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MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CELÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
1
UNIVERSIDAD DE GRANADA HOSPITAL UNIVERSITARIO VIRGEN DE LAS NIEVES
DEPARTAMENTO DE PEDIATRIA
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CELÍACA.
RELEVANCIA CLÍNICA TESIS DOCTORAL GRANADA 2009
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR: Miguel Ángel López Casado Bajo la dirección de los doctores: Maria Isabel Torres López Julio Romero González Antonio Ríos Guadix Granada, 2009
Editor: Editorial de la Universidad de GranadaAutor: Miguel Ángel López CasadoD.L.: Gr 3915-2009ISBN: 978-84-692-7863-5
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
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Agradecimientos: - En primer lugar quiero dar las gracias a Maruja López Gutiérrez sin cuya ayuda no habría iniciado este estudio - A la Dra. Mª Isabel Torres directora de esta tesis por su inestimable ayuda y entusiasmo durante los años que se ha llevado a cabo esta investigación. - Al Dr. Julio Romero González que me supo alentar y me apoyó en los momentos más bajos y sin cuya ayuda este trabajo no habría visto su fin. - A Miguel, Victor y Mamen por las horas que no les he dedicado. - A los pacientes celiacos y sus familiares por su colaboración. A mis padres
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PUBLICACIONES RELACIONADAS CON LA SIGUIENTE TESIS: 1: Torres MI, Lopez Casado MA, Rios A. New aspects in celiac disease. World J Gastroenterol. 2007 Feb 28;13(8):1156-61. Review. PMID: 17451193 [PubMed - indexed for MEDLINE] 2: Torres MI, Lopez-Casado MA, Lorite P, Rios A. Tryptophan metabolism and indoleamine 2,3-dioxygenase expression in coeliac disease. Clin Exp Immunol. 2007 Jun;148(3):419-24. Epub 2007 Mar 15. PMID: 17362267 [PubMed - indexed for MEDLINE 3: Torres MI, Lopez-Casado MA, Luque J, Peña J, Rios A. New advances in coeliac disease: serum and intestinal expression of HLA-G. Int Immunol. 2006 May;18(5):713-8. Epub 2006 Mar 28. PMID: 16569678 [PubMed - indexed for MEDLINE] 4: Torres MI, Lorite P, López-Casado MA, Ríos A.A new approach using tissue alkaline phosphatase histochemistry to identify Crohn's disease.
Pathol Res Pract. 2007;203(6):485-7. Epub 2007 May 10.
PMID: 17498884 [PubMed - indexed for MEDLINE]
5: M.I. Torres, M.A. López-Casado, J. Luque, J. Peña, A. Ríos. Soluble HLA-G expression in celiac disease. Tissue Antigens 68 (2006) 349–368
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
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MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CELÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
INDICE--------------------------------------------- -------------------------------------- 4 I. Justificación y objetivos------------------------------------------------------ 8 I.1. Antecedentes del tema.-------------------------------------------------------- 8 I.1.1. Complejo Mayor de Histocompatibilidad.-------------------------------- 9 I.1.2. Citoquinas.---------------------------------------------------------------------- 9 I.1.3. Células Th.----------------------------------------------------------------------- 10 I.1.4. Molécula de HLA_G. --------------------------------------------------------- 11 I.1.5. Enzima IDO. ------------------------------------------------------------------- 12 I.2. Objetivos.----------------------------------------------------------------------- 13 II. Introducción. --------------------------------- --------------------------------- 14 II.1. Concepto de enfermedad celiaca. ----------------------------------------- 14
II.2. Epidemiología. --------------------------------------------------------------- 18
II.2.1. Prevalencia.-------------------------------------------------------------------- 19
II.2.2. El Iceberg celiaco.------------------------------------------------------------- 21
II.3. Formas de presentación Clínica de la E. Celiaca. -------------------- 22
II.3.1. Enfermedad celiaca clásica. ----------------------------------------------- 23
II.3.2. Forma de comienzo precoz. ----------------------------------------------- 24
II.3.3. Formas No clásicas de la Enfermedad celiaca. ------------------------ 25
II.3.3.a. Enfermedad celiaca silente. --------------------------------------- 26
II.3.3.b. Enfermedad celiaca latente. --------------------------------------- 26
II.3.3.c. Enfermedad celiaca potencial. -------------------------------------- 27
II.3.3.d. Enfermedad celiaca Refractaria. Esprue refractario. ---------- 27
II.3.4. Cáncer/linfoma. --------------------------------------------------------------- 29
II.3.5. Mortalidad y Morbilidad. ------------------ ----------------------------------- 29
II.3.6. Infertilidad. ----------------------------- ---------------------------------------- 30
II.3.7. Desórdenes Autoinmunes asociadas a la EC. --------------------------- 30
II.3.8. Manifestaciones Hematológicas. ------------------------------------------ 31
II.3.9. Manifestaciones dermatológicas. ----------------------------------------- 31
II.3.9.a. Dermatitis Herpetiforme. ------------------------------------------- 31
II.3.10. Manifestaciones Endocrinas. ----------------------------------------- 32
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II.3.10.a. Diabetes mellitus insulindependiente. ------------------------------ 32
II.3.10.b. Manifestaciones tiroideas. -------------------------------------------- 33
II.3.10.c. Alteraciones en la mineralización ósea. ----------------------------- 33
II.3.11.Deficiencia selectiva de IgA. ---------------------------------------------- 34
II.3.12. Manifestaciones neurológicas.------------------------------------------- 35
II.3.12.a. Epilepsia.------------------------------------------------------------------ 35
II.3.12.b. Ataxia cerebelosa. ---------------------------------------------- 35
II.3.13. Manifestaciones reumatológicas. ---------------------------------------- 35
II.3.13.a. Artritis reumatoide. --------------------------------------------------- 35
II.3.13.b. Síndrome de Sjögren. ----------------------------------------------- 35
II.3.14. Manifestaciones digestivas.------------------------------------------------- 35
II.3.14.a. Alteraciones hepáticas. --------------------------------------------- 35
II.3.14.b. Enfermedad inflamatoria intestinal.------------------------------ 36
II.3.15.Hipoplasia del esmalte dentario.----------------------------------------- 37
II.3.16.Retraso del crecimiento. -------------------------------------------------- 37
II.3.17.Manifestaciones genéticas. ------------------------------------------------ 37
II.3.17.a.Síndrome de Down. ------------------------------------------------------ 37
II.4. Patogénesis de la Enfermedad celiaca. --------------------------------- 38
II.4.1. Factores ambienteales. ---------------------------------------------------- 40
II.4.1.1 Procesamiento de péptidos de unión a la molécula HLA DQ2.------ 43
II.4.1.2. Activación de LT CD4+ específicos de gluten de la lámina propia. 44 II.4.2. Tolerancia inmune (oral) --------------------------------------------------- 46
II.4.3. MHC Molécula de histocompatibilidad No Clásica: HLA-G.------- 47 II.4.3.1. Estructura de la molécula HLA-G y sus diferentes isoformas -- 49
II.4.3.2.Proteína HLA-G1.--------------------------------------------------------- 50
II.4.3.3.Proteínas HLA-G2.-G3 y –G4. ----------------------------------------- 51
II.4.3.4.Proteínas HLA-G5, G6 y G7. -------------------------------------------- 51
II.4.3.5.Papel de HLA-G in vivo.-------------------------------------------------- 53
II.4.3.6.HLA-G: molécula de tolerancia inmune.------------------------------ 53
II.4.3.7. Polimorfismo HLA-G. ------------------------------- -------------------- 55
II.4.4. Citokinas y Enfermedad celiaca.----------------------------------------- 55
II.4.5. Inmunogenetica: Variantes Alélicas implicadas. ---------------------- 59 II.5. Dagnóstico de la enfermedad celiaca.----------------------------------- -- 60
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II.5.1. Anticuerpos asociados con la enfermedad Celiaca.----------------- 61
II.5.2. Diagnóstico Diferencial.------------------------------------------------- 63
III. Material y Métodos. ------------------------- -------------------------- 65
III.1. Muestra. --------------------------------------------------------- 65 III.1.a. Pacientes. -------------------------------------------------------- 65 III.2. Diseño.------------------------------------------------------------ 65 II.2.1. Análisis estadístico. -------------------------------------------- 65 III.3. Método.----------------------------------------------------------- 66 III.3.1. Análisis serológicos e histológicos. ------------------------- 66 III.3.2. Análisis inmunohistoquímica. ------------------------------ 67 III.3.3. Tinciones Inmunohistoquímicas en IDO, TGF-β e Il-10 67 III.4 Técnicas inmunohisquímicas para estudio de la expresión de HLA-G, IDO,TGF-β e IL-10. ------------------------------ 68 III.5. Técnica de ELISA para estudio de isoformas de sHLA-G 72 III.6. Estadística.-------------------------------------------------------- 75 III.7. HPLC. Medición de triptófano, kinurenina y cociente k/T 75 IV. Resultados. ------------------------------------------------------- 77 IV.1. Diagnóstico. ------------------------------------------------------ 79 IV.1.1 Análisis serológicos e histológicos. --------------------------- 79 IV.1.1.a. Estudios serológicos. ------------------------------------------- 79 IV.1.1.b. Biopsia de intestino delgado. ---------------------------------- 79 IV.1.2 Expresión de HLA-G en biópsia intestinal. --------------------- 86 IV.1.3. Resultados de ELISA. ------------------------------------------ 87 IV.1.4. Estudios de polimorfismo 14-BP del Gen HLA-G.------- 90 IV.1.5. Expresión de citoquinas. ------------------- ------------------ 93 IV.1.6. Incremento de IL-17, IL-22 e IL-23. --------------------------- 95
IV.1.7. Expresión IDO en pacientes celiacos. ------------------------- 97
IV.1.8 . Concentración de triptófano y kinurenina. Cociente K/T. -- 98 V. Discusión. ------------------------------------------------------------------------- 102 V.1. Diagnóstico y prevalencia. ----------------------------------------------------- 102 V.2. Tolerancia. ------------------------------------------------------------------------ 103 V.3. Linfocitos. ------------------------------------------------------------------------- 105 V.4. Citoquinas. ------------------------------------------------------------------------ 105 V.5. HLA-G. ---------------------------------------------------------------------------- 107 V.6. Polimorfismo HLA-G. --------------------------------------------------------- 109 V.7. Expresión IDO y metabolismo del triptófano. ---------------------------- 110 V.8. Futuras direcciones. ----------------------------------------------------------- 113 VI. Conclusiones. -------------------------------------------------------------------- 115 VII. Bibliografía.-------------------------------- --------------------------------------- 117
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VIII. ANEXOS
Lista de abreviaturas:
HLA: antígenos leucocitarios humanos
IFNγ: interferón gamma
TH1: T helper 1
IL-15: interleuquina 15
IEL: linfocitos intraepiteliales
AGA Anticuerpos antigliadina
AEMA Anticuerpos antiendomisio
IMC Indice de masa corporal
EC Enfermedad celiaca
EMA Anticuerpo endomisio
sHLA-G HLA-G soluble
tTG Ac Anticuerpo antitransglutaminasa tisular
TG2 Transglutaminasa 2
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
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I. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD
CELÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA.
I.1 Antecedentes del tema:
La enfermedad celiaca (EC) puede clasificarse clínica y biológicamente como
una enfermedad autoinmune, en la que influyen componentes genéticos, ambientales e
inmunológicos [Sollid, LM. 2002 & Alaedini, A, 2005]. Se caracteriza por una
respuesta inmune anormal frente a las prolaminas del trigo y otros cereales, como
centeno y cebada, que afecta a personas genéticamente susceptibles y se manifiesta por
una lesión intestinal con atrofia vellositaria, hiperplasia de criptas e infiltrado celular
inflamatorio. [Alaedini A, 2005 & Robins, G. 2005] El elemento central de la patogenia
son las células T CD4+ de la lámina propia, que reconocen péptidos de gliadina
modificados por el enzima Transglutaminasa 2 (TG2), con restricción HLA-DQ2/DQ8,
y liberan citoquinas implicadas en la inflamación y el desarrollo de las alteraciones
histológicas, además, la inmunidad innata podría desempeñar un papel importante en la
inflamación inicial. [Robins, G. 2005]
La enfermedad celiaca es una alteración enteropática caracterizada por tener una
fuerte asociación con el complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (HLA DQ).
Así, para el diagnóstico clínico de la enfermedad celiaca es frecuente emplear los
marcadores séricos HLA tipo II DQ2, DQ8 y DR, con el inconveniente de que estas
moléculas son altamente polimórficas y varían ampliamente de un individuo a otro.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
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I.1.1 MOLECULAS COMPLEJO MAYOR HISTOCOMPATIBILIDAD
El complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) es el sistema genético más
polimórfico que se conoce, las moléculas del CMH de tipo I y II clásicas tienen un
papel fundamental en la inducción de una respuesta inmune específica mediante la
presentación de antígenos a las células T.
El complejo mayor de histocompatibilidad tipo I está compuesto de dos
antígenos diferentes: Los de tipo I clásicos, entre los que consideramos HLA-A, B y C ,
los cuales son los responsables de la identificación y de los mecanismos de defensa, y
los de tipo I no clásicos (HLA-E, F y G) que participan en la tolerancia inmune.
Dentro de estas moléculas llamadas no clásicas destacamos el papel de HLA-G por ser
una molécula de bajo grado de polimorfismo y de restringida distribución celular.
Se ha demostrado que la EC se asocia con la expresión de HLA-DQ2 y HLA-
DQ8. [Kim, CY 2004 & Louka, AS.2003] Además, la trasnglutaminasa 2 (TG2) puede
jugar un importante papel en el desarrollo de la EC, actuando como enzima de
deamidación y es el blanco autoantigénico en la respuesta inmune. [Freitag, T. 2004 &
Reif, S. 2004]
La exposición a la gliadina y prolaminas relacionadas en humanos con un
haplotipo HLA-DQ apropiado es necesaria pero no suficiente para el desarrollo de esta
enfermedad.
I.1.2. Citoquinas
En el paciente celiaco, junto a esta respuesta inmune adaptativa al contacto con
el gluten, se produce también una respuesta inmune innata al gluten en la que la
expresión local de la interleuquina 15 media la linfocitosis intraepitelial y la destrucción
de vellosidades, ambas propias de la EC. [Londei, M. 2004] La activación de los
Linfocitos T inducida por el gluten probablemente constituye un evento clave en el
desarrollo de la enfermedad. [Watson, RGP. 2004].
Verdaderamente, en pacientes celiacos la activación del sistema inmune
adaptativo probablemente pueda producirse al encontrar la gliadina en el intestino
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delgado. [Leon, F. 2005. & Forsberg, G.2002] Además de esta hipersensibilidad para la
gliadina mediada por linfocitos T, la secreción de citoquinas también contribuye a la
lesión observada en esta patología. De hecho, las citoquinas juegan un papel central en
el desarrollo de una respuesta inmune a través de su efecto regulador en las células
inmunes, tales como los linfocitos Th y monocitos.
La Interleuquina 10 (IL-10) ejerce un papel inmunomodulador fundamental en la
inflamación de la mucosa intestinal, además regula a las moléculas del complejo mayor
de histocompatibilidad, y según algunos autores parece inducir la expresión de HLA-G,
estimulando la expresión de moléculas que son requeridas por parte de las células
presentadoras de antígenos y las interacciones de estas con las células T, y
conjuntamente con el factor de crecimiento transformador-alfa aumentan la secreción
de IgA por los linfocitos T activados e inhiben la síntesis de citoquinas
proinflamatorias: factor de necrosis tumoral-beta, IL-1b e IL-6 por los monocitos.
[Forsberg, G. 2002]
I.1.3. Células Th
En el intestino de los pacientes con EC, se observa una polarización Th1, con
predominio de interferón gamma (IFN-γ), e incremento de la expresión de factor del
crecimiento transformador beta (TGFβ), aunque la activación humoral (Th2) es
detectada también en la EC. En la EC los linfocitos T reactivos al gluten reconocen
predominantemente péptidos del gluten en los que los residuos de glutamina han sido
convertidos en ácido glutámico por la desaminación mediada por la transglutaminasa
tisular TG2. [Molberg, O.1998]
La activación de los linfocitos T CD4+ probablemente representa el elemento
clave en el desarrollo de la enfermedad, de otro lado, la EC está siempre asociada con el
heterodimero HLA DQ por los alelos DQA1*0501 y DQB1*0201, aunque estos genes
no explican por entero la susceptibilidad genética de la intolerancia al gluten. [Sollid,
L.2005]
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
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I.1.4. Molécula HLA-G
El gen del antígeno de histocompatibilidad humana HLA-G es una molécula de
tolerancia inmune implicada en diversas enfermedades inflamatorias, se ha sugerido
que los antígenos HLA-G pueden desempeñar un papel protector en la inflamación.
[Carosella, ED. 2001 & Torres, MI. 2004]
En tumores, la expresión HLA G les confiere protección frente a la actividad de
las células NK y T, pudiendo impedir la eliminación de las células tumorales por parte
de las células efectoras. En trasplantes cardiacos, la presencia de HLA G reduce de
forma significativa los rechazos agudos y muestra una total ausencia de los rechazos
crónicos. Cambios en los niveles de antígenos HLA en su forma soluble se han
relacionado con enfermedades autoinmunes, así se ha encontrado expresión de HLA-G
en enfermos con psoriasis y en procesos inflamatorios, habiendo expresión en las fibras
musculares en miopatías inflamatorias. En definitiva, podemos considerar HLA-G como
una molécula implicada en la tolerancia inmune. Esta molécula se expresa de forma
selectiva en los citotrofoblastos en la interfase feto-materna, los cuales pierden la
expresión de las moléculas del complejo de histocompatibilidad tipo I clásicos como la
HLA A y B. [Le Bouteiller, P.2003 & Hunt, J. 2000]
El gen HLA-G transcribe al menos siete isoformas diferentes de HLA-G
mRNAs: cuatro isoformas de HLA-G ligadas a la membrana, llamadas HLA-G1, -G2, -
G3 y -G4, y tres proteínas solubles, llamadas HLA-G5, -G6 y -G7. [Paul, P. 2000]
La presencia de HLA-G soluble (sHLA-G) en el fluido cerebroespinal en la
esclerosis múltiple [Fainardi,E.2003] y la aceptación del aloinjerto después del
trasplante [Lila,N.2001& Marchal-Brass,2001] sugieren una función tolerogénica para
esta molécula contra la respuesta inmune innata y celular adaptativa.
La molécula HLA-G ejerce un papel protector frente a la actividad lítica llevada
a cabo por las células natural killer (NK) de la decidua uterina, protegiendo al feto de
ser rechazado por la madre, creando un estado de tolerancia, induciendo la apoptosis de
los linfocitos T CD8+ y CD4+ efectoras aloproliferativos. [Rouas-Freiss,N.1997&
Bainbridge,DR.2000]
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
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HLA-G interacciona con las células NK inhibiendo su función lítica mediante la
interacción con los receptores KIRs, incluyendo IL T2, IL T4 y P49.
I.1.5. Enzima IDO
La IDO (indolamina 2,3-dioxigenasa) es una enzima intracelular contenida en la
hemoglobina que cataliza la degradación del triptófano a través de la vía de la
kinurenina. [Taylor,MW.1991] El triptófano es el único aminoácido cuyo metabolismo
ha sido relacionado con autoinmunidad. Diversos estudios han demostrado que el
catabolismo del triptófano ocurre en sitios de inflamación tisular y la expresión IDO
puede mejorar el daño tisular en estos lugares por ser antiinflamatoria. [Mellor et all,
1999. 2003] propone que IDO podría producir en las células un papel preventivo en la
iniciación de desórdenes autoinmunes. Sin embargo, cada desorden autoinmune es
establecido por la presencia de inflamación crónica que puede provocar una producción
sostenida de IDO y el fracaso de la IDO puede limitar la disregulación inmune bajo
estas condiciones patológicas. Diversos mediadores inflamatorios, incluyendo el más
potente, interferon (IFN)-γ, induce producción IDO. El estudio de [Wolf et al 2004]
proporciona la primera evidencia de que la enzima antiinflamatoria IDO está
sobreexpresada en las biopsias alteradas de los pacientes con enfermedad inflamatoria
intestinal y también ha demostrado que las citoquinas relacionadas con los linfocitos T
helper 1 (Th1) tales como IFN-γ y el Factor de necrosis tumoral (TNF)-α son potentes
inductores de la expresión IDO.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
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I.2. OBJETIVOS
OBJETIVO PRINCIPAL : Analizar los posibles mecanismos implicados en el desarrollo de la enfermedad celiaca y de la tolerancia inmunológica 1. Realizar el diagnóstico de la enfermedad: 1.1.Analizar marcadores inmunes serológicos (anti gliadina (AGA), anti endomisio (EMA), anti transglutaminasa tisular (TGT) 1.2. Analizar marcadores genéticos. Tipaje HLA 1.3.Realizar inmunofenotipaje de los linfocitos intraepiteliales 1.4. Obtener mediante endoscpopia y realizar el análisia histológico de la biopsia intestinal. 1.5. determinar pacientes con enfermedades asociadas a la enfermedad celíaca (Síndrome de Down, diabetes, tiroidismo,etc--..) 1.6. detectar familiares en primer grado de pacientes con enfermedad celíaca.
2). Determinar la expresión de citoquinas en la enfermedad celíaca:
2.1 Determinar la expresión de IL-10.
2.2 Determinar la expresión INF-gamma
2.3 Determinar la expresión TGF-beta 2.4 Determinar la expresión Complejo Th17 (IL-17, IL-22, IL-23) 3. Determinar la expresión de antígenos de superficie de linfocitos T intraepiteliales: 3.1 Determinar CD3, CD4 y CD8 4. Determinar la expresión de moléculas implicadas en la tolerancia inmune: 4.1 molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) clase I no clásico :HLA-G 4.2 Indoleamina 2, 3-dioxygenasa (IDO) 5: Analizar el posible papel del metabolismo del triptófano y la actividad del enzima indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) en la regulación immune de la enfermedad celiaca (EC 5. Determinar si existe una asociación entre polimorfismo del gen HLA-G y la susceptibilidad para padecer enfermedad celíaca
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
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II. INTRODUCCIÓN
II.1 CONCEPTO DE ENFERMEDAD CELIACA
La enfermedad celíaca (EC) es una enteropatía sensible al gluten que se define
como una intolerancia permanente a la fracción proteica del gluten, (gliadinas,
secalinas, hordeínas y, posiblemente, aveninas) que da lugar a una lesión severa
característica de la mucosa del intestino delgado proximal en individuos genéticamente
predispuestos, que ocasiona un defecto en la utilización de nutrientes (principios
inmediatos, sales y vitaminas) en el tracto digestivo, con una repercusión clínica
variable. Actualmente la enfermedad celíaca basa su diagnóstico en el hallazgo
alteraciones específicas en la mucosa intestinal. Sin embargo, la descripción, por una
parte, de marcadores serológicos (autoanticuerpos) de elevada especificidad y
sensibilidad, y por otra de los genes del sistema HLA (HLA-DQ2/DQ8) que se
comportan como un marcador de susceptibilidad genética de la enfermedad, nos han
permitido identificar las formas no típicas de la enfermedad, así como aumentar el
diagnóstico entre los familiares de celíacos y entre pacientes con enfermedades de
reconocida asociación a la enfermedad celíaca. Hoy se considera la intolerancia
alimentaria más frecuente en nuestro medio con una prevalencia estimada del 0,5-1%.
[Sollid, LM. 2002 & Alaedini, A. 2005]
La enfermedad celiaca (EC) puede clasificarse clínica y biológicamente como
una enfermedad autoinmune, en la que influyen componentes genéticos, ambientales e
inmunológicos. [Sollid, LM. 2002 & Alaedini, A. 2005] Se caracteriza por una
respuesta inmune anormal frente a las prolaminas del trigo y otros cereales, como
centeno y cebada, que afecta a personas genéticamente susceptibles y se manifiesta por
una lesión intestinal con atrofia vellositaria, hiperplasia de criptas e infiltrado celular
inflamatorio. [Alaedini, A. 2005 & Robins, G. 2005] El elemento central de la
patogenia son las células T CD4+ de la lámina propia, que reconocen péptidos de
gliadina modificados por la enzima de la Transglutaminasa 2 (TG2), con restricción
HLA-DQ2/DQ8, y liberan citoquinas implicadas en la inflamación y el desarrollo de las
alteraciones histológicas, además, la inmunidad innata también podría desempeñar un
papel importante en la inflamación inicial. [Robins, G. 2005]
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
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La enfermedad celiaca es una alteración enteropática caracterizada por tener una
fuerte asociación con el complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (HLA DQ).
Así, para el diagnóstico clínico de la enfermedad celiaca es frecuente emplear los
marcadores séricos HLA tipo II DQ2, DQ8 y DR, con el inconveniente de que estas
moléculas son altamente polimórficas y varían ampliamente de un individuo a otro.
