initiated
adding 200 µL of 1% (w/v) azocasein and stopped after 30 min by the addition of 300 µL of
20% (w/v) trichloroacetic acid in distilled water. The mixture was centrifuged for 10 min at
10,000 xg, 25 °C and 2 M of NaOH in distilled water was added to supernatant 1:2 (v/v). The
absorbance at 440 nm was measured. Inhibitory activity against papain (EC 3.4.22.2) was
carried out using BANA as a substrate.34 Ten microliters of enzyme (0.1 mg.mL-1 in 0.25 M
sodium phosphate buffer pH 6.0) were incubated for 10 min at 37 °C with sodium phosphate
buffer 0.25 M pH 6.0, papain activator solution (0.003 M of DTT and 0.002 M EDTA in sodium
phosphate buffer 0.25 M pH 6.0) and 49.6 x 10-8 M of LsCTI. The reaction was started adding
200 µL of 1 mM BANA. The enzymatic reaction was carried out 20 min and terminated adding
500 µL of 2% HCl in ethanol. Next 500 µL of the color reagent DMACA (p-
dimethylaminocinnamaldehyde) (0.06% in ethanol) were added and mixture, after 10 min, the
58 absorbances were read at 540 nm. All tests were accompanied by standard enzymatic and blank
tests and performed in triplicate and results were expressed as mean of three independent assays.
2.4.3.3 On Glucosidases
The porcine pancreatic α-amylase (EC 3.2.1.1) inhibition assay was performed using
DNS (3,5-dinitrosalicylic acid), as previously described Dias et al.21 Fifth microliters of enzyme
(1.0 mg.mL-1 in 0.02 M sodium phosphate buffer pH 6.9 containing 0.006 M NaCl) were
incubated with 100 µL of above buffer and 100 μL (49.6 x 10-8 M) of LsCTI. After 10 min at
37 °C, the reaction was initiated adding 250 μL of 1% (m/v) starch solution in buffer assay. The
reaction was proceeded for 15 min and stopped by the addition of 500 μL of 1% (w/v) DNS in
1 M NaOH aqueous solution containing 1 M sodium potassium tartrate. The mixture was boiled
in a water bath for 10 min, diluted with 2.5 mL of distilled water, cooled to room temperature
(23 ± 2 °C) and the absorbance was measured at 540 nm. All tests were accompanied by
standard enzymatic and blank tests and performed in triplicate and results were expressed as
mean of three independent assays.
2.4.4 Kinects of LsCTI
The kinetics measurements of chymotrypsin inhibition by LsCTI were conducted
according to Dias et al. with modifications.21 LsCTI was solubilized in 0.05 M Tris-HCl buffer,
pH 7.5, at different concentrations (3.95 x 10−8 M, 9.22 x 10−8 M, and 13.16 x 10−8 M) and
incubated with 200 μL chymotrypsin (0.01 mg.mL−1 in 0.001 M HCl) at 37 °C. The reaction
was initiated adding 300 μL of BTpNA at different concentrations (0.23 x 10−3 M to 12.18 x
10−3 M) and stopped 30 min later adding 100 μL 30% (v/v) acetic acid. The absorbance was
measured at 410 nm. A Lineweaver–Burk plot was obtained by reciprocal of rate of the enzyme
reaction (1/v) versus reciprocal substrate concentration (1/[S]) in the absence and presence of
59 LsCTI. The inhibition constant (Ki) was determined according to Dixon.35 Ki was obtained by
the intersection of the five lines at the x-axis, corresponding to the substrate concentrations
(0.23 x 10-3 M, 0.40 x 10−3 M, 0.60 × 10−3 M, 0.91 x 10−3 M and 1.22 x 10−3 M).
The kinetics inhibition of LsCTI was determined by its solubilization in different
concentrations (9.17 x 10−8 M, 18.33 x 10−8 M, and 36.66 x 10−8 M) in 0.05 M Tris-HCl buffer,
pH 7.5 and it was incubated with 200 μL trypsin (0.01 mg.mL−1 in 0.001 M HCl) at 37 °C. The
reaction was initiated adding 300 μL of BApNA at different concentrations (0.7 x 10−3 M to
22.55 x 10−3 M) and after 15 min adding 100 μL 30% (v/v) acetic acid. The absorbance was
measured at 410 nm. As previous described for chymotrypsin kinect inhibition, a Lineweaver–
Burk plot was obtained and Ki was obtained by the intersection of the four lines at the x-axis,
corresponding to the substrate concentrations (0.70 x 10−3 M, 1.06 x 10−3 M, 1.40 x 10−3 M and
2.25 x 10−3 M).
