Universidad Internacional SEK Facultad de Ciencias Ambientales

8/14/2019 Universidad Internacional SEK Facultad de Ciencias Ambientales

1/15

Universidad Internacional SEKFacultad de Ciencias Ambientales

Trabajo de Biotecnologa Ambiental

Comparacin de varias especies de microorganismos degradadores de carbamatos

para determinar la mejor opcin para el tratamiento biolgico de sueloscontaminados con Carbaryl en plantaciones bananeras

Esteban Carpio Surez

Introduccin

Histricamente, muchos pases de Latinoamrica han estado fuertemente ligados al desarrollode la industria bananera, en la cual ha sido comn el uso intensivo de pesticidas para elcontrol de plagas que afectan a los cultivos de esta fruta (Araya, 2004).

El uso de carbamatos y organofosforados ha sido el medio mas asequible y eficiente para elcontrol de plagas en el banano, y se los utiliza hasta la actualidad a pesar de la toxicidad demuchas de estas sustancias (Araya, 2004).

Adicional al impacto ambiental que suponen los residuos de pesticidas aplicados en estossuelos, como es el caso del Carbaryl, se ha determinado que la prdida de la calidad delsuelo que produce la aplicacin de estas sustancias se relaciona directamente con unadisminucin de la productividad (INIBAP et. al., 2004), constituyndose as no solo en unproblema ambiental, sino que tambin tiene repercusiones econmicas y sociales.

El carbaryl es uno de los carbamatos ms utilizados para el control de una variedad de pestesen varios tipos de cultivos de frutas, vegetales, algodn, etc. El mecanismo de accin del

carbaryl es inhibir la colinesterasa, una de las enzimas ms importantes en el sistema nerviosde las personas, de vertebrados y de insectos. El carbaryl es relativamente seguro para losmamferos, txico para algunos microorganismos benficos, altamente txico para peces yparcialmente txico para las aves; particularmente este pesticida es extremadamente txicopara las abejas (Xu, 2000).

Paradjicamente al efecto que provoca la aplicacin de estas sustancias de control, se havisto en muchos casos en las plantaciones de banano que algunas especies demicroorganismos se han adaptado a la presencia de los pesticidas en el suelo, e incluso enciertos casos han acelerado el proceso natural de biodegradacin, provocando prdida en laefectividad de las aplicaciones, lo que se traduce en el uso de una mayor dosis para lograr elefecto deseado y un costo de produccin incrementado (Araya, 2004).

Para contrarrestar este efecto de biodegradacin acelerada, los especialistas de la industriabananera han propuesto el uso alternado de varios tipos de pesticidas, lo cual disminuye lacapacidad de adaptacin de los microorganismos del suelo a la presencia de stos y por endesu capacidad de biodegradacin (Araya, 2004). Esto provoca la acumulacin en el suelo depesticidas que se vuelven persistentes debido a lo mencionado anteriormente.

Entre las especies ms importantes que se han identificado en la aceleracin de labiodegradacin de carbamatos se encuentran las siguientes: Achromobacter sp., Penicilliumsp.,Arthrobacter, Pseudomonas sp., Nocardiay Bacillus sp (Araya, 2004).

Tambin se ha establecido en investigaciones previas que entre los microorganismos quetienen la capacidad de degradar un cierto tipo de carbamato, pueden ocurrir adaptaciones

cruzadas que le permiten degradar varios compuestos de la misma familia de pesticidas; por


2/15

ejemplo, se determin que una especie del gnero Achromobacter que fue aislada de unsuelo contaminado con carbofurano poda hidrolizar algunos otros carbamatos (Araya, 2004).

La secuencia de adaptacin cruzada propuesta por el mismo autor es la siguiente:

Carbofurano > Carbaryl > Propoxur > Aldicarb > O-nitofenildimetilcarbamato

En el Ecuador se ha evidenciado el uso del carbaryl en las plantaciones bananeras, pero noexiste un dato preciso de la cantidad utilizada por ao, lo cual hace difcil establecer laamplitud del uso de este carbamato en el pas.

A pesar de esto, en el Texto Unificado de Legislacin Ambiental Secundaria (TULAS) tienebien identificado a estos compuestos y a los lmites permisibles. En el Anexo 1 del Libro VI,correspondiente a la las Normas de Calidad Ambiental y de Descargas de Efluentes: Recurso Agua, en la Tabla 1: Lmites mximos permisibles para aguas de consumo humano y usodomstico, que nicamente requieren tratamiento convencional, se establece laconcentracin mxima permisible de carbamatos totales en 0,1 (mg/L); y particularmenteen la tabla 5: Criterios referenciales de calidad para aguas subterrneas, considerando un

suelo con contenido de arcilla entre (0-25,0) % y de materia orgnica entre (0 - 10,0 )%, seestablece la concentracin mxima de carbaryl en 0,06 (g/L)(Ministerio de Ambiente,2004).

