U N I V E R S I D A D D E

C O N C E P C I O N

FA C U LTA D D E M E D I C I N A

G U I A T R A B A J O S P R A C T I C O S

Q U I M I C A C L I N I C A I I - 2 0 1 4

C A S T I L L O N . J U A N L U I S , T M

C A S T I L L O N . M A R C E L O , T M

C H A N D Í A V. E M E R S O N , T M

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Práctico 1: Bilirrubina La bilirrubina deriva del grupo Hem, una protoporfirina que contiene hierro y se encuentra principalmente en la hemoglobina. Un adulto produce unos 450 umol de bilirrubina cada día. Es insoluble en el agua y se transporta en el plasma casi completamente unida a la albúmina. Es captada por la célula hepática y conjugada para formar mono y diglucurónicos de bilirrubina, los que son mucho más solubles en el agua. La bilirrubina conjugada se excreta en la bilis. La bilis, presenta un contenido de 25% de monoglucurónidos de bilirrubina y un 50 % de diglucurónidos de bilirrubina, junto algunas trazas de bilirrubina con conjugada. El principal componente de la bilis son las sales biliares que participan en la digestión de las grasas y en su absorción desde el intestino delgado. En el íleo terminal y en el colon la bilirrubina conjugada es atacada por bacterias para formar un grupo de compuestos que se conocen en conjunto como estercobilinógeno, la mayor parte es absorbida y puede ser nuevamente excretada a través de la bilis. Algunos de estos pueden ser eliminados por la orina, lugar en el que reciben el nombre de Urobilinógeno. Cuando se produce un bloqueo del tracto biliar la bilirrubina no logra ser excretada y se produce una liberación de está desde los hepatocitos hacia el torrente sanguíneo, generando un aumento de la bilirrubina en el plasma. Cuando ocurre esta situación el paciente demuestra a nivel de piel y principalmente a nivel de las escleras de los ojos un color amarillo, lo que se denomina ictericia. Valores de referencia Bilirrubina Total

EDAD VALOR REFERENCIA

< 1 día < 5,8 mg/dl

1 - 2 días < 8,2 mg/dl

3 - 5 días < 11,7 mg/dl

> 1 mes < 1,0 mg/dl

Bilirrubina Directa (química líquida): De 1 mes a la edad adulta < 0,6 mg/dl Bilirrubina Conjugada (química seca): De 1 mes a la edad adulta 0,0 mg/dl

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Objetivo General

Realizar la determinación de Bilirrubina Total y Bilirrubina Directa Objetivos específicos

Determinar los niveles de Bilirrubina total en muestras clínicas. Determinar los niveles de Bilirrubina directa en muestras clínicas Determinar los niveles de Bilirrubina indirecta en muestra clínicas.

Procedimiento

Realizar calibración de la técnica según las indicaciones del fabricante. Realizar control patológico y normal de la técnica. Realizar el análisis de muestras clínicas. Indicar cuales de ellas serían un valor crítico a informar al médico.

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Práctico 2: Transaminasas Las transaminasa, son enzimas que realizan la transferencia de grupos aminos entre aminoácidos y cetoácidos, también son conocidas cómo Aminotransferasas. Las concentraciones catalíticas de Glutamato Piruvato Transaminasa (GPT) o Alanino Amino Transferasa (ALT) y Glutamato Oxalato Transaminasa (GOT) o Aspartato Amino Transaminasa (AST) en el plasma se emplean ampliamente en la práctica clínica como indicadores sensibles, aunque inespecíficos, de lesión aguda de los hepatocitos independientemente de su etiología. Las causas de daño hepático son la hepatitis, cualquiera que sea el agente causal, y la lesión tóxica que puede acompañar a una larga serie de agresiones sobre el hígado, incluyendo la sobredosis de fármacos. También se observan lesiones hepáticas agudas debidas a choque, hipoxia grave e insuficiencia cardíaca aguda. REACCIÓN CATALIZADA POR ALT (GPT) REACCIÓN CATALIZADA POR LA AST (GOT)

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Valores de referencia

EDAD AST (GOT) ALT (GPT)

1 a 3 años 20 - 60 U/L 5 - 45 U/L

4 - 6 años 15 - 20 U/L 10 - 25 U/L

7 - 9 años 15 - 40 U/L 10 - 35 U/L

10 - 11 años 10 - 60 U/L H = 10 - 35 U/L M = 10 - 30 U/L

12 a 15 años H = 15 - 40 U/L M = 10 - 30 U/L

12 a 13 años H = 10 - 55 U/L M = 10 - 30 U/L

> 16 años H = 15 - 45 U/L M = 5 - 30 U/L

14 a 15 años H = 10 - 45 U/L M = 5 - 30 U/L

> 16 años H = 10 - 40 U/L M = 5 - 35 U/L

Objetivo General

Realizar la determinación de Asparto aminotransferasa y Alanino aminotransferasa. Objetivos específicos

Determinar la actividad enzimática de Aspartato amino transferasa en muestras clínicas. Determinar la actividad enzimática de Alanino amino transferasa en muestras clínicas.

Procedimiento Realizar la calibración de ambas técnicas según las indicaciones del fabricante.

Controlar ambas técnicas con control normal y patológico. Analizar muestras clínicas. Indicar cuales ellas tiene un valor crítico para normar al médico.