2.4.5 LsCTI Stability
Stability inhibitory upon chymotrypsin and trypsin was assessed using aliquots of these
respective concentrations of LsCTI, 49.6 x 10-8 M and 116.8 x 10-8 M, dissolved in 0.05 Tris-
HCl buffer pH 7.5. For thermal stability these aliquots were incubated in water bath at different
temperatures (37, 40, 50, 60, 70, 80, 90 and 100 °C) for 30 min. As well other aliquots were
incubated at 100 °C in different times (30, 60, 90, 120 and 180 min). After thermal treatment,
samples were cooled to room temperature (23±3 °C) and the residual inhibitory activity was
assessed as previous described for these enzymes. The stability after exposure to pH range was
evaluated according to Klomklao et al.36, for that aliquots of LsCTI were dissolved in different
buffer solutions (0.1 M): glycine-HCl (pH 2), sodium acetate (pH 4), sodium phosphate (pH 6),
Tris–HCl (pH 8), glycine-NaOH (pH 10) and sodium phosphate (pH 12). After incubation in
each buffer for 16 h at 4 °C, the pH was adjusted to pH 7.5 and residual inhibitory activity for
60 chymotrypsin and trypsin were assessed. To verify the resistance in front of reducing chemical
agent dithiothreitol (DTT), we used the methodology proposed by Bezerra et al.23Aliquots were
incubated at 37 °C with DTT at final concentrations (0.001, 0.01 and 0.1 M) for different times
(15, 30, 60 and 120 min). The reaction was terminated by the addition of twice iodoacetamide
amount of each DTT concentration. After treatments, samples were subjected to determination
of residual inhibitory activity for chymotrypsin and trypsin. All experiments were run in
triplicate and the results are mean of three independent assays.
2.5 Activities upon Ae. aegypti
2.5.1 Mosquitoes
Ae. aegypti (Rockefeller strain) eggs and larvae were obtained from NUVET/SESA
(Núcleo de Controle de Endemias Transmissíveis por Vetores/ Secretaria de Saúde do Estado
do Ceará) and maintained at 27 ± 2 ºC, with a photoperiod of 14 L: 10 D. Larvae were fed ad
libitum with turtle food (Alcon®) until archive third or fourth instar larvae for further assays.
2.5.2 In vitro inhibition of Aedes aegypti midgut proteases
To measure the inhibitory activity of LsCTI toward Ae. aegypti midgut proteases,
azocasein was used as substrate for enzyme reaction. To obtain Ae. aegypti proteases, 200
midguts were dissected from 4th instar larvae, and transferred to a microtubes containing 250
µL of 0.05 M Tris-HCl pH 7.5 buffer in ice bath, later midguts were gently macerated and
centrifuged at 10.000 x g for 10 min at 4 °C, the supernatant was collected and used in further
enzymatic assay. Sixth microliters of enzymatic solution were incubated with different
concentrations of LsCTI (0.15 x 10-6, 0.30 x 10-6, 0.60 x 10-6 and 0.90 x 10-6 M) and 340 µL of
0.05 M Tris-HCl pH 7.5 containing 0.02 M CaCl2 at 37 °C for 10 min. To start reaction 200 µL
of 1% azocasein (w/v) in 0.05 M Tris-HCl pH 7.5 buffer was added. After 30 min, the reaction
61 was stopped by adding 300 µL of 20% TCA solution in distilled water. The mixture was
centrifuged for 10 min at 10,000 x g, 25 °C and 2 M NaOH in distilled water was added to
supernatant 1:2 (v/v). Absorbances were measured at 440 nm. As enzymatic standard, the
homogenate without LsCTI was incubated at the same conditions. All test were run in triplicate
and results were expressed as mean of three independent assays.