Hoy la definición moderna de enfermedad celiaca es: enteropatía del intestino
delgado mediada por linfocitos T inducida por el gluten en individuos genéticamente
predispuestos.
La enfermedad es desencadenada en estas personas genéticamente vulnerables
tras ingerir alimentos que contienen proteínas del trigo, centeno o cebada. En la llamada
forma clásica de la enfermedad, los síntomas aparecen en una fase temprana de la vida
tras introducir estos cereales en la dieta, suele cursar con diarrea, malnutrición,
distensión abdominal, rechazo del alimento, carácter huraño. La supresión del gluten
mejora la sintomatología y normaliza la lesión intestinal para reaparecer sí se
reintroduce éste. La intolerancia al gluten de estos sujetos se mantiene a lo largo de toda
la vida. Parece ser que la introducción temprana de estos cereales en la dieta de
personas susceptibles, son factores de riesgo para su desarrollo.
El criterio diagnóstico que permite confirmar definitivamente la existencia de
enfermedad celiaca consiste en la respuesta positiva a la provocación del gluten, que
debe acompañarse de una reproducción de la lesión intestinal, con o sin presencia de
manifestaciones clínicas o funcionales de malabsorción.
La enfermedad puede detectarse por primera vez en la edad adulta sin los
síntomas típicos de la forma clásica.
En 1969 La Sociedad Europea de Gastroenterología y Nutrición
Pediátrica (ESPGHAN) definió conceptualmente la enfermedad celiaca en una reunión
en Interlaken con los siguientes criterios. [Meewise,GW. 1970]
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
16
� La EC es una intolerancia permanente al gluten que cursa con atrofia
grave de vellosidades de intestino delgado y que asocia
habitualmente signos clínicos o funcionales de malabsorción.
� El establecimiento de un régimen estricto sin gluten lleva consigo
una normalización clínica y funcional así como la reparación de la
lesión vellositaria.
� La reintroducción del gluten en la alimentación se acompaña de una
reproducción de la lesión intestinal con o sin manifestaciones clínicas
o funcionales de malabsorción. Este criterio es fundamental para el
diagnóstico de enfermedad celiaca.
En la primera Conferencia Internacional sobre la Enfermedad Celiaca en 1970, Booth y
Dowling dieron una definición que precisaba cumplir para el diagnóstico, la presencia
de malabsorción con una biopsia de intestino delgado anormal y que tanto los síntomas,
como la biopsia patológica respondiesen a la dieta sin gluten. Era por lo tanto necesaria
la realización de tres biopsias para el diagnóstico de la enfermedad, una al inicio, otra
tras uno o dos años de dieta exenta de gluten y otra en la reintroducción, antes de los
dos años. Todos estos datos fueron reafirmados por [Visakorpi, 1974]. Posteriormente
los datos obtenidos del seguimiento de estos pacientes fueron discutidos en reuniones
anuales posteriores. Las mayores dificultades para la aplicación de los criterios parecían
residir en la realización de la provocación con gluten, que en pacientes de corta edad se
aconsejaba retrasar hasta que el niño tuviera un año de edad; y en la valoración de los
casos en que a los dos años de esta no había existido recaída.
En 1989 el comité de expertos de la ESPGHAN [Report of Working Group of
ESPGAN.1990] se reune en Budapest y revisa estos criterios y asume que en
determinadas situaciones se puede aceptar el diagnóstico de EC con unos criterios
menos exigentes, dado que la biopsia intestinal es la prueba más importante e
imprescindible para el diagnóstico, exige para el diagnóstico al menos una biopsia
intestinal, que se efectuará en el momento de efectuar el diagnóstico de sospecha y antes
de iniciar la dieta sin gluten. De efectuarse una segunda biopsia, se realizará al menos
dos años después de iniciar una dieta sin gluten permitiendo asegurar la normalización
histológica de la mucosa intestinal. Únicamente requeriría confirmación, y por tanto,
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
17
provocación con gluten cuando el diagnóstico inicial se hubiera realizado sin biopsia
intestinal o la respuesta clínica la supresión del gluten de la dieta fuera dudosa.
La ESPGAN en 1989, publicó, modificados, los criterios diagnósticos iniciales:
• Existencia de una biopsia intestinal patológica con atrofia de vellosidades,
hiperplasia de criptas y epitelio superficial anormal mientras el individuo
está recibiendo gluten.
• Remisión clínica completa tras eliminar el gluten de la dieta.
• Es necesaria una biopsia de control, para comprobar una recuperación de la
mucosa, en casos muy concretos (personas con una respuesta clínica
equívoca a la dieta y en pacientes que no tienen síntomas en el momento de
la primera consulta, primera biopsia no definitoria y sobre todo en familiares
de primer grado de los pacientes). Esta, es recomendable que se realice a los
dos años de comenzar la dieta sin gluten.
Los pacientes con serología positiva se someterán a biopsia intestinal,
recomendándose, en este estudio, la biopsia por endoscopia. En pacientes que hay una
buena respuesta clínica y serológica no es necesaria la realización de más biopsias,
mientras que si la respuesta no es satisfactoria se repetirá la biopsia a los tres o seis
meses de la dieta sin gluten, y en los casos en que la biopsia intestinal inicial fuese
dudosa. En el resto de los casos la monitorización serológica es suficiente. Si embargo,
en Europa se tiende a considerar necesarias las tres biopsias intestinales para, evitar
mantener sin gluten de por vida a individuos que no son celiacos, y para descartar
enfermedad celiaca latente en individuos genéticamente predispuestos, cuya primera
biopsia intestinal haya sido normal. En los casos que tras dos años de iniciada la
provocación con gluten la mucosa continúe siendo normal, es obligado realizar
controles anatómicos cada cuatro o cinco años o bien en el momento en que se produzca
una recaída clínica o serológica. Por lo tanto en muchos casos seguirán siendo
necesarios los criterios de la ESPGAN de 1969 para el adecuado diagnóstico de la
enfermedad.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
18
II.2. EPIDEMIOLOGÍA.
La verdadera incidencia de la enfermedad celiaca (EC) en poblaciones
susceptibles parece ser más elevada de lo que previamente se creía. Muchos casos
permanecen sin diagnosticar a menos que se realicen masivos screening serológicos. El
diagnóstico de la EC se relaciona con diversos factores (predisposición genetica, calidad
y cantidad de gluten, edad de introducción del gluten, y lactancia materna). [Polanco
I.2008]
La enfermedad celiaca es más frecuente en los sujetos de raza blanca, se creía
más frecuente en Europa que en EEUU, con un claro predominio en los 5 primeros años
de vida. La relación varón: mujer es de 1:1 en la infancia para pasar a 1:2 en la edad
adulta, quizás por la mayor facilidad diagnóstica pues la mujer en edad fértil tiene una
mayor demanda metabólica y las demandas de hierro y calcio son más llamativas.
La enfermedad celiaca es rara en africanos, chinos y japoneses [Sher KS. 1993]
Aunque tradicionalmente se ha pensado que era una enfermedad rara en la raza asiática,
se ha descrito que indios afincados en Inglaterra, tenían una incidencia 2,9 veces mayor
que los europeos de la misma área. Esto puede ser debido al cambio en sus hábitos
alimentarios, al pasar de un escaso consumo de gluten en su país, a tomar las cantidades
de gluten que se ingieren en Inglaterra, considerablemente más altas. [Hung JC.1995]
En el pasado se consideró que la prevalencia de la EC era muy variable según el
área geográfica, oscila desde 1/300 en la zona occidental de Irlanda hasta 1/10000 en
EE.UU estando la zona norte de Europa en cifras de 1/2500. [Fasano,A.2001]
Actualmente en Europa la prevalencia puede llegar al 1% de la población, se calcula
que la relación de personas sin diagnosticar frente a las diagnosticadas es de 8:1. En
EE.UU. existe una notable disparidad entre la alta frecuencia de anticuerpos positivos
entre la población donante de sangre y los pocos casos diagnosticados. Sin embargo,
con el mejor conocimiento de la enfermedad y la mayor accesibilidad a los test
serológicos, se ha producido un notable incremento en la identificación de nuevos
pacientes.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
19
Figura 1: Gastroenterology. Abril 2005. Suplemento 1.
II.2.1. Prevalencia
Los datos del estudio más completo de Estados Unidos estiman, una
prevalencia global de la enfermedad celiaca en un grupo sin factores de riesgo
conocidos de 1:133 (0.8%), comparado con 1: 22 en familiares de primer grado de un
caso índice, 1:39 en familiares de segundo grado y 1:56 en individuos con síntomas
gastrointestinales o extragastrointestinales asociados con la enfermedad celiaca [Fasano
et al 2003].
[Gudjónsdóttir et al 2004] encontró que el riesgo de enfermedad celiaca en
familias con al menos dos niños afectados de aproximadamente tres veces más alto que
Prevalencia
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
20
en familias con un único niño afectado.La enfermedad celiaca raramente es
diagnosticada en individuos del África subsahariana, aunque se ha informado de
Afrocaribeños y Afroamericanos con enfermedad celiaca [Brar et al 2006]. La tasa de
infradiagnostico en estos otros grupos minonitarios puede ser alta.
La prevalencia de enfermedad celiaca está incrementada en las siguientes
entidades [Giannotti et al 2001, Fasano et al 2003, Hoffenberg et al 2003, Treem 2004,
Troncone et al 2004, Green 2005, NIH Consensus Committee 2005]:
• Síndrome de Down (prevalencia de enfermedad celiaca: 5%-12%)
• Síndrome de Turner ~3%)
• Síndrome de Williams (3%-10%)
• Deficiencia Selectiva de IgA (~2%-10%)
• Trastornos Autoimmunes como:
o Diabetes mellitus Insulin-dependiente (~6%)
o Síndrome de Sjögren (~5%)
o Tiroiditis (~2%-4%)
La prevalencia de sprue refractario no es conocida, pero probablemente es bastante
rara.
En España existen pocos estudios epidemiológicos pero las cifras son
comparables con el resto de Europa. A medida que se van realizando estudios va
variando la epidemiología en España, así en el año 1991 se realizó un estudio en
Vizcaya en el que la prevalencia de EC obtenida en la población estudiada fue de
1:2150 sin embargo en el año 2000 el Dr. Sabino Riestra realizó otro estudio en
Asturias en el que la prevalencia fue de 1:389. En El Hospital Severo Ochoa de Madrid,
[Cilleruelo ML et al, 2002] se realizó un estudio con 3.378 niños y encuentran una
prevalencia de enfermedad celíaca silente de 1/281 con una prevalencia global calculada
de 1/220 con una relación entre enfermedad celíaca conocida y no diagnosticada de
1/3,5. Más recientemente en el año 2004 en Barakaldo (Vizcaya) el Dr. Castaño realizó
otro estudio en el que la prevalencia fue de 1:118. Este último estudio también
recomienda por los resultados que obtuvieron, que la edad optima de screening de la EC
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
21
es entre los 2 y los 3 años, edad a la que el sistema inmune ya ha madurado y se pueden
diagnosticar muchos casos cuando la EC debuta en la edad infantil.
La susceptibilidad de padecer la enfermedad probablemente tenga un carácter
multigénico pero, hasta donde hoy conocemos, está ligada a la presencia de genes que
codifican las moléculas HLA de clase II. Por otro lado la ingesta de gluten que se
encuentra en el trigo, la cebada y centeno, y dudosamente en la avena, es imprescindible
para que se desarrolle la enfermedad [Goggins M.1994] Se precisa, por lo tanto, para
que se instaure la enfermedad, una cierta predisposición genética y el consumo habitual
de gluten. Esto hace que la prevalencia de la enfermedad celiaca en el planeta esté
ligada tanto a aspectos raciales y étnicos, como a la cultura nutricional de cada zona
geográfica. [Sierra Pérez, E. 2003]
II.2.2 El iceberg celíaco
La epidemiología de la EC está eficazmente representada por el modelo del
iceberg, el que conserva la validez en diferentes poblaciones del mundo. La incidencia
de la EC se puede expresar como el tamaño total del iceberg, que no está sólo
influenciado por la frecuencia de haplotipos de predisposición en la población, sino
también por el modelo de consumo de gluten. En muchos países la incidencia de EC
está apenas en el rango de 0.5-1% de la población general. Una porción mensurable de
estos casos se diagnostica correctamente como consecuencia de molestias sugestivas
(por ej. diarrea crónica, deficiencia inexplicable de hierro) u otras razones (por ej.
historia familiar de EC). Estos casos conforman la parte visible del iceberg celíaco,
expresados en términos cuantitativos por la incidencia de la enfermedad. En los países
desarrollados, por cada caso diagnosticado de EC, hay un promedio de 5-10 casos que
no se diagnostican (la parte sumergida del iceberg); usualmente debido a molestias
atípicas, mínimas o a veces inexistentes. Estos casos sin diagnóstico no reciben
tratamiento, por consiguiente están expuestos al riesgo de complicaciones a largo plazo.
La ‘línea del agua’, es decir la relación entre los casos que se diagnostican y los que no,
depende mayormente de la tendencia del médico a solicitar marcadores serológicos de
la EC en casos de baja sospecha clínica, por ej.: dominio de polimorfismo clínico de la
EC.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
22
Figura 2: Iceberg celiaco.
II.3. Formas de Presentación clínica.
La enfermedad celiaca es una enfermedad inmune sistémica que puede asociar
tanto síntomas gastrointestinales (diarrea, pérdida del peso, dolor abdominal, anorexia,
intolerancia a la lactosa, distension abdominal, e irritabilidad) como síntomas
extraintestinales altamente variables (anemia por déficit de hierro, dermatitis
herpetiforme, fatiga crónica, dolor común/inflamación, jaquecas, depresión, déficit de
atención , epilepsia, osteoporosis/osteopenia, infertilidad y/o abortos de repetición,
déficits vitamínicos, estatura corta, fallo de medro, pubertad retrasada, defectos del
esmalte dental, y enfermedades autoinmunes). La enfermedad celiaca clásica, se
caracteriza por síntomas gastrointestinales moderados o severos, es menos común que la
enfermedad celiaca no clásica, caracterizada por la ausencia de síntomas
gastrointestinales.
El promedio de tiempo entre el inicio de los síntomas y el diagnóstico es de 11
años por el amplio rango de síntomas no específicos compartidos con otros trastornos,
alta variabilidad de edad de comienzo de los síntomas y la ausencia de síntomas en
ciertos individuos (p.ej, enfermad celiaca silente) [Green et al 2001]. Sin embargo, el
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
23
rango de tiempo entre el comienzo de los síntomas y el diagnóstico, puede ocurrir en
cualquier edad después del destete; en los adultos el pico de edad del diagnóstico puede
depender del grado de conciencia de la enfermedad y la presentación clínica del
paciente.
Las características fenotípicas de la EC pueden incluir:
Manifestaciones Gastrointestinales: Diarrea crónica o recurrente, malabsorción, dolor
y distensión abdominal, vómitos y pérdida de peso. Los pacientes a menudo se
diagnostican de síndrome de intestino irritable. (IBS) [Hill et al 2005]. Más del 50% de
individuos con enfermedad celiaca no tienen diarrea en el momento del diagnóstico.
Además muchos tienen diarrea o son obesos [Murray et al 2004].
Manifestaciones No gastrointestinales:Dermatitis herpetiforme, fatiga crónica, dolor
e inflamación articular, deficiencia de hierro, anemia, migrañas, depresión, défit de
atención, epilepsia, osteoporosis/osteopenia, infertilidad y abortos de repetición, déficits
vitamínicos, talla baja, fallo de medro, pubertad retrasada, defectos del esmalte dentario
y varias enfermedades autoinmunes secundarias (Enfermedades Autoinmunes
asociadas con la enfermedad celiaca) [Green & Jabri 2003, Hill et al 2005, NIH
Consensus Committee 2005].
II.3.1. Enfermedad celiaca clásica
Se refiere a la presencia de síntomas intestinales moderados o severos como
diarrea, fallo de medro, pérdida de peso, dolor abdominal, anorexia, intolerancia a la
lactosa, distensión abdominal e irritabilidad [Hill et al 2005]. Los niños con enfermedad
celiaca típicamente presentan síntomas entre los seis y los 24 meses de edad [Catassi
& Fabiani 1997, Fasano & Catassi 2005]
Aunque en nuestro medio sigue siendo la forma más frecuente de presentación
en el niño, no es así en todos los países. Suelen ser niños de entre 2 y 5 años que
presentan la típica diarrea, vómitos, cambios de carácter, anorexia y estacionamiento del
peso. Con el tiempo el paciente desarrolla el llamado “hábito celiaco” con aspecto triste,
indiferente, irritable y huraño, con escaso panículo adiposo y pobres masas musculares.
Piel pálida, lengua de aspecto seco y carencial, ocasionalmente aftas bucales y cabellos
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
24
ralos. El abdomen prominente y las nalgas aplanadas completan este aspecto. Puede
haber hemorragias por defecto en la absorción de vitamina K, y una fragilidad vascular
por hipovitaminosis C.
En la anamnesis de estos enfermos se objetiva que la ingestión de gluten
comenzó entre los 5 y 6 meses, y tras un intervalo libre de síntomas, progresivamente se
va conformando el cuadro anteriormente descrito, aparecen unas heces brillantes y
voluminosas, malolientes de color grisáceo.
En la adolescencia y segunda década de la vida es rara esta forma de
presentación, los síntomas son más insidiosos con anorexia, pérdida de peso o dolor
abdominal inespecífico. En algunos niños celiacos diagnosticados, cuando llega la
adolescencia se encuentran asintomáticos aunque ingieran gluten, lo que conlleva a que
hagan peor la dieta. En algunos casos diagnosticados en adultos, un 25-40% han tenido
clínica en la infancia que cedió durante la adolescencia [Polanco,I.1996] así ante un
cuadro de diarrea crónica o intermitente en la que se afecte el peso, debe hacer
sospechar el diagnóstico y constituye una indicación de biopsia intestinal. La Hipoplasia
del esmalte dentario es un dato característico de los pacientes celiacos sin tratamiento,
también se ha descrito la tríada: epilepsia, calcificaciones intracraneales occipitales
bilaterales y enfermedad celiaca, que responden a la dieta sin gluten.
II.3.2. Forma de Comienzo Precoz
Es una forma afortunadamente cada vez menos frecuente, que afecta a niños
pequeños entre 10 y 18 meses, el cuadro suele iniciarse con vómitos seguidos de una
diarrea líquida con heces espumosas que producen eritema perianal sugiriendo cuadros
producidos por una intolerancia a azúcares, una gastroenteritis aguda o intolerancia a
proteínas vacunas. Progresivamente se deteriora el estado nutricional del niño, no
responde a la terapia habitual y es preciso recurrir además de la dieta sin gluten a dietas
elementales o semielementales.
Con un interrogatorio detallado se comprueba que la ingestión de gluten se
produjo antes de los 3 meses de edad. Cuanto más precoz es la ingestión del gluten más
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
25
precoz suele ser el debut de la enfermedad y las manifestaciones clínicas pueden diferir
a las que se presentan posteriormente.
La lactancia materna también puede influir sobre el momento de aparición de los
síntomas en sujetos genéticamente predispuestos, dicho efecto protector parece ser
mayor en sujetos con fenotipos HLA-DR de alto riesgo como: 3/3, 3/7 y 5/7. [Polanco,
I. 2001]
II.3.3. Formas No clásicas. Asintomáticas.
Son formas definidas por la ausencia de manifestaciones clínicas a pesar de que
pueden presentar la atrofia severa de vellosidades característica de EC. El motivo que
ha indicado la biopsia intestinal es generalmente padecer una enfermedad de reconocida
asociación a la EC o la presencia de uno o varios marcadores inmunes de EC
detectados en un despistaje familiar o poblacional, es el caso del 10 % de los familiares
de primer grado de los pacientes celiacos, por lo que estos pacientes precisan un
seguimiento y suelen expresar los genes de susceptibilidad HLA-DQ2. [Trancone,
R.1996]
Se refiere a la enfermedad celiaca sín síntomas gastrointestinales sin embargo,
los individuos con enfermedad celiaca atípica pueden tener síntomas gastrointestinales
tales como reflujo, distensión, vómitos, estreñimiento y dispepsia siendo a menudo
maletiquetados como síndrome de intestino irritable: [IBS]. Aproximadamente el 70%
de pacientes son diagnosticados basándose en las manifestaciones extraintestinales
asociadas con enfermedad celiaca [Telega et al 2008].
La anemia por déficit de hierro es la forma de presentación más frecuente de la
de la enfermedad celiaca no clásica y puede ser el único hallazgo. La dermatitis
herpetiforme es un rash intensamente pruriginoso que afecta a las superficies de
extensión de las extremidades y es una manifestación no gastrointestinal frecuente.
Otras presentaciones extraintestinales incluyen osteoporosis/osteopenia,
hipoplasia del esmalte, infertilidad y/o abortos de repetición, déficits vitamínicos,
elevación de transaminasas, fatiga, síndromes psiquiátricos y varios trastornos
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
26
neurológicos que incluyen neuropatía periférica, ataxia, convulsiones, migrañas, déficits
de atención e hiperactividad (ADHD) y retrasos de escolarización.[Zelnik et al 2004,
Hill et al 2005, NIH Consensus Committee 2005, Niederhofer & Pittschieler 2006].
Usualmente la Enfermedad celiaca No Clásica se presenta en la infancia tardía o edad
adulta. Los niños con EC no clasica pueden presentarse como talla baja inexplicada,
síntomas neurológicos y pubertad retrasada.
La Forma No clásica de la EC es más común que la Forma Clásica de EC.
II.3.3.a Enfermedad Celiaca Silente.
Es definida como la ausencia de síntomas en presencia de anticuerpos positivos
para EC y atrofia vellositaria del intestino delgado en la biopsia. Los Individuos con EC
silente son a menudo identificados a través de un familiar afecto a través de programas
de screening [Hed et al 1986, Fasano & Catassi 2001].
II.3.3.b. Enfermedad celiaca Latente
Son formas de EC en las que el cuadro clínico es poco manifiesto y las
manifestaciones digestivas están ausentes o ocupan un segundo plano El estreñimiento,
asociado o no a dolor abdominal de tipo cólico, la distensión abdominal o la aparición
brusca de edemas, generalmente coincidiendo con alguna causa precipitante (infecciosa,
quirúrgica, etc) pueden constituir formas clínicas de presentación en niños mayores. El
retraso en la talla en la infancia o la aparición más tardía de la pubertad en la
adolescencia, pueden también ser datos evocadores para el pediatra. Otra forma aislada
de presentación, consiste en la aparición de una anemia ferropénica, debida a una
malabsorción de hierro y folatos en yeyuno.
En el celiaco adulto, la infertilidad, tanto en el hombre como en la mujer, los
abortos de repetición o la depresión psíquica, así como la osteoporosis, fracturas o
neuropatías, pueden constituir signos o síntomas aislados de la enfermedad [Polanco,
I.2001]
Se ha descrito enfermedad celiaca latente en pacientes con dermatitis
herpetiforme, en los cuales se desarrolló la enfermedad cuando tomaron un suplemento
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
27
de gluten en la dieta. [O´Mahoney S, 1990] comprueban que en los pacientes con
dermatitis herpetiforme tomando dieta con gluten, existe un aumento de la
permeabilidad intestinal, los anticuerpos en suero están en cifras normales, pero en el
aspirado yeyunal existe una elevación de anticuerpos antigliadina IgA e Ig M ,
indicando el inicio de actividad inmunológica local.
Así las Formas latentes de EC se definen por una biopsia de intestino delgado normal
en:
• Un individuo que habitualmente ingiere gluten, pero que previamente tuvo una
biopsia de intestino delgado compatible con enfermedad celiaca
• Un individuo con EMA positivos
II.3.3.c. Enfermedad celiaca Potencial
Se aplica a pacientes que en ningún momento han presentado atrofia vellositaria
característica, en los que sin embargo se detectan anormalidades, principalmente
inmunológicas, propias de los pacientes celiacos [Ferguson A, 1993] como son:
Un marcador (EMA) positivo, signos de activación de inmunidad celular,
aumento de Linfocitos Intraepiteliales en las vellosidades y especialmente de la
población que expresa TCR γδ o un patrón de Ac antigliadina a nivel de la mucosa de
intestino delgado característico de EC. Para el diagnóstico de estos enfermos también
será de ayuda la presencia de HLA-DQ2.
II.3.3.d. Enfermedad Celiaca Refractaria/Esprue celiaco.
El Esprue Refractario o ECR se refiere a la persistencia de los síntomas de
malabsorción franca con inflamación intestinal persistente y atrofia vellositaria y
niveles de anticuerpos elevados a pesar de una dieta estricta sin gluten en los últimos
seis a doce meses. Los individuos con esprue refractario tienen sobre los 20 años de
edad. Raro en adultos. Existen pocos estudios de personas con esprue refractario bien
caracterizados en la literatura.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
28
El pronóstico es incierto, aunque algunas personas responden a corticosteroides o
agentes inmunosupresores:
• Esprue refractario primario : Describe la condición en la cual
los individuos no han tenido nunca respuesta a la dieta sin gluten.
