18

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE TECNOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E

TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

DALINE FERNANDES DE SOUZA ARAÚJO

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DO

SORO DE LEITE CAPRINO NA COLITE EXPERIMENTAL E

NA RESPOSTA CELULAR

JOÃO PESSOA-PB

2016

19

Daline Fernandes de Souza Araújo

Avaliação do potencial anti-inflamatório do soro de leite caprino

na colite experimental e na resposta celular

João Pessoa-PB

2016

20

Daline Fernandes de Souza Araújo

Avaliação do potencial anti-inflamatório do soro de leite caprino

na colite experimental e na resposta celular

Tese apresentada ao Programa de

Pós-graduação em Ciência e

Tecnologia de Alimentos, Centro de

Tecnologia, Universidade Federal da

Paraíba, em cumprimento aos

requisitos para obtenção do título de

Doutora em Ciência e Tecnologia de

Alimentos.

Orientadora: Profa. Dra. Rita de Cássia Ramos do Egypto Queiroga

Coorientadora: Profa. Dra. Gerlane Coelho Bernardo Guerra

João Pessoa-PB

2016

21

22

Daline Fernandes de Souza Araújo

Avaliação do potencial anti-inflamatório do soro de leite caprino na colite experimental

e na resposta celular

Tese aprovada em 12 de agosto de 2016

Banca Examinadora

_____________________________________________________________

Profa. Dra. Rita de Cássia Ramos do Egypto Queiroga

Universidade Federal da Paraíba

Coordenador da Banca

_____________________________________________________________

Profa. Dra. Gerlane Coelho Bernardo Guerra

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Coorientadora

_____________________________________________________________

Profa. Dra. Maria Manuela Estevez Pintado

Universidade Católica do Porto, Portugal

Examinador Externo

_____________________________________________________________

Profa. Dra. Silvana Maria Zucolotto Langassner

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Examinador Externo

__________________________________________________________

Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Examinador Externo

_____________________________________________________________

Profa.Dra. Prof. Dra. Juliana Késsia Barbosa Soares

Universidade Federal de Campina Grande

Examinador Interno

23

Aos meus avós maternos Giselda e Celsoϯ, e paternos

Severinaϯ e José Pergentino

ϯ,

e aos bisavós maternos Luis Conzaga e Genésia

ϯ (In memorian),

Dedico

24

AGRADECIMENTOS

Tudo posso naquele que me fortalece (Fil. 4:13). Essa passagem bíblica

representa o meu agradecimento a Deus por me fortalecer nos momentos mais difíceis,

que me fizeram muitas vezes duvidar da minha capacidade em realizar este trabalho de

doutorado.

Agradeço em especial as minhas orientadoras Profa. Rita de Cássia Ramos do

Egypto Queiroga e Professora Gerlane Coelho Bernardo Guerra, que mesmo sem me

conhecerem, acreditaram em meu potencial na investigação científica. Trabalhar com

experimentação animal era algo novo para mim, muito embora tivesse interesse pela

área.

Aos meus pais (Clidenor e Conceição), irmã (Dennya) e cunhado (Max), família

que sempre esteve presente nos momentos felizes e difíceis da minha vida. A

concretização deste trabalho só foi possível com o apoio incondicional de vocês.

Agradeço à professora Maria Manuela Estevez Pintado pelos ensinamentos e

possibilidade de através de uma colaboração com a Universidade Católica Portuguesa

realizar o doutorado sanduíche nesta instituição. Obrigada pela acolhida durante a

estadia no Porto-PT.

Aos colegas portugueses Nadia e Manu Amorim pela troca de conhecimentos e

companheirismo na adaptação ao novo laboratório na cidade do Porto-Portugal. Às

brasileiras colegas de laboratório e amigas que vou levar no meu coração Glenise,

Adriana, Mariane e em especial Andréia Tremarin e Luciana Lima pelo

companheirismo e serem confidentes principalemente nos momentos de saudosismo à

família.

Ao professor Júlio Gálvez da Universidade de Granada- Espanha a quem já

admirava mesmo antes de conhecê-lo pelas suas produções científicas, e após, pelo

grande profissional que és. Dedicado ao trabalho e preocupado com seus alunos e em

especial aos estrangeiros, desde o período de acomodação até a despedida. Meu

respeito e admiração. Não posso deixar de agradecer à Alba Rodrigues, Francesca

Algieri, Teresa Vezza pelos grandes ensinamentos os quais vou levar para toda a vida,

além de uma amizade verdadeira. Pepe, Maria Elena, Desi Camuesco (in memorian) e

Pilar Utrilla que também foram fundamentais para meu aprendizado como profissional

25

e sempre aptos a ajudar nas dificuldades encontradas no laboratório ou algo

relacionado a pesquisa. ¡Ya os echo de menos!

Às amizades conquistadas durante o doutorado, em especial Yasmim Sousa, que

partilhou muitos momentos para a realização deste trabalho, principalmente no

período do doutorado sanduíche em Portugal e na Espanha. E também foi ombro

amigo para os momentos felizes e difíceis quando estávamos fora do país, sem esquecer

de algumas aventuras e muitas histórias para recordar!

Agradeço de forma especial à amiga Paloma Oliveira. Deus nos abençoa com

pessoas que podemos chamar de irmãos, mesmo sem ter sido gerado pelo mesmo pai ou

mãe, e ter o mesmo sangue. Nos conhecemos e pudemos partilhar nossas experiências

do laboratório, ajudando uma a outra diretamente em nossas pesquisas. Você foi um

presente de Deus em minha vida, e uma amizade que desejo que frutifique ainda mais.

Agradeço à sua família que prontamente me acolheu em vários momentos de minha

vinda a João Pessoa.

E outras amizades conquistadas, como a de Raphaela Rodrigues, Fernanda

Rolim, Juliana Kessia e Mayara, o grupo de experimental. Aos colegas do doutorado

Estefânia (pela indicação à pesquisa), Fábio e Valquiria, Amanda e José (colegas de

doutorado sanduíche, os quais pude conhecer um pouco mais e admirá-los), e demais

que pude conviver neste período, Karla, Eduardo, Tayanna, Íris, Isabele, Edilza, dentre

outros colegas que pude partilhar um pouquinho de momentos vividos na UFPB, e à

secretária do PPGCTA, Lindalva, sempre muito acessível a todos em ajudar no que

estiver ao seu alcance

Ao Departamento de Farmacologia e Biofísica da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, pela possibilidade em realizar alguns dos experimentos da tese. Aos

professores Aurigena Antunes, Raimundo Araújo pela colaboração na pesquisa e

ensinamentos. Aos colegas Artur, Cássio e Valéria, alunos de iniciação científica da

Graduação de Farmácia e Biomedicina, e hoje alguns como residentes, que além de

terem me apoiado na pesquisa, contribuíram para meu aprendizado na prática sobre

experimentação animal. E aos técnicos do laboratório de Farmacologia, Flávio, César

e Karla, pela prontidão em auxiliar nos experimentos e partilhar de seus conhecimentos

na prática laboratorial. Aos funcionários Ivonete e Raimundo, os quais também

apoiaram para a realização deste trabalho. E especial à Dona Neida por participar

ativamente na experimentação animal, pela agilidade e longa experiência com técnicas

de manuseio e eutanásia de animais de laboratório.

26

À Univerdidade Federal de Sergipe, pela possibilidade do afastamento dentro e

fora do país para as atividades do doutorado. Agradeço pela torcida e apoio dos

amigos professores Adriana, Carolina, Heloisa, que viraram uma segunda família em

Sergipe, partilhando os momentos felizes, agústias, e apoio nas decisões pessoais e

profissionais e aos demais colegas de trabalho.

Ao amigo e irmão de coração Fábio Resende (Professor da Faculdade de

Ciências da Saúde do Trairi-UFRN), pela amizade, companheirismo, ensinamentos, a

quem tenho muita admiração, pela história de vida e profissional que é. Obrigada por

estar sempre por perto.

As minhas amizades fora do ambiente acadêmico, Raiana, Rayanna e Iliana.

Nós que estamos diariamente (fisicamente ou não) na torcida uma pela outra. Que

possamos estar cada vez mais unidas mesmo que na distância. Agradeço pela amizade

sincera construída nestes últimos anos.

Agradeço a amizade de Anna Beatriz Luz, que em tão pouco tempo e ainda

distantes pudemos partilhar momentos recentes e especiais de nossas vidas.

E àqueles que não foram citados, mas que de alguma forma contribuiram para

minha formação como pessoa e profissional que sou, o meu muito obrigada!

27

RESUMO

A Doença Inflamatória Intestinal (DII), caracterizada por apresentar uma inflamação

crônica não controlada na mucosa intestinal, engloba, principalmente, duas patologias: a

Colite Ulcerativa e a Doença de Crohn. Nestas, o sistema imunológico local permanece

cronicamente ativado e o intestino intensamente inflamado, devido a uma incapacidade

do organismo para a diminuição das respostas inflamatórias. Terapias alternativas e

complementares tem sido de grande interesse para o tratamento das DII, com o objetivo

de melhorar os efeitos secundários dos fármacos comumente utilizados. O soro de leite

caprino apresenta na sua composição oligossacarídeos e ácido linoleico conjugado com

propriedades funcionais, mas ainda insipiente como efeito na modulação intestinal. A

presente tese foi dividida em dois estudos: no primeiro, foi avaliada a capacidade do

soro de leite de cabra em prevenir a inflamação intestinal no modelo de inflamação

induzida por ácido acético em ratos, comparando com um fármaco padrão, a

sulfassalazina utilizada no tratamento da DII; no segundo, foi estudado o efeito anti-

inflamatório do soro de leite no modelo de colite induzido por ácido 2,4-dinitrobenzeno

sulfônico em camundongos. O pré-tratamento com soro de leite caprino (1, 2 e 4 g. Kg-

1) e sulfassalazina (250 mg. Kg

-1) melhorou os marcadores inflamatórios

(mieloperoxidase, leucotrieno B4 e citocinas pró-inflamatórias) e de estresse oxidativo

(conteúdo total de glutationa e malondialdeido) no tecido colônico dos animais. A

avaliação histológica e imunohistoquímica do tecido colônico revelaram,

respectivamente, uma preservação da citoarquitetura e redução na expressão de COX-2,

iNOS e MMP-9, em conjunto com um aumento da expressão de SOCs-1. Os resultados

sugerem que o soro caprino exerceu um efeito preventivo contra o dano intestinal

induzida por ácido acético, mostrando uma eficácia semelhante à mostrada por

sulfassalazina, sendo, portanto, um potencial tratamento para a doença inflamatória

intestinal humana. No segundo modelo, com diferente agente indutor da DII, utilizou-se

a dose de soro de leite caprino que mostrou melhor resultado na melhora da inflamação

do estudo anterior. Neste estudo, também houve uma melhora do dano intestinal no

grupo dos animais, confirmado pela avaliação do processo inflamatório colônico, e

expressão gênica do cólon dos marcadores pró-inflamatórios IL-6, IL-1β, IL-17, TNF-α,

iNOS, ICAM- 1, MMP-9, reguladores da integridade intestinal epitelial (MUC-2 e

MUC-3, ocludina e ZO-1) e supressor de sinalização de citocinas (SOCS-1). As

propriedades anti-inflamatórias do soro foram evidenciadas no estudo in vitro em

células Raw 264 de macrófagos de murinos e CMT-93 derivada de células de carcinoma

retal de murinos, em que promoveu uma redução significativa da produção de óxido

nítrico e IL-6. Dessa forma, o soro de leite caprino, mostra-se como um produto

inovador na prevenção e controle inflamação intestinal em modelos murinos.

