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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
ANA CAMILA MENDES ANDRADE METAGENÔMICA COMPARATIVA DE AMOSTRAS DE SOLO E DE
ÁGUA DO BIOMA CAATINGA PARA BIOPROSPECÇÃO DE ENZIMAS RELACIONADAS AO METABOLISMO DE
CARBOIDRATOS (CAZYMES)
Salvador 2015
ANA CAMILA MENDES ANDRADE
METAGENÔMICA COMPARATIVA DE AMOSTRAS DE SOLO E DE ÁGUA DO BIOMA CAATINGA PARA BIOPROSPECÇÃO DE
ENZIMAS RELACIONADAS AO METABOLISMO DE CARBOIDRATOS (CAZYMES)
Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação em Biotecnologia, Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia, como requisito para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Thiago Bruce Rodrigues
Salvador
2015
A543 Andrade, Ana Camila Mendes
Metagenômica comparativa de amostras de solo e de água do bioma Caatinga para bioprospecção de enzimas relacionadas ao metabolismo de carboidratos (CAZymes)/ Ana Camila Mendes Andrade. – Salvador, 2015.
109 f.
Orientador: Prof. Dr. Thiago Bruce Rodrigues Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal da Bahia.
Instituto de Ciências da Saúde, 2015.
1. Enzimas. 2. Caatinga. 3. Biocombustíveis. 4. CAZymes. I. Rodrigues, Thiago Bruce. II. Universidade Federal da Bahia. III. Título.
CDU 577.15
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Ana Lúcia e Moacy, e meus irmãos, Ana Carolina e Rodrigo, por todo apoio e confiança sem os quais eu não teria conseguido. São minhas principais fontes de admiração e inspiração para dar sempre o melhor de mim. Cada um de vocês contribuiu à sua maneira para o que sou hoje e qualquer conquista minha é também uma conquista de vocês.
A Alexandre, por ter sido um grande companheiro em todas as etapas durante o mestrado e também fora dele, por ter estado ao meu lado nos momentos de entusiasmo e por me dar forças nos momentos difíceis.
Às minhas amigas “gêmeas” Luiza e Carol, e aos demais amigos biólogos por compartilharem incertezas, alegrias, por dividirem tantos momentos e se tornarem essenciais na minha vida.
À minha prima-irmã Dandara, por estar sempre tão perto, mesmo que de longe, me aconselhando, acalmando ou simplesmente ouvindo. Faltam palavras pra descrever o quanto é bom poder contar com você.
Aos meus colegas de laboratório e aos amigos que fiz durante o mestrado, pela convivência e por terem tornado tudo mais leve e proveitoso.
A Thiago Bruce, meu orientador, por ter sido sempre muito solícito e presente durante todo o desenvolvimento do trabalho. Obrigada por todas as palavras de incentivo, pelo conhecimento compartilhado, pelo voto de confiança e por ter possibilitado o engrandecimento da minha formação científica.
Ao Me. Fabyano Alvares e à Dr. Adriana Fróes pela imensa colaboração na análise dos dados, na solução de problemas e de todas as dúvidas que tive durante este tempo.
Ao Dr. Milton Roque e à Dra. Alinne Castro por terem aceitado participar da banca de avaliação do presente trabalho. Obrigada pela dedicação de tempo, esforços e pela contribuição oferecida.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, pela oportunidade de desenvolver o projeto, pelo aprendizado durante todo o mestrado e pelo auxílio financeiro, na realização do treinamento no Rio de Janeiro, o qual foi de fundamental importância para a realização deste trabalho.
À FAPESB, pelo apoio financeiro no concedimento da bolsa de mestrado.
Ao Centro de Genômica de Alto Desempenho do DF, pelo sequenciamento das amostras.
À CEPLAC, pela colaboração nas análises físico-químicas das amostras de solo.
ANDRADE, Ana Camila Mendes. Metagenômica comparativa de amostras de solo e de água do bioma Caatinga para bioprospecção de enzimas relacionadas ao metabolismo de carboidratos (CAZymes). 109 f. 2015. Dissertação (Mestrado) – Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2015.
RESUMO
A Caatinga é a única região natural exclusivamente brasileira, sendo, no entanto, a área menos conhecida dentre os demais biomas. Pouco se sabe sobre a diversidade microbiana da Caatinga e menos ainda sobre o potencial biotecnológico desta região, no que diz respeito, por exemplo, à bioprospecção enzimática. Um dos principais grupos de enzimas de interesse biotecnológico são as hidrolases, que catalisam a hidrólise de ligações covalentes da matéria orgânica e por isso podem ser aplicadas na conversão da biomassa vegetal, para a produção de biocombustíveis. Apesar das hidrolases representarem as principais enzimas com aplicações biotecnológicas para esse fim, outros grupos de enzimas envolvidas no metabolismo de carboidratos (CAZymes) também detém um papel importante neste processo. O presente trabalho se propõe a utilizar a abordagem metagenômica para analisar amostras de água do rio Paraguaçu e amostras de solo de uma localidade da Chapada Diamantina, quanto à presença de enzimas potencialmente aplicáveis na bioconversão de biomassa vegetal. O DNA metagenômico extraído das amostras foi sequenciado pelo método shotgun e foram realizadas duas estratégias de anotação: a anotação pela tecnologia de subsistemas e a anotação baseada em regiões conservadas das sequências de CAZymes. Observou-se que o solo e a água apresentaram diferenças nos seus perfis taxonômicos e na distribuição dos subsistemas e das famílias de CAZymes que predominaram em cada ambiente. O subsistema de carboidratos foi o mais abundante no solo e o segundo com maior contribuição na água. Os subsistemas clustering-based e de aminoácidos e derivados também estiveram dentre os mais representativos nos dois ambientes. Em relação às classes de CAZymes, as glicosil hidrolases foram dominantes no solo (~44%) enquanto que as glicosil transferases foram mais frequentes na água (~50%). Em relação aos principais táxons associados às CAZymes, a classe Planctomycetia apresentou contribuição de 29% nas amostras de solo e Alphaproteobacteria contribuiu com 27% nas amostras de água. O mesmo não aconteceu ao analisar a estrutura da comunidade microbiana total, na qual Actinobacteria foi a classe dominante no solo e Betaproteobacteria na água. Os resultados encontrados indicam o potencial biotecnológico da Caatinga. Determinados grupos de enzimas identificados no solo e na água podem desempenhar atividades na degradação de substratos de interesse industrial, como o amido, o xilano, a lignina e outros compostos lignocelulósicos, tornando este bioma uma interessante fonte para bioprospecção.
Palavras-chave: Abordagem metagenômica. Caatinga. Subsistemas. CAZymes. Biocombustíveis.
ANDRADE, Ana Camila Mendes. Comparative metagenomics of soil and freshwater samples from the Caatinga biome for bioprospecting of carbohydrate-active enzymes (CAZymes). 109 f. 2015. Master Dissertation – Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2015.
ABSTRACT
The Caatinga biome is the only natural area exclusively Brazilian, however, it is the area with the lowest number of scientific studies among other Brazilian biomes. The available knowledge about microbial diversity of Caatinga is very limited and even less is known about the biotechnological potential of this region, with regards, for example, to the enzyme bioprospecting. One of the major enzyme groups of interest for biotechnological purposes are hydrolases, which catalyze the hydrolysis of covalent bonds existent in organic matter and, therefore, can be applied in the conversion of plant biomass to be used in biofuels production. Despite the fact that hydrolases are the main enzyme group with biotechnological application for this purpose, other groups of enzymes involved in carbohydrate metabolism (CAZymes) also have an important role in this process. The present study aims to use the metagenomic approach in order to analyze freshwater samples from Paraguaçu river and soil samples from one location of Chapada Diamantina, seeking to detect the presence of potentially applicable enzymes in bioconversion of plant biomass. The metagenomic DNA extracted from samples was sequenced through the shotgun sequencing method and two annotation strategies were performed: the annotation through subsystems technology and the annotation based on conserved domains of CAZyme sequences. It was observed that the soil and freshwater presented differences on their taxonomic profiles and in relation to the subsystems and CAZymes families prevailing in each environment. The Carbohydrates subsystem was the most abundant in soil and had great contribution in freshwater samples. Other subsystems such as Amino acids and Derivatives also had greater contribution in both sites. Regarding CAZymes classes, glycoside hydrolases were dominant in soil (~44%) and glycosiltransferases in freshwater (~50%). In relation to the main taxons associated with CAZymes, the Planctomycetia class had 29% contribution in soil samples and Alphaproteobacteria contributed with 27% in freshwater samples. Nevertheless, the same scenario was not observed when the structure of microbial community was analysed as a whole, in which Actinobacteria was the ruling class in soil and Betaproteobacteria in freshwater. This results indicate the biotechnological potential of Caatinga, since certain groups of enzymes found both in soil and freshwater samples may have activities in degrading substrates of industrial interest such as starch, xylan, lignin and other lignocellulosic compounds.
Keywords: Metagenomic approach. Caatinga. Subsystems. CAZymes. Biofuels.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Cobertura do bioma Caatinga no Brasil ................................................................... 17
Figura 2 - Esquema do fluxo de trabalho na abordagem metagenômica através do sequenciamento direto .............................................................................................................. 23
Figura 3 - Modelo esquemático do sequenciamento na plataforma Illumina ......................... 26
Figura 4 - Modelo simplificado da hidrólise enzimática da celulose ....................................... 33
Figura 5 - Área de estudo ......................................................................................................... 36
Figura 6 - Variações de temperatura e de umidade referentes ao período de agosto/2012 a maio/2013 na Chapada Diamantina .......................................................................................... 37
Figura 7 - Variação da precipitação pluviométrica entre os meses de agosto/2012 e maio/2013 na Chapada Diamantina ............................................................................................................ 37
Figura 8 - Coleta das amostras de solo e esquema de filtração das amostras de água ............. 38
Figura 9 - Comparação dos perfis funcionais do solo e da água pela abordagem de subsistemas ............................................................................................................................... 48
Figura 10 - Composição das CAZymes no solo e na água ....................................................... 49
Figura 11 - Contribuição das famílias mais abundantes de CAZymes, pertencentes a cada classe, para ambos os ambientes............................................................................................... 51
Figura 12 - Perfil da comunidade microbiana total nos ambientes de solo e de água para o nível taxonômico Classe .......................................................................................................... 53
Figura 13 - Contribuição dos táxons (Classes) para as sequências identificadas como CAZymes nos ambientes do solo e da água ............................................................................. 54
Figura 14 - Possíveis novas sequências de CAZymes identificadas nos metagenomas do solo e da água ...................................................................................................................................... 55
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Comparação entre as plataformas de sequenciamento de nova geração (NGS) ..... 24
Tabela 2 - Parâmetros físico-químicos das amostras de solo .................................................. 45
Tabela 3 - Parâmetros físico-químicos das amostras de água ................................................ 45
Tabela 4 - Características gerais da anotação dos metagenomas no servidor MG-RAST ...... 46
LISTA DE ABREVIATURAS
AA – Atividades auxiliares
ANOVA – Análise de Variância
CAZymes – Carbohydrate-Active Enzymes
CBM – Módulos de ligação a carboidratos
CE – Carboidrato esterases
CEPLAC – Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira
CONAMA – Conselho Nacional do Meio Ambiente
DbCAN - DataBase for automated Carbohydrate-active enzyme ANnotation
DNA – Ácido desoxirribonucléico
EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético
FDR - False Discovery Rate
FIG-fam - Fellowship Interpretation of Genomes Family
GH – Glicosil hidrolases
GOS – Coleta Global dos Oceanos
GT – Glicosil transferases
HMM - Hidden Markov Models
ICMBio - Instituto Chico Mendes de Conservação Ambiental
ID – Identificador
LPMO - Monooxigenase lítica de polissacarídeo
LPS – Lipopolissacarídeo
MEGAN – MetaGenome Analyzer
MG-RAST – MetaGenomic Rapid Annotation by Subsystem Technology
MMA – Ministério do Meio Ambiente
NGS – Sequenciamento de nova geração
ORF - Open reading frame
PCR – Reação em cadeia da polimerase
pH – Potencial hidrogeniônico
PL – Polissacarídeo liases
PNCD – Parque Nacional da Chapada Diamantina
RAST – MetaGenomic Rapid Annotation by Subsystem Technology
RNA – Ácido Ribonucléico
rRNA – RNA ribossômico
SDS – Dodecil sulfato de sódio
STAMP – Statistical Analyses of Metagenomic Profiles
TAE - Tris-Acetato-EDTA
UV – Ultravioleta
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 13
2. REVISÃO DA LITERATURA.......................................................................................... 16
2.1 O Bioma Caatinga .............................................................................................................. 16
2.1.1 O Parque Nacional da Chapada Diamantina (PNCD) ..................................................... 16
2.2 Abordagens de estudo dos microorganismos ..................................................................... 16
2.2.1 Abordagem dependente de cultivo ................................................................................. 17
2.2.2 Abordagem independente de cultivo .............................................................................. 19
2.2.2.1 A metagenômica .......................................................................................................... 20
2.2.2.2 Sequenciamento de nova geração (NGS) ..................................................................... 23
2.2.2.2.1 A plataforma Illumina .............................................................................................. 25
2.2.2.3 A Bioinformática na análise de dados metagenômicos ............................................... 27
2.2.2.3.1 Estratégia de anotação pela tecnologia de subsistemas ............................................. 27
2.2.2.3.2 Anotação pela estratégia de domínios conservados ................................................. 28
2.3 Bioprospecção de enzimas e suas aplicações na indústria ................................................ 29
2.3.1 Enzimas ativas em carboidratos (CAZymes) .................................................................. 30
2.3.1.1 CAZymes que possuem atividade hidrolítica .............................................................. 31
2.3.1.1.1 As celulases .............................................................................................................. 32
3. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 35
3.1 Objetivo geral ................................................................................................................... 35
3.2 Objetivos específicos ........................................................................................................ 35
4. METODOLOGIA .............................................................................................................. 36
4.1 Área de estudo e coleta das amostras de solo e de água .................................................... 36
4.2 Extração do DNA metagenômico ....................................................................................... 39
4.3 Sequenciamento dos metagenomas .................................................................................... 39
4.4 Anotação dos metagenomas pela tecnologia de subsistemas e análise estatística ............. 40
4.4.1 Análise taxonômica e funcional pela abordagem de subsistemas ................................... 40
4.5 Anotação dos metagenomas pela estratégia de domínios conservados .............................. 41
4.6 Análise taxonômica das CAZymes..................................................................................... 42
4.7 Identificação de possíveis novas CAZymes nos metagenomas ......................................... 42
5. RESULTADOS .................................................................................................................. 44
5.1 Parâmetros físico-químicos das amostras de solo e de água .............................................. 44
5.2 Características gerais da anotação dos metagenomas......................................................... 44
5.3. Análise comparativa dos perfis funcionais ....................................................................... 46
5.3.1 Comparação entre o solo e a água quanto à distribuição dos subsistemas ...................... 47
5.3.2 Comparação entre os dois ambientes quanto à contribuição das CAZymes .................. 49
5.3.2.1 Análise comparativa entre o solo e a água para o nível classes .................................. 49
5.3.2.2 Comparação entre o solo e a água quanto às famílias de CAZymes encontradas ........ 50
5.4 Comparação dos perfis taxonômicos ................................................................................. 52
5.4.1 Análise comparativa da estrutura da comunidade microbiana total ............................... 53
5.4.2 Comparação dos perfis das comunidades microbianas associadas às CAZymes ........... 54
5.5 Identificação de possíveis novas sequências de CAZymes no solo e na água ................... 55
6. DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 57
6.1 Comparação dos perfis funcionais quanto à representatividade dos subsistemas ............. 57
6.2 Comparação do potencial funcional quanto à contribuição das CAZymes no solo e na água.. ......................................................................................................................................... 60
6.2.1 Representatividade das diferentes classes de CAZymes nos ambientes ........................ 60
6.2.2 Contribuição das CAZymes no solo e na água em termos de famílias .......................... 62
6.3 Comparação taxonômica quanto à estrutura da comunidade microbiana total ................. 68
6.4 Perfil taxonômico da comunidade microbiana associada às CAZymes ............................ 70
6.5 Reconhecimento de potenciais novas sequências de CAZymes ........................................ 72
6.6 Importância dos estudos de metagenômica comparativa .................................................. 73
7. CONCLUSÕES .................................................................................................................. 74
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 76
APÊNDICE ............................................................................................................................ 90
1. INTRODUÇÃO
A Caatinga é a única região natural exclusivamente brasileira (LEAL;
TABARELLI, SILVA, 2003). O bioma representa a formação vegetal dominante na
região semiárida do país, sendo o bioma semiárido com a maior biodiversade conhecida
(COSTA; ARAÚJO, 2012; MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE). Ainda assim, a
Caatinga é o bioma brasileiro menos estudado (MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE)
e uma das lacunas está justamente no estudo da biodiversidade microbiana da Caatinga
quanto ao seu potencial biotecnológico.
A necessidade de se propor soluções sustentáveis para diversos processos
produtivos tem levado a um aumento na demanda por enzimas industriais (ADRIO;
DEMAIN, 2014). Mais de 500 produtos abrangendo 50 aplicações utilizam enzimas
produzidas por microorganismos em larga escala (CHERRY; FIDANTSEF, 2003).