En este gupo son importantes las Pruebas de genética Molecular
porque los individuos carecen de respuesta a la dieta sin gluten,
lo cual es uno de los criterios diagnósticos mayores.
• Esprue refractario secundario Se refiere a la condición por la
cual los individuos tienen una completa recuperación seguida de
una posterior recaída a pesar de una buena adherencia a la dieta
libre de gluten.
Una clasificación alternativa implica la determinación de los Linfocitos intraepiteliales
(IELs) en personas con ECR:
- En la Enfermedad celiaca activa no complicada, los IELs tienen expresión en
superficie de CD3 y CD8. Además, estos linfocitos no tienen restricción clonal.
- En ECR primario: los IELs son normales.
- En ECR secundario: Los IELs son anormales siguiendo varios caminos:
* Aquellos que pierden de su superficie la expresión CD3, CD8, y el TCR.
* CD3 es detectable dentro de las células.
* Generalmente de hacen clonales.
Se trata de un síndrome considerado recientemente un primer paso en la transformación
maligna de los IELs. Se caracteriza por la infiltración masiva de los IELs, (infiltración
monoclonal anormal de linfocitos T con expresión CD3c citoplasmática, sin expresión
en superficie de CD3 y CD8 y con alteración del gen receptor de los linfocitos T)
fenotipo muy similar al del Linfoma intestinal de células T asociado a enteropatía
(EITL). El 40% de pacientes con ECR presentarán un linfoma de alto grado, a nivel del
intestino delgado o en otra localización.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
29
El esprue refractario ha sido tratado exitosamente con inmunosupresores ciclosporina) e
inmunomoduladores (Infliximab). [Chaudhary R et all 2005].
EL ECR secundario tiene un peor pronóstico que los ECR promariosos con una alta
mortalidad resultado de la pobre respuesta a la inmunosupresion y alta tasa de
progresión hacia la enteropatía asociada a Linfoma T (EATL). El alto riesgo para EATL
en personas con esprue refractario puede exceder del 50% [Green & Jabri 2003, Krauss
& Schuppan 2006].
II.3.4. Cáncer/linfoma.
En pacientes con EC el riesgo de adenocarcinoma de intestino delgado es
superior al de la población general, el predominio de linfoma asociado a EC es la
enteropatía asociada a linfoma de células T, el cual no responde a quimioterapia y es
rápidamente fatal. También son más frecuentes los carcinomas escamosos de esófago y
orofaringeo y linfoma no Hodgkin. La dieta sin gluten ha demostrado efecto protector
contra el desarrollo de enfermedades malignas, aunque esto puede no ser el caso para el
desarrollo del linfoma no Hodgkin. La estimulación crónica del gluten a los linfocitos
puede producir en éstos inestabilidad cromosómica, con el riesgo de transformación
maligna.
II.3.5. Mortalidad y morbilidad.
El espectro clínico de la enfermedad celiaca es amplio, desde una ausencia de
síntomas hasta síndromes con malabsorción severa. La enfermedad celiaca no tratada
pueden incluir déficits de vitaminas y minerales, anemia, osteoporosis, infertilidad y
trastornos neuropsiquiátricos, desórdenes autoinmunes secundarios y algunos tumores
maliganos incluidos linfomas no-Hodgkin, adenocarcinoma de intestino delgado y
carcinoma escamoso de esófago y orofaringe.
El conjunto de personas con EC no tratada o que no responden a la dieta sin gluten
tienen un incremento de mortalidad más precoz comparada con la población general,
principalmente por la mayor tasa de tumores malignos. El riesgo es mayor en el año
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
30
después del diagnóstico inicial, probablemente por el periodo prolongado de síntomas
no reconocidos como asociados a la enfermedad celiaca. La tasa de Malignidad y
mortalidad es alta en individuos con esprue refractario [Corrao et al 2001].
II.3.6. Infertilidad.
La Enfermedad Celiaca se ha asociado con infertilidad, abortos de repetición, retraso en
la menarquia, menopausia precoz, amenorrea. La EC no tratada se estima que es
responsable de aproximadamente el 3%-6% de todos los casos de infertilidad de causa
desconocida y neonatos de bajo peso y con crecimiento intrauterino retardado (CIR).
Un tratamiento adecuado con dieta sin gluten parece eliminar el riesgo de infertilidad y
resultados adversos en el embarazo [Meloni et al 1999, Wong et al 20003, Bradley &
Ludvigsson et al 2005].
II.3.7. Desórdenes Autoinmunes asociados con la enfermedad celiaca.
Los desórdenes Autoinmunes son tres veces más frecuentes en los individuos con
enfermedad celiaca que en la población general. Estos incluyen la diabetes mellitus tipo
1, tiroiditis, Síndrome de Sjögren, enfermedad de Addison, enfermedad hepática
autoimmune y desórdenes neurológicos tales como neuropatía periférica.
Aunque hay estudios que sugieren que una dieta libre de gluten no previene el
desarrollo de enfermedades autoimmunes [Sategna Guidetti et al 2001a], el inicio de
una dieta libre de gluten puede conferir un beneficio para los individuos con
enfermedad celiaca con varias enfermedades autoinmunes:
� Los autoanticuerpos específicos para la diabetes y tiroiditis tienden a
desaparecer en el curso del tratamiento con la dieta exenta de gluten [Ventura et
al 1999].
� Un estudio ha reconocido un mejor crecimiento lineal y control glucémico en el
cumplimiento de la dieta de niños con diabetes mellitus tipo 1 [Sanchez-
Albisua et al 2005], aunque [Nóvoa Medina et al 2008] recientemente se ha
informado que una dieta sin gluten no tuvo impacto en el control metabólico de
la diabetes.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
31
� Una dieta sin gluten puede normalizar la función tiroidea en individuos con
enfermedad tiroidea [Sategna-Guidetti et al 2001b].
II.3.8. Manifestaciones Hematológicas
Las alteraciones hematológicas y bioquímicas no tienen relación con el grado de
intensidad de la atrofia vellositaria que tiene el paciente. El estado nutricional de estos
pacientes, sí varia según la severidad y duración de la malformación asociada
[Kemppainen TA, 1998]. La enfermedad celiaca se asocia frecuentemente a anemia
ferropénica (22%), trombocitosis, neutropenia, hipoalbuminemia, déficit de folatos
(35%), de vitamina B12 (11%) de factores de coagulación (II,VII,X) (32%), calcio
(43%), magnesio (13%) y zinc (31%) [Corazza, GR. 1995]
La anemia ferropénica es un hallazgo frecuente entre los celiacos, secundaria a
la malabsorción de hierro a nivel del duodeno proximal. En un estudio realizado por
Corazza, hasta un 5% de los pacientes con anemia ferropénica presentan celiaquía, y
Lazzari encuentran hasta un 6.2% entre 103 pacientes afectos de anemia de causa
desconocida y refractaria a tratamiento. Por lo tanto, estaría indicado en estos pacientes
el despistaje de la enfermedad celiaca mediante anticuerpos antigliadina o
antiendomisio. Esta anemia se corrige mediante dieta sin gluten. [Lazzari, R. 1995]
II.3.9. Manifestaciones Dermatológicas.
II.3.9.a. Dermatitis Herpetiforme (DH):
Es un marcador independiente de EC. Se trata de la misma enfermedad con
distintos órganos de expresión. La transglutaminasa tisular u epidérmica parece ser el
autoantígeno en el intestino y piel respectivamente. En general la afectación vellositaria
es menor en pacientes con DH y puede ser necesaria una segunda biopsia duodenal
para el diagnóstico de EC. Se presenta más frecuentemente entre los 15 y 40 años y
afecta hasta un 25% de los pacientes con EC. Se presenta clínicamente como una
erupción vesículo-ampollosa, pruriginosa, dolorosa, simétrica y con localización en
codos y superficies de extensión y cuero cabelludo. Cursa de forma crónica en brotes.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
32
La DH se caracteriza anatomopatológicamente por un depósito de gránulos de
IgA en la dermis papilar y en la unión dermoepidérmica. La dieta sin gluten es eficaz en
el tratamiento de la DH. Aproximadamente hasta un 15-30% de pacientes con psoriasis
presentan datos serológicos de EC y de ellos la mitad tienen una enteropatía de diversa
intensidad. La dieta sin gluten es capaz de mejorar las manifestaciones cutaneas de la
nenfermedad en pacientes que presentan lesiones intestinales leves, incluso ausentes.
En cuanto al vitíligo y alopecia areata, existe una asociación débil, aunque puede
ser interesante para la búsqueda de EC subclínica en estos pacientes.
II.3.10. Manifestaciones Endocrinas.
II.3.10.a. Diabetes mellitus tipo I (DMID 1)
La DM1 es una de las enfermedades crónicas más frecuentes en la infancia, en
ella intervienen factores inmunes, genéticos y medioambientales. Se caracteriza por la
destrucción de las células beta pancreáticas, y como consecuencia, por un déficit
absoluto de insulina. En el niño la etiología autoinmunitaria es la más frecuente y hasta
en un 90% de los casos se encuentran marcadores humorales de proceso autoinmune. La
DM1 se asocia con frecuencia a otras enfermedades autoinmunes. Así, se ha observado
una mayor prevalencia de anticuerpos antitiroideos, relacionados con la enfermedad
celiaca, y otros muchos autoanticuerpos contra órganos endocrinos y no endocrinos [Liu
E, 2002]. La enfermedad autoinmune que más se asocia a la DM1 es la enfermedad
tiroidea autoinmune. La EC es otra enfermedad que debe tenerse en cuenta en niños con
DM1; las tasas de prevalencia se encuentran entre el 1-10% frente al 0,01-0,03% de la
población general. [Lopez Medina, JA. 2004]
Casi siempre aparece antes la diabetes que la celiaquía. Tras la instauración de
una dieta sin gluten se asiste a un mejor control metabólico de la hiperglucemia. La
monitorización de los anticuerpos antitransglutaminasa en diabéticos, es un buen
método de detección de una EC asociada.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
33
II.3.10.b. Enfermedades tiroideas
La patología tiroidea se presenta muy frecuentemente asociada a la EC, con una
prevalencia variable (4-14%), fundamentalmente del tipo hipotiroidismo. Globalmente
la EC aparece asociada en un 3% de pacientes con hipertiroidismo y en un 5% de
pacientes con tiroiditis de Hashimoto. La dieta sin gluten origina una disminución de los
anticuerpos antitiroideos y mejora el control de la disfunción tiroidea [Rodrigo Sáez,
L.2005].
II.3.10.c. Alteraciones en la mineralización ósea
Es recomendable realizar una densitometría ósea al diagnóstico de la EC, ya que
suele existir una reducción de la densidad ósea tanto en adultos como en niños, que
suele ser más severa en la forma sintomática de la enfermedad y que está relacionada
con el riesgo de fracturas. El mecanismo subyacente de esta osteoporosis es
multifactorial incluyendo malabsorción de calcio y vitamina D, hiperparatiroidismo
secundario, deficiencia de magnesio, citoquinas inflamatorias circulantes e
hipogonadismo en el varón.
La disminución en los niveles de calcio se explica también por el atrapamiento
de iones Ca+2 en el intestino por las heces grasas y ácidas. La actividad de la hormona
paratiroidea hace que los niveles sanguíneos de calcio se encuentren dentro de los
límites de la normalidad. En los pacientes infantiles se ha visto que el tratamiento con la
dieta sin gluten durante un año, iguala la densidad ósea mineral con los niños sin esta
patología. [Vestergaard, P. 2003]
En cuanto a los niveles de calcio, fósforo y vitamina D, se detectó hipocalcemia
en 17% de los pacientes recién diagnosticados. Los niveles de calcio eran
significativamente más bajos en los pacientes no tratados, los niveles de fosfatos
estaban elevados en un 50% de los casos tanto en los pacientes tratados como en los no
tratados. Los niveles de 25-OH-D3 estaban más bajos en los pacientes no tratados, sin
embargo las diferencias no fueron estadísticamente significativas para los valores de
fosfatos, vitamina D y fosfatasa alcalina entre los pacientes con o sin dieta [Kavak, US.
2003]. Los niveles de paratohormona estaban elevados tanto en los pacientes con dieta,
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
34
como en los pacientes recién diagnosticados y las diferencias eran estadísticamente
significativas para los pacientes recién diagnosticados. Parece que está bien
documentado, que hay un balance negativo de calcio en los pacientes celiacos
producido por una disminución en la absorción del calcio y la vitamina D. La falta de
hipocalcemia en pacientes no tratados, se explicaría por una elevación de la
paratohormona que provoca un incremento en la reabsorción ósea. Sin embargo aunque
la densidad ósea mineral en los pacientes con dieta sin gluten se encuentra dentro de los
límites de la normalidad e incluso superiores, algunos estudios [Szathmári, M, 2001]
obtienen que los niveles de paratohormona se encuentran elevados. Sin embargo en los
pacientes adultos, aunque la dieta sin gluten mejora la densidad ósea mineral, no se
alcanzan los niveles de normalidad.
Tabla 1: Enfermedades Autoinmunes dependientes del gluten.
II.3.11. Deficiencia selectiva de IgA
La prevalencia de EC en este grupo, es de alrededor de un 8%. Para realizar este
diagnóstico en estos pacientes deben realizarse marcadores serológicos de tipo IgG y
cuantificar los niveles séricos de esta inmunoglobulina, así como descartar la presencia
de parasitosis asociada (tipo Giardia lamblia)
ENFERMEDAD GLUTEN DEPENDIENTE GLUTEN INDEPENDIENTE
DMIDI +
TIROIDISTIS AUTOINMUNE +
HEPATITIS AUTOINMUNE +
SÍNDROME DE SJOGREN +
E. DE ADDISON +
GASRITIS ATRÓFICA +
SÍNDROME DE DOWN +
SÍNDROME DE TURNER +
SÍNDROME DE WILIIAMS +
CARDIOPATÍAS CONGÉNITAS +
DÉFICIT DE IgA +
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
35
II.3.12. Manifestaciones Neurológicas:
II.3.12.a. Epilepsia
Responde mal al tratamiento farmacológico y bien a la dieta sin gluten si el
diagnóstico es precoz. Al igual que otros procesos, se relaciona la aparición de la
epilepsia con el tiempo de exposición al gluten. Existen algunos datos que hablan a
favor de la presencia de tipo vasculitis cerebral como sustrato morfológico de dicho
proceso.[Rodrigo Sáez, L. 2005]
II.3.12.b. Ataxia cerebelosa
Es el proceso neurológico más freceunetemente asociado a la EC. Generalmente
es de comienzo tardío y muchos pacientes además del temblor y alteraciones del
equilibrio, presentan una neuropatía periférica asociada. Frecuentemente se asocian
anticuerpos circulantes frente a las células de Purkinje del cerebelo. La respuesta a la
dieta sin gluten es buena cuando se instaura dentro de los 6 primeros meses.
II.3.13. Manifestaciones Reumatológicas:
II.3.13.a. Artritis Reumatoide (AR)
La prevalencia de EC entre pacientes con AR juvenil, es del orden del 1,5-2,5%.
Se han observado niveles elevados de AGA en pacientes con AR, tanto juvenil como
del adulto. Una explicación pudiera ser el aumento de la permeabilidad intestinal
inducido por la toma de AINE, si bien tampoco pudiera descartarse un mecanismo
inmunológico [Rodrigo Sáez, L. 2005].
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
36
II.3.13.b. Síndrome de Sjögren (SS)
Es el proceso con manifestaciones articulares que con mayor frecuencia se
asocia con la EC, pues hasta un 15% de pacientes presentan ambos procesos de forma
simultánea. Incluso en pacientes con SS sin EC asociada, se objetiva un estado de
activación inmunológica, a nivel de la mucosa intetinal.
II.3.14. Alteraciones Digestivas:
II.3.14.a. Alteraciones Hepáticas
Se ha descrito esteatosis hepática en adultos jóvenes, cursa con aumento de
aminotransferasas y se normalizan al retirar el gluten de la dieta, también se ha descrito
la asociación a hepatitis autoinmune y a cirrosis biliar primaria.
La prevalencia de EC en pacientes con transaminasas elevadas es del 10%. La
mayoría de ellos presentan una hepatitis reactiva en la biopsia, de mediana intensidad,
La instauración de una dieta sin gluten se sigue de una disminución de los niveles
séricos de AST y ALT, de forma lenta y paulatina.
La prevalencia de EC en pacientes con cirrosis biliar primaria (CBP) es del
orden del 6%. A las mujeres de mediana edad con EC que presenten un patrón de
colestasis disociada se les debe realizar un despistaje de CBP mediante la determinación
de los AMA y viceversa con anti-TGt para descartar una EC concomitante.
En pacientes con hepatitis autoinmune (HAI) la prevalencia de EC es del 5%. La
asociación de ambos procesos parece estar en relación con la presencia del haplotipo
HLA B8/DR3/DQ2, común para ambas enfermedades.
II.3.14.b. Enfermedad inflamatoria intestinal (EII)
Los pacientes con EC presentan cinco veces más riesgo de EII que la población
general. Es frecuente establecer un diagnóstico diferencial entre ambas entidades ya que
pueden presentar características clínicas y analíticas similares. Una complicación poco
frecuente de la EC es la aparición de yeyunoileitis ulcerativa, que puede evolucionar a
perforación intestinal o estenosis cicatricial.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
37
II.3.15. Hipoplasia del esmalte dentario
Los defectos en el esmalte dentario son frecuentes en pacientes con EC, que se
caracterizan por ser bilaterales, simétricos y cronológicamente distribuidos en los cuatro
sectores de la dentición. La causa de este proceso no parece estar relacionado con la
presencia de defectos nutricionales, sino más bien con trastornos inmunológicos
asociados anticuerpos antiesmalte.
II.3.16. Retraso en el crecimiento
Entre un 5 y 20% de los niños con talla baja de causa desconocida han sido
diagnosticados de enfermedad celiaca al hacerles una biopsia intestinal. En estos niños
las cifras de hormona de crecimiento son normales. Presentan una velocidad de
crecimiento disminuida y la edad ósea está retrasada. En un estudio [Mora S ,1993], se
describió que la edad ósea estaba retrasada en 2,05±1,29 años. En niños no tratados, se
ha visto que la actividad de la somatomedina es baja, y retorna a la normalidad tras la
dieta sin gluten. Tras la supresión del gluten se observa un aumento de la velocidad de
crecimiento y de la ganancia ponderal en estos niños. La talla baja, sería una indicación
para la realización de biopsia intestinal particularmente si la edad ósea está retrasada
más de cuatro años y/o existen anormalidades hematológicas asociadas. [Groll, A.
1980]
II.3.17. Manifestaciones Genéticas: II.3.17.a Síndrome de Down.
La prevalencia de EC entre personas con trisomía 21 es del 6%. La patogenia de
ambos procesos es desconocida, aunque en ambos procesos existe una mayor riesgo de
presentar enfermedades autoinmunes, y en ambas, existe una clara base genética. En un
estudio multicéntrico en Italia con 1202 pacientes con Síndrome de Down se
encontraron 55 casos de EC, con un prevalencia de esta asociación del 4,6%. Otros
estudios europeos informan de una prevalencia del 6,6% en España, un 8% en Holanda
y un 3,9% en Suecia, situación no diferente de Estados Unidos que informan de
prevalencias entre el 3,2-10,3%. [Martin F, Kagnooff, 2005]
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
38
II.4. PATOGÉNESIS DE LA ENFERMEDAD CELIACA
La enfermedad celiaca está causada por una respuesta autoinmune en individuos
genéticamente predispuestos que conduce a la inflamación del intestino delgado, atrofia
vellositaria y malabsorción. La etiología de muchas manifestaciones extraintestinales no
está completamente aclarada.
Se han propuesto diversas teorías que implican factores ambientales,
inmunológicos y genéticos para explicar la patogenia de la enfermedad. Existiría una
alteración primaria en la respuesta inmune intestinal a las proteínas del gluten o sus
productos, alterando la inmunidad celular con una amplia repercusión sistémica y a la
vez una importante asociación con los genes HLA clase II y con otros factores genéticos
y/o ambientales aún no bien conocidos. La EC esta fuertemente asociada con los genes
de HLA clase II situados en el locus DQ. Se ha demostrado que la EC esta asociada con
la expresión de HLA-DQ2 y HLA-DQ8. [Kim CY, 2004]
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
39
La EC es un desorden multifactorial resultado de la interacción de variantes
específicas descritas en genes HLA, variantes menos reconocidas en genes No-HLA,
gliadina (un subcomponente del gluten), y otros factores ambientales.
Los genes HLA-DQA1 y HLA-DQB1 son variantes conocidas que se han
asociado con la susceptibidad para la enfermedad y son causa necesaria pero no
suficiente para padecer la enfermedad.
Un defecto en el procesamiento de los antígenos por las células epiteliales, junto
con las propiedades intrínsecas de las gliadina y del haplotipo HLA-DQ de los
individuos son considerados los principales factores implicados en la patogénesis de la
EC.[Robins G, 2005]
La presentación de péptidos de la gliadina a las células T constituye un evento
crucial en la patogénesis de la EC. Estos péptidos del gluten no son completamente
digeridos por la acción de los enzimas gástricos, intestinales y pancreáticos en los
enfermos celiacos. Un 33-meropeptido fue aislado e identificado como el iniciador
primario de la respuesta inflamatoria frente al gluten en enfermos celiacos. [Shan,
L.2002] Este péptido reacciona con la transglutaminasa tisular (tTG), el principal
autoantigeno en la EC que desamina ciertos residuos de la glutamina del gluten hasta
ácido glutámico. Este cambio de carga favorece la unión y presentación por las
moléculas HLA-DQ2 y DQ8, activando a las células T y subsiguiente producción de
citoquinas que conducen al daño tisular. [Molberg, O. 1998]
Figura 3. Factores predisponentes para el desarroll o de la EC
Enfermedad Celiaca
Dieta: Gliadina
Marcadores Genéticos: HLA DQ y otros
Inmunomodulación Tolerancia
Autoinmunidad
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
40
II.4.1. Factores ambientales
El principal factor ambiental implicado en la patogenia de la EC es el gluten,
pero también podrían intervenir otros factores desencadenantes y factores protectores
aún por identificar, lo que explicaría las discordancias entre gemelos monocigóticos o
hermanos con HLA similar. Pero es la exposición a alimentos que contienen cereales de
trigo, centeno, cebada, y probablemente avena el principal factor exógeno implicado. En
la década pasada se puso de manifiesto que el gluten, el enzima transglutaminasa tisular
y ciertos HLA están conectados en la patogénesis de la EC.
Dicke comprobó que los pacientes celiacos tenían una sensibilidad especial a
determinadas harinas, especialmente al trigo, demostró que la toxicidad del trigo es
producida por una fracción proteica: gluten (mezcla de proteínas en forma de gránulos
presentes en el trigo y otros cereales que queda como residuo insoluble en agua después
de la extracción del almidón) es una proteína compleja que contiene cuatro clases de
proteínas: gliadinas (fracción de endosperma parcialmente soluble en etanol),
gluteninas, albúminas y globulinas.
La enfermedad se caracteriza por una intolerancia a proteínas tales como
gliadinas (trigo), secalinas (centeno), hordeínas (cebada) y quizás aveninas (avena),
siendo éste el orden descendente de potenciación de la enfermedad. Todavía existe
cierta controversia sobre la toxicidad de la avena, un estudio Finlandés no encontró
evidencias sobre su toxicidad en pacientes con EC que fueron expuestos a cantidades
significativas de avena durante seis meses. [Janatuinen EK, 2002]
Las gliadinas son cadenas polipeptídicas con un peso molecular entre 30.000 y
75.000 con elevado contenido de glutamina y prolamina. La concentración de prolamina
y glutamina puede ser importante en la producción de patología, pues la ingestión de
glutamina pura no produce lesión alguna, se trataría pués de una intolerancia
permanente a las prolaminas de estos cereales en individuos genéticamente
predispuestos, y es el resultado de la interacción desfavorable entre genes de
predisposición y factores ambientales.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
41
En la electroforesis de las gliadinas se identifican más de 40 componentes,
siendo los cuatro de mayor proporción los relacionados con la enfermedad celiaca: La
alfagliadina, (que es la fracción mayor en ciertas variedades de trigo y de más
importancia en la enfermedad celiaca) betagliadina, gammagliadina y las
omegagliadinas, estas tres últimas menos tóxicas.
La toxicidad de la gliadina se atribuye a una secuencia de aminoácidos de la
alfagliadina (residuos de 206-217 aminoácidos). Hay evidencias que apoyan la
presencia de epitopos inmunogénicos de la parte N-terminal de la molécula, estudios in
vivo confirman este dato observando cambios histológicos significativos en la mucosa
intestinal tras la administración de secuencias peptídicas de alfagliadina, produciendo
cambios en la mucosa.