Palavras-chave: inflamação intestinal; soro de leite caprino; marcadores inflamatórios;

estresse oxidativo, resposta celular.

28

ABSTRACT

Inflammatory Bowel Disease (IBD) is characterized as an uncontrolled chronic

inflammation of the intestinal mucosa and mainly includes two pathologies: Crohn's

disease and ulcerative colitis. Accordingly, the local immune system remains

compromised and the intestine intensely inflamed, due to an inability of decreasing

inflammatory responses. Complementary and alternative medicines have been of great

interest for the treatment of IBD, with the aim to improve the side effects of commonly

used drugs. Goat whey present oligosaccharides and conjugated linoleic acid with

different functional properties, but also an effect on intestinal incipient modulation. This

thesis was divided into two studies: the first being goat whey ability in preventing

intestinal inflammation in an inflammation model induced by acetic acid in rats,

evaluated by comparing it with a standard sulfasalazine medicine used in the treatment

of DII; in the second study, the anti-inflammatory effect of the whey colitis model

induced by 2,4-dinitrobenzenesulfonic acid in mice. In the first, the pre-treatment with

goat whey (1, 2 and 4 g. Kg-1

) and sulfasalazine (250 mg. Kg-1

) improved the

inflammatory markers (myeloperoxidase, leukotriene B4 and pro-inflammatory

cytokines) and oxidative stress (total content of glutathione and malondialdehyde) in

colonic tissue of rats. Histological and immunohistochemical evaluation of colonic

tissue showed cytoarchitecture preservation and reduction in COX-2 expression,

respectively, as well as iNOS and MMP-9 in conjunction with an increase in SOCs-1

expression. The results suggest that goat whey exerted a preventive effect against

intestinal damage induced by acetic acid, showing similar efficacy to sulfasalazine, and

thus is a potential treatment for human inflammatory bowel disease. In the second

model, we used the best dose of the first to conduct different analyses. In the second

model with a different inducing agent of IBD was used to dose goat whey that Showed

better results in improving of intestinal inflammation the previous study. This study,

there was also an improvement of intestinal damage in the group of animals, confirmed

by evaluating colonic inflammation and colonic gene expression of pro-inflammatory

markers IL-6, IL-1β, IL-17,TNF-α, iNOS, ICAM- 1, MMP-9, regulators of intestinal

epithelial integrity (MUC-2, MUC-3, occludin and ZO-1) and supressor of cytokine

signaling (SOCS-1). The anti-inflammatory properties of the goat whey were

demonstrated by an in vitro study on murine macrofhages line Raw 264 and CMT-93

cells derived from murine rectum carcinoma which promoted a significant reduction in

nitric oxide production and IL-6. Thus, goat whey shown as an innovative product in

the prevention and control of intestinal inflammation in murine models.

Keywords: intestinal inflammation; goat whey; inflammatory markers; oxidative stress,

cellular response.

29

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Vias de interação entre microbiota e células do sistema imune nas

DII 24

Figura 2 - Representação esquemática das ações do óxido nítrico (NO)

indicando os efeitos fisiológicos e patológicos das isoformas de

óxido nítrico sintase constitutiva (c) e induzida (i) 27

Figura 3 - Componentes bioativos do leite de cabra e ação na Doença

Inflamatória Intestinal 41

Figura 4 - Funcionalidade fisiológica de alimentos – peptídeos bioativos 43

Figura 5 - Fluxograma do desenho experimental referente a obtenção e

utilização do soro de leite caprino 48

Figura 6 - Desenho experimental: colite induzida por ácido acético 10% 50

Figura 7 - Esquema da determinação do conteúdo de glutationa total 53

Figura 8 - Desenho experimental: colite induzida por 2,4-dinitrobenzenos

sulfônico (DNBS) 58

Figura 9 - Equipamento utilizado da Reação de Cadeia Polimerase 60

ARTIGO 1

Figure 1 - Effect of treatments of goat whey (GW) and sulfasalazine (SAZ)

on evolution of weight (A), disease activity index (DAI; B),

macroscopic damage score (C), and weight/ length ratio (D) in the

intestinal inflammation of acetic acid induced in rats. Data (n =

10) are presented as means ± SEM. Groups with different letters

(a–d) statistically differ (P < 0.05). 116

Figure 2 - Histopathologic features of representative colonic tissue of rats,

showing the colon fragment cut in the longitudinal direction.

Normal intestinal layers (A). Intense (B) or moderate (D)

inflammation in the (a) mucosa and (b) submucosa with infiltrate

of neutrophils; (c) reduced inflammatory infiltrate, or integrated

epithelial cells with slight goblet cell loss, fewer cells infiltrate

and fibrous connective tissue hyperplasia in colonic mucous

membrane were usually found (C, E, and F; ×100). SAZ =

sulfasalazine; GW = goat whey; A = noncolitic (1–1); B = acid

acetic control (6–7); C = sulfasalazine (2–2); D = 1 g/kg of GW

(4–5); E = 2 g/kg of GW (3–4); F = 4 g/kg of GW (2–3). Data (n

30

= 10) are expressed as means ± SEM. Groups with different

letters (a–e) statistically differ (P < 0.05). 117

Figure 3 - Effect of the goat whey (GW) and sulfasalazine (SAZ) in the

myeloperoxidase (MPO) activity (A), leukotriene B4 (LTB4; B),

glutathione content (C), and malonaldehyde (MDA; D) levels in

the intestinal inflammation of the experimental model of colitis in

acid-induced rats. Data (n = 10) are expressed as means ± SEM.

Groups with different letters (a,b) differ statistically. 118

Figure 4 - Effect of different doses of goat whey (GW) and sulfasalazine

(SAZ) in IL-1β and tumor necrosis factor (TNF)-α levels in the

intestinal inflammation of the experimental model of colitis in

acid-induced rats. Data (n = 10) are expressed as means ± SEM;

groups with different letters (a,b) differ statistically (P < 0.05). 119

Figure 5 - Immunohistochemical analysis of the colonic tissue in the acetic

acid-induced colitis rats. Immunoexpression for cyclooxygenase

(COX)-2 (A), inducible nitric oxide synthase (iNOS; B), cytokine

signaling-1 suppressor (SOCS-1; C), and matrix

metalloproteinase (MMP)-9 (D). For each antigen, 3

immunostained sections were examined per animal (n = 5). 40×

magnification, scale bar = 100 μm; 1: noncolitic; 2: acetic acid

control; 3: sulfasalazine (SAZ); 4: goat whey (GW). 120

ARTIGO 2

Figure 1 - Effect of goat whey on the experimental model of colitis induced

by 2,4-dinitrobenzene sulfonic acid (DNBS). (A) Monitoring of

body weight; (B) Disease Activity Index (DAI); (C) Food

Consumption; (D) Weight / Length ratio of the colon; and (E)

colonic segment of the experimental groups. Data are expressed

as mean ± SEM. Groups with different letters differ significantly

(p

31

colitis in mice, measured by RT-PCR. Data are expressed as mean

± SEM (n = 12). Groups with different letters are statistically

different (P < 0.05). 154

Figure 4 - Effects of goat whey in the 2,4 – dinitrobenzenesulfonic acid

(DNBS) mouse colitis. Histological sections of colonic mucosa

stained with hematoxylin and eosin (x100): (A) Healthy, (B)

DNBS control, (C) Goat Whey. (D) Microscopic score assigned

to the different groups according to the criteria described by Zea-

Iriarte et al. (1996); data are expressed as means ± SEM (n=12);

groups with different letter statistically differ (P

32

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Composição química de leite/soro de diferentes animais 45

Tabela 2 - Índice de Atividade da Doença (IAD) 52

Tabela 3 - Critério para avaliação do dano macroscópico 52

Tabela 4 - Critérios para avaliação do dano microscópico do tecido colônico

e grau de infiltração leucocitária 56

Tabela 5 - Avaliação dos marcadores por imunocoloração 57

Tabela 6 - Sequência de primers usados nas análises de PCR em tempo real

do tecido colônico, modelo de colite experimental induzida por

DNBS 61

ARTIGO 2

Table 1 - Primer sequences used in real-time qPCR assays, in the model of

experimental colitis induced by DNBS. 150

Table 2 - Composition of Goat Whey (GW). 151

33

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AA

AINE

Ácido acético

Anti-inflamatório não esteroidal

Anti-TNF-α Anticorpo monoclonal para a citocina TNF-α

CD

CEUA

Doença de Crohn

Comitê de Ética no Uso Animal

CLA

CMT

COX

Ácido Linoleico Conjugado

Células de Carcinoma Retal de Murinos

Ciclooxigenase

DII Doença inflamatória intestinal

DNA Ácido Desoxirribonucleico

DNBS Ácido 2,4- dinitrobenzeno sulfônico

DSS Sulfato de Sódio Dextrana

DTNB

ELISA

Ácido Ditiobisnitrobenzóico

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

ERN Espécies reativas de nitrogênio

ERO Espécies reativas de oxigénio

GAPDH

GMP

Glideraldeido 3-fosfato Desidrogenase

Guanosina Monofosfato Cíclica

GSH Glutationa Reduzida

HCl

HLA

HTAB

Ácido Clorídrico

Histocompatibilidade

Brometo de Hexadeciltrimetilamônio

IAD

ICAM-1

Índice de Atividade da Doença

Molécula de Adesão Intercelular-1

IL Interleucina

iNOS Sintase do óxido nítrico induzida

LPS Lipopolissacarídeo

LTB4 Leucotrieno B4

MDA Malondialdeído

MIP-2 Proteína Inflamatória de Macrófago-2

34

MMP Metaloproteinases de matriz

MPO Mieloperoxidase

MUC Mucina

NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato

NF-kB

NO

Factor Nuclear kappa B

Óxido Nítrico

NOD Nucleotide-binding-oligomerisation-domains

PAMP Padrão molecular fitogeneticamente conservado asssociadoao patógeno

(pathogen-associated molecular patterns)

