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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
GENÉTICA TOXICOLÓGICA DA CHALCONA SULFONAMIDA (CPN):
EVIDÊNCIAS DE GENOTOXICIDADE E ANTIMUTAGENICIDADE EM
DIFERENTES SISTEMAS-TESTE IN VIVO E IN VITRO
CAROLINA RIBEIRO E SILVA
GOIÂNIA-GO
2015
CAROLINA RIBEIRO E SILVA
GENÉTICA TOXICOLÓGICA DA CHALCONA SULFONAMIDA (CPN):
EVIDÊNCIAS DE GENOTOXICIDADE E ANTIMUTAGENICIDADE EM
DIFERENTES SISTEMAS-TESTE IN VIVO E IN VITRO
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas do
Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Goiás, como
requisito parcial para a obtenção do título de
Doutor em Ciências Biológicas.
Área de Concentração: Bioquímica e Genética Orientadora Profa. Dra. Lee Chen Chen
GOIÂNIA-GO
2015
Dedicatória
Dedico esta Tese ao meu marido Bruno,
meu companheiro de vida! Com você ao
meu lado, tudo fica mais leve.
Aos meus amados pais, Fátima e
Celso, sempre com o coração cheio
de orgulho, me apoiando e
incentivando em todos os meus
sonhos, na minha vida profissional e
pessoal.
Às minhas irmãs, Graciély e
Andressa, e à minha sobrinha,
Gabrielly, pelo eterno laço de amor e
amizade.
À professora Dra. Lee Chen Chen, pela
dedicação, amizade e por me oferecer
muito mais do que uma orientação
acadêmica.
IV
Agradecimentos
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, pela
oportunidade oferecida.
À CAPES, pela concessão da bolsa de doutorado.
À FAPEG, pelo suporte financeiro e por acreditar no potencial desse estudo.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas, que contribuíram com seus conhecimentos para minha formação
acadêmica.
À Banca Examinadora, que gentilmente aceitaram o convite para avaliarem
esta tese de Doutorado.
À profa. Caridad Noda Pérez, pela parceira e pelas valiosas contribuições no
artigo e na tese.
Ao prof. Aparecido Divino da Cruz, por ter disponibilizado o laboratório e
equipamentos para a realização de experimentos.
À profa. Daniela de Melo e Silva, pelo apoio e parceria.
À profa. Elisângela de Paula Silveira Lacerda, por ter disponibilizado o
laboratório e equipamentos para a realização de experimentos.
À minha amiga Nilza Nascimento Guimarães, pelo apoio, solidariedade e
amizade.
À Aline Bernardes, pela parceria interlaboratorial e conhecimentos químicos.
V
À Joice Vinhal Costa Orsine, Cínthia Aparecida Silva, Flávia de Castro
Pereira e Flávio Fernandes Veloso Borges, pela parceria laboratorial e amizade.
Ao Jefferson Hollanda Véras, pela troca de conhecimentos e pela ajuda
sempre presente.
Aos amigos do Laboratório de Radiobiologia, prof. Salvador de Carvalho,
Cristiene Costa Carneiro, Camila Regina do Vale, Débora Cristina da Silva
Lima, Aroldo Vieira de M. Filho, Cláudia de Jesus Silva, Alex Lucas Hanusch,
Rangel Moreira e Silva, Luana Santos Silva, Priscila Zei Melo, Jefté Barbosa
Silva, Brenda R. L. Góes, Eliane Blanco Nunes, pela amizade, colaboração e
momentos compartilhados.
Aos amigos do Laboratório de Citogenética, pelo acolhimento e pronta
disponibilidade na condução dos experimentos.
À família do meu marido, tão minha também, Éber e Marilda, Múcio e
Raquel, Diego e Jaqueline, pelo apoio, incentivo e orações.
Aos meus queridos sobrinhos, Enzo, Pedro e Bento, pela alegria
despreocupada que emitem.
Às minhas eternas amigas, Karla, Paula e Valdirene, pelo apoio, incentivo e
amizade.
À Deus, força maior, sempre abençoando os meus passos.
VI
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas e Siglas............................................................................... VIII
Lista de Figuras..................................................................................................... IX
Lista de Tabelas.................................................................................................... XI
Resumo................................................................................................................. XII
Abstract................................................................................................................. XIV
1. Introdução......................................................................................................... 1
1.1. Chalconas e Sulfonamidas............................................................................. 1
1.2. Mutação e Antimutagenicidade...................................................................... 6
1.3. Ciclo Celular e Morte Celular......................................................................... 9
1.4. Ensaios de Genética Toxicológica................................................................. 18
1.4.1. Teste de Mutagenicidade de Ames............................................................. 18
1.4.2. Teste do Micronúcleo em medula óssea de camundongos........................ 21
1.4.3. Ensaio Cometa............................................................................................ 25
1.5. Ensaios Biológicos para o Ciclo Celular e Morte Celular............................... 27
1.5.1. Análise da Cinética do Ciclo Celular........................................................... 28
1.5.2. Detecção de Apoptose e Necrose por coloração com Anexina V/Iodeto
de Propídeo (IP)....................................................................................................
29
2. Objetivos........................................................................................................... 31
2.1. Objetivo Geral................................................................................................ 31
2.2. Objetivos Específicos..................................................................................... 31
3. Material de Métodos.......................................................................................... 32
3.1. Material........................................................................................................... 32
3.1.1. Síntese da chalcona sulfonamida, N-4-[3-(4-nitrofenil)prop-2-enoil]fenil-
benzenosulfonamida (CPN) .................................................................................
32
3.1.1.1. Síntese da 4-N[fenilsulfonilamida] acetofenona 3.................................... 33
3.1.1.2. Síntese da chalcona sulfonamida (1[4’-N-fenil-sulfonilamidafenil]-3-(4-
nitrofenil-2E-propen-1-ona) ..................................................................................
33
3.1.2. Cepas Bacterianas...................................................................................... 34
3.1.3. Camundongos............................................................................................. 34
3.1.4. Cultura de sangue periférico humano......................................................... 35
3.1.5. Cultura de células mononucleares humanas.............................................. 35
VII
3.2. Metodologias.................................................................................................. 36
3.2.1. Teste de Mutagenicidade de Ames em cepas de Salmonella typhimurium 36
3.2.1.1. Procedimento Experimental..................................................................... 36
3.2.1.2. Análise dos resultados............................................................................. 36
3.2.2. Teste do Micronúcleo em medula óssea de camundongos........................ 37
3.2.2.1. Procedimento Experimental..................................................................... 37
3.2.2.2. Análise citogenética................................................................................. 38
3.2.2.3. Análise estatística.................................................................................... 38
3.2.3. Ensaio Cometa............................................................................................ 39
3.2.3.1. Procedimento Experimental..................................................................... 39
3.2.3.2. Análise citogenética................................................................................. 40
3.2.3.3. Análise estatística.................................................................................... 40
3.2.4. Ensaio de MTT (Metiltiazoltetrazólio [3-4,5-dimetiltialzol-2il)-2,5-
difenilbrometo de tetrazolina])...............................................................................
40
3.2.5. Análise da Cinética do Ciclo Celular........................................................... 41
3.2.6. Avaliação de Apoptose e Necrose por coloração com Anexina V/Iodeto
de Propídeo (IP)....................................................................................................
41
4. Resultados........................................................................................................ 43
4.1. Teste de Mutagenicidade de Ames em cepas de Salmonella typhimurium... 43
4.2. Teste do Micronúcleo em medula óssea de camundongos........................... 46
4.3. Ensaio Cometa............................................................................................... 50
4.4. Ensaio de MTT............................................................................................... 50
4.5. Análise da Cinética do Ciclo Celular.............................................................. 51
4.6. Avaliação de Apoptose e Necrose por Coloração com Anexina V/Iodeto de
Propídeo (IP).........................................................................................................
52
5. Discussão.......................................................................................................... 55
6. Conclusões........................................................................................................ 58
Referências Bibliográficas..................................................................................... 60
Anexos.................................................................................................................. 80
Anexo A – Artigo publicado na revista Plos One................................................... 80
Anexo B – Espectros de ressonância magnética nuclear (RMN 1H),
infravermelho (IV-TF) e massa (EM) da chalcona sulfonamida CPN...................
81
VIII
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
4NQO 4-nitroquinolina 1-óxido
BACE1 β-secretase
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
CPN Chalcona sulfonamida N-4-[3-(4-nitrofenil)prop-2-enoil]fenil-
benzenosulfonamida
DMSO Dimetilsulfóxido
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
ENC Eritrócitos normocromáticos
EPC Eritrócitos policromáticos
EPCMN Eritrócitos policromáticos micronucleados
ERO Espécies reativas de oxigênio
FDA Food and Drug Administration
GSH Glutationa
IC50 Concentração que inibe 50% das células
i.p. Intraperitoneal
IP Iodeto de Propídeo
MMC Mitomicina C
MN Micronúcleo
MTT Metiltiazoltetrazólio [3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenilbrometo de
tetrazolina]
NCCD Nomenclature Committee on Cell Death
PABA Ácido p-aminobenzóico
PBMC Células mononucleares do sangue periférico
PBS Tampão salina fosfato
p.c. Peso corpóreo
PI Porcentagem de inibição da mutagenicidade
RM Razão de mutagenicidade
SCGE Single Cell Gel Electrophoresis
SDS Dodecil sulfato de sódio
SFB Soro fetal bovino
VAC-α Proteína vascular anticoagulante-α
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estereoisômero trans que ilustra o núcleo fundamental das
chalconas.............................................................................................................
2
Figura 2: Fórmulas estruturais do Prontosil® e de seu subproduto 4-amino-
fenil-sulfonamida..................................................................................................
4
Figura 3: Representação esquemática das fases do ciclo celular e dos pontos
de verificação existentes na transição entre as diferentes fases ........................
10
Figura 4: Representação esquemática das fases da mitose............................... 11
Figura 5: Representação esquemática das vias de ativação de caspases
durante a apoptose..............................................................................................
14
Figura 6: Esquema do teste de mutagenicidade de Ames.................................. 19
Figura 7: Resumo do processo de maturação das células da linhagem
eritrocitária............................................................................................................
24
Figura 8: Formação de micronúcleos em eritrócitos de medula óssea .............. 24
Figura 9: Esquema do procedimento experimental do Ensaio Cometa………… 26
Figura 10: Imagens de cometas de células do fígado após tratamento com
mutágenos............................................................................................................
27
Figura 11: Média e desvio padrão da porcentagem de DNA na cauda nos
diferentes tratamentos de CPN............................................................................
50
Figura 12: Valores médios de porcentagem de células em sub-G1, G0/G1, S,
G2/M após o tratamento com o controle negativo (CN) e as doses de 128, 256
e 512 μmol/L de CPN, respectivamente, em PBMC……………………………….
51
Figura 13: Histogramas com o perfil do ciclo celular de PBMC tratadas com
diferentes doses de CPN.....................................................................................
52
Figura 14: Valores médios de porcentagem de células viáveis, células em
apoptose inicial, células em apoptose tardia e células em necrose após o
tratamento com o controle negativo e as doses de 128, 256 e 512 μmol/L de
CPN, respectivamente em PBMC........................................................................
53
Figura 15: Citogramas dos efeitos de CPN na indução de morte celular
através do teste de dupla marcação: Anexina V/IP em 24 h de
tratamento……………..........................................................................................
54
Figura 16: Espectro de RMN ¹H (500 MHz, DMSO-d6) da 4-
X
N[fenilsulfonilamida] acetofenona 3..................................................................... 81
Figura 17: Espectro ampliado de 7,1 a 7,9 ppm de RMN ¹H (500 MHz, DMSO-
d6) da 4-N[fenilsulfonilamida] acetofenona 3. ......................................................
82
Figura 18: Espectro IV-TF da 4-N[fenilsulfonilamida] acetofenona 3.................. 83
Figura 19: Espectro de EM da 4-N[fenilsulfonilamida] acetofenona 3................ 84
Figura 20: Espectro de RMN ¹H (500 MHz, DMSO-d6) da 1[4’-N-fenil-
sulfonilamidafenil]-3-(4-nitrofenil)-2E-propen-1-ona 5..........................................
85
Figura 21: Espectro ampliado de 7,1 a 8,3 ppm de RMN ¹H (500 MHz, DMSO-
d6) da 1[4’-N-fenil-sulfonilamidafenil]-3-(4-nitrofenil)-2E-propen-1-ona 5.............
86
Figura 22: Espectro IV-TF da 1[4’-N-fenil-sulfonilamidafenil]-3-(4-nitrofenil)-
2E-propen-1-ona 5...............................................................................................
87
Figura 23: Espectro de EM da 1[4’-N-fenil-sulfonilamidafenil]-3-(4-nitrofenil)-
2E-propen-1-ona 5...............................................................................................
88
Esquema 1: Síntese da 4-N[fenilsulfonilamida] acetofenona 3........................... 33
Esquema 2: Síntese da chalcona sulfonamida (1[4’-N-fenil-sulfonilamidafenil]-
3-(4-nitrofenil)-2E-propen-1-ona).........................................................................
34
XI
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Mutações de ponto………………………………………………………… 7
Tabela 2 – Rearranjos………………………………………………………………….. 7
Tabela 3 - Nomenclatura atual para os diferentes tipos de morte celular……….. 17
Tabela 4 - Média () e desvio padrão (S) de revertentes histidina, razão de
mutagenicidade (RM) e porcentagem de inibição de mutagenicidade (PI) para
duas cepas de S. typhimurium, TA98 e TA100, tratadas com diferentes doses
de CPN....................................................................................................................
45
Tabela 5 - Avaliação das atividades genotóxica e citotóxica em camundongos:
frequência de EPCMNs e EPCs/ENCs em medula óssea de camundongos
tratados com chalcona sulfonamida N-4-[3-(4-nitrofenil)prop-2-enoil]fenil-
benzenosulfonamida (CPN)....................................................................................
48
Tabela 6 - Avaliação das atividades antigenotóxica e anticitotóxica em
camundongos: frequência de EPCMNs e EPCs/ENCs em medula óssea de
camundongos tratados com chalcona sulfonamida N-4-[3-(4-nitrofenil)prop-2-
enoil]fenil-benzenosulfonamida (CPN) mais mitomicina C (MMC)........................
49
XII
RESUMO
Derivados de chalcona sulfonamida tem apresentado importantes atividades
biológicas, incluindo atividade antitumoral. No presente estudo, investigou-se os
efeitos biológicos da chalcona sulfonamida N-4-[3-(4-nitrofenil)prop-2-enoil]fenil-
benzenosulfonamida (CPN) mediante a análise de bioindicadores de danos
genéticos em sistemas-teste bacteriano, animal e humano. No Teste de
Mutagenicidade de Ames, CPN não aumentou significativamente o número de
revertentes prototróficas de Salmonella typhimurium, em nenhuma das cepas
testadas, TA98 e TA100, em nenhuma das doses (p > 0,05). Entretanto, CPN
apresentou um perfil moderado de um composto mutagênico e tóxico, devido à
relação dose-resposta observada em todas as doses testadas, para as cepas TA98
e TA100. Na avaliação antimutagênica do Teste de Ames, CPN apresentou
atividade antimutagênica para todas as doses testadas na cepa TA98 (p < 0,05). Na
cepa TA100, CPN mostrou atividade antimutagênica nas doses acima de 50
μg/placa (p < 0,05). Os resultados do Teste do Micronúcleo demonstraram que CPN
aumentou a frequência de eritrócitos policromáticos micronucleados (EPCMN) no
tempo de 24 e 48 h, em todas as doses testadas, demonstrando efeito mutagênico
deste composto. Uma diminuição na razão de eritrócitos
policromáticos/normocromáticos (EPC/ENC) foi observada no tempo de 24 e 48 h,
indicando ação citotóxica de CPN. CPN co-administrado com mitomicina C (MMC)
diminuiu significativamente a freqüência de EPCMN em todas as doses testadas no
tempo de 24 h, demonstrando ação antimutagênica (p < 0,05). Houve também uma
diminuição na frequência de EPCMN em todas as doses testadas, no tempo de 48 h,
mas a diminuição não foi significativa (p > 0,05). Além disso, CPN co-administrado
com MMC aumentou a razão de EPC/ENC em todas as doses testadas, nos tempos
de 24 e 48 h, demonstrando efeito anticitotóxico. No Ensaio Cometa, CPN aumentou
significativamente a porcentagem de danos no DNA em todas as doses testadas (p
< 0,05), demonstrando atividade genotóxica. Na análise da Cinética do Ciclo Celular,
CPN não induziu alteração significativa nas fases G0/G1, S e G2/M do ciclo celular
de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) (p > 0,05). Entretanto, as
doses de 256 e 512 μmol/L de CPN apresentaram um aumento significativo na
porcentagem de células em sub-G1 (p < 0,05), o qual é um indicativo de apoptose,
demonstrando ação citotóxica. Na detecção de apoptose e necrose por coloração
XIII
com Anexina V/Iodeto de Propídeo, CPN mostrou um efeito citotóxico, pela indução
de apoptose tardia e necrose. Assim, de acordo com os ensaios realizados CPN
apresentou atividades genotóxica, citotóxica, antigenotóxica e anticitotóxica.
