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UNIVERSIDAD DEL MAR
CAMPUS PUERTO ESCONDIDO
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
REPORTE FINAL DE SERVICIO SOCIAL
ALUMNO:
JOSÉ EDUARDO HERNÁNDEZ CORTES
RESPONSABLE INMEDIATO:
M. EN C. JULIETA KARINA CRUZ VÁZQUEZ
INSTITUCIÓN O DEPENDENCIA:
UNIVERSIDAD DEL MAR CAMPUS PUERTO ESCONDIDO
08 DE FEBRERO DE 2016
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ÍNDICE
OBJETIVOS GENERALES ..................................................................... 2
INTRODUCCIÓN ................................................................................ 2
Preparación de medios de cultivo PDA .......................................... 2
Cultivo y crecimiento de cepas fúngicas ........................................ 3
Extracción de DNA de las cepas fúngicas ....................................... 3
Técnica de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) ................. 6
ACTIVIDADES .................................................................................... 8
Preparación de medios de cultivo y sembrado de cepas fúngicas . 8
Preparación de frotis a partir de cultivos previos para observación
a microscopio ................................................................................. 8
Extracción de DNA de cepas fúngicas cultivadas ............................ 9
Preparación de Soluciones Stock ................................................ 9
Extracción de DNA .................................................................... 10
Electroforesis de DNA ............................................................... 11
Técnica de PCR .......................................................................... 11
RESULTADOS ................................................................................... 12
CONCLUSIÓN .................................................................................. 12
SUGERENCIAS ................................................................................. 13
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................. 13
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OBJETIVOS GENERALES Llevar a cabo la caracterización de cepas fitopatógenas de papaya de la costa de Oaxaca
Realizar el sembrado de cultivos axénicos de las sepas de hongos asignadas mediante la transferencia
de colonias utilizando la técnica aséptica
Realizar los frotis de asa y cinta para lograr observar estructuras reproductoras de las cepas cultivadas
en microscopio óptico
Realizar la extracción de DNA de cepas de hongos para su posterior amplificación por PCR
INTRODUCCIÓN
Preparación de medios de cultivo PDA Los medios de cultivo son compuestos o preparaciones alimenticias elaboradas en los laboratorios de
microbiología con los nutrientes requeridos para cada género en particular, que conjuntamente con las
condiciones ambientales adecuadas propician su desarrollo, constituyendo de hecho el micromundo de los
microorganismos en condiciones de laboratorio.
Para que un medio de cultivo resulte eficaz, sus componentes deben responder a las exigencias nutricionales
de las especies que se pretenden cultivar. Debido a que existen diferencias en los elementos constitutivos que
requiere cada género o especie, así como en sus actividades metabólicas y los mecanismos para obtener los
nutrientes, se comprenderá que no hay un medio de cultivo standard que posibilite el desarrollo de todas las
especies, existiendo por lo tanto una amplia variedad de estos (Gonzales et al. 2004).
En microbiología, se usan dos tipos generales de medios de cultivo: los químicamente definidos y los complejos
(o no definidos). Los medios definidos se preparan añadiendo cantidades precisas de compuestos orgánicos o
inorgánicos purificados a un volumen en agua destilada. Por tanto, se sabe la composición química exacta de
un medio definido. Sin embargo, en muchos casos la composición exacta de un medio no es importante. Los
medios complejos pueden ser entonces adecuados o incluso ventajosos por varias razones. A menudo, los
medios complejos emplean hidrolizados de caseína, carne, soja, levaduras u otras sustancias muy nutritivas
pero que no podemos conocer su composición química exacta. Aunque son mucho más fáciles de preparar,
una de sus limitaciones es que no se puede controlar su composición nutritiva exacta (Madigan 2003).
Por regla general los ingredientes de los medios de cultivo se disuelven por agitación y calentando ligeramente
en agua destilada. Los medios que contienen agente gelificante se suelen hervir durante 1 minuto para
conseguir su disolución. Aunque en la mayor parte de los medios hay que calentar, hay que evitar
sobrecalentamientos innecesarios. Algunos medios presentan turbidez inevitable o precipitados, por ejemplo,
la Base de Caldo Tetrationato. Al distribuir el medio debe hacerse de forma uniforme, para que el precipitado
quede bien repartido. Posteriormente a la disolución se procede a la esterilización del medio. En algunos casos
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existen componentes lábiles que no pueden añadirse en el medio de cultivo deshidratado y que será necesario
su esterilización por separado y una posterior incorporación de forma aséptica para obtener el medio completo
(PANREAC, 2002).