PBS

PCR-RT

Tampão fosfato-salino

Reação de Cadeia Polimerase em Tempo Real

RAW

RNA

RPMI

Células de Macrófagos de Murinos

Ácido Ribonucléico

Roswell Park Memorial Institute Medium

SAZ Sulfassalazina

Ta Temperatura de Anelamento

TCA Ácido Tricloroacético

Th Célula T helper

TLR Receptores do tipo toll-like

TNBS 2,4,6- trinitrobenzeno sulfônico

TNF Fator de Necrose Tumoral

Tr Células T reguladoras

UC Colite ulcerativa

ZO-1 Zona de oclusão-1

35

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 18

2 REVISÃO DA LITERATURA 20

2.1 DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL 20

2.1.1 Etiopatogênese

2.1.1.1 Resposta Imune

2.1.1.1.1 Resposta Imune alterada

2.1.1.2 Estresse Oxidativo

2.1.1.3 Fatores Ambientais

2.1.1.4 Fatores Genéticos

2.1.2 Estratégias terapêuticas

2.1.2.1 Aminossalicilatos

2.1.2.2 Corticosteroides

2.1.2.3 Imunossupressores

2.1.2.4 Agentes biológicos

2.1.2.5 Tratamento complementar: evidências científicas

2.2 MODELOS EXPERIMENTAIS DE COLITE

2.2.1 Modelo de indução por Ácido Acético

2.2.2 Modelo de indução por DNBS e TNBS

2.2.3 Modelo de indução por DSS

2.3 LEITE E SORO CAPRINOS: ALIMENTOS COM POTENCIALIDADE

FUNCIONAL

2.3.1 Peptideos Bioativos

2.3.2 Ácido Linoleico Conjugado - CLA

2.3.3 Oligossacarídeos

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO SORO DE LEITE CAPRINO

3.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA INTESTINAL DO

SORO DE LEITE CAPRINO

3.2.1 Experimento in vivo 1: colite induzida por ácido acético

3.2.1.1 Avaliação do processo inflamatório intestinal

3.2.1.1.1 Indução da colite por ácido acético

21

21

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50

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51

36

3.2.1.1.2 Índice de Atividade da Doença

3.2.1.1.3 Avaliação do dano macroscópico intestinal

3.2.1.1.4 Conteúdo Total de Glutationa

3.2.1.1.5 Determinação de Malondialdeído

3.2.1.1.6 Determinação da atividade da enzima mieloperoxidase

3.2.1.1.7 Análise de citocinas e leucotrieno B4

3.2.1.1.8 Análise Histopatológica

3.2.1.1.9 Avaliação Imunohistoquímica: marcadores COX-2, iNOS, MMP-9 e

SOCS-1

3.2.2 Experimento 2: colite induzida pelo ácido 2,4 dinitrobenzeno sulfônico

(DNBS)

3.2.2.1 Avaliação do processo inflamatório intestinal

3.2.2.1.1 Indução da colite por DNBS

3.2.2.1.2 Indice de Atividade da Doença e Relação Peso/ Longitude

3.2.2.1.3 Explantes intestinais

3.2.2.1.4 Avaliação Histopatológica e Imunohistoquímica

3.2.2.1.5 Análise de expressão gênica

3.2.3 Experimento in vitro: resposta celular

3.2.3.1 Dosagem de Nitrito

3.2.3.2 Determinação de IL-6

3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA

REFERÊNCIAS

4 RESULTADOS

4.1 ARTIGO 1

4.2 ARTIGO 2

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS

ANEXO A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA NO USO ANIMAL

ANEXO B – CARTA DE ACEITE DA REVISTA JOURNAL OF DAIRY

SCIENCE

ANEXO C – CARTA DE SUBMISSÃO A REVISTA JOURNAL OF

FUNCTIONAL FOODS

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161

18

1 INTRODUÇÃO

A Doença Inflamatória Intestinal (DII) é uma condição inflamatória crônica que

acomete o trato digestório, caracterizada por períodos de exacerbações e remissões dos

sinais e sintomas, compreendendo principalmente a Doença de Crohn e a Colite

ulcerativa. A inflamação intestinal descontrolada pode levar a uma má qualidade de

vida e requer intervenções médicas e/ ou cirúrgicas.

Embora a etiologia ainda não esteja bem definida, a DII envolve um conjunto de

fatores ambientais, genéticos e imunológicos. A alta ingestão de fibra alimentar,

incluindo frutas e legumes, apresenta ação protetora contra as DII, por outro lado a

ingestão de alimentos ricos em ácidos graxos saturados tornam o organismo mais

suscetível à doença (KRISHNAN; KORZENIK, 2002; FROLKIS et al., 2013). Além de

uma dieta inadequada, fumo, microrganismos patogênicos, uso de anti-inflamatórios

não esteroidais dentre outros podem levar a perturbações da microbiota intestinal,

apresentando papel importante na patogênese da DII.

O processo inflamatório intestinal é inicialmente desencadeado pelo aumento da

permeabilidade da barreira epitelial para os antígenos luminais, conduzindo a uma

ativação inadequada do sistema imunitário da mucosa (DEDON; TANNENBAUM,

2004; HYUN; MAYER, 2006). Isso resulta em um aumento na ativação e influxo de

neutrófilos e macrófagos, com produção de vários mediadores pró-inflamatórios, como

espécies reativas de oxigênio (ERO) e nitrogênio (ERN), eicosanóides, citocinas,

quimiocinas (STROBER; FUSS, 2011; SHIN et al., 2015, SINGH et al., 2016) e

expressão de importantes moduladores da resposta inflamatória como a ciclooxigenase

2 (COX-2) e óxido nítrico sintase induzida (iNOS) (ARDIZZONE; PORRO, 2005;

SAKTHIVEL; GURUVAYOORAPPAN; 2013).

Embora o cuidado clínico tenha melhorado com inovações farmacológicas, tais

como aminossalicilatos, glicocorticóides, imunomoduladores e agentes biológicos

amplamente utilizados para tratar as DII, ainda há controvérsias sobre a manutenção da

remissão da doença e efeitos colaterais desses fármacos. A intervenção farmacológica

revela uma redução da zona inflamada, bem como dos marcadores de inflamação,

diminuindo os níveis de citocinas em pacientes com doença ativa e em estudos com

animais (STROBER; FUSS, 2011; SAKTHIVEL; GURUVAYOORAPPAN, 2013). Há

no entanto, a busca por outros medicamentos, bem como compostos alimentícios que

19

apresentem propriedades funcionais que possam reduzir a inflamação, contribuindo para

a melhoria do quadro do paciente portador colite.

Tem sido discutido o potencial de nutracêuticos, alimentos funcionais e

suplementos alimentares na minimização de problemas com a saúde, em especial

aqueles relacionados a alterações no trato gastrintestinal. A curcumina, ácidos graxos

ômega 3, glutamina, probióticos e outros nutracêuticos mostram-se promissores como

coadjuvantes ao tratamento das DII (O’SULLIVAN; NORD, 2002; GÁLVEZ;

COMALADA; XAUS, 2010; ANDERSEN et al., 2012). Além disso, alguns compostos

bioativos como peptídeos, ácido graxo linoleico e oligossacarídeos na matriz láctea

bovina e caprina tem sido de interesse pela comunidade científica (AHMED et al.,

2015; MARTINEZ-FÉREZ et al., 2006; THUM et al., 2015).

Com relação ao leite caprino, poucos estudos verificaram o efeito benéfico de

seus componentes bioativos na atividade anti-inflamatória intestinal, como mostrados

por Lara-Villoslada et al. (2006) e Daddaoua et al. (2006) e mais recentemente do nosso

grupo de estudo (ASSIS et al., 2016), no entanto, ainda não foi investigada a atividade

do soro de leite caprino ou de suas frações isoladas nas DII. O soro do leite caprino

constituiu um importante derivado lácteo, muitas vezes desprezado ou subutilizado, no

entanto, esta matriz alimentar vem ganhando espaço no mercado, justificando-se a

necessidade de investigações e aprofundamento sobre suas propriedades funcionais.

Dessa forma, o presente trabalho avaliou o potencial efeito anti-inflamatório do

soro de leite caprino na colite experimental e na resposta celular. Neste sentido, os

experimentos consistiram em verificar o efeito do soro de leite caprino no processo

inflamatório intestinal por meio da avaliação do dano macroscópico intestinal,

marcadores bioquímicos de inflamação (mieloperoxidase, citocinas e leucotrieno B4);

avaliar o efeito do soro nas alterações na citoarquitetura do cólon por meio de análises

histopatológicas; analisar o estresse oxidativo do tecido colônico por meio do conteúdo

total de glutationa e malondialdeido; e além disso, esclarecer mecanismos relacionados

à atividade anti-inflamatória do soro utilizando células Raw 264 e CMT-93.

20

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL (DII)

A DII é complexa, sendo representada principalmente pela Doença de Crohn

(Crohn Disease, CD) e retocolite ulcerativa inespecífica ou apenas colite ulcerativa

(Ulcerative colitis, UC). Inclui, inflamações não infecciosas do intestino, necessitando

ainda de investigações pelos gastroenterologistas e imunologistas (STROBER; FUSS;

MANNON, 2007; PODOLSKY, 2002).

Uma alta prevalência da DII tem sido constatada nas populações da América do

Norte e Europa, com incidência mais acentuada na segunda metade do século XX,

devido ao maior desenvolvimento industrial e urbanização constante. Além disso, as

populações anteriormente consideradas de "baixo risco" (como no Japão e Índia) estão

vivenciando um aumento na incidência (ANANTHAKRISHNAN, 2015). No Brasil, a

escassez de estudos e divulgação em meios científicos sobre as DII contribui para o

atraso no diagnóstico e aumento da morbidade (OLIVEIRA; EMERICK; SOARES,

2010).