Palavras-chave: Teste de Mutagenicidade de Ames. Teste do Micronúcleo. Ensaio
Cometa. Ciclo celular. Citotoxicidade.
XIV
ABSTRACT
Sulfonamide chalcone derivatives have shown important biological applications,
including antitumor activity. In the present study, we investigated the biological
effects of the sulfonamide chalcone N-4-[3-(4-nitrophenyl)prop-2-enoyl]phenyl
benzenesulfonamide (CPN) through bioindicators of genetic damage in bacteria,
animal and human. In the Ames Mutagenicity Test, CPN did not significantly increase
the number of His+ revertants in Salmonella typhimurium tester strains TA98 and
TA100 at all doses tested (p > 0.05). However, CPN presented a moderate
mutagenic and toxic profile, due to dose-response relationship observed at all doses
tested for TA98 and TA100 strains. In the antimutagenic evaluation of Ames Test,
CPN presented antimutagenic activity at all doses tested in TA98 strain (p < 0.05). In
the TA100 strain, CPN showed antimutagenic activity in doses over 50 μg/plate. In
the Micronucleus Test, the results demonstrated that CPN increased the frequency of
micronucleated polychromatic erythrocytes (MNPCE) at 24 h and 48 h, at all doses
tested, demonstrating mutagenic effect of this compound. A decrease in
polychromatic/normochromatic erythrocyte ratio (PCE/NCE) was observed at 24 h
and 48 h, indicating the cytotoxic action of CPN. CPN co-administered with
mitomycin C (MMC) significantly decreased the frequency of MNPCE at all doses
tested in 24 h, demonstrating antimutagenic action (p < 0.05). Also, there was a
decrease in the frequency of MNPCE at all tested doses in 48 h, but this decrease
was not significant (p > 0.05). Additionally, CPN co-administered with MMC
increased PCE/NCE ratio at all doses tested, in both times, demonstrating its
anticytotoxic effect. In the Comet Assay, CPN significantly increased the percentage
of DNA damages at all doses tested (p < 0.05), demonstrating genotoxic activity. In
the analysis of cell cycle kinetics, CPN did not induce significant changes in the cell
cycle phases G0/G1, S and G2/M of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) (p >
0.05). However, doses of 256 and 512 μmol/L of the CPN presented a significant
increase in the percentage of cells in sub-G1 (p < 0.05), which is indicative of
apoptosis, indicating cytotoxic action. For apoptosis and necrosis detection using
Annexin V/Propidium Iodide stain, CPN showed a cytotoxic effect by inducing late
apoptosis and necrosis. Thus, according to tests performed CPN presented
genotoxic, cytotoxic, antigenotoxic, and anticytotoxic activities.
XV
Keywords: Ames mutagenicity test. Micronucleus test. Comet assay. Cell cycle.
Citotoxicity.
1
1. Introdução
1.1. Chalconas e Sulfonamidas
Inúmeros fármacos disponíveis no mercado farmacêutico foram obtidos
sinteticamente baseados em estruturas de fontes naturais. A utilização de produtos
naturais ativos como modelo ou molécula-protótipo para a síntese de análogos mais
potentes e seletivos, têm contribuído significativamente para a obtenção de novos
agentes terapêuticos (Chiaradia, 2006).
Por milhares de anos, os produtos naturais têm desempenhado um papel
importante em todo o mundo no tratamento e prevenção de doenças humanas.
Cerca de 50% dos fármacos aprovados pela FDA (Food and Drug Administration)
(Gu et al. 2013) e aproximadamente 50% dos medicamentos sujeitos às prescrições
médicas são derivados de produtos naturais (Jones et al. 2006).
Fármacos de produtos naturais podem apresentar origens diferentes,
incluindo as plantas, micro-organismos, vertebrados e invertebrados terrestres, e
organismos marinhos (Raja et al. 2010). Mas a busca por alívio e cura de doenças
pela ingestão de ervas e folhas talvez tenha sido uma das primeiras formas de
utilização dos produtos naturais (Viegas Jr. et al. 2006). As plantas possuem vias
secundárias que lhes permitem sintetizar várias substâncias químicas, muitas vezes
em resposta a estímulos ambientais específicos, incluindo danos induzidos por
herbívoros, ataques de patógenos ou a privação de nutrientes (Jones et al. 2006; Gu
et al. 2013).
Estes produtos químicos, chamados de metabólitos secundários, são
compostos de baixo peso molecular e são produzidos a partir de metabólitos
primários, tais como hidratos de carbono, aminoácidos e lipídeos (Pinho et al. 2013).
Os metabólitos secundários das plantas apresentam grande potencial para encontrar
vários tipos diferentes de moléculas bioativas por possuírem grande diversidade
química, podendo desempenhar múltiplas funções em alvos celulares. Além disso,
os metabólitos secundários por serem produzidos em sistemas vivos apresentam
características ideais para difusão e transporte dentro e entre as células e tecidos
(Jones et al. 2006; Gu et al. 2013).
2
Dentre os promissores produtos naturais como fonte para o desenvolvimento
de fármacos podem-se inserir as chalconas e seus derivados. As chalconas (1,3-
difenil-2-propen-1-ona) são um grupo de compostos polifenólicos precursores da
biossíntese de flavonóides e isoflavonóides (Dyrager et al. 2011). Elas são
consideradas uma das principais classes de produtos naturais, encontradas
largamente nos vegetais, frutas, folhas e nas pétalas das flores. Nas pétalas das
flores, as chalconas tem um importante papel na polinização das plantas, pois sua
cor amarela atrai insetos e pássaros que assim, polinizam outras plantas (Zuanazzi,
2001; Nowakowska, 2007).
Quimicamente, as chalconas podem ser definidas como cetonas aromáticas
α-β-insaturadas com dois anéis aromáticos, um ligado diretamente à função cetona
(anel A) e outro à dupla ligação (anel B), conectados por uma cadeia aberta de três
átomos de carbono, ficando conjugados uma porção olefínica e um grupamento
carbonílico (Nowakowska, 2007). A conjugação entre o anel B e o sistema
carbonílico insaturado confere a chalcona sua coloração amarelada característica
(Santos, 2008) (Figura 1).
Figura 1: Estereoisômero trans que ilustra o núcleo fundamental das
chalconas.
As chalconas podem ser obtidas de fontes naturais ou sintetizadas. Diversos
métodos de síntese de chalconas são descritos na literatura. Porém, a metodologia
mais utilizada é a condensação de Claisen-Schmidt, um tipo de reação de
condensação aldólica, baseada na condensação entre cetonas e aldeídos
aromáticos na presença de catalisadores básicos ou ácidos (Mai et al. 2014).
As chalconas e seus derivados têm recebido grande atenção devido à sua
facilidade de obtenção, à sua estrutura relativamente simples e, principalmente, à
diversidade de atividades biológicas que apresentam (Nowakowska, 2007).
O
A B
β
α
12
3
45
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
3
Derivados de chalconas apresentaram atividade citotóxica e antimitótica.
Estes compostos, em diferentes linhagens de células tumorais, foram capazes de se
ligar ao sítio da colchicina na β-tubulina, inibindo assim sua polimerização.
Consequentemente, os microtúbulos, elementos celulares essenciais ao processo
de mitose, não são formados (Lawrence e McGrown, 2005; Dyrager et al. 2011;
Ruan et al. 2011).
Relatos na literatura têm mostrado que muitas chalconas apresentam
atividade citotóxica e propriedade anticâncer devido à sua reatividade com grupos
tióis intracelulares. A inibição do crescimento tumoral envolve a adição nucleofílica
de cetonas α-β-insaturadas com reagentes nucleofílicos bio-orgânicos, como a
glutationa (GSH) através de uma adição conjugada ao carbono β do aceptor. Tal
característica da reação tem demonstrado que a presença da dupla ligação nas
chalconas é essencial para a sua atividade antitumoral (Nam et al. 2004; Jha et al.
2007; Via et al. 2009).
As chalconas também apresentam atividades antimutagênica (Torigge et al.
1983; Edenharder et al. 1993), hipoglicemiante (Alberton et al. 2008), anti-
inflamatória (Reddy et al. 2011), antifibrótica (Lee et al. 2011), antibacteriana
(Nielsen et al. 2004; Chiaradia et al. 2006; Mascarello et al. 2010), antifúngica
(Boeck et al. 2005), antiprotozoária (Aponte et al. 2010), antimalárica (Chen et al.
1997) e antiviral (Dimmock et al. 1999).
Outra classe de compostos bioativos são as sulfonamidas. As sulfonamidas
são fármacos sintéticos derivados de cloreto de benzenossulfonila substituídos e
aminas (Aragão, 2011). As sulfonamidas são caracterizadas pela presença de
grupos R-SO2-NR’R”-, a variação dos grupos R produz compostos com
propriedades físicas, químicas e farmacológicas diferentes (Rang et al. 1997). São
ácidos orgânicos fracos, pouco solúveis em meios aquosos e mais solúveis em
meios alcalinos (Alaburda et al. 2007).
A fração sulfonamida está presente em uma grande variedade de fármacos
para o tratamento de diversas doenças, para uso humano e animal (Martinez et al.
2013). O desenvolvimento das sulfonamidas como medicamentos iniciou-se por
volta de 1930, quando o Prontosil® (Figura 2A) foi utilizado no tratamento de
infecções causadas pela bactéria Streptococcus. Pesquisas posteriores com
Prontosil® identificaram seu mecanismo de ação no organismo humano. Também foi
constatado que o Prontosil® é convertido na 4-amino-fenil-sulfonamida (Figura 2B)
4
no organismo e que esse subproduto é o agente responsável pela ação bactericida
contra o Streptococcus (Solomons e Fryhle, 2009).
Figura 2: Fórmulas estruturais do Prontosil® e de seu subproduto 4-amino-
fenil-sulfonamida.
As sulfonamidas possuem estruturas análogas às do ácido p-aminobenzóico
(PABA) o qual é precursor da biossíntese do ácido fólico. O ácido fólico, por sua vez,
é precursor da síntese de ácidos nucléicos. Assim, as sulfonamidas impedem a
incorporação do PABA na molécula do ácido fólico por competição pelo centro ativo
da enzima diidropteroato-sintetase. Em conseqüência, formam-se análogos não
funcionais do ácido fólico, impedindo o crescimento da célula bacteriana (Goodman,
1996; Pelczar Jr. 1996; Jawetz et al. 1998). Como as células humanas obtêm o
ácido fólico via alimentação e não possuem a enzima, os efeitos colaterais são
menores. Por isso, somente são sensíveis às sulfonamidas os micro-organismos
que não conseguem utilizar o ácido fólico pré-formado, essencial para síntese do
DNA (Alaburda et al. 2007).
As sulfonamidas apresentam outras atividades biológicas importantes.
Derivados de sulfonamidas têm mostrado excelente atividade antitumoral em
linhagens de células de tumor de roedores e humano in vitro e in vivo. A atividade
antitumoral das sulfonamidas tem sido atribuída à sua ação inibidora da anidrase
carbônica (Vullo et al. 2004; Supuran et al. 2007) e à sua ação antimitótica (Owa et
al. 2002). Inibidores de anidrase carbônica são isoenzimas associadas ao câncer,
que possuem propriedades inibitórias no crescimento de tumores, sendo usados na
medicina clínica (Ozawa et al. 2002; Casey et al. 2004). A atividade antimitótica está
relacionada à inibição da polimerização das tubulinas que impede a formação do
fuso mitótico (Luo et al. 2011), como os herbicidas antimitóticos trifluralina e
NN
NH2
NH2
SNH2
O
O
NH2
SNH2
O
O
17 18A B
5
orizalina, que possuem atividade seletiva contra tubulina de leishmania
(Bhattacharya et al. 2004).
Relatos na literatura também têm mostrado outras atividades biológicas das
sulfonamidas, como antiviral (Betz et al. 2002), analgésica (Walter et al. 2004),
hipoglicemiante (Maren, 1976; Drew, 2000), antitireoidiana (Maren, 1976) e anti-
inflamatória (Li et al. 1995). Além disso, as sulfonamidas têm sido usadas
clinicamente para o tratamento de doenças como o glaucoma, o edema macular,
diversos distúrbios neuromusculares e infecções fúngicas (Maren, 1976; Barnish et
al.1980; Innocenti et al. 2004; Martinez et al. 2013).
Uma combinação de dois ou mais grupos farmacofóricos pode aumentar a
probabilidade de descoberta de novos compostos com importantes atividades
biológicas, especialmente se tais atividades são estreitamente relacionadas.
Isoladamente, chalcona e sulfonamida são grupos farmacofóricos bem conhecidos e
apresentam várias aplicações farmacêuticas para uma variedade de doenças
(Andrighetti-Frohner et al. 2007). Assim, vários estudos têm apresentado
importantes atividades biológicas de chalconas sulfonamidas (Domínguez et al.
2005; Seo et al. 2005; Bharatham et al. 2008; Lee et al. 2009; Kang et al. 2013).
Derivados de chalconas sulfonamidas apresentaram atividade antimalárica,
inibindo a formação de β-hematina e atividade antiparasitária contra o Plasmodium
falciparum em cultura (Domínguez et al. 2005). Bharatham et al. (2008) e Seo et al.
(2005) mostraram que alguns compostos de chalconas sulfonamidas inibem
enzimas α-glucosidases, as quais desempenham papel essencial no metabolismo de
carboidratos. As enzimas α-glucosidases são os principais alvos para o tratamento
de diabetes tipo 2 e contra o vírus HIV. Estudos realizados por Kang et al. (2013)
mostraram que compostos derivados de chalconas sulfonamidas foram capazes de
inibir a enzima β-secretase (BACE1). Esta enzima está relacionada ao
desenvolvimento da doença de Alzheimer. Além disso, chalconas sulfonamidas
apresentaram também atividades antitumorais em hepatócitos (Lee et al. 2009).
Devido ao potencial biológico de chalconas e sulfonamidas, é de grande
relevância o estudo dos efeitos biológicos destes compostos por meio da análise de
bioindicadores de danos genéticos.
6
1.2. Mutação e Antimutagenicidade
O genoma é continuamente agredido por vários agentes, endógenos ou
exógenos. Os agentes endógenos incluem os produtos do metabolismo celular,
como as espécies reativas de oxigênio, os produtos da peroxidação lipídica, agentes
alquilantes, estrógenos, espécies reativas de nitrogênio, agentes clorinantes e certos
intermediários de algumas vias metabólicas (Burcham, 1999). Os agentes exógenos
inevitáveis, incluem a radiação UV, radiação ionizante, radioisótopos de ocorrência
natural e numerosas substâncias químicas presentes naturalmente ou como
contaminantes na dieta e no ar (Otteneder e Lutz, 1999). Tanto os agentes
endógenos ou exógenos podem induzir lesões no DNA.
O reconhecimento das lesões, ou os seus efeitos inibitórios nos processos de
transcrição ou replicação, desencadeia respostas celulares que podem parar o ciclo
celular, induzir morte celular, e/ou regular a expressão de enzimas de reparo do
DNA para reparar danos no DNA (Wyrobek et al. 2007). Caso essas lesões sejam
fixadas, provocando alterações hereditárias que se perpetuam nas células filhas
durante o processo de replicação, temos, então, a formação de uma mutação
(Rekha et al. 2006; Abhilash e Singh, 2009).
As mutações podem ser agrupadas por critérios diferentes que variam a partir
das descrições das consequências fisiológicas de uma mutação (ou seja, alterações
no fenótipo) até descrições moleculares sistemáticas. De maneira geral, as
mutações podem ser classificadas em dois grandes grupos: (1) mutações de ponto,
as quais envolvem uma ou poucas alterações nos nucleotídeos e (2) rearranjos, que
são alterações que envolvem segmentos cromossômicos de centenas ou milhões de
nucleotídeos (Ennis, 2001).
As mutações de ponto consistem em substituições de bases e são agrupadas
em duas categorias: transições e transversões. As transições são a forma mais
simples de mutação, envolvendo a substituição de uma purina em um filamento do
DNA por outra purina e a substituição de uma pirimidina no filamento complementar
por outra pirimidina. As transversões também são relativamente simples e envolvem
a substituição de uma purina por uma pirimidina e vice-versa (Tabela 1) (Ennis,
2001).
7
Tabela 1 – Mutações de ponto
Substituições de bases
Transições Pirimidina Pirimidina (T C ou C T)
Purina Purina (A G ou G A)
Transversões Pirimidina Purina (exemplo: T A)
Purina Pirimidina (exemplo: G T)
FONTE: Adaptado (Ennis, 2001).
Os rearranjos, por sua vez, podem envolver apenas algumas bases (≈10) ou
grandes segmentos de cromossomos, envolvendo milhões de pares de bases. Estes
rearranjos são classificados em quatro subclasses gerais: deleções, inversões,
translocações e duplicações (Tabela 2) (Ennis, 2001).