Um dos principais grupos de enzimas de atual interesse para a indústria são
enzimas de ação hidrolítica, mais conhecidas como hidrolases (KIRK; BORCHERT;
FUGLSANG, 2002). Estas enzimas realizam a hidrólise de ligações covalentes da
matéria orgânica e por isso apresentam importantes aplicações nos mais diferentes
processos como, por exemplo, na conversão da biomassa vegetal para a produção de
biocombustíveis (PARISUTHAM; KIM; LEE, 2014). Tal conversão requer a atuação
de grupos de enzimas que sejam capazes de transformar eficientemente a biomassa
vegetal em açúcares fermentáveis, possibilitando assim a produção de bioetanol. As
celulases, por exemplo, são um grupo de enzimas que pertencem à classe das glicosil
hidrolases e que, ao atuarem em conjunto, hidrolisam a celulose, que é o principal
componente da biomassa vegetal e é um biopolímero de grande abundância na natureza
(SADHU; MAITI, 2013). Muitos organismos, incluindo animais, plantas e
microorganismos produzem celulases, entretanto, a maioria das que são conhecidas
provém de origem microbiana (DUAN; FENG, 2010). Os sistemas especializados de
decomposição dos polissacarídeos da parede celular vegetal incluem, além das
celulases, hemicelulases e outras glicosil hidrolases relacionadas, assim como
polissacarídeo liases e carboidrato esterases (HIMMEL et al., 2010). Estas classes de
enzimas - glicosil hidrolases (GH), polissacarídeo liases (PL) e carboidrato esterases
(CE) - juntamente às glicosil transferases (GT), atividades auxiliares (AA) e módulos de
ligação a carboidratos (CBM) compõem as denominadas CAZymes (LOMBARD et al.,
2014). O termo CAZymes refere-se ao espectro de atividades catalíticas envolvidas na
biotransformação de açúcares e seus derivados, para assegurar tanto a montagem de
monossacarídeos em oligo e polissacarídeos quanto a clivagem de diversos tipos de
açúcares, permitindo, ainda, a conjugação destes a compostos como proteínas e lipídeos,
entre outros (ANDRÉ et al., 2014). As CAZymes representam portanto um vasto
repertório de enzimas com alta relevância biotecnológica, em função, entre outras
coisas, da sua potencial aplicação na produção de bioenergia a partir da biomassa
vegetal residual (HORN et al., 2012).
Apesar de um grande número de microorganismos habitarem a biosfera, mais de
99% não são passíveis de serem cultivados através das técnicas de laboratório existentes
(LI et al., 2015). No entanto, avanços recentes em genômica, metagenômica, técnicas
emergentes de DNA recombinante, entre outras, têm facilitado a descoberta de novas
enzimas microbianas na natureza, através, por exemplo, dos metagenomas (ADRIO;
DEMAIN, 2014).
A metagenômica é o estudo de sequências genômicas obtidas diretamente do meio
ambiente e que contorna a necessidade de isolar e cultivar os microorganismos
(HANDELSMAN, 2004; WOOD; SALZBERG, 2014). O sequenciamento dos
metagenomas permite explorar microorganismos recalcitrantes ao cultivo que habitam
os mais diversos locais (PRAKASH; TAYLOR, 2012). A análise dos metagenomas
pode ser feita através de ferramentas de bioinformática que permitem investigar uma
variedade de aspectos das comunidades microbianas estudadas. A abordagem
metagenômica permite responder às perguntas “Quem esta aí?” e “O que podem
fazer?”, proporcionando elucidações sobre a história evolutiva dos microorganismos e o
potencial metabólico da comunidade microbiana (SESHADRI et al., 2007). A
metagenômica, além de permitir estudar as relações entre os microorganismos e os
habitats nos quais eles vivem, pode também fornecer informações genéticas sobre novos
biocatalisadores ou enzimas potenciais (THOMAS; GILBERT; MEYER, 2012;
WOOLEY et al., 2010). A enorme quantidade e diversidade de dados genômicos
gerados através da abordagem metagenômica representa uma importante fonte para
prospecção de novos genes de interesse biotecnológico. A metagenômica torna
acessível o potencial biotecnológico das bactérias recalcitrantes ao cultivo, permitindo a
prospecção de genes com as mais diversas funções e o fornecimento único de moléculas
bioativas para aplicação industrial (LORENZ; ECK, 2005).
O presente trabalho representa a primeira caracterização comparativa do potencial
funcional da microbiota do solo e da água doce de uma região da Caatinga baiana. Neste
sentido, o trabalho se propõe a utilizar a metagenômica como ferramenta, no intuito de
bioprospectar grupos de enzimas relacionados à bioconversão lignocelulósica, com
potencial aplicação da cadeia produtiva de bioetanol.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 O bioma Caatinga
A Caatinga ocupa uma área de aproximadamente 844.453km², representando cerca de
11% do território nacional, sendo o principal bioma da região nordeste e o bioma semiárido
mais biodiverso do mundo (Figura 1) (MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE). O bioma
Caatinga é caracterizado por apresentar uma vegetação tropical seca e decídua, composta por
pequenas árvores, arbustos, gramíneas e por deter altos níveis de insolação, altas temperaturas
e recursos hídricos escassos, o que ocasiona grandes períodos de seca ao longo do ano
(GORLACH-LIRA; COUTINHO, 2007).
A Caatinga representa um bioma exclusivamente brasileiro e, por isso, seu patrimônio
biológico é único e de extrema importância. Segundo o Ministério do Meio Ambiente
(MMA), o bioma detém um imenso potencial para uso sustentável e bioprospecção, pois a
biodiversidade da Caatinga é capaz de amparar diversas atividades econômicas, incluindo as
industriais.
No entanto, ainda que detenha um patrimônio biológico único e seja uma importante
fonte de recursos naturais, a Caatinga é o bioma proporcionalmente menos estudado dentre as
regiões naturais brasileiras, já que grande parte dos estudos científicos se concentra em torno
de algumas das principais cidades da região (LEAL; TABARELLI; SILVA, 2003).
Informações sobre a densidade e diversidade de microorganismos do solo são escassas na
Caatinga (GORLACH-LIRA; COUTINHO, 2007) e ainda são incipientes os trabalhos neste
bioma brasileiro com foco na prospecção de enzimas microbianas com aplicação industrial.
2.1.1 O Parque Nacional da Chapada Diamantina (PNCD)
O Parque Nacional da Chapada Diamantina encontra-se inserido na ecorregião do
Complexo da Chapada Diamantina, dentro dos limites do bioma da Caatinga brasileira. O
parque é uma Unidade de Conservação de cerca de 152.000ha, tendo sido criado pelo decreto
nº 91.655 de 17 de setembro de 1985, estando localizado na região central do estado da Bahia
(VELLOSO et al., 2002).
A criação do parque tem como objetivo proteger amostras dos ecossistemas da Serra do
Sincorá, na Chapada Diamantina, assegurando a preservação de seus recursos naturais e
proporcionando, entre outras coisas, oportunidades para pesquisa científica. A preservação
desses ecossistemas propicia a manutenção de um banco genético de grande importância tanto
para a pesquisa, quanto para a manutenção da biodiversidade brasileira (GONÇALVES et al.,
2005).
Assim como para o bioma Caatinga em sua totalidade, ainda são escassas as pesquisas
científicas conduzidas dentro dos limites do PNCD. A maioria dos estudos realizados abarca
aspectos da flora (BASTOS; STRADMANN; VILAS BÔAS-BASTOS, 1998; RIBEIRO-
FILHO; FUNCH; RODAL, 2009) e fauna (PEREIRA; GEISE, 2009). Pesquisas sobre a
biodiversidade microbiana e a bioprospecção de enzimas produzidas por esses
microorganismos são realizadas de forma ainda mais limitada.
2.2 Abordagens de estudo dos microorganismos
Figura 1. Cobertura do bioma Caatinga no Brasil. Fonte: www.cerratinga.org.br/caatinga.
Estima-se que existam cerca de 4–6 × 1030 células procarióticas habitando a terra
(WHITMAN; COLEMAN; WIEBE, 1998). Tais procariotos comumente organizam-se em
comunidades microbianas complexas, ocupando os mais diversos nichos existentes e
desempenhando funções cruciais numa variedade de processos biológicos essenciais à
manutenção dos ecossistemas (PRAKASH; TAYLOR, 2012).
As principais formas de se ter acesso a esta imensa diversidade de microorganismos são
através de duas diferentes estratégias de estudo, as quais serão apresentadas a seguir: a
abordagem dependente e a abordagem independente de cultivo.
2.2.1 Abordagem dependente de cultivo
No sentido de se estudar os mais diferentes processos bacterianos, o isolamento em
culturas puras é, tradicionalmente, a etapa inicial a ser realizada (RIESENFELD; SCHLOSS;
HANDELSMAN, 2004). Tais técnicas da microbiologia, baseadas na análise de culturas
puras crescidas em laboratório, se reúnem na denominada abordagem dependente de cultivo.
Esta abordagem permite a identificação os microorganismos obtidos através do cultivo – e,
com isso, o conhecimento da sua diversidade – assim como permite triar determinadas
características fisiológicas e bioquímicas de interesse (AMANN; LUDWIG; SCHLEIFER,
1995).
A precisão de tais estudos e a carência de outras metodologias disponíveis fizeram com
que, durante muito tempo, grande parte do conhecimento gerado fosse oriundo de
microorganismos estudados a partir de suas culturas puras crescidas em laboratório. De fato, a
diversidade de microorganismos do solo foi por muitos anos explorada através de técnicas de
cultivo e isolamento das espécies (DANIEL, 2004). Como resultado, muitos produtos naturais
de valor econômico (como por exemplo, antibióticos) foram derivados de microorganismos
do solo cultivados (DANIEL, 2004; STROHL, 2000).
Os maiores desafios que envolvem o cultivo dos microorganismos em laboratório estão
relacionados à identificação e ao fornecimento, na sua correta concentração, dos nutrientes
necessários para promover o crescimento microbiano (ALAIN; QUERELLOU, 2009).
Avanços recentes nas estratégias de cultivo têm levado à superação destes e de outros desafios
associados à obtenção das culturas, uma vez que as novas ferramentas têm proporcionado o
melhoramento das condições que permitem o estabelecimento dos microorganismos.
Novas abordagens de cultivo estão sumarizadas nas revisões de Alain e Querellou
(2009) e de Pham e Kim (2012), indicando os diversos estudos que embasam o
desenvolvimento de cada uma das técnicas. Estas novas estratégias incluem: o refinamento
dos meios e das condições de cultivo, através da diversificação da formulação dos meios,
modificações no período de incubação e no tamanho do inóculo; o cultivo in situ, através da
simulação das condições naturais em biorreatores ou em câmaras de difusão; o cultivo de alto
rendimento pela microencapsulação combinada com citometria de fluxo ou pela utilização de
chips de culturas microbianas e robotização; e a cultura baseada nas interações célula-célula,
através da adição de compostos sinalizadores no meio, pelo cultivo de comunidades inteiras (
a partir de um mix de bactérias que requerem cooperação) ou pelo cultivo em biofilmes.
No entanto, apesar dos métodos dependentes de cultivo permitirem a análise e a
caracterização da diversidade microbiana em determinada amostra, e de ter havido um grande
avanço nas estratégias de cultivo, existe um grande gargalo na diversidade vista através desta
abordagem, em relação à diversidade microbiana real no ambiente. Estima-se que as técnicas
de cultivo tradicionais sejam capazes de representar apenas 1% ou menos da diversidade
bacteriana na maioria das amostras de ambientes naturais, ou seja, a grande maioria das
bactérias presentes na natureza (≥ 99%), ainda não foi cultivada (AMANN; LUDWIG;
SCHLEIFER, 1995; LI et al., 2015; RIESENFELD; SCHLOSS; HANDELSMAN, 2004;
TORSVIK; ØVREÅS, 2002). Este fato pode se tornar particularmente crítico em se tratando
de microorganismos em amostras de solo, por exemplo. Isso ocorre devido à estimativa de
que 1g de solo pode conter mais de 10 bilhões de microorganismos, podendo pertencer a
milhares de espécies diferentes (MYROLD; ZEGLIN; JANSSON, 2013; ROSSELLÓ-
MORA; AMANN, 2001).
2.2.2 Abordagem independente de cultivo
Para contornar estas e outras limitações associadas à abordagem dependente de cultivo,
diferentes técnicas de estudo das comunidades microbianas que independem do cultivo foram
sendo desenvolvidas. As análises independentes de cultivo permitem o acesso ao genoma de
toda a comunidade microbiana de uma amostra, possibilitando a análise de dezenas de
espécies de maneira simultânea e não apenas o estudo de algumas espécies individualmente,
como a abordagem dependente de cultivo propõe (HANDELSMAN, 2004; WOOLEY;
GODZIK; FRIEDBERG, 2010).
2.2.2.1 A metagenômica
Dentre as formas de abordagem independentes de cultivo, que permitem o acesso à
informação genética de comunidades microbianas, está a metagenômica. O termo
“metagenômica” foi pela primeira vez utilizado por Handelsman e colaboradores (1998), e
refere-se à abordagem independente de cultivo baseada na investigação das moléculas de
DNA de uma mistura de populações microbianas, ou seja, é baseado na análise genômica de
DNA microbiano extraído diretamente do ambiente (HANDELSMAN et al., 1998). A
metagenômica representa um conjunto de técnicas que incluem abordagens e métodos
relacionados à genômica, como o sequenciamento e a clonagem. Tais técnicas proporcionam
uma visão menos enviesada do que a oferecida pelas abordagens dependentes de cultivo, não
somente em relação à estrutura da comunidade (riqueza e distribuição de espécies) como
também sobre o potencial funcional (metabólico) desta comunidade (WOOLEY; GODZIK;
FRIEDBERG, 2010). Sendo assim, a metagenômica se caracteriza por contornar a
necessidade de cultivo e, em função da vasta diversidade microbiana existente, pode ser
conduzida em grande escala (HANDELSMAN, 2005).
Os dados proporcionados pela análise de metagenomas permitem inferir uma série de
características sobre o ambiente estudado, seja quanto à composição microbiana em
determinada comunidade, à presença de microrganismos específicos ou dominantes, à
existência de rotas metabólicas ou à identificação de genes de interesse (STEELE; STREIT,
2005). É possível, por exemplo, realizar um screening do DNA metagenômico estudado
buscando alguma atividade enzimática específica (HUGENHOLTZ; TYSON, 2008). Por isso,
esta abordagem representa uma poderosa ferramenta para prospecção de genes responsáveis
pela síntese de moléculas com propriedades de interesse biotecnológico (BARONE et al.,
2014; BERGMANN et al., 2014; COWAN et al., 2004; HANDELSMAN, 2004; STEELE;
STREIT, 2005).
A idéia da clonagem do DNA diretamente de amostras ambientais foi primeiramente
proposta por Pace, Stahl e Oisen, em 1985, que utilizaram a técnica de PCR para explorar a
diversidade microbiana a partir de sequências de RNA ribossômico (PACE; STAHL; OISEN,
1985). Isso levou ao primeiro estudo de isolamento e clonagem de DNA em grande escala a
partir de amostras ambientais, o qual foi realizado por Schimdt, Delong e Pace (SCHMIDT;
DELONG; PACE, 1991). Neste estudo, a diversidade filogenética picoplanctônica marinha
foi analisada a partir da clonagem de sequências de DNA, oriundas de uma região do oceano
pacífico, em bacteriófagos λ. A análise do rRNA 16S amplificado detectou a presença de
grupos filogenéticos de Proteobacteria distantes das sequências de rRNA 16S conhecidas até
então. Estes achados fortaleceram a idéia de que a diversidade microbiana é muito mais
complexa do que a conhecida através das técnicas de cultivo tradicionais.
A partir de então, a diversidade microbiana em ecossistemas terrestres e aquáticos foi
sendo cada vez mais estudada através da abordagem metagenômica. Janssen (2006) analisou
bibliotecas de rRNA 16S preparadas a partir de solos das mais diferentes localidades como
Canadá, EUA, Brasil, Alemanha e Áustria. Os filos dominantes encontrados nas bibliotecas
foram, na ordem decrescente: Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria,
Verrucomicrobia, Bacteriodetes, Chloroflexi, Planctomycetes, Gemmatimonadetes e
Firmicutes, que juntos compuseram mais de 92% das bibliotecas do solo.
Em relação às amostras aquáticas, Venter e colaboradores (2004) também realizaram
um estudo metagenômico em larga escala no Mar de Sargaço. Foram gerados mais de 1.045
bilhão de pares de bases, que foram anotadas e analisadas. Em relação à diversidade
filogenética, o grupo dominante foi Proteobacteria (das subdivisões α, β, e γ) e houve também
uma contribuição moderada de Firmicutes e de Cyanobacteria. Este estudo faz parte do
projeto Coleta Global dos Oceanos (GOS), que envolve a coleta, sequenciamento e análise do
DNA de microorganismos de diversos ambientes aquáticos.
Pesquisas mais recentes têm ampliado o espectro de alcance da metagenômica,
associando a diversidade microbiana existente em determinado ambiente com a sua
diversidade funcional. Mendes e colaboradores (2015), por exemplo, realizaram um estudo
no intuito de perceber as consequências da perturbação do solo na composição de uma
comunidade microbiana e na sua capacidade funcional. Os autores encontraram que, dentre os
quatro tipos de solo analisados – de uma floresta nativa, de um local desmatado, um solo
utilizado para agricultura e um para pastagem -, os dois últimos estiveram entre os mais
diversos e apresentaram maior redundância funcional. Tais resultados sugeriram que o
equilíbrio funcional na floresta (ambiente não perturbado) se manteve baseado numa alta
abundância dos microorganismos, enquanto que para os ambientes de solo perturbardos, uma
maior diversidade microbiana parece ser a responsável pela manutenção deste equilíbrio.
Já Debroas e colaboradores (2009) utilizaram a metagenômica para estudar a
diversidade funcional e taxonômica da comunidade microbiana no maior lago da França, o
Lac du Bourget. Os autores encontraram que Actinobacteria, seguida de Alpha- e
Betaproteobacteria e Bacteroidetes foram os grupos dominantes nas bibliotecas analisadas.
Em relação aos perfis metabólicos, ao comparar os resultados encontrados com os obtidos em
outros estudos de ambientes aquáticos, foi observado que o metagenoma da comunidade
microbiana do Lac du Bourget é caracterizado por uma maior representatividade de genes
envolvidos na degradação de xenobióticos e metabolismo de glicanos, com menor
representatividade de genes relacionados ao metabolismo de alguns aminoácidos. Os autores
ainda associaram o perfil metabólico encontrado com os grupos taxonômicos que foram mais
abundantes no lago. Foi visto que a maioria dos genes anotados para Alphaproteobacteria
pertencem à degradação de xenobióticos, enquanto que Actinobacteria esteve mais
relacionada ao metabolismo de nucleotídeos, cofatores e vitaminas, energia, replicação e
reparo; Betaproteobacteria distinguiu-se dos outros grupos por genes de transporte de
membrana e transdução de sinal e Bacteroidetes teve uma maior representatividade de genes
de biossíntese de glicanos e do metabolismo de carboidratos.
