UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS – UEA FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS – FMTAM

MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

ROSSICLÉIA LINS MONTE

A IMPORTÂNCIA CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA DOS MARCADORES LABORATORIAIS PRESUNTIVOS E CONFIRMATÓRIOS PARA O DIAGNÓSTICO

DA DOENÇA MENINGOCÓCICA

ROSSICLÉIA LINS MONTE

Manaus

2004

ROSSICLEIA LINS MONTE

A IMPORTÂNCIA CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA DOS MARCADORES LABORATORIAIS PRESUNTIVOS E CONFIRMATÓRIOS PARA O DIAGNÓSTICO

DA DOENÇA MENINGOCÓCICA

Dissertação apresentada no Programa de Pós Graduação da Universidade do Estado do Amazonas, para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientador: Prof. Antônio Tavares, Dr. Co-orientadores: Prof. Bernardino Cláudio de Albuquerque, MsC

Prof. Dr. Wornei Miranda Braga

Manaus

2004

“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina” Cora Coralina

AGRADECIMENTOS

À Deus por seu amor infinito. Ao Dr Bernardino Claudio de Albuquerque pela orientação, incentivo, paciência e zelo, sem o qual este trabalho não teria sido realizado. Ao Dr Wornei Miranda Braga, pela amizade e valiosa orientação na parte estatistica deste trabalho Aos Drs Wilson Duarte Alecrim, Marcus Guerra e Silas de Oliveira Guedes de Oliveira, pela implantação do Curso de Mestrado de Doenças Tropicais e Infecciosas A todos os funcionários e colaboradores do Laboratório de Bacteriologia, pela dedicação, trabalho e comprometimento sem os quais este trabalho não teria sido concretizado. Aos amigos da Gerência de Informática especialmente Clenilton Alencar por toda a elaboração a partir do banco de dados até a montagem final do trabalho, e ao Marcos Sabóia pela montagem do banco de dados. Às bibliotecárias Artemísia Seabra da Silva, Melquizete de Souza Almeida e Gisella Paula G. Gonzáles, pela colaboração inestimável e principalmente amizade durante a revisão bibliográfica As senhoras Maria José Cirino e Socorro Tavares pela prestimosa colaboração na revisão gramatical do conteúdo deste trabalho. À Fundação de Medicina Tropical do Amazonas e sua direção pelo apoio e incentivo na realização desde trabalho Ao Dr João Avelino e demais colaboradores do Centro de Pesquisas e Diagnósticos Especializados (CPDE) pelo apoio, incentivo e flexibilidade no desempenho de minhas atividades naquela instituição no decorrer do desenvolvimento deste trabalho. Aos funcionários da Sub-Gerência de Epidemiologia da FMTAM, em especial a Graça Saraiva, pela ajuda complementar no desenvolvimento desde trabalho.

Aos colegas do curso de mestrado, especialmente Marcelo Cordeiro, amigo querido de longos tempos e Marilú Victória pela convivência e amizade indispensáveis durante o curso. À SUFRAMA pelo incentivo viabilizado através do Convênio 035/2002. Ao meu orientador Dr. Antônio de Matos Tavares, pela infinita paciência. À minha família, pelo estímulo, incentivo e apoio em todas as decisões tomadas durante a minha existência. À todos que, de alguma forma, colaboraram para a realização deste trabalho.

RESUMO

A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que ocorram, anualmente, cerca de 1,2 milhões de casos de meningite bacteriana em todo o mundo, dos quais 135.000 evoluem para o óbito. Aproximadamente, 500.000 desses casos, que resultaram em 50.000 mortes, são atribuídas ao meningococo. No ano de 2002 foram notificados na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTAM) 347 casos de meningite bacteriana, sendo 133 suspeitos de doença meningocócica (DM). Realizou-se um estudo laboratorial descritivo retrospectivo, no período de janeiro a dezembro de 2002, com o objetivo de avaliar a importância a importância clínico-epidemiológica dos marcadores presuntivos e confirmatório para o diagnóstico de DM; por meio dos resultados das amostras biológicas de pacientes suspeitos de DM, recebidos no Laboratório de Bacteriologia da FMTAM. Foram incluídos no estudo, os exames suspeitos de DM que preencheram os requisitos do Ministério da Saúde, com exames de líquido cefalorraquidiano (LCR) e/ou hemoculturas positivas, látex e bacterioscopia, perfazendo 120 pacientes. Destes, 115 amostras de sangue, 113 de LCR, 17 de sangue capilar periférico e 12 amostras de escarificação de pele foram estudadas. A DM foi mais prevalente no gênero masculino e, no feminino, a faixa etária de maior prevalência foi a de crianças até cinco anos (35%). A idade média correspondeu a 13,9 anos. A forma de apresentação clínica de maior prevalência foi a forma mista (meningite meningocócica com meningococcemia), com 52% dos casos. A análise liquórica mostrou que o aspecto turvo predominou em 72,6%. A contagem dos leucócitos foi superior a média de 5.000/mm3 para a forma mista e para a meningite meningocócica, com predomínio de polimorfonucleares em 74,3% nestas. A média dos níveis de glicose foi inferior a 30mg/dl e a de proteínas totais superior a 300mg/dl e os níveis de lactato encontravam-se acima de 12 mmol/L. Para a meningococcemia, a média da glicorraquia foi acima de 50 mg/dl, das proteínas totais abaixo de 45 mg/dl e do lactato em torno de 4 mmol/L. O diplococo gram-negativo (DGN) foi visualizado em 66,7% das escarificações de lesões de pele. Em 88,2% das amostras de sangue capilar periférico foi possível visualizar diplococo sugestivo de Neisseria sp. A Neisseria meningitidis sorogrupo B foi detectada em 61,8% dos 55 LCR testados por aglutinação do látex, e no sorogrupo C em 3,7%. A bacterioscopia das amostras foi positiva em 61,9%. A Neisseria meningitidis foi isolada em 88,9%, sendo mais freqüentes o sorotipo 4,7 e o subtipo P1.19,15; o meningococo C correspondeu a 11,1% das culturas. A Neisseria meningitidis foi isolada em hemocultura em 33,9% das amostras, com predomínio do meningococo sorogrupo B em 92,3%, o sorogrupo C em 7,7%, com sorotipo e subtipo similares aos do LCR. A partir desses resultados conclui-se que a Neisseria meningitidis sorogrupo B, sorotipo 4,7 e subtipo P1.19,15 foi o mais prevalentes nos isolados. Palavras-chave: doença meningocócica – diagnóstico laboratorial – Neisseria meningitidis

ABSTRACT The World Health Organization (WHO) estimates 1.2 million cases of bacterial meningitis annually, worldwide, with more than 100 thousands deaths. 500 thousands of those with 50 thousands deaths are attributed to N. meningitides. In 2002 the Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTAM) registered 347 cases of bacterial meningitis with 133 cases suspected of meningococcal disease. This is a retrospective descriptive study of laboratorial finds of patients with suspected meningococcal disease attending to the FMTAM from January to December 2002. The main objective of this study was to evaluate the significance of laboratorial markers of meningococcal disease. The study evaluates of suspected meningococcal disease, 115 blood samples, 130 of CSF, 17 of peripheral capillary blood and 12 of scarification of skin lesions. The majority of the samples were from male patients and among females the most prevalent group was of individuals up to 5 years of age. The men age of the study subjects was 13,9 years. 52% were classified as mix forms of meningitis with meningococcemia. The aspect of the CSF was clouded in 72.6% of the samples, the mean cell count higher than 5.000/mm3 with predominance of polinuclear cells. The mean level of glucose, proteins and lactate, in CSF, among those classified as meningitis was 30 mg/dl, higher than 300 mg/dl and higher than 12 mmol/L, respectively. Within those with meningococcemia the mean glucose, protein and lactate level in CSF was higher than 50 mg/dl, less then 45 mg/dl and 4 mmol/L, respectively. Gram-negative diplococcic was visualized in 66,7% of the skin lesions specimen and in 88,2% of the peripheral blood samples. The N. meningitides was isolated in 55.9% of the CSF culture, 88,9% of the serogroup B, serotype 4,7 and subtype P1.19,15. Serogroup C was found in 11.1% of the CSF culture. In blood culture the N. meningitides was isolated in 33,9% of the samples been serogroup B the most prevalent, 92,3%, serogroup C was found only in 7,7% of the cases. We conclude that N. meningitides serogroup B, serotype 4,7 and subtype P1.19, 15 was the most prevalent agent of meningococcal disease among the study subjects. Key words: Meningococcal disease – laboratory diagnosis – Neisseria meningitidis

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO 11

1. A DOENÇA MENINGOCÓCICA 12 1.1 História da doença meningocócica 12 1.2 O agente etiológico 15 1.3 Transmissão 18 1.4 Manifestações clínicas 19 1.5 Fisiopatologia 23 1.6 Diagnóstico laboratorial 24

2. OBJETIVOS 34

2.1 Objetivo geral 34 2.2 Objetivos específicos 34

3. METODOLOGIA 35 3.1 Modelo de estudo 35 3.2 Universo de estudo 35 3.3 Procedimentos laboratoriais 38 3.4 Análise dos dados 44

4. RESULTADOS 45

5. DISCUSSÃO 56

CONCLUSÃO 66

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 68

ANEXOS 73 Anexo 1 – Ficha clínico-laboratorial de pacientes

Com doença meningocócica 73 Anexo 2 – Termo de Aprovação do Trabalho de Tese pelo

Comitê de Ética em Pesquisa da FMTAM 74

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Neisseria meningitidis Página 15 Figura 2 Estrutura do meningococo Página 17 Figura 3 Frequência de materiais biológicos coletados para diagnóstico

laboratorial da doença meningocócica – FMTAM/2002 Página 45 Figura 4 Distribuição dos 120 casos de doença segundo forma clínica

– FMTAM/2002 Página 47 Figura 5 Frequência do crescimento bacteriano de Neisseria

meningitidis em 106 amostras de líquor – FMTAM/2002 Página 52 Figura 6 Classificação da Neisseria meningitidis em sorogrupos isolado

de líquor em 63 amostras de pacientes com doença meningocócica – FMTAM/2002 Página 52

Figura 7 Sorogrupos identificados a partir de isolados de sangue –

FMTAM/2002 Página 54

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Distribuição segundo faixa etária e gênero dos pacientes com Doença Meningocócica-FMTAM/2002 Página 46

Tabela 2 Distribuição do aspecto do líquor nas 113 amostras de

acordo com a forma clínica da Doença Meningocócica – FMTAM/2002 Página 48

Tabela 3 Análises dos valores médios de celularidade, glicose,

proteínas e lactato em função da forma clínica da DM-FMTAM/2002 Página 49

Tabela 4 Freqüência de diplococos gram-negativos em 113 amostras

de Líquor de pacientes com doença meningocócica – FMTAM/2002 Página 50

Tabela 5 Freqüência com que diplococos Gram-negativos foram

visualizados em 12 amostras de escarificação de pele – FMTAM/2002 Página 50

Tabela 6 Frequência com que diplococos Gram-negativos foram

visualizados em 17 amostras de sangue periférico de pacientes com doença meningocócica – FMTAM/2002 Página 51

Tabela 7 Freqüência de sorogrupos de N.meningitidis em 55

amostras de líquor pela aglutinação com partículas de látex – FMTAM/2002 Página 51

Tabela 8 Distribuição dos subtipos identificados a partir do líquor

distribuídos em função do sorotipo da Neisseria meningitidis B – FMTAM/2002 Página 53

Tabela 9 Frequência da positividade para Neisseria meningitidis em

cultura do sangue – FMTAM/2002 Página 53 Tabela 10 Freqüência dos resultados de hemocultura para N.

meningitidis em função da forma clínica da doença meningocócica – FMTAM/2002 Página 54

Tabela 11 Distribuição dos subtipos identificados a partir do sangue

distribuído em função do sorotipo da Neisseria meningitidis B – FMTAM/2002 Página 55

FICHA CATALOGRÁFICA

MONTE, Rossicléia Lins A importância Clínico-epidemiológica dos marcadores laboratoriais

presuntivos e confirmatórios para o diagnóstico da doença meningocócica / Rossicléia Lins Monte – Manaus-AM: UEA; FMTAM, 2004.