Una vez que ha sido preparado un medio de cultivo, puede ser inoculado y a continuación incubado en
condiciones que favorezcan el crecimiento. En general, se tratará del crecimiento de un cultivo axénico o puro,
ya que contiene solo un único tipo de microorganismos (Madigan, 2003).
Cultivo y crecimiento de cepas fúngicas Para obtener y mantener un cultivo axénico o puro es esencial evitar la entrada de otros microorganismos. Los
organismos no deseados llamados contaminantes, son muy ubicuos, por lo cual se han diseñado técnicas
microbiológicas para evitarlos. Un método importante para obtener cultivos axénicos o puros y para asegurar
la pureza de un cultivo es el uso de medios sólidos en placas de Petri. Dado que los microorganismos son
ubicuos, los medios de cultivo se han de esterilizar antes de usarse. Para la mayoría de los medios de cultivo
esto se realiza por calor, habitualmente mediante calor húmedo en un gran recipiente a presión llamado
autoclave. Una vez preparado un medio de cultivo estéril, puede recibir un inoculo de un cultivo puro y cultivarlo
nuevamente. Esto requiere el uso de la técnica aséptica.
La técnica aséptica consiste en una serie de procedimientos que evitan la contaminación durante la
manipulación de los cultivos y de los medios de cultivo estériles. El problema más común es la contaminación
ambiental a través del aire, ya que este siempre contiene polvo en suspensión que generalmente lleva una
comunidad de microorganismos. Cuando las placas o tubos se abren deben manejarse de tal modo que los
contaminantes del aire no penetren. La transferencia aséptica de un cultivo desde un tubo con medio a otro, se
realiza habitualmente con el asa o aguja de siembre previamente esterilizada a la llama por incandescencia.
Los cultivos en los que ha habido crecimiento se pueden transferir luego a la superficie de placas con agar,
donde se desarrollaran colonias como resultado del crecimiento y división de las células aisladas que han sido
sembradas. La toma y resiembra por extensión de una colonia aislada es un método idóneo para obtener
cultivos axénicos o puros a partir de mezclas complejas que contienen muchos organismos diferentes (Madigan,
2003).
Extracción de DNA de las cepas fúngicas En la actualidad, el estudio de la variación genética entre individuos, poblaciones y especies para explicar
patrones y procesos ecológico-evolutivos se aborda mediante marcadores moleculares, segmentos de DNA
con o sin función conocida que proporcionan información sobre la variación alélica y permiten distinguir
individuos. Estos marcadores se obtienen con técnicas como la PCR (por las siglas en inglés de Polymerase
Chain Reaction) y secuenciación, que hacen posible analizar la variación en la molécula del ADN con un detalle
sin precedentes. Los datos moleculares han permitido estudiar con mayor precisión los patrones de diversidad
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genética y su distribución; el comportamiento; la selección natural; las interacciones biológicas; la composición,
funcionamiento y dinámica de comunidades microbianas; las relaciones filogenéticas, entre otros (Velázquez et
al. 2014). Debido a esto los métodos de detección de ácidos nucleicos tales como PCR se han vuelto una
herramienta común para identificación y diagnostico microbiano. Aunque la amplificación por PCR puede ser
realizada directamente en varios cultivos microbianos para hongos filamentosos y levaduras, es importante
realizar un previo aislamiento del DNA, ya que la extracción de DNA elimina muchas sustancias desconocidas
del material biológico que interfieren con su procesamiento, por lo cual juega un importante papel en asegurar
resultados consistentes y confiables (Liu et al. 2000).
La aplicación de diferentes técnicas empleadas en biología molecular para el análisis del genoma, depende en
gran medida de la habilidad para extraer el DNA. Para lo cual se utilizan diversos métodos de extracción,
dependiendo del tipo de tejido a emplear (Mosquera, 2005). La extracción consiste en el aislamiento y
purificación de moléculas de DNA y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. El DNA está
constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están
integrados por un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o
citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces fosfodiéster,
dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante puentes de
hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal.
Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al DNA una carga neta
negativa y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para su extracción. Los grupos fosfato
tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al DNA en
soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molécula. Pero, en presencia de etanol, se
rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión
con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el
DNA precipite. Por otro lado, la carga neta negativa del DNA le permite unirse a moléculas y matrices
inorgánicas cargadas positivamente (Velázquez et al. 2014).
Para lograr la extracción de DNA existen tres básicos experimentos: (1) abrir las células en la muestra para
exponer los ácidos nucleicos para su posterior procesamiento, (2) separar los ácidos nucleicos de otros
componentes celulares, y (3) recuperar los ácidos nucleicos en su forma purificada. Para esto una variedad de
métodos pueden ser usados, desde simples procedimientos con pocos pasos a purificaciones más complejas
que involucran varios diferentes pasos.
El primer paso de cualquier protocolo de extracción de DNA es la ruptura del material biológico con que se
inicia, el cual puede ser viral, bacteriano, de plantas o animales. El método usado para abrir las células debe
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ser lo más gentil posible, preferiblemente utilizando degradación enzimática del material de la pared celular (si
está presente) y lisis por detergentes para las membranas celulares. Si se requieren de métodos más vigorosos
de ruptura (como es el caso en material celular de algunas plantas), existe el peligro de cortar grandes
moléculas de DNA, y esto puede dificultar la producción de moléculas recombinantes representativas durante
el subsecuente procesamiento.
Seguido de la ruptura, la mayoría de métodos utilizan la etapa de desproteinización. Esto puede llevarse a cabo
por una o más extracciones usando mezclas de fenol o fenol/cloroformo. En la formación de esta emulsión y su
subsecuente centrifugación se forman fases separada, donde las moléculas proteicas se particionan en la fase
de fenol y se acumulan en la interface. Los ácidos nucleicos permanecen principalmente en la fase acuosa
superior y pueden ser precipitadas con una solución usando isopropanol o etanol. Si se requiere preparar el
DNA, puede utilizarse la enzima RNasa para la digestión del RNA en la preparación (Nicholl, 2008).
Después de que son eliminados los lípidos y las proteínas, se recupera el DNA. Para ello, se adiciona etanol y
soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o amonio que se unen a los grupos fosfato, esta mezcla
reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el DNA se pliegue sobre sí mismo haciéndolo
insoluble. Un paso de centrifugación permite que el DNA permanezca en el fondo del tubo mientras que el
etanol es desechado. Los restos de etanol se eliminan con un lavado con etanol al 70% y el remanente se
elimina por evaporación.
Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el DNA para mantenerlo en solución. En el
caso de emplear agua, el pH debe ser de 7 para permitir la redisolución completa del DNA y evitar una hidrólisis
ácida. Cuando se utiliza una solución amortiguadora, es preferible utilizar una solución de Tris-HCl a 10mM y
EDTA a 0.1M a un pH de 8.0 para almacenar el material. Cuando se está disolviendo el DNA es importante
evitar el pipeteo y la agitación agresiva pues se pueden fragmentar moléculas de alto peso molecular. Una
opción que evita la fragmentación consiste en incubar a 55 °C el ADN, 1 a 2 horas con agitación suave
(Velázquez et al. 2014).
Una vez terminado el proceso de separación del DNA, se procede a verificar la calidad del DNA extraído. Este
proceso se lleva a cabo mediante la Electroforesis. La electroforesis es una técnica que se basa en la capacidad
de las macromoléculas cargadas para desplazarse en un campo eléctrico, con una velocidad proporcional a su
carga e inversamente proporcional a su tamaño. Las moléculas de DNA poseen, al pH alcalino habitual una
carga negativa uniforme por unidad de masa, lo que hace que su movilidad hacia el ánodo (+) solo venga
determinada por el tamaño de la molécula (número de pares de bases, si es lineal). La separación de los
fragmentos de DNA doble se realiza por electroforesis en geles de agarosa (Horizontal) o poliacrilamida
(vertical). En ambos casos, el gel se prepara con distintas concentraciones en función del tamaño de los
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fragmentos de DNA que se quieren separar. Los fragmentos más pequeños (1,000 pb) se pueden separar en
geles de poliacrilamida; para tamaños algo mayores (20 kpb) se usan geles de agarosa. Modificando la
concentración de acrilamida o agarosa se consigue variar el intervalo de tamaños que es posible separar.