Existen publicaciones que identifican un grupo de péptidos que son reconocidos
por las células T, obtenidos a partir de muestras de pacientes menores de 12 años,
encontrando respuesta de células T frente a nuevos epítopos de gliadinas y de
gluteninas. [Vader, W.2002] Demuestran que la mayoría de niños tienen células
reactivas contra péptidos de gluteninas, mientras la mitad reconoce los epítopos
inmunodominantes en adultos
Figura 4. El alto contenido de glutamina y prolina en las gliadinas y gluteninas del trigo es mayor que el de hordeinas y secalinas, jugando un importante pepel en la patogénesis de la enfermedad. (Tomado de Gastroenterology.Volumen 124. nº:4.suplem.1. 2005)
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
42
Algunos de los péptidos no necesitan desaminación para ser reconocidos, lo que
implicaría que la respuesta podría iniciarse hacia péptidos nativos del gluten y se iría
restringiendo con el tiempo hacia una especificidad dirigida frente a péptidos
desaminados. En base a algoritmos matemáticos [Koning y col, 2005] sugieren que
podrían existir por lo menos 50 péptidos en el gluten (trigo) y hordeínas (cebada).
Recientemente se ha identificado un mayor número de péptidos de α y γ gliadinas que
asociados a DQ2 son capaces de activar linfocitos T de mucosa [Arentz-Hansen,
H.2000].
Estos nuevos péptidos se encuentran agrupados en regiones ricas en prolina.
¿Por qué la giadina y no las aveninas? Porque el porcentaje de residuos de prolina
presentes en las aveninas es menor que en las gliadinas. La especificidad de la tTG
estaría determinada por la proporción de prolinas y glutaminas.
La alta cantidad de prolina de estas proteínas las hace relativamente resistentes a
la digestión proteolítica gástrica, pancreática, y de los enzimas del borde en cepillo del
intestino humano. Resultando péptidos largos y con alto contenido en prolina y
glutamina en el intestino delgado. Aunque esto solo no se ha visto como suficiente
causa de la enfermedad ni se conocen las diferencias entre la digestión proteica entre
individuos sanos y aquellos susceptibles de desarrollar la enfermedad. Sin embargo, es
concebible que el fallo en la degradación de estas proteínas puede ser exagerado en el
intestino delgado de individuos con enfermedad celiaca activa que tienen un daño
marcado en el borde en cepillo del epitelio y que estos se acompañarían de disfunción
pancreática.
En el año 2002, Lu Shan y col identificaron un epitopo peptídico de 33
aminoácidos, procedente de la degradación de la α-gliadina que resultó de particular
interés, como posible inductor de la respuesta inflamatoria al ser resistente a la digestión
por las proteasas pancreáticas, gástricas e intestinales.
Este producto de 33 aminoácidos: 33 meropéptido:
LQLQPFPQPQLPYPQPQLYPPQPOLPYPQPQPF, residuos 57 al 89. [Shan L, 2002]
Estos péptidos denominados como inmunodominantes están incluidos en este segmento
de 33 aa. Este péptido está presente en los cereales tóxicos para los enfermos celiacos
(trigo, cebada, centeno) y ausente en los cereales no tóxicos como avena, maíz y el
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
43
arroz. Este péptido se une con alta afinidad a DQ2 y no requiere de procesamiento para
ser presentado por la APC. [Qiao, SW.2004] Sin embargo existen por lo menos 15
péptidos de gluten reconocidos por las células T, muchos de los cuales no están
presentes en este fragmento de 33 aa.
De acuerdo con la teoría inmunológica, el elemento central de la patogenia de la
enfermedad celíaca es la pérdida de la tolerancia al gluten de la dieta, con activación
de linfocitos T reactivos al gluten de la lámina propia de la mucosa. Estos
acontecimientos pueden agruparse en la siguiente secuencia:
II.4.1.1 Procesamiento y selección de péptidos de unión a la molécula HLA
DQ2.
La respuesta inmune frente al gluten está controlada por las células T del
intestino que presentan restricción por moléculas DQ2 o DQ8 en el reconocimiento de
antígeno: Los heterodimeros DQ unen predominantemente péptidos de gluten
modificados por el enzima Transglutaminasa tisular (tTG) mediante desaminación,
sustitución de glutamina cargado positivamente, situado en la posición 6 del péptido
PQQPQQSFPQQRP de la gliadina, por ácido glutámico cargado negativamente, que
son presentados a los linfocitos T específicos de gluten junto a moléculas DQ2 o DQ8
en la membrana de células presentadoras de antígeno.[Sollid,LM,2002] La tTG,
además de tener una función esencial en el procesamiento del gluten en el intestino, es
también el principal autoantígeno de los anticuerpos específicos para esta enfermedad.
[Dieterich, W.1997]
Otros genes fuera de la región HLA podrían tener un papel distinto en grupos
diferentes de pacientes y contribuir a la diversificación de los mecanismos patogénicos.
Por ejemplo, genes del sistema HLA de clase I no clásico, (MICA, MICB) [López-
Vazquez,A.2002] genes de citoquinas (como los polimorfismos de TNFα)
[Garrote,JA.2002] o de moléculas coestimuladoras (CTLA-4) ).[Djilali-Saiah,I.1998]
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
44
El hecho de que solo el 1 ó 2 % de los individuos con DQ2 ó DQ8 que toman
gluten desarrollen enfermedad implica la existencia de otros factores microambientales
que ejercerían un papel en la activación de la respuesta de las células T lesivas para el
intestino. El gluten e incluso otros péptidos desaminados en el intestino, o el enzima
tTG, no parecen ser factores limitantes en la EC. Sin embargo una alteración en la
inmunidad local, característica en la EC, puede ser determinante en el desarrollo de la
enfermedad.
II.4.1.2. Activación de linfocitos T CD4+ específicos de gluten de la lámina propia. En el intestino sano las respuestas inmunes siguen fundamentalmente un patrón
TH1 predominando las citoquinas proinflamatorias, probablemente debido a la
presencia de IL-12 en las placas de Peyer, mediante un proceso en el que intervienen
moléculas de la familia de los factores transductores de la señal y activadores de la
transcripción (STAT-4 y T-bet), migrando después a la lámina propia donde producen
especialmente INFγ, y mueren por apoptosis [Neurath, MF, 2002]
Las moléculas HLA de clase II son expresadas en la superficie de las células
presentadoras de antígeno donde pueden unirse y posteriormente presentar péptidos
extraños encontrados en el ambiente extracelular de las poblaciones de linfocitos CD4
que son reconocidos por los complejos DQ2 o DQ8 péptidos. Estos péptidos que se
unen a DQ2 o DQ8 en el caso de la enfermedad celiaca son ricos en glutamina y prolina
Figura 5 . Las moléculas de HLA clase II que expre sadas en la superficie de las APC (Ej., macrófagos, células dendríticas, células B) DQ2 y DQ8 unen adecuadamente Péptidos de “gluten,” tomado de Gastroenterology.Vo lumen 124. nº:4.suplem.1. 2005)
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
45
y permanecen en el intestino después de la digestión del gluten de la dieta. Así, es de
suponer que el enigma de porqué los péptidos del gluten cargados negativamente eran
los preferidos para unirse a los heterodimeros DQ2 o DQ8, y en ausencia de esta unión
era improbable activar las células CD4.
Este dilema fue solventado después del descubrimiento en pacientes con EC de
estos autoanticuerpos anti-tTG, que pueden desaminar la glutamina, conviertiéndola en
acido glutámico, cargado negativamente.
La observación de que los péptidos de gliadinas desamidados por tTG
presentaban mayor capacidad de unión a HLA-DQ2 y mayor estimulación de las líneas
T, introdujo un cambio sustancial en la interpretación del papel de la tTG en la
patología.[Van de Wal, Y. 1998] La desamidación de la glutamina por tTG no es al
azar, ya que estudiando substratos naturales o péptidos de síntesis, se establecieron
ciertos requisitos de secuencia para la deamidación selectiva.[Vader, W.2006] Por otro
lado, los estudios de unión de péptidos a la molécula HLADQ2 [Costantini S, 2005] y a
DQ8, [Van der Wal,Y.1998] permitieron establecer las restricciones de anclaje y definir
las secuencias de gliadinas que tienen mayor afinidad de unión. Considerando en
conjunto las restricciones de secuencia para la desamidación selectiva y las restricciones
de anclaje de las moléculas HLA-DQ2/DQ8, fue posible proponer algoritmos que
predicen, en forma teórica, las secuencias potencialmente tóxicas.[Vader,W.2003] La
estimulación in vitro de biopsias de intestino delgado de pacientes celíacos con
fragmentos de gliadinas obtenidos por digestión enzimática o con péptidos sintéticos,
induce una respuesta de tipo TH1, en la que predomina el IFNγ, cuyos niveles se
normalizan en la fase de remisión. [Forsberg, G. 2002]
Se ha confirmado que péptidos del gluten modificados por la enzima
transglutaminasa tisular aumentan su afinidad para unirse a las moléculas DQ2/DQ8 en
la superficie de las células presentadoras de antígeno, siendo reconocidos por los
linfocitos T reactivos específicos de gluten, localizados en el intestino de pacientes con
EC. La molécula DQ8 tiene una función similar en pacientes con DQ2 negativo. El
TNF-α se produce también por clones específicos de linfocitos T, que junto al IFN-γ
producen un efecto tóxico de la misma forma que éste puede inducir moléculas de HLA
II en la superficie de los enterocitos.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
46
En la mucosa intestinal, además de la inmunidad específica o adaptativa
mediada por los linfocitos T CD4+ podría intervenir también la inmunidad innata (no
específica de antígeno). La IL-15 es la principal citoquina inducida por la vía innata.
Está producida por células del mesénquima, monocitos y células epiteliales, y se
relaciona con TGFβ, interviene en la modulación de los cambios epiteliales en la fase
activa de la EC, induciendo la infiltración del epitelio por las células linfoides (IELs) y
la apoptosis de los entericitos.[Maiuri,L.2001] También controla la inflamación
inducida por gluten, la expresión COX-2 y las células CD25+ , además regula la
expresión de receptores coestimuladores para los ligandos MHC clase I no clásicos, a
través de los cuales se activan los linfocitos TCRγδ y células NK intraepiteliales. Las
moléculas HLA II tienen como misión la presentación de antígenos a los linfocitos T,
que una vez reconocidos podrían tener al enterocito como célula diana.
En la enfermedad celiaca, una respuesta inmune inapropriada conduce a una
inflamación crónica y a daño. Las dos principales categorías de respuesta inmune
implicadas en la enfermedad celiaca son: la respuesta inmune adaptativa (HLA-
específica) y la respuesta inmune innata (independiente del tipo de HLA). [Sollid &
Jabri 2005]
II.4.2. TOLERANCIA IMMUNE (ORAL)
El sistema inmune del intestino está expuesto a una amplia variedad de
antígenos derivados de los alimentos, de las bacterias residentes y de los
microorganismos invasivos. La tolerancia oral es una condición fisiologica
caracterizada por la inducción de insensibilidad inmune hacia los antígenos alimentarios
y las bacterias de la flora intestinal. Multiples mecanismos celulares y moleculares están
implicados en la regulación de esta propiedad fundamental del sistema inmunológico
del intestino. [Dubois,B.2005] La EC es la enteropatía sensible a alimentos más
frecuente en humanos y está causada por una pérdida de la tolerancia inmune (tolerancia
oral) hacia el gluten del trigo y otras fracciones de prolaminas del centeno y de la
cebada. Han sido identificados diferentes péptidos del gluten que son reconocidos por
las células T del intestino. [Arentz-Hansen H.2002]
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
47
Ya hemos comentado anteriormente que la activación de estas células T
reactivas al gluten representan el elemento clave en la patogénesis de la EC [Sollid
LM,2002]. La mucosa de los pacientes con EC esta caracterizada por una alta
proporción de linfocitos intraepiteliales T portando cadenas gamma-delta como
receptores antigénicos de las células T (γδ IEL). [Ebert EC 1990]. La ingestión de
gliadina es el agente disparador de esta enfermedad, pudiendo atravesar la barrera
epitelial y obtener linfocitos T dañinos mediando la respuesta inmune. A las células
dendríticas se les supone un papel central en el esquema de la respuesta inmune [Alpan,
O. 2001] Las células dendríticas inmaduras se caracterizan por unos bajos niveles de
expresión del MHC de clase II y moléculas co-estimuladoras y que pueden mediar en la
tolerancia, presumiblemente por inducción de las células T reguladoras (Treg cells).
[Steinman RM.2000] Además, la liberación de IL-10 por las Treg cells pueden modular
la función de las células dendríticas inmaduras e inhibir su diferenciación, amplificando
la presencia local de ‘‘células dendríticas tolerantes’’ [Jonuleit H.2000] La IL-10
modula a las células dendríticas induciendo anergia de las células T efectoras a través
de mecanismos aún no definidos que requieren contacto célula- célula. Por lo tanto, la
dirección de la respuesta inmune hacia la tolerancia inmune depende del estado de
maduración y de las propiedades funcionales de las células dendríticas. Los péptidos de
la gliadina pueden contribuir a la superación del estado de indiferenciación de las
células dendríticas inmaduras induciendo la maduración funcional y fenotípica de las
células dendríticas, haciendo más eficiente la presentación y procesamiento de los
péptidos de la gliadina a los linfocitos T específicos [Palova-Jelinkova L .2005]
II.4.3. COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD (MHC) . MOLÉCULA DE HISTOCOMPATIBILIDAD NO CLÁSICA: HLA-G
El complejo mayor de histocompatibilidad se localiza en la porción distal de la
banda 6p21.3, en el brazo corto del cromosoma 6, y supone aproximadamente un 0.1%
del genoma humano. Se han conseguido identificar unos 400 genes en el MHC humano
o murino, y se piensa que se han podido conservar unidos en grupos (clusters) durante
la evolución.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
48
El sistema MHC, en humanos, se conoce con el nombre de HLA y se puede
subdividir en tres subregiones: clase I, clase II y clase III. La región de clase I, más
cercana al telomero, contiene los loci HLA-A, -B, -C que agrupan genes que codifican
series de antígenos definidos serológicamente y, posteriormente, confirmados por
técnicas moléculares y son conocidos como los antígenos HLA clásicos de trasplante,
estos genes se conocen como de clase MHC Ia. Otros tres genes de clase I,
denominados MHC Ib, HLA-E, -F, -G codifican moléculas funcionales. La región de
clase II engloba los genes: HLA-DR, -DQ y –DP (Figura 5). Más cercanos al
centrómero se encuentra la región de clase III que originariamente se creía circunscrita a
los genes del complemento C4, C2 y Bf, e incluye también genes tan importantes como
los del factor de necrosis tumoral (TNF-α y TNF-β), los de la enzima 21-hidroxilasa y
los que codifican para tres miembros de la familia de las “proteínas de choque térmico”
(Heat shock protein). Uno de los hechos más relevantes del complejo HLA es su
polimorfismo extremo. Debido a esto la heterocigosidad es de un 90%, y la mayoría de
los alelos tienen una frecuencia menor de 0,15. Los antígenos HLA se heredan de una
forma Mendeliana dominante. Esta combinación de determinantes genéticos es referida
como haplotipo. Ya que el cromosoma 6 es un autosoma, todos los individuos tienen
dos haplotipos HLA (uno para cada cromosoma).
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
49
Figura 6.Ordenación génica del complejo mayor de histocompatibilidad
II.4.3.1 ESTRUCTURA DE LA MOLÉCULA HLA-G Y SUS
DIFERENTES ISOFORMAS FUNCIONALES.
El transcrito primario de HLA-G sufre un splicing alternativo, dando como
resultado siete ARNm alternativos que codifican para cuatro isoformas de membrana
(HLA-G1,-G2, - G3, -G4) y tres isoformas solubles (HLA-G5, -G6, -G7) (Figura 6)
[Kirszenbaum et al., 1994]. A continuación se describen las peculiaridades de las
distintas isoformas.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
50
Figura 7. Estructura y ordenación génica de las isoformas de HLA-G-. Imagen cedida por la
Dra. MI Torres (facultad Ciencias Experimentales, Univ. Jaén)
II.4.3.2. Proteína HLA-G1
ARNm HLA-G1 codifica una proteína de 39 kDa que contiene los dominios α1,
α2 y α3 unidos al dominio transmembrana codificado por el exon 5 y a una reducida
cola citoplasmática, debido a la existencia de un prematuro codon de parada en el exon
6. Esta isoforma presenta una estructura similar a otras moléculas HLA de clase I en
que está asociada con β2-microglobulina y une un péptido de 9 aas [Lee et al., 1995a]
(Figura 7).
Varias líneas de evidencia indican que la función primaria de HLA-G1 es servir
como un ligando inhibidor para células immunocompetentes, contribuyendo al
establecimiento de una tolerancia periférica. HLA-G1 es reconocido por los receptores,
ILT2 (Immunoglobulin-like transcript) expresado en células mielomonociticas
[Colonna et al., 1998], ILT4 expresado en monocitos, macrófagos y células dendríticas
y p49/KIR2DL4 (CD158d) expresado en células NK y células T. A través de estos
receptores HLA-G1 puede interactuar directamente con las células NK, T, B, y APC
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
51
Células transfectadas con HLA-G1 han mostrado que modulan la producción de
citoquinas de células mononucleares tanto deciduales como de sangre periférica. Las
cantidades de TNF-α e INF-γ liberadas por células mononucleares deciduales y de
sangre periférica se vieron descendidas, mientras que la cantidad de IL-4 secretada se
aumentó [Kanai et al., 2001a] También se ha asociado una respuesta Th2 (supra-
regulación de IL-10 e IL-4, y subregulación de TNF-α e INF-γ) con la exposición a
altas concentraciones de HLA-G1 purificada. Recientemente se ha descubierto que
HLA-G1 afecta la producción general de citoquinas en linfocitos granulares de la
decidua de una forma no consistente en el paradigma Th1/Th2 (descenso de la
producción de IL-10, IL-13, TNF-α, INF-γ y GM-CSF) [Rieger et al., 2002].
II.4.3.3. Proteínas HLA-G2.-G3 y –G4
Los transcritos primarios de HLA-G2, G3 y G4 que respectivamente excluyen
exon 3, exon 3 y 4, y exon 4, generan isoformas truncadas que poseen solo el dominio
α1 en HLA-G3, los dominios α1 y α3 para HLA-G2, y los dominios α1 y α2 para
HLA-G4, unidos a la región transmembrana (Figura 6).
Estas isoformas son expresadas fisiológicamente en el citotrofoblasto Menier et
al., 2000] y patológicamente en células tumorales, como las de coriocarcinoma [Adrian
et al., 1999], y melanoma [Paul et al., 2000] así como en células transfectadas [Mallet et
al., 2000]. Se ha observado que estas isoformas inhiben la citolisis tanto de las células
NK como la mediada por las células CTL especificas mediante una ruta HLA-E
específica [Riteau et al., 2001]. Quizás estas isoformas truncadas tengan mayor
relevancia en situaciones en las que la expresión de HLA-G1 esté impedida.
II.4.3.4. Proteínas HLA-G5, G6 y G7
Las isoformas solubles de HLA-G están desprovistas de las partes transmembrana
y citoplásmica, debido a las presencia de un codon de parada en el intron 4 (-G5, y –G6)
o en el intron 2 (-G7) dejando una cola específica C-Terminal para estas formas
solubles. (Figura 7). La isoforma completa HLA-G5 es una glicoproteina de 37 kDa que
guarda idénticos dominios líder, α1, α2 y α3 pero incluyendo una secuencia del intron
4 que produce una región de lectura abierta que codifica para 21 aas unidos al dominio
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
52
α3 y excluye el dominio transmembrana [Lee et al., 1995b]. De igual manera, la
isoforma HLA-G6 mantiene la secuencia del intron 4, dando lugar a una proteína
soluble la cual carece del dominio α2 [Paul et al., 2000b]. HLA-G7 es la isoforma que
ha sido descrita más recientemente, es una proteína soluble de 17 kDa producida por
una variante de splicing en la cual la secuencia de lectura abierta continúa en el intron 2,
el cual contiene un codon de parada. HLA-G7 está formada por el dominio α1 unido a
dos aas codificados por el intron 2 [Paul et al., 2000ª].
Debido a la disponibilidad de anticuerpos, como el anticuerpo monoclonal 16G1,
el policlonal PAG5-6 y actualmente con el monoclonal 5A6G7 que son específicos
para el extremo C-terminal (residuos codificados por el intron 4) tanto de HLA-G5
como HLA-G6, se ha podido investigar estas moléculas.
La isoforma HLA-G5 ha sido descrita en varios fluidos corporales, como el
liquido amniótico y suero de mujeres embarazadas [Rebmann et al. 1999;, 1999;Hamai
et al., 1999], pacientes con cáncer [Ugurel et al., 2001;Adrian et al., 2001] pacientes
trasplantados de corazón [Lila et al., 2000b;Lila et al., 2002]. También ha sido descrito
en trofoblasto [Fournel et al., 2000;], oocitos [Menicucci et al., 1999] embriones pre-
implantados [Jurisicova et al., 1996;Fuzzi et al., 2002] y durante la reactivación del
citomegalovirus humano [Onno et al., 2000].
La proteína HLA-G5 recombinante exhibe propiedades inhibitorias y se une a
CD8 y receptores inhibidores, como lo hace HLA-G1. De hecho, la isoforma HLA-G5
inhibe la lisis mediada por células NK y células T CD8+ [Marchal-Bras-Goncalves et
al., 2001b;Contini et al., 2003] y la respuesta alogénica de los CTLs. Por otra parte, la
isoforma HLA-G5 producida naturalmente por células T CD4+ aloreactivas inhibe su
respuesta proliferativa, a través de de efectos inhibitorios por feedback [Lila et al.,
2001c]. También se ha observado que la proteína recombinante HLA-G5 influencia la
liberación de citoquinas por las PBMCs estimulando su liberación de IL-10, TNF-α, e
INF-γ [Kanai et al., 2003].
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
53
II.4.3.5. Papel de HLA-G in vivo.
HLA-G es una molécula que en circunstancias normales no está expresada,
excepto en la interfase materno fetal y en las células epiteliales tímicas. Por otra parte se
ha demostrado que hay expresión de HLA-G en pacientes trasplantados de corazón,
Higado y riñon [Lemaoult et al., 2005] y esta correlacionado con la ausencia de rechazo
de estos trasplantados [Creput et al., 2003a;Creput et al., 2003b.]
HLA-G en inflamación y autoinmunidad
Con base en las funciones tolerogénicas que presenta HLA-G, podemos considerar que
esta molécula está implicada en las enfermedades autoinmunes e inflamatorias. En este
sentido, se ha descrito previamente expresión de HLA-G en los tejidos como la piel
[Gazit, E. et al.2004], el músculo, el páncreas, el tracto digestivo , y el sistema nervioso
central participando en procesos inflamatorios que a menudo tienen una etiología
autoinmune.[Carosella ED,2001] de los niveles plasmáticos de sHLA-G o menor
expresión de HLA-G se han encontrado en monocitos de pacientes con artritis
reumatoide, asma, o esclerosis múltiple [Lila N, et al, 2001]. Esta baja expresión de
HLA-G se correlaciona positivamente con los parámetros de actividad de la
enfermedad, lo que indica que la HLA-G no protege eficazmente a los tejidos dañados
de las células NK y T. Curiosamente, la expresión de HLA-G por los monocitos de
pacientes con esclerosis múltiple puede ser estimulada por el interferón-beta, que se
utiliza comúnmente para el tratamiento de esta enfermedad [Fainardi, E, et al 2003].
Los efectos beneficiosos del tratamiento con IFN-beta puede ser debido a la
restauración de la expresión de HLA-G por los monocitos que son así capaces de ejercer
la función tolerogénicas en estos pacientes.
II.4.3.6. HLA-G: molécula de tolerancia inmune
HLA-G es una molécula no clásica de clase I del Complejo mayor de
histocompatibilidad que se expresa selectivamente en la intefase materno-fetal en las
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
54
células del citotrofoblasto protegiendo al feto del rechazo inmune por parte de la madre
y creando un estado general de tolerancia. HLA-G exhibe propiedades tolerogénicas
vía interacción con receptores inhibitorios presentes en las células natural killer (NK),
células T y células presentadoras de antígenos (APC). [Le Rond S. 2005]
La molécula HLA-G pertenece a la familia de moléculas de histocompatibilidad no
clásicas y se caracterizan por un limitado polimorfismo y una distribución celular y
tisular restringida al trofoblasto fetal y células del epitelio tímico. Esta molécula puede
presentarse en siete isoformas distintas, codificadas por splicing alternativo, cuatro de
ellas son proteínas unidas a membrana (HLAG1, G2, G3 Y G4), y otras tres isoformas
que son proteínas solubles (HLA-G5, G6 Y G7 ).