75 p.: il. Dissertação (Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas) 1. doença meningocócica 2. diagnóstico laboratorial 3. Neisseria meningitidis

11

INTRODUÇÃO

A doença meningocócica (DM) é uma enfermidade bacteriana aguda, causada

pela Neisseria meningitidis (meningococo), de ocorrência mundial com variações

sazonais e epidêmicas localizadas, representando de 10% a 40% das meningites

bacterianas.

A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que ocorram, anualmente,

cerca de 1,2 milhões de casos de meningites bacterianas em todo o mundo, dos quais

135.000 evoluem para o óbito. Aproximadamente 500.000 desses casos, com 50.000

mortes, são atribuídos ao meningococo (WHO, 2001).

12

A DOENÇA MENINGOCÓCICA

1.1 História da Doença Meningocócica

O primeiro relato de uma epidemia de meningite cérebro-espinhal foi

registrado em 1805, em Genebra (Suíça), pelo médico Gasparo Vieusseux, que

descreveu a sintomatologia e a patologia de uma moléstia que afetava crianças e

jovens, resultando em 33 mortes (VIEUSSEWX apud REQUEJO,1999).

Um ano depois, 1806, em Medfield (Massachusetts, EUA), Danielson e Mann

reconheceram a doença então denominada “meningite cérebro-espinhal epidêmica”.

Entre 1806 e 1815 a doença surgiu em militares franceses e alemães, atingindo as

populações civis (APICELLA, 1995: SHELD et al., 1999).

No sul da França, Alemanha e Itália, a doença meningocócica (DM)

reapareceu em 1820. Muitas epidemias ocorreram na Europa e América entre 1837 a

1887, passando pela França em 1842, acometendo a população civil, tropas militares

e prisioneiros. No final do século XIX, foi reconhecida na Ásia, África e Austrália

(MEIRA, 2002), mas o agente etiológico só foi descrito em 1884, quando Marchiafava

e Celli observaram o microrganismo em exsudatos meníngeos (KONEMAN, 2001).

13

O médico austríaco Anton Weichaelbaum, em 1887, analisando os casos de

meningite cerebroespinhal epidêmica, descreveu pela primeira vez a ocorrência de

bactérias pareadas com faces achatadas no líquido cefalorraquidiano (LCR).

Observou que essas bactérias eram encontradas, em geral, dentro de células

sangüíneas e que eram diferentes dos pneumococos já conhecidos. Denominou-se

então Diplococcus intracellularis meningitidis e o termo “meningococcus de

Weichsealbaum" passou a ser referido na literatura. Admitia Weichsealbaum que o

agente patogênico penetrava no organismo humano pelas vias respiratórias, chegava

à medula espinhal e causava a meningite. Naquela época, os sintomas descritos já

incluíam convulsões generalizadas, cefaléia, calafrios, rigidez de nuca, febre e

vômitos (WEICHSELBAUM, 1887, apud REQUEJO, 1999).

A punção lombar foi introduzida por Quincke, em 1891, quando reconheceu

que as principais alterações no LCR estavam relacionadas com as meningites

(SCHELD et al.,1999).

Com os trabalhos adicionais de Kiefer, no ano de 1896, depois Albrecht e

Ghon, em 1901, estabeleceu-se a existência de pessoas sadias portadoras de

meningococo (APICELLA, 1995; KONEMAN, 2001).

Durante a epidemia alemã de 1904-1905, Lingelsheim introduziu as culturas

bacterianas para isolamento e identificação do meningococo (apud REQUEJO, 1999).

Em 1904, Jaeger desenvolveu a produção de antissoros meningocócicos em coelhos,

para o emprego na caracterização sorológica das cepas epidêmicas (GRAY e

FEDORKO, 1992).

14

Em 1905, Jockmann (apud REQUEJO, 1999) iniciou os estudos experimentais

na produção de um imunossoro específico para a cura da meningite meningocócica,

propondo à companhia Merck, então, a sua produção em cavalos.

A meningite cerebroespinhal epidêmica foi descrita pela primeira vez no

Brasil por Godinho, em 1906 (apud MELLES e TAUNAY, 1992), a partir de casos

clínicos registrados entre pessoas que haviam chegado ao porto de Santos, no navio

Provence, procedentes da Espanha e Portugal. O material foi enviado ao Instituto

Bacteriológico de São Paulo, onde Adolpho Lutz, Carlos Meyer e Theodoro Bayma

identificaram o meningococo.

Baseados em estudos sorológicos, os tipos específicos do meningococo

foram reconhecidos pela primeira vez por Dopter, em 1909 (apud APICELLA, 1995),

sendo esta a base utilizada por Flexner, em 1913 (apud APICELLA, 1995), para a

terapia do soro no tratamento da doença meningocócica. A soroterapia permaneceu

em uso até os anos de 1930, quando foram descobertas as sulfonamidas.

Em 1937 a terapia com sulfonamidas alterou radicalmente o prognóstico da

doença meningocócica. Então, em 1940, Fairbrother e Kuhns iniciaram a terapia

como medida profilática no controle do estado de portador assintomático (KUNS et al.,

1943, apud APICELLA, 1995). Nesta mesma década, durante a segunda guerra

mundial, a penicilina passou a ser usada como nova alternativa no tratamento da

doença meningocócica e, por conta disso, a mortalidade diminuiu.

Entre 1941 e 1943, Shoenback e Phais (apud APICELLA, 1996)

reconheceram a resistência crescente às sulfonamidas entre os meningococos.

15

Então, a partir da década de 1960, a rifampicina tem sido largamente utilizada na

profilaxia da doença meningocócica.

1.2 O agente etiológico

A Neisseria meningitidis - o meningococo - faz parte da família Neisseriacea,

onde se incluem os gêneros: Neisseria, Moraxella, Acinetobacter e Kingella. O gênero

Neisseria compreende as espécies N. meningitidis, N. gonorrhoeae, N. lactamica e

outros diplococcus gram-negativos saprofíticos não relacionados com doenças

invasivas, como N. sicca e N. subflava. Os meningococos são diplococos gram-

negativos, imóveis, não esporulados, capsulados, com as faces adjacentes

achatadas. Como o microorganismo sofre autólise com facilidade, pode-se observar

uma variação considerável em tamanho e forma nos cultivos mais antigos

(GUIBOURDENCHE e RIOU, 1997).

N. meningitidis desenvolvem-se bem em meios de cultura contendo base de

Ágar-sangue, Ágar-chocolate suplementado, tripticase-ágar-soja, agar-Mueller-Hinton

e Ágar Thayer-Martin (MS,1986; CDC,1998). O ágar Mueller Hinton, adicionado ao

suplemento Nm criado por Sotolongo, em 1991, também tem todos os nutrientes

necessários para um crescimento excelente. Nestes meios, os meningococos

Figura 1: Neisseria meningitidis Fonte: <www.worldwidevaccines.com>

16

crescem formando colônias convexas, transparentes, não pigmentadas, não

hemolíticas, com diâmetro aproximado de 1-5 mm. As colônias podem assumir

aparência mucóide, quando é formada grande quantidade de polissacarídeo capsular,

substância integrante da cápsula bacteriana e responsável pelo sistema básico para

a tipagem dos sorogrupos (SOTOLONGO, 1995; ROSENSTEIN et al, 2001).

A identificação do meningococo isolado em amostras clínicas de pacientes,

depende de uma série de fermentações de carboidratos, como o metabolismo da

glicose e da maltose, e a transformação da glicose em ácido sem produzir gás. Possui

ainda na parede celular a enzima citocromo-oxidase. Depois da identificação da N.

meningitidis como agente etiológico da DM e o reconhecimento da condição de

portadores, Scherp e Rake, em 1935 (apud APICELLA,1995), realizaram estudos de

natureza imunológica a fim de estabelecer diferentes tipos de meningococo, com base

em sua constituição antigênica.

A estrutura do meningococo inclui uma cápsula externa (polissacáride

capsular), fimbrias ou pili, membrana externa (lipopolissacarideos-LPS), membrana

citoplasmática e a massa protoplasmática interna.

Cada sorogrupo é definido pelo seu polissacáride capsular que exerce

fundamental importância na determinação da toxicidade e no poder imunogênico dos

meningococos. Atualmente são conhecidos 13 sorogrupos: A, B, C, D, 29E, H, I, K, L,

W135, X, Y e Z. Os três primeiros são responsáveis por cerca de 90% dos casos de

doença meningocócica em todo o mundo; e os demais casos são atribuídos aos

sorogrupos W135 e Y. Tem sido relatado casos de DM, associados aos sorogrupos D,

17

X e 29E, em indivíduos imunodeprimidos e portadores assintomáticos (CAUGANT,

1998; GREENWOOD, 1998; ROSENSTEIN et al, 2001).

A camada mais externa do meningococo (membrana externa) é constituída

por uma mistura complexa de lipopolissacarídeos (LPS) e proteínas encravadas entre

a dupla camada lipídica. A membrana externa contém de três a cinco proteínas

principais (PMEs), subdivididas em cinco diferentes classes estruturais, com base no

peso molecular, e são designadas em classes um, dois, três, quatro e cinco,

respectivamente. Portanto, todas as cepas de meningococo têm na sua membrana

proteínas da classe dois ou da classe três, mas nunca ambas simultaneamente.

Estas são agrupadas em uma única classe denominada 2/3 e são responsáveis pela

especificidade do sorotipo protéico (REQUEJO, 1996).

Cepas do mesmo sorotipo também podem ser diferenciadas com base nas

proteínas da membrana externa, pertencentes à classe um e à classe cinco, que

Figura 2: Estrutura do meningococo Fonte: The New England Journal of Medicine (v.344, n.18, 2001)

18

definem o subtipo do meningococo, sendo importantes marcadores epidemiológicos.

Também induzem à formação de anticorpos bactericidas e à elaboração de vacinas. A

maioria dos casos de DM causada pelo meningococo sorogrupo B pertence aos

sorotipos dois ou quinze. Já o sorotipo dois é responsável pelas epidemias causadas

pelos meningococos C, Y e W135. O sorotipo de maior patogenicidade varia de

região para região, no decorrer dos anos (CAUGANT, 1998).

A identificação descritiva de uma cepa de N. meningitidis é representada pela

seqüência sorogrupo:sorotipo:subtipo, designada então como fórmula antigênica.

Exemplo: Neisseria meningitidis B:4:P1.15, onde B é o sorogrupo, 4 o sorotipo e

P1.15 o subtipo (REQUEJO, 1996; CAUGANT, 1998).

1.3 Transmissão

A fonte de infecção da doença meningocócica é o homem, doente ou

portador, único reservatório do meningococo. A bactéria responsável pela DM, a N.

meningitidis, pode ser encontrada nas vias aéreas superiores dos seres humanos,

sem que estes apresentem quaisquer sintomas, caracterizando o estado de portador.

Essa é a forma mais comum da ocorrência da DM e da sua disseminação (Centro de

Vigilância Epidemiológica de São Paulo, 1995).

O mecanismo de transmissão do meningococo geralmente é por via direta,

por meio de gotículas de secreções nasofaríngeas, facilitadas pela presença de

fatores tais como tosse, espirros; pela viabilidade do meningococo em épocas secas,

temperaturas mais baixas; e pela maior possibilidade de contato entre portadores e

não-portadores. O período de incubação comum é de quatro dias, podendo variar

entre dois e dez dias. A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que de 10% a

19

25% da população alberguem em algum momento a N. meningitidis. Esta taxa de

portadores aumenta em situações epidêmicas (WHO, 2003).