Una vez separadas, las moléculas de DNA se visualizan normalmente por la fluorescencia de distintos
compuestos que se unen a ellas. Aunque el más utilizado es el bromuro de etidio; este es un agente intercalante
que se introduce entre las bases apiladas del DNA y abre un poco la doble hélice, provocando un
desenrollamiento local. Su fluorescencia aumenta mucho cuando se une al DNA (color anaranjado al iluminar
con luz UV) por lo cual es utilizado como método de tinción o revelado del DNA, especialmente en electroforesis
o centrifugación (Cabrera y Sánchez, 2002).
Técnica de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) Conceptualmente, el proceso de clonación (clonado o clonaje) consiste en la obtención de un clon, entendido
como un conjunto de “elementos” genéticamente idénticos entre si y a su precursor. Estos “elementos” pueden
ser moléculas, células, tejidos, órganos u organismos pluricelulares completos. Cada componente individual de
un clon contiene la misma información genética, el mismo genotipo, que el elemento de partida; por ello, se
puede considerar que la clonación supone una amplificación genética.
El interés de la clonación radica esencialmente en su carácter biotecnológico como proceso de multiplicación
de moléculas de DNA o RNA, células, tejidos u organismos completos, mediante mecanismos de manipulación
genética. La biología en general, y la investigación en particular, están avanzando enormemente y lo harán aún
más en el futuro, con la variada gama de copias de elementos genéticos ya empleados para estudiar y resolver
problemas tanto de carácter básico como aplicado (Angel, 2002).
Por tal motivo, para que se lleven a cabo estas investigaciones se han desarrollado diversas técnicas de
clonación, entre estas se encuentra la PCR por sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction o Reacción en
Cadena de la Polimerasa. La idea de dicha técnica es sintetizar o “clonar” muchas veces un pedazo o fragmento
de DNA utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la
bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79 ⁰C a 85 ⁰C), de ahí su nombre comercial más
conocido: taq polimerasa.
Cuando hacemos una reacción de PCR simulamos lo que sucede en una célula cuando se sintetiza el DNA y
en el tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa, el DNA del organismo que
queremos estudiar (donde se encuentra el fragmento que queremos sintetizar), los oligonucleótidos (llamados
también primers, iniciadores, cebadores, “oligos”, etc.) necesarios para que se inicie la transcripción,
dinucleótidos (dNTPs), y las condiciones para que la enzima trabaje adecuadamente (cierto pH, determinadas
cantidades de magnesio en forma de MgCl2, KCl, y pueden necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo
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de cada polimerasa). Esta técnica tan ingeniosa tiene muchísimas aplicaciones distintas y se ha convertido en
una herramienta muy importante en la biología molecular; sus aplicaciones van desde la genética de
poblaciones, evolución molecular y genómica hasta la medicina forense (Espinosa, 2007).
La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del DNA: el DNA bicatenario se desenrolla y pasa a
DNA monocatenario, se duplica y se vuelve a enrollar. Esta técnica consiste en ciclos repetitivos de: (1)
Desnaturalización del DNA por fusión a temperatura elevada, a fin de convertir el DNA bicatenario en DNA
monocatenario, (2) unión (anillamiento) de dos oligonucleótidos, utilizados como cebadores, al ADN objetivo y
(3) extensión de la cadena de DNA por adición de nucleótidos a partir de los cebadores utilizando DNA
polimerasa como catalizador, en presencia de iones Mg2+ (Imagen 1).
Los oligonucleótidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas, que son diferentes entre sí y
complementarias de los sitios de reconocimiento que flanquean el segmento de DNA objetivo que debe
amplificarse. Las fases de desnaturalización del DNA molde, anillamiento del cebador y extensión del cebador
constituyen un «ciclo» del método de amplificación por PCR.