A partir dos estudos supracitados é possível perceber que a análise da diversidade
microbiana através da metagenômica, em ambientes como o solo e a água, tem permitido uma
caracterização taxonômica e funcional que até então não era possível através das técnicas
tradicionais de cultivo, ilustrando o grande potencial dessa abordagem.
A abordagem metagenômica é conduzida de forma que o DNA metagenômico seja
analisado através da investigação funcional e/ou baseada em sequenciamento (Figura 2). As
análises baseadas em função tem o potencial de detectar novos genes, proteínas e outros
compostos bioativos, requerendo a expressão heteróloga dos genes clonados e transformados,
seguida da triagem dos clones com expressão positiva (DANIEL, 2004). De acordo com Li e
colaboradores (2009), um dos principais problemas deste tipo de análise é a observação de
uma baixa expressão dos genes que são clonados nos hospedeiros. Muitos genes podem não
ser expressos de maneira eficiente devido a diferenças na utilização de códons, modificações
pós-traducionais, toxicidade da enzima produzida entre outros (LI et al., 2009).
As análises baseadas em sequenciamento, por sua vez, não dependem da expressão de
genes clonados em hospedeiros (DANIEL, 2004). Este tipo de abordagem pode envolver o
sequenciamento completo dos clones, na busca do grupo taxonômico originário da sequência,
assim como o sequenciamento aleatório para identificação de genes de interesse
(HANDELSMAN, 2004).
Independente da estratégia de análise utilizada – seja ela baseada em função ou no
sequenciamento - um grande número de clones é requerido para as análises. Em um estudo
realizado por Henne e colaboradores (2000), foram necessários 730.000 clones para revelar
apenas um clone positivo para a atividade lipolítica no meio ágar testado. Uma forma de
eliminar a utilização destes sistemas de clonagem, e diminuir o tempo de execução, surgiu
com o desenvolvimento de novas técnicas de sequenciamento, mais avançadas do que o
método de Sanger (SANGER; COULSON, 1975).
2.2.2.2 Sequenciamento de nova geração (NGS)
As estratégias de sequenciamento de nova geração estão superando rapidamente o
sequenciamento de Sanger, tanto no estudo de genomas pequenos quanto de grandes amostras
ambientais (WOOLEY; GODZIK; FRIEDBERG, 2010). Segundo Metzker (2010), a
capacidade de produzir com rapidez um enorme volume de dados (alcançando mais de um
Figura 2. Esquema do fluxo de trabalho na abordagem metagenômica através do sequenciamento direto. Fonte: www.cardiovasculairegeneeskunde.nl.
bilhão de reads por corrida), representa o principal progresso proporcionado pelo
sequenciamento de nova geração. Em relação à metagenômica, a maior eficiência que pode
ser associada às técnicas de NGS advém da redução dos vieses relacionados à clonagem
tradicional, o que é proporcionado pela realização da clonagem in vitro (CARVALHO;
SILVA, 2010; SHAMSADDINI et al., 2014).
Dentre as técnicas de sequenciamento de nova geração pode-se citar a plataforma 454
da Roche, a SOLiD e a Ion Torrent da Life Technologies e a Illumina, da companhia
homônima (Tabela 1). Tais plataformas podem englobar diferentes sistemas de
sequenciamento (como por exemplo os sistemas Hiseq, Miseq e GAIIx, todos da Illumina), o
que faz com que as estimativas dos tempos de execução e dos custos variem bastante dentro
de uma mesma plataforma, a depender do sistema utilizado. A grande capacidade de geração
de dados, a economia de tempo e custo são pontos em comum entre as diferentes técnicas (JI;
NIELSEN, 2015). O que as difere e determina o tipo de dado produzido em cada uma das
plataformas são as especificidades técnicas na realização do sequenciamento (METZKER,
2010). No presente estudo, o sistema de sequenciamento utilizado foi o Miseq, da Illumina,
que será detalhado a seguir.
Plataforma Companhia Tempo de execução
Milhões de reads por corrida
Custo de reagentes por corrida
454 Roche 10-20h 0.1-1 U$1.100-6.200
Illumina Illumina 26h-14 dias 3.4-3.000 U$750-23.470
SOLiD Life Technologies
8-12 dias >700 U$6.101-10.503
HeliScope Helicos Não disponível
800 Não disponível
Ion Torrent Life Technologies
2h 0.1-8 U$500~925
PacBio Pacific Biosciences
0.5-2h 0.01 U$110-900
Starlight Life Technologies
Não disponível
~0.01 Não disponível
Tabela 1. Comparação entre as plataformas de sequenciamento de nova geração (NGS). Modificado de Glenn, 2011.
2.2.2.2.1 A plataforma Illumina
Na plataforma Illumina (assim como em outras plataformas de sequenciamento de nova
geração) as bibliotecas metagenômicas são geradas a partir da fragmentação aleatória das
sequências de DNA pelo método de sequenciamento shotgun. O DNA fragmentado é ligado a
adaptadores em ambas as extremidades (Figura 3A) e, em seguida, este DNA é imobilizado
na superfície de clonagem (flow cell) (Figura 3B). Isso ocorre a partir da hibridização entre o
adaptador livre presente nas sequências do DNA ligado, com adaptadores presentes também
na superfície das flow cells. A alta densidade de adaptadores nas flow cells faz com que ocorra
esta hibridização, formando assim uma estrutura em “ponte” (Figura 3C). Dá-se então o
processo de amplificação dos fragmentos de DNA fita simples ligados em ambas as
extremidades à superfície, com a síntese da fita complementar ao DNA ligado, a partir da
adição de nucleotídeos não marcados e da DNA polimerase ao sistema (Figura 3D). A DNA
polimerase incorpora os nucleotídeos de maneira que são construídas “pontes” de DNA fita
dupla no suporte sólido. Uma etapa de desnaturação dos fragmentos de fita dupla leva
novamente à linearização das sequências de DNA fita simples ancoradas ao sistema (Figura
3E). A amplificação em fase sólida leva à formação de mais de 1.000 cópias idênticas de cada
fragmento de DNA que permanecem próximos uns dos outros, formando clusters
(Technology Spotlight: Illumina® Sequencing) (Figura 3F).
A tecnologia de sequenciamento utilizada na plataforma Illumina, assim como o
sequenciamento de Sanger, é realizada por síntese, utilizando a DNA polimerase e quatro
nucleotídeos terminadores marcados com diferentes fluoróforos (CARVALHO; SILVA,
2010). No entanto, o processo de sequenciamento da Illumina não requer a clonagem física de
fragmentos, já que esta clonagem é feita in vitro na superfície das flow cells, o que caracteriza
um avanço em relação ao método de Sanger, permitindo o sequenciamento de dezenas de
milhares de clusters em paralelo (CARVALHO; SILVA, 2010). Durante cada ciclo de
sequenciamento nos clusters, nucleotídeos terminadores marcados com fluorescência são
adicionados à reação (Figura 3G).
O nucleotídeo marcado serve como terminador para a reação, então, durante cada
incorporação de um nucleotídeo, é feita a leitura da fluorescência para identificação da base
adicionada (Figura 3H). Em seguida, esse nucleotídeo é enzimaticamente clivado para
remoção do terminal 3’ bloqueado e do fluoróforo, permitindo a incorporação do próximo
nucleotídeo (METZKER, 2010). A identificação das bases é feita diretamente através da
medida da intensidade do sinal em cada ciclo (Technology Spotlight: Illumina® Sequencing).
Os ciclos são repetidos de maneira que, ao final, seja identificada a sequência de bases dos
fragmentos de DNA em cada cluster (I-J), permitindo assim a geração dos dados que serão
posteriormente analisados.
Figura 3: Modelo esquemático do sequenciamento na plataforma Illumina. (A) Fragmentação aleatória do DNA (shotgun) e ligação aos adaptadores em ambas extremidades. (B) Ligação dos fragmentos de DNA fita simples às suas sequências complementares na superfície das flow cells. (C) Etapa de anelamento, com a formação das “pontes”, a partir da ligação do adaptador presente na extremidade livre do fragmento de DNA, com sua sequência complementar aderida à superfície. (D) Amplificação das cadeias de DNA a partir da incorporação de nucleotídeos pela DNA polimerase, formando “pontes” em fita dupla. (E) Etapa de desnaturação na qual as “pontes” são desfeitas. (F) Após diversos ciclos de amplificação, são formados clusters com milhares de sequências idênticas. (G) Adição dos nucleotídeos terminadores marcados e sua incorporação à cadeia pela DNA polimerase. (H) Após excitação à laser, a fluorescência em cada cluster é captada pelo sistema, identificando qual base foi incorporada à cadeia de DNA. (I e J) Repetição do ciclo de incorporação,
excitação à laser e detecção do nucleotídeo pelo sistema. (L) Determinação da sequência de bases em cada fragmento. Adaptado de Carvalho e Silva, 2010.
2.2.2.3 A Bioinformática na análise de dados metagenômicos
O desenvolvimento de técnicas avançadas de sequenciamento tem levado à produção de
um grande volume de dados genômicos e metagenômicos, o que representa tanto uma
oportunidade como um desafio para os cientistas. O crescimento na disponibilidade de
sequências ocorreu concomitantemente ao desenvolvimento computacional, o que promoveu
um surgimento cada vez maior de bases de dados, bem como de ferramentas de análises de
dados de DNA/RNA e proteínas (REHM, 2001).
A Bioinformática é uma área interdisciplinar de pesquisa, desenvolvida no intuito de
organizar, analisar e distribuir informações a fim de responder a questões biológicas
complexas (ABD-ELSALAM, 2003; SINGH; KUMAR, 2001). Nos últimos anos, um grande
número de ferramentas de bioinformática têm se tornado disponível, o que trouxe à tona as
questões de quais ferramentas utilizar e como utilizá-las, no sentido de melhor responder às
questões científicas propostas (REHM, 2001).
Estudos metagenômicos originam conjuntos de dados de grande volume e
complexidade que, segundo Desai e colaboradores (2012), não podem ser vistos simplesmente
como uma extensão da genômica, pois requerem diferentes ferramentas de bioinformática.
Ainda segundo os autores, a análise dos dados é o fator limitante principal na metagenômica,
tendo o aumento no volume dos dados trazido desafios às ferramentas existentes. A superação
dessas dificuldades pode ser conseguida através da otimização das estratégias utilizadas em
cada estudo metagenômico particular, a partir das ferramentas já disponíveis.
2.2.2.3.1 Estratégia de anotação pela tecnologia de subsistemas
A comparação de determinado conjunto de sequências, com bases de dados de
sequências de referência, é o primeiro passo na análise dos metagenomas, o qual envolve um
grande esforço computacional, mas fornece subsídios para diversas análises como
comparações filogenéticas, anotações funcionais e reconstruções metabólicas (MEYER et al.,
2008). O servidor MG-RAST (MEYER et al., 2008) é um sistema automatizado de anotação
para o processamento e análise de dados metagenômicos, capaz de promover tais análises. O
servidor, até março de 2015, já contava com mais de 12.000 usuários e 163.729 metagenomas
anotados. Seu fluxo de trabalho envolve o controle de qualidade das sequências, predição de
proteínas, clustering e anotação baseada em similaridade. O servidor realiza uma busca por
similaridade entre as proteínas preditas a partir das sequências submetidas (na etapa de gene
calling) e as bases de dados de proteínas. A anotação pode ser visualizada em diversas
categorias diferentes, entre elas a de subsistemas.
Um subsistema pode ser entendido como um conjunto de papéis funcionais que
implementam um determinado processo biológico ou estrutural (OVERBEEK et al., 2005).
Os subsistemas são classificados em níveis hierárquicos, de maneira que no nível 1 são
incluídas funções gerais tanto catabólicas quanto anabólicas (por exemplo, o metabolismo do
DNA) e nos níveis 2 e 3 constam vias mais específicas (como por exemplo, a assimilação do
sulfato) (DINSDALE et al., 2008). Cada subsistema é curado por um grupo de cientistas
especializados em vias metabólicas específicas, estabelecendo quais os principais genes
envolvidos e sua arquitetura genômica. As proteínas que compõem os subsistemas formam
famílias de homólogos isofuncionais (FIGfam-Fellowship Interpretation of Genomes Family)
(GERLT; BABBITT, 2001). Sendo assim, existem três componentes principais que tornam
esse método de anotação rápido e acurado: o servidor RAST, os subsistemas e as FIG-fam.
2.2.2.3.2 Anotação pela estratégia de domínios conservados
Outra estratégia para otimizar a busca por enzimas com atividades de interesse é triar as
sequências-alvo, obtidas por sequenciamento de alta vazão, através das ferramentas de
bioinformática. É possível identificar “assinaturas” nas sequências-alvo (através do seu
alinhamento global) e utilizar tais assinaturas como sondas para efetuar a busca em bases de
dados de sequências protéicas (FINN; CLEMENTS; EDDY, 2011). Essa abordagem permite
a identificação de genes putativos para produção de enzimas de interesse, funcionando como
um filtro para selecionar genes-alvo para clonagem molecular.
A busca por domínios catalíticos tem se mostrado mais eficiente do que a simples
busca por similaridade de sequências para a identificação de novas proteínas (EDDY, 2011).
Sequências que apresentam no mínimo 40% de identidade com uma cobertura de 70%, em
comparação à sequências depositadas em bases de dados de sequências homólogas, são
utilizadas como parâmetros para uma inferência funcional relativamente segura, de acordo
com evidências empíricas (EDDY, 2009; HINZ, 2010). Essa estratégia difere das tradicionais
que realizam triagem funcional de bibliotecas metagenômicas de metagenomas inteiros,
triagem a qual, em comunidades muito diversas não apresenta alta eficiência (DANIEL,
2004). A caracterização do potencial funcional baseado na análise de sequências conservadas
no metagenoma da microbiota do solo e da água permite identificar previamente as
sequências de interesse, otimizando, dessa forma, todo o processo.
2.3 Bioprospecção de enzimas e suas aplicações na indústria
As enzimas são proteínas com atividade catalítica e estão envolvidas em um grande
número de transformações de moléculas com importância biológica (WHITESIDES; WONG,
1983). Essas proteínas apresentam características que favorecem sua utilização como
catalisadores, como por exemplo, suas aceleradas taxas de reação e a seletividade específica
ao substrato (WHITESIDES; WONG, 1983). Devido a estas propriedades catalíticas, as
enzimas têm sido incorporadas nos mais diversos produtos e processos industriais (KIRK;
BORCHERT; FUGLSANG, 2002), e o rápido desenvolvimento tecnológico atual tem
aumentado cada vez mais o alcance das suas aplicações.
Microorganismos na natureza têm sido, ao longo dos anos, uma importante fonte de
bioprospecção de diversos tipos de moléculas, incluindo as enzimas. Com os avanços da
bioinformática e dos estudos genômicos e metagenômicos, tem se tornado cada vez mais
eficiente o isolamento de genes, bem como de compostos de interesse no ambiente (KIRK;
BORCHERT; FUGLSANG, 2002). Nesse sentido, é possível observar a crescente
disponibilidade de estudos de bioprospecção de enzimas na literatura e, dentre os principais
grupos de proteínas com interesse biotecnológico, estão as enzimas relacionadas ao
metabolismo de açúcares. Isso se deve ao fato de que os carboidratos são moléculas que
intercedem nos mais diversos processos biológicos, do reconhecimento e sinalização celulares
à formação de reservas energéticas e de moléculas estruturais, sendo encontrados de maneira
abundante no meio ambiente (LOMBARD et al., 2014). Sendo assim, as enzimas envolvidas
no seu metabolismo também detém importância em diferentes funções biológicas e podem ser
melhor compreendidas e exploradas dado o potencial biotecnológico que possuem.
2.3.1 Enzimas ativas em carboidratos (CAZymes)
De uma maneira geral, as enzimas envolvidas na clivagem de carboidratos complexos,
bem como as relacionadas à sua biossíntese, controlam o metabolismo dos carboidratos e são
denominadas de CAZymes (LOMBARD et al., 2014). As CAZymes são produzidas por um
amplo espectro de organismos, que as utilizam das mais diferentes formas para modificar os
carboidratos, seja na formação ou clivagem de ligações glicosídicas, o que permite, dentre
outras coisas, a biossíntese e degradação da celulose e de outros polissacarídeos (MUNIR et
al., 2014; OLIVEIRA et al., 2015).
As enzimas que compõem as CAZymes são classificadas com base na similaridade de
sequências e de estruturas protéicas e, de acordo com a base de dados CAZy
(www.cazy.org/), são ao todo 6 as suas principais classes. As glicosil hidrolases (GHs)
compõem um amplo grupo de enzimas responsáveis pela hidrólise e/ou rearranjo de ligações
glicosídicas; as carboidrato esterases (CEs) estão envolvidas na hidrólise de ésteres de
carboidratos; as glicosiltransferases (GTs) catalisam a formação de ligações glicosídicas
através da transferência de sacarídeos a uma variedade de aceptores; as polissacarídeo liases
(PLs) promovem a clivagem de ligações glicosídicas através de um mecanismo de
eliminação; as atividades auxiliares (AAs) são enzimas do tipo redox que agem em conjunto
com outras CAZymes na degradação da parede celular vegetal; e os módulos de ligação a
carboidratos (CBMs), que são domínios não catalíticos auxiliares, cuja função principal é a de
reconhecer e ligar-se especificamente a polissacarídeos, permitindo a sua hidrólise pelo
biocatalisador (CANTAREL et al., 2009; GUILLÉN; SÁNCHEZ; RODRIGUEZ-SANOJA,
2010; LEVASSEUR et al., 2013; LOMBARD et al., 2014; MUNIR et al., 2014; WEADGE;
PALCIC, 2008; YIP; WITHERS, 2006).
Uma gama de estudos metagenômicos têm relatado a contribuição e a diversidade de
CAZymes nos mais distintos ambientes, como no solo de uma plantação de pinheiros (UROZ
et al., 2013), na resposta do bacterioplâncton marinho após um bloom de diatomáceas
(TEELING et al., 2012) no rúmen de bovinos (BRULC et al., 2009; WANG et al., 2013; ) e
no intestino grosso de cupins (WARNECKE et al., 2007) e de humanos (KAOUTARI et al.,
2013). Mais ainda, pesquisas recentes têm direcionado o foco à descoberta e identificação de
novas CAZymes (BERGMANN et al., 2014; MATSUMURA et al. 2014; STROOBANTS;
PORTETELLE; VANDENBOL, 2014).