1.4 Manifestações clínicas

As manifestações clínicas da doença meningocócica podem variar desde

formas benignas, caracterizadas por febre e bacteremias, até a quadro mais graves

que evoluem para a morte. A melhor classificação destas manifestações foi proposta

por Wolfe e Birbara, em 1968 (apud SCHELD et al., 1999), e compreende as

seguintes apresentações:

a) Bacteremia sem septicemia: quadro benigno, infeccioso respiratório

superior leve ou virose exantemática, e o diagnóstico é feito por meio de

hemocultura, que é positivo para N. meningitidis, sem antibioticoterapia

prévia;

b) Meningococcemia sem meningite: quadro grave, onde o paciente

apresenta-se septicêmico, toxemiado, com fraqueza, hipotensão e

leucocitose;

c) Meningite com ou sem meningococcemia: caracteriza-se por cefaléia,

febre, sinais meníngeos e LCR turvo. O estado do paciente pode variar

de desperto ou consciente, sonolento, torposo ou em coma.

d) Meningoencefalite: o paciente apresenta-se com depressão sensorial

profunda, sinais meníngeos e líquor purulento.

20

Mesmo havendo diferentes apresentações clínicas, a meningite e a

meningoencefalite são as formas mais freqüentes com que se manifesta a doença

meningocócica.

Em 1962, Carpenter e Petersdorf (apud APICELLA, 1995), relataram sintomas

de cefaléia e convulsões em 53 casos de doença meningocócica. A rigidez de nuca

esteve presente em menos de 50% dos pacientes. Nos lactantes e meninos

pequenos, febre e vômitos foram os únicos sintomas.

Na doença meningocócica, principalmente nas formas que evoluem com

meningite, meningoencefalite e meningococcemia, é freqüente o aparecimento de

exantema hemorrágico. Geralmente o exantema é petequial, com petéquias

pequenas e superficiais, localizando-se nas extremidades (MEIRA, 2002). O

percentual de ocorrência do exantema petequial é diretamente proporcional ao

sorogrupo prevalente. Os sorogrupos B, C e W135 levam a um número elevado de

meningococcemia (cerca de 60%), enquanto que o sorogrupo A apresenta um

percentual menor (cerca de 15%). Observa-se também exantema petequial em outras

formas de meningites bacterianas (Centro de Vigilância Epidemiológica de São Paulo,

1995).

A Síndrome de Waterhouse-Friderichsen é caracterizada pela

meningococcemia fulminante, que corresponde a cerca de 5% a 10% dos casos de

doença meningocócica. É a mais temida forma da DM, pela rapidez com que se

instala e pela elevada letalidade, podendo ocorrer coagulação intravascular

disseminada e colapso periférico. As insuficiências cardíacas são, em geral, os

eventos terminais. Muitos destes casos não apresentam alterações liquóricas, ou

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estas são muito discretas e acompanhadas de baixa celularidade. São mais comuns

em crianças, com letalidade elevada, variando em média de 20% a 40% (APICELLA,

1995).

A doença meningocócica pode se apresentar de diversas formas. Porém, os

critérios estabelecidos pelo Ministério da Saúde (Centro de Vigilância Epidemiológica

de São Paulo, 1995) são baseados no quadro clínico e nos resultados dos exames

laboratoriais:

a) Meningite meningocócica com meningococcemia:

- Paciente apresenta quadro clínico toxi-infeccioso agudo com sinais e

sintomas de meningite, acompanhado de petéquias e/ou sufusões

hemorrágicas, exames laboratoriais negativos ou não realizados sem

outro agente etiológico determinado;

- Paciente apresenta quadro clínico toxi-infeccioso agudo, com sinais e

sintomas de meningite, acompanhado de petéquias e/ou sufusões

hemorrágicas, somente com celularidade alterada no exame

quimiocitológico do LCR e demais exames negativos ou não realizados.

Nestes casos, os critérios para confirmação de diagnóstico são clínicos;

- Bacterioscopia positiva no LCR e/ou no raspado de lesões de pele;

- Cultura positiva no LCR e/ou no sangue. Quando possível, identificar

sorogrupo, sorotipo e subtipo do meningococo;

- Contraimunoeletroforese (CIEF) positiva no sangue e no LCR;

- Látex positivo no LCR ou no sangue;

b) Meningite meningocócica:

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- Paciente com sinais e sintomas de meningite sem a presença de

petéquias e/ou sufusões hemorrágicas. O agente tem que ser identificado

no mínimo pelo GRAM, a não ser que utilize o critério epidemiológico;

- Bacterioscopia positiva no LCR;

- Cultura positiva no LCR;

- CIEF positiva no LCR;

- Látex positivo no LCR;

c) Meningococcemia:

- Quando o paciente apresentar quadro toxiinfeccioso grave, com petéquias

ou sufusões hemorrágicas, mas sem sinais de meningite e alterações

liquóricas que demonstrem a invasão do LCR pelo agente etiológico, utiliza-

se o critério clínico para definir o caso como meningococcemia;

- Bacterioscopia positiva no sangue e/ou no raspado de lesão de pele;

- Cultura positiva no sangue;

- CIEF positiva no soro;

- Látex positivo no soro;

Eventualmente o meningococo pode causar também outras entidades

clínicas, como infecções respiratórias (pneumonias) e inflamações das serosas ou

articulações, causando pleurite, pericardite ou artrite (WHO, 2003).

1.5 Fisiopatologia

A nasofaringe é colonizada por meningococos, através de estruturas

fenotípicas na sua superfície, as pili (ou adesinas), que os permite aderir à mucosa,

sendo fator importante para o estabelecimento do estado de portador e na habilidade

23

dessas bactérias em transpor a barreira “sangue-líquido cefalorraquidiano” e atuar

sobre as meninges.

Após o ataque à superfície da mucosa, a bactéria é transportada através de

células epiteliais, dentro dos vacúolos fagocíticos, atingindo a corrente sangüínea.

Eventualmente as bactérias podem penetrar o espaço sub-aracnóideo, atingindo o

LCR (REQUEJO, 1999; ROSENSTEIN et al., 2001).

O LCR e o espaço sub-aracnóideo são deficientes em células fagocíticas,

complemento e anticorpos. Assim, a invasão e a multiplicação do meningococo no

LCR causam inflamação das meninges, ou seja, a meningite.

A inflamação das meninges inicia-se com a liberação de lipopolissacarídeos e

outros componentes da parede celular no espaço sub-aracnóideo. Os monócitos são

estimulados pelos antígenos bacterianos a produzir interleucina-1 (IL-1) e estimulam

macrófagos, astrócitos, células microgliais, ependimais e endoteliais do sistema

nervoso central (SNC) a produzir a citoquina, TNF-alfa (fator de necrose tumoral-alfa).

A TNF-alfa e IL-1 agem sinergicamente, induzindo as respostas inflamatórias, o que

manifesta clinicamente a meningite (MEIRA, 2002; REQUEJO,1999).

1.6 Diagnóstico laboratorial

O diagnóstico definitivo da doença meningocócica é estabelecido pelo

isolamento bacteriológico e identificação de N. meningitidis de líquidos biológicos

habitualmente estéreis, como sangue, líquido cefalorraquideo (LCR), e outros, como o

líquido sinovial, pleural ou pericárdico. O LCR e o sangue constituem-se nas principais

fontes de cultivo positivo para meningococo, desde que coletados antes da

24

administração de antibióticos. Em aproximadamente 20% a 25% de pacientes com

meningococcemia, os meningococos são visualizados na gota espessa do sangue

periférico. Em aspirado de petéquias, os microrganismos são observados em

aproximadamente 70% pela coloração de GRAM, no interior de polimorfonucleares

(SCHELD et al., 1999; GRAY e FEDORKO, 1992).

Recomenda-se, ainda, a detecção de antígenos capsulares por métodos

imunológicos, como contra-imunoeletroforese, ensaios imunoenzimáticos ou

aglutinação pelo látex sensibilizado com anti-soros específicos. Por esses métodos é

possível obter diagnóstico rápido e, em algumas vezes, até mesmo a partir de LCR

que não foi adequadamente armazenado e encaminhado para o laboratório (MS,

2000; SOTOLONGO, 1995; GRAY e FEDORKO, 1992).

1.6.1. Estudo do Líquido Cefalorraquidiano- Líquor/LCR

Os exames de rotina mínimos a serem realizados em toda amostra de LCR

são o quimiocitológico; citológicos com contagem global e diferencial de células;

bioquímicos, com dosagem de glicose, proteínas e lactato; microbiológicos com

bacterioscopia pelo método Gram; além da cultura e da pesquisa do antígeno do

meningococo pela contraimunoeletroforese ou aglutinação pelo látex (MS, 1986;

SOTOLONGO, 1995).

O aspecto do LCR deve ser verificado imediatamente após a sua retirada. A

pleocitose confere um aspecto opalescente a este; e as concentrações maiores de

células tornam-no turvo. O aspecto purulento é um forte indicativo de DM. Quanto à

celularidade, há uma quantidade de leucócitos que varia de zero a mais de 100.000

25

células/ml de LCR. O exame diferencial revela ou não predomínio de

polimorfonucleares (APICELLA, 1995; GRAY e FEDORKO, 1992)

As dosagens bioquímicas podem fornecer elementos prognósticos. A glicose

no líquor corresponde a dois terços da glicose sanguínea. Hipoglicorraquia pode ser

notada em casos onde existe um curto tempo da DM, algo em torno de um a três dias.

Nos estágio iniciais da DM, o nível de proteínas no LCR geralmente está elevado.

Com a regressão do processo inflamatório, a concentração protéica se reduz, em

associação com a pleocitose. Em relação ao lactato, estudos indicam que é um

indicador de DM mais sensível que a glicose e proteínas, já que muitas vezes a

concentração está aumentada sem qualquer indicação da pleocitose no LCR

(WATSON & SCOTT, 1996).

1.6.1.1 Bacterioscopia

É um exame essencial. Trata-se de um método rápido baseado na técnica de

Gram, capaz de revelar o agente etiológico em até 90% dos casos. A visualização e

descrição morfológica dos microrganismos só é possível quando há mais de 105

germes/ml em LCR não-centrifugado. Enquanto que o uso prévio de antibióticos reduz

em 75% a positividade das culturas liquóricas, a bacterioscopia sofre influência em

apenas 10% na sensibilidade em detectar bactérias sob tais circunstâncias (GRAY e

FEDORKO, 1992).

1.6.1.2 Cultura de Líquor

Método que permite o isolamento e a identificação da N. meningitidis,

viabilizando a determinação do sorogrupo, sorotipo e subtipo através da aglutinação

com antisoros específicos. O líquor deve ser semeado em Ágar sangue, ágar

26

chocolate, Thayer Martin, tendo como base o Ágar Muller-Hinton enriquecido,

suplementado com sangue de coelho, carneiro ou cavalo a 5%. Incubar por 24-48h, a

35º-37ºC em 5%-10% de atmosfera de CO2 e saturação de umidade (MS, 2000;

GRAY e FEDORKO, 1992; SOTOLONGO, 1995).

1.6.1.3 Pesquisas de antígenos polissacarídeos - aglutinação pelo látex

A detecção de antígenos bacterianos por meio de ensaios imunológicos é um

complemento importante para a definição presuntiva do agente etiológico da DM. A

antibioticoterapia prévia algumas vezes inibe o crescimento bacteriano nos meios de

cultura e, dessa forma, os ensaios imunológicos são a alternativa para a detecção do

agente etiológico (MS, 2000).

1.6.2. Sangue

Importante material no caso de meningococcemia com ou sem meningite, pois

nestes casos os exames de líquor podem ter resultados negativos.