2.5.3 Effect on Egg hatching
The effect of LsCTI upon hatching of Ae. aegypti eggs was performed as described by
Souza et al.37 with slight modifications. Ten eggs of Ae. aegypti were selected considering their
integrity by using a stereomicroscope Luxeo 4Z (Labo America, Inc., California, USA) and
placed into tubes containing 5 mL of LsCTI solubilized in distilled water (final concentration
0.3 mg.mL-1 (3,38 x 10−5 M)). Positive (0.3 mg.mL-1 soybean Bowman-Birk inhibitor (3.75 x
10−5 M) and negative controls (distilled water and 0.3 mg.mL-1 bovine serum albumin) were
also tested under the same conditions. Each samples were run in three replicates and results
were presented as mean of this.
2.5.4 Effect on Development assay
To evaluate the effect of LsCTI and its precursor protein fraction (LsF5) upon Ae.
aegypti development we used the methodology proposed by Almeida Filho et al.22 Ten eggs
were gently placed into glass tubes containing 5 mL of 0.3 mg.mL-1 LsCTI (3.38 x 10−5 M) or
LsF5 solution (0.3 mg.mL−1), both in distilled water. A solution 0.3 mg.mL−1 of soybean BBI
(3.75 x 10−5 M) was used as positive protein control and bovine serum albumin (0.3 mg.mL−1)
as a negative, using the same solvent. Only distilled water was also used as standard for
development time. The number of hatched larvae after 48 h were recorded for treatments. The
development stages, number of individuals and survival rates for each treatment were
62 monitored along 11 days. To prevent microbial growth, larvae were transferred to a new test
solution every 72 h and receive an amount of turtle feed (0.2 mg per larva). The experimental
results were taken as the average of ten independent replicates.
2.6 Statistical analysis
Analyses of variance (ANOVA) were used for each set of results, followed by Dunnet
test (p<0.05) and/or Tukey test (P<0.05) for determining whether there were significant
differences among treatments.Results were expressed as means ± SD.
3 RESULTS AND DISCUSSION
Plants are sessile organisms which are constantly exposed to stress factors of the
environment. Besides the improper influences of their surroundings, they are also subject to
constant attack from predators and pathogens. To overcome unfavorable conditions, plants
underwent evolutionary adaptations that culminated in the development of bioactive
compounds, some of which are toxic.38 Among these compounds, protease inhibitors have
been gaining considerable attention due to their involvement in plant defense and possible
applications in plant engineering to increase resistance to pest insects and other pathogens.
Regarding to insects, inhibitors targeting chymotrypsin-like and trypsin-like proteases are of
particular interest due to their roles in insect nutrition, growth and development.20,39,40 There
are many reports for the presence of protease inhibitor in Fabacea family plants.21,41 Together
with these reports Carvalho et al.29 have previously described the presence of trypsin inhibitors
in L. sericeus seeds, a legume belonging to Papilionoideae, a Fabaceae subfamily. In front of
biotechnological potential of protease inhibitors, we aimed to purify this novel inhibitor
present in L. sericeus seeds and assess to insecticidal effect upon Ae. aegypti a multiple disease
vector.
63 Before inhibitor purification, the crude protein extract from L. sericeus seeds was
assessed to its chymotrypsin inhibition ability and the specific activity achieved for that protein
sample was 1,808.51 CUI.mg-1. Next, the crude extract was subjected to protein precipitation
by TCA addition to obtain the TCA-protein fraction (LsF5) which exhibited 5,631.77 CUI.mg-
1. This protein fraction was loaded into trypsin-agarose column and two peaks were obtained,
the first was eluted with equilibration buffer and the second eluted by applying 0.05 M HCl
(Figure 1). Eluted fractions from second peak were pooled together (LsCTI) and exhibited
higher specific activity 14,935.06 CUI.mg-1. The purification process of LsCTI was 8.26 fold
according to chymotrypsin inhibitory activity. The purification was summarized in Table 1.