Si bien en el Anexo 2 del Libro VI, correspondiente a la Norma de Calidad Ambiental delRecurso Suelo y Criterios de Remediacin para Suelos Contaminados, no se incluyen alcarbaryl o al grupo de los carbamatos dentro de la Tabla 3: Criterios de Remediacin oRestauracin, dentro del grupo pesticidas regulados para esta actividad (Ministerio de Ambiente, 2004), es de gran importancia el tratamiento de suelos contaminados conCarbaryl, para evitar la escorrenta de este pesticida a fuentes de agua, donde s estnestablecidas las concentraciones mximas de este carbamato, conforme a lo revisadoanteriormente; y para evitar la prdida de calidad del suelo que pueda llevar a un bajo

rendimiento de produccin de banano.Objetivos

General

- Determinar cul es la mejor opcin a aplicar en la remediacin biolgica de sueloscontaminados con este pesticida en plantaciones bananeras.

Especficos

- Comparar varios ensayos realizados en laboratorio con diferentes especies demicroorganismos en los cuales se trataron directa o indirectamente su capacidad debiodegradacin del carbaryl.

- Comparar los resultados obtenidos para determinar cul cepa es la ms eficientebiodegradando carbaryl.

- Comparar los medios de cultivo y los parmetros crticos necesarios para elcrecimiento de los microorganismos, para definir cul es la opcin que requiere deuna menor inversin econmica y tcnica para su escala.

- Analizar los resultados y recomendar diferentes aplicaciones a una escala mayor parala biodegradacin de carbaryl en suelos contaminados.


3/15

Marco Terico

Aislamiento, cultivo e inoculacin de cepas 50552 y 50581 de Pseudomonas sp.segn la investigacin realizada por Chapalamadagu et. al. (1991)

Para la determinacin de biodegradacin en esta investigacin se utiliz carbaryl de grado

analtico (>99,5% de pureza), y carbaryl comercial (98% de pureza) (Chapalamagu et.al,1991).

Este estudio se basa en la premisa de que en ciertos casos los productos xenobiticopueden ser solamente parcialmente degradados, en este caso se identific que la cepa50552 degradaba carbaryl a un compuesto ms txico, el 1-naftol; y se identific que lacepa 50581 degradaba el 1-naftol completamente a CO2 y H2O por lo que se propuso eluso de un consorcio de las dos cepas para la degradacin integral de carbaryl(Chapalamagu et. al,1991).

Medio de Cultivo

Los microorganismos fueron incubados en un medio aerobio a 30 C, a pH 7, en mediominimal que presente como nica fuente de carbono el carbaryl (para la cepa 50581), y 1-naftol (para la cepa 50582), el medio de cultivo contena 10 g de NaCl, 10 g de triptona, y5 g de almidn, aadiendo 1,8% en volumen de agar al medio (Chapalamagu et. al,1991).

Los experimentos de biodegradacin fueron realizados utilizando tubos de ensayoduplicados de 25 ml, cada uno contena 2 ml de medio minimal y 1 mg de carbaryl(analtico y comercial) o 1-naftol. Se inocul a este medio con 15 ml de bacterias que seencontraban ya en crecimiento exponencial.

Para la identificacin de metabolitos producto de la degradacin de carbaryl y 1-naftol seanalizan los sobrenadantes del tubo de ensayo utilizando cromatografa de gases y

cromatografa lquida de alto rendimiento (Chapalamagu et. al,1991).Para la determinacin de la generacin de CO2 se cubren los tubos de ensayo con papelfiltro empapados con una solucin 1M de NaOH para retenerlo y realizar las medicionesrespectivas (Chapalamagu et. al,1991).

Resultados y Discusin

Todas los inculos realizados con la cepa 50581 hidrolizaron el carbaryl a 1-naftolutilizando el terminal metilcarbamato como fuente nica de carbn, pero ninguno lodegrad por completo, por lo que se inocularon estas muestras de 1-naftol con la cepa50582 en la cual se detect emisin de CO2 del sistema (Chapalamagu et. al,1991).


4/15

Cuadro 1. Hidrlisis de carbaryl por la cepa 50581 dePseudomonas sp., en negro la concentracin decarbaryl, en rayas la concentracin de 1-naftol,ambas concentraciones determinadas medianteCromatografa Lquida de Alto Rendimiento (HPLC)(Chapalamagu et. al,1991).

Cuadro 2. Hidrlisis completa de carbaryl utilizando elconsorcio microbiano de las cepas 50581 y 50552 de Pseudomonas sp. (Chapalamagu et. al,1991).