1.6.2.1 Hemocultura (Cultura do sangue)

Usando método manual ou automatizado, deve-se coletar duas amostras com

quantidade correspondente de 10% a 20% do volume do meio, devendo-se incubar à

temperatura 35º-37ºC, fazendo repique de 24 a 48 horas. O meio de cultura indicado

para este procedimento é o TSB ou BHI com anticoagulante (Ministério da Saúde,

2000).

1.6.3. Pele

A bacterioscopia nos raspados de lesões hemorrágicas de pele é indicada nos

casos em que o paciente apresenta sinais de meningococcemia. Deve-se aplicar a

coloração pelo método de GRAM (SOTOLONGO, 1995).

27

1.6.4. Sangue capilar periférico (gota espessa)

Trata-se de exame presuntivo na suspeita de meningococcemia, onde utiliza-

se a coloração pelo Azul de metileno a 1% (SOTOLONGO, 1995).

1.7 Tratamento

A doença meningocócica é potencialmente fatal e sempre deverá ser vista

como uma emergência médica. A terapia antimicrobiana (antibioticoterapia) deve ser

aplicada o mais rápido possível, preferencialmente logo após a punção lombar;

devendo ser associada a outros tipos de tratamento de suporte, como reposição

hídrica e cuidados assistenciais de enfermagem.

Os antibióticos preconizados pelo Ministério da Saúde são Penicilina

G.Cristalina e Ampicilina. A Rifampicina é indicada como droga de primeira escolha

para a quimioprofilaxia, por erradicar o estado de portador em um percentual elevado

e por apresentar poucos efeitos colaterais (FUNASA/MS, 2002).

Em áreas com instalações de saúde precárias, tomando como base as

condições epidêmicas da África, o Cloranfenicol oleoso é a droga de primeira escolha:

uma única dose tem ação prolongada (WHO, 2003).

1.8 Epidemiologia

A doença meningocócica (DM) continua sendo um sério problema de Saúde

Pública mundial devido a alta taxa de morbidade e mortalidade à qual está associada.

A situação é mais grave nas regiões tropicais, onde o número de casos aumenta no

inverno e primavera. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), os

sorogrupos B e C são os responsáveis pela maioria dos casos na Europa e América.

28

Várias epidemias atribuídas ao sorogrupo C ocorreram no Canadá e EUA, nos

anos de 1992-1993, e na Espanha, entre 1995 e 1997. Durante dez anos a doença

meningocócica aumentou particularmente na Nova Zelândia onde, em média, 500

casos acontecem todos os anos, sendo a maioria deles associada ao sorogrupo “B”

(WHO, 2001).

O sorogrupo “A” foi responsável por uma epidemia que se propagou por vários

países. Inicialmente no Nepal, em 1983, atingindo a Índia e o Paquistão em 1985, e a

Arábia Saudita em 1987, ocasionada pela peregrinação religiosa à cidade de Meca,

provavelmente trazida por peregrinos do sul da Ásia. Entre 1988 e 1989, após o

retorno dos sauditas para suas residências, ocorreram intensas epidemias em vários

países africanos. Os sorogrupos B e C têm sido responsáveis também por eventos

epidêmicos, porém de menor intensidade (MOORE e BROOME, 1994).

Fora da África, só a Mongólia informou uma grande epidemia nos anos 1994 e

1995. Nos anos 2000 e 2001 foram evidenciadas epidemias associadas ao sorogrupo

"W135". Enquanto assistiam o Hajj na Arábia Saudita, cem peregrinos foram

infectados com N. meningitidis, do sorogrupo “W135”. Em 2002, o mesmo sorogrupo

apareceu em Burkina Faso, infectando 13.000 pessoas, resultando em 1.500 óbitos

(WHO, 2003).

Nos países do cinturão africano das meningites, uma área que vai do oeste do

Senegal ao leste da Etiópia, cuja população é de 300 milhões de pessoas, as

epidemias acontecem de modo cíclico. N. meningitidis sorogrupos "A", "C" e "W135"

são os mais prevalentes. Nessas epidemias, as taxas de incidência variam de cem a

29

oitocentos casos por 100 mil habitantes. Nas pequenas comunidades, essas taxas

chegam a 1.000 por 100 mil habitantes (MEMISH, 2002).

A maior epidemia registrada na África aconteceu no ano de 1996, com mais

de 250.000 casos e 25.000 mortes. Entre 1996 e 2002 foram informados à

Organização Mundial de Saúde 223 mil casos novos de doença meningocócica. Em

2002, os países mais afetados foram Burkina Faso, Chade, Etiópia e Niger, que

contribuíram com 65% dos casos, o que sugere que o cinturão africano das

meningites esteja se deslocando para o Sul. A Grande Região dos Lagos foi afetada

com endemias em aldeias e acampamentos de refugiados com mais 2.500 casos e

200 óbitos (WHO, 2003).

No Brasil, segundo Branham, de 1953 (apud MELLES e TAUNAY, 1992) até

1928 não se dispunha de dados estatísticos fiéis sobre a doença meningocócica.

Entre os anos de 1923 e 1926, amostras de N. meningitidis puderam ser identificadas

no Instituto Adolfo Lutz, em São Paulo, como pertencentes ao grupo I, que

corresponde ao sorogrupo "A". De 1928 a 1931, foram registrados 474 casos

suspeitos de meningites bacterianas. Cerca de 20% destas cepas puderam ser

identificadas como N. meningitidis. De 1939 a 1942, as amostras de N. meningitidis

foram analisadas como pertencentes ao grupo II, que corresponde ao sorogrupo “B”,

na classificação atual.

No Estado de São Paulo houve epidemias de doença meningocócica de 1945

a 1952 e de 1971 a 1974, sendo esta última causada por dois sorogrupos: sorogrupo

"C" em 1971 e sorogrupo "A" em 1974. Oito meses após a implantação da epidemia,

associada ao meningococo do sorogrupo “A”, já haviam sido comprovados 6.533

30

casos de meningite por esse sorogrupo, enquanto que o número de casos associados

ao sorogrupo “C” foi em torno de 1.900, para os anos de 1973 e 1974. Essa

ocorrência ficou registrada como uma das maiores epidemias da DM que atingiu o

Brasil, ano em que o coeficiente de incidência geral chegou a atingir 179 por 100 mil

habitantes. A partir de 1977 a N. meningitidis sorogrupo “A” praticamente desapareceu

e o sorogrupo C retornara ao seu nível endêmico (MELLES e TAUNAY, 1992).

No período entre 1980 e 1986 as taxas de incidência da DM para o Brasil

foram relativamente baixas (em torno de 1 por 100.000 habitantes). Houve, então, um

crescimento que atingiu o maior pico em 1996 (4,5 por 100 mil habitantes). A partir de

1987, foram registrados aumentos em vários Estados isolados, como São Paulo em

1988, que foi atingido por um novo surto epidêmico, associado ao sorogrupo “B”. Em

1989, Amapá e Sergipe atingiram índices de 14,8 e 10,5 por 100 mil habitantes,

respectivamente (FUNASA/MS, 1999).

No período de 1993 a 1997, ocorreu no Brasil uma outra elevação na

incidência da DM, com taxas próximas a 4 por 100 mil habitantes. Nessa década, as

regiões de maior incidência foram Sul e Sudeste, particularmente nos Estados de

Santa Catarina, Espírito Santo, Rio de Janeiro, Paraná e, novamente, São Paulo, que

apresentaram coeficientes de 11; 10,8; 9,4; 7,0 e 6,4 por 100 mil habitantes,

respectivamente, em diferentes anos. Outros Estados da Federação, como

Amazonas, Sergipe, Goiás e Distrito Federal, também apresentaram, em alguns anos,

incidência superior à média nacional (FUNASA/MS, 1999).

31

O número de casos no Brasil para o período de 1998 a 2001, divulgado em

2002 pela Fundação Nacional de Saúde (FUNASA/MS, 2001), foi de 17.639, com

3.149 óbitos.

Segundo informação da FUNASA, em julho de 2003 foram notificados no país

1.195 casos de DM, com 215 óbitos, perfazendo um coeficiente de incidência de 0,68

por 100 mil habitantes e 18% de letalidade. A Região Norte do país apresentou um

coeficiente de incidência de 0,69 por 100 mil habitantes. A prevalência desses casos

está associada a N. meningitidis sorogrupo “B”.

No Estado do Amazonas, as primeiras informações disponíveis sobre a

doença meningocócica aparecem apenas em 1976 com a comunicação de dez casos

e sete óbitos ocorridos no município de Lábrea, um ano após de o Ministério da Saúde

ter aplicado na população daquela cidade a vacina anti-meningocócica A-C. Em

1977, mais 21 casos, com dois óbitos, foram registrados no mesmo município,

havendo ainda suspeita da ocorrência de mais cinco casos, com dois óbitos, em uma

família residente no Seringal São Pedro. Foram coletadas, pelo Instituto Evandro

Chagas, amostras de material da nasofaringe destes indivíduos, cujos cultivos

revelaram a presença de quatro portadores de N. meningitidis entre 17 pessoas

examinadas. O estudo epidemiólogico revelou que essa família havia estado naquele

município na época do agravo (LINS, 1983).

Segundo o Boletim Epidemiológico da FSESP, o total acumulado de casos de

DM no Estado do Amazonas, nos anos de 1976 a 1977, foi de 13 e 49 casos,

respectivamente. De 1978 a 1980, o total foi de 59 casos, com 18 óbitos, onde os

sorogrupos envolvidos nessas microendemias foram o "C" e o "A" (LINS, 1983).

32

A DM no Amazonas ocorre durante todo o ano, apresentando picos

principalmente entre dezembro e janeiro, período chuvoso de temperaturas mais

baixas. Entre 1997 e 2002, foram notificados 740 casos de DM em todo o Estado,

com a incidência anual em torno de 4,5 por 100 mil habitantes, portanto, acima da

média nacional, que era em torno de 2,76 por 100 mil habitantes no ano de 2000. Os

sorogrupos circulantes foram o “B” e o “C”, com predomínio do sorogrupo “B”

(FMT/IMT-AM, 2002).

Em Manaus, capital do Amazonas, nesse mesmo período foram confirmados

532 casos de DM com 74 óbitos. A incidência em 2001 foi de 6,8 por 100 mil

habitantes e as zonas com maior freqüência foram Oeste, Centro-Sul e Leste. A

letalidade da doença meningocócica variou em torno de 10%, sendo que as menores

taxas foram observadas quando o diagnóstico e tratamento se mostraram precoces.

No Estado do Amazonas, esta letalidade gira em torno de 15% e 20% (SARAIVA et

al., 2003).

Na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTAM), foi verificado, no

período de 1994 a 1999, um total de 1.965 casos de meningites, sendo 451 casos

associados a DM, com 51 óbitos. No ano de 1998 houve uma elevação significativa de

doença meningocócica, com a ocorrência de 45% dos casos no primeiro trimestre,

sendo necessária a aplicação da vacina anti-meningocócica B-C, que reduziu

substancialmente o número de casos. O percentual de óbito no mesmo período foi de

15,6% (FMTAM, 1999).

No ano de 2002, a FMTAM notificou 347 casos de meningites com 34 óbitos,

cuja taxa de letalidade foi de 9,8%, sendo 133 casos suspeitos de doença

33

meningocócica, com vinte óbitos e com predomínio do sorogrupo “B”. A doença

ocorreu com mais severidade em crianças menores de quatro anos, apresentando

características endêmicas, tendo sido verificada em todas as zonas urbanas de

Manaus (SARAIVA, et al., 2003).

34

OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Avaliar a importância clínico-epidemiológica dos marcadores laboratoriais presuntivos

e confirmatórios para o diagnóstico da doença meningocócica.

2.2. Objetivos específicos

2.2.1 Descrever os resultados de marcadores laboratoriais inespecíficos que auxiliem

como elementos para o diagnóstico presuntivo.