As DII são caracterizadas por inflamação intestinal crônica e recidivante, com

produção anormal de citocinas, aumento da expressão de moléculas de adesão e

infiltrado celular, levando a um dano da mucosa e apoptose celular (MANDALARI et

al., 2011). É crucial a determinação do grau de severidade ou atividade da ambas as

doenças, uma vez que a gravidade, duração e a localização da doença são importantes

na resposta ao tratamento (CARUSO, 2014).

DII é uma doença inflamatória crônica recidivante, caracterizada por aumento da

permeabilidade epitelial, edema, e infiltração de leucócitos do cólon. E embora grandes

avanços tenham sido conquistados no tratamento desta doença nas últimas décadas,

ainda não existe uma terapia definitiva, necessitando de mais esclarecimentos sobre os

mecanismos envolvidos na sua patogênese (SANDS, 2000; ANANTHAKRISHNAN,

2015).

A CD é uma doença inflamatória transmural, ou seja, que pode acometer todas

as camadas teciduais intestinais, afetando qualquer parte do trato gastrintestinal, desde a

boca até o reto, no entanto, a localização mais frequente é na região ileocecal. A

inflamação e ulceração é descontínua, sendo comum o espessamento da parede do

intestino, muitas vezes com granulomas (GÁLVEZ, COMALADA, XAUS, 2010).

21

Os pacientes com CD relatam sintomas gastrointestinais de dor abdominal,

diarreia e sangramento retal, bem como sintomas sistêmicos de perda de peso, febre e

fadiga. Além disso, podem desenvolver estenoses com obstrução intestinal e conexões

inflamatórias entre os segmentos do intestino ou entre o intestino e a pele e outros

órgãos (FUSS et al., 2004).

A UC é uma doença inflamatória não transmural que afeta o reto e se estende ao

cólon (proximal) com uma inflamação contínua da mucosa comprometendo parte do

intestino grosso (GRAMLICH; PETRAS, 2007). A sintomatologia da UC geralmente

inclui diarreia sanguinolenta, dor abdominal e eliminação de pus e/ou muco durante as

evacuações (WEYLANDT et al., 2007). Essa enfermidade pode ser classificada quanto

ao padrão de distribuição (proctite, pancolite extensa e colite distal), atividade

(remissão, leve, moderada e grave) e curso (assintomático após surto inicial, aumento da

intensidade com o tempo, sintomas crônicos contínuos ou reincidivantes) da doença

(MEIER; STURM, 2011).

2.1.1 Etiopatogênese

Embora a patogênese ainda não esteja totalmente esclaredia, há um consenso, de

que as DII são o resultado de alguns componentes básicos que apresentam grande

interação: fatores ambientais, variações genéticas no hospedeiro, fatores luminais

(relacionados a microbiota intestinal, seus antígenos e produtos metabólicos e os

antígenos alimentares), relacionados à barreira intestinal (incluindo os aspectos

referentes à imunidade inata e à permeabilidade intestinal), e à imunorregulação

(incluindo a imunidade adaptativa) (CARUSO, 2014; GALVEZ; COMALADA;

XAUS, 2010; MOLODECKY; KAPLAN, 2010; SANG et al, 2014;

ANANTHAKRISHNAN, 2015).

Os estudos em modelos murinos das duas formas de DII sugerem que são

causadas por uma desregulação da resposta imune da mucosa por antígenos na

microbiota (STROBER; FUSS; BLUMBERG, 2002).

2.1.1.1 Resposta Imune

O trato gastrintestinal humano é um sistema complexo e eficiente que tem papel

importante na digestão e absorção dos nutrientes e proteção do corpo contra a invasão

http://www.nature.com/nrgastro/journal/v12/n4/fig_tab/nrgastro.2015.34_F1.html#auth-1

22

bacteriana (ECKBURG et al., 2005). A homeostase intestinal envolve uma ação

coordenada entre células epiteliais e células da resposta imune inata e adaptativa.

Contudo, a patogênese da DII considera que existe uma interação disfuncional entre a

microbiota intestinal com a ativação do sistema imunológico da mucosa (STROBER;

FUSS; MANNON, 2007).

A imunidade inata apresenta como principal característica a capacidade de

distinguir um microrganismo do outro, sendo responsável pela proteção inicial contra as

infecções. O sistema imune inato possui estratégias para o reconhecimento de

microrganismos, uma das quais é o reconhecimento do padrão molecular

fitogeneticamente conservado, associado ao patógeno (pathogen-associated molecular

patterns – PAMP). O reconhecimento deste por meio da ativação de receptores do tipo

toll-like (TLR) acarreta a secreção de citocinas e o consequente início da resposta inata,

com recrutamento e ativação de neutrófilos e macrófagos, cujo fato é essencial para a

morte do patógeno (ROGERO; FOCK; BORELLI, 2013; PEARL et al., 2013).

Quando essa resposta inflamatória for insuficiente, não eliminando esses

produtos microbianos a imunidade adquirida será estimulada. A resposta imune

adaptativa é iniciada quando os antígenos são apresentados a célula CD4+, quando

ativadas podem ser diferenciadas em células T helper (Th), Th1 e Th2 (PALLONE;

MONTELEONE, 2001).

2.1.1.1.1 Resposta Imune alterada

Uma alteração existente na microbiota intestinal, quer no tipo ou número dos

organismos que compreendem a população, ou forma em que os mesmos confrontam o

sistema imune da mucosa, que resulta em uma perda de tolerância, uma vez que a

microbiota é capaz de induzir uma resposta do sistema imune normal a antígenos

microbianos em excesso (STROBER; FUSS; MANNON, 2007). De forma similar, uma

inflamação na barreira epitelial intestinal aumenta sua permeabilidade, levando também

à ativação inapropriada do sistema imune da mucosa em pacientes com DII (HYUN;

MAYER, 2006; LARA-VILLOSLADA et al., 2006).

Vários componentes do sistema imune da mucosa têm sido implicados na

patogênese da DII incluindo células epiteliais intestinais, macrófagos, monócitos,

células dendríticas e células natural killers (NK) (sistema imune inato), células T e B

23

(sistema imune adaptativo), bem como mediadores de inflamação (citocinas e

quimiocinas) (ROGERO; FOCK; BORELLI, 2013).

Na DII, os antígenos luminais ganham acesso ao tecido da mucosa subjacente

através de uma barreira permeável ou mesmo por uma susceptibilidade da mucosa.

Células da resposta imune inata e adaptativa expressam um perfil diferente e número de

receptores de reconhecimento de padrões moleculares. Ocorre um aumento da resposta

mediada por células T, sendo que as células ativas Th1, Th2 e Th17 predominam sobre

as células T reguladoras (Th3, Tr). Na CD, as células T imatura (Th0) diferenciam

preferencialmente em células Th1, que leva a uma produção aumentada de INF-γ e IL-

12, e na UC, estas células se diferenciam em Th2, produzindo IL-4, IL-5 e IL-13 e IL-

17 em maiores quantidades (STROBER; FUSS; MANNON, 2007; BAUMGART;

CARDING, 2007; FUSS et al, 2004), Figura 1.

Novos componentes e características do sistema imunológico celular foram

descobertos nas últimas décadas que revolucionaram a compreensão dos mecanismos

subjacentes ao desenvolvimento de DII, é o caso das células Th17. A Th17 produz IL-

17 e IL-23, potentes indutoras de inflamação que estimulam infiltração celular e a

produção de citocinas pró-inflamatórias (BAUMGART; CARDING, 2007; GÁLVEZ,

2014).

O desenvolvimento e a cronicidade das lesões, tanto na CD como na UC, podem

ser explicados pela cascata inflamatória, responsável pelo aumento das citocinas pró-

inflamatórias que está associada com o início e a progressão da doença (MÛZES et al.,

2012). O desequilíbrio entre as citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias que

ocorre na DII impede a resolução da inflamação e leva a perpetuação da doença

(NEURATH, 2014).

O papel das citocinas no sistema imunitário, no interior da mucosa do cólon, tem

sido extensivamente avaliado em estudos clínicos e experimentais, sendo estas

sintetizadas e segregadas por células de defesa que podem prolongar ou atenuar o

processo inflamatório. As DII são condições crônicas caracterizadas por super-

regulação de citocinas pró-inflamatórias e resposta imune descontrolada

(BERTEVELLO et al., 2005; SARTOR, 2006), e estão relacionadas a complicações

como estenose intestinal, sangramento retal, abcesso e formação de fístula, e o

desenvolvimento de colite associada neoplasias.

24

Figura 1 - Vias de interação entre microbiota e células do sistema imune nas DII

Fonte: Michielan & D’Incà (2015); Ordás et al. (2012), adaptada pelo autor.

Na DII, a inflamação do epitélio aumenta a permeabilidade da barreira intestinal,

que conduz à ativação do sistema imune da mucosa indevidamente, caracterizada

principalmente por exacerbações agudas associadas a um aumento do influxo de

neutrófilos e ao recrutamento de mediadores inflamatórios, incluindo metabolitos de

nitrogênio, ERO, como superóxido, radical hidroxila, peróxido de hidrogênio e ácido

hipocloroso, além de proteases, eicosanóides, citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias

(DEDON; TANNENBAUM, 2004; HYUN; MAYER, 2006; STROBER; FUSS, 2011;

BAUMGART; CARDING, 2007).

O infiltrado de neutrófilos na lâmina própria leva a um aumento da enzima

mieloperoxidase que é considerada um importante marcador bioquímico na inflamação

tecidual (FAURSCHOU; BORREGAARD, 2003). O papel patogênico desse infiltrado

pode contribuir para danos nos tecidos através da liberação de mediadores

inflamatórios, incluindo ERO e proteases, bem como citocinas pró-inflamatórias

(ARDIZZONE; PORRO, 2002).

25

As primeiras citocinas liberadas na resposta inflamatória pelo macrófagos

ativados incluem a IL-1β, IL-6 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), que ativam

fatores pró-inflamatórios de transcrição para produzir outras citocinas, e exercem um

papel fundamental na patogênese nos pacientes com DII e colite experimental (Strober

& Fuss, 2011).