2.3.1.1 CAZymes que possuem atividade hidrolítica
As hidrolases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações covalentes da matéria
orgânica, geralmente convertendo uma molécula grande em duas unidades menores. A classe
das hidrolases contém mais de 200 enzimas que são classificadas de acordo com o substrato
alvo da sua ação, como por exemplo, o grupo das proteases ou peptidases, que agem sobre as
ligações peptídicas e as glicosidases (ou glicosil hidrolases) que têm sua ação sobre as
moléculas de açúcares em carboidratos (www.enzyme-database.org).
Na natureza, as hidrolases são produzidas por uma ampla diversidade de organismos,
desde bactérias a eucariotos superiores (MORENO et al., 2013), e são responsáveis por
funções degradativas importantes, como a clivagem de moléculas complexas que servirão
como fonte de carbono para a produção de energia (DOUGHERTY et al., 2012).
Uma importante fonte de hidrolases no meio ambiente são os microorganismos, que as
produzem e utilizam para a manutenção de diversas funções do seu metabolismo. Enzimas
hidrolíticas de diferentes tipos produzidas por microorganismos vêm sendo estudadas e
descritas na literatura. Na revisão de Moreno e colaboradores (2013), são mostrados os
resultados de diversos estudos focados na diversidade de bactérias halófilas com atividade
hidrolítica. Dentre os diferentes ambientes hipersalinos estudados, foram encontrados muitos
microorganismos (como por exemplo, dos gêneros Salicoca, Salinibacter e Pseudomonas)
produtores de lipases, proteases e amilases, entre outras enzimas hidrolíticas.
Na indústria, a maioria das enzimas utilizadas pertence ao grupo das hidrolases, as quais
têm sido incorporadas nos processos de degradação de várias substâncias naturais (KIRK;
BORCHERT; FUGLSANG, 2002). A revisão de Cherry e Fidantsef (2003) ressalta as
aplicações na indústria de alguns destes principais grupos de enzimas.
Dentro da classificação das CAZymes, as enzimas hidrolíticas são encontradas em duas
classes: na classe das carboidrato esterases (CEs) e das glicosil hidrolases (GHs). As
carboidrato esterases reúnem-se atualmente em 16 famílias envolvidas na desacetilação de
açúcares, reação que parece ter se desenvolvido para contornar a proteção conferida pela
presença de ésteres na parede celular vegetal (BIELY, 2012). A ação das carboidrato esterases
favorece a sacarificação enzimática - permitindo, portanto, a bioconversão da biomassa
vegetal - ao facilitar a ação das glicosil hidrolases na clivagem das ligações glicosídicas
presentes nos polissacarídeos vegetais complexos, como por exemplo, as hemiceluloses
(BIELY, 2012; CANTAREL et al., 2009; LI et al., 2009).
As glicosil hidrolases, por sua vez, agrupam-se em 133 famílias, constituindo a classe
mais ampla, diversificada e melhor caracterizada dentre as CAZymes (CANTAREL et al.,
2009; STROOBANTS; PORTETELLE; VANDENBOL, 2014). As famílias de glicosil
hidrolases são distribuídas de maneira bastante variável entre os organismos, compreendendo
uma ampla gama de atividades já descritas (SATHYA; KHAN, 2014). Dentre os principais
grupos de glicosil hidrolases, que participam da decomposição de polissacarídeos da parede
celular vegetal, estão as celulases, juntamente às hemicelulases e outras glicosil hidrolases
relacionadas (HIMMEL et al., 2010). As celulases pertencem a 12 famílias de GHs e, dentre
estas, as famílias GH9 e GH5 parecem ser as mais bem caracterizadas (SUKHARNIKOV et
al., 2011). Segundo Cherry e Fidantsef (2003), a aplicabilidade das celulases ocorre
principalmente na indústria têxtil, de papel e celulose, de detergentes e na alimentação
humana e animal. No entanto, mais recentemente, grandes esforços têm sido direcionados ao
estudo e prospecção destas enzimas para aplicação na conversão de biomassa vegetal em
biocombustíveis (BARNARD et al., 2010; SADHU; MAITI, 2013; WILSON, 2009).
2.3.1.1.1 As celulases
As celulases são um conjunto de enzimas pertencentes à classe das glicosil hidrolases
que são capazes de hidrolisar a celulose, o biopolímero mais abundante na natureza (LI et al.,
2009). Tais enzimas estão amplamente distribuídas entre os microorganismos, incluindo
fungos e bactérias, que são capazes de crescer em substratos celulósicos (KUHAD; GUPTA;
SINGH, 2011). Dentre as bactérias conhecidas por terem atividade celulolítica estão as
aeróbicas pertencentes aos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Cellulomonas e Acinetobacter, e
as anaeróbicas dos gêneros Clostridium, Fibrobacter e Acetivibrio, entre outros (KUHAD;
GUPTA; SINGH, 2011; SUKUMARAN; SINGHANIA; PANDEY, 2005).
As enzimas celulolíticas têm demonstrado seu vasto potencial biotecnológico,
evidenciado pelo crescente interesse na sua incorporação em processos industriais. Devido à
sua multiplicidade de aplicações - como no processamento do algodão, na reciclagem de
papel, na indústria de detergentes, na extração de sucos e na alimentação animal – as celulases
têm representado o terceiro maior grupo de enzimas interesse industrial no mundo, em
volume de dólares (WILSON, 2009). Espera-se que ocorra uma expansão ainda maior do
mercado de celulases, uma vez que estas podem ser utilizadas para converter a biomassa
lignocelulósica em açúcares, os quais, por sua vez, podem ser fermentados para produzir
bioetanol e outros produtos em larga escala (DUAN; FENG, 2010).
A aplicabilidade das celulases na produção de biocombustíveis está justamente no fato
de que essas enzimas catalisam a hidrólise de resíduos vegetais, cujo principal componente é a
celulose, produzindo assim açúcares fermentáveis, que podem ser utilizados na produção de
bioetanol. Geralmente este rejeito vegetal é aproveitado como adubo ou ração animal.
Atualmente, porém, tem se tornado uma fonte atrativa para a produção de bioetanol devido à
sua disponibilidade, abundância, baixo custo e o fato de não ser utilizado como fonte de
alimento humano (PHITSUWAN et al., 2012). Esses resíduos apresentam alto teor de
material vegetal e, por isso, a conversão de biomassa em bioetanol pode ser realizada através
da aplicação de hidrolases microbianas.
A despolimerização da celulose representa uma etapa de alto rendimento energético
para a fermentação. A degradação completa da celulose requer um complexo formado
principalmente por três classes enzimáticas, que devem atuar de maneira sinérgica (Figura 4).
Figura 4. Modelo simplificado da hidrólise enzimática da celulose. As endoglucanases são as primeiras a clivarem as regiões amorfas da celulose, gerando celooligossacarídeos. As celobiohidrolases (exoglucanases) atuam nos terminais não-redutores, gerando principalmente unidades de celobiose livres. Por fim, as β-glicosidases hidrolisam os produtos resultantes – celobioses e oligossacarídeos – em glicose. Fonte: Phitsuwan et al., 2012.
Este complexo é composto por endoglucanases, que hidrolisam randomicamente a fibra
de celulose nas ligações β-1,4 internas reduzindo o tamanho do polímero; exoglucanases, que
hidrolisam a celulose a partir dos terminais não-redutores, liberando unidades de celobiose; e
β-glicosidases, que clivam os oligossacarídeos ou as celobioses livres, gerando glicose (HAN;
YOO; KANG, 1995; LYND et al., 2002).
Segundo Duan e Feng (2010), apesar dos diversos estudos realizados acerca das
celulases, continua a existir uma crescente demanda por novas enzimas com melhores
propriedades catalíticas, como por exemplo, uma maior eficiência em substratos celulósicos
insolúveis, uma maior estabilidade em determinado pH e sob condições de temperaturas
elevadas.
Relatos como este reforçam a importância de pesquisas que envolvam a bioprospecção
de celulases e demais CAZymes, revelando o potencial biotecnológico existente na descoberta
de novos genes codificantes para estas enzimas, a partir de diferentes estratégias de estudo. A
bioprospecção de enzimas envolvidas no metabolismo da matéria orgânica parece ser uma
estratégia importante, tanto do ponto de vista da caracterização microbiana funcional, quanto
do seu potencial alcance biotecnológico.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Caracterizar a diversidade taxonômica e o potencial funcional da microbiota do solo e
da água doce de uma localidade da Caatinga, para buscar genes com possível atividade
hidrolítica e demais relacionadas à bioconversão lignocelulósica, que tenham potencial
aplicação na cadeia produtiva de bioetanol de segunda geração, através da abordagem
metagenômica.
3.2 Objetivos específicos:
1. Sequenciar o metagenoma da microbiota do solo e da água doce de uma região da
Caatinga baiana;
2. Caracterizar a diversidade taxonômica e o potencial funcional a partir dos
metagenomas da microbiota do solo e da água doce de uma região da Caatinga baiana;
3. Caracterizar a diversidade de hidrolases e demais enzimas relacionadas à
bioconversão lignocelulósica na microbiota do solo e da água doce desta região de Caatinga;
4. Identificar possíveis novas sequências de CAZymes com atividade hidrolítica e
outras também associadas à degradação da biomassa vegetal.
4. METODOLOGIA
4.1 Área de estudo e coleta das amostras de solo e de água
A coleta das amostras de solo e de água foi realizada na ecorregião da Chapada
Diamantina, mais especificamente na localidade da Toca do Morcego (Figura 5A-C). A
expedição ocorreu de 25 a 27 de fevereiro de 2013 e contou com o suporte técnico do Instituto
Chico Mendes de Conservação Ambiental (ICMBio).
Figura 5: Área de estudo. (A) Mapa do Parque Nacional da Chapada Diamantina (em verde), destacando a localidade da Toca do Morcego, onde foram coletadas as amostras; (B) Vista do rio Paraguaçu na Toca do Morcego; (C) Aspecto geral de um dos pontos de coleta das amostras de solo.
A coleta das amostras ocorreu no período de seca. Na maior parte do mês de fevereiro, a
temperatura na região da Chapada Diamantina ficou em torno dos 30ºC, tendo a umidade
sofrido uma ampla variação, de 54 a 98% durante este mês (Figura 6).
Em relação à precipitação pluviométrica, o período compreendido entre 25/01/2013 e
21/03/2013 foi considerado como um dos piores períodos de seca da região, apresentando
apenas cerca de 8mm de precipitação entre os dois meses considerados (Figura 7).
Figura 6. Variações de temperatura e de umidade referentes ao período de agosto/2012 a maio/2013 na Chapada Diamantina - Lençóis-BA, estação mais próxima dos pontos de coleta (Fonte: INMET).
Figura 7. Variação da precipitação pluviométrica entre os meses de agosto/2012 e maio/2013 na Chapada Diamantina - Lençóis-BA, estação mais próxima dos pontos de coleta (Fonte: INMET).
Em relação à flora na região de coleta das amostras, esta possui características dos
Campos Rupestres, com vegetação herbáceo arbustiva sobre afloramentos rochosos, com
adaptações para resistir à flutuações acentuadas de temperatura e umidade. As plantas exibem
características para resistir à perda de água, como folhas espessas e rígidas, cobertas pos cera
ou pêlos e podem possuir raízes modificadas em órgãos subterrâneos para armazenamento de
água e de nutrientes (PNCD).
Foram coletadas 3 amostras de solo, preservando uma distância de aproximadamente
100m entre elas. Cada amostra foi composta por solo recolhido em 3 pontos escolhidos de
maneira aleatória, dentro de uma área de aproximadamente 1m², numa profundidade máxima
de 8cm após a retirada da serrapilheira (Figura 6A-D). Foram coletados cerca de 200g de solo
por ponto (totalizando 600g por amostra), e este material foi acondicionado em sacos
plásticos estéreis e mantido sob refrigeração até o seu processamento. Parte das amostras de
solo coletadas foi utilizada para extração de DNA metagenômico, enquanto que o restante das
amostras foi encaminhado para análise físico-química. A caracterização físico-química do
solo foi realizada em colaboração com o Laboratório de Solos da CEPLAC.
Figura 8. Coleta das amostras de solo e esquema de filtração das amostras de água. (A) Aspecto geral do ponto de coleta 1; (B e C) Coleta no ponto 2; (D) Armazenamento do solo; (E) Esquema de filtração Niskin com filtros acoplados.
Em relação às amostras de água, foram coletadas 2 amostras em pontos distintos do rio
Paraguaçu, em uma profundidade de aproximadamente um metro, também na localidade da
Toca do Morcego. Este material foi filtrado em uma rede de 20µm e novamente filtrado em
três filtros de 0.22µm (Sterivex, Milipore, USA) por ponto de coleta. Filtrou-se 0.5 a 2L de
água por filtro de 0.22µm. O material coletado foi preservado em solução-tampão (20%
sacarose, 50 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0). A filtração foi realizada por pressão
positiva aplicada ao sistema de garrafas Niskin (Figura 6E). Os parâmetros físico-químicos
das amostras de água foram avaliados em colaboração com o Laboratório de Zooplâncton
Marinho (UFRJ).
4.2 Extração do DNA metagenômico
Para a realização da extração do DNA metagenômico das amostras de solo foi utilizado
um kit específico (PowerSoil DNA Isolation Kit da MO-BIO). O DNA foi extraído a partir de
0.25g de solo obtido de cada uma das 3 amostras, de acordo com as recomendações do
fabricante. A eficiência da extração foi posteriormente analisada em gel de agarose a 1% em
TAE 1X (p/v).
A extração do DNA metagenômico das amostras de água foi realizada em colaboração
com o laboratório de Enzimologia, no Instituto de Biologia, da Universidade de Brasília, a
partir de um protocolo já estabelecido no laboratório. O protocolo envolveu a extração do
DNA utilizando lisozima (1mg/mL na concentração final) por 45 minutos à 37ºC. Em seguida
foi adicionada proteinase K (0.2 mg/mL na concentração final) e SDS (1% na concentração
final) e as amostras foram incubadas por 60 minutos à 60ºC sob leve agitação a cada cinco
minutos. O lisado foi transferido para novos tubos e, em seguida, foi tratado com um volume
de fenol : clorofórmio : álcool isoamílico (25:24:1, Sigma) e depois com clorofórmio : álcool
isoamílico (24:1, Sigma). A precipitação foi realizada com etanol e acetato de sódio (3M
final) a -20ºC overnight. Após a precipitação, o DNA foi purificado com Power Clean DNA
Clean-Up Kit (MO-BIO) e submetido a um gel de agarose a 1% contendo brometo de etídeo
(2µg/mL) com marcador molecular 1kb plus (Invitrogen).
4.3 Sequenciamento dos metagenomas
As amostras contendo o DNA metagenômico obtido através da extração foram
encaminhadas ao Centro de Genômica de Alto Desempenho do DF, em Brasília, para
realização do sequenciamento, o qual foi conduzido utilizando-se o sistema Illumina MiSeq
de sequenciamento de nova geração (Illumina® Sequencing). Bibliotecas foram geradas
utilizando o kit Nextera (Nextera DNA Sample Preparation Kit, Illumina), segundo o
protocolo do fabricante. O DNA proveniente da fragmentação foi submetido às etapas de
purificação, ligação a adaptadores e quantificação, para então ser sequenciado no sistema
Illumina Miseq. A corrida foi paired-end 2x300pb para as amostras de solo e 2x250pb para as
amostras de água.
4.4 Anotação dos metagenomas pela tecnologia de subsistemas e análise estatística
Os metagenomas foram anotados utilizando o servidor MG-RAST (MetaGenomic
Rapid Annotation by Subsystem Technology), um sistema de genômica comparativa que
permite estudar a função e a composição de comunidades microbianas (MEYER et al., 2008).
O servidor oferece controle de qualidade, anotação, análise comparativa e arquivamento
automatizados. O fluxo de informações, bem como a interação com os dados e ferramentas de
análise, ocorre dentro de um ambiente virtual (SEED) (OVERBEEK et al., 2005). Este
ambiente abriga o servidor RAST que contém um banco de genomas completos anotados,
bem como a lista de subsistemas já caracterizados. Foram utilizados os parâmetros padrão de
qualidade do servidor, com exceção do lowest phred score que foi alterado para 20.
4.4.1 Análise taxonômica e do potencial funcional pela abordagem de subsistemas
Os perfis taxonômicos e funcionais foram gerados pelo MG-RAST através de uma
análise de similaridade entre as sequências submetidas contra um conjunto de bases de dados
não-redundantes incluindo o SEED, de subsistemas. A análise taxonômica foi baseada na
correlação entre as proteínas identificadas nos metagenomas e seu organismo de origem nas
bases de dados, permitindo o cálculo da abundância relativa de cada táxon obtido. Os táxons
foram identificados através do Best Hit Classification, utilizando como base de dados o
GenBank, e com os parâmetros E value <10-5, mínima identidade de 60% e comprimento
mínimo do alinhamento de 15 como cutoff. A classificação do potencial funcional dos
metagenomas foi realizada no MG-RAST através da anotação pela tecnologia de subsistemas,
utilizando a base de dados do SEED e também com os parâmetros E value <10-5, mínima
identidade de 60% e comprimento mínimo do alinhamento de 15 como cutoff.
Os dados taxonômicos e funcionais foram estatisticamente avaliados através da
comparação entre dois grupos (solo e água), no programa STAMP (Statistical Analyses of
Metagenomic Profiles) (PARKS et al., 2014). Para o perfil taxonômico, o teste estatístico
aplicado foi o teste t de Welch bicaudal, o teste de Welch invertido como método de intervalo
de confiança e o FDR de Storey (STOREY, 2002) como método de correção dos dados. Para
a análise do potencial funcional, foi também aplicado do teste t de Welch e o teste de Welch
invertido como método de intervalo de confiança. No entanto, como os valores de p não
estavam distribuídos uniformemente, o método FDR de Benjam-Hochberg foi utilizado para
correção. A diferença entre as abundâncias relativas foi considerada significativa para q<0.05.
As reads não classificadas foram removidas das análises.