2.2.2 Estimar a ocorrência de isolados de Neisseria meningitidis em relação ao

material biológico utilizado.

2.2.3 Avaliar a importância de provas imunológicas rápidas para a definição de

sorogrupos.

2.2.4 Identificar, com provas sorológicas, cepas de Neisseria meningitidis isoladas de

material biológico e determinar as variedades das mesmas.

35

METODOLOGIA

3.1 Modelo de estudo

Trata-se de um estudo laboratorial descritivo retrospectivo de resultados de

amostras biológicas de pacientes suspeitos de doença meningocócica recebidas no

Laboratório de Bacteriologia da FMTAM, no período de janeiro a dezembro de 2002.

3.2 Universo de estudo

3.2.1 População de Estudo

Pacientes com suspeita clínica de doença meningocócica atendidos e

referenciados para a Unidade Hospitalar Nelson Antunes da Fundação de Medicina

Tropical do Amazonas (UHNA/FMTAM), unidade de referência para atendimento de

doenças infecciosas e parasitárias. Após identificação do caso suspeito, esses

pacientes foram submetidos a coletas de material biológico: sangue, líquor e, em

alguns casos, escarificação de lesão de pele e sangue capilar periférico (gota

espessa), cujas amostras foram encaminhadas ao Laboratório de Bacteriologia da

FMTAM, unidade de referência para diagnóstico de meningites no Estado do

Amazonas, para elucidação de diagnóstico.

36

3.2.2 Critérios de inclusão

Todos os casos suspeitos de DM com pelo menos uma prova laboratorial

confirmada.

Definição de caso de Doença Meningocócica

Critério Clínico-laboratorial

Todo caso suspeito que apresente pelo menos uma das seguintes condições:

• Cultura positiva do LCR ou sangue, com isolamento de Neisseria meningitidis

(padrão ouro);

• Látex positivo, com detecção do antígeno no LCR ou sangue;

• Contraimunoeletroforese (CIE) positiva com detecção do antígeno no LCR e

sangue;

• Bacterioscopia do LCR ou raspado de lesões da pele, com achado de diplococo

gram-negativo;

• Reação de Cadeia de Polimerase (PCR) positivo, com detecção da cadeia

genética da Neisseria meningitidis.

Observação

Devemos salientar que neste estudo não foram considerados como critério de

inclusão a Contraimunoeletroforese (CIE) e a Reação de Cadeia de Polimerase (

PCR), por não fazer parte da rotina do Laboratório de Bacteriologia.

37

3.2.3 Critérios de exclusão

Caso suspeito com diagnóstico laboratorial negativo, sem vínculo

epidemiológico com caso suspeito ou com diagnóstico confirmado de outra doença.

3.2.4 Seleção da amostra

Foram analisados os resultados de amostras biológicas recebidas no

Laboratório de Bacteriologia da FMTAM, no período de janeiro a dezembro de 2002,

com hipótese diagnóstica de Doença Meningocócica. Após análise dos dados de 133

casos suspeitos, somente 120 resultados estavam de acordo com os critérios

estabelecidos pelo Ministério da Saúde para definição de Doença Meningocócica.

Para anotação dos resultados foi elaborada a Ficha Clínico-laboratorial de

pacientes com Doença Meningocócica, especificamente elaborada para este estudo e

devidamente preenchida após a coleta de dados da ordem de serviço emitida pelo

Sistema de Controle e Emissão de Exames Bacteriológicos pertencente ao

Laboratório de Bacteriologia. Nesta ficha constavam as seguintes informações:

- data de entrada do material no laboratório;

- nome do paciente;

- idade;

- sexo;

- exames solicitados; e

- resultados.

Verificou-se se o caso havia sido notificado e, em caso positivo, acrescentou-se

na ficha de cada um dos pacientes, por meio da Ficha de Investigação Individual de

Meningites do Sistema Nacional de Agravos de Notificação-SINAN, fornecida pela

Sub-Gerência de Epidemiologia da FMTAM, informações como:

38

- início dos sintomas;

- data da internação;

- uso prévio de antimicrobianos;

- data da alta ou óbito; e

- classificação final da doença meningocócica.

3.3. Procedimentos laboratoriais

As amostras biológicas recebidas para processamento no Laboratório de

Bacteriologia da FMTAM foram de pacientes encaminhados pelas unidades de

assistência da Rede Hospitalar da Cidade de Manaus à UHNA/FMTAM. Esses

pacientes foram atendidos pelas equipes de plantão e, após a identificação do caso

suspeito de DM, submetidos à coleta de materiais biológicos.

Para a apresentação clínica de meningococcemia foram coletados líquor,

sangue e, em alguns casos, escarificação de lesão de pele e sangue capilar periférico

(gota espessa).

Para meningite meningocócica foram coletados líquor e sangue.

Nos quadros de meningite mista, foram coletados líquor, sangue e, em alguns

casos, escarificação de lesão de pele e sangue capilar periférico (gota espessa).

Após a coleta, os materiais biológicos foram imediatamente enviados para

processamento ao Laboratório de Bacteriologia da FMTAM, em frascos esterilizados e

identificados adequadamente.

39

3.3.1 Líquido cefalorraquidiano - LCR

Segundo a metodologia recomendada pelo Ministério da Saúde (1986, 2000)

e pelo Centro de Referência Nacional de Meningites - Instituto Adolfo Lutz e

implementado pelo Laboratório de Bacteriologia da FMTAM, a análise laboratorial do

LCR compreendeu os exames físico, citoquímico, bioquímico, imunológico e

bacteriológico.

3.3.1.1 Exame físico do LCR

Refere-se à descrição do aspecto e da cor do LCR. O LCR normal se apresenta

límpido e incolor. Um LCR comprometido torna-se:

- turvo: com 200 ou 300 leucócitos/mm3.

- esbranquiçado ou opalescente: com 500 leucócitos/mm3.

- purulento- com mais de 700-800 leucócitos/mm3.

- xantocrômico- quando existem proteínas com valor maior ou igual a 200 mg/dl.

3.3.1.2 Exame citoquímico do LCR

Esse exame deve ser realizado imediatamente após a chegada do LCR no

laboratório, pois os leucócitos e as hemácias desintegram-se rapidamente, podendo

levar a resultados incorretos. Neste estudo foi utilizada a Câmara de Fucks-Rosenthal

para contagem e avaliação da celularidade global e, após centrifugação, as lâminas

foram coradas pelo método de Panótico para contagem específica e observação das

células à microscopia.

Número de células ou número de leucócitos: aceitam-se como limites superiores

de normalidade:

- recém-nascidos: até 15 leucócitos/mm3

40

- menores de um ano: até 10 leucócitos/mm3

- com um ano ou mais: até 4 leucócitos/mm3

Contagem diferencial de células: Em um líquor normal existe a predominância de

células mononucleares em 99% e 1% de outras células, como polimorfonucleares

neutrófilos.

3.3.1.3 Exame bioquímico

Foram analisadas neste estudo as dosagens bioquímicas de glicose, proteína

total e lactato, utilizando-se a parte sobrenadante do líquor após centrifugação a

2.000rpm durante 10 minutos.

a) Determinação da glicose no LCR (glicorraquia): Na determinação dos

níveis de glicose foi empregado o método enzimático Glicose-6-fosfato desidrogenase

(G-6-PDH), utilizando-se o aparelho de marca DADE-BEHRING, modelo DIMENSION

AR, cujos valores de referência para normalidade estão no intervalo entre 40 a 75

mg/dl.

Normalmente, a glicose no líquor (glicorraquia) é de 60% (ou 2/3) do valor da

glicose do sangue (glicemia). Nas infecções bacterianas geralmente ocorre um valor

abaixo de 40% da glicemia, realizada concomitantemente. Como neste estudo não foi

feita glicemia junto com a punção liquórica para fins de comparação, aceitou-se como

valor normal para glicose no LCR algo em torno de 50 a 90mg/dl, valor este

preconizado pelo Ministério da Saúde (1986).

41

b) Determinação da proteína total no LCR (proteinorraquia): Para

determinação das proteínas no LCR foi realizado o método UCEP (molibdato-rojo-de

piragalol), por meio do aparelho marca DADE-BEHRING, modelo DIMENSION AR,

cujo valor de referência varia de 15-45,0 mg/dl. .

A quantidade de proteínas considerada normal, segundo o Ministério da Saúde

(1986), varia conforme a idade:

• Recém-nascidos: 50 a 120mg/dl

• Crianças e adultos: 15 a 40mg/dl

c) Determinação do lactato no LCR: As análises desse estudo foram feitas

pelo método enzimático LDH (desidrogenase láctica), sendo processadas por meio do

aparelho automatizado DADE-BEHRING modelo DIMENSION AR, cujos valores de

referência para normalidade estão entre 0,2 e 2,2 mmol/L.

3.3.1.4 Exame imunológico

Pesquisa de antígenos polissacarídicos (aglutinação pelo látex)

Para a pesquisa de antígenos de meningococo no LCR, empregou-se o Kit

Slidex meningite-kit 5 Biomérieux e Pastorex® meningites Sanofi Pasteur seguindo-

se as normas do fabricante. O princípio deste método baseia-se na aglutinação em

lâminas, quando se aplica sobre o material biológico estudado reagentes contendo

partículas de látex sensibilizadas por anti-soros A, B, C e W135.

42

3.3.1.5 Exame bacteriológico

Para cada LCR foram realizados os exames bacterioscópico direto e cultura,

ambos indispensáveis, pois além de determinarem a natureza da infecção são de

importância vital para a orientação terapêutica.

- Bacterioscopia direta do líquor: É o exame do LCR no qual pode ser visualizado,

pela coloração de Gram modificado por Hucker, o diplococo gram-negativo intra e

extra-celulares.

- Cultura do líquor: A cultura do LCR vai permitir o isolamento e identificação de

Neisseria meningitidis, possibilitando a determinação do sorogrupo, sorotipo e subtipo

por meio da aglutinação com antissoros específicos. O LCR deve ser semeado em

agar Mueller-Hinton com sangue a 5% e Ágar chocolate a 5% (podendo este sangue

ser de carneiro ou de cavalo) e ainda Agar Thayer-Martin e Agar Mueller-Hinton

enriquecido com Isovitalex e adicionado à mistura inibidora VCN (vancomicina,

colistina e nistatina), incubando-se em estufa de CO2. Após o isolamento, a

identificação é feita por meio da bacterioscopia (GRAM), prova de oxidase, prova de

catalase e fermentações de glicose e maltose. As bactérias que se apresentaram sob

forma de diplococcos Gram-negativos, com provas de oxidase e catalase positivas,

foram consideradas Neisseria meningitidis, segundo Manual Bergey, 1984 (apud

Sotolongo, F., 1995).

3.3.2 Hemocultura

O sangue para cultura foi coletado e armazenado em frascos de cultivo

BACT/ALERT FA, numa quantidade de 10 ml para adulto e de 3 a 5 ml no frasco

pediátrico, e incubados em seguida no Sistema de Detecção Microbiana

43

BACT/ALERT (Organon-Teknika), que é capaz de detectar o crescimento bacteriano

entre 10 e 12 horas de incubação.

3.3.3 Escarificação de lesão de pele

A coleta das petéquias foi feita com lanceta ou agulha estéril, sendo o material

depositado em lâmina de vidro. Deixou-se secar e em seguida foi feita coloração pelo

método de GRAM, após a qual as lâminas foram lidas com objetiva de imersão (100x)

em microscópio binocular. Os diplococos gram-negativos (DGN) foram visualizados no

interior dos neutrófilos polimorfonucleares.