As deleções consistem na falta de um segmento cromossômico, que podem
incluir um ou vários genes. As inversões resultam da "inversão" da ordem de um
segmento cromossômico e, como resultado, todos os genes do referido segmento
são colocados em orientação oposta em relação ao resto do cromossomo. As
translocações são mutações em que um segmento de um cromossomo muda para
outra parte do mesmo cromossomo ou para um cromossomo diferente. As
duplicações são definidas como a formação de cópias adicionais de segmentos
cromossômicos (Tabela 2). Uma classe especial de rearranjos são causadas por
elementos genéticos transponíveis, ou transposons (Ennis, 2001). Os transposons
são segmentos de DNA que podem mover-se de uma posição em uma molécula de
DNA para outra (Snustad e Simmons, 2008).
Tabela 2 – Rearranjos
Classes de rearranjos Mudança
Deleção abcdefg ab-fg
Inversão abcdefg ab-edc-fg
Translocação abcdefg ab-WXYZ-cdefg
Duplicação abcdefg abcdefg-abcdefg
FONTE: Adaptado (Ennis, 2001).
8
As mutações podem ser decorrentes de processos celulares normais,
chamadas de mutações espontâneas, as quais são resultantes de um nível baixo de
erros metabólicos inerentes, ou podem ser mutações induzidas quando resultantes
da exposição do organismo a agentes físicos, químicos e biológicos que causam um
maior nível de mudanças no DNA (Snustad e Simmons, 2008).
Os agentes químicos, físicos ou biológicos, que induzem mutações são
chamados de mutágenos. Os mutágenos estão envolvidos na genotoxicidade,
carcinogênese e na patogênese de diversas doenças crônico-degenerativas
incluindo desordens hepáticas e neurodegenerativas, doenças cardiovasculares,
diabetes, artrites, inflamação crônica e nos processos de envelhecimento
(Bhattacharya, 2011).
Os agentes mutagênicos podem ser classificados como: a) aqueles que
atuam diretamente sobre a molécula de DNA; b) agentes indiretos, que precisam ser
metabolizados para que seus metabólitos causem danos; c) os que promovem a
produção de espécies reativas de oxigênio, e d) aqueles que causam inibição no
reparo e na síntese do DNA (Watson et al. 2006).
Por outro lado, os antimutágenos são agentes que podem proteger os
organismos contra danos no DNA e suas consequências. Os antimutágenos são
definidos como agentes que inativam o mutágeno ou previnem a reação do
mutágeno com o DNA. Outro tipo de antimutágeno pode induzir, reparar ou inativar
diretamente ou indiretamente enzimas de reparo do DNA em processos de
replicação e recombinação (Bhattacharya, 2011).
O termo “antimutagênico” foi usado originalmente por Novick e Szilard em
1952 para descrever compostos que reduzem a freqüência de mutação espontânea
ou induzida, independente dos mecanismos envolvidos (Von Borstel et al. 1996).
Sendo assim, substâncias naturais ou sintéticas que são capazes de modular a ação
de diversos agentes potencialmente mutagênicos, são genericamente denominadas
antimutagênicas.
Os mecanismos de ação da maioria dos compostos antimutagênicos estão
relacionados à inativação enzimática ou química; à prevenção da formação de
espécies químicas reativas; ao sequestro de radicais livres e/ou à ação antioxidante
(DeFlora et al. 1992). Assim, os mecanismos de ação dos compostos
antimutagênicos foram classificados em dois processos maiores, denominados
desmutagênese e bioantimutagênese. Na desmutagênese, os agentes
9
antimutagênicos atuam como protetores, sendo capazes de inativar um agente
mutagênico por ação direta, podendo ser química ou enzimaticamente, após o
processo de metabolismo, ou até mesmo, pelo sequestro ou adsorção de agentes
mutagênicos e radicais livres, impedindo sua ligação ao DNA (Ferguson, 1994;
Waters et al. 1996). Na bioantimutagênese, os antimutagênicos atuam como
moduladores do reparo e replicação do DNA, agindo em nível celular. Assim, eles
podem inibir possíveis erros decorrentes da falha dos sistemas de reparo da célula
(Mitscher et al. 1996).
Entretanto, já se sabe que um grupo de compostos antimutagênicos têm
também apresentado atividade mutagênica. Estes compostos são também
conhecidos como mutágenos e carcinógenos Janus, nome dado em referência ao
deus romano Janus por ser descrito como tendo uma cabeça com duas faces. Um
número razoável de compostos possuem tanto efeitos antimutagênicos como
mutagênicos. Por exemplo, o β-caroteno foi o primeiro anticarcinogênico presumível
a ser usado em larga escala, até que os ensaios clínicos revelaram que o tratamento
com o composto estava associado a um aumento de incidência de câncer de pulmão
em vez da esperada redução. Outros exemplos incluem a quercetina, testosterona,
β-estradiol, dietilestilbestrol, vanilina, etc (Paolini et al. 2003; Zeiger, 2003;
Mazumdar et al. 2011; Bhattacharya, 2011).
A identificação de compostos naturais ou sintéticos com propriedades
mutagênicas e antimutagênicas tem enorme aplicabilidade como medida preventiva
ou de remediação. A partir do aumento da exposição a agentes antimutagênicos e
limitando a influência de agentes mutagênicos, pode-se reduzir a taxa de mutações,
diminuindo assim a incidência de câncer e outras doenças genéticas (Eventi et al.
2009).
1.3. Ciclo Celular e Morte Celular
Nas últimas décadas, os estudos sobre a regulação do ciclo celular e da
morte celular mostram que a desregulação destes eventos estão associados à
patogênese de várias doenças, incluindo o câncer, a aterosclerose, infecção,
inflamação e distúrbios neurodegenerativos. Ambos os processos são também
essenciais para a prevenção da auto-imunidade. Assim, do ponto de vista clínico, a
percepção de que as células seguem uma série de passos geneticamente
10
regulamentados para sua própria destruição e a compreensão de que a maquinaria
suicida desta célula é freqüentemente desabilitada em patologias humanas sugerem
que o processo de morte celular pode ser passível de intervenção terapêutica.
O ciclo celular e a morte celular são dois processos fisiológicos
predominantes no controle da homeostase tecidual em organismos adultos. A
integridade do genoma, a proliferação celular e a sobrevivência são reguladas por
uma rede intricada de vias que incluem os pontos de verificação do ciclo celular,
reparo e recombinação do DNA e morte celular programada (Zhivotovsky e Orrenius,
2010).
Nos eucariotos, o ciclo celular é realizado em quatro fases principais: G1, S,
G2 e M e a transição entre elas é altamente regulada. As células que estão
quiescentes se mantêm em um estado especial denominado G0. Quando a célula
em G0 recebe estímulo para se dividir, progride até G1. Nessa fase, há síntese de
proteínas necessárias para a fase S, durante a qual há duplicação do DNA. A célula
prossegue, então, para a fase G2 e, em seguida, para a mitose (fase M) (Figura 3)
(Alberts et al, 2004, p. 983).
Figura 3: Representação esquemática das fases do ciclo celular e dos pontos
de verificação existentes na transição entre as diferentes fases (traços vermelhos)
(Houtgraaf et al.2006).
11
Apesar de ser considerada como uma fase da divisão celular, a mitose pode
ser dividida em vários estágios. Na prófase os cromossomos, cada um composto por
duas cromátides irmãs, sofrem intensa condensação em conjunto com proteínas
cromossômicas e histonas. Durante a metáfase, feixes de proteínas do citoesqueleto
promovem o alinhamento dos cromossomos em um plano central da célula para que
as cromátides irmãs sejam separadas de forma organizada durante a anáfase. Em
seguida, na telófase, observa-se a presença de cromossomos descondensados e o
envelope nuclear é reconstruído antes do início da citocinese, etapa na qual o
citoplasma é dividido e duas células filhas são formadas (Figura 4) (Lodish et al.
2008, p. 847).
Figura 4: Representação esquemática das fases da mitose. Modificado de
http://www.biology.iupui.edu/biocourses/N100/images/8mitosiscropped.jpg
O controle do ciclo celular garante que as células filhas sejam cópias exatas
da célula inicial através de uma série de eventos bioquímicos interconectados. Os
componentes centrais do sistema de controle do ciclo celular são as quinases
dependentes de ciclinas. A atividade dessas enzimas varia durante as diferentes
fases do ciclo graças à ação das proteínas reguladoras ciclinas, cuja síntese e
degradação estabelecem o caráter cíclico do ciclo celular (Coudreuse e Paul Nurse,
2010). Esse sistema inclui, também, três pontos principais de verificação: o primeiro
ao final da fase G1, o segundo entre as fases G2 e M e o terceiro na transição entre
a metáfase e a anáfase (Houtgraaf et al. 2006).
A progressão entre as fases G2 e M só pode ocorrer após o término da
replicação do DNA. E a célula só poderá progredir da metáfase para a anáfase
12
quando os cromossomos estiverem aderidos ao fuso mitótico. Além disso, mesmo
que esses requisitos sejam atendidos, a ocorrência de lesões no DNA bloqueará a
progressão do ciclo celular (Lazzaro et al. 2009). Nesses casos, o bloqueio ocorre,
frequentemente, na transição entre as fases G1 e S ou entre G2 e M e permite a
remoção das lesões (Kao et al. 2001). Quando não é possível reparar o DNA, o
bloqueio permanente do ciclo é seguido da ativação de mecanismos de morte
celular (Zhivotovsky e Orrenius, 2010).
A morte celular pode ocorrer por diferentes vias. Uma das primeiras
classificações para diferenciar os tipos de morte celular foi proposta por Schweichel
e Merker (1973), que separou em três classes: tipo I (ou heterofagia), tipo II
(autofagia) e tipo III (morte celular sem digestão), mortes celulares atualmente
nomeadas como apoptose, autofagia e necrose, respectivamente.
A apoptose é um tipo de morte celular que tem papel fundamental no
desenvolvimento e na manutenção dos organismos. Esse processo também está
envolvido na formação de tecidos, no desenvolvimento do sistema imune e na
manutenção da homeostase uma vez que permite a eliminação de células e tecidos
lesados. A apoptose é caracterizada pela ativação de caspases que medeiam a
clivagem de proteínas celulares vitais, a condensação da cromatina, a fragmentação
do núcleo e a formação de vesículas na membrana (Kerr et al. 1972). Esse tipo de
morte pode ser induzida por duas vias, a intrínseca e a extrínseca, que diferem pela
natureza e origem dos estímulos, bem como por vias de sinalização subsequentes,
incluindo as caspases iniciadoras. Eventualmente, as duas vias convergem para o
nível das caspases executoras (caspases-3, -6 e -7), que, quando ativadas,
desencadeiam uma série de eventos bioquímicos que iniciam a degradação dos
componentes celulares culminando na morte celular (Radogna et al. 2015).
A via intrínseca de apoptose, é ativada por sinais intracelulares de morte, tais
como danos no DNA, fatores de crescimento e estresse oxidativo. A via intrínseca é
estreitamente regulada por membros da família Bcl-2, que medeiam a liberação de
proteínas, tais como o citocromo c, através do processo de permeabilização da
membrana mitocondrial externa (mitochondrial-outer-membrane permeabilization
(MOMP). MOMP ativa uma cascata de caspases, que culminam na ativação de
caspase-3 que, eventualmente, conduz a características morfológicas e bioquímicas
da apoptose. MOMP é regulada pelo permeability transition pore complex (PTPC) e
pela interação dinâmica entre os membros da família Bcl-2. Os membros pró-
13
apoptóticos (Bak, Bax e Bok) induzem diretamente MOMP enquanto que os
membros anti-apoptóticos (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1 e A1), através da sua
homologia com os domínios de Bcl-2, liga e inibe a formação do complexo de
Bak/Bax. Apenas as proteínas BH-3 (Bid, Bad, Bim, Bik, BNIP3, BMF, HRK, Noxa e
Puma) induzem MOMP por duas vias diferentes: a primeira, neutralizando o efeito
inibidor dos membros anti-apoptóticos da família Bcl-2 em multimerização de
Bak/Bax e a segunda via, pela ativação direta de Bak e Bax (Figura 5) (Radogna et
al. 2015).
A via extrínseca de apoptose, também chamada via receptores de morte, é
mediada por receptores de morte na superfície celular, como FAS, TNFR (receptor
do fator de necrose tumoral) ou receptores TRAIL. O estímulo do ligante de morte
resulta na oligomerização dos receptores e recrutamento da proteína adaptadora
Domínio de Morte FAS-associada (FADD) e pro-caspase-8, formando o complexo de
sinalização de indução de morte (DISC), resultando na clivagem e ativação da
caspase-8. A auto-ativação da caspase-8 no DISC é seguida pela ativação de
caspases efetoras, incluindo as caspases-3, -6, e -7, que atuam como efetoras do
programa de morte celular e uma vez ativado induz a fragmentação do DNA e
apoptose (Figura 5) (Radogna et al. 2015).
14
Figura 5: Representação esquemática das vias de ativação de caspases
durante a apoptose (Taylor et al. 2008).
A autofagia, é um outro mecanismo de morte celular, que pode ser descrito
como uma espécie de auto-canibalismo no qual os lisossomos degradam estruturas
celulares como organelas e membranas. A autofagia é um processo envolvido na
manutenção da função celular ao destruir estruturas desgastadas ou mal-formadas
(Hotchkiss et al. 2009; Peter, 2011). Porém, também pode ser desencadeada por
inúmeros tipos de estresse metabólico ou terapêutico como o bloqueio de vias de
sinalização de fatores de crescimento, a supressão do crescimento de tumor, a
eliminação de substâncias tóxicas, eliminação intracelular de micro-organismos
(Hotchkiss et al. 2009), o acúmulo de cálcio intracelular (Hoyer-Hansen et al. 2007) e
de espécies reativas de oxigênio (Scherz-Shouval et al. 2007).
15
A necrose é, geralmente, considerada um tipo de morte celular não
programada que ocorre em resposta à hipóxia ou lesão isquêmica aguda, como no
infarto do miocárdio e no acidente vascular cerebral. Ela ocorre espontaneamente
em neoplasias quando a proliferação celular supera a angiogênese (Hotchkiss et al.
2009). Na necrose ocorre um aumento do volume celular, hidrólise do DNA e perda
da integridade de membranas, inclusive de lisossomos. Com a lise da célula, o
conteúdo intracelular é liberado e induz resposta inflamatória e imune no tecido
adjacente (Kumar et al. 2005, p.3). Apesar de ser normalmente tida como um
processo desordenado, estudos demonstram que a necrose é controlada pela
interação de diferentes vias de sinalização (Peter, 2011; Wolpaw et al. 2011). A
proteína que interage com receptor de morte (RIP), bem como o fator 2 associado
ao receptor de TNF, são importantes reguladores da necrose celular induzida por
receptores de morte (Holler et al. 2000; Lin et al. 2004). Quando RIP é ativada, é
translocada para a mitocôndria e promove o acúmulo de espécies reativas de
oxigênio e depleção de ATP (Temkin et al. 2006).
Outra via que reduz a produção de ATP em células com DNA danificado
envolve a ativação da poli-ADP-ribose polimerase a qual depleta o cofator da
glicólise NAD+ (Zong et al. 2004). O subsequente aumento do conteúdo intracelular
de cálcio e de espécies reativas de oxigênio promove a ativação de calpaínas,
proteases citoplasmáticas, e de fosfolipase A2. A proteólise e a peroxidação das
membranas que resultam da atividade dessas enzimas levam à permeabilização da
célula e à morte por necrose (Amaravadi e Thompson, 2007).
A senescência celular e a catástrofe mitótica também são consideradas
outras diferentes vias de morte celular. A senescência celular foi descrita em 1961
por Hayflick e Moorhead. Nesse processo, a divisão celular é bloqueada de forma
irreversível, mas as células permanecem metabolicamente ativas. Do ponto de vista
bioquímico, a célula em senescência apresenta alterações metabólicas típicas, como
a indução de β-galactosidase (Dimri et al. 1995). A senescência pode ser iniciada
pelo encurtamento dos telômeros, uma propriedade bastante conhecida de células
de mamíferos, ou por algum tipo de estresse (Singh et al. 2010).
A catástrofe mitótica é um tipo de morte celular que resulta da tentativa de
divisão de células com DNA danificado (De Bruin e Medema, 2008). Sabe-se que a
presença de danos no DNA promove bloqueio do ciclo celular. Quando esse
bloqueio não é eficiente e células com DNA danificado entram em mitose, ocorre
16
morte por catástrofe mitótica (Roninson et al. 2001). Do ponto de vista morfológico,
as células apresentam alterações características durante a catástrofe mitótica. É
comum observar-se a presença de células gigantes, multinucleadas e com
cromossomos descondensados (Singh et al. 2010). Além disso, pode ocorrer divisão
em mais de duas células filhas com distribuição desigual de citoplasma, DNA e
cromossomos (Castedo et al. 2004b).