A IL-1β é uma citocina pró-inflamatória que desempenha um papel central nas

respostas inflamatórias do intestino, provocando um aumento na permeabilidade

epitelial intestinal (AL-SADI; MA, 2007; AL-SADI et al., 2013). Existe um

desequilíbrio de IL-1β e o seu antagonista que ocorre naturalmente no tecido intestinal

de doentes com CD, sugerindo a falta de capacidade intrínseca para neutralizar o efeito

da citocina (O’NEILL; DINARELLO, 2000).

A IL-6 é melhor caracterizada como uma das citocinas pró-tumorogênicas e

juntamente como outros membros da sua família afetam a proliferação, sobrevivência,

diferenciação, migração celular etc. É ativada pela via de sinalização Janus

Kinase/Transdutores de Sinal e Ativadores de Transcrição 3 (JAK/STAT-3), sinais

importantes para o desenvolvimento de colite murina (TANIGUCHI; KARIN, 2014).

Uma inibição da IL-6 em pacientes com DII, não só pode reduzir a inflamação

intestinal, mas também o risco de desenvolvimento de câncer colorretal (WALDNER;

NEURATH, 2014). Alguns autores relatam que a carcinogênese pode estar relacionada

com a cronicidade da inflamação e um dano causado pela ativação prolongada das vias

de sinalização responsáveis pela renovação celular continuada. A severidade, o tempo e

a extensão das DII está relacionada ao maior risco para o surgimento de uma neoplasia

(MCDONALD et al., 2006; JESS et al., 2006).

Uma outra citocina é a IL-7, que está envolvida no desenvolvimento de

condições inflamatórias crônicas, incluindo a DII e doenças auto-imunes quando

produzida em excesso. Por outro lado, em baixas concentrações, a IL-17 desempenha

um papel chave na defesa do hospedeiro extracelular de bactérias e fungos contra

infecções (BERINGER; NOACK; MIOSSEC, 2016).

Na DII, o TNF-α induz hipervascularização e angiogênese, induz a produção de

outras citocinas pró-inflamatórias por macrófagos e células T, provoca alterações na

barreira intestinal e promove a morte celular de células epiteliais intestinais e células de

Paneth. O TNF-α também promove a destruição do tecido, aumentando a produção de

metaloproteinases de matriz (MMPs) pelos miofibroblastos e conduz a ativação do

factor nuclear-kB (NF-kB) (NEURATH, 2014). Este último é importante na regulação

26

da transcrição de outros mediadores pró-inflamatórios, e induz a expressão de diversos

genes envolvidos nos processos anti-apoptóticas e pro-metastáticos (SALAS et al, 2002,

NAUGLER; KARIN, 2008, AGARWAL et al, 2004).

Além da expressão de proteínas inflamatórias, ocorre um aumento da produção

das enzimas COX-2, lipoxigenase (LOX), iNOS (SAKTHIVEL;

GURUVAYOORAPPAN, 2013; JOBIN, 2008; ARDIZZONE; PORRO, 2005). A

COX-2 e a LOX participam do metabolismo do ácido araquidônico, gerando produtos

como prostaglandinas e tromboxanos, e leucotrienos, respectivamente. Estes

eicosanóides são importantes produtos de ativação de neutrófilos e macrófagos, com a

capacidade de recrutar e ativar uma gama de células efetoras (CROOKS; STOCKLEY,

1998; WHITTLE et al., 2008) com destaque para o leucotrieno B4 (LTB4), um potente

quimiotático que tem sido descrito como um mediador patogênico na inflamação

intestinal (GÁLVEZ et al., 2001).

A expressão da COX e iNOS são reguladas por NF-kappaB (NF-kB) e contra-

reguladas pelo supressor de NF-kB que pode atenuar a colite experimental em

camundongos (NEURATH et al., 1996). A enzima COX-2 apresenta baixa expressão

no epitélio intestinal normal, sendo induzida nas células apicais do epitélio inflamado

do íleo terminal e cólon, apresentando-se aumentada na DII, tanto na forma aguda

quanto na crônica (JIANG, 2006). A Figura 2, mostra que o NO é produzido a partir da

ação do óxido nítrico sintase (NOS) na presença do substrato L-arginina, e que a NOS

pode estar disponível nas isoformas constitutiva e induzida (MARLETTA, 1994).

A NOS constitutiva (cNOS) é regulada pela ação do cálcio e de ligação da

calmodulina e está presente no sistema nervoso como a NOS neuronal (nNOS) ou no

endotélio vascular como a óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). A cNOS produz

baixos níveis de NO, que ativa a guanilato ciclase solúvel e os resultados da produção

do segundo mensageiro Guanosina Monofosfato Cíclica (GMP) em locais em todo o

corpo, incluindo o trato da mucosa gastrointestinal (CROSS; WILSON, 2003; WILSON

et al., 1996). Por outro lado, a iNOS é induzida pelas citocinas TNF-α, IL-1, IFN-γ, e

por lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) em uma variedade de tipos de células. Na DII, a

iNOS é expressa em células epiteliais e nos macrófagos teciduais da mucosa inflamada

(DIJKSTRA et al., 2002).

A síntese de grandes quantidades de NO por iNOS foi demonstrada na

patogênese da colite, onde a sua expressão é aumentada nas áreas de inflamação e está

associada a parâmetros inflamatórios histológicos tais como ulcerações e depleção de

27

células caliciformes que constituem um componente importante do epitélio intestinal,

uma vez que são responsáveis pela produção de peptídeos cruciais para a defesa e

reparo do epitélio da mucosa intestinal (MASHIMO et al., 1996; KIMURA et al.,

1997). O NO é potencialmente tóxico, em grandes quantidades, estando presente,

particularmente, em situações de estresse oxidativo, na geração de intermediários do

oxigênio e na deficiência do sistema antioxidante; e pode apresentar ação potente sobre

a adesão de leucócitos e quimiotaxia (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003).

Figura 2 - Representação esquemática das ações do óxido nítrico (NO) indicando os

efeitos fisiológicos e patológicos das isoformas de óxido nítrico sintase constitutiva (c)

e induzida (i)

Fonte: Cross e Wilson (2003).

2.1.1.2 Estresse Oxidativo

O estresse oxidativo é definido como um desequilíbrio entre o excesso de

produção de radicais livres e o sistema de defesa antioxidante. Destacam-se ERO, como

o peróxido de hidrogênio, ânions superóxido e radicais hidroxilo e ERN, como

peroxinitrito e NO, além de outras substâncias potencialmente tóxicas. O excesso de

ERO e ERN pode ser verificado como um processo de intermediação de doenças como

inflamação, isquemia, trauma, doenças degenerativas e morte celular por ruptura da

membrana (lipoperoxidação) e inativação enzimática (KOURY; DONANGELO, 2003).

A produção de radicais livres ocorre como um processo contínuo e fisológico

nas funções biológicas do organismo. Em quantidades adequadas possibilita a geração

de energia, ativação de genes e na participação de mecanismos de defesa durante o

Pequenos níveis

de cNOS

(fisiológico)

Guanilato

ciclase

solúvel

Guanosina

monofosfato

cíclica

Altos níveis de

iNOS

(tóxico)

Respiração mitocontrial

Outra enzima FeS

Apoptose

Dano ao DNA

28

processo de infecção. Contudo, em quantidades elevadas pode levar a um dano

oxidativo (BARBOSA et al., 2010).

Na patogênese da DII, o estresse oxidativo também desempenha um papel

importante, podendo influenciar na inflamação intestinal através de mecanismos que

resultam na produção de citocinas pró-inflamatórias, ativação de macrófagos, alteração

da permeabilidade e da microbiota intestinal (BONAZ; BERNSTEIN, 2013; BAILEY

et al., 2011).

Os radicais livres são responsáveis pela peroxidação de lipídeos que é um

processo de reação em cadeia, iniciado geralmente por um radical hidroxila, o qual tem

a capacidade de retirar um átomo de hidrogênio da molécula de lipídeo. Este ataque

ocasiona a fragmentação de lipídeos poli-insaturados e gera produtos secundários, como

o malondialdeido (MDA), que reage com proteínas e fosfolipídeos, inclusive com o

Ácido Desoxirribonucleico (DNA), causando lise e morte celular (BARREIROS;

DAVID, 2006).

O excesso de radicais livres no organismo é combatido por sistemas de defesa

antioxidantes endógenos, com a participação das enzimas superóxido dismutase,

glutationa peroxidase e a catalase, capazes de neutralizar o estresse oxidativo na mucosa

intestinal e como papel importante no reparo do DNA (MANDALARI et al., 2011;

ROESSNER et al., 2008).

A enzima superóxido dismutase catalisa a dismutação do ânion radical

superóxido a peróxido de hidrogênio e oxigênio; a catalase atua na decomposição de

peróxido de hidrogênio, oxigênio e água; e a glutationa peroxidase, que atua sobre

peróxidos em geral, com utilização de glutationa como co-fator (VASCONCELOS et

al., 2007). Outros antioxidantes podem ser provenientes da dieta como o α-tocoferol, β-

caroteno, ácido ascórbico, e compostos fenólicos, em especial flavonoides

(HALLIWELL et al., 1995).

2.1.1.3 Fatores Ambientais

Os fatores ambientais são componentes essenciais na patogênese da DII e

principal responsável pela sua incidência crescente em todo o mundo. Evidências

epidemiológicas, clínicas e experimentais apoiam uma associação entre as DII e um

grande número de fatores ambientais aparentemente não relacionados, que incluem

tabagismo, dieta, medicamentos, situação geográfica e social, estresse, agentes

29

microbianos, permeabilidade intestinal e apendicectomia (DANESE; SANS; FIOCCHI,

2004; HO; BOYAPATI; SATSANG, 2015).

A relação entre o tabagismo e DII é um pouco intrigante. Estudos mostram que o

hábito de fumar é um fator de risco para o desenvolvimento de CD, ou complicações na

doença (formação de fístulas e estenoses). Os efeitos do tabagismo resultam na soma

dos efeitos contraditórios de várias substâncias, incluindo nicotina e monóxido de

carbono, além de serem modulados por: gênero, antecedentes genéticos, localização da

doença e atividade, dose e concentração de nicotina do cigarro (COSNES, 2004). O

aumento da concentração de monóxido de carbono pode amplificar o comprometimento

da capacidade de vasodilatação nos microvasos cronicamente inflamados, resultando em

isquemia e perpetuando em ulceração e fibrose (PULLAN, et al., 1994; HATOUM et

al., 2003).