According to Carvalho et al.29 L. sericeus seeds have a high content of protein, around
35% in dry weight basis, similar to this finding we observed a high content of soluble proteins
in the crude extract, 18% in dry weight basis. This finding reinforces our hypothesis about L.
sericeus be a good source of proteins with biological activity. Until present time, there is no
chymotrypsin inhibitor report for that plant. Among the bioactive proteins already reported are
lectin, trypsin inhibitor and urease.29,42 The purification of LsCTI by a single chromatography
step achieved a 0.88% protein yield. LsCTI recovery was lower than those reported for Butea
monosperma (7.7%)43 and Artocarpus heterophyllus (7.1%)44 protease inhibitors, but higher
compared to that of Pipitadenia moniliformis (0.15%).45
In order to characterize this novel inhibitor, we subjected that molecule to many assays.
An SDS-PAGE of LsCTI shows a single protein band (inset Figure 2) which was analyzed by
mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) under native conditions generating a spectrum (m/z)
with a major peak at 8,870.45 Da (Figure 2A). The molecular mass observed for LsCTI was
similar to those of other chymotrypsin inhibitors reported as BTCI from Vigna unguiculata
(9.1 kDa) and WeCI from Triticum dicoccoides (13 kDa).46,47 It is well known the protease
inhibitors generally have more than one isoform.48,49
64 Tabela 1: Table 1 – Purification steps of Lonchocarpus sericeus chymotrypsin/trypsin
inhibitor (LsCTI) from 1000 mg defatted seed flour
aInhibitory activity toward bovine chymotrypsin. One unit of chymotrypsin inhibitor
activity was defined as a decrease of 0.01 in absorbance (410 nm), at 37 °C after 30 min.
bSpecific activity was calculated taking the ratio of total inhibitory activity (CIU) to totalprotein
content (in milligrams).
cYield was based on protein recovered after each purification stage regarding to crude protein
extract content.
dPurification was measured as the ratio between the specific activity in the purification stage
and specific activity of crude protein extract.
Sample Volume
(mL)
Total protein
(mg)
Total
activity
(CIU)a
Specific
activity
(CIU.mg-1)b
Yield
(%)c
Purification
indexd
CPE 8.8 181.88 328,931.92 1,808.51 100 1
LsF5 12.4 22.92 129,102.67 5,631.77 12.60 3.11
LsCTI 10.4 1.60 23,925.97 14,935.06 0.88 8.26
65 When LsCTI was subjected to a 2-D electrophoresis process we obtained a profile
showing 4 isoforms with isoelectric point ranging from 4.19 to 4.92 (Figure 3). Morrison et al.
have described the presence of isoforms of trypsin inhibitors in pea (Pisum sativum L.) seeds,
which had distinct isoelectric points ranging from 4.6 to 7.6.50 EE et al.49 have described three
isoforms for trypsin inhibitors present in Acacia victoriae seeds with isoelectric points varying
between 4.27 and 5.13. The presence of multiple isoforms is a common phenomenon which can
be explained through post-translational modifications or gene duplication phenomena.25 As a
practical example, insects have biochemical mechanisms to escape from inhibitor insecticidal
activity, on the other hand plants during prey predator co-evolution developed strategies to
overcome insect adaptations. This example supports the presence of more than one isoform,
which although quite similar among each other they have different characteristics such as
isoelectric point, inhibitory capacity and resistance to digestion.50,51
Enzyme inhibitors may show different enzyme specific inhibitory activity. Few
inhibitors are specific for chymotrypsin but do not inhibit trypsin,19 whereas others are specific
for trypsin but do not exert activity upon chymotrypsin;21 Some are potent trypsin inhibitors
and inhibit chymotrypsin as well, such as the inhibitor purified from Derris trifoliata seeds,48
or have the ability to inhibit enzymes of different classes, such as the inhibitor from A. pavonina
seeds (ApKTI), which inhibits trypsin and papain.41 Tests for enzyme inhibition specificity of
LsCTI was performed for 3 enzymes classes (serine and cysteine proteases and glucosidase).
Among the enzymes tested, LsCTI was able to inhibit only serine proteases (Table 2), showing
higher values for chymotrypsin and trypsin. Interestingly the chymotrypsin inhibitor from T.
dicoccoides (WeCI) did not exert inhibitory activity towards trypsin but was able to promote
inhibition upon α-amylase characterizing a bifunctional inhibitor.47
66 Tabela 2: Table 2 – Enzyme specific inhibitory activity of LsCTI toward different enzymes
classes
aValues are means ± standard deviation of three independent assays. Inhibition was calculated
based on the enzyme activity in the absence of LsCTI.