Los anlisis de cultivos de la cepa 50552 mediante Cromatografa de Gases yCromatografa Lquida de Alto Rendimiento (HPLC), que fueron inoculados en mediominimal en el cual la nica fuente de carbn era el 1-naftol, arrojaron que laconcentracin del sustrato disminuy con un incremento en la turbidez del medio(crecimiento microbiano). Todo el sustrato fue degradado en un rango de menos de 36horas luego de realizado el inculo. Adems se determin la generacin de CO2 en elmedio inoculado, al contrario del testigo donde no se gener CO2, lo cual prueba ladegradacin completa del 1-fenol (Chapalamagu et. al,1991).

Luego de que estos resultados fueron completamente analizados, se propuso laconstruccin de un consorcio microbiano de estas dos cepas de Pseudomonas sp. paradegradar completamente el carbaryl, los resultados arrojaron que luego de 36 horas deincubacin, luego de haber inoculado en medio minimal en el cual el carbaryl era la nicafuente de carbn, con las dos cepas mediante Cromatografa de Gases y CromatografaLquida de Alto Rendimiento , se encontr que no hubo rastros de carbaryl residual ni deotros metabolitos.

Cuadro 3. Generacin de CO2 a partir de carbaryl en

diferentes situaciones: La serie de cuadros correspondea la degradacin por parte del consorcio microbiano delas cepas 50581 y 50552; la serie en crculos blancoscorresponde a la degradacin por parte de la cepa50581, en crculos negros luego la generacin de CO2cuando la cepa 50552 ha sido aadida posteriormente, yen tringulos la cepa 50552 sola. (Chapalamagu et.al,1991).


5/15

En el caso de la cepa 50581, se observ que adems de la produccin de 1-naftol a partirde carbaryl, se gener un metabolito que no pudo ser identificado, esto puede ser debidoa que el 1-naftol es txico para esta cepa en particular, y por eso evade la ruta metablicay sintetiza este metabolito desconocido (Chapalamagu et. al,1991).

En otros estudios realizados se aislaron otras cepas de Pseudomonas sp., RodococcusyBacillus sp. con la capacidad de degradar carbaryl, en los cuales se identificaron que losprincipales metabolitos generados eran 1-naftol y 1,4-naftoquinona. La cepa 50581utilizada no produjo 1,4-naftoquinona (Chapalamagu et. al,1991).

La bibliografa tambin cita a cepas de Pseudomonas sp. y de Achromobacter sp. quehaban sido aisladas de suelos contaminados con carbofurano y que tambin presentaroncapacidad para biodegradar carbaryl, sin embargo la cepa 50581 no present crecimientoen un medio minimal con carbofurano como la nica fuente de carbono, esto puedeindicar que existe una especificidad en esta cepa para la degradacin de carbaryl,contrario al comportamiento de adaptacin cruzada para la degradacin de otroscarbamatos (Chapalamagu et. al,1991).

En cuanto a la cepa 50552 se estableci la capacidad para degradar completamente el 1-naftol sin la generacin de metabolitos de por medio, pero no es capaz de metabolizarcarbaryl directamente. Sin embargo se comprob la capacidad de degradacin completade carbaryl a travs del uso del consorcio de las dos cepas de Pseudomonas sp. , ya seaque sean inoculadas las dos simultneamente o que la cepa 50552 sea inoculada en lafase de crecimiento exponencial de la cepa 50581 una vez que se haya generado 1-naftol,pero antes de que se genere el metabolito desconocido (Chapalamagu et. al,1991).

Como producto de este consorcio el autor propone la va metablica probable para ladegradacin completa de carbaryl (Chapalamagu et. al,1991):

Cuadro 4. Ruta metablica propuesta para ladegradacin de carbaryl por el consorcio de cepas 50552

y 50581 de Pseudomonas sp. (Chapalamagu et. al.,1991).


6/15

Aislamiento, cultivo e inoculacin de cepas C4, C5, y C6 de Pseudomonas sp.segn la investigacin realizada por Swetha et. al. (2005)

Este estudio identifica tres cepas distintas a las utilizadas por Chapalamagu et. al (1991)para la degradacin de carbaryl, utilizndolo como fuente nica de carbn que,dependiendo de cada una de las cepas, hidroliza el carbaryl va saliciato a gentisato o

catecohol (Swetha et. al., 2005).

Adicional al carbaryl, las tres cepas utilizan adems 1-naftol, salicilato y 4-hidrobenzoatocomo fuente de carbn (Swetha et. al., 2005).

Nota: Esta investigacin est ms enfocada a al establecimiento de la ruta metablica ydel estudio de la actividad enzimtica de las tres cepas, pero aporta informacin muyimportante para la biodegradacin de carbaryl a travs de estas cepas.