A catástrofe mitótica pode ocorrer após exposição a fármacos que induzem
hiperpolimerização de microtúbulos, como os taxanos, ou que causam
despolimerização, como os alcalóides vincristina e vimblastina (Castedo et al.
2004a). Os mecanismos moleculares responsáveis pela morte das células por
catástrofe mitótica não foram completamente esclarecidos. Entretanto, sabe-se que
diferentes tipos celulares entram em apoptose em consequência da catástrofe
mitótica (Roninson et al. 2001). Além disso, a catástrofe mitótica pode resultar em
morte celular por necrose (Mansilla et al. 2006; Vakifahmetoglu et al. 2008).
Contudo, com o aparecimento de métodos bioquímicos que permitiram
quantificar a expressão, atividade e localização celular de proteínas envolvidas nos
processos de morte celular, tornou-se possível a diferenciação destes eventos, até
então similares, quando levado em conta apenas os aspectos morfológicos. Assim,
novas nomenclaturas para os eventos de morte celular surgiram. De acordo com o
NCCD (Nomenclature Committee on Cell Death), modificações na nomenclatura dos
diferentes tipos de morte celular foram atualizados em 2012 (Tabela 3) (Galluzzi et
al. 2012).
17
Tabela 3 - Nomenclatura atual para os diferentes tipos de morte celular
Nomenclatura Fenômenos bioquímicos envolvidos Envolvimento de caspases
Anoikis de EGFR, inibição da sinalização de
ERK1, não envolvimento de 1-integrina,
de BIM e ativação de caspase-3,-6, -7
Sim
Autofagia Lipidação de MAP1LC3, degradação de SQSTM1
Não
Apoptose intrínseca caspase
dependente
Dissipação irreversível do , liberação de proteínas no espaço intramembrana,
inibição da cadeia respiratória
Sim
Apoptose intrínseca caspase
independente
Não
Apoptose extrínseca por receptor de
morte
Sinalização por receptor de morte, ativação de caspases-8, -10, clivagem de BID e MOMP (em células tipo II), ativação
de caspases-3, -6, -7
Sim
Apoptose extrínseca depedente de
receptor
Sinalização dependente de receptores, ativação de PP2A e DAPK1, ativação de
caspase-9, -3, -6 e -7
Sim
Cornification Ativação de transglutaminases, ativação de caspase-14
Sim
Entosis Ativação de RHO e ROCK1 Não
Catástrofe mitótica Ativação de caspase-2, TP53 ou TP73 (em alguns casos), bloqueio de mitose
Não
Necroptose Sinalização via receptor de morte, inibição de caspase, ativação de RIP1 e/ou RIP3
Não
Netosis Inibição de caspase, ativação de NADPH oxidase, liberação de NET (em alguns
casos)
Não
Parthanatos Acúmulo de PAR mediado por PARP1.
Dissipação inrreversível do , depleção de ATP e NADH, ligação de PAR com AIF
Não
Pyroptosis Ativação de caspase-1 (-7), secreção de
IL-1 e IL-18
Sim
FONTE: Adaptado (Galluzzi et al. 2012).
NOTA: EGFR, receptor do fator de crescimento epidérmico; ERK1, quinase regulada por sinal
extracelular 1; BIM, agonista de morte com domínio de interação BH3; MAP1LC3, cadeia leve 3 da
proteína 1 associada aos microtúbulos; SQSTM1, sequestosomo 1; MOMP, permeabilização da
membrana mitocondrial externa; PP2A, proteína fosfatase 2A; DAPK1, proteína quinase 1 associada
à morte; ROCK1, proteína quinase associada a Rho; TP53, supressor tumoral; TP73, supressor
tumoral da família de TP53; RIP1, proteína 1 de interação com receptor; RIP3. Homólogo de RIP1;
NET, armadilhas extracelulares neutrofílicas; PAR, poli(ADP-ribose); PARP1, polimerase poli (ADP-
ribose); AIF, fator indutor de apoptose; IL-1β, interleucina-1β; IL-18, interleucina-18.
18
1.4. Ensaios de Genética Toxicológica
No estudo do potencial genotóxico e/ou antigenotóxico de compostos
químicos, físicos e biológicos, podem ser utilizadas várias técnicas em diferentes
sistemas biológicos, in vitro e/ou in vivo (Hovhannisyan, 2010; Escobar et al. 2013).
As características gerais de uma bateria de testes padrão para a avaliação da
genotoxicidade de compostos, recomendada pela FDA (2012), são as seguintes: (1)
avaliação de mutação reversa em bactérias, que pode ser realizada utilizando o
teste de mutagenicidade com Salmonella typhimurium (Teste de Ames). Os agentes
mutagênicos detectados primeiramente no Teste de Ames são apresentados
posteriormente como agentes carcinogênicos em testes que utilizam animais. (2) A
genotoxicidade também deve ser avaliada em células de mamíferos in vitro e/ou in
vivo, como pode ser realizada no Teste do Micronúcleo e no Ensaio Cometa (FDA,
2012).
1.4.1. Teste de Mutagenicidade de Ames
O teste de mutagenicidade com Salmonella typhimurium (Teste de Ames) é
utilizado para detectar a ação mutagênica e antimutagênica de agentes indutores
que atuam ao nível do DNA bacteriano (Maron e Ames, 1983).
O ensaio foi desenvolvido por Bruce N. Ames e colaboradores na década de
70 (Ames, 1971; Ames et al. 1973) e foi posteriormente revisado ao longo dos anos
para melhorar a sensibilidade para muitos tipos de agentes mutagênicos (Maron e
Ames, 1983; Wilcox et al., 1990; OECD, 1997). O teste de Ames é utilizado em todo
o mundo e reconhecido pela comunidade científica e agências governamentais
como um ensaio inicial para determinar o potencial mutagênico de novos produtos
químicos e medicamentos. Diversos agentes mutagênicos detectados primeiramente
pelo teste de Ames são apresentados posteriormente como agentes carcinogênicos
em testes que utilizam animais (Mortelmans e Zeiger, 2000).
O teste de Ames emprega linhagens de S. typhimurium derivadas da
linhagem parental LT2, auxotróficas para histidina (his-), apresentando diferentes
mutações no operon deste aminoácido. Essas linhagens são incapazes de crescer
em meio de cultura mínimo, sem histidina, a menos que ocorram mutações que
restaurem a sua capacidade de síntese (Umbuzeiro e Vargas, 2003). Por esse
19
motivo, o ensaio é frequentemente referido como um "ensaio de reversão"
(Mortelmans e Zeiger, 2000).
No teste de Ames, as cepas bacterianas são cultivadas em placas de Petri,
contendo meio ágar mínimo, sem histidina, juntamente com o composto em estudo.
Os compostos que são mutagênicos induzem à reversão da mutação, restaurando a
capacidade de síntese do aminoácido histidina. O número de revertentes é
quantificado, pela contagem de colônias que crescem em meio mínimo, após um
período de incubação de 48-72 h (Ames et al. 1973). O composto-teste é
considerado mutagênico, se o aumento no número de colônias revertentes excede
tipicamente de 2 a 3 vezes em relação ao número de colônias revertentes do
controle negativo, ou se o aumento é estatisticamente significativo (Figura 6)
(Escobar et al. 2013).
Figura 6: Esquema do teste de mutagenicidade de Ames. Colônias
revertentes são contadas após a exposição a substâncias tratadas (Zanoni, 2010).
20
Cada cepa de S. typhimurium utilizada no teste de Ames, apresenta uma taxa
de reversão espontânea específica. A frequência de reversão é facilmente medida
pela contagem do número de colônias prototróficas para a histidina, provenientes de
mutações espontâneas, ou de mutações induzidas por agentes mutagênicos. O co-
tratamento com agentes antimutagênicos atenua o aparecimento de lesões no DNA,
ou seja, há diminuição na formação de colônias revertentes (Neves, 2007).
Alguns compostos químicos requerem ativação metabólica para exercer a
atividade mutagênica (Escobar et al. 2013). Para identificar compostos químicos
convertidos em mutagênicos no fígado, o teste de Ames trata potenciais agentes
mutagênicos com uma mistura de enzimas hepáticas, conhecida como mistura S9
(Watson et al. 2006). Apesar disso, o teste de Ames não apresenta informação
direta sobre o potencial mutagênico em mamíferos, todavia, existe alta concordância
dos resultados obtidos pelo teste de Ames e ensaios de carcinogenicidade em
roedores (Neves, 2007; Escobar et al. 2013).
As cepas bacterianas utilizadas no teste de Ames, são modificadas para
serem altamente sensíveis para a identificação de diferentes classes de compostos
químicos mutagênicos (Maron e Ames, 1983; Escobar et al. 2013). Além da
incapacidade de sintetizar histidina, as cepas apresentam redução da capacidade de
reparo de DNA e permeabilidade aumentada da parede celular (McCarren et al.
2011). As cepas utilizadas foram especialmente construídas para detectar
compostos que induzem mutações gênicas por deslocamento do quadro de leitura
do DNA (frameshift) ou por substituição de pares de bases nitrogenadas (Escobar et
al., 2013).
A maioria das cepas apresentam uma deleção do gene uvrB, o que causa a
perda da capacidade de reparo por excisão de nucleotídeos, permitindo que mais
lesões no DNA sejam reparadas por mecanismos sujeitos a erros, elevando a
sensibilidade do teste na detecção do mutágeno. A deleção do gene uvrB é
estendida até o gene responsável pela síntese da biotina, tornando as linhagens
dependentes desta vitamina (Tejs, 2008). Todas as cepas apresentam uma mutação
denominada rfa que causa perda parcial da barreira de lipopolissacarídeos da
parede bacteriana, facilitando a difusão de moléculas grandes para a célula, como
as aminas aromáticas, hidrocarbonetos e aflatoxinas (Tejs, 2008).
Algumas cepas contém o plasmídeo pKM101, que além de conferir
resistência à ampicilina, possui o gene muc, cuja expressão causa um estímulo no
21
sistema de reparo suscetível ao erro, aumentando tanto a mutagênese espontânea
como a induzida, pois o produto desse gene interfere na fidelidade da DNA
polimerase (Maron e Ames, 1983; Valent, 1990).
As linhagens TA98 e TA100, selecionadas para o presente estudo, são
comumente utilizadas para estudos de triagem, mostrando eficiência na detecção de
grande número de agentes mutagênicos (Umbuzeiro e Vargas, 2003). A mutação
existente na cepa TA100, denominada hisG46, resulta da substituição de uma
leucina (GAG/CTC) por uma prolina (GGG/CCC), e pode ser revertida para o estado
selvagem por um composto mutagênico que cause uma substituição de pares de
bases num dos pares GC. A mutação que ocorre na cepa TA98, denominada
hisD3052, é consequência de um frameshift, que afeta a leitura correta de uma
sequência próxima, constituída de oito resíduos GC – C-G-C- G-C-G-C-G-
repetitivos e portanto é um hot spot. Estes mutágenos geralmente atuam em
unidades repetitivas do DNA fazendo com que haja uma restauração do quadro
correto da leitura envolvida na síntese de histidina. Nesta cepa, a reversão para o
fenótipo his+ ocorre pela deleção de um ou dois pares de bases da seqüência do hot
spot ou, pela adição de um par (Maron e Ames, 1983). Essa mutação é revertida por
agentes mutagênicos como 2-nitrofluoreno e derivado nitro aromáticos. Além disso,
as linhagens TA98 e TA100 apresentam outras mutações que aumentam suas
capacidades de detectar substâncias mutagênicas: mutação rfa, a deleção do gene
uvrB e o plasmídio pKM101 (Maron e Ames, 1983). Assim, a aplicação das duas
cepas acima mencionadas permite a identificação de mutágenos ou antimutágenos
com diferentes mecanismos de ação.
1.4.2. Teste do Micronúcleo em medula óssea de camundongos
O Teste do Micronúcleo em medula óssea de roedores in vivo é um teste
amplamente utilizado para a detecção de agentes clastogênicos (que quebram
cromossomos), e de agentes aneugênicos (que induzem aneuploidia ou segregação
cromossômica anormal) (Elhajouji et al. 2011; FDA, 2012). Este teste é
internacionalmente aceito como parte da bateria de testes recomendada para a
avaliação do potencial mutagênico e para o registro de novos produtos químicos que
entram no mercado mundial (Ribeiro, 2003).
22
O procedimento original para o Teste do Micronúcleo foi desenvolvido por
Schmid e colaboradores (Matter e Schmid, 1971; Schmid et al. 1971; Nichols et al.
1972; Schmid, 1973) e, subsequentemente, modificado por Heddle e colaboradores
(Heddle, 1973; Salamone et al. 1980; Heddle e Salamone, 1981), que também
estabeleceram a origem do micronúcleo (MN) (Carrano e Heddle, 1973; Heddle e
Carrano, 1977). O ensaio foi desenvolvido primeiramente em sistema-teste in vivo,
em células de medula óssea de camundongos, e posteriormente teve a versão in
vitro introduzida por Heddle, em 1976.
Este teste pode ser executado praticamente em qualquer população de
células que estejam constantemente em divisão, sendo a medula óssea de
mamíferos uma das regiões mais adequadas, visto que suas células levam de 22 a
24 horas para completar um ciclo de divisão (Heddle, 1973). Os eritroblastos, na
medula óssea, sofrem duplicação e se diferenciam em eritrócitos policromáticos
(Figura 7) (Ribeiro, 2003).
O MN, também conhecido como corpos de Howell-Jolly, foi originalmente
identificado e descrito nos eritrócitos pelos hematologistas, William Howell e Justin
Jolly e foram associados com deficiências em vitaminas tais como folato e vitamina
B12 (Fenech et al. 2011). A indução de MN por um produto químico foi
primeiramente relatada por Klein e Klein (1952) em células de tumor ascítico de
Ehrlich tratadas com colchicina e a associação entre a formação de MN e a
exposição a agentes ambientais foi primeiramente descrita em células da raiz de
Vicia faba expostas à radiação ionizante (Evans et al. 1959).
O MN constitui-se de uma pequena massa nuclear delimitada por membrana
e separada do núcleo principal. Os MN aparecem nas células filhas, em decorrência
de danos induzidos nas células parentais (Ribeiro, 2003). A formação de MN ocorre
a partir de fragmentos de cromossomos acêntricos ou o cromossomo inteiro que não
foram incorporados nos núcleos das células filhas após a mitose. Esses
cromossomos inteiros deslocados ou fragmentos de cromossomos são envolvidos
por uma membrana nuclear e, com exceção de seu tamanho menor, são
morfologicamente semelhantes aos núcleos das células, após coloração nuclear
convencional (Figura 8) (Fenech et al. 2011).
Os eventos que levam à formação de MN podem ser atribuídos por uma
variedade de fatores que provocam danos ao material genético, os quais podem ser
classificados como fatores exógenos e endógenos. Os fatores exógenos incluem a
23
radiação, agentes químicos, invasão de micro-organismos, etc. Os fatores
endógenos incluem defeitos genéticos nos genes de reparo e/ou de controle do ciclo
celular, mudanças patológicas, deficiência de nutrientes requeridos como cofatores
no metabolismo do DNA, tais como o ácido fólico e injúrias induzidas por produtos
metabólicos deletérios, tais como as espécies reativas de oxigênio (Huang et al.
2011). Assim, a presença de MN pode ser considerada um possível indicador de
susceptibilidade para a carcinogênese (Bonassi et al. 2011), doenças
neurodegenerativas (Migliore et al. 2011), diabetes, doenças cardiovasculares
(Andreassi et al. 2011) e infertilidade (Fenech, 2011).
Quando os eritroblastos expelem seu núcleo, ao se transformarem em
eritrócitos, os MN permanecem no citoplasma onde são facilmente reconhecidos
(Figura 8) (Rabelo-Gay, 1991). Os MN são analisados em eritrócitos policromáticos
(EPC, eritrócitos jovens) de medula óssea de camundongos ou ratos (Figura 8)
(Ribeiro, 2003). Durante um período de 10 a 24 horas, os eritrócitos jovens são
policromáticos (RNA-positivos), isto é coram‐ se em azul e não em vermelho, pela
coloração com solução de Giemsa convencional. Se contarmos os MN apenas
nesse tipo de célula, é possível concluir que eles se formaram na mitose anterior, na
presença do agente mutagênico. Como o período entre a última divisão e a
formação do EPC é de 8 a 12 horas, é possível encontrar os micronúcleos induzidos
pelo agente cerca de 10 horas após o tratamento. Além disso, o intervalo mínimo
dentro do qual os micronúcleos podem ser detectados corresponde à duração do
estágio policromático, que varia de 10 a 24 horas (Figura 7) (Rabelo‐ Gay, 1991).
No Teste do Micronúcleo em medula óssea de camundongos, ainda é
possível avaliar a citotoxicidade de compostos pela análise da proporção de EPC
sobre eritrócitos normocromáticos (ENC) (FDA, 2012).