Por outro lado, o tabagismo pode exercer um efeito protetor no aparecimento da

UC (CALABRESE et al., 2012). Esse efeito tem relação com os níveis de citocinas pró-

inflamatórias IL-1β, IL-8 e TNF-α no cólon, sendo significativamente menores em

fumantes, do que não-fumantes com colite (ALDHOUS et al., 2008; BAUMGART;

CARDING, 2007). Isso foi demostrado em estudos in vivo em modelos de colite

ulcerativa que revelaram que a nicotina tem um efeito inibitório sobre Th-2, mas não

exerce efeito inibitório em células Th-1 (COSNES, 2004).

Outro fator ambiental relacionado a patogênese da DII é a dieta que tem sido

amplamente estudada. Mas os resultados devem ser interpretados com cautela, pois os

pacientes podem mudar sua dieta antes do diagnóstico, para reduzir os sintomas da

doença. Estudos demonstraram que uma alta ingestão de fibra alimentar, incluindo

frutas e legumes, protege contra DII. O mecanismo pelo qual as frutas e legumes pode

conferir proteção está relacionado com a sua capacidade de modificar enzimas

envolvidas na remoção de ERO (AMRE et al., 2007).

Por outro lado, o consumo de carne vermelha e processada, álcool e baixo teor

de fibra dietética estão associados com um aumento da probabilidade de recidivas

(FROLKIS et al., 2013; SPOOREN et al., 2013; HO; BOYAPATI; SATSANG, 2015).

Isso se deve ao fato das gorduras saturadas desempenharem um papel na resposta

inflamatória através da modulação dos TLR em macrófagos (LEE et al., 2004). O

elevado consumo de ácidos graxos poli-insaturados ômega-6 e um baixo consumo de

ômega-3 (ou uma elevada relação n-6: n-3) tem sido associado com um aumento do

risco tanto da colite ulcerativa como da doença de Crohn (COSTEA et al., 2014).

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1568997204000400http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1568997204000400http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1568997204000400

30

Estudos tem mostrado a relação epidemiológica de causa-efeito entre o uso de

anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) e DII. Santos et al., (2006) mostraram que

além de efeitos adversos no trato gastrintestinal superior, o uso contínuo de AINEs

pode provocar lesões no intestino delgado e cólon. Em modelos animais de colite

espontânea usando camundongos deficiente de IL-10, a administração de AINEs não

seletivos demostrou uma rápida e severa inflamação colônica associada ao bloqueio da

proteção de protaglandinas E2 e alteração imune da mucosa (BERG et al., 2002).

2.1.1.4 Fatores Genéticos

Em 2001, foi descoberto o primeiro gene de susceptibilidade para a CD, o

domínio de oligomerização de ligação de nucleotídeos (NOD2), localizado no

cromossomo 16q12 (OGURA et al., 2001; HUGOT et al., 2001). Atualmente mais de

160 locus genéticos foram associados com a susceptibilidade da DII (JOSTINS et al.,

2012).

Em estudos genéticos de coorte em pacientes com CD, foram identificadas

mutações no gene de Domínio do Recrutamento e Ativação de Caspase (CARD15), que

codifica NOD2, sendo responsável por 10-15% da prevalência da doença (SARTOR,

2006; MOLODECKY; KAPLAN, 2010). Um modelo murino de mutação do gene

CARD15 mostrou perda de sua função e produção excessiva de citocinas pró-

inflamatórias em resposta a sinalização mediada pelo TLR em macrófagos deficientes

de CARD15 (STROBER et al., 2006).

Embora os camundongos deficientes em NOD2 sejam mais susceptíveis à

infecção por agentes patégenos bacterianos específicos, ainda não se sabe até que ponto

a deficiência de NOD2 pode alterar a resposta imune do hospedeiro para destruir

bactérias comensais (DESHMUKH et al., 2009).

Outros genes também são conhecidos que estão envolvidos na regulação da

imunidade inata (genes de Histocompatibilidade - HLA, genes NOD, genes de

interleucina), gene associado à produção alterada de adipocinas (ATG16L1), aqueles

envolvidos nas funções epiteliais (genes de mucina), dentre outros (OGURA et al.,

2001).

O receptor de IL-23 (IL23R) também desempenha um papel importante na

resposta aos agentes patógenos e mutações de IL23R associado com o aumento do risco

de DII. Os níveis elevados de IL-23 foram encontrados na barreira da mucosa epitelial

31

de portadores dessa doença, indicando ainda o papel da IL-23 na resposta inflamatória

crônica a bactérias luminais (RIOL-BLANCO et al., 2010).

Mais de 50% dos locus genéticos de susceptibilidade da DII também estão

associados a outras doenças auto-imunes e inflamatórias. Estes genes sobrepostos

podem ter efeitos contrastantes em diferentes doenças (KHOR; GARDET; XAVIER,

2011). A exemplo das variantes genéticas MST1, IL2, CARD9 e REL que são

compartilhados entre UC e a colangite esclerosante primária, uma inflamação das vias

biliares; e o NOD2, C13orf31 e LRRK2, compartilhado com o Mycobacterium leprae e

a CD (ZHANG et al., 2009; JANSE et al., 2111).

Os sintomas articulares constituem a manifestação extra-intestinal mais comum

em pacientes com UC e DC. Polimorfismos do gene CARD15 já foram associados a um

risco maior de se desenvolver DC e são considerados preditores tanto de doença

inflamatória intestinal crônica em pacientes com espondiloartrites quanto de sacroiliíte

em acometidos por DC (LANNA et al., 2006).

2.1.2 Estratégias terapêuticas

Os principais objetivos para o tratamento da DII são promover a remissão dos

sintomas da fase aguda, manter a remissão por controle da inflamação crônica, para

impedir a reativação do processo inflamatório intestinal, diminuir as complicações

associadas ao tratamento e à doença, e melhorar a qualidade de vida dos pacientes

(CHINYU; GARY, 2004).

A regulação da alteração da resposta imune é essencial para a melhora dos

pacientes com DII, sendo atualmente o principal objetivo da terapia farmacológica, que

inclui aminosalicilatos, corticoides, imunomoduladores, anticorpos monoclonais para a

citocina TNF-α (anti-TNF-α) utilizados para reduzir os sintomas da doença e manter sua

remissão (BERNSTEIN, 2015; KOZUCH; HANAUER, 2008; NG; KAMM, 2009).

Essas terapêuticas são relacionadas pelas diretrizes de prática clínica para o tratamento

médico de não hospitalizada UC, chamado de The Toronto Consensus (BERNSTEIN,

2015).

32

2.1.2.1 Aminossalicilatos

Os aminossalicilatos medicamentos que contêm na sua molécula de ácido 5-

aminossalicílico (5-ASA ou mesalazina), que contém propriedades terapêuticas. Seu

mecanismo de ação não é plenamente estabelecido, embora seja conhecido por estar

envolvido na inibição da síntese de produtos do ácido araquidônico, inibição da

quimiotaxia sobre os macrófagos intestinais e recrutamento leucócitos (ACOSTA,

2016). Além de reduzirem a secreção de anticorpos pelas células mononucleares,

diminuírem a secreção de citocinas pró-inflamatórias, e inibirem o fator NF-κB ou

devido a uma ação antioxidante (WHITTLE; VARGA, 2010).

Meta-análises têm mostrado a eficácia da administração de 5-aminossalicilato

via retal como terapia de indução em pacientes com ligeira a moderada proctite ulcerosa

ativa ou da colite instalada mais ao lado esquerdo do cólon (BRESSLER et al., 2015).

A maioria dos efeitos adversos do fármaco tem sido relacionada a intolerância

gástrico, alergias de pele, anemia hemolítica, hepatite, pancreatite e oligospermia,

embora tenha sido demonstrado que tratamento com sulfassalazina é eficaz em induzir a

remissão de surtos de UC leve a moderada (ACOSTA, 2016).

2.1.2.2 Corticosteroides

Os corticoides são a segunda opção após falha dos aminossalicilatos, mas estes

também estão associados com uma incidência relativamente alta de efeitos adversos

(GISBERT et al., 2002; GONZALEZ-LAMA et al., 2012).

Os corticosteróides "clássicos" ou "convencional" (prednisona, prednisolona,

metilprednisolona) que foram e continuam sendo usados no tratamento de escolha para

surtos graves, apresentam limitações importantes como o desenvolvimento da doença

metabólica dos ossos e das complicações infecciosas, devendo usar uma dose mais

eficaz por um menor tempo possível, e associar uma suplementação com o cálcio e

vitamina D durante o tratamento (ACOSTA, 2016).

Com base na experiência clínica e várias definições utilizadas em ensaios

clínicos de UC, o termo "resistência a corticosteróide" é definido como a falta de uma

resposta sintomática mesmo após um ciclo de prednisona oral de 40 a 60 mg/ dia (ou

equivalente) por pelo menos 14 dias. Por outro lado, o termo "Dependência de

corticosteróides" foi definida como a incapacidade de retirar (dentro de 3 meses do

33

início) a corticoterapia oral sem recorrência dos sintomas (TURNER et al., 2007;

BRESSLER et al., 2015).

2.1.2.3 Imunossupressores

Os medicamentos imunossupressores são utilizados no tratamento das DII, por

serem eficazes em induzir a remissão da doença, contudo sem benefícios para mantê-la,

e portanto, não devem ser mantidos por um longo prazo (CARBONNEL et al., 2016).

A ciclosporina, um fármaco de resgate para doentes refratários a esteroides e

com colite severa (HANAUER, 2008). Já foi demonstrada ser benéfica em crises

graves, apesar de efeitos colaterais, incluindo hipertensão, nefrotoxicidade e

desequilíbrio eletrolítico estarem frequentemente associados ao seu uso (MOCCIARO

et al., 2012).

2.1.2.4 Agentes biológicos

Técnicas de investigação estão em avanço constante, conduzindo

progressivamente a uma maior compreensão dos principais processos fisiopatológicos

subjacentes a estas doenças, permitindo por sua vez o desenvolvimento de terapias

novas e poderosas (STROBER; FUSS; MANNON, 2007).

Um grande avanço na terapia das DII foi a introdução do tratamento com

anticorpos monoclonais de TNF-α (anti-TNF) como o infliximabe, o adalimumabe e o

certolizumabe. A terapia com esses agentes biológicos é usada em casos

moderados/severos que não apresentam resposta aos tratamentos anteriores

(ARDIZZONE; PORRO, 2005; NGO et al., 2010; TARGAN, 2006). Contudo não

mostraram eficácia em todos os pacientes, sendo sua utilização limitada por baixas taxas

de remissão ao longo prazo e por um risco de infecções graves, incluindo infecções

oportunistas (NYBOE et al., 2015).