Otras características de esta molécula son:
• Es reconocida por ciertos receptores inhibidores, tales como KIR2DL4, ILT-2 y
ILT-4 y, en consecuencia posee, capacidad de inhibir la lisis mediada por células
NK y ciertas células T.
• Está relacionada con la inducción de tolerancia materno-fetal. Se ha demostrado
que la molécula HLA-G es capaz de inhibir la actividad de las células NK de los
leucocitos de la decídua sobre los trofoblastos durante el primer trimestre de
gestación. Parece participar en la vigilancia del sistema inmune frente a tumores
y se ha descubierto un aumento en el nivel de la expresión de esta molécula en la
superficie de las células infectadas por el HIV, que podría ser una forma del
virus de escapar de la destrucción por el sistema inmune.
La presencia de HLA-G soluble (sHLA-G) en el fluido cerebroespinal de
enfermos con esclerosis múltiple [Fainardi, E.2003] y en receptores de aloingerto
después de un trasplante [Lila N.2001] sugieren una función tolerogénica para esta
molécula contra la respuesta celular inmune innata y adaptativa. Curiosamente, nuestro
grupo investigador y otros autores han sugerido que los antígenos HLA-G juegan un
papel protector en la inflamación. [Carosella, ED.2001]. Así, las moléculas de sHLA-G
inhiben la actividad lítica de las células NK, induciendo apoptosis de CD8+ CTLs y
afectan la alloproliferación de CD4+. [Bainbridge DR.2000] Las propiedades
inmunomoduladoras del sistema sHLA-G explican su potencial interés en EC. La
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
55
expresion de HLA-G soluble en la EC es de especial interés porque su molécula juega
un importante papel en la inducción de la tolerancia inmune.[Rouas – Freiss, N.2000]
II.4.3.7. POLIMORFISMO HLA-G
El Polimorfismo de HLA-G se reduce a sólo 9 HLA variantes diferentes de la proteína
G codificada por 28 alelos, de los cuales 23 corresponden a las sustituciones en la
secuencia de codificación. El Polimorfismo en regiones no codificadoras también afecta
a la expresión de los genes HLA-G y tiene un significado funcional. En este sentido,
nivel de mRNA y la estabilidad, así como la expresión del HLA-G soluble (sHLA-G) e
IL-10 por las células mononucleares de sangre periférica se relacionan con el
polimorfismo de de 14 pares de bases de HLA-G. En enfermedades humanas, los alelos
HLA-G han sido estadísticamente asociados con el aborto espontáneo recurrente, el
pénfigo vulgar , la enfermedad inflamatoria intestinal, y la sarcoidosis .
II.4.4. Citokinas y Enfermedad celiaca.
Las características de una respuesta inflamatoria dependen de las citokinas
producidas durante esta respuesta. La producción de citoquinas po las células T y
macrófagos es de potencial importancia en las lesiones histológicas que aparecen en la
EC.
Células Th1: Las lesiones de la EC asocian una marcada infiltración de células Th1
dominadas por la síntesis de citoquinas proinflamatorias, IFN-gamma y TNF-α. [Nilsen
EM.1995] La IL-15 también tiene un importante papel en la EC, por orquestar cambios
en los linfocitos intraepiteliales en esta enfermedad. Ciertas partes del gluten pueden
estimular la respuesta inmune innata, y la IL-15 es un elemento central en la respuesta
inmune inducida por el gluten, produciendo la activación de los IELs en la
EC.[Maiuri,L.2000] La sobreexpresión de IL-15 por las células epiteliales en el
intestino conducen a una masiva expansión de células T CD8+ intestinales que
acompaña a una enteropatía CD-like. Además, la IL-15 induce la expresion de MICA,
el ligando epitelial de NKG2D.[Hue, S.2004]
La IL-10 actúa predominantemente como un potente factor antiinflamatorio y
agente supresor de la respuestas Th1. TGF-beta es el principal factor para la producción
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
56
de inmunoglobulina A (IgA) y actua como un potente mediador en la reparación del
daño tisular. [Cataldo,F.2003]
Curiosamente, la tTG, se ha descrito como el principal autoantígeno hacia el
que van dirigidos los anticuerpos antiendomisio en la EC. Es necesaria para la
activación de TGF-beta [Hansson,T.2002] Los niveles elevados de Il-10 y TGF-beta
son insuficientes para la inhibición de la reacción autoinmune, y podrían modular la
respuesta inmune e inducir la activación de los linfocitos B. Estas citoquinas pueden
jugar un importante papel en la inducción de HLA-G. Esta consideración, el posible
papel de la IL-10 en la inducción de la expresión protéica de HLA-G ya ha sido descrita
previamente en la enfermedad celiaca [Torres,MI.2006]
Uno de los primeros estudios sobre citoquinas en EC demostró mediante
técnicas de inmunohistoquímica, que la mucosa de los enfermos celiacos presentaba
menor porcentaje de IELs (3,5% v 13,5%) y de LPL (10,3% vs 47.2%) productores de
IFN-γ que los controles . Este dato fue puesto en duda por otro grupo de autores quienes
demostraron más tarde por hibridación in situ, mayor número de LPL productores de
IFN-γ en celiacos que en controles, sugiriendo que el balance Th1/Th2 estaría alterado
[Kontakou, M. 1994].
El incremento de citoquinas Th1 se demostró en biopsias de mucosa
provenientes de enfermos celiacos, que tras la ingestión de proteínas de trigo, a las
cuatro horas incrementaban la síntesis de mRNA de IFN-γ, IL-12 y TNF-α.
Clones de LPL CD4+ aislados de mucosa celiaca y específicos de gliadina,
muestran un patrón Th1 con producción de IFN-γ cuando los péptidos son presentados
por DQ2, y un patrón Th1/Th0 (IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, TGF-β) cuando
lo hacen asociados a DQ8. [Nilsen, EM. 1995]. Otro estudio sobre clones CD4+
específicos de gliadina y restringidos por DQ2, producen mayoritariamente IFN-γ
aunque algunos también IL-4 [Troncone, R. 1998] Este patrón observado en clones
específicos de gliadina confirmaría los estudios realizados en biopsias de mucosa.
Células Th3: Son células T CD4 + productoras de TGF-β que se aislan de
nódulos linfáticos mesentéricos tras la administración oral de antígenos a bajas dosis.
En el año 1994, en el modelo de EAE (encefalitis autoinmune experimental) se
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
57
describen un tipo de células productoras de TGF-β que impedían la inducción de la
enfermedad por MBP o PLP.
Células CD4+ CD25+: Los linfocitos CD4+ CD25+ son otra población a las que
se atribuye la supresión activa de autorreactividad. Son células derivadas del timo que a
través de mecanismos moleculares no muy claros, median activamente la inhibición de
las células T (autorreactividad, síntesis de citoquinas). El efecto principal de esta célula
sería el de reducir/inhibir la expresión de IL-2 en las células CD4+ CD25-. In Vitro, el
efecto supresor requiere la activación de las células supresoras, el contacto entre ésta y
la efectora, y no es mediado por citoquinas. El efecto se inhibe con adición de anti-
CD28, lo cual sugiere que estarían actuando sobre la señal coestimulatoria. Sin
embargo, las CD4+ CD25+ pueden inducir supresión de síntesis de citoquinas en un
sistema libre de APCs. Es la única población en ratón que expresa constitutivamente
CTLA-4. Se desconoce si el CTLA-4 está involucrado en la función reguladora de esta
población. Su efecto supresor parece ser independiente de la IL-4 e IL-10. Si bien la
supresión y/o tolerancia están generalmente vinculadas a la producción de dos
citoquinas, la IL-10 y el TGF-β, hasta el momento no se ha visto un efecto directo de
estas en el proceso de diferenciación o en la función efectora de las células T
reguladoras. Aún queda por resolver si las Treg actúan a través del contacto célula-
célula o a través de mediadores solubles, qué marcadores las diferencian, qué antígenos
reconocen y sobre qué tipos de células actúan.
Los linfocitos T y B son los mediadores de la respuesta inmune, pero de
la presencia de células dendríticas dependerá la correcta diferenciación de las mismas
[Banchereau, J. 1998] La secreción de citoquinas por parte de las CD y de las células T
condicionará en muchos casos el resultado final, es decir, la polarización hacia una
respuesta de tipo Th1 ó Th2 [Neurath, MF. 2002] Algunas enfermedades tienen una
clara asociación con la presencia de determinadas citoquinas, como ocurre en las
enfermedades inflamatorias intestinales
CÉLULAS TH17. IL-17/IL-23
El paradigma que establece una dicotomía de respuestas inmunológicas frente a
antígenos, basado en la existencia de linfocitos Th1 y Th2 continua sin aclarar del todo.
La evidencia de un nuevo tipo de linfocito T cooperador, denominado Th17, trae nuevas
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
58
luces y complejidades a la comprensión de los mecanismos de inmunoregulación,
inmunopatología y su rol en enfermedades autoinmunes e inflamatorias.
Los linfocitos Th1 producen grandes cantidades de IFN-gamma participan en procesos
inflamatorios, mientras que los Th2 productores de IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13 están
asociados con la protección frente a alergias. Los linfocitos Th17 son distintos a los Th1
y Th2 y se caracterizan por producir IL-17, TNF-alfa, IL-6, IL-22 y GM-CSF.
Asimismo, se ha descrito para ellas un efecto proinflamatorio queles permite hacer de
puente entre la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa. Las citocinas implicadas en
el control de la actividad TH17 son la IL-23, el (TGF-β) y la IL-6. El TGF-β y la IL-6
promueven la diferenciación de los linfocitos quiescentes en células TH17. Los
diferentes tipos de células colaboradoras se inactivan mutuamente, de modo que los
TH1(a través de lIFN-γ) inhiben selectivamente la actividad de los TH2 y los TH17. A
su vez, los TH2 inhiben la proliferación de los TH1 y los TH17 mediantela IL-10 y la
IL-4, y los TH17 inhiben a TH1 y a TH27. Hasta hace unos años se consideraba que los
principales causantes del daño tisular en las enfermedades autoinmunes eran las células
TH1, pero actualmente se considera que las TH17 son las principales inductoras de
enfermedad autoinmune. Recientemente se ha demostrado que los linfocitos Th17
también participan en la patogénesis de enfermedades inflamatorias. [Blauvelt (2007]
propone que la psoriasis debe ser una enfermedad Th17. De igual manera, los linfocitos
Th17 pueden ser importantes en otras enfermedades o desordenes caracterizadas por
inflamación y autoinmunidad.
La investigación sobre los Th17 ha permitido señalar tres vías independientes y
exclusivos de respuestas inflamatorias: IL-12/ IFN-gamma, IL-4/IL-5/IL-13 e IL-
23/IL-17. La identificación de la vía involucrada en las distintas formas clínicas o
estadios de una enfermedad permitirá la aplicación de esquemas terapéuticos más
precisos y certeros
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
59
Figura 8
II.4.5. Inmunogenetica: Variantes Alélicas implicadas.
La enfermedad celiaca muestra una de las asociaciones más fuertes con la región
HLA-clase II conocida hasta ahora. En la mayoría de las poblaciones estudiadas (una
excepción es la población indígena sudamericana) el 95 % de los pacientes son
portadores del heterodímero HLA-DQ2, que se asocia a DR3 (más común en el centro y
norte de Europa); o a DR7/DR5 en heterocigotos (más frecuente en países
mediterráneos). Sin embargo, alrededor del 25-30% de la población general tiene el
heterodímero DQ2, lo que sugiere que otros genes (probablemente no HLA) podrían ser
relevantes. Más del 95% de los pacientes con EC presentan los alelos de riesgo
DQB1*02 y DQA1*0501 o DQB1*0302 y DQA1*03 [Karell, K. 2003] y los casos
DQ2/DQ8 negativo, suelen tener al menos uno de los alelos de riesgo por separado
(DQA1*0501 ó DQB1*02), siendo muy raros los casos en los que ambos están
ausentes. Sin embargo, la concordancia de EC en gemelos monocigotos es del 75% y
sólo un 1-2% de los individuos portadores de HLA-DQ2/DQ8 desarrollan la
enfermedad, lo que sugiere que otros factores serían responsables de la activación (o
cronificación) de la respuesta inmune local frente a las prolaminas tóxicas en individuos
genéticamente predispuestos.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
60
El resto de los pacientes (5-10%) suelen portar un segundo heterodímero, DQ8
(mayoritario entre los pacientes indígenas de Sudamérica), asociado normalmente a
DR4. Por último los pacientes no portadores de DQ2 ni de DQ8, pueden mostrar al
menos uno de los alelos del DQ2 por separado, y se han descrito muy pocos casos en
los que ambos alelos de riesgo están ausentes. Además dentro de la región HLA se han
estudiado otros genes no-DQ, que podrían estar asociados a la susceptibilidad.
Las proteínas HLA-DQ2 y DQ8 son heterodimeros encontrados en la superficie de las
células presentadoras de superficie (APCs). Las proteínas DQ2 y DQ8 constan de una
cadena α y una cadena β codificadas por secuencias variantes específicas codificadas
por los genes HLA-DQA1 y HLA-DQB1 respectivamente.
Los individuos con enfermedad celiaca que tienen DQ2:
• Poseen el haplotipo de susceptibilidad para enfermedad celiaca DR17-
DQ2 [HLA-DRB1*0301;HLA-DQA1*0501;HLA-DQB1*0201] o
• Son heterocigotos para los haplotipos de susceptibilidad celiaca
DR11 o DR12-DQ7 [HLA-DRB1*11/12;HLA-
DQA1*0505;DQB1*0301] o DR7-DQ2 [HLA-DRB1*07;HLA-
DQA1*0201;HLA-DQB1*0202]
Los individuos con enfermedad celiaca que tienen DQ8 tienen el haplotipo de
susceptibilidad celiaca DR4-DQ8 (HLA-DRB1*04;HLA-DQA1*03;HLA-
DQB1*0302) [Sollid 2002, Sollid & Lie 2005].
II.5. DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD CELIACA
El diagnóstico de enfermedad celiaca se realiza a través de la combinación de los
siguientes: [Hill et al 2005, NIH Consensus Committee 2005, Green & Cellier 2007]:
• Biopsia de intestino delgado que muestra las alteraciones histológicas
características
• Mejoría posterior (clinica y/o histológica) a la dieta sin gluten
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
61
Además descubrir en muchos individuos afectados:
• Alteraciones analíticas (aunque algunos individuos están
asintomáticos y carecen de alteraciones analíticas)
• Anticuerpos específicos asociados a la Enfermedad Celiaca
Aunque la positividad de las pruebas de anticuerpos especifícos tienen
una fuerte asociación con el diagnóstico de enfermedad celiaca y
ayudan muchísimo a su diagnóstico [Fasano 2001, Farrell et al 2002],
la biopsia de intestino sigue siendo el “gold standard” en la
confirmación del diagnóstico de la enfermedad celiaca.
• La enfermedad celiaca se asocia con los (HLA) human leukocyte
antigen
II.5.1. Anticuerpos asociados con la enfermedad Celiaca
(1) Es importante que tanto los niveles de anticuerpos como la biopsia intestinal se
realicen tomando una dieta con gluten, porque los niveles de anticuerpos y las
anormalidades histológicas revierten a la normalidad gradualmente después de instaurar
una dieta sin gluten.
(2) Para los individuos que toman gluten en su dieta, el diagnostico de enfermedad
celiaca puede ser realizado con los test de anticuerpos y biopsia intestinal que seguirán a
los cambios de gluten de la dieta (p.ej., comer alimentos con gluten [el equivalente a
tres rebanadas de pan al día] al menos tres meses si no se observan síntomas). Sin
embargo, los cambios del gluten pueden causar un daño importante en algunos
individuos.
a) Anticuerpos Anti transglutaminasa tisular (tTG) IgA. Medir la concentración
de anticuerpos anti transglutaminasa tisular (tTG) de clase IgA es recomendable
para el diagnóstico inicial por su alta sensibilidad y Especificidad para la
enfermedad celiaca, con relativo bajo coste, y de fácil realización y alta fiabilidad.
Sin embargo, la sensibilidad y Especificidad difieren entre laboratorios [Abrams et
al 2006]. Los resultados Falsos positivos pueden ocurrir en personas con síndrome
coronario agudo y en individuos con hepatopatías crónicas y cirrosis.
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b) Anticuerpos Antiendomisio (EMA) IgA. La concentración en suero de
anticuerpos antiendomisio (EMA) IgA tienen una alta Especificidad (~99%),
pero es más caro y llevan demasiado tiempo su realización y son potencialmente
más propensos a presentar falsos negativos que la concentración sérica de
anticuerpos tTG IgA. Porque son determinados por inmunofluorescencia
indirecta, la concentración sérica de EMA IgA está sometida a la variabilidad
subjetiva del observador, lo que afecta su sensibilidad [Murray 2004] Cuando
son relizados por un analista experto, este test tiene una alta Especificidad
(cercana al 100%) tanto o más que los anticuerpos tTG y son útiles en
individuos con cirrosis.
c) Anticuerpos anti péptidos desaminados relacionados con la gliadina (a-
DGP) IgA e IgG. Este nuevo test detecta anticuerpos que se unen a péptidos
sintéticos desaminados relacionados con la gliadina (DGPs). Estudios
preliminares examinan grupos con alta prevalencia de enfermedad celiaca,
ambos isotipos (IgA e IgG) demostraron tener una alta sensibilidad y
especificidad para la enfermedad celiaca activa. La Especificidad es mayor que
la de los anticuerpos antigliadina (AGA) y similar a la de los anticuerpos tTG.
Un incremento de los niveles de anticuerpos DGP pueden preceder al
incremento de la concentración sérica de anticuerpos tTG-IgA en niños [Liu et
al 2007]. Sin embargo, con todos estos test, una minoria de individuos tienen
resultados falsos negativos.
d) Medición de la concentración sérica de IgA total para evaluar la deficiencia
selectiva de IgA. La prevalencia de la deficiencia selectiva de IgA, tiene una
causa desconocida, afecta a 1:700 de la población general. Se descococe el
porqué la prevalecia de la deficiencia selectiva de IgA es más alta (1:50) en
individuos con enfermedad celiaca que en la población general [Wong el al
2003, Alaedini & Green 2005].
i. Los individuos con déficit selectivo de IgA no producen
anticuerpos IgA, la EC se asocia anticuerpos tTG IgA y EMA
de clase IgA y no están presentes en estos individuos. Por tanto,
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en estos individuos, se recomienda realizar anticuerpos
específicos para EC de clase IgG (tTG IgG) o DGP-IGG que
pueden ser realizados en su lugar.
e) Anticuerpos Antigliadina (AGA) IgA e IgG. En la NIH Conferencia sobre el
Consenso y Desarrollo sobre la Enfermedad Celiaca se hicieron
recomendaciones contra el uso de AGA en el diagnóstico de enfermedad celiaca
por la baja Especificidad de esta prueba y la disponibilidad de test de más
sensibilidad y especificidad, incluidos tTG y EMA IgA [Hill et al 2005].
La sensibilidad global de las pruebas de anticuerpos relacionados con la enfermedad
celiaca puede incrementarse ligeramente cuando se hacen los cuatro tests
(concentraciones séricas de tTG IgA, EMA IgA, total IgA, y AGA IgA e IgG). No
obstante, el uso de paneles que incorporan AGA incrementan marcadamente la tasa de
falsos positivos, como resultado de un único positivo en los anticuerpos AGA y el valor
predictivo positivo hasta niveles bajos excepto en el caso de un pretest con una muy
alta prevalencia.
Aunque un resultado en las pruebas de anticuerpos asociados a la enfermedad celiaca es
probable que sea diagnóstico, pueden ocurrir falsos positivos y a la inversa, resultados
normales en las pruebas de anticuerpos no excluyen el diagnóstico de enfermedad
celiaca, especialmente en presencia de grados bajos de atrofia intestinal o en personas
que toman una dieta sin gluten en pruebas previas.
II.5.2. Diagnóstico Diferencial
La enfermedad celiaca está infradiagnosticada por su presentación clínica variable y que
puede ser superponible con otras entidades.
Las condiciones que tienden a enmascarar el diagnóstico de enfermedad celiaca
incluyen dispepsia, SII, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), esprue tropical,
estreñimiento, fatiga crónica y varios síndromes neurológicos [Alaedini & Green 2005,
NIH Consensus Committee 2005]. Algunas de estas condiciones pueden ocurrir
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conjuntamente con la enfermedad celiaca. Se estima que el 36% de individuos
diagnosticados de enfermedad celiaca iniicialmente ha tenido el diagnóstico de SII
[Green et al 2001]. Aproximadamente el 5% de individuos con SII y el 2% de
personas con IBD también tienen enfermedad celiaca [Yang et al 2005].
Sensibilidad al gluten No-celiaca: Es una condición distinta de la enfermedad celiaca
y que está presente en algunos individuos que no tienen enfermedad celiaca pero tienen
sensibilidad al gluten que mejora con una dieta sin gluten. Los mecanismos patogénicos
para esta condición no son completamente conocidos. Un estudio reveló que los
individuos diagnosticados de SII que respondían a la retirada del gluten eran DQ2
positivos. Los individuos con síntomas neurológicos o gastrointestinales en ausencia
de enfermedad celiaca que informaron de mejoría con una dieta sin gluten son difiles
de evaluar y pueden recibir la etiqueta de sensibilidad o intolerancia al gluten.
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III. Material y Métodos
III.1. Muestra
III.1.a. Pacientes:
El estudio fue realizado después de ser aprobado por la Comisión de Ética. Las
biopsias de intestino delgado fueron obtenidas mediante endoscopia gastrointestinal,
contando con el consentimiento informado de los pacientes para ser investigados para
EC (los pacientes fueron seguidos en el Hospital Virgen de las Nieves de Granada,
España). Se obtuvieron dos muestras de biopsia de cada paciente, empleándose una de
ellas para análisis inmunohistoquímico. Veinte y cuatro pacientes tuvieron los hallazgos
típicos de la EC y nueve pacientes en los que la EC fue excluida fueron incluidos en el
grupo control de no celiacos (pacientes con síndrome de intestino irritable (n=2),
síndrome de malabsorción (n=2) y enfermedad de Crohn (n=5)).
Para la segunda parte del estudio, metabolismo del triptófano y expresión de la
2,3 indolamina dioxigenasa (IDO), se usaron las biopsias de intestino Delgado de los
veinticuatro pacientes anteriores que tenían características de EC típica activa. Doce
pacientes en los que la EC fue excluída se incluyeron como grupo control de No
celiacos [pacientes sanos (n = 5) y pacientes con enfermedad de Crohn (n = 7)].
III.2.Diseño
III.2.1. Análisis estadístico:
Todos los resultados fueron expresados como media + SEM. Los datos fueron
evaluados para significación estadística usando el programa STATGRAPHICS Plus 5.
Se usó un test no paramétrico (test de Kruskal-Wallis) para determinar las diferencias
entre grupos. El test de Kolmogorov-Smirnov fue usado para comparar la distribución
entre grupos. Se consideraron significativos valores de P < 0.05.
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Para la segunda parte del estudio Todos los resultados fueron expresados como
media y como error estándar de la media (s.e.m.) Las comparaciones fueron realizadas
por el test de Kruskal– Wallis. Los valores de P menores de 0·05 fueron considerados
como diferencia significativa. El test de Kolmogorov–Smirnov fue usado para comparar
la distribución entre grupos. Todos los análisis estadísticos fueron realizados usando el
programa statgraphics Plus 5 m.
III.3.Método
III.3.1. Análisis serológicos e histológicos:
El diagnóstico de EC es establecido mediante tests de screening serológico
acompañados por biopsia del intestino delgado y confirmación de una respuesta clínica
a la eliminación del gluten de la dieta. Los pacientes fueron estudiados
prospectivamente para EC usando anticuerpos antiendomisio (EMAs), anticuerpos
antigliadina (AGAs), anticuerpos anti transglutaminasa tisular (tTGAs) y tipaje HLA
específico de EC. La mejor determinación para screening es la Ig A humana
recombinante antitransglutaminasa tisular, medida por medio de ELISA, el cual tiene
una alta sensibilidad y especificidad para EC. [Lock, R. J.2004]
El diagnóstico histopatológico estuvo basado en las lesiones típicas de la mucosa
intestinal con hiperplasia de criptas, atrofia de las vellosidades y aumento del número de
linfocitos intraepiteliales. Todos los pacientes con EC fueron positivos para los
anticuerpos antiendomisio (EMA) y anti-transglutaminasa (tTG Ac)
En el momento del diagnóstico. Ningún paciente con Sprue refractario fué
enrolado en el estudio.
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III.3.2. Análisis inmunohistoquímicos:
Las muestras fijadas en formalina e inmovilizadas en parafina fueron usadas
para inmunohistoquímica. El HLA-G fue detectado usando un mAb MEM-G/1 (Exbio,
Praga, Republica Checa), que reacciona con las cadenas pesadas de HLA-G
desnaturalizado, y 5A6G7 (Exbio) que reconoce isoformas de sHLA-G. Se usó como
control negativo un mAb isotópico IgG1. La tinción inmunohistoquímica fue realizada
usando el sistema de detección UltraTech HRP Streptavidin-Biotin Universal
(Inmunotech, Francia).