3.3.4 Sangue capilar periférico (gota espessa)

Procedimento realizado para diagnóstico presuntivo de meningococcemia. Era

feita lâmina com sangue capilar e em seguida corada com solução de azul de

metileno a 1% durante dois minutos. As lâminas foram lidas com objetiva de imersão

(100x) em microscópio binocular. Os diplococos gram-negativos (DGN) foram

visualizados em coloração azul escura, contra um fundo azul claro, onde apareceram

também polimorfonucleares.

3.3.5 Sorogrupagem

Uma vez identificadas as cepas de Neisseria meningitidis, a classificação do

sorogrupo é dada pelos polissacarídeos da cápsula, por meio de aglutinação com

anti-soros específicos A,B,C e W135.

3.3.6 Subtipagem

Definidos os sorogrupos, as cepas de Neisseria meningitidis são repicadas em

tubos com agar Mueller-Hinton enriquecido e enviadas conforme fluxo e contrafluxo,

44

combinados previamente com o Laboratório Central (LACEN), que as encaminharam

para o Instituto Adolfo Lutz(IAL) do Estado de São Paulo Laboratório de Referência

Nacional para Meningites, para determinação dos sorotipos e subtipos pela reação

imunoenzimática, utilizando anticorpos monoclonais específicos.

3.4 Análise dos dados

Os dados foram registrados em banco de dados tipo DBF padrão Xbase.

Análises estatísticas foram conduzidas utilizando o programa Epi Info versão 6.04d

fornecido gratuitamente por Centers for Disease Control & Prevention (CDC)-USA.

Métodos padrões de análise foram realizados, iniciando com a descrição estatística

simples, IC95% e teste de significância foram empregados para validar as proporções

encontradas. Foram calculadas médias, IC95% e testes de significância para

variáveis numéricas.

45

RESULTADOS

O presente estudo compreendeu o conjunto de 120 pacientes atendidos na

UHNA/FMTAM com diagnóstico de Doença Meningocócica, com as investigações

epidemiológica e laboratorial concluídas. Destes 120 pacientes foram coletadas 115

amostras de sangue, 113 amostras de líquor, 17 amostras de sangue capilar periférico

e 12 amostras de escarificação de lesões de pele (figura 3), as quais foram utilizadas

para os procedimentos laboratoriais.

Dos pacientes incluídos no estudo observou-se que a DM atingiu ambos os

gêneros, na relação de 69 (57,5%) e 51 (42,5%) respectivamente para o masculino e

12

17

113

115

0 20 40 60 80 100 120

Escarificação

Sangue capilar

Líquor

Sangue

Figura 3: Freqüência dos materiais biológicos coletados para diagnóstico laboratorial da Doença Meningocócica – FMTAM/2002

46

o feminino. A idade média correspondeu a 13,9 anos, com mediana de 11 anos,

sendo que a idade mínima foi igual a quatro meses e a máxima de 79 anos. A idade

média dos homens foi igual a 15 anos e a das mulheres em torno de 13 anos,

diferença estatisticamente significativa (p=0,03). Em relação a distribuição por grupo

de idade, 35% dos pacientes acometidos estavam na faixa de até 5 anos e 22% acima

dos 20 anos, observando-se maior prevalência nos extremos. Na distribuição por

gênero, as mulheres foram mais atingidas na faixa de até 5 anos e os homens mais

atingidos na faixa acima dos 20 anos (Tabela 1).

Tabela 1 - Distribuição segundo faixa etária e gênero dos pacientes com Doença Meningocócica-FMTAM/2002

Gênero

Masculino Feminino Total Faixa etária

N % N % N % Até 5 anos 18 42,8 24 57,2 42 100 6 a 10 anos 12 66,7 6 33,3 18 100

11 a 15 anos 12 66,7 6 33,3 18 100 16 a 20 anos 7 46,7 8 53,3 15 100

Acima de 20 anos 20 74,1 7 25,9 27 100 Total 69 57,5 51 42,5 120 100

4.1 Forma Clínica

De acordo com o diagnóstico da DM, os casos foram caracterizados segundo

a forma de apresentação clínica, verificando-se que a forma clínica frequentemente

observada foi a forma mista em 63 (52%), onde se fazia presente a sintomatologia

compatível com a meningococcemia associada ao comprometimento meníngeo. A

menigococcemia isoladamente correspondeu a 32 (27%) e a meningite

meningocócica 25 (21%), de acordo com a Figura 4.

47

4.2 Marcadores laboratoriais

4.2.1 Marcadores presuntivos

4.2.1.1 Análise do Líquido Cefalorraquidiano

Foram analisadas 113 amostras de líquor, segundo critérios já definidos no

item 3.2.2, cujos resultados foram os seguintes.

4.2.1.1.1 Aspecto do líquor

O aspecto turvo do líquor predominou em 82 amostras (72,6%), encontrando-

se 28 (24,8%) com aspecto límpido e as demais enquadrando-se em hemorrágico ou

purulento. Na estratificação segundo a forma clínica da doença, verificou-se que o

aspecto límpido correspondeu predominantemente na meningococcemia, enquanto

que o turvo na meningite meningocócica e na forma mista (Tabela 2).

Meningite mista63

(52%) Meningococcemia32

(27%)

Meningite meningocócica

25(21%)

Figura 4: Distribuição dos 120 casos de doença meningocócica segundo a forma clínica – FMTAM/2002

48

Tabela 2 – Distribuição do aspecto do líquor nas 113 amostras de acordo com a forma clínica da Doença Meningocócica – FMTAM/2002

Forma clínica da DM Aspecto do

Líquor Meningite meningocócica

Meningococcemia

Meningite mista

Total

N % N % N % N % Límpido 0 0,0 24 88,9 4 6,5 28 24,7Hemorrágico 0 0,0 0 0,0 2 3,2 2 1,8Turvo 24 100,0 3 11,1 55 88,7 82 72,6Purulento 0 0,0 0 0,0 1 1,6 1 0,9Total 24 100,0 27 100,0 62 100,0 113 100,0

4.2.1.1.2 Estudo citoquímico do líquor

Compreendeu o estudo da celularidade global (citometria) e da citologia.

a) Análise da celularidade global (Citometria): Na celularidade global do

líquor, observou-se diferença de comportamento segundo a forma clínica. Na

meningite meningocócica, a média (x) foi igual a 5.912 leuc/mm3 (405-21.333

leuc/mm3), na forma mista a média da celularidade correspondeu a 6.122 leuc/mm3 (5-

24.154 leuc/mm3) e na meningococcemia esta média foi igual a 12,7 leuc/mm3 (0-53

leuc/mm3). Observou-se ainda o predomínio de neutrófilos polimorfonucleares em

74,28% das amostras, diferença estatisticamente significativa (x2=59,41, p< 0,001),

conforme demonstra a Tabela 3.

b) Estudo bioquímico do líquor:

− Análise dos níveis de glicose (glicorraquia): Quando analisados os

níveis de glicose, a média (x) da glicorraquia na meningite meningocócica

foi igual a 23,19 mg/dl (0-105 mg/dl), na forma mista 26,21 mg/dl (0-91

mg/dl) e na meningococcemia 68,22 mg/dl (2-128 mg/dl), diferença

49

estatisticamente significativa (x2= 32,53, p< 0,001), de acordo com a

Tabela 3.

− Análise dos níveis de proteínas totais (proteinorraquia): Na

determinação das proteínas totais, a média (x) da proteinorraquia na

meningite meningocócica foi igual a 349,81 mg/dl (45-1.148 mg/dl) e na

meningite mista 316,68 mg/dl (25-1.347 mg/dl), comportamento

diferenciado na meningococcemia, onde se verificou a média de 43,96

mg/dl (12-340 mg/dl), diferença estatisticamente significativa (x2= 49,02,

p<0,001) verificada na Tabela 3.

− Análise dos níveis de lactato: Os níveis de lactato demonstraram

expressiva alteração à medida que 87% dos casos apresentaram-se acima

do intervalo considerado normal (0,2-2,2 mmol/L). Na observação por

forma clínica, a média (x) para meningite meningocócica foi de 18,25

mmol/L (0-15,0 mmol/L) e para a meningite mista de 12,0 mmol/L, (0-12,6

mmol/L). Verificou-se que mesmo nos quadros de meningococcemia a

média foi igual a 4,0 mmol/L (0-12 mmol/L), diferença estatisticamente

significativa (x2= 29,60, p< 0,001), também demonstrada na Tabela 3.

Tabela 3 - Análises dos valores médios de celularidade, glicose, proteínas e lactato em função da forma clínica da DM-FMTAM/2002 Forma clínica Citometria

(leuc/mm3) Glicose (mg/dl)

Proteínas (mg/dl)

Lactato (mmol/L)

Meningite meningocócica 5.912 23,19 319,81 18,35Meningite mista 6.122 26,21 346,68 12Meningococcemia 12,7 68,22 43,96 4 p<0.001* p<0.001* p<0.001* p<0.001**Teste de significância para diferença entre médias (ANOVA)

50

c) Estudo bacteriológico do líquor

O estudo bacteriológico do líquor compreendeu a bacterioscopia direta pela

coloração de GRAM e a cultura.

− Bacterioscopia: A presença de diplococus Gram-negativos intra e

extracelulares foi positiva em 70 (61,9%) das amostras examinadas,

conforme Tabela 4.

Tabela 4 - Freqüência de diplococos gram-negativos em 113 amostras de Líquor de pacientes com doença meningocócica – FMTAM/2002

Resultado de Gram de

Líquor N %

Presença 70 61,9 Ausência 43 38,1 Total 113 100,0

4.2.1.2 Escarificação de lesões de pele

A escarificação de lesões de pele não foi material muito freqüente, tendo sido

encaminhadas somente 12 amostras ao Laboratório de Bacteriologia da FMTAM.

Destas, em 8 (66,7%) ocorreu a visualização de diplococos Gram-negativos intra e

extracelulares feita por meio da coloração de GRAM, conforme mostra a Tabela 5.

Tabela 5 - Freqüência com que diplococos Gram-negativos foram visualizados em 12 amostras de escarificação de pele – FMTAM/2002

Resultado de Gram de escarificação de pele

N %

Diplococos gram-negativos 8 66,7 Ausência de diplococos 4 33,3 Total 12 100,0

51

4.2.1.3 Sangue capilar periférico (Gota espessa)

O sangue periférico (gota espessa ou gota grossa) também foi material pouco

encaminhado, tendo sido possível verificar diplococos por meio da coloração com azul

de metileno a 1%, sugestivos de Neisseria sp, em 15 (88,2%) das 17 amostras,

conforme a Tabela 6.

Tabela 6 - Frequência com que diplococos Gram-negativos foram visualizados em 17 amostras de sangue periférico de pacientes com doença meningocócica – FMTAM/2002 Resultado da coloração

com azul de metileno em sangue periférico

N %

Presença de diplococos 15 88,2 Ausência de diplococos 2 11,8 Total 17 100,0

4.2.2 Marcadores confirmatórios

4.2.2.1 Pesquisa de antígenos de Neisseria meningitidis no líquor

Das 113 amostras de líquor, 55 amostras foram testadas pela reação de

aglutinação de partículas de látex sensibilizadas por antissoros específicos (LA),

obtendo-se uma positividade de 36 (65,4%), das quais 34 (61,8%) aglutinaram para

Neisseria meningitidis sorogrupo “B” e 2 (3,6%) para Neisseria meningitidis sorogrupo

“C” (Tabela 7).

Tabela 7 – Freqüência de sorogrupos de N.meningitidis em 55 amostras de líquor pela aglutinação com partículas de látex – FMTAM/2002

Resultado do látex N %

Negativo 19 34,5 Neisseria meningitidis B 34 61,8

Neisseria meningitidis C 2 3,7 Total 55 100,0

52

4.2.2.2 Cultura do líquor

Das 113 amostras de líquor, apenas 106 foram cultivadas e, destas, 63

(59,4%) apresentaram crescimento bacteriano identificado como Neisseria

meningitidis.