Medio de Cultivo

Las cepas aisladas fueron cultivadas en 150 ml de medio salino minimal en erlemeyer de

500 ml a 30 C a pH de 7,5. Para las cepas C4 y C5 los componentes del medio salinominimal fueron los siguientes: 6 g K2HPO4, 4.1 g KH2PO4, 1 g NH4NO3, 100 mgMgSO4.7H2O, 1mg MnSO4, 1 mg CuSO4.5H2O, 5 mg FeSO4.7H2O, 1 mg H3BO3, 5 mgCaCl2.2H2O, 1 mg ZnSO4, 1 mg NaMoO4. Para la cepa C6 la composicin es la mismaaadiendo 8 g de K2HPO4 y 1 g de KH2PO4; el medio fue suplementado con 0.1% dehidrocarburo o 0.25% de glucosa como fuente de carbn. El crecimiento fue monitoreadomediante espectrofotometra a 540 nm (Swetha et. al., 2005).

Para la identificacin de metabolitos el medio fue acidificado a pH 2 con 2 N HCl y extradocon un volumen igual de acetato de etilo. Esta solucin fue analizada va TLC utilizandouna solucin disolvente de hexano, cloroformo y cido actico en las siguientesproporciones respectivamente 8:2:1 (vol/vol/vol) (Swetha et. al., 2005).

Dos gramos (2 g) de suelo contaminado con 0.1% de carbaryl fueron inoculados con cadauna de las cepas cultivadas en medio salino minimal. Se les permiti desarrollarse porcuatro das y luego eran recultivadas cada 48 horas (Swetha et. al., 2005).


Cuadro 5. Perfil de crecimiento de lastres cepas de Pseudomonas sp.utilizadas, en crculo la cepa C4, entringulos la cepa C5, y en cuadrado lacepa C6 en el medio salino minimalcon 0.1% de carbaryl (Swetha et. al.,2005).


7/15

Como se haba mencionado anteriormente, el estudio se encuentra enfocado a la actividadmetablica de las tres cepas, y no a las tazas de degradacin de carbaryl explcitamente,sin embargo en el cuadro anterior observamos el crecimiento de las tres cepas inoculadasen medio salino minimal con 0.1% de carbaryl, lo cual confirma la metabolizacin delsustrato.

Cuadro 6. Cambios espectrales dependientes de tiempo para las reacciones de (A) carbaryl hidroxilasa y (B)dioxigenasa de gentistato. Las flechas para arriba indican la generacin de metabolitos, mientras que las flechaspara abajo indican la metabolizacin del sustrato (Swetha et. al., 2005)

Cuadro 7. Ruta metablica propuesta para ladegradacin de carbaryl en las tres cepas dePseudomonas sp. (C4, C5, C6) (Swetha et. al., 2005).

Como conclusin de este estudio se proponela siguiente ruta metablica: Carbaryl > 1-Naftol > 1,2-dihidroxinaftaleno >salicilaldehdo > salicilato > gentisato >maleilpiruvato (Swetha et. al., 2005).

Lamentablemente no existen datos explcitossobre la eficiencia de degradacin delcarbaryl, sin embargo los diagramasanteriores del crecimiento de las cepas y dela actividad enzimtica, confirman que estastres cepas poseen las caractersticas

necesarias para degradar grandesconcentraciones de carbaryl, lo cual las hacecepas ideales para su aplicacin en ladegradacin y remediacin de sueloscontaminados (Swetha et. al., 2005).


8/15

Aislamiento, cultivo e inoculacin de la cepa RC100 de Arthrobacter sp. segn lainvestigacin realizada por Hayatsu et. al. (1998)

En este estudio, se describe el proceso de aislamiento y caracterizacin de una cepa deArthrobabacter sp. capaz de utilizar al carbaryl como su nica fuente de carbn. Adems

se establece la ruta metablica de degradacin de carbaryl (Hayatsu et. al., 1998).

Nota: Esta investigacin esta ms enfocada al aislamiento de dos plsmidos de la cepaRC100 deArthrobacter sp. involucrados en la degradacin de carbaryl.

Medio de Cultivo

La cepa aislada fue cultivada en medio minimal con 1.0 mM de carbaryl, as como mediominimal con 1 mM de salicilato y medio minimal suplementado con 0.2% de glucosa,0.4% de bactotriptona y 0.2% de almidn, a una temperatura de 30C y a un pH de 7(Hayatsu et. al., 1998).

Una muestra de 10 g de suelo expuesto a carbaryl fue suspendido en 100 ml de mediominimal con carbaryl como fuente de carbn (Hayatsu et. al., 1998).


El estudio reporta que la cepa RC100 deArthrobacter sp. inoculada en medio minimal con0.4 mM de carbaryl fue capaz de degradarlo completamente en 48 horas luego de habersido cultivada; en la muestra testigo se observ tambin una pequea degradacin delcarbaryl, atribuible a hidrlisis qumica (Hayatsu et. al., 1998).

Los principales metabolitos identificados en el sobrenadante luego de 4h de la inoculacinfueron 1-naftol y cido saliclico, los cuales fueron identificados a travs de Cromatografa

Lquida de Alto Rendimiento (HPLC). Esta cepa fue capaz de crecer en carbaryl, cidosalislco y 1-naftol (Hayatsu et. al., 1998).