Tras cada ciclo, las hebras de DNA recién
sintetizadas pueden servir de DNA molde
para el ciclo siguiente. El producto principal de
esta reacción exponencial es un segmento de
DNA bicatenario cuyos extremos vienen
definidos por los extremos 5’ de los
oligonucleótidos cebadores y cuya longitud
viene dada por la distancia entre los
cebadores. Los productos de una primera
ronda de amplificación efectiva son moléculas
de DNA de diferentes tamaños, cuyas
longitudes pueden superar la distancia entre
los sitios de unión de los dos cebadores. En la segunda ronda, estas moléculas generan hebras de DNA de
longitud definida que se acumulan de forma exponencial en rondas posteriores de amplificación y constituyen
los productos dominantes de la reacción. Así, la amplificación, que es el número final de ejemplares de la
secuencia diana, se expresa con la siguiente ecuación:
(2n-2n)x
Donde n es el número de ciclos, 2n es el número de moléculas del primer producto obtenidas tras el primer
ciclo y de los segundos productos obtenidos tras el segundo ciclo con longitud indefinida, x es el número de
Imagen 1. Fases de la amplificación por PCR (Imagen: Andy Vierstraete, 1999).
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ejemplares del DNA molde original. Teóricamente, al cabo de 20 ciclos de PCR habrá una amplificación de 220
veces, suponiendo que cada ciclo tiene un rendimiento del 100 %. El rendimiento de una PCR varía de un DNA
molde a otra y depende del grado de optimización que se haya conseguido (Somma y Querci, 2007).
ACTIVIDADES
Preparación de medios de cultivo y sembrado de cepas fúngicas Las actividades realizadas se llevaron a cabo en el campo experimental y dentro del laboratorio de
genética de la Universidad del Mar. El proyecto “Aislamiento e identificación de agentes causales de
la reducción de rendimiento en el cultivo de papaya en la costa de Oaxaca" consistió principalmente
en el cultivo de hongos de papaya (Carica papaya) por medio de la obtención de cepas fitopatógenas
del fruto de la planta. Estas cepas se cultivaron con ayuda de técnicas básicas de microbiología como;
el sembrado en medios líquidos y sólidos, frotis, y con estas técnicas se obtuvieron cultivos axénicos
que se utilizaron para la caracterización macro y microscópica de las cepas fúngicas.
Para llevar a cabo la parte de cultivo en medios sólidos, se utilizaron placas de Petri estériles que se prepararon
utilizando agar como medio gelificante y medio de cultivo PDA para las 50 cepas diferentes que nos fueron
proporcionadas. Para la preparación de los medios de cultivo se utilizó agar Papa y Dextrosa (PDA), este se
pesó en una balanza analítica y posteriormente se vacío en un matraz Erlenmeyer de 250 ml en el cual se
añadió agua destilada y se agito vigorosamente hasta eliminar todos los grumos del medio.
Una vez diluido el medio se tapó el matraz con un pedazo de papel aluminio y se esterilizo en un autoclave a
15 Lb/in2 por 20 minutos.
Terminada la esterilización se añadió ácido láctico al medio esterilizado. Finalmente se vertió el medio en las
placas Petri. Se dejaron enfriar por dos días en la mesa del laboratorio para descartar contaminación, y
posteriormente se almacenaron en un refrigerador hasta su próximo uso.
Posteriormente, la inoculación de las cajas Petri estériles se realizó con una cepa diferente para cada caja. El
sembrado se realizó dentro de una campa de flujo transfiriendo con ayuda de un bisturí estéril una pequeña
muestra de agar con micelio del hongo a la nueva caja Petri. Este inoculo se colocó en el centro de la caja Petri.
Una vez que todas las cajas Petri se inocularon se sellaron con parafilm y se colocaron dentro de una
incubadora a 27 ºC hasta que presentara crecimiento en aproximadamente 1 a 2 semanas.
Preparación de frotis a partir de cultivos previos para observación a microscopio De las cepas cultivadas se realizó un raspado de las placas de Petri con una asa bacteriológica (Frotis por asa)
y con cinta masquin tape (Frotis por cinta), ambas tomas de muestra se realizaron dentro de una campana de
flujo laminar y con ayuda de un mechero para esterilizar.
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Cada muestra que se tomó se colocó en un portaobjetos, se rotulo según el nombre de la cepa, se le añadió
unas gotas de azul de lactofenol y se observó al microscopio en busca de estructuras que nos ayudaran a
identificar al hongo de interés.