Os resultados positivos obtidos com o Teste do Micronúcleo fornecem fortes
evidências de genotoxicidade sistêmica da substância química avaliada. Os
resultados negativos podem indicar que a substância teste não é genotóxica in vivo
(Ribeiro, 2003).
24
Figura 7: Resumo do processo de maturação das células da linhagem
eritrocitária (Ribeiro, 2003).
Figura 8: Formação de micronúcleos em eritrócitos de medula óssea (Ribeiro,
2003).
25
1.4.3. Ensaio Cometa
O Ensaio Cometa, também chamado Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE)
é amplamente aceito como um método padrão para avaliar danos no DNA
(McKenna et al. 2008). Esta técnica consiste num estudo genotoxicológico sensível
que detecta quebras de filamentos de DNA em sítios álcali-lábeis através da
mensuração da migração do DNA a partir do DNA nuclear imobilizado de células
individuais (Lee e Steinert, 2003). Esta técnica não é utilizada para detectar
mutações, mas sim lesões genômicas, que após serem processadas, podem resultar
em mutação. Diferente das mutações, as lesões detectadas com o Ensaio Cometa
são passíveis de correção (Gontijo e Tice, 2003), constituindo, portanto, lesões pré-
mutagênicas (Kammann et al. 2001).
O Ensaio Cometa foi primeiramente descrito por Ostling e Johanson (1984) e
foi denominado como “estudo microeletroforético” de danos no DNA em células
individuais. Esta técnica tem sido modificada e extensivamente validada ao longo
dos anos, e é agora comumente referida como Ensaio Cometa (Wong et al. 2005). O
Ensaio Cometa pode ser aplicado em qualquer tecido in vivo, desde que uma
suspensão de células individuais nucleadas possam ser obtidas (Hartmann et al.
2003).
As células submetidas ao Ensaio Cometa são incluídas em gel de agarose e
dispostas em fina camada de gel sobre lâminas histológicas. Mediante o tratamento
com soluções apropriadas, as membranas das células, núcleos e organelas são
rompidas. Consequentemente, os componentes citoplasmáticos e as proteínas
nucleares são removidas e o material genético restante é submetido à eletroforese.
A partir do núcleo, fragmentos de DNA migram no sentido do ânodo. Quanto mais
intensa for a indução de quebras, menores serão os fragmentos e maior a extensão
de migração (Figura 9). Após coloração específica, o DNA da célula que não
apresentar dano migrará de forma homogênea formando um círculo. Em
contrapartida, o DNA danificado forma fragmentos de diversos tamanhos, originando
uma forma similar a de um cometa, com a cauda correspondendo aos fragmentos
que migraram. O dano pode ser quantificado em células individuais, permitindo
avaliar o potencial genotóxico de amostras ou de condições ambientais alteradas.
Para a interpretação dos resultados, o cometa é dividido entre cabeça e cauda.
Assim células sem ou com pouco dano no DNA, não apresentam cauda, enquanto
26
células com mais danos apresentam caudas maiores (Figura 10) (Perez-Cerezales
et al. 2009).
O Ensaio Cometa apresenta vantagens como a detecção de baixos níveis de
danos no DNA, aplicabilidade em vários tipos de tecidos e/ou tipos de células
eucarióticas, a necessidade de pequena quantidade de células (< 10.000),
habilidade de conduzir estudos utilizando pequena quantidade de substância-teste, e
baixo custo associado a um curto período para a realização dos experimentos (Speit
et al. 2009). Outra vantagem do Ensaio Cometa é a sua flexibilidade, pois com a
combinação de diferentes condições de lise, eletroforese e uso de enzimas
específicas, é possível detectar diferentes tipos e níveis de danos no DNA (Wong et
al. 2005).
Devido às numerosas vantagens do Ensaio Cometa, esta técnica tem sido
amplamente utilizada nos estudos de genotoxicidade de substâncias farmacêuticas,
aditivos alimentares, agroquímicos, em sistemas in vitro e/ou in vivo; estudos de
reparo do DNA, estudos de ecotoxicologia, biomonitoramento humano e ambiental
(Wong et al. 2005; Piperakis, 2009; Liao et al. 2009).
Figura 9: Esquema do procedimento experimental do Ensaio Cometa.
Preparação de lâminasDNA
Detecção de quebras
de fitas de DNA
27
Figura 10: Imagens de cometas de células do fígado após tratamento com
mutágenos. Três tipos de danos: 0 (A), 1 (B), 2 (C) 3 (D) e 4 (E) (400 x) (Barbisan et
al. 2003).
1.5. Ensaios Biológicos para o Ciclo Celular e Morte Celular
Nos estudos da cinética do Ciclo Celular e dos eventos de Morte Celular,
podem ser utilizadas as técnicas para a análise da Cinética do Ciclo Celular com
Iodeto de Propídeo (IP) e de detecção de apoptose e necrose por coloração com
Anexina V/IP, respectivamente. Para a realização destas técnicas, utiliza-se o
citômetro de fluxo. O citômetro de fluxo pode medir simultaneamente múltiplos
parâmetros em cada célula individualmente, em um número elevado de células de
uma população celular pura ou até, de uma subpopulação componente de uma
população celular heterogênea. A grande maioria das medições citométricas
implicam na ligação específica de fluorocromos aos componentes celulares de
interesse (Jahan-Tigh et al. 2012).
Para a realização destas técnicas, determinou-se a IC50 do composto em
estudo, utilizando o Ensaio de MTT. O Ensaio de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-
difenilbrometo de tetrazolina) é um método usado para avaliar a viabilidade celular
(Peres et al. 2008). Este método foi descrito por Mosmann (1983), o qual consiste
28
num ensaio colorimétrico baseado na formação de um composto púrpura em células
com atividade metabólica intacta (Nedel et al. 2011; Wang et al. 2012). O Ensaio de
MTT é um teste rápido, preciso, simples e com boa reprodutibilidade para detectar
células vivas em culturas de células de mamíferos (Ho et al. 2012; Mao et al. 2013).
O MTT é um sal de tetrazólio solúvel em água, de cor amarela, o qual é
convertido para formazan insolúvel, de cor púrpura, pela clivagem do anel de
tetrazólio pela enzima succinato desidrogenase no interior da mitocôndria de células
saudáveis (Mosmann, 1983; Mao et al. 2013). Assim, a concentração dos cristais de
formazan produzidos pode ser quantificada espectrofotometricamente e é
diretamente proporcional ao número de células metabolicamente ativas (Wang et al.
2012). A intensidade da atividade metabólica indica o grau de viabilidade das
células, quanto maior a citotoxicidade promovida pelas substâncias menor será a
intensidade metabólica e consequentemente menor será a absorbância da solução
(Berridge et al. 2005).
1.5.1. Análise da Cinética do Ciclo Celular
A análise da Cinética do Ciclo Celular permite quantificar e caracterizar as
fases do ciclo celular das células expostas a compostos químicos. Este ensaio
consiste na marcação do conteúdo do DNA das células utilizando iodeto de propídeo
(IP). O IP é um agente intercalante fluorescente que se liga ao DNA corando-o de
vermelho. A interação entre o IP e o DNA segue uma relação estequiométrica (uma
molécula de IP a cada 4 a 5 pares de bases) (Nicoletti et al. 1991).
O conteúdo de DNA de cada célula pode ser medido, podendo ser utilizado
para estimar a distribuição celular no ciclo celular. O conteúdo de distribuição de
DNA numa população celular típica em crescimento celular caracteriza-se por dois
picos em G0/G1 e G2/M e um vale na fase S. As células na fase G2/M apresentam o
dobro da quantidade de DNA que a fase G0/G1, sendo que a fase S apresenta
variações da quantidade de DNA entre as fases G1 e G2. A monitorização do ciclo
celular, bem como a sua regulação, é fundamental para compreensão dos efeitos de
compostos em estudo na célula (Tavares e Tavares, 2009).
29
1.5.2. Detecção de Apoptose e Necrose por coloração com Anexina V/Iodeto de
Propídeo (IP)
A detecção de Apoptose e Necrose por coloração com Anexina V/IP identifica
e quantifica células viáveis e células que estão no início ou no final do processo
apoptótico, através de citometria de fluxo. O corante Anexina V é um ligante a
fosfolipídeos e o IP é um corante vital que se liga ao núcleo celular.
No final de 1970, a anexina V foi isolada da placenta humana. Poucos anos
depois, esta proteína foi descoberta independentemente em vasos sangüíneos e
nomeada como proteína vascular anticoagulante-α (VAC-α) com propriedade de
inibir a coagulação sangüínea. O mecanismo anticoagulante é baseado na alta
afinidade de ligação a fosfolipídeos de membrana, especialmente de fosfatidilserina
(Boersma et al. 2005; Brumatti et al. 2008). Assim, a anexina V tem a capacidade de
se ligar fortemente aos fosfolipídeos de membrana plasmática, através de suas
cargas negativas na presença de íons cálcio. Todas as anexinas apresentam um
domínio central com quatro repetições em α-hélice, que permite a ligação do cálcio
(Moss e Morgan, 2004). Assim, na presença de íons cálcio, várias moléculas de
anexina V se associam fortemente aos fosfolipídeos de membrana, como por
exemplo, fosfatidilcolina e esfingomielina, ligando-se avidamente as cargas
negativas presentes especialmente nas fosfatidilserinas externalizadas. A
associação entre si das anexinas leva à formação de ligação proteína-proteína
estável, porém reversível, quando os níveis de cálcio intracelular são depletados
(Van Heerde et al. 2000). As taxas de associação e dissociação sugerem que
anexina V não penetra na membrana e comporta-se como uma proteína extrínseca
de membrana plasmática. Assim, a translocação da fosfatidilserina presente na face
interna para a face externa da membrana celular e a ligação de anexina V é uma
evidência forte da apoptose (Mochizuki et al. 2003).
Dessa forma, na fase precoce da apoptose, as células translocam moléculas
de fosfatidilserina, para a membrana plasmática externa, ficando exposta a
marcadores celulares como a anexina V (Watanabe et al. 2002). Ao utilizar-se
anexina V para detecção de apoptose é possível avaliar os níveis de fosfatidilserina
expostas na membrana celular externa que se associaram à anexina V, indicando
fase inicial de apoptose (apoptose precoce). Associando IP pode-se mensurar
células com permeabiliddade de membrana, o que poderia indicar fase tardia de
30
apoptose ou necrose (Pec et al. 2003). Assim, as células em necrose ou em
apoptose tardia exibem os mesmos padrões característicos, especialmente quanto à
permeabilidade de membrana. Tanto no processo de apoptose tardia, quanto na
necrose, a anexina V pode atravessar a membrana permeabilizada ao mesmo
tempo em que o IP entra no citosol (Pec et al. 2003).
Assim, as células serão classificadas como células viáveis quando forem
negativas tanto para Anexina V como para IP; células em início de apoptose quando
apresentarem positivas para Anexina V e negativas para IP, células em final de
apoptose quando forem positivas tanto para Anexina V quanto para IP e células em
necrose quando forem negativas para Anexina V e positivas para IP.
31
2. Objetivos
2.1. Objetivo Geral
Investigar os efeitos biológicos da chalcona sulfonamida N-4-[3-(4-
nitrofenil)prop-2-enoil]fenil-benzenosulfonamida (CPN) por meio da análise de
bioindicadores de danos genéticos em sistemas-teste bacteriano, animal e humano.
2.2. Objetivos Específicos
Avaliar o potencial mutagênico e antimutagênico de CPN pelo teste de
mutagenicidade com Salmonella typhimurium (Teste de Ames).
Avaliar a possível atividade mutagênica e antimutagênica de CPN pelo teste
do micronúcleo em medula óssea de camundongos in vivo.
Avaliar o potencial genotóxico de CPN pelo Ensaio Cometa em sangue
periférico humano.
Determinar a IC50 de CPN utilizando o teste do MTT em células
mononucleares humanas.
Avaliar o efeito de CPN sobre a Cinética do Ciclo Celular com marcação com
Iodeto de Propídeo, em células mononucleares humanas.
Avaliar o perfil apoptótico de células mononucleares humanas tratadas com
CPN utilizando o método de coloração com Anexina V/Iodeto de Propídeo.
32
3. Material e Métodos
3.1. Material
3.1.1. Síntese da chalcona sulfonamida, N-4-[3-(4-nitrofenil)prop-2-enoil]fenil-
bezenosulfonamida (CPN)
A chalcona sulfonamida, N-4-[3-(4-nitrofenil)prop-2-enoil]fenil-
bezenosulfonamida (CPN) foi sintetizada no Laboratório de Síntese e Estudos
Cristalográficos do Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás.
No presente trabalho, sintetizou-se primeiramente a cetona sulfonamida e
posteriormente condensou-a ao p-nitrobenzaldeído via reação de Claisen Schmidt
para obter a chalcona sulfonamida.
Como reagentes, foram usados cloreto de benzenosulfonila, p-
aminoacetofenona e p-nitrobenzaldeído, com purezas de 99%. Como catalisador foi
utilizado hidróxido de sódio com pureza de 85%. Os solventes utilizados foram
diclorometano, acetonitrila, etanol, n-hexano, acetona e acetato de etila. O ácido
clorídrico utilizado foi PA (37%).
Os espectros de absorção na região do infravermelho foram registrados no
equipamento BOMEM modelo M102 com transformada de Fourier e calibração
interna e no Spectrum 100 da Perkin Elmer. As amostras foram incorporadas em
pastilhas de KBr e as absorções estão expressas em número de ondas (cm-1).
Os espectros de ressonância magnética nuclear de prótons foram obtidos no
aparelho BRUKER AVANCE III – 500 MHz de 11,75 Tesla (pertencente à UFG). Os
deslocamentos químicos (δ) estão expressos em parte por milhão (ppm) e as
constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz) em relação a um padrão interno de
TMS ou o próprio solvente. Utilizou-se DMSO-d6 como solvente.
Os espectros de massa foram obtidos num equipamento GCMS-QP 2000 da
Shimadzu (da COPPE/UFRJ), no modo scann e com temperatura da fonte de íons e
da interfase em 250°C. Em relação à técnica de injeção, foi usada introdução direta
de amostras no espectrômetro de massas. A programação do DI de 50-200°C a
10°C/min, de 200-350°C a 20°C/min e permaneceu a 350°C por 5 min. Os
fragmentos foram expressos pela razão entre unidades de massa e carga (m/z) e a
abundância relativa dos picos em porcentagem (%).
33
O ponto de fusão foi determinado em um aparelho KARL KOLB Scientific-
Technical-supplies FrankFurt/M Germany e estão expressos em graus Celsius (°C).
3.1.1.1. Síntese da 4-N[fenilsulfonilamida] acetofenona 3
Foram utilizados cloreto de benzenosulfonila 1 (1,0 mmol; 0,135 mL) e p-
aminoacetofenona 2 (1mmol; 140 mg) em 5 mL de diclorometano. A reação foi
mantida sob agitação magnética e em refluxo (303K) durante 6 horas.
Posteriormente, evaporou-se o diclorometano e o precipitado obtido foi lavado com
n-hexano e recristalizado em uma mistura de acetona e água (2:1).
Esquema 1: Síntese da 4-N[fenilsulfonilamida] acetofenona 3.
DADOS ESPECTROSCÓPICOS PARA O COMPOSTO 3:
IV (cm-1): 3219 (N-H), 1674 (C=O), 1593 (N-H), 1513 (C=O), 1337 (S=O), 1277 (C-N)
e 1155 (S=O).
RMN ¹H (Hz – DMSO-d6): δ 2,46 (s; 3H; Hα), δ 7,21 (ddd; 2H; J = 8,7, J = 9,2; H3 e
H5), δ 7,57 (t; 2H; J = 7,9; H9 e H11), δ 7,63 (t; 1H; J = 7,9; H10) e δ 7,81-7,84 (m;
4H; H2, H6, H8 e H12).
EM (m/z): 275, 260, 167, 141, 119, 106, 93, 77, 43 e 27.
3.1.1.2. Síntese da chalcona sulfonamida (1[4’-N-fenil-sulfonilamidafenil]-3-(4-
nitrofenil)-2E-propen-1-ona)
Em 30 mL de solução etanólica de NaOH 50% (m/m), adicionou-se a cetona 3
(1 mmol; 275 mg) e posteriormente a sua solubilização, adicionou-se o p-
nitrobenzaldeído 4 (1 mmol; 151 mg). A reação foi mantida em agitação à
temperatura ambiente por 24 horas. Finalizada a reação, adicionou-se 20 mL de
Rendimento: 54%
P. f.: 133-115 °C
34
água destilada gelada e o meio foi neutralizado com HCl 10% (m/v). O precipitado
(amarelo-laranja) obtido foi extraído com diclorometano e recristalizado em uma
mistura de acetonitrila e acetato de etila (1:2).
Esquema 2: Síntese da chalcona sulfonamida (1[4’-N-fenil-sulfonilamidafenil]-
3-(4-nitrofenil)-2E-propen-1-ona).