Cuadro 8. Degradacin de carbaryl porcrecimiento de la cepa RC 100 de

Arthrobacter sp. utilizando el carbaryl comofuente nica de carbn. En tringulos ladegradacin de carbaryl del testigo debido ahidrlisis qumica (Hayatsu et. al., 1998).


9/15

Cuadro 9. Ruta metablica propuesta para ladegradacin de carbaryl por la cepa RC100 de

Arthrobacter sp(Hayatsu et. al., 1998).

La ruta metablica es muy similar a la

utilizada por otras bacterias degradadoras decarbamatos, pero difiere en la habilidad parametabolizar el catecohol, por lo que toma laruta de gentisato para llegar a la degradacincompleta de carbaryl (Hayatsu et. al., 1998).

Es conocido adems que la habilidad deArthrobacter de degradar varios compuestosorgnicos se encuentra codificada enplsmidos catablicos (Hayatsu et. al., 1998).

Aislamiento, cultivo e inoculacin de la cepa AA101 de Citrobacter sp. segn lainvestigacin realizada por Bahig et. al. (2008)

El objetivo de este estudio es el de determinar la resistencia varias especies demicroorganismos a varios compuestos xenobiticos para determinar cules de ellos tienenel potencial de ser utilizados en aplicaciones de biodegradacin (Bahig et. al., 2008).

Se recolectaron muestras de suelos agrcolas, de las cuales se aislaron microorganismos a

travs del cultivo en solucin salina (0,9%) en agar nutritivo, incubadas a 37C por 48horas. Las colonias que se diferenciaban morfolgicamente fueron aisladas y purificadas yfueron mantenidas en agar nutritivo a 4C y recultivadas cada cuatro semanas (Bahig et.al., 2008).

Medio de Cultivo

Para la prueba de degradacin de pesticidas, se aislaron las especies identificadas enmedio salino minimal cuya composicin fue la siguiente: 0.5 g (NH4)2SO4, 0.2 gMgSO4.7H2O, 0.05 g CaCl2, 2.44 g Na2HPO4 y 1.5 g de KH2PO4, un litro de agua destiladaa un pH de 6.8, suplementado con 1mM de fenol, 50 g/ml de carbaryl cipermetrina. Latemperatura de incubacin fue de 37C (Bahig et. al., 2008).


10/15

Aproximadamente, el 61% de las bacterias aisladas fueron capaces de asimilar y utilizar elcarbaryl como nica fuente de carbn y energa, la cepa AA101 de Citrobacter sp. mostrla mejor taza de crecimiento en carbaryl (Bahig et. al., 2008).

Esta cepa fue inoculada en 50 ml de medio salino minimal con 50 g/ml de carbaryl eincubada a 37 C. El cultivo, recolectado durante una fase avanzada de crecimiento

exponencial fue inoculada en tres matraces con medio salino minimal suplementado concarbaryl, stas a su vez fueron incubadas a 30C. El crecimiento de la cepa fuemonitoreado constantemente en intervalos regulares va Densidad ptica a 600 nm (Bahiget. al., 2008).


De las bacterias aisladas, la cepa AA101 de Citrobacter sp. mostr la mayor taza dedegradacin de carbaryl por lo que fue seleccionada para los ensayos de biodegradacin.Se sigui el crecimiento del inculo de carbaryl y de glucosa va Densidad ptica a 600 nmy se encontrn que existe una diferencia significativa en el crecimiento entre los dosmedios; esto puede ser debido a la diferencia en la disponibilidad de la fuente de carbn

(Bahig et. al., 2008).

Se report que el crecimiento de esta cepa inoculada en medio salino minimal concarbaryl como nica fuente de carbn fue considerablemente lento y bajo (Bahig et. al.,2008).

Cuadro 10. Crecimiento de Citrobacter AA101 en

medio salino minimal con carbaryl como fuente nicade carbono (serie de cuadros), medio salino msglucosa (serie de rombos), cultivo de nutrientes(serie de tringulos) y medio salino sin fuente decarbono como testigo (serie de X), todos incubadosa 37C (Bahig et. al., 2008).

Cuadro 11. Anlisis espectral del sobrenadante del

crecimiento de Citrobacter AA101 en medio salinominimal con carbaryl al momento del inculo, a 3 a 6 y a9 das despus, incubado a 37C. La flecha a 276 nmindica el pico de absorcin de carbaryl (Bahig et. al.,2008).


11/15

Comparacin de los casos de estudio

Antes de comenzar con la comparacin de las diferentes especies utilizadas, las cuales hansido revisadas previamente, es de importancia establecer que el objetivo de este estudio esidentificar la mejor opcin para una biodegradacin completa de carbaryl a CO2+H2O.