4.5 Anotação dos metagenomas pela estratégia de domínios conservados
A segunda estratégia de anotação utilizada no presente estudo envolveu a busca das
CAZymes (Carbohydrate Active Enzymes) (LOMBARD et al., 2014) nos metagenomas do
solo e da água, a partir da assinatura dos domínios conservados de tais grupos de enzimas. A
anotação das CAZymes foi realizada localmente, a partir dos dados obtidos das etapas de
anotação no MG-RAST e com os perfis HMM das CAZymes, baixados no servidor dbCAN
(http://csbl.bmb.uga.edu/dbCAN/).
Foram acessadas as sequências submetidas à anotação no MG-RAST após a etapa de
Screening (remoção de reads quase idênticas a sequências de genomas de organismos-modelo
como por exemplo humanos e ratos), sendo obtido um arquivo multifasta contendo as
sequências de DNA de todas as amostras. Estas sequências foram traduzidas nas 6 janelas de
leitura utilizando o programa Transeq, do pacote EMBOSS (European Molecular Biology
Open Software Suite) (RICE; LONGDEN; BLEASBY, 2000). Em seguida, foram baixados
os perfis (domínios conservados) de todas as famílias de CAZymes já descritas no servidor
dbCAN. Foi então utilizado o programa hmmscan, do pacote de programas HMMER (FINN;
CLEMENTS; EDDY, 2011), que usou os perfis HMM das famílias de CAZymes baixados,
pra realizar uma busca contra o multifasta obtido do MG-RAST e traduzido, o qual funcionou
como uma “base de dados”, permitindo a anotação. A ideia principal do hmmscan é a de
utilizar perfis baseados nas cadeias ocultas de markov (HMM) como modelos na busca de
regiões conservadas homólogas na base de dados de interesse. O resultado do hmmscan
mostrou a quantidade de hits para CAZymes em cada ambiente, permitindo uma análise
quanto à distribuição das diferentes classes e famílias destas enzimas. Para determinar a
diferença entre a contribuição das CAZymes encontradas no solo e na água o teste ANOVA
um-fator foi aplicado, considerando o resultado estatisticamente significativo para p<0.05.
4.6 Análise taxonômica das CAZymes
Para realizar a análise taxonômica das reads associadas às CAZymes, a partir do
resultado do hmmscan foram recuperadas apenas as sequências que apresentaram hit com os
perfis HMM das enzimas. Tais sequências foram recuperadas a partir dos seus identificadores
(ID’s) no arquivo multifasta baixado do MG-RAST e traduzido. Posteriormente, essas
sequências foram comparadas contra a base de dados não redundante NR, utilizando o
algorítmo BLASTP (ALTSCHUL et al. 1997), para identificação de sua origem taxonômica.
O resultado do BLASTP foi então computado utilizando o programa MEGAN5.6.3
(MetaGenome Analyzer) (HUSON et al. 2007). Este programa utiliza-se do resultado do
BLAST contra bases de dados de referência (como NR, NT, ENV-NR, ENV-NT) para
calcular a classificação taxonômica das reads, possibilitando também uma classificação do
potencial funcional. A estimativa do perfil taxonômico das amostras é conseguida através de
algorítmos, que classificam as reads a partir da sua associação a um determinado grupo na
taxonomia do NCBI (NCBI taxonomy), baseando-se nos hits obtidos para sequências
conhecidas, os quais são registrados no arquivo de saída do BLAST.
4.7 Identificação de possíveis novas CAZymes nos metagenomas
O reconhecimento de possíveis novas sequências codificantes para CAZymes foi
conseguido através do emprego de dois códigos (scripts). O primeiro utilizou o arquivo
FASTA dos metagenomas (traduzido) e os dados provenientes do BLASTP para gerar uma
tabela, contendo as porcentagens de cobertura da query (sequência de interesse) e as
porcentagens da identidade do alinhamento. A cobertura indica a porcentagem da sequência
oriunda da base de dados que é coberta por resíduos correspondentes da sequência query
(www.alphalyse.com). A identidade do alinhamento, por sua vez, aponta a porcentagem de
resíduos idênticos nas mesmas posições no alinhamento entre duas sequências (
www.ncbi.nlm.nih.gov/). O segundo código foi utilizado para plotar os dados resultantes da
tabela no programa R (R Development Core Team, 2008), permitindo a visualização gráfica
da cobertura da query (%) vs. a identidade do alinhamento (%).
As etapas in silico foram executadas durante um treinamento na Unidade Multiusuários
de Genômica Funcional e Estrutural (UFRJ). Os dados referentes aos itens 4.5, 4.6 e 4.7
foram analisados através de expressões regulares que constam no Apêndice desta dissertação.
5. RESULTADOS
5.1 Parâmetros físico-químicos das amostras de solo e de água
A tabela 1 mostra o resultado da análise físico-química para as amostras de solo. Os
parâmetros revelam que o solo desta região da Chapada Diamantina pode ser classificado
como muito fortemente ácido (pH 4.5-5.0) (USDA - The U.S. Department of Agriculture) e
possui características mais arenosas. Em grande parte da porção leste da Chapada Diamantina,
onde foram coletadas as amostras de solo, existem áreas nas quais predominam os
Espodossolos (medianamente profundos, bem drenados, textura argilosa e fertilidade média) e
os Latossolos (profundos, bem drenados, ácidos e de fertilidade baixa) (VELLOSO et al.,
2002). Uma das amostras de solo apresentou valores mais discrepantes em relação às outras
duas amostras coletadas, o que acarretou nos altos desvios-padrão encontrados para alguns
dos parâmetros analisados. Estes desvios já eram de certa forma esperados devido à
hetereogeneidade do ambiente de solo amostrado, como pôde ser observado na figura 6, na
seção 4.1 da Metodologia.
A tabela 2, por sua vez, apresenta o resumo dos parâmetros físico-químicos obtidos
para as amostras de água. Pode-se observar que, para os dados analisados, nenhuma das
concentrações dos nutrientes que provavelmente têm origem/atividade antropogênica está
acima do permitindo pela resolução nº 357 do CONAMA que dispõe, dentre outras coisas,
sobre a classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais para seu enquadramento.
5.2 Características gerais da anotação dos metagenomas
O sequenciamento do DNA resultou em aproximadamente 6.3 milhões de sequências a
partir das amostras de solo, com um comprimento médio de 242pb (pares de bases) e 1.5
milhão de sequências a partir das amostras de água, com comprimento médio de 246pb
(Tabela 3). Cerca de 97% das sequências submetidas a partir das amostras de solo, e 84% das
submetidas a partir das amostras de água, mantiveram-se após a etapa de controle de
qualidade do servidor MG-RAST.
Foram preditas um total de 1.96 milhão de proteínas para o solo (41.6% do total de
reads), sendo que cerca de 76% destas proteínas foram anotadas em categorias funcionais.
Para as amostras de água, foram preditas 362.729 proteínas (37% do número total de
sequências), tendo 85% das sequências sido identificadas funcionalmente. Dentre todas as
sequências analisadas, para ambos ambientes, mais de 55% não possuem similaridade às
bases de dados de proteínas associadas ao servidor MG-RAST.
5.3. Análise comparativa dos perfis funcionais
Os perfis funcionais observados para o solo e para a água se assemelharam em alguns
aspectos - quando considerados de maneira mais global - porém diferiram à medida que uma
análise mais detalhada foi conduzida. Este fato pode ser observado através da análise das duas
Amostras Solo Água
1
(4566398.3) 2
(4566399.3) 3
(4567013.3) 1
(4566739.3) 2
(4566680.3) Contagem das sequências
903.004 2.531.434 2.094.312 748.085 707.145
Número de sequências após o controle de qualidade
894.648 (99.1%)
2.466.863 (97.4%)
1.984.723 (94.8%)
696,806 (93.1%)
595.678 (84.2%)
Comprimento médio das sequências (pb)
262 ±106 259 ±118 204±117 261±106 231±112
Sequências protéicas identificadas
363.839 (42.6%)
961.753 (43.2%)
636.058 (39.25%)
202.091 (38%)
160.638 (36.3%)
Sequências sem similaridade à base de dados do SEED
490.549 (57.4%)
1.264.869 (56.8%)
988.482 (60.8%)
329.876 (62%)
281.965 (63.7%)
Sequências protéicas anotadas em categorias funcionais
279.477 (76.8%)
735.710 (76.5%)
484.191 (76.1%)
171.693 (85%)
136,958 (85.3%)
Tabela 4. Dados gerais da anotação dos metagenomas no servidor MG-RAST.
estratégias de anotação utilizadas e que serão apresentadas a seguir: a anotação baseada na
tecnologia de subsistemas e a anotação pela abordagem de domínios conservados.
5.3.1 Comparação entre o solo e a água quanto à distribuição dos subsistemas
A anotação dos metagenomas no servidor MG-RAST, utilizando a base de dados do
SEED, de subsistemas, permitiu realizar uma análise do potencial funcional das sequências
obtidas do solo e da água, plotada através do programa STAMP. Foram identificados um total
de 28 subsistemas nos metagenomas provenientes dos ambientes estudados, e observou-se
que existem diferenças entre os subsistemas de nível 1 mais abundantes nos dois (Figura 7A).
Nas as amostras de solo, o subsistema de Carboidratos foi o mais abundante, com uma
média de 16.89%, seguido dos subsistemas Clustering-based (aqueles que possuem genes que
são encontrados próximos uns dos outros no genoma de diversos táxons, porém sua função
ainda não é bem compreendida), com 13.81%. O subsistema de Aminoácidos e Derivados foi
o terceiro que mais contribuiu, apresentando uma abundância de 11.18%. Para as amostras de
água, houve uma inversão na ordem entre os mais abundantes: primeiramente têm-se os
subsistemas Clustering-based (14.57%), seguido do subsistema de Carboidratos (11.55%) e
então de Aminoácidos e Derivados, com 9.62% de abundância relativa.
Comparativamente, o solo apresentou uma abundância significativamente maior do
subsistema de Carboidratos, assim como o de Respiração, Metabolismo de Compostos
Aromáticos, Metabolismo Secundário, Metabolismo de Enxofre e Resposta ao Stress (Figura
7B). A água, por sua vez, mostrou-se como um ambiente com uma abundância
significativamente maior de subsistemas como o de Metabolismo de RNA, Ciclo e Divisão
Celular, Parede Celular e os subsistemas Clustering-based.
Figura 9. Comparação dos perfis funcionais do solo e da água pela abordagem de subsistemas. (A) O heatmap retrata os subsistemas de nível 1 encontrados nas amostras dos dois ambientes. As duas primeiras linhas verticais correspondem aos metagenomas da água e as três últimas, do solo. Os quadrados preenchidos em escala de azul representam a abundância de cada subsistema para cada metagenoma. O dendograma na parte superior mostra o agrupamento das amostras, de acordo com a distribuição dos subsistemas e o dendograma à esquerda mostra como os subsistemas estão agrupados, de acordo com sua coocorrência nos metagenomas. (B) Subsistemas de nível 1 significativamente diferentes entre o solo e a água (p<0.05), analisados pelo STAMP.
5.3.2 Comparação entre os dois ambientes quanto à contribuição das CAZymes
O subsistema de Carboidratos revelou-se como um componente de grande importância
tanto para o ambiente de solo quanto para a água. A análise dos metagenomas quanto à
distribuição de enzimas relacionadas ao metabolismo de carboidratos, as CAZymes, mostrou
que existem diferenças na contribuição das classes e famílias dessas enzimas entre os dois
ambientes. Foram encontradas um total de 10.081 reads associadas a CAZymes na água e
61.603 no solo. Nas figuras 8 e 9 é possível observar a representatividade de cada classe de
CAZymes e das famílias pertencentes a estas classes, no solo e na água, respectivamente.
5.3.2.1 Análise comparativa entre o solo e a água para o nível classes
Em relação às classes, as glicosil hidrolases (GHs) foram as mais abundantes no solo,
com 44.68% de abundância, seguida das glicosil transferases (GTs) com 32.15% (Figura 8).
Com menor representatividade estão as classes das carboidrato esterases (CEs), com 9.77%,
das atividades auxiliares (AAs), com 8.52% de abundância, dos módulos de ligação a
carboidratos (CBMs), com 3.94% e, por fim, a classe das polissacarídeo liases (PLs), com
0.92% de abundância.
Figura 10. Composição das CAZymes no solo e na água. Os gráficos mostram a abundância relativa das 6 classes de CAZymes para cada um dos ambientes. GH (Glicosil Hidrolase); GT (Glicosil Transferase); CE (Carboidrato Esterase); AA (Atividades Auxiliares); CBM (Módulos de Ligação a Carboidratos) e PL (Polissacarídeo Liases). As classes GH e CBM foram significativamente mais abundantes no solo, enquanto que a classe GT teve representatividade maior na água (p<0.05), com aplicação da ANOVA um-fator (ambiente). Para as demais classes não houve diferença estatística.
Por outro lado, nas amostras de água, a classe de CAZymes que apresentou maior
abundância foi a das GTs (49.42%), seguida das GHs (31%), AAs (8.42%), CEs (8.39%),
CBMs (1.73%) e PLs (0.96%). As classes GH e CBM apresentaram abundância
significativamente maior no solo em relação à água, enquanto que nesta, a representatividade
das GTs foi significativamente maior (p<0.05). Para as demais classes, não houve diferença
estatisticamente significativa entre os ambientes.
5.3.2.2 Comparação entre o solo e a água quanto às famílias de CAZymes encontradas
No que diz respeito às famílias de CAZymes, os gráficos de barras empilhadas da figura
9 mostram a fração das famílias encontradas, nos ambientes de solo e de água, que tiveram
maior contribuição em termos de abundância relativa, para cada uma das 6 classes
anteriormente descritas.
Em relação às CAZymes pertencentes à classe das glicosil hidrolases, foram
encontradas um total de 110 famílias nos dois ambientes, com 27.676 reads identificadas no
solo e 3.125 na água. Destas 110 famílias, estão sendo mostradas na figura 9 as 11 mais
abundantes, que contribuem com aproximadamente 35% do total de GHs no solo e 45% na
água. A família GH13 foi a que teve a maior representatividade dentre o total de GHs
encontradas nas amostras de solo, cerca de 9.4% de abundância relativa, seguida de GH15
com 6.4% e GH3 com 5.1% de abundância. Já para as amostras de água, houve maior
contribuição da família GH23 (com 9.3%), seguida de GH13, GH1 e GH3 com
aproximadamente 6% cada.
Dentre as demais famílias de CAZymes encontradas, as pertencentes à classe das
glicosil transferases estão mais relacionadas à biossíntese de carboidratos do que à sua
degradação. Foram encontradas um total de 72 famílias de GTs nos ambientes (19.819 reads
no solo e 4.977 na água), sendo que as 12 famílias mais frequentes (Figura 9), contribuíram
com 80% do total de GTs no solo e 84% na água. As famílias mais abundantes em ambos
foram GT4, GT2 e GT41. A família GT4 apresentou uma abundância de aproximadamente
18% do total de GTs no solo e 13% na água, enquanto que para GT2 a representatividade foi
de 15% no solo e 12% na água e, por fim, GT41 com 14.1% no solo e 22.7% de abundância
na água.
As carboidrato esterases são enzimas que catalisam a desacetilação de açúcares
substituídos, ou seja, ésteres ou amidas nos quais o açúcar desempenha o papel do álcool e da
amina (BIELY, 2012). Foram encontradas um total de 16 famílias de CEs (6.011 reads no
solo e 852 na água) e, dentre estas, as 12 famílias mais frequentes somaram aproximadamente
Figura 11. Contribuição das famílias mais abundantes de CAZymes, pertencentes a cada classe, para ambos os ambientes. Os gráficos de barras empilhadas mostram a média da abundância relativa encontrada para cada família, no solo e na água.
95% do total das CEs identificadas. A família com maior contribuição nos dois ambientes foi
a CE10 sendo que, no solo, sua contribuição dentre o total das carboidrato esterases foi de
33.4%, enquanto que na água foi de 30.3%. A família CE11 também teve grande
representatividade na água, com uma abundância relativa de 25.7%.
As famílias da classe das atividades auxiliares compreendem enzimas que estão
potencialmente envolvidas na conversão de material lignocelulósico, mas através de uma via
oxidativa e não hidrolítica. Dez famílias de AAs foram encontradas no solo e na água (com a
identificação de 5.079 e de 850 reads, respectivamente) e a que apresentou maior abundância
em ambos os ambientes foi a família AA3, com 43.8% de abundância relativa no solo e 45%
na água.
A classe dos complexos de ligação a carboidratos (CBM) compreende proteínas não
catalíticas, que são capazes de se ligar a carboidratos cristalinos e solúveis, sendo geralmente
encontradas com outras classes de CAZymes aumentando a atividade catalítica dessas
enzimas. Os CBMs representaram um total de aproximadamente 4% das CAZymes no solo
(com 2.457 reads) e 2% na água (174 reads), sendo distribuídos em 42 famílias. As 12
famílias mais abundantes contribuíram com 83.4 e 84.4% do total de CBMs no solo e na
água, respectivamente. Dentre todas as famílias encontradas, as que obtiveram maior
representatividade na água foram a CBM50, com 20.8% de abundância relativa, seguida de
CBM48, com 18.9%. Já para o solo, a mais abundante foi a foi a CBM48, com 20.8%,
seguida de CBM13, com 18.5%.
As polissacarídeo liases, que tiveram uma baixa representatividade tanto nos
metagenomas de solo quanto da água (menos de 1% em cada ambiente), são enzimas que
clivam certas ligações glicosídicas presentes em polissacarídeos acídicos (YIP; WITHERS,
2006). Dentre as 18 famílias de PLs encontradas (totalizando 549 reads no solo e 98 na água),
as 10 mais abundantes representaram aproximadamente 97 e 94% das PLs detectadas,
respectivamente, em cada ambiente. A família PL22 foi a mais abundante para os dois locais,
com 36.8% de abundância no solo e 58% na água.
5.4 Comparação dos perfis taxonômicos
A caracterização taxonômica da estrutura da comunidade microbiana revelou, como
esperado, que existem perfis distintos para o solo e para a água desta região de Caatinga, no
que diz respeito às classes de microorganismos que compõem estes ambientes. Mais ainda, a
distinção entre os perfis encontrados pôde ser observada em dois níveis que serão
apresentados a seguir: através da comparação entre as estruturas das comunidades
microbianas totais e através da análise comparativa dos táxons que, especificamente,
contribuíram para as sequências identificadas como CAZymes nos dois ambientes.