DADOS ESPECTROSCÓPICOS PARA O COMPOSTO 5:
IV (cm-1): 3211 (N-H), 1658 (C=O), 1607 (Ar-CO-C=C-Ar), 1516 (N-H), 1342 (S=O),
1281, 1223 (C-N), 1155 (S=O).
RMN ¹H (Hz – DMSO-d6): δ 7,22 (ddd; 2H; J = 8,9, J = 9,3; H3’ e H5’), δ 7,42 (dt;
2H;, J = 7,4 e J = 1,2; H9’ e H11’), δ 7,55-7,60 (d e dt; 2H; J = 15,8, J = 7,4 e J = 1,2;
Hα e H10’), δ 7,77 (ddd; 2H; J = 8,8, J = 9,2; H2 e H6), δ 7,80 (d; 1H; J = 15,8; Hβ), δ
7,86 (dt; 2H; J = 8,1, J = 2,1 e J = 1,2; H8’ e H12’), δ 7,96 (ddd; 2H; J = 8,9, J = 9,3;
H2’ e H6’), δ 8,28 (ddd; 2H; J = 8,8, J = 9,2; H3 e H5).
3.1.2. Cepas Bacterianas
Foram utilizadas cepas bacterianas mutantes de Salmonella typhimurium
TA98 e TA100, deficientes na síntese do aminoácido histidina. Na ausência desse
aminoácido, essas cepas são incapazes de sobreviver.
3.1.3. Camundongos
Os experimentos foram realizados após a aprovação pela Comissão de Ética
no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Goiás (UFG) (Protocolo N°
017/11). Foram utilizados 75 camundongos Mus musculus (Swiss Webster) outbred,
machos, pesando entre 30 e 40g, com idade de 7 a 12 semanas, procedentes do
Biotério Central da UFG. Antes da realização do experimento, os animais
Rendimento: 55%
P.f.: 178 - 181°C
35
permaneceram por sete dias no laboratório, onde foram mantidos em gaiolas de
polipropileno de dimensão de 40 cm x 30 cm x 16 cm com 5 animais por gaiola,
forradas com maravalha, trocadas diariamente, alimentados com ração comercial
(marca “Presence-ratos e camundongos”) e água filtrada, ambos oferecidos ad
libitum. Os animais foram mantidos à temperatura ambiente de 25°C ± 2°C, umidade
50% ± 20% e um ciclo de luz 12 h claro/12 h escuro.
3.1.4. Cultura de sangue periférico humano
Os experimentos foram realizados após a aprovação pelo Comitê de Ética em
Pesquisa (CEP) da UFG (CAAE N° 39321514.9.0000.5083). Foram coletados 5 mL
de sangue de voluntários utilizando seringas estéreis descartáveis de 5 mL contendo
heparina. Imediatamente após a coleta, o sangue foi diluído em meio RPMI-1640.
Em seguida, esta cultura celular foi tratada com diferentes doses de CPN para o
Ensaio Cometa.
3.1.5. Cultura de células mononucleares humanas
Os experimentos foram realizados após a aprovação pelo Comitê de Ética em
Pesquisa (CEP) da UFG (CAAE N° 39321514.9.0000.5083). As células
mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram coletadas de voluntários. Para a
obtenção da cultura de PBMC, 20 mL de sangue foram coletados utilizando seringas
estéreis descartáveis de 20 mL contendo heparina. O sangue foi diluído em 20 mL
de meio RPMI-1640 e transferido para tubos cônicos contendo Histopaque, na
proporção 2:1. Após centrifugação, a 200 X g, por 50 minutos a 6°C, a camada de
PBMC obtida entre a mistura Histopaque e o plasma sanguíneo foi removida,
depositada em novos tubos cônicos e lavada com meio de cultura RPMI-1640
suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Depois de nova centrifugação a
300 X g, por 10 minutos a 6ºC, o sobrenadante foi descartado e o sedimento foi
ressuspendido em 10 mL de meio RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB e
novamente centrifugado a 300 X g, durante o mesmo tempo e mesma temperatura.
Depois do descarte do sobrenadante, o sedimento composto de PBMC foi
ressuspendido em 2 mL de meio de RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB.
Numa microplaca de 12 poços foi adicionado 200 μL da suspensão celular, 100 μL
36
de fitohemaglutinina (estimulador mitogênico) e 3 mL de meio RPMI-1640
suplementado com 10% de SFB. A cultura de PBMC foi incubada a 37°C, numa
atmosfera com 5% de CO2, por 24 h.
3.2. Metodologias
3.2.1. Teste de Mutagenicidade de Ames em cepas de Salmonella typhimurium
3.2.1.1. Procedimento Experimental
As cepas de Salmonella typhimurium TA98 e TA100 foram incubadas em
caldo nutriente, a 37°C, com agitação e aeração constantes, até atingir a fase
estacionária de crescimento. Para a avaliação da atividade mutagênica, alíquotas de
culturas das cepas bacterianas foram incubadas em diferentes doses de CPN (1, 10,
20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 e 5000 μg/placa), durante 25 min, em tubos em
triplicata com agitação e aeração constantes. Na avaliação da atividade
antimutagênica, os controles positivos (0,5 μg de 4-nitroquinolina 1-óxido para a
cepa TA98 e 1,5 μg de azida sódica para a cepa TA100) foram co-adminstrados com
as diferentes doses de CPN. Após a incubação, foi adicionado ágar glicosado
liquefeito (top-ágar) à temperatura de 45°C, contendo solução de histidina/biotina
(0,5 mM). O conteúdo foi vertido em placas de Petri, de 9 cm de diâmetro, em
triplicata, contendo meio MEVB sólido (meio mínimo glicosado), que foram
incubadas a 37°C, durante 48 h em estufa de demanda bioquímica de oxigênio
(BOD). Decorrido este período, foram contados os números de colônias revertentes
prototróficas para histidina, considerando-se a média aritmética dos resultados entre
as placas (Maron e Ames, 1983). Os resultados foram expressos pela média do
número de revertentes prototróficas obtidas de experimentos independentes
realizados em triplicata.
3.2.1.2. Análise dos resultados
Na avaliação da mutagenicidade, após a contagem do número de revertentes
foi calculada a razão de mutagenicidade (RM) para cada dose utilizada. A RM é
dada pela seguinte equação:
37
𝑅𝑀 = 𝑚é𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑛. 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑣𝑒𝑟𝑡𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒 (𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑡â𝑛𝑒𝑜𝑠 + 𝑖𝑛𝑑𝑢𝑧𝑖𝑑𝑜𝑠)
𝑚é𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑛. 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑣𝑒𝑟𝑡𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑑𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 (𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑡â𝑛𝑒𝑜𝑠)
Considera-se como resultado positivo para a mutagenicidade, quando o
número de colônias revertentes nas placas teste for igual ou superior ao dobro do
número de colônias revertentes espontâneas do controle negativo (Maron e Ames,
1983). Os resultados também foram avaliados pelo teste estatístico ANOVA e post
hoc Tukey e a normalidade dos dados foi avaliada pelo teste estatístico Kolmogorov-
Smirnov. Para determinar a relação dose-resposta foi utilizado o teste estatístico de
Regressão Linear. Valores de p < 0,05 foram considerados significativos.
Para a avaliação da antimutagenicidade, a normalidade dos dados foi
avaliada pelo teste estatístico Kolmogorov-Smirnov e a diferença entre as doses em
relação aos respectivos controles positivos foi avaliada pelo teste estatístico ANOVA
e post hoc Tukey. O valor de p < 0,05 foi considerado significativo. A análise
estatística foi realizada utilizando o software Statistical Package for the Social
Sciences, versão 20 (SPSS, Chicago, IL). A porcentagem de inibição da
mutagenicidade (%) foi calculada utilizando-se a seguinte equação:
𝑃𝐼(%) = [1 − (𝑛. 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑣𝑒𝑟𝑡𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑛𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒 − 𝑅𝐸
𝑛. 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑣𝑒𝑟𝑡𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑛𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑑𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 − 𝑅𝐸)] × 100
placa teste: placas incubadas com mutágeno e composto.
placa do controle positivo: placa incubada somente com o mutágeno.
RE: revertentes espontâneos (cepas testes incubadas na ausência de composto e
mutágeno).
3.2.2. Teste do Micronúcleo em medula óssea de camundongos
3.2.2.1. Procedimento Experimental
Os camundongos foram divididos em grupos de 5 animais. Para a avaliação
da mutagenicidade os animais foram tratados, via intraperitoneal (i.p.), com as doses
de 25, 50, 100 e 150 mg/kg de CPN em diferentes tempos (24 h e 48 h). Para a
38
avaliação da antimutagenicidade, as mesmas dosagens foram co-administradas com
uma dose única de 4mg/kg de mitomicina C (MMC) i.p. O grupo controle negativo foi
tratado com DMSO [0,1 mL/10 g peso corporal (p.c.)], enquanto o grupo controle
positivo recebeu uma dose padrão de MMC [4 mg/kg p.c. (80% DL50)]. Após os
tratamentos de 24 h e 48 h, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical
conforme descrito pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) como
procedimento mais rápido e conciso. Depois de sacrificados, os animais tiveram
seus fêmures retirados e dissecados. As epífises dos fêmures foram cortadas e a
medula óssea lavada com 1 mL de soro fetal bovino. Após homogeneização da
medula no soro, esta foi centrifugada a 1000 rpm durante 5 min. O sobrenadante foi
parcialmente descartado e o precipitado de células foi homogeneizado com pipeta
Pasteur. Uma gota de suspensão celular foi transferida para a lâmina histológica,
onde realizou-se o esfregaço celular. Após a secagem das lâminas, estas foram
fixadas em metanol absoluto durante 5 min e coradas em solução de Giemsa
tamponada com pH 6,8 por um período de 15 min. Após este período, as lâminas
foram lavadas em água corrente e deixadas secar à temperatura ambiente (Heddle,
1973).
3.2.2.2. Análise citogenética
A análise das lâminas foi realizada em microscópio óptico de luz branca com
a finalidade de se detectar micronúcleos nos eritrócitos da medula óssea dos
animais submetidos aos diferentes tratamentos. As células foram visualizadas
utilizando objetiva de imersão (100x). Foram contados 2000 eritrócitos
policromáticos (EPC) em duas lâminas para cada animal. Para a avaliação da
citotoxicidade, foram contados 2000 EPC e também computada a freqüência de
eritrócitos normocromáticos (ENC) presentes nos mesmos campos. A razão
EPC/ENC foi determinada conforme Schmid (1975).
3.2.2.3. Análise estatística
As frequências de eritrócitos policromáticos micronucleados (EPCMN) em
2000 EPC de cada grupo foram comparadas em relação ao grupo controle negativo
ou positivo pelo teste ANOVA e post hoc Tukey e foram considerados significativos
39
valores de p < 0,05. A normalidade dos dados foi avaliada pelo teste estatístico
Kolmogorov-Smirnov. Para determinar a relação dose-resposta foi utilizado o teste
estatístico de Regressão Linear.
As frequências de EPC e ENC de cada grupo tratado com CPN foram
comparadas com o grupo controle negativo ou positivo pelo teste qui-quadrado e
foram considerados significativos valores de p < 0,05.
A análise estatística foi realizada utilizando o software Statistical Package for
the Social Sciences, versão 20 (SPSS, Chicago, IL).
3.2.3. Ensaio Cometa
3.2.3.1. Procedimento experimental
A versão alcalina do Ensaio Cometa (Single Cell Gel Eletrocforesis) foi
realizada conforme descrito por Singh e colaboradores (1988) com pequenas
modificações. Na avaliação do potencial genotóxico de CPN, 100 μL de sangue
periférico humano foi adicionado em 1 mL de meio RPMI-1640. Em seguida, as
células foram tratadas com as doses 187,5; 375; 562,5 e 750 μg/mL de CPN e
incubadas a 37°C, numa atmosfera de 5% CO2, por quatro horas. Após este período,
15 μL da cultura de células foram misturadas e homogeneizadas em 120 μL de
agarose de baixo ponto de fusão e imediatamente a suspensão foi distribuída em
uma lâmina. A suspensão celular em agarose foi coberta com uma camada de
agarose de ponto de fusão normal a 1,5%. As lâminas foram cobertas com lamínulas
e mantidas a 4°C por 5 minutos. Após este período, as lâminas foram colocadas em
uma solução de lise (0,25 mol/L NaOH, 2,5 mol/L NaCl, 10 mmol/L Tris, 100 mmol/L
EDTA, 1% Triton X-100 e 10% DMSO, pH10,0) e incubadas a 4°C overnight para
remover proteínas e membranas. Posteriormente, as lâminas foram colocadas em
uma cuba para eletroforese com tampão alcalino (300 mmol/L NaOH, 1mM EDTA,
pH > 13,0) por 25 min para a desnaturação do DNA. A corrida eletroforética foi
realizada a 1V/cm, 300 mA, a 4°C, por 25 min. Após a eletroforese, as lâminas foram
mergulhadas em solução de neutralização (0,4M Tris, pH 7,5) durante 5 min por 3
vezes. Em seguida, as lâminas foram lavadas com água destilada e deixadas secar
à temperatura ambiente. Após a secagem, as lâminas foram fixadas em etanol
absoluto por 15 min. Todo o procedimento foi realizado no escuro ou sob luz
40
amarela para prevenir danos no DNA. As lâminas foram coradas com 20 μL de
solução de brometo de etídio (0,02 mg/mL). Foram realizados três ensaios
independentes.
3.2.3.2. Análise citogenética
A análise das lâminas foi realizada em microscópio de epifluorescência
Axioplan-Imaging®, utilizando o software Isis® com filtro de excitação de 510-560
nm e um filtro barreira de 590 nm, num aumento de 200X. Foram analisados 100
nucleóides para cada dose de CPN.
Para a avaliação dos danos genômicos, foi usado o programa TriTek Comet
Score®, versão 1.5. O parâmetro adotado no presente estudo foi a porcentagem de
DNA na cauda para a quantificação de danos no DNA.
3.2.3.3. Análise estatística
A média e o desvio padrão da porcentagem de DNA na cauda foi obtida para
cada tratamento. As diferentes doses de CPN foram comparadas em relação ao
controle negativo pelo teste ANOVA post hoc Tukey e foram considerados
significativos valores de p < 0,05. A normalidade dos dados foi avaliada pelo teste
estatístico Kolmogorov-Smirnov.
A análise estatística foi realizada utilizando o software Statistical Package for
the Social Sciences, versão 20 (SPSS, Chicago, IL).
3.2.4. Ensaio de MTT (Metiltiazoltetrazólio [3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-
difenilbrometo de tetrazolina])
Para o Ensaio de MTT, alíquotas de 1 x 105 de PBMC foram tratadas com as
doses de 2, 20, 50, 100, 250 e 500 μmol/L de CPN, em triplicata, utilizando
microplacas de 96 poços por 24 h em estufa a 37ºC com atmosfera contendo 5% de
CO2. Após este período, foi adicionado aos poços de cultivo celular, 10 μL de MTT
na concentração de 5mg/mL e incubados por 3 h em estufa a 37°C com atmosfera
contendo 5% de CO2. Em seguida, foram adicionados 50 μL de SDS a 10% diluído
em HCl/0,01N e incubados por 12 h à temperatura ambiente. A quantificação da
41
densidade óptica (DO) foi medida em espectrofotômetro (AWARENESS
TECHNOLOGY INE/ STAT FAX 2100). Os resultados de absorbância para as
diferentes doses de CPN e para o controle negativo foram analisadas no software
GraphPad Prism para determinação da citotoxicidade e da IC50.
3.2.5. Análise da Cinética do Ciclo Celular
Para a análise da Cinética do Ciclo Celular, alíquotas de 5 x 105 de PBMC
foram incubadas com as doses de 128, 256 e 512 μmol/L de CPN, em triplicata,
utilizando microplacas de 12 poços, em estufa a 37°C com atmosfera contendo 5%
de CO2 por 24 h. Foram realizados três experimentos, em triplicata. Após este
período, as células foram centrifugadas e em seguida lavadas com PBS. Ao final da
lavagem o sobrenadante foi desprezado e o pellet celular foi incubado com 1 mL de
álcool etílico gelado (70%) por 24 h a -20°C. Ao final do período de incubação as
células foram lavadas novamente com PBS e em seguida estas foram incubadas por
15 min em uma solução contendo ribonuclease A (RNAse A) 0,05% e iodeto de
propídeo (50 µg/mL). A análise da porcentagem de células em sub-G1, G0/G1, S,
G2/M foi realizada em citômetro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences), por meio
do software ModFit.