Por el objetivo expuesto, la reaccin buscada (utilizando la frmula promedio de biomasa),independientemente de la ruta metablica que se elija, debera ser la siguiente:

Balanceando obtenemos la siguiente reaccin terica

Es pertinente realizar la comparacin de cada caso tomando en cuenta los aspectosrelevantes del proceso: diseo del medio del cultivo y resultados obtenidos.


Comparacin del Medio de Cultivo

Cepa Medio ComposicinTemperatura

deIncubacin

pH delmedio

Pseudomonas sp.(cepa 50552)

Minimal10 g NaCl

10 g triptona5 g de almidn

30C 7

Pseudomonas sp.

(cepa 50581)Minimal

10 g NaCl10 g triptona5 g de almidn

30C 7

Consorcio cepas50552-50581

Minimal10 g NaCl

10 g triptona5 g de almidn

30C 7

Pseudomonascepa C4

SalinoMinimal

6 g K2HPO44.1 g KH2PO41 g NH4NO3

100 mg MgSO4.7H2O1mg MnSO4

1 mg CuSO4.5H2O5 mg FeSO4.7H2O

1 mg H3BO3

5 mg CaCl2.2H2O1 mg ZnSO4

1 mg NaMoO40.1% hidrocarburo

0.25% glucosa

30C 7.5-8

Pseudomonascepa C5

SalinoMinimal

6 g K2HPO44.1 g KH2PO41 g NH4NO3

100 mg MgSO4.7H2O1mg MnSO4

1 mg CuSO4.5H2O5 mg FeSO4.7H2O

1 mg H3BO35 mg CaCl2.2H2O

30C 7.5-8


12/15

1 mg ZnSO41 mg NaMoO4

0.1% hidrocarburo0.25% glucosa

Pseudomonascepa C6

SalinoMinimal

6 g K2HPO44.1 g KH2PO4

1 g NH4NO3100 mg MgSO4.7H2O

1mg MnSO41 mg CuSO4.5H2O5 mg FeSO4.7H2O

1 mg H3BO35 mg CaCl2.2H2O

1 mg ZnSO41 mg NaMoO4

8 g de K2HPO4 y 1 g deKH2PO4

0.1% hidrocarburo

0.25% glucosa

30C 7.5-8

Arthrobacter sp.cepa RC100

Minimal

1 mM salilciliato0.2% glucosa

0.4% bactotriptona0.2% de almidn

30C 7

Citrobacter sp.cepa AA101

SalinoMinimal

0.5 g (NH4)2SO40.2 g MgSO4.7H2O

0.05 g CaCl22.44 g Na2HPO41.5 g de KH2PO4

1mM fenol

30C 6.8

(Bahig et. al., 2008), (Chapalamagu et. al.,1991), (Hayatsu et. al., 1998), (Swetha et. al.,

2005)En primer lugar, tomando en cuenta los componentes que se requieren para la preparacindel medio de cultivo para la incubacin de las diferentes cepas degradadoras de carbaryl, laopcin ms favorable sera optar por las cepas de Pseudomonas sp. de la investigacin deChapalamagu et. al. (1991) o por la cepa de Arthrobacter sp. del estudio llevado a cabo porHayatsu et. al. (1998); sobre todo si se tiene en mente una escalada del bioprocesos parabiomagnificacin o tratamiento de grandes volmenes de suelo contaminado a travs delandfarming, considerando el componente econmico del proyecto.

En cuanto a la temperatura, todos los autores concuerdan en que la temperatura a la que sedebe trabajar para la degradacin de carbaryl es de 30C, y el pH vara segn las diferentescepas de 6.8 a 8, el cual constituye un rango bastante restringido, lo que nos indica que loptimo es trabajar en un pH neutro de 7 a 7.5. En este caso no existe un limitante paratrabajar con cualquiera de las cepas mencionadas, el control de este parmetro se lorealizara directamente en el suelo a tratar, por lo que la mejor opcin en este caso seratrabajar mediante landfarming.

Comparacin de resultados

CepaCantidad de Carbaryl

InoculadaTiempo de

DegradacinProducto deDegradacin

Pseudomonas sp.(cepa 50581)

1 mg 40 horas 1-naftol+Metabolito desconocidoPseudomonas sp.(cepa 50552)

No degrada carbaryl(degradacin 1mg 1-

36 horas CO2+H2O


13/15

naftol)Consorcio cepas50552-50581

1 mg 36 horas CO2+H2O

Pseudomonascepa C4

20 mg ? CO2+H2OPseudomonascepa C5 20 mg ? CO2+H2OPseudomonascepa C6

20 mg ? CO2+H2OArthrobacter sp.cepa RC100

8.04 mg 48 horas CO2+H2O

Citrobacter sp.cepa AA101

50 mg ? ?