Além disso, os bloqueadores de citocinas (por exemplo, tocilizumabe e

ustekinumabe, que tem como alvo a interleucina IL-6 e a subunidade p40 da IL-12 e IL-

23, respectivamente); e os inibidores de JAK e de sinalização STAT (por exemplo, o

inibidor de sinalização JAK3 e JAK1, tofacitinibe, que bloqueia a sinalização de IL-2,

IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21) apresentaram resultados promissores em ensaios

clínicos (NEURATH, 2014).

34

No entanto, apesar destes fármacos demonstrarem eficácia clínica, existe uma

proporção importante de efeitos secundários que podem limitar a sua utilização a longo

prazo (SIEGEL, 2011), como o aumento do risco de infecção, as reações do lupus e a

formação de anticorpos antinucleares (WALSH; MABEE; TRIVEDI, 2011).

Neste contexto, novas terapias para a DII que combinam eficácia e segurança

são necessárias. Entre estas, as intervenções dietéticas com nutracêuticos e/ ou

alimentos funcionais parecem representar uma alternativa segura para modular a

resposta imune alterada da mucosa que ocorre na inflamação intestinal, sendo

conseguida principalmente através do seu impacto sobre a microbiota intestinal, como

foi relatado por prebióticos (ROBERFROID et al., 2010).

2.1.2.5 Tratamento complementar: evidências científicas

Condições patológicas crônicas, como inflamações intestinais e câncer

geralmente exigem tratamentos longos ou estão associados com períodos alternados de

remissão e recidiva. Atualmente, tem sido apresentada a associação das terapias

tradicionais com probióticos, melhorando significativamente o quadro clínico da colite

ulcerativa em humanos (HEGAZY; EL-BEDEWY, 2010; LEBLANC; LEBLANC,

2016) e em ensaios animais (FITZPATRICK et al., 2008; HERIAS et al., 2005;

PHILIPPE et al., 2011). O consumo de probióticos no leite e leite fermentado forneceu

proteção contra a perda de peso e inflamação intestinal em um modelo murino de colite

induzido por DSS como relatado por Lee et al. (2015).

O uso de probióticos contra a DII é baseado em evidências convincentes

implicando as bactérias intestinais na patogênese destas doenças. Os probióticos são

"organismos vivos" que, quando ingerido em determinadas quantidades, têm um efeito

benéfico, pois estimulam a síntese e secreção de fatores de proteção, como as mucinas

(componentes do muco luminal), defensinas, Imunoglobulina A, proteínas do choque

térmico, dentre outras, e ainda induzem a manutenção da barreira epitelial por

influenciar o aumento das junções oclusivas (O'FLAHERTY et al., 2010; THOMAS;

VERSALOVIC, 2010; YAN; POLK, 2010). Os probióticos também tem função

imunoestimulante através da produção de citocinas anti-inflamatórias, aumentando a

função de barreia intestinal pela secreção de antioxidantes e compostos

anticancerígenos, e suprimindo a inflamação (CHONG, 2014; SIVAN et al., 2015).

35

Entre as investigações sobre o efeito anti-inflamatório de plantas, a curcumina

(Curcuma longa, o componente ativo do açafrão) levou a remissão da doença em seres

humanos, sendo a terapêutica mais promissora até agora (BALIGA et al., 2014). Além

disso, apresenta ações farmacológicas, incluindo efeitos anti-inflamatórios,

antioxidante, antitumoral, e como alternativa no tratamento das DII, podendo ser

utilizada como uma terapia adjunta para indivíduos que procuram uma combinação à

medicina convencional (JURENKA, 2009; TAYLOR, LEONARD, 2011). Em estudos

animais com colite, a curcumina regulou negativamente a expressão de genes

inflamatórios (JIANG, 2006).

Dados recentes sugerem que a vitamina D ou seu receptor pode ter um papel

na patogênese e no curso da DII. Em ratos, a deficiência de 1,25-di-hidroxi vitamina D3

(1,25 (OH) 2D3) está associada com um risco aumentado de desenvolvimento de colite.

Sua administração melhorou a inflamação e suprimiu a expressão de genes pró-

inflamatórios, incluindo TNF-α (FROICU; CANTONA, 2007; FROICU; ZHU;

CANTONA, 2006).

Além disso, glutamina (VICARIO et al., 2007), histidina (ANDOU et al., 2009),

taurina (ZHAO et al., 2007), e curcumina (UNG et al., 2009) foram relatados ter efeitos

anti-inflamatórios em modelos experimentais de DII. Esses resultados mostram que

dietética podem ser uma alternativaa de melhorar a inflamação intestinal.

2.2 MODELOS EXPERIMENTAIS DE COLITE

Com intuito de compreender os mecanismos envolvidos na patogênese das DII,

vários modelos animais foram desenvolvidos nas últimas décadas, como o de indução

química por 2,4-dinitrobezeno sulfônico (DNBS), 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico

(TNBS), ácido acético, oxazolona, sulfato de sódio dextrana (DSS), etc. Embora esses

modelos não representem na totalidade a complexidade da doença que acomete o

homem, são importantes para análise de muitos aspectos importantes das DII que são

difíceis de serem estudados em humanos.

Embora os fatores etiológicos envolvidos na perpetuação da DII permanecem

incertos, o desenvolvimento de vários modelos de indução da colite em animais fornece

novas estratégias para desvendar o aparecimento e a progressão da DII (RANDHAWA

et al., 2014).

36

Os modelos animais são considerados ferramentas valiosas e indispensáveis que

fornecem uma grande variedade de opções para investigar o envolvimento de vários

fatores na patogênese da doença, contribuindo para avaliar diferentes opções

terapêuticas e selecionar os tratamentos mais eficientess e seguros (PERSE; CERAR,

2012). No entanto, é importante considerar que não existe um modelo animal ideal que

reproduza completamente a DII humana, uma vez que não se pode mostrar em modelos

experimentais a etiologia completa dessa doença (GÁLVEZ; COMALADA; XAUS,

2010; DOTHEL et al., 2013).

Existem duas categorias principais de indução da colite, uma delas induzida por

agentes químicos, mais comumente utilizados, e que reproduzem vários aspectos

imunológicos e histopatológicos das DII em humanos, e existem também modelos

animais em que as DII desenvolvem-se espontaneamente. Nestes modelos, as mutações

genéticas relacionadas aos componentes do sistema imune causam processos

inflamatórios intestinais de diversos tipos e, nestes casos, a sintomatologia inflamatória

geralmente se intensifica progressivamente (GÁLVEZ, COMALADA, XAUS, 2010).

A deleção de genes responsáveis pela transcrição de algumas citocinas também

pode favorecer o desenvolvimento de colite espontânea em animais. Dentre estes

modelos se destacam os que utilizam camundongos knockout (modificados

geneticamente) para as citocinas IL-10 e IL-2. Neste caso, os animais desenvolvem

colite espontânea, devido à desregulação da interação entre as células do sistema imune

e a microbiota entérica (BERG et al., 2002; BOONE et al., 2002). As mutações

genéticas relacionadas aos componentes do sistema imune causam processos

inflamatórios intestinais de diversos tipos e, nestes casos, a sintomatologia inflamatória

geralmente se intensifica progressivamente até a morte do animal (WIRTZ et al., 2007).

O aparecimento da inflamação intestinal nos modelos de indução por agentes

químicos, são considerados rápidos, o que torna sua utilização relativamente simples

(WIRTZ et al., 2007). A indução é realizada através da inserção de um cateter no colón

do animal (camundongos, ratos ou coelhos) para instilação de um determinado agente

químico. É o caso do ácido acético, do DNBS, do TNBS e da oxazolona. Outro agente

químico que pode induzir inflamação intestinal é o DSS, que é administrado por via

oral, diluído na água. Esses modelos podem imitar as características morfológicas,

histopatológicos e sintomáticas da DII humana (RANDHAWA et al., 2014). Tanto o

modelos de indução por DSS, como por TNBS estão bem estabelecidos em modelos

animais de inflamação da mucosa, sendo utilizados há mais de 2 décadas em estudos

37

pré-clínicos e de patogênese da DII (NEURATH; FUSS; STROBER, 2000; WIRTZ;

NEURATH, 2007).

2.2.1 Modelo de indução por Ácido Acético

Em 1978, MacPherson e Pfeiffer propuseram um modelo experimental de

indução pelo ácido acético a 10% via retal. Embora seja um modelo antigo, ainda hoje é

bastante estudado, principalmente na pesquisa de fármacos eficazes contra as DII (NOA

et al, 2000; GUERRA et al., 2015).

O ácido acético é usado exclusivamente para modelo agudo de colite e a sua

administração intracolônica provoca um processo inflamatório similar à UC, com

alterações endoscópicas e histopatológicas de fácil reprodutibilidade, no qual os

mediadores inflamatórios como ERO, aminas vasoativas e eicosanoides desempenham

um papel importante (CARTY et al., 2000).

A administração por via intracolônica de ácido acético em murinos provoca

lesões epiteliais do cólon com necrose e inflamação associada a infiltração de

neutrófilos e macrófagos no tecido colônico. A resposta inflamatória resultante desse

processo é devido à produção de ERO e ao produto de influxo do conteúdo luminal para

a lâmina própria, decorrente da destruição das células epiteliais (MILLAR et al., 1996).

Neste modelo de indução, Guerra et al (2015) verificaram um aumento da

lipoperoxidação e diminuição do conteúdo de glutationa total no homogeinado de

intestino grosso distal dos ratos quando comparados ao grupo controle negativo.

A perda da barreira que se situa entre as células imunológicas e o lúmen do

intestino provoca a injúria do tecido e, consequentemente, a ativação de uma cascata

inflamatória. Sendo assim, a utilização deste modelo animal também contribui para uma

melhor compreensão da colite humana com respeito às alterações imunológicas, já que,

além de reproduzir as lesões macroscópicas na mucosa colônica, também se mostra

satisfatório no padrão de citocinas expressas após a indução com o ácido acético

(BERTEVELLO et al., 2005).