3.2.6. Avaliação de Apoptose e Necrose por coloração com Anexina V/Iodeto
de Propídeo (IP)
Para a detecção de Apoptose e Necrose foi utilizado o kit de detecção de
apoptose Anexina V/IP (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) de acordo com as instruções
do próprio fabricante. Para este ensaio alíquotas de 5 x 105 de PBMC foram tratadas
com as doses de 128, 256 e 512 μmol/L de CPN, utilizando microplacas de 12 poços
incubadas em estufa a 37°C com atmosfera contendo 5% de CO2 por 24 h. Também
foram incubadas apenas células, sem tratamento, para o controle negativo. Foram
realizados três experimentos, em triplicata. Após o período de tratamento com CPN
as células foram centrifugadas e posteriormente lavadas com PBS. O sobrenadante
foi descartado. Em seguida, foi adicionado 400 µL de tampão de ligação ao pellet
celular e em seguida acrescentados 5 µL de Anexina V e 1 µL de IP. As células
foram então incubadas em temperatura ambiente por 15 min e posteriormente foi
42
realizado a análise das células em citômetro de fluxo (FACSCallibur, BD
Biosciences). Para a análise dos dados foi utilizado o software Cell Quest. Foram
classificadas como células em apoptose inicial aquelas com marcação somente para
Anexina V (AN+)/(IP-) e como células em apoptose tardia aquelas com dupla
marcação de Anexina V e IP (AN+)/(IP+), células em necrose somente com
marcação para IP (AN-)/(IP+) e células viáveis não apresentam nenhuma marcação.
43
4. Resultados
4.1. Teste de Mutagenicidade de Ames em cepas de Salmonella typhimurium
A Tabela 4 mostra os resultados da avaliação mutagênica e antimutagênica
de CPN no teste de Ames. Os resultados foram obtidos a partir de três experimentos
independentes realizados em triplicata. Os dados obtidos para os grupos controle
negativo e positivo indicaram que as cepas estão de acordo com o protocolo
estabelecido por Maron e Ames (1983) e Mortelmans e Zeiger (2000).
Na avaliação da mutagenicidade, as doses de CPN (1, 10, 20, 50, 100, 200,
500 e 1000 μg/placa) apresentaram um aumento no número de revertentes
prototróficas para as cepas testadas, TA98 e TA100. No entanto, estes resultados
não indicaram uma diferença significativa entre o controle negativo e as diferentes
doses de CPN, pelo teste ANOVA e post hoc Tukey (p > 0,05). Para as doses de
2000 e 5000 μg/placa foi observada uma pequena diminuição no número de
revertentes prototróficas em ambas as cepas testadas. Os resultados mostraram
uma relação dose-resposta utilizando a análise de regressão, para ambas as cepas
testadas (p < 0,05). No entanto, nenhuma das cepas utilizadas apresentou razão de
mutagenicidade (RM) ≥ 2. O maior valor de RM foi obtido na dose de 1000 μg/placa,
na qual observou um RM = 1,59 para a cepa TA98 e um RM = 1,56 para a cepa
TA100. Assim, podemos inferir que CPN apresentou um perfil moderado de um
composto mutagênico com base na relação dose-resposta observada para as doses
testadas. Nas doses mais elevadas, 2000 e 5000 μg/placa, CPN mostrou um efeito
tóxico, que foi observado pela diminuição do número de revertentes prototróficas.
A avaliação antimutagênica de CPN mostrou que todas as doses de CPN (1,
10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 e 5000 μg/placa) co-tratadas com [4-
nitroquinolina 1-óxido (4-NQO)] na cepa TA98 causou uma diminuição significativa
no número de revertentes prototróficas em comparação com o controle positivo (4-
NQO) (p < 0,05). Além disso, na cepa TA100 foi observada uma diminuição no
número de revertentes prototróficas em todas as doses de CPN. No entanto, apenas
nas doses superiores à 50 μg/placa esta diminuição foi significativa (p < 0,05) em
comparação com o controle positivo (azida sódica). A maior porcentagem de inibição
de mutagenicidade (PI) foi observada na dose de 5000 μg/placa de CPN em ambas
44
as cepas, que atingiram uma PI = 61% para a cepa TA98 e uma PI = 41% para a
cepa TA100. Os resultados da antimutagenicidade sugerem que a diminuição do
número de revertentes prototróficas nas doses mais elevadas de CPN pode ser
parcialmente atribuída ao efeito tóxico de CPN, que já foi apresentado na avaliação
mutagênica.
45
Tabela 4 - Médias () e desvio padrão (S) de revertentes histidina, razão de mutagenicidade (RM) e porcentagem de inibição de
mutagenicidade (PI) para duas cepas de S. typhimurium, TA98 e TA100, tratadas com diferentes doses de CPN.
Tratamento Mutagenicidade3 Antimutagenicidade3
TA98 TA100 TA98 TA100
± 𝑆 RM ± 𝑆 RM ± 𝑆 PI (%) ± 𝑆 PI (%)
Controle negativo1 24,8 ± 6,0a,b 1,00 202,0 ± 61,0a 1,00 25,9 ± 7,4a - 174,0 ± 38,0a -
Controle positivo2 377,4 ± 27,0c 15,22 1822,3 ± 353,1b 9,02 383,4 ± 63,5b - 2086,8 ± 196,5b -
CPN 1 μg/placa 29,0 ± 7,0a 1,17 201,7 ± 57,6a 0,99 213,7 ± 31,8c 47 1890,5 ± 241,6b 10
CPN 10 μg/placa 30,8 ± 7,7a 1,24 214,0 ± 65,5a 1,06 201,9 ± 49,3c 51 1830,0 ± 123,0b 13
CPN 20 μg/placa 38,4 ± 8,8a 1,55 238,0 ± 41,0a 1,18 203,9 ± 47,9c 50 1834,0 ± 29,9b 13
CPN 50 μg/placa 28,3 ± 6,1a 1,14 235,3 ± 54,6a 1,16 207,8 ± 27,7c 49 1704,3 ± 157,8b,d 20
CPN 100 μg/placa 30,7 ± 7,2a 1,24 254,7 ± 49,2a 1,26 208,7 ± 44,1c 49 1610,0 ± 136,3,c,d 25
CPN 200 μg/placa 32,5 ± 6,2a 1,31 235,7 ± 16,2a 1,17 203,3 ± 22,9c 50 1556,3 ± 137,1c,d 28
CPN 500 μg/placa 35,2 ± 5,5a 1,42 260,9 ± 35,2a 1,29 198,2 ± 20,8c 52 1525,0 ± 104,6c,d 29
CPN 1000 μg/placa 39,4 ± 3,9a 1,59 316,0 ± 69,0a 1,56 189,4 ± 17,1c 54 1428,3 ± 110,1c,d 34
CPN 2000 μg/placa 23,2 ± 3,7a,b 0,94 212,7 ± 33,1a 1,05 173,5 ± 29,1c 59 1497,7 ± 170,7c,d 31
CPN 5000 μg/placa 10,2 ± 2,5b 0,41 112,7 ± 32,3a 0,56 166,6 ± 20,9c 61 1306,0 ± 174,0d 41
1Controle negativo: 20 μL de dimetilsulfóxido (DMSO). 2Controle positivo: 0,5 μg/placa de 4-nitroquinolina 1-óxido (4NQO) para TA98 e 1,5 μg/placa de azida sódica para TA100.
Todos os valores são média ± desvio padrão de três experimentos independentes. 3Análise estatística: teste de ANOVA post hoc Tukey.
Valores seguidos por pelo menos uma mesma letra na mesma coluna não apresentam diferença significativa (p > 0,05). Valores com letras diferentes na
mesma coluna apresentam diferença significativa (p < 0,05).
46
4.2. Teste do Micronúcleo em medula óssea de camundongos
Nas Tabelas 5 e 6, estão apresentados os resultados da avaliação das
atividades mutagênica, citotóxica, antimutagênica e anticitotóxica de CPN.
No presente estudo, o grupo controle negativo (dimetilsulfóxido - DMSO)
mostrou baixa frequência de eritrócitos policromáticos micronucleados (EPCMN),
como esperado, e o grupo controle positivo (mitomicina C - MMC) mostrou um
aumento significativo em EPCMN comparado com o grupo controle negativo (p <
0,05), confirmando a sensibilidade do teste.
Na análise da mutagenicidade de CPN (Tabela 5), observou-se nas doses de
25, 50, 100 e 150 mg/kg uma frequência média de EPCMN de 11,2, 18,2, 20,8, e
22,4 [em 2000 eritrócitos policromáticos (EPC)] no tempo de 24 h, e 7,0, 8,6, 9,2, e
10,2 no tempo de 48 h, respectivamente, enquanto que o grupo controle negativo
apresentou uma média de 4,2 EPCMN. Para todas as doses testadas, CPN
aumentou a freqüência de EPCMN no tempo de 24 h e 48 h comparado com o grupo
controle negativo (p < 0,05). Apenas na dose de 25 mg/kg de CPN, no tempo de 48
h, a frequência EPCMN não foi significativa (p > 0,05). Em ambos os tempos de
tratamento foi observado um efeito dose-resposta. Assim, os resultados indicaram
que CPN mostrou um efeito mutagênico.
A razão de eritrócitos policromáticos sobre eritrócitos normocromáticos
(EPC/ENC) pode ser usada como um indicador de citotoxicidade (Tabela 5). Nos
grupos tratados com 25, 50, 100, e 150 mg/kg de CPN, a razão EPC/ENC foi de
1,05, 0,83, 0,80, e 0,71 no tempo de 24 h, e 0,97, 0,63, 0,59, e 0,56 no tempo de 48
h, respectivamente, enquanto que o grupo controle negativo foi de 1,04. Estes
resultados demonstraram que nos tempos de 24 h e 48 h, a dose de 25 mg/kg de
CPN não causou uma diminuição significativa na razão EPC/ENC comparada com o
grupo controle negativo (p > 0,05). No entanto, nas doses de 50, 100 e 150 mg/kg
nos tempos de 24 h e 48 h, observou-se uma diminuição significativa na razão
EPC/ENC comparada com o grupo controle negativo (p < 0,05), sugerindo um efeito
citotóxico nestas doses. Observou-se que a razão EPC/ENC foi menor no tempo de
48 h, em comparação com os resultados obtidos no tempo de 24 h, indicando que
CPN mostrou ação citotóxica maior neste tempo.
Na avaliação da atividade antimutagênica (Tabela 6), os valores médios de
EPCMN (por 2000 EPC) dos grupos tratados com 25, 50, 100, e 150 mg/kg de CPN
47
co-administrados com MMC, foram 20,2, 16,0, 17,8, e 19,6 no tempo de 24 h, e 8,0,
7,0, 7,4, e 8,2 no tempo de 48 h, respectivamente, enquanto que o grupo controle
positivo foi 35,4 no tempo de 24 h e 11,0 no tempo de 48 h. Para todas as doses
testadas no tempo de 24 h, CPN diminuiu significativamente a freqüência de
EPCMN (p < 0,05), comparado com o respectivo grupo controle positivo. Estes
resultados indicaram que CPN modulou a atividade mutagênica de MMC,
demonstrando um efeito antimutagênico. Para todas as doses de CPN no tempo 48
h, observou-se uma atenuação menor contra o efeito mutagênico de MMC e a
redução da frequência de EPCMN em relação ao respectivo grupo controle positivo
não foi significativa (p > 0,05).
Em relação à atividade anticitotóxica de CPN (Tabela 6), a razão EPC/ENC
obtida nas doses de 25, 50, 100 e 150 mg/kg de CPN co-tratadas com MMC foram
0,67, 0,71, 0,80, e 0,88 no tempo de 24 h, e 0,55, 0,54, 0,58 e 0,63 no tempo de 48
h, respectivamente, enquanto que para o grupo controle positivo foi de 0,64 no
tempo de 24 h e 0,47 no tempo de 48 h. Um aumento significativo na razão
EPC/ENC foi observado em relação com o respectivo grupo controle positivo para
todas as doses de CPN em ambos os tempos (p < 0,05), com exceção da dose de
25 mg/kg no tempo de 24 h (p > 0,05). Os resultados indicaram que o tratamento
simultâneo atenuou a citotoxicidade de MMC.
48
Tabela 5 - Avaliação das atividades genotóxica e citotóxica em camundongos: frequência de EPCMNs e EPCs/ENCs em medula óssea de
camundongos tratados com chalcona sulfonamida N-4-[3-(4-nitrofenil)prop-2-enoil]fenil-benzenosulfonamida (CPN).
Tratamento (mg/kg p.c.) Tempo de 24 h Tempo de 48 h
3EPCMNs/2000EPCs 4EPCs/ENCs 3EPCMNs/2000EPCs 4EPCs/ENCs
Controle negativo1 4,2±1,48a 1,04±0,09a 4,2±1,48a 1,04±0,09a
Controle positivo2 35,4±4,04d 0,64± 0,06d 11,0±2,92c 0,47± 0,04d
25 mg/kg CPN 11,2±3,19b 1,05±0,09a 7,0±2,35a,c 0,97±0,13a
50 mg/kg CPN 18,2±3,27c 0,83±0,08b 8,6±1,14b,c 0,63±0,04b
100 mg/kg CPN 20,8±2,77c 0,80±0,06b 9,2±2,28b,c 0,59±0,04b,c
150 mg/kg CPN 22,4±3,29c 0,71±0,07c 10,2±2,59b,c 0,56±0,08c
1 Controle negativo: Dimetilsulfóxido (DMSO) 0,1 mL/10 g peso corporal (p.c.). 2 Controle positivo: Mitomicina C (MMC) 4 mg/kg (80% DL50).
Todos os valores são média ± desvio padrão a partir de cinco animais. 3 Análise estatística: ANOVA e post hoc Tukey. 4 Análise estatística: teste do qui-quadrado.
Os valores médios seguidos pela mesma letra na coluna não apresentam diferença significativa com 5% de probabilidade.
Valores seguidos por pelo menos uma mesma letra na mesma coluna não apresentam diferença significativa (p > 0,05). Valores com letras diferentes na
mesma coluna apresentam diferença significativa (p < 0,05).
49
Tabela 6 - Avaliação das atividades antigenotóxica e anticitotóxica em camundongos: frequência de EPCMNs e EPCs/ENCs em medula óssea
de camundongos tratados com chalcona sulfonamida N-4-[3-(4-nitrofenil)prop-2-enoil]fenil-benzenosulfonamida (CPN) mais mitomicina C
(MMC).
Tratamento (mg/kg p.c.) Tempo de 24 h Tempo de 48 h
3EPCMNs/2000EPCs 4EPCs/ENCs 3EPCMNs/2000EPCs 4EPCs/ENCs
Controle negativo1 4,2±1,48c 1,04±0,09e 4,2±1,48a 1,04±0,09d
Controle positivo2 35,4±4,04a 0,64± 0,06a 11,0±2,92b 0,47±0,04a
25 mg/kg CPN + MMC 20,2±3,11b 0,67±0,06a,b 8,0±2,65a,b 0,55±0,10b
50 mg/kg CPN + MMC 16,0±2,55b 0,71±0,08b 7,0±1,58a,b 0,54±0,06b
100 mg/kg CPN + MMC 17,8±2,59b 0,80±0,06c 7,4±1,52a,b 0,58±0,11b
150 mg/kg CPN + MMC 19,6±3,51b 0,88±0,06d 8,2±1,92a,b 0,63±0,10c
1 Controle negativo: Dimetilsulfóxido (DMSO) 0,1 mL/10 g peso corporal (p.c.) 2 Controle positivo: Mitomicina C (MMC) 4 mg/kg (80% DL50).
Todos os valores são média ± desvio padrão a partir de cinco animais. 3Análise estatística: ANOVA e post hoc Tukey. 4 Análise estatística: teste do qui-quadrado.
Os valores médios seguidos pela mesma letra na coluna não apresentam diferença significativa com 5% de probabilidade.
Valores seguidos por pelo menos uma mesma letra na mesma coluna não apresentam diferença significativa (p > 0,05). Valores com letras diferentes na
mesma coluna apresentam diferença significativa (p < 0,05).
50
4.3. Ensaio Cometa
Os resultados obtidos na avaliação de danos no DNA pelo Ensaio Cometa
estão representados na Figura 11.
As células expostas às doses de 187,5, 375, 562,5 e 750 μg de CPN
mostraram 32, 31, 37 e 45% de danos no DNA, respectivamente, enquanto que o
controle negativo apresentou 11%. Para todas as doses testadas, CPN apresentou
um aumento significativo na porcentagem de danos no DNA (p < 0,05) quando
comparado com o controle negativo. A maior porcentagem de danos no DNA foi
observada na dose de 750 μg. Assim, os resultados no Ensaio Cometa
demonstraram que CPN apresentou efeito genotóxico.
Figura 11: Média e desvio padrão da porcentagem de DNA na cauda nos
diferentes tratamentos de CPN. CN: Controle Negativo [Dimetilsulfóxido (DMSO)].
4.4. Ensaio de MTT
No Ensaio de MTT, a cultura de PBMC foi tratada com as doses de 2, 20, 50,
100, 250 e 500 μmol/L de CPN por 24 h. A partir dos resultados da viabilidade
celular, foi calculada a IC50 (concentração que inibe 50% das células) de CPN. O
valor de IC50 de CPN obtido foi de 256 μmol/L. Esta concentração de CPN foi
utilizada como referência para a seleção de doses utilizadas na análise da cinética
0
10
20
30
40
50
60
CN 187,5μg 375μg 562,5μg 750μg
% D
NA
na c
au
da
Tratamentos
51
do ciclo celular e na avaliação de apoptose e necrose por coloração com Anexina
V/IP.