Después de desparafinización y rehidratación, (las secciones de las muestras de
biopsia) fueron sometidas al microondas en 10 nM de citrato buffer (pH, 6.0) para
recuperar antígenos. Las secciones fueron congeladas en PBS, y la actividad de
peroxidasa endógena fue saturada con peróxido de hidrógeno en agua destilada. Las
secciones fueron tratadas con el agente bloqueante de proteínas, incubadas
secuencialmente con el anticuerpo primario, y luego con un anticuerpo secundario
biotinilatado y con el reactivo streptavidina-peroxidasa. La inmunoreacción fue
visualizada con una solución AEC (3-amino-9-etil-carbazol) (Inmunotech) que actúa
como cromógeno. Finalmente, las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina.
Siempre se consideró un control positivo y otro negativo.
III.3.3. Tinciones Inmunohistoquímicas para IDO, TGF-β e Il-10
Secciones de parafina fueron desparafinadas en xyleno, seguido por hidratación a
través de alcohol. Usamos los siguientes anticuerpos: rabbit anti-human IFN-g
(Biosource), sheep antihuman indoleamine 2, 3-dioxygenase (Serotec), mouse
antihuman transforming growth factor (TGF)-b (Serotec) y mouse anti-human IL-10
(Santacruz Biotechonology). Las tinciones inmunohistoquímicas fueron realizadas
usando UltraTech, en la cual el anticuerpo primario fue sustituido por el
correspondiente anticuerpo control isotipo.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
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III.4 TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA PARA EL ESTU DIO DE LA
EXPRESIÓN DE HLA-G, IDO, IL-10, TGF-beta.
Material en parafina
Se obtendrán secciones de 3-4 micras mediante micrótomo rotatorio
convencional, montándose sobre portaobjetos con adhesivo celular. Se secan a
temperatura ambiente durante una hora y después se depositarán en una estufa a 37º C,
para favorecer la adherencia de la sección. No usándose temperaturas mayores para
evitar daños antigénicos.
Anticuerpos.
Se utilizarón los anticuerpos monoclonal anti-HLA-G humana MEM-G/01
(Exbio, Praga. R. Checa) y 4H84 (Cedido por el Dr Carosella) los cuales reconocen
todas las isoformas desnaturalizadas de HLA-G. El anticuerpo 5A6G7 (Exbio, Praga. R.
Checa) que reconoce las isoformas solubles HLA-G5 y HLA-G6.
Buffers Usados
Se utilizaron como buffers o tampones el fosfato salino tamponado (Phosphate
Buffered Saline: PBS), 0.01M, a pH 7.2 y se prepara como sigue: a un litro de agua
destilada se añade 1.48g de fosfato sódico dibásico anhídro, 0.43g de fosfato potásico
mono básico anhídro y 7.2g de cloruro sódico. Tras cada nuevo elemento añadido se
agitará la disolución para que no quede poso. Una vez preparado se comprobará el pH
mediante pHmetro convencional, ajustándolo si fuese necesario. La solución se
guardará a 4º C.
Tampón citrato para la recuperación antigénica se utilizó el de la casa DAKO
(DakoCytomation Target Retrieval Solution, Citrate pH 6. S 2369)
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Técnica de inmunotínción
Se utilizó el método avidina-biotina-peroxidasa mediante al Kit para
inmunomarcaje de Immunotech (HRP 2391. Marseille, Francia)
Realización de la técnica:
• Se secarán las secciones de la estufa y se dejan a temperatura ambiente así como
en el resto de material que vamos a utilizar.
• Desparafinar, en dos cubas con xilol las secciones son introducidas 10 minutos
en cada una.
• Hidratación en alcohol etílico decreciente (absoluto, 90º ,70 º y 50º) 10 minutos
para cada paso
• Las muestras se calentaran con tampón citrato
• Se dibujará sobre el porta y alrededor de la sección un círculo mediante el lápiz
hidrófobo (Dako, Glostrup, Dinamarca; S-2002) que dá una lámina de un
polímero plástico hidrófobo, que evita el desparramamiento de las soluciones
por el porta, asegurando una cantidad adecuada y uniforme de reactivo sobre la
sección.
• Inhibición de la peroxidasa endógena con H2O2 al 3%, durante 5 minutos. Esta
solución deberá prepararse en el acto.
• Lavaremos en PBS, 5 minutos
• Incubaremos con el anticuerpo primario adecuadamente diluido (1/1000)
durante una hora a t.a.
• Lavaremos tres veces con PBS, 5 minutos cada repetición.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
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• Incubación con anticuerpo anti ratón biotinilado del kit comercial HRP 2391;
Immunotech, Marsella. Francia) durante 10 minutos a t.a.
• Lavaremos tres veces con PBS, 5 minutos cada repetición.
• Incubación con complejo avidina-biotina-peroxidasa durante 10 minutos a t.a.
• Lavaremos tres veces con PBS, 5 minutos cada repetición.
• Incubación con la solución cromógena del kit , durante 8 minutos a t.a. , recién
preparada.
• Lavado en agua corriente, 5 minutos
• Contratínción nuclear con hematoxilina convencional. Aprox 2 minutos.
• Lavado abundante con agua destilada
• Secamos con papel absorbente los excesos de agua.
• Montaje permanente con gel fijador (Glicergel, Dako, Dinamarca).
• Colocaremos un cubre y depositaremos en oscuridad hasta que la sección se fije.
Valoración de las tinciones
La cuantificación de marcaje se ha realizado mediante el software WCIF ImageJ
(Western Research Institute. Toronto. Canadá)
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Controles de las técnicas
A) Control negativo
Su función es detectar alteraciones del tejido en estudio que produzcan tinciones
inespecíficas o bien alteraciones en el sistema de detección (anticuerpo, complejo
del sistema de detección, cromógeno)
Para ello se usaron secciones de tejidos conocidamente negativos que fueron
inmunoteñidos de forma similar a las secciones de estudio, no debiéndose obtener
tinción si la técnica está bien hecha.
B) Control positivo
Su función es chequear el adecuado comportamiento del anticuerpo usado y
secundariamente del sistema de detección.
Para ello utilizaremos secciones de trofoblasto materno donde ha sido ampliamente
descrita la presencia de HLA-G1 [Kavak et al., 2003].
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
72
III.5 TECNICA DE ELISA (ENZIME LINKED IMMUNOABSORB ENT
ASSAY) PARA EL ESTUDIO DE LAS ISOFORMAS SOLUBLES SHLA-
G1+HLA-G5 Y sHLA-G TOTAL EN PLASMA.
Muestras de plasma
La sangre total se recogió en tubos EDTA, el plasma se obtuvo centrifugando a
1700 rpm la sangre total quedándonos con la parte soluble de la sangre total. Esta se
almacenará en tubos Eppendorf y se congelará a -20ºC hasta su posterior análisis.
Cuantificación de sHLA-G1 y HLA-G5 en plasma
La cuantificación se llevó a cabo mediante el Kit de sHLA-G de Exbio (Cat.
RD194070100, Exbio, Praga), todos los componentes necesarios para la realización del
ELISA vienen suministrados en este Kit. Previamente se preparó la solución de lavado
que se hace como sigue: Se diluye 100 ml de la solución de lavado del Kit sHLA-G
(Exbio) con 400 ml de agua deionizada y destilada.
Por otra parte se ha de reconstituir la proteína estándar sHLA-G (Exbio) con 0.2
ml de agua destilada y deionizada, La concentración de HLA-Gs resultante es de 1000
Unid/ml (solución stock). Para la preparación de la curva estándar realizamos diluciones
seriadas de la solución stock:
Volumen del estándar Tampón de dilución Concentración del estándar
Solución stock estándar ---- 1000 Unid/ml
100 µl de Solución stock estándar 400 µl 200 Unid/ml
100 µl of est. 200 Unid/ml 100 µl 100 Unid/ml
100 µl of est. 100 Unid/ml 100 µl 50 Unid/ml
100 µl of est. 50 Unid/ml 100 µl 25 Unid/ml
100 µl of est. 25 Unid/ml 100 µl 12.5 Unid/ml
100 µl of est. 12.5 Unid/ml 100 µl 6.25 Unid/ml
100 µl of est. 6.25 Unid/ml 100 µl 3.125 Unid/ml
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
73
Realización de la técnica
1) Pipetear 50 µl del tampón de dilución en los pocillos.
2) Pipetear 50 µl de las muestras y de los estándares en duplicado. En los pocillos
apropiados.
3) Incubar la placa a temperatura ambiente (24°C) durante 1 hora, en un agitador
de microplacas.
4) Lavar los pocillos 3 veces con solución de lavado (0.35 ml por pocillo).
5) Añadir 10 µl de la solución conjugada.
6) Incubar la placa a temperatura ambiente (24°C) durante una hora en un
agitador de microplacas.
7) Lavar los pocillos 3 veces con solución de lavado (0.35 ml por pocillo).
8) Añadir 100 µl de la solución sustrato. (No colocar la placa en exposición
directa a la luz solar). Se cubrirá con papel de aluminio.
9) Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.
10) Añadir 100 µl de la solución de parada.
11) Determinar la absorbancia de la placa a 450nm. (La Absorbancia se debe leer
en menos de cinco minutos después del paso 10).
Cuantificación de sHLA-I total en plasma
Las moléculas solubles HLA de tipo I totales se cuantificaron utilizando el
anticuerpo monoclonal W6/32 (8 µg/ml) como anticuerpo de captura. Como
muestras estandar se utilizó muestras de suero de nuestro laboratorio para calibrar
y calcular los datos de densidad optica
Realización de la técnica
1) Preparación del tampon carbonato a pH=9,5 Na2CO32H2O + NaHCO3 + NaN3
2) Tapizado de la placa con el anticuerpo W6/32 diluido 1/400 en el tampón
carbonato.
3) Incubar la placa a 4º C overnight.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
74
4) Añadir BSA (2-3%) e incubar durante 1 hora a 37º C en agitador de placas.
5) Lavar los pocillos 3 veces con solución de lavado (0.35 ml por pocillo).
6) Añadir las muestras de plasma (100µ) Incubar la placa a temperatura ambiente
(24°C) durante una hora en un agitador de microplacas.
7) Lavar los pocillos 3 veces con solución de lavado (0.35 ml por pocillo).
8) Añadir Ac 2º conejo anti human β2-microglobulina e incubar durante 1 hora a
temperatura ambiente en agitación.
9) Lavar los pocillos 3 veces con solución de lavado (0.35 ml por pocillo).
10) Incubar 30 min con el amplificador DAKO Envision System HRP rabbit
11) Lavar los pocillos 3 veces con solución de lavado (0.35 ml por pocillo).
12) Revelamos con sustrato cromógeno orthofenilenediamina (Sigma, St Louis,
MO, USA) y 8µl H2O2 30%, durante 20 min en la oscuridad.
13) Añadir solución de Parada H2SO4 3M
14) Determinar la absorbancia de la placa a 492 nm.
Estudio del polimorfismo 14-bp en el gen HLA-G
Para estudiar el polimorfismo de la inserción/deleción de 14-bp en el exón 8 del
gen de HLA-G. se extrajo el ADN de PMBC de pacientes celáicos y sanos que actúan
como control. Posteriomente se realizó una amplificación de este fragmento de ADN
mediante PCR. Los cebadores usados fueron el RHG4 5’-
GGAAGGAATGCAGTTCAGCATGA y el GE14HLAG 5’-
GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACC [Hviid et al, 2002] y se generaron fragmentos
de ADN de 224 y 210 bp dependiendo de si el individuo poseía o no la deleción de 14-
bp. las condiciones para la amplificación fueron las siguientes: desnaturalziación inicial
a 92ºC durante 5minutos, 30 ciclos de 92ºC durante 30 segundos, 64ºC durnate 1 minuto
y 72ºC durnate 2 minutos y APRA finalizar un paso final de elongación de 72ºC durnate
10 minutos. Se amplificaron 100ng de ADN genómico en 25ul que contenía dNTPs
0,2mM, MgCl2 1,5mM, cebadores a una concentración de 10pmol cada uno y 1 U de
Taq polimerasa. Los productos resultantes de esta amplificación fueron analizados pro
eelctroforesis en un gel de agarosa al 4% teñido con bromuro de etidio
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
75
III.6. ESTADISTICA
Los análisis estadísticos se realizaron mediante SPSS versión 12.0 software y
JMP IN Statistical software package (4.0.2 version. SAS Institute, Cary, NC, USA) para
entorno Windows. Se utilizó el test Kolmogorov-Smirnov para comprobar la
normalidad de las variables. En el caso de variables con distribución normal se
compararon mediante el test T de Student cuando estaban reunidas en dos grupos, en el
caso de más de dos grupos se utilizó el test ANOVA paramétrico. Cuando las muestras
no presentaron una distribución normal, las comparaciones se realizaron mediante el
test no paramétrico Mann-Whitney para dos grupos, si fue entre más grupos se utilizó el
test Kruskal-Wallis. Si el test ANOVA resultó significativo. Los valores de P < 0.05 se
consideraron significativos.
Muestras de sangre
Las muestras de sangre fueron recogidas y centrifugadas inmediatamente, el
suero fue almacenado a -20°C hasta que se realizaron las mediciones.
III.7. HPLC. Medición de triptófano, kinurenina y niveles de
kinurenina/triptófano
Los metabolitos del triptófano fueron determinados por Cromomatografía
líquida de alta calidad (HPLC). Brevemente, las muestras fueron desproteinizadas con
ácido tricloroacético y separadas en fase invertida con C18 usando material 0·015 M
de buffer de fosfato de potasio (pH 6·4). La fase mólvil fue de 15 mm ácido
acético/acetate de sodio (pH 4·0) conteniendo 27 ml/l de acetonitrilo. El triptófano fue
monitorizado por su fluerescencia native a 285 nm de excitación y 365 nm de
emisión. La kinurenina fue detectada por absorción UV a 360 nm de longitud de onda
en algunas series cromatográficas. Las concentraciones de triptófano y kinurenina
fueron estandarizadas por el peso húmedo de las muestras. La ratio
kinurenina/triptófano fue calculada dividiendo las concentraciones de kinurenina
(mmol) por las concentraciones de triptófano (mmol). La solución de Nitrotirosina
usada es standard. Fueron usadas tres muestras de plasma, cada una de las tres
diferentes concentraciones de mezcla standard. La mezcla de soluciones estándar,
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
76
conteniendo varias cantidades de cada una, fue preparada. La solución standard interna
y ácido perclórico fueron adicionadas a las soluciones standard, hasta asegurar que su
composición fue comparable con las muestras. Las curvas de Calibración fueron
preparadas desde areas de picos de cromatografía de las mezclas de solución standard.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
77
IV. Resultados
Los niños celiacos presentaron afectación del crecimiento, diarrea crónica,
distensión abdominal, anorexia o astenia. Los pesos y tallas medias de los sujetos con
EC no fueron significativamente diferentes de los de la población de referencia del
mismo sexo y edad (peso medio 13.43 + 6.14, talla media 90.79 + 20.05, edad media
3.74 + 3.07), y el índice de masa corporal (IMC) en los pacientes celiacos indicó bajo
peso para la edad con un IMC inferior al percentil 5. Hammer, L.1991 El diagnóstico de
EC se estableció por medio de tests serológicos de screening acompañados por biopsia
de intestino delgado y confirmación de una respuesta clínica a la eliminación del gluten
de la dieta. En nuestro estudio, la AGA IgA estuvo elevada en el 83 % de los casos; los
anticuerpos antiendomisio (EMAs) fueron elevados en el 79 % de este grupo de niños.
No hubo pacientes con déficit de Ig A.
Las características demográficas, clínicas e inmunológicas de los pacientes con
enfermedad celiaca son presentadas en la tabla1
TABLA 3. Datos pacientes
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
78
Considerados en conjunto, hubo un 29 % de niños en los que se encontraron
otros problemas médicos potencialmente relacionados con el desarrollo de EC: tres
pacientes tenían trisomía 21, tres pacientes tiroiditis autoinmune y otros tres pacientes
alergia. Nueve de los 24 pacientes (37.5 %) tuvieron una historia familiar de EC en
familiares de primer grado.
Los casos con histología positiva fueron definidos como aquellos que cumplían
los criterios de Marsh tipo I-IV. Marsh clasificó el espectro de anomalías mucosas
vistas en la EC. El setenta y cinco por ciento de los pacientes celíacos tuvieron lesiones
Marsh 3, el 17 % de los pacientes tuvieron lesiones Marsh 2 y el 8 % de los pacientes
tuvo lesión Marsh 1. La EC activa fue confirmada en pacientes por análisis histológico
que demostró atrofia vellositaria, hiperplasia críptica y una aparente infiltración
linfocítica. La mucosa intestinal está ensanchada por incremento del número de células
linfoides tanto en el compartimento intraepitelial, en el cual hay un incremento de
células T, como en la lámina propia, la cual está ensanchada por linfocitos y células
plasmáticas. Las criptas intestinales están elongadas por un incremento de células
epiteliales en división, y los villi están acortados, debido a la rápida pérdida de células
epiteliales maduras del vértice de las vellosidades.
Tabla. 4 Clasificación de Marsh modificada: Tipo 0: Mucosa normal con menos de 40 LIE/100 células epiteliales (CE).Estado Preinfiltrativo Tipo 1: (Tipo Infiltrativo): Normal arquitectura de las vellosidades, normal altura de criptas y un aumento en el número de LIE hasta más de 40 LIE/100 CE. Incremento de linfocitos intraepiteliales Tipo 2: (Tipo Hiperplástico): Normal arquitectura vellositaria, aumento de LIE superior a 40 LIE/100 CE. Tipo 3: (Tipo Destructivo): Divido en tres subgrupos: 3.a. Caracterizado por aplanamiento moderado de vellosidades, incremento en tamaño de las criptas y aumento del número de LIE superior a 40/100 CE. Atrofia parcial vellositaria 3.b. Caracterizado por un marcado aplanamiento vellositario, aumento en el tamaño de las criptas y aumento en el número de LIE superior a 40 LIE/100 CE. Atrofia vellositaria subtotal 3.c. Caracterizado por aplanamiento total vellositario, aumento en el tamaño de las criptas y aumento en el número de LIE superior a 40 LIE/100 CE. Atrofia vellositaria total Tipo 4: (Muy rara, lesión hipoplástica) con aplanamiento de la mucosa con normal tamaño de criptas y normal cuantificación de LIE. Atrofia vellositataria total con hipoplasia de criptas
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
79
IV.1. DIAGNÓSTICO
IV.1.1. Análisis Serológicos e Histológicos
IV.1.1.a. Estudios Serológicos
Los anticuerpos Anti-gliadina de clase IgG (AGA IgG) estuvieron elevados (media: 84;
rango 40–200) en el 83% de pacientes con EC, los anticuerpos antiendomisio (EMA)
estuvieron elevados (media: 1/245, rango 1/80–1/360) en el 79% y los anticuerpos anti-
transglutaminase (tTG Ac) estuvieron elevados (media: 80; rango 30–165) en el 60%
de pacientes con EC. Ningún paciente tenía deficit de IgA.
IV.1.1.b. Biopsia de intestino delgado
Los pacientes con EC presentaban atrofia parcial o total de vellosidades con incremento
en el número de linfocitos intraepiteliales. Los casos con histología positiva fueron
clasificados considerando los criterios de Marsh (tipos I–IV). En el setenta y cinco por
ciento de enfermos celiacos se encontró que tenían lesiones grado III de Marsh (atrofia
parcial vellositaria), el 17% de pacientes tenía lesiones del grado II de Marsh
(hiperplasia de criptas con linfocitosis intraepitelial) y un 8% tenían lesiones de grado I
de Marsh (Infiltración linfocitaria con arquitectura normal).
La utilidad de los marcadores serológicos y genéticos de la enfermedad celiaca debe ser
siempre considerada en el contexto de la clínica, y teniendo a la biopsia intestinal como
la principal prueba diagnóstica. El estudio del HLA, permite seleccionar individuos de
alto riesgo entre familiares de celiacos, y entre pacientes con enfermedades asociadas
(diabetes mellitus, Síndrome de Down o algunas enfermedades autoinmunes, etc). Estos
casos con marcadores positivos, exigen mantener un grado de vigilancia mayor y un
seguimiento clínico y analítico periódico.
Los marcadores genéticos, son un criterio importante para dirigir el diagnóstico
diferencial ante la sospecha clínica, en especial cuando la biopsia o las pruebas
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
80
serológicas son poco claras.Tampoco hay que olvidar que el 30% de la población
general es portadora de estos alelos y, por lo tanto, no puede utilizarse como prueba
específica.
Estrategias de diagnóstico
Estrategia de pruebas para establecer el diagnóstico de enfermedad celiaca en
individuos sintomáticos previos a la dieta sin gluten (por descripción de síntomas
clínicos):
� Anticuerpos específicos asociados a la enfermedad celiaca
(excepto AGA). Resultados positivos o equívocos podrían
seguirse de una biopsia intestinal.
� Si la sospecha clínica para la enfermedad celiaca es fuerte o
existe una malabsorción franca, la biopsia intestinal debe ser
realizada sin tener en cuenta los resultados de las pruebas de
anticuerpos específicos para enfermedad celiaca.
� Cuando los anticuerpos específicos para la enfermedad celiaca
están ausentes, las pruebas de genética molecular: alelos HLA
asociados a la enfermedad celiaca pueden ayudar en descartar o
determinar la susceptibilidad para la enfermedad celiaca en el
resto de casos sospechosos de enfermedad celiaca.
� Un diagnóstico definitivo de enfermedad celiaca es realizado en
presencia de una biopsia de intestino delgado que demuestre las
alteraciones histológicas características y clínica y/o mejoría con
la dieta sin gluten; sin embargo, hay excepciones en aquellos
individuos con enteritis autolimitadas y esprue tropical que no
mejoran con una dieta sin gluten.
� Para los individuos en los que no se detectan los alelos HLA
asociados a la enfermedad celiaca en las pruebas de genética
molecular, es necesario examinar si esos síntomas pueden tener
causas alternativas.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
81
� Los Individuos que continúan teniendo síntomas después de la adherencia a la
dieta sin gluten es improbable que tengan enfermedad celiaca; las pruebas de
genética molecular para la enfermedad celiaca: Los alelos HLA pueden
permitir excluir la enfermedad celiaca en una proporción sustancial de tales
individuos. En estos individuos, hay que examinar causas alternativas.
� Si las pruebas de genética molecular detectan los alelos HLA asociados y el
grado de sospecha clínica es alto, el paciente puede someterse a dieta
(consistente en dieta con gluten por al menos un mes o hasta que aparezcan
síntomas) previos a la biopsia intestinal que confirme el diagnóstico.
� Si los individuos no desean introducir el gluten en su dieta por miedo a enfermar
y al daño intestinal, no es posible establecer un diagnóstico definitivo de
enfermedad celiaca. Para establecer el diagnóstico en estos individuos con
certeza y continuar con dieta sin gluten si se alivian los síntomas.
Estrategia Diagnóstica para establecer el diagnóstico de enfermedad celiaca en
individuos sintomáticos con anticuerpos específicos asociados a la enfermedad
celiaca ambiguos o en valor límite incluyendo la combinación de pruebas de tTG,
EMA, DGPs IgA e IgG, e IgA total, si no se ha hecho previamente:
� Para individuos que continúan teniendo valores límite o ambiguos en los
anticuerpos asociados a enfermedad celiaca, se recomiendan las pruebas de
genética molecular: HLA asociados a EC para excluir o determinar la
susceptibilidad para la enfermedad celiaca.
� La biopsia de intestino delgado se recomienda en aquellos individuos que
poseen los alelos HLA asociados a EC y tienen un alto grado de sospecha clínica
y está bien establecido el contenido en gluten de la dieta (el equivalente a una a
tres rebanadas de panal día durante tres meses o aparezcan los síntomas).
� El diagnóstico definitivo de enfermedad celiaca puede ser realizado en personas
que tienen una biopsia de intestino delgado positiva y clínica y/o mejoría
histológica con la dieta sin gluten.
Estrategia Diagnóstica en individuos sintomáticos que no han respondido a la dieta sin
gluten está indicado revisar los resultados de los anticuerpos específicos de la EC (si
están realizados) previos al inicio de la dieta sin gluten y revisar la biopsia original (si
realizada) por un patólogo experto en gastroenterología para confirmar el diagnóstico de
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
82
enfermedad celiaca. Si los resultados son negativos o no concluyentes, se recomienda lo
siguiente:
Pruebas de genética molecular: Alelos HLA para determinar la
susceptibilidad genética para la enfermedad celiaca.
� Investigación de otras causas de los síntomas además de la enfermedad celiaca.