(Bahig et. al., 2008), (Chapalamagu et. al.,1991), (Hayatsu et. al., 1998), (Swetha et. al.,2005)

Comparando los resultados de la degradacin de carbaryl de las diferentes cepas revisadas,podemos establecer lo siguiente:

La cepa que menos se acerca al comportamiento deseado es Citrobacter sp. cepa AA101, enel mismo estudio se concluye que, aunque relativamente fue la cepa que mayor crecimientotuvo entre todas las cepas que fueron capaces de crecer en un medio con carbaryl comonica fuente de carbn, el crecimiento en una muestra de 50 mg de carbaryl, el crecimientofue lento y bajo (Bahig et. al., 2008). Adems no se indica que haya sido capaz de degradarcompletamente la cantidad de carbaryl a la que estuvo expuesta; por este motivo quedadescartada como la cepa ideal para nuestro objetivo de bioremediacin de sueloscontaminados con este carbamato.

Por otro lado, tenemos el caso de las tres cepas de Pseudomonas sp. (C4, C5 y C6), que apesar de que tuvieron un crecimiento favorable en exposicin a la mayor cantidad de carbaryl

de todas las alternativas revisadas (20 mg), y que en la discusin se la reporta como una delas mejores alternativas para aplicaciones de biodegradacin (Swetha et. al., 2005), no seindica explcitamente si cualquiera de estas cepas fue capaz de degradar completamente todoel carbaryl presente, a pesar de que la ruta metablica sugiere una degradacin completa aCO2+H2O, ni el tiempo en el que lo hara. Como referencia, se ha definido en el estudio quelas tres cepas entran a un crecimiento estacionario a las 20 horas de haber sido inoculados(Swetha et. al., 2005), sin embargo esto no confirma explcitamente que se haya degradadotodo el carbaryl. Para su aplicacin en el proceso de bioremediacin de suelos contaminadoscon carbaryl, se debera confirmar esta informacin.

En cuanto a las dos cepas restantes de Pseudomonas sp. (50581 y 50552) se identific queindividualmente no degradan completamente el carbaryl: la cepa 50581 lo degrada hasta 1-

naftol en la fase de crecimiento exponencial, luego al entrar a la fase estacionaria comienza ametabolizar el 1-naftol a un metabolito no identificado. La cepa 50552 por s misma nodegrada carbaryl en absoluto, fue aislada por su capacidad de degradar 1-naftol, producidopor la cepa 50581 en la fase de crecimiento exponencial, a CO 2+H2O. Adems se identific laespecificidad de estas cepas para la degradacin de carbaryl, ya que no mostraroncrecimiento en otro tipo de carbamatos (Chapalamagu et. al.,1991). La nica forma en queestas dos cepas contribuyen a nuestro objetivo de bioremediacin de suelos contaminadoscon carbaryl, es el uso de un complejo de los dos microorganismos para lograr metabolizarcompletamente este pesticida, pero esto puede suponer una dificultad en la escalada para laaplicacin en landfarming, tal como se ha planteado.

Por ltimo, tenemos el caso de la cepa RC100 de Arthrobacter sp., la cual fue capaz dedegradar 0.4mM de carbaryl (80.4 g) en 48 horas luego de haber sido inoculada. Adicional a

esta respuesta tan acelerada, se determin que esta cepa, debido a la codificacin de dosplsmidos especficos, degrada el carbaryl a 1-naftol, y puede seguir degradndolo


14/15

directamente a CO2+H2O, sin necesidad de crear un consorcio para complementar la rutametablica (Hayatsu et. al., 1998).

A mi criterio, la mejor opcin para la biodegradacin de suelos contaminados con carbaryl enla industria bananera es la cepa RC100 deArthrobacter sp., y en segundo lugar optara por eluso del consocio de las cepas 50581 y 50552 de Pseudomonas sp., tanto por las tazas de

degradacin de carbaryl, el tiempo en que lo hacen, y el costo de la preparacin del medio decultivo.

El uso de las otras tres cepas de Pseudomonas sp. dependera de la confirmacin cuantitativade la taza de degradacin del pesticida en cuestin y del tiempo requerido, un punto encontra de esta opcin es el costo de la preparacin de los medios de cultivo, pero al parecerpor la cantidad de carbaryl utilizada en los ensayos, puede ser la opcin ms efectiva, aunquedebe ser comprobada cuantitativamente su taza de degradacin.

Conclusiones

Habiendo revisado los aspectos ms importantes del desarrollo de las diferentes opciones

analizadas para proponerlas para el tratamiento de carbaryl en suelos contaminados en laindustria bananera, se estableci que la mejor opcin es el uso de la cepa RC100 de Arthropobacter sp. debido a los resultados mostrados en cuanto a la taza ms eficiente dedegradacin de este carbamato en comparacin a las revisadas en los dems estudios y a larelativa sencillez de los componentes del medio de cultivo, lo que supone una inversinmenor en la escalada para un proceso de bioremediacin de suelos.