4.5. Análise da Cinética do Ciclo Celular
Os resultados da análise da cinética do ciclo celular após o tratamento com
as doses de 128, 256 e 512 μmol/L de CPN em PBMC, por 24h, estão apresentados
nas figuras 12 e 13.
A análise da cinética do ciclo celular mostrou que todas as doses de CPN
testadas não induziram alteração significatva nas fases G0/G1, S e G2/M do ciclo
celular de PBMC em relação ao controle negativo (p > 0,05). Entretanto, as doses de
256 e 512 μmol/L de CPN aumentaram significativamente a porcentagem de células
em sub-G1 comparada com o controle negativo (p < 0,05). Estes resultados
indicaram que CPN não interfere na progressão do ciclo celular, mas sugere um
efeito citotóxico de CPN devido ao aumento da porcentagem de células em sub-G1,
que é um indicativo de apoptose.
Sub G1 G0/G1 S G2/M0
20
40
60
80
100CN
128 µmol/L
256 µmol/L
512 µmol/L
*****
(% d
e c
élu
las)
Figura 12: Valores médios de porcentagem de células em sub-G1, G0/G1, S,
G2/M após o tratamento com o controle negativo (CN) e as doses de 128, 256 e 512
μmol/L de CPN, respectivamente, em PBMC. **Diferença significativa em relação ao
controle negativo considerando p < 0,01. ***Diferença significativa em relação ao
controle negativo considerando p < 0,001.
52
Figura 13: Histogramas com o perfil do ciclo celular de PBMC tratadas com
diferentes doses de CPN.
4.6. Avaliação de Apoptose e Necrose por coloração com Anexina V/Iodeto de
Propídeo (IP)
Os resultados da avaliação de apoptose e necrose por coloração com
Anexina V/IP estão apresentados nas figuras 14 e 15.
Na avaliação de apoptose e necrose por coloração com Anexina V/IP de
CPN, a cultura de PBMC foi tratada com as doses de 128, 256 e 512 μmol/L por 24
h. Na figura 14, pode-se observar que a porcentagem de células viáveis diminuiu
significativamente nas três doses avaliadas de CPN em relação ao controle negativo
(p < 0,05). A menor porcentagem de células viáveis foi observada na dose de 256
μmol/L de CPN, que mostrou 28% de células viáveis, enquanto que o controle
negativo apresentou 71% de células viáveis. Observou-se também uma diminuição
na porcentagem de células em apoptose inicial nas três doses de CPN testadas em
relação ao controle negativo, mas esta diminuição não foi significativa (p > 0,05). A
menor porcentagem de células em apoptose inicial foi observada na dose de 512
μmol/L, que apresentou 8% de células em apoptose inicial enquanto que o controle
negativo apresentou 15% de células em apoptose inicial. Entretanto, a porcentagem
de células em apoptose tardia e necrose aumentou significativamente em relação ao
controle negativo para todas as doses de CPN testadas (p < 0,05). A maior
porcentagem de células em apoptose tardia foi observada na dose de 256 μmol/L
Controle Negativo Sub-G1: 0% G0/G1: 94% S: 2% G2/M: 4%
G1
S G2
G2 S
G1 128 μmol/L de CPN Sub-G1: 2% G0/G1: 93% S: 4% G2/M: 3%
G2 S
G1 256 μmol/L de CPN Sub-G1: 5% G0/G1: 92% S: 4% G2/M: 4%
512 μmol/L de CPN Sub-G1: 12% G0/G1: 94% S: 3% G2/M: 3%
S G2
G1
53
(34%) e a maior porcentagem de células em necrose foi observada na dose de 512
μmol/L (30%), enquanto que o controle negativo apresentou 8% de células em
apoptose tardia e 6% de células em necrose. Assim, pode-se afirmar que CPN é um
composto citotóxico, pela indução de apoptose tardia e necrose.
A figura 15 mostra os citogramas para o controle negativo e para as doses de
128, 256 e 512 μmol/L de CPN. O quadrante inferior esquerdo indica a população de
células que não foram marcadas por anexina V ou IP. Nas doses de 128, 256 e 512
μmol/L de CPN, foi observado deslocamento da população de células para os
quadrantes superiores direito e esquerdo. O deslocamento para o quadrante
superior direito está relacionado ao aumento da marcação dessas células com IP e
anexina V, indicando a apoptose tardia. O deslocamento das células para o
quadrante superior esquerdo está relacionado ao aumento da marcação das células
apenas com IP, indicando células que estão em necrose.
Figura 14: Valores médios de porcentagem de células viáveis, células em
apoptose inicial, células em apoptose tardia e células em necrose após o tratamento
com o controle negativo e as doses de 128, 256 e 512 μmol/L de CPN,
respectivamente em PBMC. **Diferença significativa em relação ao controle negativo
considerando p < 0,01. ***Diferença significativa em relação ao controle negativo
considerando p < 0,001.
0
20
40
60
80
100ViabilidadeApoptose InicialApoptose TardiaNecrose
********
*** ***
*
********
***
Concentração em µMol/L
(% d
e cé
lula
s)
CN 128 μmol/L 256 μmol/L 512 μmol/L
54
Figura 15: Citogramas dos efeitos de CPN na indução de morte celular
através do teste de dupla marcação: Anexina V/IP em 24 h de tratamento.
512 μ
mol/L d
e C
PN
128 μ
mol/L d
e C
PN
256 μ
mol/L d
e C
PN
Contr
ole
Nega
tivo
71% 15%
6% 8%
30%
35%
25%
9% 10% 28%
34% 29%
8% 30%
32% 30%
55
5. Discussão
Chalconas e sulfonamidas são grupos químicos bem conhecidos devido às
suas diversas aplicações farmacêuticas no tratamento de uma variedade de
doenças. Estudos recentes têm demonstrado que chalconas com substituintes
sulfonamidas apresentam importantes atividades biológicas (Andrighetti-Frohner et
al. 2007). Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos biológicos
de CPN por meio da análise de bioindicadores de danos genéticos em sistemas-
teste bacteriano, animal e humano.
Os resultados do Teste de Ames demonstraram que CPN apresentou um
perfil moderado de um composto mutagênico e tóxico. O efeito tóxico deste
composto, observado pela redução do número de revertentes prototróficas nas
doses mais elevadas de CPN, pode ser relacionado com o efeito antibacteriano de
compostos sulfonamidas. De acordo com Pelczar (1996) e Jawetz (1998), as
sulfonamidas são estruturalmente similares ao ácido p-aminobenzóico (PABA), o
qual é precursor da via de biossíntese do ácido fólico. O ácido fólico, por sua vez, é
precursor da síntese de ácidos nucléicos. Assim, as sulfonamidas impedem a
incorporação do PABA na molécula do ácido fólico por competição pelo centro ativo
da enzima diidropteroato-sintetase. Em conseqüência, formam-se análogos não
funcionais do ácido fólico, impedindo o crescimento da célula bacteriana. Esta
possível propriedade bactericida de CPN pode apresentar resultados falsos
negativos com uma mutagenicidade subestimada no teste de Ames, que é
justificado pelos baixos valores da RM observados após o tratamento com as doses
mais elevadas de CPN.
No Teste do Micronúcleo, o tratamento com CPN induziu um aumento
significativo na frequência de EPCMN, no tempo de 24 h e 48 h (p < 0,05),
demonstrando ação mutagênica. Uma diminuição significativa na razão EPC/ENC,
foi observada nas maiores doses de CPN no tempo de 24 h e 48 h (p < 0,05)
comparado com o controle negativo, na qual sugere que CPN apresentou efeito
citotóxico.
No Ensaio Cometa, também observou-se atividade genotóxica de CPN,
devido ao aumento significativo da porcentagem de danos no DNA para as
diferentes doses testadas em relação ao controle negativo (p < 0,05).
56
Na análise da Cinética do Ciclo Celular, CPN apresentou um aumento da
porcentagem de células em sub-G1, o qual é um indicativo de apoptose,
demonstrando ação citotóxica.
Na detecção de apoptose e necrose por coloração com Anexina V/IP, CPN
mostrou um efeito citotóxico, pela indução de apoptose tardia e necrose. A indução
de apoptose tardia e necrose pode ser um indicativo de indução de morte por uma
via chamada de necroptose. A necroptose apresenta tanto características
apoptóticas quanto necróticas. Tal como na apoptose, a necroptose envolve a
formação de complexos multi-protéicos que resultam em morte celular. E tal como
na necrose, a necroptose é caracterizada por perda da integridade da membrana
plasmática, organelas e inchaço celular e por consequência, a lise da célula
(Radogna et al. 2015). Em contraste com a apoptose, a necroptose é independente
da atividade das caspases (Radogna et al. 2015) e na maioria dos casos a sua
ativação envolve a proteína sinalizadora RIP1 e/ou seu homólogo RIP3 (Galluzzi et
al. 2012) e membros da família TNF (Radogna et al. 2015). A necroptose pode ser
induzida por diferentes maneiras, como danos ao DNA e moléculas que se ligam aos
receptores de morte. Estudos sobre necroptose tem mostrado que este tipo de morte
celular, garante a morte das células quando a apoptose falha (Shiraishi et al. 2010;
Zhang et al. 2011; Wu et al. 2011).
Assim, nos sistemas-teste, bacteriano, animal e humano, utilizados no
presente estudo, mostraram que CPN apresentou atividades genotóxica e citotóxica.
Estas atividades, possivelmente podem ser atribuídas ao grupo nitro como
substituinte. Chalconas com grupo nitro apresentam maior potencial mutagênico e
carcinogênico comparado com chalconas não substituídas. Substituintes no C (4) do
anel B, como no caso do grupo nitro na chalcona sulfonamida CPN, são essenciais
para tais atividades (Ramalho et al. 2013).
As atividades genotóxica e citotóxica de compostos que tem um grupo nitro
podem estar associadas com a redução enzimática, gerando metabólitos
intermediários nitrosos e N-hidroxilados (Poirier & Weisburger, 1974). Intermediários
N-hidroxilados são muito reativos com grupos tióis presentes em proteínas e
também podem ser acetilados tornando-se promotores de reações relacionadas com
a formação de adutos no DNA, alterando-o e podendo gerar instabilidade
cromossômica (Guengerich, 1992).
57
Estudos na literatura, como os realizados por Cheng e colaboradores (2008) e
por Luo e colaboradores (2011), relatam que tanto chalconas, quanto sulfonamidas
apresentam atividade antimitótica devido à inibição da polimerização das tubulinas
impedindo a formação do fuso mitótico. Os resultados obtidos na análise da Cinética
do Ciclo Celular, mostraram que CPN não alterou a progressão do ciclo celular.
Assim, os dados obtidos podem indicar que as atividades genotóxica e citotóxica de
CPN não estão relacionadas à inibição da formação de tubulinas ou à atividade
antimitótica.
De acordo com os resultados da avaliação da atividade antimutagênica, CPN
indicou considerável atividade antimutagênica no Teste de Ames e no Teste do
Micronúcleo. No Teste do Micronúcleo, CPN ainda mostrou um aumento na razão
EPC/ENC comparada com o respectivo controle positivo, indicando um efeito
protetor contra a ação citotóxica de MMC em medula óssea de camundongos.
A ação antimutagênica de CPN no Teste de Ames pode ser parcialmente
atribuída ao efeito antibacteriano obtido nas doses mais altas observadas nos
resultados da avaliação mutagênica neste teste. Estudos anteriores mostraram que
derivados de chalcona que possuem cetonas α,β-insaturadas apresentam efeito
antimutagênico contra o promutágeno benzo(a)-pireno (Torigge et al. 1983). Assim,
o efeito quimioprotetor de CPN em ambos os testes, possivelmente pode ser
atribuído, parcialmente pela presença da porção α,β-insaturada neste composto.
Os resultados do presente estudo mostraram que CPN apresentou atividades
genotóxica e antigenotóxica. Muitas substâncias antimutagênicas também
apresentam atividade mutagênica, tal como a quercetina, que é convertido em um
produto potencialmente tóxico, enquanto oferece proteção pela eliminação de
espécies reativas de oxigênio (ERO) na célula (BOOTS et al., 2008).
Adicionalmente, uma série de substâncias que apresentam ação antimutagênica
e/ou anticarcinogênica contra aminas heterocíclicas também apresentaram efeitos
mutagênicos ou carcinogênicos (Dashwood, 2002). A maioria destas substâncias
moduladoras são produtos biossintetizados por plantas, assim como as chalconas.
58
6. Conclusões
O presente trabalho avaliou os possíveis efeitos biológicos da chalcona
sulfonamida N-4-[3-(4-nitrofenil)prop-2-enoil]fenil-benzenosulfonamida (CPN) por
meio da análise de bioindicadores de danos genéticos em sistemas-teste bacteriano,
animal e humano.
Os resultados obtidos permitiram-nos concluir que:
• Na avaliação da atividade mutagênica pelo Teste de Ames em cepas de S.
typhimurium TA98 e TA100, CPN não apresentou um aumento significativo no
número de revertentes prototróficas para as cepas testadas. Entretanto, CPN
apresentou perfil moderado de um composto mutagênico e tóxico, devido à
relação dose-resposta observada para as doses testadas. Nas doses mais
elevadas, 2000 e 5000 μg/placa de CPN, foi observado uma diminuição do
número de revertentes prototróficas.
• No Teste de Ames, CPN apresentou ação antimutagênica para todas as
doses testadas na cepa TA98. Na cepa TA100, CPN apresentou ação
antimutagênica significativa nas doses superiores à 50 μg/placa.
• No Teste do Micronúcleo, CPN apresentou efeito mutagênico em todas as
doses testadas de CPN, no tempo de 24 h e 48 h. CPN também mostrou
efeito citotóxico no Teste do Micronúcleo, observado pela diminuição na razão
de EPC/ENC em todas as doses testadas, no tempo de 24 h e 48 h.
• Na avaliação da atividade antimutagênica, no Teste do Micronúcleo, CPN
diminuiu significativamente a freqüência de EPCMN (p < 0,05), no tempo de
24 h, demonstrando efeito antimutagênico. No tempo de 48 h, observou-se
também uma diminuição na freqüência de EPCMN, mas esta não foi
significativa (p > 0,05). Em relação à atividade anticitotóxica de CPN, no Teste
de Micronúcleo, observou-se um aumento na razão EPC/ENC para todas as
doses testadas. Assim, os resultados indicaram ação anticitotóxica de CPN.
• No Ensaio Cometa, observou-se atividade genotóxica de CPN, devido ao
aumento significativo da porcentagem de danos no DNA para todas as doses
testadas.
• Na análise da Cinética do Ciclo Celular, CPN não induziu alteração
significativa nas fases G0/G1, S e G2/M do ciclo celular de PBMC, para todas
59
as doses testadas (p > 0,05). Entretanto, as doses de 256 e 512 μmol/L de
CPN apresentaram um aumento significativo na porcentagem de células em
sub-G1 (p < 0,05), o qual é um indicativo de apoptose, demonstrando ação
citotóxica.
• Na detecção de apoptose e necrose por coloração com Anexina V/IP, CPN
mostrou um efeito citotóxico, pela indução de apoptose tardia e necrose.
60
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80
Anexos
Anexo A – Artigo publicado na revista Plos One
81
81
Anexo B – Espectros de ressonância magnética nuclear (RMN ¹H),
infravermelho (IV-TF) e massa (EM) da chalcona sulfonamida CPN.
Figura 16: Espectro de RMN ¹H (500 MHz, DMSO-d6) da 4-
N[fenilsulfonilamida] acetofenona 3.
82
Figura 17: Espectro ampliado de 7,1 a 7,9 ppm de RMN ¹H (500 MHz, DMSO-
d6) da 4-N[fenilsulfonilamida] acetofenona 3.
83
Figura 18: Espectro IV-TF da 4-N[fenilsulfonilamida] acetofenona 3.
84
Figura 19: Espectro de EM da 4-N[fenilsulfonilamida] acetofenona 3.
85
Figura 20: Espectro de RMN ¹H (500 MHz, DMSO-d6) da 1[4’-N-fenil-
sulfonilamidafenil]-3-(4-nitrofenil)-2E-propen-1-ona 5.
86
Figura 21: Espectro ampliado de 7,1 a 8,3 ppm de RMN ¹H (500 MHz,
DMSO-d6) da 1[4’-N-fenil-sulfonilamidafenil]-3-(4-nitrofenil)-2E-propen-1-ona 5.
87
Figura 22: Espectro IV-TF da 1[4’-N-fenil-sulfonilamidafenil]-3-(4-nitrofenil)-
2E-propen-1-ona 5.
88
Figura 23: Espectro de EM da 1[4’-N-fenil-sulfonilamidafenil]-3-(4-nitrofenil)-
2E-propen-1-ona 5.