Extracción de DNA de cepas fúngicas cultivadas Para llevar a cabo la extracción se utilizaron los cultivos de hongos en medio líquido Papa-Dextrosa que fueron
cultivados previamente. Para obtener el material biológico se aisló el micelio del medio, utilizando material estéril
y libre de DNA que pudiera interferir con la posterior extracción y amplificación de su DNA. Una vez obtenido el
material biológico se continuó con la preparación de los materiales y reactivos para realizar la extracción de
DNA. El proceso de extracción se llevó a cabo según castellanos et al. (2011).
Preparación de Soluciones Stock Se prepararon las soluciones respectivas para los diferentes experimentos realizados.
EDTA, pH 8: Agente quelante de iones metálicos como Ca y Mg. Inhibe la acción de las nucleasas al no haber
cofactores libres para su actividad y así proteger al DNA.
NaCl: Aumenta el poder iónico de la solución y ocasiona la precipitación del DNA.
Tris-HCl, pH 7.5: Tampón biológico, mantiene el pH de la solución constante (pH 7-8)
Buffer de extracción (NTES). Se preparó 200 ml de solución. Utilizando soluciones madre preparadas de
NaCl, Tris-HCl, EDTA y detergente SDS. Las concentraciones finales en la solución fueron: NaCl 0.5M, Tris-
HCl 0.2M, EDTA 10mM y SDS 1%.
SDS: compuesto tensoactivo iónico que se utiliza para romper las membranas.
Fenol/Cloroformo/AlcoholIsoamilico (25:24:1): Precipita proteínas
Imagen 2. Reactivos para la extracción de DNA
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Cloroformo/AlcoholIsoamilico (24:1): Precipita proteínas
Isopropanol: Se utiliza para precipitar los ácidos nucleicos y formar el pellet
1X TE: Usado para resuspender el pellet de DNA. Se preparó 250 ml con las soluciones madre Tris-HCl y
EDTA. Las concentraciones finales en la solución fueron: Tris-HCl 10mM y EDTA 1mM.
TBE 5X: Usado como buffer para la electroforesis. Se preparó 1 litro. 54 g de Tris Base, 7.5 g de ácido bórico
y 20 ml de EDTA 0.5 M (pH 8)
Buffer de Carga 6X: Se utiliza para añadir densidad a las muestras de DNA y que puedan ser colocadas en
los pocillos del gel de agarosa. Se preparó utilizando Azul de bromofenol, Glicerina y agua desionizada.
Gel de agarosa 1 % w/v: utilizado como soporte para la corrida del DNA. La concentración utilizada depende
de los fragmentos de DNA que queremos separar. Según Sambrook y Russell (2001) el siguiente cuadro
resume las concentraciones relacionadas con el tamaño de fragmento a separar.
Extracción de DNA Una vez que se prepararon las soluciones se prosiguió con la extracción del DNA del micelio recuperado.
El primer paso fue realizar el maceramiento del micelio mediante un mortero y pistilo previamente esterilizado
y frio. Se omitió el uso del nitrógeno líquido ya que no se consiguió.
Una vez macerado, el micelio se pasó a tubos eppendorf de 1.5 ml con la ayuda del pistilo. Llenándolos solo
la parte del fondo.
Se adiciono a cada una de las muestras 500 μl de buffer de extracción (NTES). Se homogeneizo mediante
vortex y se incubaron las muestras en un multiblock (Thermo scientific) a una temperatura de 65 ºC durante
30 minutos.
Después de la incubación se adiciono 500 μl de la solución fenol:cloroformo:alcoholisoamilico y se mezcló
con el vortex.
Se centrifugo a 12,000 rpm durante 10 minutos.
Imagen 3. Procedimiento de PCR en el laboratorio de genética
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Se rescató el sobrenadante en un nuevo tubo eppendorf con la ayuda de micropipetas, cuidando no mezclar
la interface de nuevo.
Se agregó una solución de cloroformo:alcoholisoamilico y se centrifugo a 12,000 rpm durante 10 minutos.
Se rescató de nuevo el sobrenadante en un nuevo tubo eppendorf y se agregó una solución de isopropanol
frio (400 μl) y se almaceno a -20 º C por una semana.