5.4.1 Análise comparativa da estrutura da comunidade microbiana total
Os perfis taxonômicos das comunidades microbianas do solo e da água, computados
através do MG-RAST, utilizando como base de dados o GenBank, podem ser observados na
figura 10. Estão sendo representadas as 11 classes mais abundantes em cada ambiente, que
correspondem a aproximadamente 88% do total de classes encontradas no solo e 94% na
água. Em relação ao solo, as classes com maior abundância foram Actinobacteria (pertencente
ao filo homônimo) com 45.4%, seguida de Alphaproteobacteria, com 14.5%. Foram
identificadas também as classes Solibacteres (6.2%), Acidobacteriia (5.9%),
Betaproteobacteria (4.5%), Gammaproteobacteria (3.2%), Deltaproteobacteria (2.9%),
Ktedonobacteria (1.6%), Planctomycetia (1.8%), Clostridia (1.32%) e Sphingobacteriia
(0.28%).
Figura 12. Perfil da comunidade microbiana total nos ambientes de solo e de água para o nível taxonômico Classe. As sequências foram anotadas através do servidor MG-RAST, utilizando o GenBank como base de dados, e analisadas pelo STAMP (p<0.05).
Já para as amostras de água, a classe com grande predominância foi Betaproteobacteria,
pertencente ao filo Proteobacteria, com 67.5% de abundância relativa. Foram também
encontradas nas amostras de água as classes Alphaproteobacteria (10.8%), Actinobacteria
(5.7%), Gammaproteobacteria (4.8%), Deltaproteobacteria (1.5%), Sphingobacteriia (0.81%),
Clostridia (0.75%), Acidobacteriia (0.7%), Solibacteres (0.7%), Planctomycetia (0.53%) e
Ktedonobacteria (0.1%). Apenas a classe Aplhaproteobacteria não foi significativamente
distinta entre os ambientes. Em relação às demais, o solo teve uma contribuição maior de
Actinobacteria, Solibacteres, Acidobacteriia, Deltaproteobacteria, Ktedonobacteria,
Planctomycetia e Clostridia. Na água, por sua vez, as classes Betaproteobacteria,
Gammaproteobacteria e Sphingobacteriia foram significativamente mais representativas
(p<0.05).
5.4.2 Comparação dos perfis das comunidades microbianas associadas às CAZymes
A realização do BLASTP entre as sequências de CAZymes e a base de dados NR (não-
redundante) permitiu identificar a origem taxonômica destas enzimas, nas amostras de solo e
de água (Figura 11). O táxon com maior abundância relativa no ambiente de solo foi
Planctomycetia (29%), enquanto que para a água, houve uma maior representatividade de
Alphaproteobacteria (27%). Foram também associadas às CAZymes as classes Cytophagia
(com 17% de abundância no solo e 11% na água), Spirochaetia (16% no solo e 18% na água),
Deltaproteobacteria (com 10% e 7% respectivamente), Betaproteobacteria (com 6% e 12%),
Chloroflexia (com 3% e 1%), Flavobacteriia (com 1% e 2%) e Gammaproteobacteria, com
1% de abundância relativa em ambos os ambientes.
5.5 Identificação de possíveis novas sequências de CAZymes no solo e na água
A comparação dos dados das sequências metagenômicas do solo e da água, com as
sequências protéicas de referência da base de dados NR, através do BLASTP, permitiu
reconhecer possíveis novas CAZymes nos metagenomas (Figura 12A e B).
De uma maneira geral, para ambos os ambientes, a maioria das sequências de CAZymes
recuperadas possuem uma alta identidade (maior do que 50%), em relação às sequências de
aminoácidos da base de dados analisada. Entretanto, dentre este total de reads identificadas
para as CAZymes, no solo e na água, foram encontradas sequências aparentemente pouco
relacionadas às já existentes. Tais sequências, que quando comparadas àquelas depositadas na
base de dados NR, apresentaram uma alta cobertura (>70%), porém uma baixa identidade
(<40%), podem, possivelmente, representar novas CAZymes.
Figura 13. Contribuição dos táxons (Classes) para as sequências identificadas como CAZymes nos ambientes do solo e da água. Foi realizado um BLASTP entre as sequências de CAZymes encontradas e a base de dados NR (não-redundante), permitindo a identificação dos táxons. O resultado foi analisado utilizando o software MEGAN.
Figura 14. Possíveis novas sequências de Cazymes identificadas nos metagenomas do solo (A) e da água (B). A realização do BLASTP contra a base de dados NR permitiu inferir a existência de novas sequências putativas para CAZymes, com base na relação entre a identidade do alinhamento e a cobertura das sequências-alvo (query). As sequências que apresentaram uma alta cobertura (>70%), porém baixa identidade (<40%), foram atribuídas a possíveis novas sequências de CAZymes (região evidenciada em branco). A escala numérica corresponde à quantidade de sequências presentes em cada ponto no gráfico, de maneira que uma maior intensidade de cor significa um maior número de sequências, num determinado ponto considerado.
6. DISCUSSÃO
Embora o solo seja um dos principais focos da metagenômica funcional
(HANDELSMAN, 2005), ainda são parcos os trabalhos que visam a bioprospecção de
enzimas do solo da Caatinga brasileira. Um cenário ainda mais restrito ocorre para ambientes
de água doce - incluindo os da Caatinga - nos quais até mesmo a caracterização da
diversidade microbiana ainda é subexplorada. Segundo Wetzel (2000), menos de 10% dos
dados limnológicos disponíveis dizem respeito aos vírus, bactérias, fungos e protistas e seus
processos metabólicos nestes ambientes aquáticos. Uma das evidências de que o
conhecimento sobre microorganismos de água doce é ainda inferior, em relação aos
marinhos, reside na escassez de sequências depositadas em bases de dados para bactérias de
água doce (GHAI et al., 2011).
No presente estudo, mais da metade das sequências obtidas tanto no ambiente do solo
como da água foram classificadas como sequências desconhecidas, através da anotação no
MG-RAST. Esta baixa similaridade das sequências com as bases de dados de referência do
servidor já é um fato esperado, e deve-se provavelmente ao viés associado a estas, fator que
em última instância reflete a escassez de sequências genômicas microbianas depositadas para
diversos tipos de ambientes. O viés associado às bases de dados reside no fato de que estes
dependem de sequências de origem e função gênicas já descritas, as quais, muitas vezes,
pertencem a microorganismos modelo ou cultiváveis (SIMON; DANIEL, 2009). Sendo
assim, por não encontrarem sequências similares nas bases de dados, até 90% das reads de um
conjunto de dados metagenômicos podem permanecer desconhecidas (HUSON et al., 2007).
6.1 Comparação dos perfis funcionais quanto à representatividade dos subsistemas
Para as sequências que foram atribuídas a categorias funcionais, a estratégia de anotação
pela tecnologia de subsistemas permitiu observar um perfil do potencial funcional com
algumas similaridades entre o solo e a água, mas também podem ser destacadas
particularidades. Os subsistemas mais abundantes nos dois ambientes foram os de
Carboidratos e os Clustering-based (sendo que o primeiro foi o mais representativo no solo, e
o segundo, na água). Em relação ao solo, estes resultados se assemelham aos encontrados por
Delmont e colaboradores (2012), que realizaram um estudo metagenômico numa região de
pastagem natural. Dentro do nível hierárquico mais abrangente dos subsistemas (nível 1), os
subsistemas Clustering-based e o de Carboidratos foram os que obtiveram a maior quantidade
de reads associadas, cerca de 17 e 14%, respectivamente. Pacchioni e colaboradores (2014)
também encontraram os subsistemas Clustering-based e de Carboidratos como mais
representativos, tanto nos solos da Mata Atlântica quanto da Caatinga que foram analisados,
não tendo havido uma diferença discrepante entre as proporções desses subsistemas nos dois
ambientes.
Para Delmont e colaboradores (2012), a relativamente alta abundância dos subsistemas
Clustering-based nas amostras sequenciadas sugere que eles têm um papel chave nos
ecossistemas de solo ao redor do mundo, e devem ser explorados no intuito de melhor
entender a composição destes ecossistemas.
Dinsdale e colaboradores (2008), por sua vez, realizaram um estudo de metagenômica
comparativa com quase 15 milhões de sequências de 9 biomas distintos, incluindo amostras
marinhas, de lagoas hipersalinas e de água doce, entre outros. Os autores encontraram que a
maior porcentagem das sequências, em média, estava associada ao subsistema de
Carboidratos (17.218%), seguido do subsistema de Aminoácidos e Derivados (12.036%),
numa análise combinada dos biomas. Resultado semelhante foi encontrado por Breitbart e
colaboradores (2009), ao compararem as funções metabólicas dos microbialitos com as de
ecossistemas de água doce e marinhos. O subsistema de Carboidratos seguido do de
Aminoácidos e Derivados apresentaram a maior porcentagem de sequências associadas
(aproximadamente 18 e 14%), tanto no metagenoma dos microbialitos quanto nos
metagenomas provenientes da água doce e marinhos.
A análise comparativa entre os ambientes mostrou que os subsistemas Clustering-based
e os relacionados ao Metabolismo de RNA, Ciclo e Divisão Celular e Parede Celular e
Cápsula foram significativamente mais frequentes nas amostras de água, enquanto que os
subsistemas de Carboidratos, de Metabolismo Secundário, de Resposta ao Stress,
Metabolismo de Enxofre, Respiração e Metabolismo de Compostos Aromáticos foram mais
abundantes no solo. As condições mais arenosas do solo desta região Caatinga - que leva a
uma baixa retenção hídrica e de nutrientes - a alta incidência de radiação UV e a existência de
períodos de estiagem podem explicar a maior representatividade, no solo, dos genes
relacionados à resposta ao stress, ao metabolismo secundário e à respiração.
A atividade dos microorganismos no solo é também influenciada por outros fatores
como por exemplo, as plantas (GRAYSTON et al., 1998). As raízes das plantas liberam uma
grande variedade de compostos que incluem etileno, açúcares, vitaminas, aminoácidos, ácidos
orgânicos, polissacarídeos e enzimas (GARBEVA; VAN VEEN; VAN ELSAS, 2004). Estes
e outros exsudatos podem ser utilizados como fonte de carbono pelos microorganismos
(BULGARELLI et al., 2013), o que pode explicar a maior ocorrência do subsistema de
Metabolismo de Compostos Aromáticos no solo em relação à água. A maior presença de
matéria orgânica proveniente da vegetação pode explicar a maior contribuição do subsistema
de Carboidratos no solo, no qual, ao realizar uma análise mais detalhada, sobressaíram-se os
subsistemas de nível 2 relacionados à Fermentação, ao Metabolismo de Polissacarídeos e de
outros açúcares (dados não mostrados).
No que diz respeito às amostras de água, segundo GHAI e colaboradores (2014), apesar
da importância ecológica e de saúde pública da microbiota de água doce, estes
microorganismos têm recebido relativamente pouca atenção dos microbiologistas. Tal fator
pode estar relacionado à maior abundância dos subsistemas Clustering-based (que possuem
genes acoplados funcionalmente, porém com função ainda desconhecida) nesse ambiente. No
presente estudo, a classe predominante nas amostras de água foi Betaproteobacteria e, dentro
desta, o gênero Polynucleobacter teve a maior representatividade, com abundância de 52%
considerando apenas os gêneros pertencentes à classe e de 34.2% no total de gêneros
encontrados (dados não mostrados). A grande contribuição deste gênero pode explicar a maior
abundância dos subsistemas de Metabolismo de RNA (com genes envolvidos no
processamento e modificação do RNA), Parede Celular e Cápsula (com genes relacionados
aos componentes de paredes celulares gram-negativas) e Ciclo e Divisão Celular. De acordo
com Wu e Hahn (2006), Polynucleobacter representa um grupo de distribuição cosmopolita
em ambientes de água doce como rios e lagos. A espécie Polynucleobacter necessarius, por
exemplo, possui organismos tanto endossimbiontes obrigatórios (P. n. necessarius) quanto
bactérias de vida livre (P. n. asymbioticus) que são heterotróficas, gram-negativas e de habitat
planctônico, podendo compreender de <1% a 70% do total do bacterioplâncton em ambientes
de água doce (HAHN et al., 2012; WU; HAHN, 2006). Segundo HAHN (2003), uma das
características necessárias para o estabelecimento de populações de bactérias de vida livre,
que contribuem para uma grande fração do bacterioplâncton, é seu menor tamanho. Os
autores descreveram que as bactérias da espécie Polynucleobacter necessarius de vida livre
possuem um menor tamanho em relação a outras bactérias (<0.1 μm3), o que permite
minimizar sua vulnerabilidade frente a predadores e pode explicar a maior representatividade
destes microorganismos de tamanho reduzido no bacterioplâncton. Num estudo conduzido
por Boscaro e colaboradores (2013), foi realizada uma análise comparativa entre as
subespécies de Polynucleobacter necessarius e, para a subespécie de vida livre, características
como o crescimento lento, um genoma compacto, especializado e de flexibilidade metabólica
reduzida foram relatadas. Essas características podem explicar os resultados encontrados neste
estudo: a maior representatividade, na água doce, de subsistemas de metabolismo de RNA
(relacionados ao seu processamento e modificação para uma maior especialização
metabólica); dos subsistemas de Parede Celular e Cápsula (paredes gram-negativas
características do gênero) e dos subsistemas de Ciclo e Divisão Celular, devido ao
crescimento lento destas bactérias que apresentam dominância populacional na água doce.
6.2 Comparação do potencial funcional quanto à contribuição das CAZymes no solo e na água
Os resultados da anotação pela tecnologia de subsistemas confirmaram que o
metabolismo de carboidratos é um subsistema importante na manutenção das comunidades
microbianas do solo e da água em diversos ecossistemas, evidência que pode ser observada
pela sua representatividade tanto nas amostras analisadas quanto nos estudos comparados.
Considerando o metabolismo de carboidratos e dada a importância biotecnológica da
degradação de matéria orgânica, em especial a de material lignocelulósico, a segunda
estratégia de anotação realizada permitiu identificar a composição das CAZymes em dois
níveis hierárquicos de organização que serão em seguida apresentados: as classes, que
compõem o nível mais geral e abrangente e as famílias, que reúnem-se de maneira mais
específica com base na similaridade de sequências e de estruturas protéicas (www.cazy.org).
6.2.1 Representatividade das diferentes classes de CAZymes nos ambientes
A análise de sequências putativas de CAZymes nos metagenomas revelou a maior
presença da classe das glicosil hidrolases no solo (~45%) e das glicosiltransferases na água
(~50%). As GHs já foram encontradas como a classe de CAZymes significativamente mais
abundante no horizonte orgânico do solo (~33%), em relação ao mineral (~28%), em uma
plantação de pinheiros, revelando a especialização dos microrganismos habitantes desse
horizonte na degradação de moléculas de carboidratos complexas (UROZ et al., 2013).
De fato, as glicosil hidrolases compreendem um grande grupo de enzimas que, ao
possibilitarem o metabolismo de polissacarídeos como o amido, a celulose, o xilano e a
quitina, viabilizam o crescimento bacteriano no ambiente (BERLEMONT; MARTINY,
2015). Devido à abundância e ampla distribuição dos genes codificantes pra GHs nos
genomas, a classe se tornou a mais bem caracterizada, dentre o conjunto de enzimas que
compreendem as CAZymes (CANTAREL et al, 2009). Diversos estudos têm mostrado o
potencial biotecnológico deste amplo grupo de enzimas, como a aplicação na indústria
alimentícia, na produção de aditivos para alimentação animal, na fabricação de papel e fibras,
de detergentes e, em especial, na degradação de biomassa lignocelulósica para produção de
biocombustíveis (HIMMEL et al., 2010; LYND et al., 2002; PAËS; BERRIN;
BEAUGRAND, 2012; PHITSUWAN et al., 2012; SATHYA; KHAN, 2014; STROOBANTS;
PORTETELLE; VANDENBOL, 2014; WILSON, 2009).
Além das GHs, os CBMs também foram significativamente mais frequentes no solo em
relação à água. Esta classe de CAZymes possui módulos não-catalíticos, os quais interagem e
ligam-se a polissacarídeos como o amido, a celulose e o xilano (OH et al., 2015). O principal
papel dos CBMs é o de reconhecer e ligar-se de maneira específica aos carboidratos, o que
pode resultar em diferentes funções como aumentar a hidrólise de substratos insolúveis,
aproximar o domínio catalítico do substrato e promover a ruptura da estrutura polissacarídica
(BORASTON et al., 2004; GUILLÉN; SÁNCHEZ; RODRÍGUEZ-SANOJA, 2010). A maior
presença desta classe de CAZymes no solo em detrimento à água faz sentido dada à sua ação
conjunta com as glicosil hidrolases, que também foram dominantes no solo. Os CBMs podem
associar-se aos carboidratos complexos presentes no solo, permitindo um aumento da
eficiência catalítica das glicosil hidrolases na degradação destas moléculas.
As glicosiltransferases representaram aproximadamente 50% do total de CAZymes
encontradas na água, sendo o único grupo cuja contribuição foi significativamente maior nos
metagenomas da água em relação ao solo. Esta classe de CAZymes compreende enzimas
responsáveis pela biossíntese de carboidratos complexos a partir de doadores de açúcares
ativados, os quais podem ser açúcares ligados a nucleotídeos (a maioria), a fosfatos ou
fosfatos lipídicos (LAIRSON et al., 2008). Os aceptores da reação podem ser carboidratos,
proteínas, lipídios, DNA e diversas moléculas menores como antibióticos e esteróides, o que
faz com que seus produtos compreendam a maior classe de compostos naturais encontrados
na natureza (PALCIC, 2011; WEADGE; PALCIC, 2008). Os resultados obtidos no presente
trabalho indicam que o ambiente de água doce desta região de Caatinga possui um maior
potencial de biossíntese de compostos sacarídicos e de glicosilação de pequenas moléculas,
em detrimento ao potencial de clivagem e degradação da matéria orgânica, que foi melhor
observado no solo, devido à predominância de GHs.