2.2.2 Modelo de indução por DNBS e TNBS

Alguns modelos animais de DII mostram similaridade com CD humana, entre

esses, o modelos de inflamação colônica induzida por DNBS e TNBS em camudongos,

38

notavelmente pela predominância do NF-kB dependente da ativação de células Th1

(CANNARILE et al., 2009; NEURATH et al., 2002; STROBER; FUSS; BLUMBERG,

2002). Essas substâncias quando administradas por via retal promovem uma inflamação

crônica mediada por células Th1, simulando uma CD com um aumento da produção de

IL-12 por macrófagos que compõem a mucosa intestinal (TE VELDE; VERSTEGE;

HOMMES, 2006; BOUMA; STROBER, 2003; RANDHAWA et al., 2014).

Além disso, a colite induzida por DNBS e TNBS permite estudar a patogênese

da DII associada a fatores ambientais, tais como estresse e dieta, os efeitos de potenciais

terapias, e os mecanismos da inflamação intestinal subjacente e lesão da mucosa

(MORAMPUDI et al., 2014).

O DNBS, assim como o TNBS são haptenos administrados em combinação com

etanol (40-50%), para romper a barreira da mucosa intestinal e permitir a penetração do

ácido para o interior da parede do intestino. A resposta imune induzida por hapteno

provoca graves ulcerações da mucosa e da barreira epitelial caracterizada pela

infiltração de células mononucleares transmural (MORRIS et al., 1989).

No modelo de TNBS e DNBS, o tipo de resposta imunitária induzida por

hipersensibilidade retardada é uma reminiscência da célula mediada por resposta

inflamatória humana que ocorre na CD. No entanto, apenas uma dose única de TNBS

ou DNBS é utilizada na maioria dos estudos pré-clínicos (TE VELDE; VERSTEGE;

HOMMES, 2006).

O TNBS é metabolizado pelas enzimas do cólon produzindo uma reação

imunomediada por citocinas pró-inflamatórias e substâncias citotóxicas. Nesse modelo

a lesão pode ser aguda ou crônica dependendo da dose administrada (YAMADA et al.,

1993).

2.2.3 Modelo de indução por DSS

O processo inflamatório intestinal induzido por DSS tem sido amplamente

utilizado como modelo experimental de DII, devido a sua simplicidade de

administração, porém apresenta custo elevado. Polímeros dessa substância são

dissolvidos na água dos animais e dependendo da concentração, a duração e frequência

de administração DSS, os animais podem desenvolver colite aguda ou crônica ou

mesmo lesões displásicas (MARGOLIS; GERSHON, 2009).

39

O DSS provoca uma lesão mais semelhante a colite ulcerativa que é

morfologicamente e macroscopicamente caracterizada por hiperemia, ulceraçõoes,

moderado a severo edema na submucosa, acompanhada de lesão por mudanças

histopatológica com infiltrações de granulócitos (DHARMANI; LEUNG; CHADEE,

2011).

A colite aguda geralmente é induzida pela administração contínua de 2-5% DSS

por curto período (4-9 dias). Enquanto que a colite crônica pode ser induzida por um

tratamento contínuo de baixas concentrações de DSS ou administração cíclica do

mesmo, como por exemplo, 2 ciclos de tratamento DSS por 7 dias intercalados de 10

dias de água. As manifestações clínicas na fase crônica da colite geralmente não

refletem a gravidade da inflamação ou características histológicas encontradas no

intestino grosso (PERSE; CERAR, 2012).

As diferentes respostas parecem ser dependentes não só da concentração, peso

molecular, a duração da exposição, fabricante e lote do DSS, mas também dos fatores

genéticos (tensão e subestirpe, gênero) e microbiológicos (estado microbiológico e flora

intestinal). Além disso, o aparecimento e gravidade da colite podem variar com com o

estresse do animal (MELGAR et al., 2008).

O DSS é tóxico para as células epiteliais do cólon e provoca defeitos na

integridade da barreira epitelial. O mecanismo de como DSS passa através das células

epiteliais da mucosa permanece incerto. As primeiras mudanças relacionadas ao DSS

foram observados após um dia de tratamento com DSS, sendo a perda de um da zona de

oclusão-1 (ZO-1) e o aumento da expressão de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-

1, IFN-y, IL-10 e IL-12) no cólon (ICHIKAWA-TOMIKAWA et al., 2011; LAPRISE,

2011; PORITZ et al., 2007).

Outro modelo disponível, que provou ser particularmente útil na colite é a

indução por oxazolona, por administração intra-retal deste agente hapteno. Quando

administrados intra-retalmente oxazolona sem sensibilização prévia, vê-se um

desenvolvimento rápido da inflamação histologicamente, em que ele é marcado por uma

lesão superficial edematosa, que afeta a porção distal do cólon (BOIRIVANT et al.,

1998).

Embora nenhum modelo animal apresente todas as características patogênicas e

clínicas da DII humana, cada modelo animal contribui para compreender melhor os

mecanismos subjacentes de iniciação e perpetuação da inflamação intestinal (WIRTZ;

NEURATH, 2007).

40

2.3 LEITE E SORO CAPRINOS: ALIMENTOS COM POTENCIALIDADE

FUNCIONAL

Os alimentos funcionais são aqueles alimentos que se destinam a ser consumidos

como parte da dieta normal e que contêm componentes biologicamente ativos como

potencial na melhora da saúde ou redução do risco de doença. Exemplos de alimentos

funcionais incluem alimentos que contêm minerais específicos, vitaminas, ácidos graxos

ou fibra dietética, alimentos com adição de substâncias biologicamente ativas, tais como

fitoquímicos ou outros antioxidantes e probióticos que contêm culturas vivas.

O leite é um produto que possui naturalmente em sua composição proteínas de

alto valor biológico, lipídeos, lactose, hormônios, fatores de crescimento, nucleotídeos,

enzimas, oligossacarídeos e peptídeos bioativos que apresentam efeitos benéficos à

saúde (PEREIRA, 2014).

Estudos populacionais têm demonstrado que o consumo de leite e derivados

estão associados a um menor risco de desenvolvimento de síndrome metabólica,

hipertensão, doenças cardiovasculares e certos tipos de câncer, como o de cólon

(GOLDBOHM et al., 2011) e também à melhora da densidade óssea (FAO, 2013). O

leite de vaca apresenta destaque com produção mundial de 83%, e também com maior

consumo mundial 50 Kg/ per capta/ ano (FAOSTAT, 2012). No entanto, esta matriz

láctea não é indicada para infantes, uma vez que apresentam uma alta densidade

energética, proteínas alergênicas, e menor conteúdo de imunoglobulinas e lactoferritina

ideais para esta fase. O leite materno é o produto mais indicado, sendo indicado o

aleitamento exclusivo até os 6 meses de vida, sendo complementar até 1-2 anos

(BALLARD; MORROW, 2013).

Leites de outros ruminantes como o leite caprino apresenta propriedades já

conhecidas em relação ao leite de vaca, como melhor digestibilidade devido a seus

globulos de gordura menores, menor alergenicidade, além de altos teores de

micronutrientes (cálcio, fósforo, potássio, magnésio, dentre outros), e destaque para

seus constituintes bioativos como os peptídeos, ácido linoleico conjugado (CLA) e

oligossacarídeos (HERNÁNDEZ-LEDESMA; RAMOS; GÓMEZ-RUIZ, 2011;

ALBENZIO et al., 2012; GARCÍA et al., 2014), Figura 3.

41

Figura 3 - Componentes bioativos do leite de cabra e ação na Doença Inflamatória

Intestinal

Fonte: Elaborado pelo autor (2016).

A cabra é um animal que se adapta muito bem a condições ambientais extremas

com escassez de forragem e água, dessa maneira por muitas décadas associou-se o uso

do leite de cabra com pobreza e ao subdesenvolvimento. No Nordeste Brasileiro, por

muito tempo a produção e consumo do leite caprino eram comuns. Em contrapartida,

em países do mediterrâneo a criação de cabras leiteiras já representavam mercado

econômico importante (BOYAZOGLU; HATZIMINAOGLOU; MORAND-FEHR,

2005), devido ao interesse principalmente de produtos como queijos e iogurte

(HAENLEIN, 2004). A produção leiteira mundial de cabras em 2010 foi de 2,4%,

mundialmente, contudo em regiões como a África Subsaariana a produção média é

12,6%, enquanto que o Brasil detém uma produção de 0,5%, muito inferior a seu

potencial (FAOSTAT, 2012).

Atualmente, não só o leite, mas os derivados caprinos (queijos, iogurtes e

bebidas lácteas) tem ganhado cada vez mais destaque também nos países em

desenvolvimento, no mercado produtor e consumidor, por serem promissores alimentos

funcionais na promoção da saúde e prevenção de doenças.

A fabricação de queijos é uma das mais importantes, pelo crescente mercado

econômico dessa matriz láctea. No entanto, apresentam alguns problemas, a exemplo da

da produção do soro de queijo, a qual para produzir 1 Kg de quejo, são necessários 10

Kg de leite, resultando em 9 Kg de soro, e cerca de 50% desse soro não é aproveitado,

Compostos Bioativos

do Leite Caprino

Imunoglobulinas

Fator de

Crescimento

Proteínas e

Peptídeos Bioativos

Oligossacarídeos

Lipídios Bioativos

CLA

Minerais e

Vitaminas

Adesão leucocitária

Imunomodulador Linfócitos

Anti-inflamatório IL-6; IL-1β; IL-17, TNF-α

IL-10; IL-2, Mucinas

Antioxidante

Síntese de citocinas

42

gerando desperdício, perda financeira e um grande volume de efluentes problemas

ambientais relevantes (MAGALHÃES et al., 2011; TEJAYADI; CHERYAN, 1995).

No passado, a grande maioria das fábricas de queijo descartavam seus efluentes

diretamente em rios, lagos e oceanos, sem qualquer pré-tratamento. Alguns fabricantes

construiram tanques de armazenamento, mas descarregam no sistema de esgoto

municipal, outros destinam o soro produzido para a alimentação dos animais.

Mais recentemente, o soro de leite passou a ser melhor aproveitado, não apenas

pela preocupação ambiental, mas pela descoberta de seus constituintes nutricionais, a

exemplo do isolamento de proteínas do soro utilizadas como suplementos alimentares;

como ingrediente para a produção de bebidas lácteas, e o interesse científico em estudas

seus componentes isolados.

2.3.1 Peptídeos Bioativos

As proteínas do soro são transformadas em peptídeos bioativos, por meio de

processos enzimáticos ou fermentação (YADAV et al., 2015) e dessa forma evidenciam

os efeitos