Once LsCTI is an inhibitor of multiple serine proteases which acts preferably towards
chymotrypsin and trypsin, we performed the following characterization assays by using only
those two enzymes. To characterize the inhibition type exerted by LsCTI upon these enzymes,
kinetic assays were performed. Analyzing the generated Lineweaver-Burk diagrams we
observed that LsCTI is a noncompetitive inhibitor for both chymotrypsin (Figure 4A) and
trypsin (Figure 4B) once Km and Vmax values were altered. This type of inhibition was reported
for TTI from Tamarindus indica52 and ApTI from A. pavonina.53 Although LsCTI showed the
same inhibition type for both tested enzymes, a different enzymatic affinity was previously
noted. That was confirmed by constructing Dixon plot diagrams to determine inhibition
constant (Ki) which was 8.24 x 10-8 M and 7.61 x 10-7 M for chymotrypsin (Figure 4C) and
trypsin (Figure 4D), respectively. The lower Ki value of LsCTI obtained for chymotrypsin
corroborates its higher affinity for that enzyme. LsCTI Ki value for trypsin was higher than
BmPI from B. monosperma (1.2 x 10-9 M)43 and IVTI from Inga vera (1.19 x 10-9 M)23, but Ki
Enzyme class Inhibitiona (%)
Serine Chymotrypsin 92 ± 0.5
Trypsin 49 ± 1.2
Neutrophilic elastase 25 ± 1.6
Pancreatic elastase 13 ± 0.7
Cysteine Bromelain 0
Papain 0
Glucosidase Pacreatic α-amylase 0
67 value for chymotrypsin is similar in magnitude to the inhibitor from Ricinus communis (1.9 x
10-8 M)54 and AHLTI from A. heterophyllus (3.47 x 10-8 M).44
An important step to point out proteins as biotechnological tools is to determine their
optimal activity conditions, especially in front of ranges of temperature and pH, as well as the
stability against chemicals, such as DTT, which can reduce the disulfide bridges. Protease
inhibitor without disulfide bridges are more susceptible to variations of pH and temperature.55.
The disulfide bridges play a well-known role in stabilization of protease inhibitor structure and
biological functions.33 Before proceeding to LsCTI incubation with different concentrations of
DTT, we determined the minimum amount of LsCTI to achieve maximum inhibition for
chymotrypsin (49.6 x 10-8 M) and trypsin (116.8 x 10-8 M). After DTT incubation, LsCTI loses
its inhibitory activity towards chymotrypsin and trypsin following the increase in DTT
concentration. The lowest DTT concentration (1 x 10-3 M) did not affect the activity even after
120 min of incubation time, whereas at 10 x 10-3 M it was necessary only 30 min of incubation
to reduce more than 80% of the inhibitory activity upon chymotrypsin (Figure 5A) and totally
for trypsin (Figure 5B). Although the LsCTI reduction caused by higher DTT concentrations
led to loss of activity for both enzymes assessed, that molecule was more resistant to reduction
than CFPI from Clitoria fairchildiana that loses 77% of its inhibitory activity for trypsin and
44% for chymotrypsin after 120 min incubation with DTT (1 x 10-3 M )56 and BgPI from Vigna
mungo which lost completely its activity after 15 min at the same DTT concentration.57 The
incubation of LsCTI with DTT (10 x 10-3 M) for 30 min caused completely loss of its inhibitory
activity upon trypsin and over 80% for chymotrypsin. This finding suggests the existence of
more disulfide bonds near the anti-trypsin reactive site than near the anti-chymotrypsin one.