� Consultar con un dietista experto para analizar posibles fuentes ocultas de gluten
y evaluar una posible intolerancia a la fructosa o fructosa, la cual puede
contribuir a una pobre respuesta a la dieta sin gluten.
� Si se sospecha esprue refractario , el seguimiento recomendado es:
� Valorar estudios inmunohistoquímicos para IELs anormales.
� Estudios para genes reparadores del receptor (TCR) de clones de los linfocitos
T.
� Valoración para el linfoma de células T, si está indicado (ver también Tipos de
enfermedad celiaca, Esprue Refractario/enfermedad celiaca)
� Estudios de imagen para las complicaciones benignas o malignas
Estrategia diagnóstica en familiares asintomáticos de individuos con enfermedad
celiaca que incluyen pruebas de genética molecular para determinar la ausencia de los
haplotipos HLA de susceptibilidad para la enfermedad celiaca:
� Los test de genética molecular que revelan los alelos HLA asociados a EC se
seguirán de anticuerpos específicos para la EC a intervalos de tres a cinco años.
o Se recomienda la biopsia de intestino delgado cuando los anticuerpos
asociados a la EC son positivos.
o El diagnóstico definitivo de enfermedad celiaca es realizado a personas
con biopsia positiva de intestino delgado y clínica y/o mejoría
histológica con la dieta sin gluten.
� Los test de genética molecular que no detectan los alelos HLA asociados a EC
excluyen esencialmente el diagnóstico de enfermedad celiaca. Se espera que
aproximadamente un tercio de los miembros de una familia estén en esta
categoría [Bonamico et al 2006]. No se recomienda un seguimiento clínico
especial.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
83
PREVALENCIA
En la actualidad, la forma clínica de presentación más frecuente de EC está
cambiando. En nuestra experiencia la EC es un trastorno muy frecuente, y son muchos
los individuos que tienen formas atípicas o silentes de la enfermedad, las cuales son
también las formas de presentación más prevalentes en nuestra población.
Verdaderamente hemos observado un porcentaje más elevado de pacientes que
asocian la molécula HLA-DQ8 en la EC (alrededor del 20%-25%) que han sido
descritos previamente en otros estudios, los cuales estiman que el porcentaje de
pacientes con HLA DQ8 se estiman sobre el 10% [Tighe, MR.1992]. Además, los
pacientes con EC Y HLA-DQ8 se asocian frecuentemente con síntomas de
presentación extraintestinales y están frecuentemente asociados con otras enfermedades
autoinmunes.
LINFOCITOS INTRAEPITELIALES, CD3, CD4 Y CD8
En la biopsias intestinales de pacientes celíacos encontramos células CD4+, CD8+ y
CD3+. Mediante anticuerpos unidos a fluorescencia que reconocen esos tipos de células
T observamos que esas células T se localizaban a nivel de la lámina propia de la mucosa
intestinal. No encontramos en ningún caso células positivas en la capa epitetelial. En
contramos mayor porcentaje de células CD4+
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
84
Figura 9. Expresión CD4+ en lámina propia en biopsia de celíacos
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
85
Figura 10. Expresión CD3+ en lámina propia en biopsia de celíacos
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
86
Figura 11. Expresión CD8+ en lámina propia en biopsia de celíacos
IV.1.2. EXPRESIÓN DE HLA-G EN BIOPSIA INTESTINAL
Se analizó la expresión del antígeno HLA-G en las biopsias de pacientes
celíacos activos. Nuestros resultados aportan la primera evidencia de expresión de
HLA-G en pacientes celíacos. En efecto, todos los pacientes testados mostraron una
expresión positiva de HLA-G con diferente grado de inmunoreacción, como se
demuestra por inmunohistoquímica usando el anticuerpo 5A6G7, el cual permite
discriminar entre proteína de sHLA-G y las formas de HLA-G unidos a la membrana.
Nuestros resultados no demostraron la expresión de HLA-G de superficie en la EC.
Curiosamente, sólo detectamos la presencia de isoformas de sHLA-G y no las formas de
HLA-G unidas a la membrana, como lo demuestra el hecho de no hallar
inmunorreactividad cuando se usó el anticuerpo que reconoce las formas de HLA-G
unidas a membrana.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
87
Figura 12. Expresión HLA-G a nivel de las criptas de Lieberhün en
biopsia de celíacos
Figura 13. Expresión HLA-G a nivel epitelio de la mucosa en biopsia de celiacos.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
88
IV.1.3. Resultados de ELISA
A la vista de los resultados anteriores, decidimos seguir analizando el sHLA-G
en suero de pacientes celiacos y no celiacos mediante ELISA. Establecimos los
siguientes grupos de pacientes para el análisis ELISA: pacientes celiacos con otras
enfermedades asociadas, como síndrome de Down o tiroiditis autoinmune (EC1, n=7);
pacientes celiacos con transgresiones dietéticas (EC2, n=7) y pacientes celiacos con
dieta exenta de gluten con más de 5 años sin transgresiones (EC3, n=7) y pacientes no
celiacos (C, n=9).
Los niveles de sHLA-G en suero fueron mas altos en los pacientes del grupo
EC1 (400 Uml-1 + 50), el grupo 2 de pacientes celiacos (EC2) presentó valores medios
de sHLA-G (55,52 Uml-1 + 12,5) y el grupo 3 de pacientes celiacos (EC3) niveles bajos
o muy bajos de sHLA-G ( < 10,5 Uml-1 + 2,5). Por lo tanto, los resultados en los
pacientes del grupo EC3 probablemente fueron debidos a la larga duración de la dieta
exenta de gluten. El grupo C presentó muy bajos niveles de sHLA-G (1,5 Uml-1 + 0,3).
Hubo diferencias significativas entre los pacientes del grupo EC1 y los otros dos grupos
(EC2 y EC3), así como entre los pacientes del grupo EC1 y los pacientes no celiacos
(C) (Figura 2). Aunque sin significación estadística, hubo también diferencias entre los
pacientes del grupo EC2 y los pacientes no celiacos.
Es interesante señalar el comportamiento de uno de los pacientes (JP), padre de
un niño celiaco (MBP). Este paciente fue considerado como no celiaco, presentando una
biopsia normal y valores normales de los tests serológicos para anticuerpos
antiendomisio (EMAs) y tTG Ac. Sin embargo, el paciente presentó baja
inmunorreactividad para sHLA-G en la biopsia intestinal y valores positivos de sHLA-
G en suero (25 Uml-1).
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
89
Expresión sHLA-G en el suero de pacientes celíacos. Gráficos A y B
Hemos demostrado una asociación de EC con la expresión sHLA-G (Gráficos
Ay B) y hemos encontrado correlación entre el incremento de los niveles de la
expresión de sHLA-G y EC asociada con otras enfermedades autoinmunes, siendo
dependiente de una asociación genética con estas enfermedades a través de los genes
HLA
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
90
IV.1. 4. ESTUDIOS DE POLIMORFISMO 14-BP DEL GEN HLA-G
La enfermedad celiaca es el resultado de una respuesta inmunológica anómala frente a
al gluten mediada por linfocitos T y con base genética. La susceptibilidad genética a la
enfermedad celiaca ha sido asociada con heterodímeros DQ2 y DQ8 del antígeno HLA
tipo II, pero también está claro que otros genes dentro o fuera de la región HLA
parecen estar involucrados en el desarrollo de la enfermedad.
Hemos demostrado la presencia de niveles elevados de expresión de HLA-G en su
forma soluble (sHLA-G) en biopsias intestinales y en plasma de pacientes celiacos. Los
niveles más elevados de sHLA-G se detectaron en aquellos pacientes celiacos que
presentaban otras enfermedades asociadas de naturaleza genética o autoinmune, tales
como, síndrome de Down y tiroiditis autoinmune. Dada la gran variabilidad
interindividual observada en los niveles de sHLA-G plasma´ticos, se analizó si existía
alguna relación entre dichos niveles plasmáticos y el polimorfismo 14-bp del gen HLA-
G. El objetivo de este estudio fue investigar la posible asociación del polimorfismo de
14 pb del gen HLA-G con la susceptibilidad a padecer enfermedad celíaca y determinar
si este polimorfismo influye en la estabilidad del ARNm y en la expresión proteica de
HLA-G
En nuestro estudio hemos evaluado el polimorfismo de HLA-G en pacientes pediátricos
con enfermedad celiaca, diagnosticados con los criterios estándar. Se estudiaron 40
pacientes celiacos y 42 pacientes sanos, utilizados como control. Los polimorfismos se
definieron mediante PCR, calculándose posteriormente las frecuencias genotípicas y
alélicas.
Los pacientes se clasificaron según presentaran o no la inserción/deleción de 14 pares
de bases en el exon 8 del extremo 3’ del gen HLA-G, definiéndose los siguientes
genotipos:
1) homocigoto negativo (-14/-14pb)
2) heterocigoto (+14/-14pb)
3) homocigoto positivo (+14/+14-pb).
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
91
Figura 14. Electroforesis en gel d eagarosa de los fragmentos del exón 8 del gen HLA-G
amlificados por PCR. El alelo -14 da lugar aun fragmento de 210bp mientras que el alelo +14
da lugar a un fragmento de 224bp
Se analizó inicialmente si las frecuencias alélicas para el polimorfismo de 14-bp en
nuestros pacientes se correspondían a las d euna población en equilibrio de Hardy-
Weinberg, y se observó que así era (x=) (Tabla 5)
Tabla 5 . Frecuencias Alélicas
Alelos HLA-G 14-pb Frecuencias celíacos Frecuencias controles
- 14 30 (54%) 32 (64%)
+ 14 26 (46%) 18 (36%)
Genotipo HLA-G 14-pb Frecuencias celíacos Frecuencias controles
-14 pb /-14 pb 9 (26%) 18 (50%)
-14 pb /+14 pb 21 (60%) 13 (42%)
+14 pb /+14 pb 5 (14 %) 2 (8%)
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
92
En nuestro estudio, hemos observado que hay diferencias significativas en las
frecuencias genotípicas entre la población control y la población de enfermos celiacos
para el polimorfismo de HLA-G. También se detecta una relación entre el polimorfismo
de HLA-G y los niveles plasmáticos de HLA-G. En este sentido, los mayores niveles de
expresión de sHLA-G se presentan en aquellos pacientes celiacos que tienen el genotipo
-14/-14pb. Por el contrario, los niveles mas bajos de sHLA-G, se encontraron en
aquellos pacientes celiacos que presentaban el genotipo +14/+14pb, indicando que
podría existir un efecto dominante del alelo +14pb en reducir la estabilidad del ARNm
y la producción proteica de HLA-G. Consecuentemente, este estudio muestra por una
parte, que el polimorfismo de 14pb del gen HLA-G influye en la expresión de sHLA en
enfermos celiacos, y por otra parte nuestros resultados sugieren que el polimorfismo de
14pb del gen HLA-G tiene influencia sobre la susceptibilidad para desarrollar la
enfermedad celiaca y puede ser un marcador genético a considerar.
Figura 15. Niveles plasmáticos de sHLA-G en relación con el polimorfismo 14-
bp del gen HLA-G
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
93
V.1.5. EXPRESIÓN DE CITOQUINAS
Incremento de TGF-b, IL-10 y expresión IFN-γ en la lamina propia de
pacientes celiacos
También hemos encontrado en los pacientes con EC un incremento de los
niveles de citoquinas antiinflamatorias IL-10 y TGF-beta a nivel de la lámina propia en
muestras de biopsias de pacientes con atrofia intestinal e incremento del infiltrado de
linfocitos intraepiteliales (Figura 1B y C). Hemos determinado la producción de IL-10
en pacientes con EC. La inmunohistoquímica para IL-10 fue realizada en tejidos fijados
con formalina y la inmunorreactividad fue determinada de forma semicuantitativa. En
los pacientes celiacos observamos una intensa inmunorreactividad a IL-10 en la lámina
propia (Figura 3). Esta citoquina fue expresada principalmente en áreas de infiltración
por células inflamatorias.
La expression celular de TGF-b fue detectada en muestras de lámina propia de
enfermos con EC. Encontramos una fuerte inmunoreactividad, con un alto número de
células etiquetadas intensamente marcadas (Fig. 1a). En suma, la inmunoreactividad de
la IL-10 fue particularmente fuerte en la lámina propia de pacientes celiacos (Fig. 1b).
La alta expresión de TGF-b y IL-10 fue encontrada principalmente en áreas infiltradas
por células inflamatorias.
Finalmente, la producción de IFN-g en pacientes con EC esta también incrementada
(Fig. 1c), con una fuerte inmunoreactividad a nivel de la lámina propia.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
94
Figura 16. Expresión de IL-10 a nivel de lámina propia en biopsia celiacos.
Figura 17. Expresión de TGF-beta a nivel de lámina propia en biopsia celiacos.
-
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
95
Figura 18. Nivel de expresión de IFN-gamma en
IV.1.6. INCREMENTO DE IL-17, IL-22 e IL-23
Examinamos los cortes y encontramos que hay un incremento en la expresión de IL-17
e IL-22 en las muestras de pacientes celíacos en comparación con pacientes control. La
expresión de estas citoquinas se localizaba en las células presentes en la lámina propia
de la mucosa intestinal y también en la submucosa. Nuestros resultados parecen indicar
que ambos subconjuntos de células, las CD8 y CD4 probablemente contribuyen a la
respuesta inmune, ya que ambos tendrían la capacidad de producir IL-17 y están
presentes en cantidades significativas en la infiltración a nivel de la mucosa intestinal.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
96
Figura19. Expresión de Il-17 en la lámina propia en biopsias de pacientes celíacos
Figura 20. Expresión de IL-22 en la lámina propia en biopsias de pacientes celíacos
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
97
Mediante las técnicas de ELISA analizamos los niveles serológicos de IL-23 en
pacientes celiacos. En nuestro análisis encotramos un fuerte incremento que alcanzó
significación estadística en los nivéles séricos de IL-23 en celiacos en comparación con
los pacientes controles.
Figura 21. Expresión sérica de IL-23 en pacientes celíacos
IV.1.7. EXPRESIÓN IDO EN PACIENTES CELIACOS
Definir cual es el tipo de célula que expresa IDO, su mejor localización,
determinar la tinción inmunohistoquímica para IDO en secciones de intestino delgado
de pacientes celiacos. La expresión de IDO fue localizada en la lámina propia y en la
capa epitelial (Fig. 1d). Las células que expresan IDO muestran una morfología típica
inflamatoria de mononucleares y células dendríticas en la lámina propia. Además, en la
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
98
capa epitelial la inmunorreactividad fue menos intensa a la presentada en las células
caracterizadas por una morfología linfoide-like. Un isotipo- negativo para la tinción
control fue siempre considerado.
De otro modo, la expresión IDO fue también encontrada en biopsias de pacientes con
enfermedad de Crohn en la lámina propia y en la capa epitelial. En controles sanos
pudimos detectar solo unos pocos casos de expresión IDO en células de la lámina
propia .
Figura 22. Expresión de IDO a nivel de lámina propia en biopsia celiacos.
IV.1.8. CONCENTRACIÓN DE TRIPTOFANO Y KINURENINA Y COCIENTE K/T
La Kinurenina, representa el primer producto del catabolismo del triptófano, fue
significativamente más alta en muestras de suero de pacientes con EC (4·2 mmol/l _
0·27) que en el suero de controles sanos (2·6 mmol/l _ 0·54, P < 0·0024) (Fig. 2a). Los
niveles de kinurenina fueron más elevados en pacientes celiacos que otras enfermedades
como síndrome de Down o tiroiditis autoimmune.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
99
De forma similar, la ratio entre kinurenina y triptófano (¥100) fue más alta en
muestras de pacientes con EC (11·5 mmol/ l _ 1·01 versus 6·5 mmol/l _ 1·57, P <
0·0072, pacientes con EC y controles, respectivamente) (Figuras Ay B). La
concentración de triptófano en el suero de pacientes con EC fue más baja que en los
individuos sanos (Figura C).
Curiosamente, las concentraciones de kinurenina (4·2 mmol/l _ 0·27 versus 4·9
mmol/l _ 0·44, P < 0·17), triptófano (35·8 mmol/l _ 1·3 + 33·7 mmol/l _ 2·01, P < 0·4,
EC y C), y kinurenina/triptófano ratio ¥ 100 (11·5 mmol/l _ 1·01 versus 14·6 mmol/l _
1·4, P < 0·13) no presentan diferencias significativas entre EC y enfermedad de Chrohn
respectivamente (Fig. A, B, C).
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
100
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
101
Hemos detectado un incremento de kinurenina (4·2 mmol/l _ 0·27 versus 2·6
mmol/l _ 0·54, P < 0002) y de la ratio kinurenina/triptofano en muestras de pacientes
celiacos (11·5 mmol/l _ 1·01 versus 6·5 mmol/l _ 1·57, P < 0005) en comparación con
los sujetos sanos, respectivamente, y no hemos encontrado diferencias con los
pacientes con enfermedad de Crohn. Los análisis de Immunohistoquímica de las
muestras de biopsias intestinales de los pacientes celiacos mostraron un incremento de
la expresión de IDO, interferon-gamma, interleukina-10 y Factor beta de crecimiento
transformante. Nuestros datos sugieren que los mecanismos dependientes del
catabolismo del triptófano pueden regular la respuesta inmune en la EC.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
102
V. DISCUSIÓN
V.1. DIAGNÓSTICO Y PREVALENCIA Creemos que los criterios diagnósticos actuales para la EC deben ser revisados, ya que a
menudo el diagnóstico de EC permanece oculto porque muchos individuos no presentan
los síntomas gastrointestinales clásicos de la enfermedad. De hecho, el porcentaje de
población infradiagnosticada está incrementándose de manera clara, y los riesgos y
complicaciones significativos que se asocian con la EC no tratada. (Tabla 1). Es un
trastorno multifactorial, la EC puede presentarse con una gran diversidad de
manifestaciones clínicas.
Los pacientes con EC típicamente desarrollan síntomas extraintestinales (no
clásicos) con ausencia de síntomas gastrointestinales tales como diarrea, dolor
abdominal, distensión abdominal o pérdida de peso.
En nuestra población pediátrica, los síntomas no clásicos son a menudo los más
frecuentes como formas de presentación de los casos nuevamente diagnosticados de EC.
Estos incluyen alopecia autoimmune, deficiencia de hierro o niveles elevados de
transaminasas y que a menudo puede ser la única manifestación de la EC en un
individuo afectado En nuestra experiencia, la biopsia de intestino Delgado es crucial
para el diagnóstico de pacientes con serología negativa para EC y con HLA compatible
para esta enfermedad. Aunque consideramos la biopsia intestinal como el ”gold
standard” para el diagnóstico de EC, en ocasiones el permiso para la biopsia intestinal
es rechazado. Tanto los test serológicos como genéticos son necesarios para seleccionar
los sujetos que necesitan biopsia.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
103
La EC es más común en ciertos grupos de riesgo. Familiares de primer grado de
pacientes celiacos representan el grupo de estudio más importante. La determinación de
HLA es el primer escalón útil que podría excluir aproximadamente un tercio de los
familiares de primer grado de enfermos con EC. Nosotros encontramos una alta
prevalencia de EC entre familiares y el mayor porcentaje fue observado entre las hijas.
Los familiares de enfermos con EC son una población de riesgo para el desarrollo de
intolerancia al gluten y proponemos que un extenso estudio de tales grupos pueda ser
emprendido. Es digno de mención que después del primer diagnóstico de EC, la familia
estará más concienciada en el reconocimiento precoz de los síntomas relacionados con
la enfermedad.
El primer escalón en el diagnóstico de la EC son los test serológicos. Los
mejores test disponibles son los que usan anticuerpos de clase (IgA) antihumanos anti
transglutaminasa tisular (tTG) y anticuerpos IgA antiendomisio por inmunofluorescence
(EMA) por su extremadamente alta especificad y sensibilidad. No obstante, la
confirmación histológica de los cambios característicos del intestino delgado, (atrofia
intestinal, hiperplasia de criptas y linfocitosis intraepitelial) son considerados esenciales
para el diagnóstico de EC.
Los patólogos suelen usar los Criterios de Marsh’s modificados para clasificar el grado
de atrofia vellositaria necesario para confirmar el diagnóstico de EC. En el dinámico
proceso de desarrollo de las lesiones asociado con las manifestaciones clínicas, el
incremento de IELs y la hiperplasia de criptas son el primer cambio en la arquitectura,
mientras que en la presencia de altos grados de alteración histológica (tipos 3a-3b-3c de
la clasificación de Marsh’s) con incremento de IEL e hiperplasia de criptas se asocian
siempre a atrofia vellositaria. [Collin, P. 2005]
V.2. TOLERANCIA
El sistema inmunológico del intestino se expone a una amplia variedad de antígenos
derivados de los alimentos, las bacterias residentes e invadiendo microorganismos. La
tolerancia oral es una condición fisiológica caracterizada por la inducción de la falta de
respuesta inmune intestinal hacia antígenos alimentarios y de bacterias de la flora
intestinal. Múltiples mecanismos celulares y moleculares están implicados en la
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
104
regulación de esta propiedad fundamental de del sistema inmune intestinal [Rouas
Freiss et al, 2000].
El gluten es el alimento más común en la enteropatía sensible en los seres humanos y es
causada por la falta de tolerancia inmunológica (por vía oral de tolerancia) de gluten de
trigo y las fracciones de prolamina el centeno y la cebada. Muchos de los diferentes
péptidos del gluten reconocidos por las células T intestinales han sido identificados
[Kim, CH-Y, et al 2004].
La activación por parte del gluten de estas células T reactivas representa un
acontecimiento clave en la patogénesis de la enfermedad celíaca [Sollid, L. M. 2002.,
Alaedini, A.2005]. La mucosa intestinal de los pacientes con celiaquía se caracteriza por
presentar una proporción alta de células T intraepiteliales (γδ IEL) [Leon F, et al.2005].
El gluten ingerido, agente desencadenante de la enfermedad, puede cruzar la barrera
epitelial y obtener una respuesta inmune mediada por linfocitos T reactivos. Las células
dendríticas se supone que desempeñan un papel fundamental en la conformación de la
respuesta inmunitaria [Steinman RM, 2000].
Las células dendríticas inmaduras se caracterizan por presentar niveles bajos de
expresión de MHC de clase II y moléculas co-estimuladoras que pueden mediar en la
tolerancia, por inducción de la células T reguladoras (células Treg). Por otra parte, la
IL-10 liberada por las células Treg puede modular la función de las células dendríticas
inmaduras e inhibir su diferenciación. Las células dendríticas moduladas por IL-10
inducen a las células T efectoras (anergia) a través de mecanismos que requieren
contacto célula-célula. Por lo tanto, la dirección de la respuesta inmune o la tolerancia
hacia la inmunidad depende de la etapa de maduración y las propiedades funcionales de
las células dendríticas. Péptidos de la gliadina puede contribuir mediante la inducción
de células dendríticas fenotípicas y funcionalmente maduras, dando lugar a un proceso
de presentación de péptidos de la gliadina a células T específicas.
La adquisición de la respuesta inmune innata implica a los linfocitos T helper CD4+
descritos en la enfermedad celíaca, una respuesta innata implica a los linfocitos T
intraepiteliales CD8+ citotóxicos (IELs) que ejercen un papel en la patogénesis de la
enfermedad celiaca.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
105
En el intestino, la tTG desamina la gliadina, introduciendo cargas negativas en
los péptidos del gluten. Ambas proteínas DQ2 y DQ8, situadas en la superficie de las
células presentadoras de antígeno (APCs) de la lamina propia, unen preferentemente
estos péptidos del gluten desaminados cargados negativamente. Las células T- helper
(con marcador de superficie CD4 positivo) son activadas tras el reconocimiento de
péptidos de gluten desaminados unidos a DQ2 o DQ8 en las APCs y producen
citoquinas como el interferon gamma (IFN-γ).
La respuesta inflamatoria resulta en la liberación de citoquinas adicionales y sustancias
químicas importantes que conducen al daño y atrofia vellositaria. Como repuesta a la
inflamación, las células plasmáticas en el tejido intestinal inflamado liberan anticuerpos,
incluyendo anticuerpos antigliadina, antiendomisio y anticuerpos autoinmunes contra
la tTG. [Treem 2004, Alaedini & Green 2005, Sollid & Lie 2005].
V.3. LINFOCITOS
En nuestro estudio hemos encontrado células T CD3 positivas, células T CD4 positivas
y células T CD8-positivos presentes en las biopsias de la mucosa intestinal de los
pacientes celíacos a nivel de la lámina propia. La mayor expresión se correspondía con
células T CD4 y CD3 positivas. Estos datos sugieren que las células CD4 y CD3
desempeñan el papel fundamental en la enfermedad celíaca.