El uso del consorcio de las cepas 50581 y 50552 de Pseudomonas sp. tambin mostr serefectivo para la degradacin de carbaryl, y a pesar de que el medio de cultivo es quesupondra una menor dificultad, sobre todo para la escalada, no se lo aconsej como laalternativa principal debido a la dificultad que podra suponer el aislamiento de estas doscepas especficas. Otro punto en contra es la especificidad que han desarrollado estas dos

bacterias para la degradacin especfica de carbaryl, ya que no fueron efectivos al momentode degradar otros carbamatos, lo cual contrasta con la habilidad mostrada por las demscepas para crecer en otros carbamatos como fuente nica de carbn y energa, lo cual creauna condicin ideal para el tratamiento de suelos expuestos a fumigaciones cclicas.

No se propuso el uso de las cepas C4, C5 y C6 de Pseudomonas sp. debido a la falta deinformacin sobre las tazas de degradacin de carbaryl, aunque en la bibliografa semencion que estas tres cepas constituyen una buena alternativa para el tratamientobiolgico de pesticidas. Adems, el medio de cultivo es ms complejo que el de las otrascepas, lo que se traduce en un costo mayor para la escalada.

La bibliografa revisada coincide, en que con respecto a los parmetros crticos para eldesarrollo de bacterias degradadoras de carbaryl en laboratorio, se debe mantener una

temperatura de 30C y un pH entre 6.8 y 8, como nica fuente de carbono y energa seutiliz el carbaryl, pero en algunos casos, principalmente en el medio de cultivo de las cepasC4, C5 y C6 de Pseudomonas sp. se aadieron ms elementos constituyentes, lo cual suponeun costo elevado en la escalada del bioproceso, por lo que se prioriz la atencin a lasespecies cuyo medio de cultivo era ms sencillo.


15/15

Recomendaciones

Se recomienda en primer lugar realizar un estudio taxonmico de las cepas analizadas, quenos permita identificar a qu especie pertenecen y tener un conocimiento ms amplio de suscaractersticas, para poder confirmar o replantear los resultados y conclusiones realizados eneste trabajo.

Tambin es necesario complementar la informacin bibliogrfica referente a la capacidad dedegradacin de pesticidas de las cepas C4, C5 y C6 de Pseudomonas sp., para determinar sisu aplicacin en tratamiento de suelos contaminados con carbaryl es econmicamentefactible, sobre todo tomando en cuenta que el medio de cultivo para el desarrollo de estascepas es el ms complejo de los analizados, por lo que se requiere una justificacinfundamentada en una taza de degradacin ideal para justificar la escala de este bioproceso.

Tomando en cuenta los parmetros crticos expuestos anteriormente, se debera revisar si serequieren las mismas condiciones para la escalada a un bioproceso a nivel de landfarming obiopilas para tratamiento ex situ o bioaumentacin para tratamientos in situ.

Bibliografa

- Araya, M., 2004, La Biodegradacin Acelerada de Nematicidas No-Fumigantes enPlantaciones Comerciales de Banano (Musa AAA) CORBANA S.A. Gupiles, CostaRica.

- Bahig, A., Aly, E., Khaled, A., Amel, K., 2008, Isolation, Characterization and Application of bacterial population from agricultural soil at Sohag Province, EgyptSohag University, Egipto.

- Chapalamagu, S., Chaudhry, R., 1991, Hydrolysis of Carbaryl by a Pseudomonas sp.and Construction of a Microbial Consortium That Completely Metabolizes Carbaryl

Oakland University.- Hayatsu, M., Hirano, M., Nagata, T., 1998, Involvement of Two Plasmids in the

Degradation of Carbaryl by Arhthrobacter sp. Strain RC100 National Institute ofFood, Tukuba, Japn.

- INIBAP, CATIE, CORBANA, INIA, IDIAP, IDIAF, CEDAF, 2004, Innovacionestecnolgicas para el manejo de la calidad y salud de suelos bananeros de AmricaLatina y el Caribe INIBAP. Washington, Estados Unidos.

- Ministerio de Ambiente, 2004, Texto Unificado de Legislacin Ambiental SecundariaCaptulo VI Anexo 1: NORMA DE CALIDAD AMBIENTAL Y DE DESCARGA DEEFLUENTES : RECURSO AGUA

- Swetha, V., Phale, P., 2005, Metabolism of Carbaryl via 1,2-Dihydroxynaphthaleneby Soil Isolates Pseudomonas sp. Strains C4, C5 and C6. Institute of Technology,Bombay, India.

- Xu, S., 2000, Environmental Fate of Carbaryl Environmental Monitoring & PestManagement. Sacramento, Estados Unidos.

Documents

Universidad Internacional SEK Facultad de Ciencias Ambientales