Similar findings have been reported for CFPI from C. fairchildiana56 and horsegram BBI from
Dolichos biflorus.58
68 The LsCTI was stable to expousure pH range maintaining its inhibitory activity upon
chymotrypsin (Figure 5C) and trypsin (Figure 5D). Similarly, the protease inhibitor from T.
dicoccoides (WeCI) was shown to be stable in a wide pH range (2-12)47 and differently, the
BmPI from B. monosperma had been shown to maintain activity only at the pH range of 5-10.43
The LsCTI stability after heat treatment was remarkable, that molecule was able to maintain its
inhibitory activity in all temperature tested (37 °C – 100 °C) (Figure 5E) even when heated at
100 °C for 180 min (Figure 5F). Protease inhibitors with disulfide bridges generally are stable
to high temperatures and pH variations. Differently from the higher thermal stability of LsCTI,
the BBI from Vicia faba was stable only until 60 °C59 and PpyTI from P. pyramidalis until
70 °C after same time incubation.24 Similar to the results for LsCTI, the BBI from soybean
retains its inhibitory activity even after heating at 100 °C.60 Protease inhibitors from Fabaceae
plants are generally stable up to 80 °C, however there are cases of stability loss above this
temperature.61 The stability of these protease inhibitors may be associated with the rigidity of
their tridimensional structure and the number of disulfide linkages. Together, these factors
allow the inhibitors to undergo slight conformational changes and yet be able to renature after
adverse conditions.21
Among serine, cysteine, aspartic or metallo-protease inhibitors, the first type are the
most common and best studied.62 Within serine protease inhibitors there are two families which
should be highlighted, Kunitz and Bowman-Birk. These families are abundant in various
legumes.56 Characteristics observed for LsCTI such as its low molecular mass (8.87 kDa),
inhibitory activity towards several serine enzymes, remarkable stability in front of denaturing
agents suggest that the inhibitor is a novel Bowman-Birk (BBI). Furthermore, L. sericeus
belongs to Papilionoideae, the most evolutionarily derived Fabaceae subfamily which typically
expresses BBI in contrast to other subfamilies expressing Kunitz-type inhibitor.45 According to
Domoney et al.63 BBIs are products of multigene families justifying the existence of multiple
69 isoforms as we have shown for LsCTI. Similarly, other BBIs have been purified from
Papilionoideae species and showed isoforms like P. sativum63 and Lens culinaris.64
The plant protease inhibitors can play diverse physiological functions such as regulation
of self-proteases, reserve of sulfur amino acids and acting as defense molecules against
herbivorous animals like insect pests. Those proteins can bind to insect proteases blocking its
activity which can promote an impairment in the absorption of nutrients necessary for growth,
development and survival.39 There are many reports both in vitro and in vivo for the activity of
protease inhibitors upon larval gut enzymes. Silva et al.54 have reported the in vitro inhibition
of Ae. aegypti larvae midgut proteases by trypsin inhibitor from R. communis and Sasaki et al.11
showed the in vivo inhibition of Ae. aegypti enzymes after larvae incubation in solutions of
ApTI, an inhibitor from A. pavonina. In order to characterize the insecticidal activity of LsCTI,
we firstly evaluated its ability to inhibit in vitro the midgut proteases extracted from Ae. aegypti
larvae (Figure 6). This inhibitor at the highest tested concentration (9.0 x 10-7 M) was able to
bind and block insect proteases activity, causing about 60% inhibition and the calculated IC50
was 4.7 x10-7 M. The inhibition value was higher than the one reported for R. communis trypsin
inhibitor.54 The IC50 was 10-fold lower than that reported for ClTI21 suggesting that LsCTI had
more affinity to this insect midgut proteases and may play insecticidal activity towards
immature developmental stages.