Estudios de Inmunohistoquímica mediante la determinación de niveles de mRNA han
encontrado niveles superiores de INF-γ en pacientes celiacos que reciben gluten en
contraste con controles sanos, El interfero liberado puede incrementar la permeabilidad
epitelial y la producción de citoquinas proinflamatorias durante la infección
incrementando la expresión de péptidos de gluten unidos al DQ2 y DQ8 de las APC de
la mucosa facilitando la activación de células inmunes e inflamatorias adicionales,
facilitando la respuesta patológica de los péptidos del gluten.
V.4. CITOQUINAS
la inflamación presente en la enfermedad celíaca es mediada por citoquinas pro- y
contra-inflamatorias. Las células T CD4 se han subdividido en diversas sub-poblaciones
en gran parte en base a las citoquinas que producen. Estas sub-poblaciones incluyen
células Th1, Th2 y las células T reguladoras. Las células Th1 inducen la producción de
IFN-gamma y TGF-beta, las cuales estimulan la producción de citoquinas pro-
inflamatorias e induce la inmunidad celular. Otra población de células T se ha descrito,
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
106
las Th17, que se caracterizan por la producción de IL-17. Estas células desempeñan un
papel primordial en la inflamación y en la autoinmunidad.Las células Th17 pueden
promover respuestas protectoras o patogénicas dpendiendo de que otros fáctores
adicionales estén presentes. Los mecanismos que regulan la respuesta de las células
Th17 aún no se conocen.
El desarrollo de las células Th17 es promovido por otras citoquinas como la IL-23 y
TGF-beta en presencia de IL-6. La IL-23 y la IL-17 constituyen un nuevo eje via
formación de células Th17 en la patogénesis de enfermedades inflamatorias y
autoinmunes. En las biopsias intestinales de los pacientes celíacos se observó una alta
expresión de IL-17 en las células de la lámina propia y también nos encontramos
expresión a nivel de la capa epitelial. Células Th17 ahora se sabe que desempeñan un
papel importante en la patogénesis de la inflamación y enfermedades autoinmunes
[Ìwakura Y et al., 2006]. Selectivamente las células Th17 producen citoquinas
proinflamatorias, como IL-17 e IL-22. Células T CD4 + son los principales productores
de IL-17, pero además en CD8 + células T, neutrófilos y células NKT también producir
esta citocina. IL-17 produce células T CD4 + representa un nuevo subgrupo de
linfocitos T (células Th17), que son cruciales en la mediación de las respuestas
inflamatorias.
Otra citoquina producida por células Th17 es la IL-22, que pertenece a la misma familia
que la IL-10 expresandose en las células T activadas, las células Th1 y células NK. De
hecho, hemos encontrado una alta expresión de IL-22 en pacientes celíacos. Si bien es
claro que la IL-22 e IL-17 puede contribuir a la patogénesis de enfermedades
autoinmunes, también es notable que la IL-22 también tiene importantes efectos anti
inflamatorios. Nuestros datos indican un importante papel de las células Th17 en la
enfermedad celíaca. Estos hechos indican la complejidad de las células Th17, que
producen citoquinas múltiples y tienen diversas funciones durante la inflamación y su
importancia puede variar entre los diferentes enfermedades autoinmunes, como en la
enfermedad celíaca, que es una enfermedad inflamatoria inducida por células Th1/Th17.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
107
V.5. HLA-G
En este estudio, hemos demostrado una asociación de EC con la expresión de
HLA-G, IDO. Que conozcamos, este es el primer estudio que describe la expresión de
sHLA-G en muestras de biopsia y en suero de pacientes con EC. Por el contrario, no
hubo expresión de moléculas de HLA-G de membrana en pacientes celiacos. La falta de
expresión de HLA-G de membrana puede estar ligada a un proceso de regulación
específico en el engarce alternativo del HLA-G transcrito, lo cual puede favorecer la
selección de isoformas solubles.
Las propiedades inmunomoduladoras del sHLA-G justifican su potencial interés
en el control de enfermedades inflamatorias, como la EC. En este estudio, hemos
demostrado que el nivel plasmático de sHLA-G fue mas elevado en pacientes celiacos
con otras enfermedades asociadas, como síndrome de Down o tiroiditis autoinmune,
elevado o en niveles medios en pacientes celiacos con transgresiones dietéticas y bajo o
incluso en valores negativos en pacientes celiacos con mas de 5 años de dieta sin gluten
sin transgresiones. Hasta ahora, una dieta sin gluten es la única terapia que podemos
ofrecer a los pacientes celiacos. Además, a veces es difícil seguir una dieta
completamente exenta de gluten y algunos pacientes continuan tomando gluten en su
dieta. Como resultado de ello, en algunos individuos, la recuperación de la mucosa
intestinal se prolonga y puede tardar más de 18 meses. [Cataldo,F.2003]
Por otra parte, la EC puede definirse como “silente” en un sujeto aparentemente
sano. Muchos de ellos tienen una arquitectura de la mucosa intestinal normal o
minimamente anormal y no tienen el típico genotipo HLA predisponente (DQ2 o DQ8)
y también tienen negativos los anticuerpos AEMs y/o TTGAs. Curiosamente, en nuestro
estudio, un paciente silente fue positivo para la expresión de sHLA-G a nivel sérico y de
la mucosa. Aunque este resultado es preliminar y se requiere un elevado número de
casos, sugiere que la expresión de sHLA-G puede ser considerado como un marcador
útil de EC silente.
La prevalencia aumentada de enfermedades autoinmunes en pacientes celiacos,
incluyendo diabetes mellitus insulin-dependiente y enfermedades tiroideas
autoinmunes, ha sido ampliamente comunicada. [Troncone,R.2004] Nuestros resultados
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
108
muestran una correlación entre niveles incrementados de sHLA-G y EC asociada con
otras enfermedades autoinmunes. En consonancia con esto, la conexión entre EC y otros
desordenes autoinmunes puede depender de una vinculación genética de estas
patologías mediada por estos genes HLA.
La forma soluble de HLA-G es de especial interés porque su molécula juega un
importante papel en la inducción de la inmunotolerancia.[Rouas-Freiss,N.2000] Una
función inmunosupresora del HLA-G puede así contribuir al control de las actividades
CD4+ y CD8+, jugando como consecuencia de ello un importante papel en la inmunidad
adaptativa. [LeMaoult, J.,2004] En este sentido, sHLA-G tiene la función de inhibir la
proliferación de células T activadas, e inducir apoptosis dosis dependiente de las células
T, reforzando el papel inmuno inhibitorio del sHLA-G que puede ser secretado en la EC
como parte de un mecanismo de restauración del proceso de la tolerancia a antígenos
orales. Respecto a la respuesta adaptativa en EC, una poderosa respuesta
antiinflamatoria a la gliadina puede ocurrir durante el desarrollo de la enfermedad. En
pacientes celiacos, se ha visto que el aporte de gluten causa una sobrerreacción de
linfocitos T intraepiteliales, con producción incontrolada de HLA-G e IL-10. Esto puede
causar reclutamiento de linfocitos intraepiteliales, llevando a un círculo vicioso con
actividad inmune amplificada y mantenimiento de lesiones intestinales.
Las citoquinas, pueden jugar importantes papeles en la inducción de la expresión
de HLA-G. De hecho, se ha demostrado que la IL-10, favorece la expresión de HLA-G.
[Urosevic,M.2002] Por lo tanto, no podemos descartar que en situaciones
particularmente estimulatorias, las citoquinas secretadas induzcan la expresión de
HLA-G. Aquí, consideramos la posibilidad de que la producción de sHLA-G es
afectada por citoquinas secretadas por macrófagos. Los macrófagos pueden controlar la
respuesta inmune secretando citoquinas antinflamatorias como la IL-10. El papel de la
IL-10 en la inducción de la expresión de la proteína HLA ha sido ya demostrada en
monocitos y en células trofoblásticas purificadas. [Moreau,P.1999] Además, se ha
demostrado una asociación entre IL-10 y expresión de HLA-G en linfomas cutáneos y
en colitis ulcerosa.[Torres,MI.2004]
En conclusión, el mayor incremento en la expresión de sHLA-G en la EC podría
ser debido a que es parte de un mecanismo para tratar de restaurar el proceso de
tolerancia a antígenos orales en una enfermedad causada por la pérdida de tolerancia a
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
109
antígenos dietéticos. Una potente respuesta antiinflamatoria a la gliadina podría ocurrir
durante el desarrollo de la enfermedad con una producción incontrolada de HLA-G e
IL-10 que contrarrestan la inflamación y/o puede causar reclutamiento de linfocitos
intraepiteliales, manteniendo las lesiones intestinales. Además, la expresión de sHLA-G
puede convertirse en un parámetro inmunohistológico para el diagnóstico de EC. Esto
tiene una importante relevancia en pacientes con síntomas típicos o no clásicos, incluso
clínicamente silentes, que permanecen sin diagnosticar y expuestos al riesgo de
complicaciones a largo plazo aunque no muestren manifestaciones clínicas de EC.
Pensamos que el aumento en la expresión del sHLA-G encontrado en la EC
puede ser parte de un mecanismo para restablecer la tolerancia al gluten. HLA-G puede
actuar a través de receptores inhibitorios (ILT) cuya interacción puede conducir al
desarrollo de células dendríticas tolerogénicas con la inducción de anergia y células T
inmunosupresoras, y/o detener la maduración/activación de las células dendríticas. La
expresion de estos receptores ILT en las células dendríticas esta fuertemente controlada
por estímulos inflamatorios y por citoquinas. Así, una poderosa respuesta
antiinflamatoria hacia la gliadina puede ocurrir durante el desarrollo de esta enfermedad
con producción incontrolada de HLA-G y citoquinas antiinflamatorias, tales como IL-
10 y TGF-beta, las cuales contrarrestan la inflamación y/o pueden causar reclutamiento
de linfocitos intraepiteliales, manteniendo las lesiones intestinales presentes en la EC.
V.6. POLIMORFISMO HLA-G
En contraste con el extensivo polimorfismo de los genes clase I clásicos del HLA, se ha
considerado bajo el grado de polimorfismo en el locus del HLA-G presentando una
l imitada heterogeneidad de secuencias y con pocos alelos descritos ()
Existe una gran variablidad interindividual en los niveles de sHLA-G plasmático de
pacientes celíacos. En este estudio intentamos averiguar si esta variabilidad pueden
deberse a las distintas variantes alélicas para el polimorfismo de 14-bp presente en el
gen HLA-G
Los resultados obtenidos en nuestro estudio mostró diferencias significativas en la
distribución del polimorfismo de HLA-G d 14-pb entre la enfermedad celíaca y los
sujetos sanos. Los alelos polimórficos el gen HLA-G muestran una deleción /
polimorfismo de inserción de una secuencia de 14 pares de bases (14bp) en el exón 8 en
la región 3' no traducida. Se ha asociado la presencia del alelo 14bp inserción (+14 pb) a
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
110
un ARN mensajero inestable y una menor producción de la proteína HLA-G, lo que
sugiere una habilidad diferente para contrarrestar la inflamación entre los distintos
genotipos. En nuestra población estudiada el alelo -14 tiene un carácter dominante y
está asociado a unos mayores niveles de HLA-G plasmático
V.7. EXPRESIÓN IDO Y METABOLISMO DEL TRIPTÓFANO
Este estudio proporciona la primera evidencia de que el enzima antiinflamatorio
IDO está altamente expresado en las biopsias intestinales de pacientes con EC. Además
este incremento en los niveles de IDO es resultado de una elevación en los niveles
séricos de kinurenina de pacientes con EC. La respuesta antiinflamatoria representada
en la EC puede ser el resultado de la vía de la kinurenina, la que intensificaría
potencialmente la inflamación.
En nuestro estudio, no ha sido posible establecer una correlación entre la
expresión IDO o los niveles de los metabolitos del triptófano con los diferentes grados
de de actividad inflamatoria en las biopsias de enfermos celiacos deacuerdo con la
clasificación de Marh’s. Los niveles más altos de kinurenina fueron encontrados en
pacientes con enfermedad celiaca con otra enfermedad asociada tales como síndrome de
Down o tiroiditis autoinmune, contribuyendo al daño. Nuestros datos presentados aquí
están en la línea de los descubrimientos de Wolf et al. [Wolf, AM.2004] quienes
describen una sobreespresión de IDO en otras enfermedades inflamatorias crónicas del
tracto grastrointestinal mediadas por un mecanismo Th1 tales como la enfermedad de
Crohn con un incremento en los niveles de kinurenina y con una alta relación
kynurenina/triptófano. Nosotros hipotetizamos un posible papel de la IDO en la
enfermedad celiaca y la enfermedad de Crohn, ya que ambas están caracterizadas por
una respuesta exagerada por células Th1. En nuestro estudio encontramos un
incremento de los niveles de IFN-gamma, que podría ser un potente inductor de la
expresión IDO en esta enfermedad. En este sentido, el estudio de Wolf et al. han
demostrado que el IFN-gamma y el TNF-alfa son potentes inductores de la expresión
IDO.
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
111
En suma, hemos encontrado un incremento en la expresión de IL-10 y TGF-beta.
Las células IDO-positivo pueden ejercer sus funciones reguladoras induciendo la
producción de estas dos citoquinas inmunosupresoras.
Una fuente importante de IL-10 y TGF-beta es la producida por los monocitos y
macrófagos y es una consecuencia del bajo efecto regulador en la inflamación. TGF-
beta está implicado en la regulación de la respuesta inmune y en la inflamación. Esta
citoquina es el principal factor para la producción de inmunoglobulina A (IgA) y actúa
como un potente mediador de la reparación tisular.[Hanson,T.2002] Interesantemente,
tTG, ha sido descrito como el principal autoantígeno hacia el que se dirigen los
anticuerpos antiendomisio en la EC, es necesario para la activación de TGF-b.[Cataldo,
F.2003] Los niveles elevados de IL-10 y TGF-b encontrados en pacientes con CD ,
aunque insuficiente para la total inhibición de la reacción autoinmune, podría modular
la respuesta inmune y es un efecto secundario que causa activación de los linfocitos B.
Igualmente, bajo condiciones inflamatorias tales como la EC, el incremento de la
expresión de IDO puede ayudar a reducir el riesgo de un exceso de respuesta a
autoantígenos. De hecho, un importante cuerpo de la evidencia lo soporta la hipótesis de
que las células regulan la expresión de IDO, la respuesta inflamatoria mediada por
células T, rechazo de trasplantes, embarazo y cáncer.[Mellor, A.L..2004]
Verdaderamente, recientes informes confirman que los metabolitos de la vía de la
kinerunina son activos en la supresión de la proliferación de las células T e inducción de
apoptosis.[Fallarino,F.2003]
Nosotros hemos demostrado que las moléculas supresoras como IDO y HLA-G
están expresadas en EC. La expresión de sHLA-G [Torres,MI.2006] en conjuncción con
un incremento de la expresión IDO en pacientes con EC podría ser una pieza esencial
del mecanismo para intentar restaurar la tolerancia hacia estímulos de la dieta. Así, el
incremento en la actividad IDO refleja un intento de control del estímulo crónico del
antígeno por down-regulation de las células T que median la reacción inmune. IDO y
HLA-G pueden cooperar en la supresión de la respuesta inmune en la EC activa.
Nuestros resultados están en la línea de los descubrimientos de [López AS et all ,2006]
quinenes demuestran que las moléculas supresoras IDO y HLA-G s son expresadas en
células dendríticas y estas moléculas pueden producir inmunosupresión . Queda por ser
investigado si la expresión IDO está aumentada o no en pacientes celiacos después de
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
112
una dieta sin gluten. En suma, nuestros datos sugieren que los mecanismos dependientes
de los mecanismos dependientes del metabolismo del triptófano que reponde
positivamente y puede regular la respuesta inmune en la EC.
El HLA-G y la IDO presentan propiedades comunes con respecto a la expresión,
función y regulación. De hecho, en humanos la expresión de IDO y HLA-G se ha
demostrado en placenta, en órganos trasplantados, y pueden ser expresadas
ectópicamente por tumores. [Uyttenhove C, 2003 & Rouas-Freiss N,2003] En estas
situaciones, tanto la IDO como el HLA-G tienen funciones comunes, ya que ambas
contribuyen al mantenimiento de la tolerancia materno-fetal, a la aceptación del
trasplante, así como al escape tumoral. [Urosevic M, et al.2002]
Como se ha descrito anteriormente, la enzima IDO inhibe la proliferación de las células
T. Así mismo, diversos estudios demuestran que el HLA-G presenta esta misma acción
por mecanismos diferentes. [Mellor A, et al. 2004] El HLA-G5 soluble inhibe la
proliferación de células T CD4+ alogénicas. Además, el HLA-G soluble inhibe la
proliferación de células T alogénicas inducidas por células dendríticas humanas sin
afectar a su diferenciación y maduración. Las células presentadoras de antígeno que
expresan HLA-G1 también son capaces de inhibir a las células T CD4+. Recientemente,
se ha demostrado que el HLA-G derivado de monocitos puede actuar como un potente
inhibidor de la activación de células T CD4+ autólogas y puede estar implicado en el
control de la activación de células T autoreactivas. Además, estas moléculas
inmunosupresoras pueden contribuir a la inducción de tolerancia en los órganos donde
migran las células tumorales y contribuir así a la aparición de metástasis y comprometer
la eficacia de ciertos citostáticos. Las estrategias de tratamiento tumoral se basan en
muchas ocasiones en el disparo de la respuesta inmunológica, y así favorecer la
actuación de los agentes quimioterapéuticos. De hecho, estudios recientes demuestran
que alguno de los tratamientos empleados en el cáncer colorrectal pueden estar
implicados en la neutralización de los efectos inmunosupresores del tumor.[Izcue A, et
al.2009]
Ambos mecanismos de supresión no actúan de forma independiente, sino que están
relacionados entre ellos, y probablemente con otros factores de supresión y activación.
De hecho, tanto la IDO como el HLA-G pueden ser estimulados por las mismas
moléculas, como el interferón y los metabolitos de la IDO pueden afectar a la expresión
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
113
de HLA-G.[ López AS, et al.2006] Otro factor implicado es el estado redox celular. De
hecho, la IDO puede ser regulada por el óxido nítrico y así se puede interferir en la
tolerancia inducida por IDO. Una producción mantenida del mismo disminuye el nivel
de IDO en líneas celulares de carcinoma de pulmón y carcinoma uroepitelial humano.
Cabe destacar el papel antioxidante de la IDO al usar como substrato al anión
superóxido o el de su metabolito 3-hidroxi-antranílico.
Hemos demostrado previamente que el HLA-G es expresado en pacientes con EC.
[Torres MI, 2006]. Un nuevo concepto ha emergido en EC, lo cual indica que el
aumento en la expresión de HLA-G llevando a unificar las propiedades reguladoras.
Una respuesta inflamatoria potente hacia la gliadina puede ocurrir durante el desarrollo
de esta enfermedad, junto con una incontrolada producción de HLA-G. En
consecuencia, puede ocurrir un reclutamiento de linfocitos intraepiteliales manteniendo
algunas de las propiedades de IDO y HLA-G: ambas tienen capacidad tolerogénica y
son altamente expresadas en la placenta humana [Honing, A. 2004 & Rouas-
Freiss,N.1997] y en tumores y su expresión puede ser regulada por algunas citoquinas
(IFN-γ, IL-10). [Moreau,P.1999]
Los mecanismos dependientes del metabolismo del triptófano pueden estar implicados
en la regulación de la respuesta inmune en la EC. Además, hemos demostrado que los
niveles de triptófano y kinurenina en el suero de enfermos celiacos, es una buena
determinación analítica de los niveles de IDO en estos pacientes.
V.8. FUTURAS DIRECCIONES
Hay muchas preguntas sin respuesta a cerca de la EC. Cómo se rompe la
tolerancia oral. Restaurando la tolerancia inmunológica al gluten podría representar el
tratamiento ideal de esta enfermedad. Sin embargo, si las células T específicas para el
gluten pudieran ser inactivadas o suprimidas, la tolerancia al gluten podría ser restituida.
¿Cual es el significado del amplio número casos no diagnosticados actualmente con esta
enfermedad? ¿Cuál es el significado del incremento en el número de personas con
síntomas extraintestinales o sín síntomas clásicos de la EC? Nosotros hemos anticipado
que el ritmo de diagnóstico continuará ascendiendo, ello podría ser importante en el
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
114
futuro de nuestro entendimiento de la patogénesis de la EC y mejorar su diagnóstico
(Tabla 3). La diversidad en la presentación clínica de la EC puede complicar el
diagnóstico y retrasar el inicio del tratamiento. En nuestra experiencia, el test
diagnóstico más importante para la EC es “la sospecha de la enfermedad”. El screening
de la EC debe comenzar con un test serológico (para anticuerpos antiendomisio de clase
IgA e IgG y anti-tTG anticuerpos), y tipificación HLA. Si los pacientes genéticamente
compatibles con esta enfermedad (igual con serología negativa) deben realizarse
precozmente una biopsia intestinal con endoscopia, se han realizado muchos esfuerzos
para identificar los factores de riesgo que presdisponen a EC. La carencia de tolerancia
inmune (Tolerancia oral) en la EC puede ocurrir debido a los polimorfismos de algunas
moléculas del sistema MHC implicadas en la inducción, regulación o expresión de la
respuesta inmune de la mucosa, tales como la IL-10 , TGF-beta, IFN-gamma. Muchos
de estos polimorfismos afectan genes de transcripción influenciando la susceptibilidad
individual para la EC. En suma, diversas asociaciones entre diferentes genes
polimórficos localizados en la región MHC han sido informados. Además, hemos
encontrado evidencia de que HLA-G es un gen interesante candidato en la EC. Estos
descubrimientos pueden abrir nuevas perspectivas en la identificación genética para la
EC.
º
Tabla 19. Futuras direcciones en la Enfermedad Celia ca
Preguntas sin respuesta
Inmunopatogénesis ¿Cómo se rompe la tolerancia oral? Células T específicas al gluten Diagnóstico ¿Cuál es el significado del amplio número de personas sin diagnosticar con esta enfermedad? ¿Cuál es el significado del incremento en el número de personas con síntomas extraintestinales o sin síntomas clásicos en la EC? Genética Identificar los factores de riesgo genéticos que predisponen a EC
Direcciones Futuras
Restaurando la tolerancia inmunológica al gluten podría representar la cura ideal para la EC. Células T gluten-específicas podrían ser inactivadas o suprimidas, podria restaurarse la tolerancia al gluten. La relación de diagnósticos podría continuar con un mejor diagnóstico. “La sospecha de la enfermedad” Genes polimórficos localizados en la región MHC y EC polimorfismos genéticos de citoquinas que pueden influenciar el riesgo de EC asociando polimorfismos con marcadores serológicos de polimorfismos de HLA-G
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
115
VI. CONCLUSIONES
1) El primer escalón en el diagnóstico de la EC son los test serológicos. Los
mejores test disponibles son los que usan anticuerpos de clase (IgA)
antihumanos anti transglutaminasa tisular (tTG) y anticuerpos IgA
antiendomisio por inmunofluorescence (EMA) por su extremadamente alta
especificad y sensibilidad. No obstante, la confirmación histológica de los
cambios característicos del intestino delgado (atrofia intestinal, hiperplasia de
criptas y linfocitosis intraepitelial) y el tipaje HLA son considerados esenciales
para el diagnóstico de EC.
2) Observamos un porcentaje más elevado de pacientes que asocian la molécula
HLA-DQ8 en la EC (alrededor del 20%-25%) Además, los pacientes con EC Y
HLA-DQ8 se asocian frecuentemente con síntomas de presentación
extraintestinales y están frecuentemente asociados con otras enfermedades
autoinmunes.
3) Nuestros resultados sugieren que las células CD4+ y CD3+ desempeñan un
papel fundamental en la enfermedad celíaca.
4) La IL-23 y la IL-17 constituyen un nuevo eje via formación de células Th17 en
la patogénesis de enfermedad celíaca
5) En los pacientes celíacos activos hay un incremento en la expresión de IL-10 y
TGF-beta
6) En la enfermedad celíaca en su fase activa se produce un incremento en los
niveles plasmáticos de HLA-G en su forma soluble
7) el incremento de los niveles de la expresión de sHLA-G en la enfermedad
celíaca se asocia con otras enfermedades autoinmunes, siendo dependiente de
una asociación genética con estas enfermedades a través de los genes HLA
8) El polimorfismo de 14 pb del gen HLA-G influye en la expresión de la isoforma
HLA-G5 en pacientes celiacos
9) El polimorfismo de 14 pb del gen HLA-G tiene influencia sobre la
susceptibilidad para desarrollar la enfermedad celiaca y puede ser un marcador
genético a considerar.
10) El incremento de HLA-G en plasma se debe a la isofroma HLA-G5
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
116
11) Se observa un incremento del enzima IIDO tanto a nivel plasmático como en
biopsis intestinal y una disminución de los niveles de triptófanoen pacientes
celíacos .
MECANISMOS DE TOLERANCIA INMUNE EN LA ENFERMEDAD CE LÍACA. RELEVANCIA CLÍNICA
117
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