Juntamente com as GHs, as polissacarídeo liases são enzimas que também participam
do processo de degradação de polissacarídeos (HIMMEL et al., 2010). No entanto, as PLs
clivam os polissacarídeos por um mecanismo de eliminação ao invés da hidrólise, ou seja, a
quebra catalisada pelas PLs ocorre sem a intervenção de moléculas de água (LOMBARD et
al., 2010). Apenas uma diminuta fração de PLs foi encontrada no solo e na água (menos de
1%), o que indica a pequena contribuição deste mecanismo de degradação em ambos os
ambientes analisados.
As carboidrato esterases compõem, por sua vez, um grupo de CAZymes que remove
substituintes ésteres das cadeias de glicano e assim facilitam a ação das GHs e PLs
(CANTAREL et al., 2009; KAOUTARI et al., 2013). Estas enzimas parecem ter evoluído no
sentido de contornar a complexidade da parece celular vegetal e por isso podem auxiliar as
glicosil hidrolases na conversão de biomassa (BIELY, 2012). No presente estudo, as CEs
representaram o 3º e o 4º grupo de CAZymes com maior contribuição no solo e na água,
respectivamente, não havendo, no entanto, diferença estatística entre eles.
As atividades auxiliares compõem uma classe de CAZymes mais recentemente descrita,
que agrupa módulos catalíticos envolvidos na degradação de material lignocelulósico por uma
via oxidativa (LEVASSEUR et al., 2013). Integram as AAs as famílias de enzimas redox e de
LPMOs (monooxigenases líticas de polissacarídeos), com habilidade em potencial para
auxiliar as GHs, PLs e CEs no acesso aos carboidratos presentes na parede celular vegetal
(LEVASSEUR et al., 2013; STROOBANTS; PORTETELLE; VANDENBOL, 2014). Este
grupo apresentou entre 8 e 8.5% do total de CAZymes encontrado no solo e na água,
respectivamente, o que não garante diferença significativa entre os ambientes, mas aponta a
contribuição destas enzimas no processo degradativo lignocelulósico.
6.2.2 Contribuição das CAZymes no solo e na água em termos de famílias
Numa análise mais detalhada do perfil de CAZymes encontrados no solo e na água, foi
possível identificar as famílias que mais contribuíram para o metabolismo de carboidratos
nestes ambientes. Em relação à classe das glicosil hidrolases, as famílias mais abundantes nas
amostras de solo foram, em ordem decrescente, GH13, GH15 e GH3, enquanto que nas de
água foram GH23, GH13, GH1 e GH3.
A família GH13, também conhecida como a família das α-amilases, é uma das mais
amplas famílias e contém enzimas com diferentes atividades e especificidades ao substrato,
que agem, por exemplo, sobre o amido, o glicogênio e oligo e polissacarídeos relacionados
(como as α-amilases, α-glicosidases, pululanases, entre outras) (KUMAR, 2010; STAM et al.,
2006). Já foi relatada na literatura a importância biotecnológica desta família de enzimas dada
a sua aplicação em diversas indústrias, como por exemplo, a de alimentos (SÁNCHEZ;
CARDONA, 2008; SATHYA; KAHN, 2014), têxtil (HAQ et al., 2010) e também na
produção de bioetanol de primeira geração (ELLEUCHE et al., 2014;). Segundo Li e
colaboradores (2009), o fato da família GH13 ser a mais ampla dentre as famílias de GHs, e
englobar diversas atividades enzimáticas e distintas especificidades ao substrato, pode
explicar o fato de essa ser a família dominante em diversos metagenomas de diferentes
ambientes.
As enzimas da família GH15 possuem atividades de glicoamilase, glicodextranase e
α,α-trealase (www.cazy.org), e podem também estar envolvidas no processamento do amido
(BERTOLDO; ANTRANIKIAN, 2002; MARÍN-NAVARRO; POLAINA, 2011). As glicosil
hidrolases da família GH23 possuem como atividades conhecidas as lisozimas tipo G,
peptideoglicano liases e quitinases. As lisozimas e quitinases representam importantes grupos
de enzimas que hidrolizam polissacarídeos, estando a quitinase responsável pela quebra da
quitina e a lisozima pela ruptura do peptideoglicano da parede celular bacteriana
(MONZINGO et al., 1996; WOHLKÖNIG et al., 2010).
Enquanto as lisozimas da família GH23 possuem origem eucariótica e atividade sobre a
quitina e quitinoligossacarídeos (além do peptideoglicano), as peptideoglicano liases são de
origem bacteriana e bacteriófaga, não sendo reconhecida outra atividade, além da clivagem do
peptideoglicano, a qual ocorre sem a intervenção de moléculas de água (www.cazy.org).
Apesar da família GH23 conter reconhecidamente apenas as lisozimas e peptideoglicano
liases (também chamadas de transglicosilases líticas), um estudo recente identificou uma
celulase pertencente ao grupo. A proteína até então hipotética CtCel124, de Clostridium
thermocellum, foi caracterizada como uma endoglucanase, cujo sítio ativo exibiu uma
estrutura conservada com enzimas da família GH23 (BRÁS et al., 2011). Este estudo ratifica
o quanto apenas uma porção da capacidade celulolítica microbiana tem sido estudada e
anotada, e que a busca por potenciais celulases eficientes - pertencentes a outras famílias além
das até então conhecidas - deve ser aumentada (SUKHARNIKOV et al., 2011).
As enzimas da família GH1 possuem como atividades enzimáticas mais comuns a β-
glicosidase e β-galactosidase, sendo reconhecidas também as atividades β-manosidase, β-D-
fucosidase e outras (WARNECKE et al., 2007). Membros desta família são responsáveis por
clivar ligações β-glicosídicas em celooligossacarídeos e outros substratos para gerar, por
exemplo, glicose (HILL; RAILLEY, 2008). As β-glicosidases são frequentemente
componentes dos celulossomas, mas podem também ser secretadas, exercendo função na
conversão de biomassa vegetal (CAIRNS; ESEN, 2010). Além do potencial lignocelulolítico
da família, sua aplicabilidade na indústria alimentícia também já foi reportada: as β-
galactosidases da família GH1 podem ser aplicadas, por exemplo, para produção de leite com
baixo teor de lactose e na produção de galacto-oligossacarídeos (SATHYA; KAHN, 2014).
A família GH3 compreende membros que possuem atividades enzimáticas distintas,
incluindo além das β-D-glicosidases, as β-D-xilopiranosidases, α-L-arabinofuranosidases e N-
acetil-β-D-glicosaminidases (www.cazypedia.org). As enzimas deste grupo realizam uma
série de funções que envolvem, por exemplo, a degradação da biomassa celulósica, a
renovação de componentes da parede celular e a modificação de algumas moléculas como
antibióticos (FAURE, 2002). Li e colaboradores (2009) conduziram uma pesquisa com 46
metagenomas publicamente disponíveis e, ao realizarem um blast destes metagenomas contra
as sequências de CAZymes, conseguiram recuperar 7.338 homólogos putativos de glicosil
hidrolases. A família GH3 apareceu dentre as 5 mais abundantes famílias de GHs na maioria
dos metagenomas analisados, incluindo o microbioma do intestino humano (11%), de ratos
(10%) e de cupins (8%); a microbiota de comunidades marinhas (7%), de um lodo australiano
(7%) e até em uma amostra de ar (9%). A família GH3 apareceu também dentre as mais
abundantes em amostras metagenômicas do microbioma do rúmen de bovinos, com >700
sequências associadas (BRULC et al., 2009) e com contribuição de 14.9% do total de GHs
detectadas (WANG et al., 2013). Resultado semelhante foi encontrado para o intestino grosso
de cupins, nos quais foram identificados 69 módulos correspondentes aos domínios catalíticos
de GH3, sugerindo que o metabolismo final de oligossacarídeos ocorre através da atividade
dos módulos de glicosidase desta família (WARNECKE et al., 2007). No presente estudo, a
GH3 foi a 3ª família de glicosil hidrolases mais abundante no solo e a 4ª na água, o que pode
indicar o potencial de degradação lignocelulósica destes locais, se comparado a metagenomas
de ambientes caracterizados por uma constante entrada e ciclagem de biomassa vegetal
complexa, como é o caso dos metagenomas de comunidades microbianas derivadas do
intestino de cupins, humanos e ratos e do rúmen de bovinos, por exemplo (LI et al., 2009).
Devido à ampla variedade de funções dos carboidratos, várias proteínas atuantes nestas
moléculas adquiriram os CBMs, que são módulos não-catalíticos capazes de interagir
especificamente com mono, oligo e polissacarídeos (GUILLÉN; SÁNCHEZ; RODRÍGUEZ-
SANOJA, 2010). De acordo com Boraston e colaboradores (2004), apesar de muitos destes
módulos associarem-se à parede celular da planta, existem diversas famílias de CBM
relacionadas à ligação a polissacarídeos de armazenamento tais como o glicogênio, o que é o
caso da família CBM48. Tal família, que foi a mais abundante nas amostras de solo, contém
módulos de aproximadamente 100 resíduos, que possuem a função de ligação ao glicogênio e
são anexos aos módulos GH13 (www.cazy.org). Tal resultado é consistente com o fato de a
família GH13 ter sido a família de glicosil hidrolases mais abundante nas amostras de solo.
A família de CBMs com maior contribuição nas amostras de água, por sua vez, foi a
CBM50, cujos módulos têm a propriedade de ligar-se ao peptideoglicano e à quitina. Os
CBM50 podem ser encontrados associados a 6 famílias de GHs, incluindo a GH23. Esta
família foi a mais abundante dentre as GHs nas amostras de água, o que pode também
explicar a predominância dos módulos de CBM50 neste ambiente.
A família CBM13 foi a segunda mais representativa no solo e terceira na água. A
família, apesar de promover ligações fracas a mono, di e oligossacarídeos, tem, na verdade,
grande afinidade pelo xilano (BORASTON et al., 2000). Segundo Boraston e colaboradores
(2004), CBM13 parece ser mais frequente em toxinas bacterianas ou enzimas (glicosil
hidrolases e glicosiltransferases) que atacam superfícies de células eucarióticas ou a matriz de
glicanos. A representatividade de CBM13 nas amostras de solo e de água também pode estar
associada à maior contribuição de uma das famílias de glicosil hidrolases, a GH3, cujas
atividades descritas envolvem a hidrólise do xilano.
Ao contrário do potencial de quebra de ligações glicosídicas associado às famílias de
glicosil hidrolases, podendo, para isso, ter o auxílio dos CBMs, as glicositransferases são
enzimas que estão mais relacionadas à formação destas ligações glicosídicas. Os resultados
obtidos no presente trabalho revelaram que o ambiente de água possui maior potencial de
biossíntese de carboidratos do que o solo. A família que mais contribuiu para este cenário foi
a família GT41. Esta família possui duas atividades conhecidas, a UDP-GlcNAc: peptídeo β-
N-acetilglicosaminatransferase e UDP-Glc: peptídeo β-N-glicosiltransferase. Até 2013,
apenas 3 estruturas haviam sido descritas para a família e as atividades já encontradas estão
relacionadas, por exemplo, à glicosilação de proteínas envolvidas na sinalização, resposta ao
stress e metabolismo de energia (GÓMEZ-CASATI; MARTÍN; BUSI, 2013; HART;
AKIMOTO, 2009). Outras duas famílias que tiveram maior abundância no solo e na água
foram GT4 e GT2, que são as famílias de GTs mais numerosas e que catalisam uma vasta
gama de reações, com diferentes doadores e receptores de açúcares (RUANE; DAVIES;
MARTINEZ-FLEITES, 2008). Conhece-se o papel destas enzimas por estarem envolvidas na
síntese de celulose, de quitina e de ácido hialurônico (GT2) e também de sacarose (GT4),
dentre as muitas outras atividades.
As polissacarídeo liases tiveram a menor representatividade dentre todas as classes de
CAZymes encontradas no presente estudo. Lombard e colaboradores (2010), no intuito de
promover uma classificação hierárquica das PLs, analisaram genomas de diversos organismos
distintos (desde Archea a plantas e animais superiores) e viram que a ocorrência de PLs é
geralmente baixa e consiste entre 3 e 5% do número de GHs encontradas nos genomas.
Segundo os autores, essa baixa frequência se deve provavelmente ao fato de que o substrato
das PLs (polissacarídeos contendo ácidos urônicos) compõe apenas uma pequena fração de
todos os polímeros de carboidratos existentes. No presente trabalho, as PLs detectadas
pertencem principalmente à família PL22, a qual compreende enzimas que são geralmente
encontradas em bactérias fitopatogênicas ou entéricas, participando do metabolismo da
pectina. Estes microrganismos atacam a rede de pectina através de suas enzimas
pectinolíticas, provocando a ruptura e perda da integridade da parede celular vegetal
(LOMBARD et al, 2010).
Juntamente às glicosil hidrolases e polissacarídeo liases, as carboidrato esterases
também participam da sacarificação de polissacarídeos da parede celular vegetal, já que a
desacetilação dos resíduos de açúcares expõe as ligações glicosídicas à hidrólise enzimática
(BIELY, 2012; HIMMEL et al., 2010). Em relação às carboidrato esterases encontradas no
presente trabalho, a família com maior contribuição tanto no solo quanto na água foi a CE10,
cujas atividades conhecidas envolvem aril-esterase, carboxilesterase, colinesterase, entre
outras. Como a grande maioria (se não todos) os membros desta família são esterases que
agem em substratos que não são carboidratos, suas informações não são mais atualizadas na
base de dados do CAZy. A segunda família que teve maior representatividade na água foi a
CE11, que compreende enzimas com atividade de UDP-3-0-acil N-acetilglicosamina
desacetilase, que podem estar relacionadas, por exemplo, à biossíntese de LPS
(lipopolissacarídeo) da parede de bactérias gram-negativas (COGGINS et al., 2003;
WHITTINGTON, et al., 2003). As outras duas famílias que mais contribuíram com as CEs no
solo e na água foram as CE1 e CE4, que são conhecidas por exibirem atividade acetil xilano
esterase, podendo agir em sistemas multifuncionais com as xilanases (presentes em
determinadas famílias de GHs) participando na degradação das hemiceluloses vegetais
(BIELY, 2012; HIMMEL et al., 2010;). De fato, as famílias CE1 e CE4 foram as que tiveram
o maior número de sequências nos metagenomas do microbioma do rúmen de bovinos e do
intestino grosso de cupins (BRULC et al., 2009; WARNECKE et al., 2007), evidências que
reforçam o potencial destas famílias na bioconversão de biomassa vegetal.
O último grupo de CAZymes que envolve o sistema de bioconversão da lignocelulose
compõe a classe das atividades auxiliares, a qual possui famílias de módulos catalíticos
associados com a degradação da parede celular vegetal (MATSUMURA et al., 2014). A
família AA3, que foi a mais representativa nos dois ambientes analisados, compreende
enzimas com diversas atividades, incluindo celobiose desidrogenase, glicose oxidase, aril-
álcool oxidase, álcool oxidase e piranose oxidase. As celobiose desidrogenases, por exemplo,
são conhecidas por serem produzidas por diversos fungos decompositores de madeira, sendo
geralmente secretadas no espaço extracelular durante o crescimento em substratos celulósicos
(ZAMOCKY et al., 2006). As aril-álcool oxidases também são secretadas por fungos e
participam, por sua vez, da degradação da lignina (HERNÁNDEZ-ORTEGA; FERREIRA;
MARTÍNEZ, 2012). A família AA7, segunda mais abundante no solo, possui atividades
glicooligossacarídeo oxidase e quitooligossacarídeo oxidase, podendo oxidar uma variedade
de carboidratos (glicose, maltose, celobiose, lactose entre outros) e estão potencialmente
envolvidas na biotransformação ou detoxificação de compostos lignocelulósicos (FAN;
OGUNTIMEIN; REILLY, 2000; LEVASSEUR et al., 2013). A segunda família de AA mais
abundantes na água, por sua vez, foi a AA6, cujas enzimas possuem atividade 1,4-
benzoquinona redutase, que são enzimas intracelulares envolvidas na biodegradação de
compostos aromáticos (www.cazy.org).
Até o momento, as famílias de AAs descritas estão fortemente enviesadas para o reino
Fungi, o que pode explicar, por exemplo, o fato de não terem sido encontrados genes de
degradação de lignina no metagenoma da microbiota do intestino grosso do cupim
Nasutitermes (BUGG et al., 2011; LEVASSEUR et al., 2013; WARNECKE et al., 2007). No
entanto, na revisão de BUGG e colaboradores (2011), constam relatos de bactérias cuja
capacidade de romper a lignina foi mostrada in vitro e, interessantemente, muitas destas
bactérias já foram isoladas do intestino grosso de cupins. Estes fatos reforçam a necessidade
de mais estudos acerca do papel enzimático das bactérias na conversão de lignina, o que vai
ajudar a preencher a lacuna nas famílias de AAs descritas para bactérias, permitindo uma
anotação funcional confiável e uma melhor compreensão de todo o processo lignolítico
relacionado a essas enzimas bacterianas (LEVASSEUR et al., 2013).
6.3 Comparação taxonômica quanto à estrutura da comunidade microbiana total
A análise da composição da comunidade microbiana da região de Caatinga estudada
mostrou que existem perfis taxonômicos com diferenças e semelhanças entre o solo e a água:
as classes Actinobacteria (45%) seguida de Alphaproteobacteria (14%) foram dominantes no
solo, enquanto que Betaproteobacteria (67%) seguida também de Alphaproteobacteria
(10,8%), foram as classes mais abundantes na água.
Resultados semelhantes em relação ao solo foram encontrados por Pacchioni e
colaboradores (2014). Actinobacteria e Alphaproteobacteria foram também as classes
dominantes no solo de Caatinga estudado através da abordagem metagenômica (36.4% e
12.41% de abundância, respectivamente). Uma grande abundância do filo Actinobacteria já
foi encontrada na rizosfera de espécies de cactos no semiárido mexicano (AGUIRRE-
GARRIDO et al., 2012) assim como foi o filo dominante nas amostras obtidas, durante a
estação seca, no solo e na rizosfera associada a Cereus jamacaru (mandacaru), numa região
de Caatinga brasileira (KAVAMURA et al., 2013).