Chymotrypsin and trypsin-like proteases are present in insect orders like lepidopterans
and dipterans. These enzymes have been reported to be involved in protein digestion for
nutrition and development along Ae. aegypti life cycle.65,66 Once LsCTI was able to in vitro
inhibit the midgut enzymes of this mosquito larvae, in vivo assays were performed to verify
how this inhibitor can affect mosquito development. For the in vivo assays, both LsCTI and its
precursor protein fraction (LsF5) were used. The Ae. aegypti egg hatchability was about 80%
and was not affected after incubation in LsCTI or LsF5 solutions (0.3 mg.mL-1) for 48 hours,
70 being similar to protein controls. Similarly, other protease inhibitors did not affect egg
hatchability such as ClTI21 and MoFTI from Moringa olifera.12 On the other hand, protease
inhibitor from L. leucocephala inhibited the egg hatching by 50% at the same conditions.22
Other classes of proteins have also been reported on their ability to inhibit egg hatchability,
such as lectins67 and cysteine proteases.68
Regardless of LsCTI did not affect egg hatching, this inhibitor was able to delay larval
development and to cause high larval mortality. The delay promoted by bioactive proteins
LsCTI, LsF5 and BBI were 25; 12.5 and 37.5%, respectively. Interestingly, the protein control
(BSA) reduced the time required for arising mosquitoes generating a negative value for
development time (Table 3). A visual register was made of larvae after 96 h treatment, protease
inhibitors (BBI and LsCTI)-treated larvae (Figure 7C and 7D) were smaller and have external
structures, such as cuticle and siphon, underdeveloped when compared to control (figure 7A)
and LsF5-treated larvae (Figure 7B). In agreement with our results, others authors have reported
the ability of protease inhibitors to delay the Ae. aegypti larvae development, such as the LTI 22
and MoFTI.39
In our study, BSA treatment was apparently an additional source of proteins that ensured
more nutrients for larvae growth and acceleration of their development. On the other hand, the
chronic ingestion of inhibitors may have impaired protein digestion and essential nutrients
uptake, such as amino acids, and this could delay insect development as suggested by Paiva et
al.69 Furthermore the tight binding of protease inhibitors to insect digestive proteases can trigger
an adaptive response, where insects change their protease profile to evade inhibitor action or an
enzyme overproduction can be elicited to keep digestive and absorption rates, but sometimes it
may decrease sulfur-amino acids availability.43
The mortality rate calculated at the end of 11 days as the ratio of survivors to hatched
larvae was not significantly different (p < 0.05) among protease inhibitors-treated larvae.
71 Although protein fraction (LsF5) had promoted delay in development, the mortality rate
promoted by that fraction (19.4% ± 12.0) was not significantly different (p < 0.05) when
compared to BSA (6.4% ± 9.3) and distilled water (8.0% ± 10.3) (Table 3). LsF5 contains 7%
of LsCTI and was able to delay larval development, however it did not cause a high mortality
rate as the purified inhibitor did. This suggests that LsCTI is the active principle responsible for
causing larvae death.
Protease inhibitors have been frequently reported to cause deleterious effects on insect
larvae, such as growth rate delay, increased mortality and severe deformations.69 In our study
we observed all these deleterious effects. Similarly, Sasaki et al.11 have reported that the
incubation of Ae. aegypti larvae with ApTI (0.25 mg.mL-1) caused about 80% larvae mortality
and hypertrophy of the gastric caeca cells, the latter may be related to the overexpression of
digestive enzymes. Mortality rate values for Ae. aegypti larvae treated with LsCTI (0.3 mg.ml-
1) was 76,9% and higher than that described for trypsin inhibitor from M. oleifera flowers and
that from C. leiandra which caused 47 and 44% of mortality at the same concentration,
respectively.39,21 The insecticidal effect of serine protease inhibitor such as LsCTI is not limited
only to dipterans insects, there are several studies reporting the effects of proteases inhibitor
towards insects belonging to lepidopterans24,43,56 or even but not so common upon
coleopterans.23
Our findings suggest that LsCTI is a BBI-like inhibitor with promising insecticidal
activity against Ae. aegypti, once it inhibits insect midgut proteases and cause high mortality
after chronic exposure even at low concentrations. It is also important to point out that the
interruption or delaying of insect life cycle, such as that of Ae. aegypity, consists one of the
important strategy to reduce vector population.21 In addition, our results contribute for a better
understanding on the insecticidal potential of plant protease inhibitors and especially for
72 recognizing L. sericeus as source of bioactive proteins. Therefore LsCTI may be employed as
a biotechnological tool in strategies for Ae. aegypti control.
73 Tabela 3 Table 3: Effect of LsCTI on the development of Aedes aegypti larvae arising from eggs treated with aqueous solution (0.3 mg.mL-1). The
mortality, number of individuals at different stages and delay on development were determined after eleven days of exposure. Bovine serum
albumin, Soybean Bowan-Birk inhibitor and LsF5 were used at the same conditions. Distilled water was used as control. The mortality values are
present as means and standard deviation of ten replicates. The different letters indicate significant difference assessed by Tukey (p <0.05).