Se centrifugo a 12,000 rpm durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante, en este paso se tuvo cuidado
de no perder el pellet de DNA.
Se lavó el pellet con 500 μl de etanol 70% frio y se volvió a centrifugar a 12,000 rpm durante 5 minutos.
Seguido se descartó de nuevo el sobrenadante y se dejó secar el pellet a temperatura ambiente por inversión
del tubo.
Como último paso se diluyo el pellet en buffer 1X TE y se mantuvo a -20 ºC hasta su próximo uso.
Electroforesis de DNA Los resultados del proceso de extracción fueron corroborados con una electroforesis, esta se realizó de la
siguiente manera; El buffer de electroforesis utilizado fue TBE; este se vertió en la cámara de electroforesis
hasta cubrir el gel de agarosa. El Buffer de carga 6X se mezcló con la muestra en un pedazo de papel film,
utilizando una micropipeta de 10 μl (se utilizó 9 μl de muestra de DNA, adicionando una gota a partir de la
micropipeta del buffer de carga). Después que se mezcló (Cambio de color a azul) se colocó la muestra en los
pocillos del gel de agarosa.
En cuanto al gel de agarosa se preparó con una concentración de 1 % al cual se añadieron 3 gotas Bromuro
de etidio para el posterior revelado del DNA. La corrida se realizó por 90 minutos a 80 volts. Una vez finalizada
la corrida, se retiró el gel de la cámara y se introdujo en una cámara de luz UV para observar los fragmentos
de DNA de cada muestra.
Técnica de PCR Para realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizaron las muestras de DNA obtenidas a partir
de la extracción de DNA. Primeramente, se realizaron los cálculos necesarios para preparar los elementos
necesarios para realizar el PCR (Buffer, primers, Taq Polimerasa, Magnesio, dNTP’s). Las concentraciones
finales se prepararon según Zivkovic et al. (2010). Mediante el uso de Excel se calcularon las cantidades de
cada uno de los reactivos para el PCR. El volumen final fue de 25 μl para cada tubo de PCR
Una vez preparado el master mix en un tubo eppendorf se añadió 23.5 μl de este en un tubo eppendorf (Foto
(B), imagen 4), al cual se le agregaron 1.5 μl de la muestra de DNA. Una vez listas las muestras se configuro
el programa en el termociclador BIO-RAD T100 (Foto (C), imagen 4) de la siguiente manera; desnaturalización
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inicial a 94ºC por 5 minutos, seguido de 35 amplificaciones consistiendo de 1 min. a 94 ºC, 2 min. a 59 ºC, 1
min. de extensión a 72 ºC y una extensión final de 5 min. a 72 ºC (Foto (D), Imagen 4).
Una vez terminado el PCR las muestras se mantuvieron almacenadas a -20 ºC para su posterior verificación
por electroforesis en gel de agarosa.
RESULTADOS De las caracterizaciones que se llevaron a cabo 50 cepas fúngicas fueron caracterizadas a nivel de
especie, cada una de estas fue identificada por los métodos anteriormente descritos. También se
realizaron ilustraciones de estas para ayudar a identificar posteriores cepas que se continuen
analizando. Las pruebas moleculares dieron como resultado una identificación más precisa de las
cepas cultivadas, evaluando así la previa caracterización macro y microscópica que se realizó.
CONCLUSIÓN Durante el servicio social, pude aprender distintas técnicas de estudio moleculares que me sirvieron
de ayuda para caracterizar e identificar hongos, así también aprendí otros métodos relacionados con
el estudio de microorganismos que realice durante el servicio social en el laboratorio de genética de
la Universidad del Mar.
Imagen 4. Preparación de muestras y configuración de termociclador para la PCR
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SUGERENCIAS Me gustaría comentar que es bueno trabajar con algo que esté relacionado con la carrera de biología
ya que aprendes de personas ya ejerciendo su profesión y así obtener experiencia para futuros
trabajos al finalizar la licenciatura.
BIBLIOGRAFÍA 1. Angel Herraez J. L., 2002, Biología molecular e ingeniería genética, Elsevier, Madrid, 2002
2. Cabrera J. L., y Sánchez A. H., 2002, Texto Ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética
conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud, Elsevier Science, España
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