De fato, já foi reportado na literatura que Actinobacteria é um dos filos que mais
contribui para a comunidade microbiana em solos áridos e semiáridos (BACHAR et al., 2010;
CHANAL et al., 2006; FIERER et al., 2012), estando sua maior presença nestes ambientes
relacionada à existência de diversas espécies resistentes ao estresse hídrico, que são tolerantes
a altas temperaturas e radiação (CONNON et al., 2007; SINGLETON et al., 2003). Acredita-
se que seja um grupo que possui um papel importante na ciclagem de nutrientes,
decomposição e formação do húmus no solo (GOODFELLOW; WILLIAMS, 1983), já tendo
sido encontrada sua potencial significância na decomposição de materiais lignocelulósicos
(VĚTROVSKÝ; STEFFEN; BALDRIAN, 2014).
A alta abundância de Actinobacteria em solos áridos e semiáridos contrasta com o que
já foi descrito para solos de florestas, como por exemplo, da Mata Atlântica (BRUCE et al.,
2010; FAORO et al., 2010) e do cerrado (ARAÚJO et al., 2012). Nestes ambientes, a
frequência de Actinobacteria foi mais baixa (<10%, 1.2% e 4-7% nos respectivos estudos) em
detrimento de Acidobacteria, cuja contribuição para as sequências de rRNA 16S obtidas foi
dominante (29–54%, 63% e 40–47%, respectivamente). O filo Acidobacteria, apesar de ser
um dos filos mais abundantes no solo (CATÃO et al., 2014; JANSSEN, 2006) incluindo no
ambiente semiárido (AGUIRRE-GARRIDO et al., 2012; BACHAR et al. 2010; CHANAL et
al., 2006) teve apenas 6% de abundância no presente estudo. Pacchioni e colaboradores
(2014) também encontraram uma pequena contribuição de Acidobacteria (2.5%) no solo de
Caatinga e da Mata Atlântica analisados. Os autores atribuíram esse achado, entre outros
fatores, ao maior teor de areia das suas amostras, que pode ter tornado menos propícia a
presença de Acidobacteria, já que eles observaram que este grupo parece ser mais abundante
na fração argilosa do solo, em relação à siltosa e à arenosa (LILES et al. 2010; RUSSO et al.
2012).
No que diz respeito às amostras de água, a classe Betaproteobacteria - que foi o grupo
taxonômico dominante - parece ser também frequente em outros ambientes de água doce.
Ghai e colaboradores (2011) realizaram um estudo metagenômico da microbiota do rio
Amazonas, por meio de duas estratégias distintas: utilizando as sequências de rRNA 16S
recuperadas dos metagenomas e analisando o total de reads, através da anotação no servidor
MG-RAST. Os autores encontraram Betaproteobacteria como a segunda classe mais
abundante nas amostras analisadas, atrás apenas da classe Actinobacteria, levando em conta
as sequências de rRNA 16S. No entanto, ao considerar o total de reads, a classe
Betaproteobacteria foi a dominante, o que sustenta os achados do presente trabalho, no qual
também foram utilizadas as reads totais para anotação. Os dados obtidos também corroboram
com os encontrados por Zwart e colaboradores (2002), que realizaram um estudo com
sequências de rDNA 16S depositadas em bases de dados e provenientes do plâncton de água
doce em diferentes localidades (América do Norte, Europa e Ásia). Os autores encontraram
que Proteobacteria (das subdivisões Alphaproteobacteria e Betaproteobacteria) estiveram
dentre as principais divisões bacterianas representadas em todos os ambientes de água doce
analisados. Ainda segundo os autores, existe uma separação evolutiva entre bactérias que
crescem na água doce e em oceanos, fato que é evidenciado, por exemplo, pela ampla
distribuição de Betaproteobacteria em ambientes de água doce, contrastando com sua
ausência em ambientes oceânicos.
Betaproteobacteria é um grupo relativamente amplo de bactérias, que frequentemente
pertence aos membros mais abundantes em amostras de bacterioplâncton de água doce
(LINDSTRÖM; KAMST-VAN; ZWART, 2005; SALCHER, 2014; WU; HAHN, 2006),
possuindo um amplo espectro de modos de vida que incluem simbiontes, patógenos e
organismos de vida livre. A maioria das sequências associadas ao grupo pertence ao cluster
Polynucleobacter, cujos membros já foram detectados numa variedade de ecossistemas de
lagos e rios (HAHN, 2003; ZWART et al., 2002). A presença deste grupo em habitats tão
diferentes quanto a características físico-químicas e em diferentes zonas climáticas pode
resultar de uma diversificação ecológica dentro do táxon, e não de uma adaptação generalista
das cepas, embora os detalhes sobre suas adaptações específicas ainda sejam desconhecidos
(HAHN et al., 2012; JEZBERA et al., 2011; JEZBEROVÁ et al., 2010).
Polynucleobacter foi o gênero mais abundante nas amostras de água analisadas no
presente estudo (>50%; dados não mostrados) e a alta representatividade deste grupo nas
amostras de água pode indicar a presença de características ambientais únicas nesta região de
água doce da Caatinga, que favoreceram o estabelecimento do grupo neste ambiente. Segundo
HAHN e colaboradores (2012), o fato de existirem poucas informações sobre as adaptações
ecológicas das bactérias pertencentes ao grupo dificulta uma comparação intra-habitats das
suas características. Nesse sentido, mais estudos precisam ser realizados a fim de se
compreender o perfil metabólico e o papel ecológico destes microoorganismos nos mais
diversos ambientes de água doce que eles ocupam.
6.4 Perfil taxonômico da comunidade microbiana associada às CAZymes
Em relação ao solo, o táxon que apresentou maior contribuição para as sequências
anotadas como CAZymes foi um dos que obteve a menor representatividade, dentre os táxons
dominantes encontrados na comunidade microbiana como um todo. Planctomycetia teve uma
abundância de apenas 1.8% dentre o total de classes que foram encontradas no solo, enquanto
que, em relação às CAZymes, sua contribuição foi de 29%, a maior frequência identificada.
Resultado semelhante foi encontrado para as amostras de água. Planctomycetia foi a segunda
classe com mais sequências pertencentes às CAZymes (21%) tendo, no entanto, uma pequena
contribuição para a comunidade microbiana total (0.5%).
A classe Planctomycetia pertence ao filo Planctomycetes, o qual era originalmente
encontrado em ambientes de água doce, mas que se mostrou amplamente distribuído em
habitats marinhos, hipersalinos e em solos terrestres (FUERST, 1995). De fato,
Planctomycetes tem sido encontrado em bibliotecas de rRNA 16S provenientes de diversos
tipos de solos (BORNEMAN; TRIPLETT, 1997; KUSKE; BARNS; BUSCH 1997; ZHOU et
al., 2003). A onipresença geográfica e ampla diversidade filogenética de Planctomycetes
sugerem que a capacidade metabólica do grupo seja bastante versátil (BUCKLEY et al., 2006;
ELSHAHED et a. 2007). No entanto, todos os Planctomycetes cultivados até o momento
parecem ser aeróbios especializados no metabolismo de açúcar (ELSHAHED et al. 2007).
Esta especialização metabólica já verificada para os representantes cultivados pode explicar o
fato de Planctomycetia ter sido o grupo taxonômico mais abundante em relação às CAZymes
encontradas no solo e o segundo grupo mais frequente na água.
A classe Alphaproteobacteria também teve grande contribuição para as CAZymes
encontradas, principalmente na água (27%). Os microorganismos pertencentes a esta classe
são encontrados nos mais diversos ambientes e exibem uma enorme plasticidade nos seus
genomas e estilos de vida (NEWTON et al., 2011). São ubíquos em lagos de água doce,
apesar de serem menos numerosos do que em ambientes marinhos, nos quais parecem ser
microorganismos dominantes (MORRIS et al., 2002; NEWTON et al., 2011).
De uma maneira geral, Alphaproteobacteria de água doce é uma classe pouco estudada,
mas os dados disponíveis para os membros dominantes em ambientes lacustres sugerem que
sejam bactérias resistentes, competitivas em circunstâncias de baixa disponibilidade de
nutrientes e substrato, mas também capazes de degradar compostos orgânicos complexos
(NEWTON et al., 2011). A predominância de Alphaproteobacteria, em relação aos outros
táxons associados às Cazymes, evidencia a importância das enzimas relacionadas ao
metabolismo de carboidratos na manutenção das características que garantem o sucesso de
Alphaproteobacteria nestes ambientes de água doce. Uma estratégia diferente parece ocorrer
para ambientes marinhos. Segundo Dittami e colaboradores (2014), as Alphaproteobacteria
marinhas são conhecidas por conterem poucas CAZymes, apesar de estas bactérias
geralmente não serem capazes de realizar fotossíntese e dependerem, portanto, de uma fonte
externa de carbono e de energia.
As outras duas classes com maior abundância no total de CAZymes encontradas foram
Cytophagia (solo) e Spirochaetia (água). A classe Cytophagia pertence ao filo Bacteroidetes,
cujos membros mais conhecidos são especializados no processamento da matéria orgânica,
especialmente em solos (gênero Cytophaga) ou no intestino de mamíferos (FERNÁNDEZ-
GÓMEZ et al., 2013). A classe já compreendeu um dos grupos de Bacteroidetes
significativamente mais frequentes no horizonte orgânico do solo em relação ao mineral,
evidenciando que o filo, juntamente com Verrucomicrobia e Proteobacteria, fazem parte da
comunidade adaptada a substratos de carbono facilmente acessíveis (UROZ et al., 2013).
A classe Spirochaetia, por sua vez, pertence ao filo Spirochaetes, amplamente
distribuído na natureza, cujos microorganismos ocorrem como formas de vida livre em
ambientes de água doce, marinhos e hipersalinos, podendo associar-se também a
invertebrados e hospedeiros vertebrados (BREZNAK, 2002). Um dos habitats em que
Spirochaetes representa um dos principais grupos é no microbioma do intestino grosso de
cupins (BREZNAK, 2002) e constituem, no caso do cupim Nasutitermes, um dos principais
contribuintes para as enzimas degradativas de matéria orgânica (WARNECKE et al., 2007).
Segundo Margulis e Chapman (2009), as espiroquetas provavelmente não possuem celulases,
porém, produzem enzimas hábeis na digestão dos produtos da sua quebra inicial, sendo
observadas em ambientes degradadores de celulose proveniente de algas ou plantas.
6.5 Reconhecimento de potenciais novas sequências de CAZymes
A anotação pela assinatura de domínios conservados permitiu reconhecer sequências de
CAZymes recuperadas dos metagenomas do solo e da água. No entanto, uma fração destas
sequências apresentou baixa identidade em relação àquelas depositadas na base de dados não-
redundante NR. Este fato permitiu supor que se tratam de sequências distantemente
relacionadas às já existentes, o que pode também significar que sejam novas sequências de
CAZymes.
Stroobants, Portelle e Vandenbol (2014) identificaram novas CAZymes derivadas de
um solo agrícola, ao realizarem um screening das bibliotecas metagenômicas obtidas. Os
autores detectaram nos clones sete β-glicosidases putativas e duas glicosiltransferases
putativas. As duas ORFs codificantes para as glicosiltransferases apresentaram identidades de
25 e 27% em relação às GTs já conhecidas, o que permitiu aos autores inferir que fossem
enzimas pertencentes a novas famílias de CAZymes.
De uma maneira geral, na denominada “zona cinzenta ou de incerteza” (twilight zone) –
intervalo de identidade entre 20-35% – não é possível inferir homologia com base apenas na
quantidade de resíduos idênticos no alinhamento entre duas sequências (ROST, 1999). Outros
parâmetros, como por exemplo, a porcentagem de cobertura, podem ser utilizados em paralelo
para auxiliar nesta inferência.
A estratégia de anotação realizada no presente estudo, baseada na busca de domínios
protéicos conservados, permitiu identificar a totalidade de sequências de CAZymes nos
metagenomas do solo e da água. No entanto, as sequências de baixa identidade podem ser
homólogas distantemente relacionadas às CAZymes já existentes e com isso, possivelmente
representam novas sequências e até mesmo novas famílias destas enzimas relacionadas ao
metabolismo de carboidratos. A recuperação destas sequências nos metagenomas pode ser
futuramente realizada no intuito de se analisar e compreender melhor suas propriedades
catalíticas, bem como as relações filogenéticas com as CAZymes até então conhecidas.
6.6 Importância dos estudos de metagenômica comparativa
Segundo Simon e Daniel (2009), “A metagenômica comparativa é útil para a
identificação de diferenças na habilidade de comunidades microbianas de se adaptarem a
condições ambientais variáveis”. O estudo do perfil funcional de comunidades microbianas
distintas permite, além de caracterizá-las individualmente, perceber tais diferenças que
indicam que existem alguns metabolismos que são dominantes em cada um dos ambientes.
São estes metabolismos dominantes que sugerem a existência de perfis funcionais que são
particulares a cada metagenoma (DINSDALE et al, 2008).
Tringe e colaboradores (2005), realizaram um estudo de metagenômica comparativa
entre diferentes comunidades microbianas que permitiu deduzir genes habitat-específicos e
perfis funcionais característicos nos ambientes amostrados. Para Simon e Daniel (2009),
ambientes com demandas compatíveis podem significar perfis funcionais similares, e é isso
que uma “abordagem centrada em genes” parece sugerir. Provavelmente, a maior presença de
determinado gene em uma comunidade se deve ao fato de ele ser de alguma forma benéfico
neste ambiente (HUGENHOLTZ; TYSON, 2008).
Sendo assim, as proteínas codificadas por uma comunidade microbiana parecem ser
mais elucidativas sobre o ambiente do que os próprios táxons que as codificam; de maneira
que é possível até mesmo distinguir locais a partir dos perfis funcionais encontrados
(TRINGE, 2005). Mais ainda, a maioria dos genes que são expressos diferencialmente em
cada ambiente não têm função conhecida, o que os tornam interessantes focos de pesquisa
tanto do ponto de vista ecológico quanto biotecnológico (HUGENHOLTZ; TYSON, 2008).
7. CONCLUSÕES
· As comunidades microbianas que habitam o solo e a água desta região de Caatinga
apresentaram diferentes perfis taxonômicos e potenciais funcionais, indicando que
existem distintos metabolismos dominantes e táxons que são mais frequentes em cada
ambiente;
· A estratégia de anotação pela tecnologia de subsistemas permitiu realizar uma
caracterização geral dos potenciais funcionais do solo e da água. Foi possível observar
que o metabolismo de carboidratos compõe um subsistema importante na manutenção das
comunidades microbianas em ambos os locais;
· A maior contribuição dos subsistemas Clustering-based na água indica que este ainda é
uma ambiente menos explorado do ponto de vista científico, em relação, por exemplo, ao
solo;
· A segunda estratégia de anotação utilizada - baseada em domínios conservados de
sequências protéicas - permitiu caracterizar de maneira mais precisa e específica o solo e
a água, quanto à presença de enzimas relacionadas ao metabolismo de carboidratos
(CAZymes);
· No presente estudo o solo mostrou-se como um ambiente potencialmente mais
especializado na degradação de moléculas de carboidratos complexas, fato evidenciado
pela predominância da classe de glicosil hidrolases (GHs) neste ambiente;
· A água, por sua vez, foi caracterizada por conter, significativamente, mais enzimas
relacionadas à biossíntese de carboidratos e transferência de glicosídeos (GTs);
· O solo aparentou ser, inicialmente, mais vantajoso do ponto de vista da bioprospecção de
enzimas lignocelulolíticas, dada à contribuição significativamente maior de GHs, em
relação à água. Porém, nas amostras de água também foram encontradas famílias de
CAZymes com tal potencial biotecnológico, mesmo que em menor proporção;
· Dentre as CAZymes mais abundantes, a família de glicosil hidrolases GH13, encontrada
em ambos os ambientes e GH15, no solo, possui enzimas com possível aplicação na
cadeia de bioetanol de primeira geração, devido à sua atividade na bioconversão do
amido. Já as famílias GH1 e GH23 (mais frequentes na água), e GH3 (presente em ambos
os ambientes), contém enzimas com capacidade de degradação da biomassa
lignocelulósica e com isso potencial aplicação na produção de bioetanol de segunda
geração;
· Duas das mais frequentes famílias de carboidrato esterases encontradas no solo e na água,
as famílias CE1 e CE4, têm capacidade de auxílio na conversão de biomassa vegetal
através da degradação da hemicelulose;
· Para as famílias de atividades auxiliares, a família AA3 possui papel importante na
decomposição fúngica da lignocelulose, enquanto que a família AA7 está potencialmente
envolvida na biotransformação ou detoxificação de compostos lignocelulósicos, sendo
grupos interessantes do ponto de vista biotecnológico;
· Dentre os CBMs, a família CBM13 possui afinidade pelo xilano, podendo ser encontrada
em associação às glicosil hidrolases no ataque à matriz de glicanos da parede celular
vegetal, auxiliando na sua degradação;
· A estratégia de anotação funcional que envolveu a busca de domínios protéicos
conservados também permitiu inferir a existência de potenciais novas sequências de
CAZymes, no solo e na água desta região de Caatinga. Estudos posteriores são
necessários para se compreender melhor estas enzimas e sua ligação com as CAZymes já
existentes.
· Em relação à caracterização taxonômica, a maior contribuição de Actinobacteria no solo
sugere que esta seja uma classe relevante em solos com características mais áridas,
provavelmente pela existência de diversas espécies resistentes ao stress hídrico;
· Já para as amostras de água, a maior frequência de Betaproteobacteria veio reforçar sua
ubiquidade em ambientes de água doce;
· O táxon Planctomycetia foi o que mais contribuiu para as CAZymes identificadas nos
metagenomas do solo, sendo o segundo grupo mais abundante na água. Entretanto,
Planctomycetia esteve dentre os táxons mais raramente encontrados, em ambos os
ambientes, levando em conta a estrutura da comunidade microbiana como um todo;
· Os resultados encontrados apontam para a relevância dos grupos menos abundantes na
manutenção de determinadas atividades nas comunidades microbianas, assim como
indicam a importância de abordagens como a metagenômica na identificação,
caracterização e descoberta do potencial biotecnológico de tais grupos.
REFERÊNCIAS
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