4.2.2.2.1 Sorogrupagem

As 63 amostras isoladas de Neisseria meningitidis foram testadas com soros

específicos anti-Neisseria meningitidis A, B, C e W135 em cuja aglutinação definiu-se

que 56 (88,9%) pertenciam ao sorogrupo “B” e 7 (11,1%) ao sorogrupo “C”, não tendo

sido identificado nenhum sorogrupo A ou W135.

N e is s e r ia m e n in g it id is

B - 5 6(8 9 % )

N e is s e r ia m e n in g it id is

C - 7(1 1 % )

Figura 6: Classificação da N.meningitidis em sorogrupos isolado de líquor em 63 amostras de pacientes com DM

N.meningitidis63

59%

Sem c res c imento bac ter iano43

41%

Figura 5: Freqüência do crescimento bacteriano de Neisseria meningitidis em 106 amostras de líquor – FMTAM/2002

Sem crescimento bacteriano 43

(40,6%)

N.meningitidis 63

(59,4%)

53

4.2.2.2.2 Subtipagem

Das 63 amostras sorogrupadas somente 41 isolados foram enviadas para o

Instituto Adolfo Lutz (IAL) em São Paulo, cujos resultados mostraram que o sorotipo

4,7 foi o mais freqüente, correspondendo a 36 (87,8%) dos isolados e o P.19,15 como

o principal subtipo (Tabela 8).

Tabela 8 - Distribuição dos subtipos identificados a partir do líquor distribuídos em função do sorotipo da Neisseria meningitidis B – FMTAM/2002

Subtipo Sorotipos

P1.16 P1.19,15 P1.7,1 Total

19,10 1 1 4,7 35 1 36 7 4 4

Total 1 35 5 41

4.2.2.3 Sangue

O sangue foi o material mais frequentemente encaminhado ao Laboratório de

Bacteriologia da FMTAM, com 115 amostras para cultura.

4.2.2.3.1 Cultura do sangue

A positividade para Neisseria meningitidis em cultura do sangue foi verificada

em 39 ( 33,9%) das 115 amostras estudadas (Tabela 9).

Tabela 9 - Frequência da positividade para Neisseria meningitidis em cultura do sangue – FMTAM/2002 Resultado da cultura do

sangue N %

Neisseria meningitidis 39 33,9

Sem crescimento bacteriano 76 66,1 Total 115 100,0

54

Comparando-se os resultados da cultura do sangue em relação a forma

clínica da doença meningocócica, foi possível verificar que este método teve maior

sensibilidade quando a DM apresentou-se na forma clínica de meningococcemia,

quando foi possível identificar a Neisseria meningitidis em l6 (50%) das amostras de

sangue cultivadas (Tabela 10).

Tabela 10 - Freqüência dos resultados de hemocultura para N. meningitidis em função da forma clínica da doença meningocócica – FMTAM/2002

Forma clínica da doença meningocócica Meningite

meningocócicaMeningococce

mia Meningite mista

Hemocultura

N % N % N % N. meningitidis 9 39,1 16 50,0 14 23,3 Sem crescimento bacteriano 14 60,9 16 50,0 46 76,7

Total 23 100,0 32 100,0 60 100,0

4.2.2.3.2 Sorogrupagem

Na definição do sorogrupo da N.meningitidis das 39 amostras isoladas de

hemocultura por aglutinação com soro específico, 36 (92,3%) pertenciam ao

sorogrupo “B” e 3 (7,7%) ao sorogrupo “C”, não tendo sido verificada nenhuma que

pertencesse aos sorogrupos A ou W135.

B3 5

9 2 %

C3

8 %

Figura 7: Sorogrupos identificados a partir de isolados de sangue – FMTAM/2002

N.meningitidis C 3

(8%)

N.meningitidis B 35

(92%)

55

4.2.2.3.3 Subtipagem

Das 39 amostras identificadas como Neisseria meningitidis, vinte amostras

foram enviadas ao Instituto Adolfo Lutz (IAL) em são Paulo, cujo resultado mais

freqüente foi o sorotipo 4,7 que correspondeu a 17 (85%) dos isolados, tendo como

principal subtipo o P1.19,15 (Tabela 11).

Tabela 11 - Distribuição dos subtipos identificados a partir do sangue distribuído em função do sorotipo da Neisseria meningitidis B – FMTAM/2002

Subtipo Sorotipo P1.19,15 P1.7,1

Total

4,7 16 1 17 7 3 3

Total 19 1 20

56

DISCUSSÃO

A Doença Meningocócica (DM), assim como outras meningites bacterianas,

ocorre em todas as faixas etárias. As maiores incidências da DM são verificadas nos

primeiros cinco anos de vida, relacionadas com a susceptibilidade imunológica. Nos

primeiros seis meses de vida as crianças possuem anticorpos protetores de origem

materna. À medida que a criança vai perdendo os anticorpos maternos, ocorre uma

queda progressiva dos anticorpos bactericidas adquiridos pela exposição a outras

bactérias que expressam antígenos capsulares comuns aos dos meningococos

(CAUGANT, 1998). Segundo Peltola (1983), a distribuição da DM, pela idade e

gênero, varia de uma área para outra e ocorre uma mudança do padrão de

distribuição nos grupos etários em períodos epidêmicos. Este estudo observou que

dos 120 resultados avaliados, 69 (57,5%) eram do gênero masculino e 51 (42,5%) do

gênero feminino, sendo que 42 (35%) dos casos atingiram crianças até 5 anos;

distribuição etária semelhante a referenciada por Kemp (1994) em um estudo

realizado em Campinas, no período de 1988 a 1993; por Weiss, Coplan e Guess

(2001) no período de 1997 a 1998 e por Pinheiro et al. (1991) em um estudo

realizado em Ribeirão Preto/São Paulo em que a ocorrência predominou entre os

grupos de zero a cinco e de cinco a dez anos. A segunda faixa etária atingida é a dos

adolescentes e adultos jovens, cujo fato pode estar relacionado com a vida escolar e o

57

ingresso dos jovens no mercado de trabalho, quando aumenta o contato com

portadores. As crianças adquirem freqüentemente as cepas invasivas dos

contactantes familiares, enquanto que os adolescentes e os adultos as adquirem fora

do ambiente familiar. Neste estudo a idade média do gênero masculino foi igual a 15

anos e do feminino em torno de 13 anos. Para os maiores de 20 anos, o

acometimento ficou em torno de 27 (22%), casos com o predomínio para o gênero

masculino em 20 casos, semelhante ao trabalho de Campos, et al (1994), em

Botucatu/ São Paulo, que relata maior incidência para o gênero masculino na idade

igual ou superior a 19 anos. O recrutamento de jovens para o serviço militar e seus

ingressos no mercado de trabalho e em universidades provocam o aumento da

incidência da DM nesse grupo etário. Portanto, o nível de aquisição para o gênero

masculino é alto, conseqüentemente com maior probabilidades de ocorrências em

contato efetivos entre as bactérias e o hospedeiro susceptível (REQUEJO, 1999).

Quando analisada a distribuição de casos quanto a forma clinica, os

resultados deste estudo demonstram que a maior proporção é da forma mista

(meningococcemia associada com meningite) em 63 (52,50%) dos casos, achado

este semelhante ao encontrado por Kemp (1994), em Campinas, que verificou

meningococcemia associado com quadro clinico de meningite em 60% dos casos. Em

outro estudo, conduzidos por Kemp, Rocha e Iversson (1998), também em um

hospital de Campinas, no ano de 1991, encontraram meningococcemia associado

com quadro clinico de meningite, em 74,5% dos casos. Segundo Camargo (1990), na

epidemia da Grande São Paulo, em 1988 e 1990, foi encontrado um percentual em

torno de 56%, para forma mista, e 59% para meningococcemia sem meningite,

superior aos nossos resultados onde a meningococcemia isoladamente correspondeu

a 32 (27%) dos casos. Vale ressaltar que os achados deste estudo não estão

58

relacionados com surto epidêmico, nos quais freqüentemente observa-se esse tipo de

comportamento.

5.1 Marcadores Laboratoriais da Doença Meningocócica

O LCR normalmente é um fluido cristalino puro. Alterações no seu aspecto

físico, celularidade e bioquímica, tradicionalmente, constituem-se marcadores

presuntivos do comprometimento meningoencefálico, quer sejam indicativos de

tumores, infecções meníngeas por uma grande variedade de agentes dos marcadores

bioquímicos destacam-se glicose, proteínas totais e, agora, mais recentemente lactato

(WALTSON e SCOTT, 1996). Segundo Sotolongo (1995), a bacterioscopia e gota

espessa, por meio de colorações, são procedimentos laboratoriais mais simples e um

dos mais úteis disponíveis para o diagnóstico presuntivo da morfologia bacteriana.

Analisando os resultados do LCR neste estudo, observou-se que o aspecto

turvo predominou em 82 (72,6%) dos casos, correspondendo a meningite

meningocócica e a forma mista, achados estes semelhantes à de outros estudos

(CAMPOS et al, 1994; BLATT, KOERICH e PEREIRA, 1999).

Quanto à celularidade global de leucócitos, observamos que a média ficou

acima de 5.000 leuc/mm3, correspondendo a forma mista e a meningite

meningocócica , com predomínio de polimorfonucleares em torno de 70%. Os

achados deste trabalho são semelhantes aos encontrados por Wang et al (2001) em

estudo realizado com 231 LCR de DM em um Hospital de Boston, no período de 1981

a 1996, e superiores aos encontrados em Santa Catarina por Blatt, Koerich e Pereira

(1999), celularidade superior a 600 leuc/mm3 com predomínio de polimorfonucleares,

em torno de 85%, para forma mista e meningite meningocócica, em Botucatu/São

59

Paulo, Campos et al; (1994) encontraram celularidade acima de 500 leuc/mm3 e

segundo estes autores o aspecto e a celularidade do liquor são considerados fatores

de prognóstico decisivo na avaliação da gravidade da doença meningocócica. Na

meningococcemia, o aspecto predominante neste estudo foi límpido e a celularidade

média ficou em torno de 12,7 leuc/mm3, similar ao estudo de Wang et al (2001) que

encontrou celularidade em meningococcemia igual ou superior a 10 leu/mm3 em

amostras de liquor de pacientes de um Hospital Pediátrico em Boston.

Dos indicadores bioquímicos detectados no liquor, o nível de glicose na

doença meningocócica demonstrou a ocorrência predominantemente de

hipoglicorraquia, sendo mais intensa nas formas de meningite meningocócica e forma

mista, onde verificamos valores médios inferiores a 30 mg/dl. Para a forma clínica de

meningococcemia, esta média foi eventualmente mais elevada ficando acima de 50

mg/dl, demonstrando uma marcante diferença entre os dois grupos de formas clínicas.

Quanto aos resultados dos níveis de proteínas totais no LCR, verificamos que

os valores médios, acima de 300 mg/dl, corresponderam a forma mista e a meningite

meningocócica; enquanto na meningococcemia, estes valores estão abaixo de 50

mg/dl. Tal como a glicose houve diferença na forma clínica de meningococemia em

relação as demais. Verificou-se que os resultados deste estudo não diferem dos

estudos realizados por Campos et al (1994), Blatt, Koerich e Pereira (1999).

Embora achados combinados, provenientes da determinação de glicose,

proteínas e da cultura e citologia do LCR, sejam freqüentemente suficientes para

determinar ou refutar um diagnóstico de meningite bacteriana, vários outros

marcadores bioquímicos complementares têm sido investigados, dentre estes o

60

lactato. Esse marcador, cuja alteração no LCR possa ocorrer devido a diversos

processos, tais como hipoxia, edema cerebral e por metabolismo bacteriano e

granulocitico, na maioria dos casos de meningite infecciosa, à produção de lactato no

LCR é aparentemente uma seqüela de números aumentados de leucócitos,

aparecendo como um indicador mais sensível do que glicose e proteínas totais para

meningite bacterianas, dentre estas a Doença Meningocócica (WATSON e SCOTT,

1996).