Treatment Aedes aegypti
Number of
individuals 11
days after egg
treatment
Number of individuals at different stages of mosquito life
cycle
Larvae
mortality (%)
Time for first
mosquito
hatching (days)
Developmental
time delay (%)
Larvae instar Pupae Mosquito
L1 L2 L3 L4
BSA 76 0 0 0 5 14 57 6.4 ± 9.3ª 7 -12.5
BBI 33 0 0 0 6 7 20 55.4 ± 17.0b 10 25
LsF5 60 0 0 0 13 17 30 19.4 ± 12.0ª 9 12.5
LsCTI 20 0 0 0 0 13 7 76.9 ± 11.2b 11 37.5
Control 76 0 0 0 6 14 56 8.0 ± 10.3ª 8 0
74 4 ACKNOWLEDGEMENTS
The authors thank MCT-INSA/CNPq/CT- through Hidro/Ação Tranversal N º 35/2010-
Desenvolvimento Sustentável do Semiárido Brasileiro and Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal do Ensino Superior (CAPES) for financial support of this research.
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84 ATTACHMENTS
0.05 M HCl
Figura 5 - Figure 1 – Chromatographic profile of LsF5 from Lonchocarpus sericeus on trypsin
agarose column equilibrated with 0.05 M Tris-HCl pH 7.5 buffer. Non-adsorbed proteins were
eluted by washing with equilibration buffer. Adsorbed proteins were eluted with by adding
0.05 M HCl (arrow tip). Fractions of 1.0 mL were collected at flow rate of 0.5 mL.min-1 and
subjected to chymotrypsin inhibition assay.
85 97.0
66.0
45.0
30.0
21.0
14.0
1 2
Rel
ativ
e in
tens
ity
Mass (m/z)
Figura 6 - Figure 2 – Mass spectrum (MALDI-TOF-MS) of Lonchocarpus sericeus chymotrypsin
and trypsin inhibitor (LsCTI) under native conditions revealed a major peak at 8,870.45 Da; Inset:
SDS-PAGE (15% w/v) profile of LsCTI, 1- molecular mass markers (kDa), 2- LsCTI.
86 3 10 pH range
4.19
4.52
4.77
4.92
Figura 7 - Figure 3 – Electrophoretic profile on SDS-PAGE (15% w/v) of LsCTI after
isoelectric focalization on a 7 cm gel strip with immobilized pH range (3-10). Arrows indicate
the isoelectric point for observed isoforms
87 A
C
B
D
Figura 8 - Figure 4 – Inhibition kinetics. Lineweaver-Burk plot analysis of LsCTI toward (A)
chymotrypsin and (B) trypsin. Dixon plot for determination of LsCTI dissociation constant
(Ki) at different substrate concentration for (C) chymotrypsin and (D) trypsin. Ki was 8.24 x
10-8 M and 7.61 x 10-7 M for chymotrypsin and tryspin, respectively.
88
A B
C D
E F
Figura 9 - Figure 5 – LsCTI inhibitory stability. (A) and (B) after incubation with different
DTT concentrations and times at 37 °C; (C) and (D) after pH incubation at different pH for 16
h at 4 °C; (E) thermal stability after 30 min incubation at different temperatures and (F) after
100 °C in different times. Bars correspond to SD from triplicate measurements.
89 Figura 10 - Figure 6 – Inhibition of Aedes aegypti midgut digestive proteases by different concentrations of LsCTI. The inhibition percentage was calculated regarding to midgut proteases in the absence of LsCTI.
90
LS
LS
LS
LS
LC
LC LC
LC
A
C
B
D
Figura 11 - Figure 7 - External morphology of Aedes aegypti larvae after 96 h incubation with (A) distilled water; (B) Lonchocarpus sericeus protein fraction (LsF5); (C) soybean Bowman-Birk inhibitor and (D) LsCTI. All protein samples were used at 0.3 mg.mL-1. Larva cuticle (LC) and larva siphon (LS) were pointed by arrows. The bar size equals 1 mm.