Quando analisados os resultados de lactato neste estudo, observamos que a

média para meningite meningocócica está igual a 18,25 mmol/L e para forma mista

12,0 mmol/L, na meningococcemia, está em torno de 4,0 mmol/L, mesmo com glicose

e proteínas normais, verificamos novamente um diferencial entre as formas clínicas de

doença meningocócica. Resultados compatíveis com o de Genton e Berger (1990)

que analisaram 25 casos de meningite bacteriana, encontrando média de lactato em

torno de 13,6 mmol/L. Estudos realizados por Imuekehme et al (1997), em crianças

nigerianas com diagnóstico de meningite bacteriana, demonstraram que todos os

LCRs de pacientes com meningite meningocócica apresentavam nível de lactato

superior a 25 mmol/L, referindo que a sua análise pode ser um método sensível de

avaliar a eficácia terapêutica. Resultados propostos por Pavese et al; (1997),

mostraram que a elevação dos níveis de lactato na diferenciação entre meningite

bacteriana e viral ocorre com muito mais constância do que os outros marcadores

bioquímicos (glicose e proteínas totais); e diferente da glicose, os níveis de lactato no

líquor permanecem elevados durante o tratamento inicial, mas diminuem rapidamente

quando há êxito terapêutico, representado, portanto, um marcador presuntivo sensível

de avaliar meningites bacterianas em pacientes tratados com antibióticos antes da

punção lombar. Nos estudos conduzidos em Santa Catarina por Blatt, Koerich e

61

Pereira (1999), na análise de líquor de 80 crianças, encontraram uma variação

significativa nos valores de lactato entre as com meningite bacteriana e meningite

viral.

O exame bacterioscópico do LCR é um diagnóstico presuntivo de importância

fundamental, pela rapidez com que se pode demonstrar o agente bacteriano. A

observação de qualquer morfologia bacteriana neste exame é importante para

orientação terapêutica. Analisando os resultados deste estudo, verificamos que a

visualização de diplococos gram-negativos, intra e extra-celulares, por meio da

coloração de GRAM, em 113 amostras de LCR, foi positiva em 70 (61,9%), achados

estes, condizentes com o da literatura (LANDGRAF,: ALKMIN e VIEIRA 1995;

CAMPOS et al; 1994: ROCHA et al; 1999; KEMP, ROCHA e IVERSSON, 1998;

MELLES et al; 1989).

A não visualização de microorganismos nas 43 (38,1%) amostras restantes,

deve-se possivelmente a baixa concentração de bactérias existentes nestas amostras,

já que quantidades inferiores a 100.000 Unidades Formadoras de Colônias (UFC)/ml

freqüentemente não são visualizadas em amostras de líquor não centrifugadas

(SOTOLONGO, 1995).

Em 1917, Netter e colaboradores, propuseram pela primeira vez a realização

de escarificação de lesões de pele ou biopsia, como diagnóstico de meningococcemia

(VAN DEUREN et al, 1993). Ao analisarmos este estudo, observamos que em 12

amostras de escarificação de pele o diplococo gram-negativo (DGN) foi visualizado

em 8 (66,7%) das amostras. Estes resultados, apesar da amostragem pouco

representativa, são semelhantes ao de Van Deuren et al (1993), que em estudo

62

prospectivo pesquisaram meningococo em lesões de pele em 25 pacientes, sendo a

bactéria detectada em 16 (62%) das amostras examinadas. Outra vantagem

demonstrada é que foi possível obter positividade no GRAM, até 48 horas após o

inicio da antibioticoterapia adequada. O mesmo autor refere neste trabalho que, em

1947, Hill e Kinney escreveram “é surpreendente que a biópsia de pele como

diagnóstico adjunto não tenha o reconhecimento que merece”.

Segundo Scheld, Wenger e Souza (1999), em aproximadamente 20% a 25%

dos pacientes com meningococcemia, podem ser visualizados os meningococos em

sangue periférico, por meio de gota espessa coradas. Neste estudo observou-se que

das 17 amostras coletadas, em 15 (88,2 %) foram encontrados diplococos, vale

ressaltar que não é um diagnóstico presuntivo, exclusivamente de meningococcemias,

mas também de outras infecções bacterianas sistêmicas (SOTOLONGO, 1995).

Assim, a Doença Meningocócica (DM) é confirmada quando, além do

diagnóstico presuntivo, forem realizados exames laboratoriais para o isolamento e a

identificação da Neisseria meningitidis em liquor (LCR) e/ou sangue obtidos do

paciente ou na detecção de antígenos meningocócicos específicos no LCR, por meio

de aglutinação de látex (SOTOLONGO, 1995).

Portanto, o diagnóstico especifico de DM, além de confirmar o diagnóstico

clínico, tem relevante importância epidemiológica, pois permite identificação do

sorogrupo prevalente numa população e, conseqüentemente, oferece subsídios para

sua profilaxia possibilitando, ainda, a classificação da DM direcionada ao sistema de

Vigilância Epidemiológica.

63

Ao se analisar as 113 amostras de liquor, 55 amostras foram testadas pelo

látex (LA) para pesquisa de antígenos meningococicos, obtendo-se 34 (61,8%)

amostras positivias para Neisseria meningitidis, sorogrupo B, e duas (3,6%) amostras

para Neisseria meningitidis, sorogrupo C, estando semelhante a resultados da

literatura (ALKMIN et al., 1997; LANDGRAF, ALKMIN e VIEIRA, 1995). Estes

mesmos autores informam que na fase inicial da DM, antígenos bacterianos podem

ainda não estar presentes no LCR, conduzindo a um teste imunológico negativo;

tornando, então, necessário associar técnicas bacteriológicas clássicas.

Quanto a confirmação por cultura de isolamento de Neisseria meningitidis do

LCR, este estudo observou que dos 106 cultivos realizados foram isoladas Neisseria

meningitidis em 63 (59,4%) das amostras, que após sorogrupadas, verificou-se maior

freqüência para o sorogrupo B em 56 (88.9%) das cepas isoladas e para o sorogrupo

C em 7 (11,1%) das cepas, dados estes concordantes com estudo de Kemp, Rocha e

Iversson (1998) que encontraram, em Campinas, predominância do sorogrupo B em

41,5% das amostras isoladas, seguido do sorogrupo C em 12,3%. Rocha et al; (1999)

identificou o sorogrupo B em 52,02%. Portanto, no período desde estudo, houve

predominância da Neisseria meningitidis grupo B seguido do grupo C, acompanhando

o perfil epidemiológico da DM no Brasil como um todo, de acordo com dados do

Ministério da Saúde (2000). Em outros países, observam-se percentuais maiores de

identificação de sorogrupos, assim, Tondella et al; (2000) referem nos Estados Unidos

em torno de 90% dos casos de DM são sorogrupados com predomínio de sorogrupo

B. Verificamos ainda nos resultados que 41 cepas foram subtipadas, com predomínio

para o sorotipo 4,7 em 36 (87,8%), como principal subtipo P1.19,15 após todo o

estudo, definiu-se que a cepa mais isolada foi a B:4,7:P1.19,15, esta de maior

circulação em Manaus e possivelmente do Estado do Amazonas, sendo necessário

64

mais estudos para ser caracterizada como a cepa vacinal do municipio, este sorotipo

e subtipo também circulam em S. Paulo, Rio de Janeiro, Santa Catarina. Observamos

ainda neste estudo um sorotipo 19,10 que correspondeu ao subtipo P1.16, um dos

subtipos que circulam na América do Norte (REQUEJO, 1996). Quanto ao não

crescimento do meningococo em meios de cultura, segundo foi observado por Melles

et al., (1988) maiores dificuldades são encontradas no diagnóstico laboratorial quando

o líquor colhido é semeado e transportado de forma inadequada, o que facilita a

desintegração dos microorganismos, dificulta a leitura do exame bacterioscópio e o

desenvolvimento em meios de cultura próprios. O uso de antibiótico prévio, da mesma

forma, irá interferir na interpretação de um esfregaço corado e principalmente na

positividade da cultura.

Ao analisar este estudo quanto a cultura de sangue, observou-se que o

percentual de positividade obtido nas hemoculturas foi de 39 (33,9%), percentual

semelhante ao encontrado por Lopes e Santos (2002) e superior ao verificado no

estudo realizado por Ragunathan et al (2000), que foi de 22%, e por Weiss et al

(2001) em torno de 15,0%, porem mais baixo que o valor de 98% encontrado em

trabalho descrito por Kuppermann (1999). Verificou-se neste estudo que culturas de

sangue contribuíram com 16 (50%) para o diagnóstico da meningococcemia. Em

relação aos sorogrupos identificados de Neisseria meningitidis, houve maior

ocorrência do sorogrupo B, sorotipo 4,7 e subtipo P1.19,15 similar ao verificado no

padrão da Neisseria meningitidis isoladas na cultura do Líquor

Quanto a alta percentagem de cultura negativa, é sabido, segundo Melles et

al. (1988), que quando a coleta de sangue é feita fora do período de maior

65

concentração de microorganismos circulantes e uso prévio de antibióticos, há

dificuldade na recuperação de bactérias por meio de cultura de sangue.

66

CONCLUSÃO

• Os marcadores presuntivos do LCR, como aspecto turvo, celularidade e as

dosagens bioquímicas de glicose, proteínas e lactato, foram importantes e

decisivas no diagnóstico da DM, principalmente nas formas de Meningite

meningocócica e mista.

• Na apresentação clínica de meningococcemia, as alterações nos níveis de

lactato evidenciaram ser um indicativo precoce se comparado com os

níveis de glicose e proteínas, que freqüentemente encontra-se nos limites

da normalidade.

• A visualização de DGN em material da escarificação de lesão de pele e de

diplococos sugestivos de Neisseria sp na gota espessa foram importantes

e sensíveis indicadores presuntivos, decisivos para o diagnóstico da forma

clínica meningococcemia, apesar do número de amostras reduzido, se

comparado com outros materiais, como sangue e líquor,

• A detecção do antígeno bacteriano foi um indicador confirmatório precoce

da etiologia meningocócica e do sorogrupo correspondente.

67

• Como diagnóstico definitivo, as culturas de LCR foram fundamentais para

o isolamento e a identificação da Neisseria meningitidis, nas formas

clínicas de meningite meningocócica e mista.

• Os meningococos sorogrupo B, sorotipo 4,7 e subtipo P1.19,15 foram os

mais prevalentes na FMTAM.

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ANEXOS

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Anexo 1 - Ficha Clínico-Laboratorial de Pacientes com Doença Meningocócica Ficha____________ Matrícula____________ 1-Identificação Nome_______________________________________________ Data Nascimento ___/__/___ Idade____anos Sexo: ( ) M ( ) F Data Internação ___/__/___ Data da Alta ___/___/___ Diagnóstico definitivo____________________________________________________ Inicio do Sintoma________________ Tempo de Evolução________________ Uso de Antibiótico___________________________ Material Coletado: Sangue ( ) LCR( ) Sangue Capilar ( ) escarificação de pele ( ) Estudo do líquor Volume-------------- Cor------------------- Aspecto-------------- Coágulo------------- Citometria------------------------------------ Citologia: Polimorfonucleares------------ Mononucleares----------------- Bioquimica: Glicose-----------------lactato--------------Oxidase--------------ONPG------------- Globulinas-------------Proteinas-----------Catalase------------- Aglutinação pelo Látex:-------------------- Bacteriologia Gram------------------------------------------- Cultura------------------------------------------ Sorogrupo---------------Sorotipo-------------Subtipo-------------- Sangue Cultura----------------------- Sorogrupo------------------Sorotipo---------Subtipo---------------- Outros Azul de metileno a 1%:__________________ GRAM de escarificação:_________________