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Práctico 3: Gamma GT

La gamma glutamil transferasa (GT), una enzima unida a membranas, está presente en orden decreciente de abundancia en el túbulo renal proximal, hígado, páncreas (ductos y células

del acino), e intestino. La actividad de GT en suero proviene principalmente del hígado. La vida

media de GT en humanos es aproximadamente de 7 a 10 días; en la injuria hepática asociada al alcohol, la vida media aumenta hasta 28 días, sugiriendo una disminución en el clearance. La

concentración catalítica de -glutamiltransferasa en el plasma está aumentada siempre que exista colestasis, y es un indicador muy sensible de alteración hepática. Está afectada por la ingestión de etanol, incluso si no hay una hepatopatía reconocible. Los fármacos como la fenitoína inducen la

síntesis de esta enzima. En la lesión hepática aguda, los cambios en la concetración catalítica de -glutamiltransferasa en el plasma son paralelos a los de las aminotransferasas. En los hombres adultos es adecuado un único rango de referencia entre las edades de 25 y 80 años. Aunque los límites superiores del intervalo de referencia son aproximadamente 2 veces mayores en aquellos que tienen ascendencia africana, no se provee comúnmente a los laboratorios información sobre características raciales; sería dificultoso para los laboratorios reportar valores con el intervalo de referencia apropiado basado en la raza. En las mujeres y niños,

los límites superiores de referencia para GT aumentan gradualmente con la edad, y son considerablemente más bajos que los encontrados en los hombres adultos. Se deben establecer límites de referencia separados para hombres y mujeres, y para diferentes rangos de edad en mujeres y niños. En niños esto requerirá probablemente un esfuerzo cooperativo de los laboratorios para obtener un número adecuado de muestras de niños sanos.

La GT es ligeramente más sensible que ALP en la enfermedad hepática obstructiva. La GT aumenta en promedio 12 veces el límite superior de referencia en el 93-100% de pacientes con colestasis, mientras que ALP aumenta en promedio tres veces el límite de referencia superior en el

91% del mismo grupo. La GT parece aumentar en colestasis por los mismos mecanismos que

aumenta la ALP. La GT está aumentada en 80-95% de pacientes con alguna de las formas de hepatitis aguda. Los pacientes con diabetes, hipertiroidismo, artritis reumatoidea y enfermedad pulmonar

obstructiva a menudo tienen un incremento en GT; las razones para estos hallazgos no se

conocen bien. Luego del infarto agudo de miocardio, GT puede permanecer anormal por

semanas. Estos otros factores determinan un bajo valor predictivo de GT (32%) para enfermedad hepática.

Referente a la GT (gamma-glutamil-transferasa):

aumenta con consumo crónico, antes del desarrollo de daño hepático

no aumenta con la ingesta aguda

no aumenta en todos los bebedores exagerados

no hay correlación con cantidad de ETOH

vida media de descenso en abstinencia: 26 días

también aumenta en la obstrucción biliar y otras alteraciones hepática

puede aumentar con drogas antiepilépticas, anticoagulantes y barbitúricos

el mejor marcador disponible para el seguimiento del paciente con daño hepático por alcohol.

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VALORES DE REFERENCIA.

25 C 30 C 37 C

Hombres (U/l) 5 a 25 7 a 34 10 a 45

Mujeres (U/l) 4 a 16 6 a 22 7 a 32

Objetivo General

Realizar la determinación de gamma glutamil transferasa (GGT) Objetivos específicos

Determinar la actividad enzimática de GGT en muestras clínicas. Procedimiento

Realizar calibración de la técnica según la indicación del fabricante. Controlar la técnica usando un control normal y un control patológico. Analizar muestras clínicas. Indicar cuales de ellas tienen valor crítico para ser informado al médico.

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Práctico 4: Fosfatasa Alcalina Los incrementos de la concentración catalítica de fosfatasa alcalina en el plasma durante la enfermedad hepática son el resultado de una síntesis aumentada de le enzima por las células que se alinean a lo largo de los canalículos biliares, generalmente como respuesta a una colestasis que puede ser intra o extrahepática. La colestasis, aunque sea de corta duración, da lugar a una concentración catalítica aumentada has al menos dos veces el límite superior de referencia. También puede haber una concentración catalítica aumentada de la fosfatasa alcalina en el plasma en la enfermedad infiltrativa del hígado, cuando existen lesiones que ocupan espacio (tumores). También aparece en la cirrosis. El hígado no es la única fuente de fosfatasa alcalina. Existen cantidades sustanciales en hueso, intestino delgado, placenta y riñón, las que son todas isoformas de la enzima (isoenzima). En el plasma en condiciones fisiológicas, la concentración catalítica de fosfatasa alcalina deriva principalmente del hueso e hígado, con pequeñas aportaciones del intestino. La fosfatasa alcalina placentaria aparece en la sangre materna en el tercer trimestre del embarazo. A veces, la causa del incremento de la concentración catalíca de fosfatasa alcalina no será evidente de forma inmediata. Las isoenzimas óseas y hepáticas pueden separase mediante electroforesis. Sin embargo, una concentración catalítica de Gamma Glutamil Transferasa en el plasma elevada sugiere que el hígado es la fuente de ese aumento de la concentración de fosfatasa alcalina. Los valores de referencia de la fosfatasa alcalina, varían de forma considerable con la Edad y principalmente con el método utilizado, los más comunes son el IFCC y el DGKC, el primero presenta valores de referencia mucho más bajos que el segundo, por lo que es importante tener claro que técnica se está trabajando. Objetivo General

Realizar la determinación de actividad enzimática Fosfatasa alcalina. Objetivos específicos

Determinar la actividad enzimática de fosfatasa alcalina en muestras clínicas. Procedimiento

Realizar calibración de la técnica según la indicación del fabricante. Controlar la técnica usando un control normal y un control patológico. Analizar muestras clínicas. Indicar cuales de ellas tienen valor crítico para ser informado al médico.

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Práctico 5: Glicemia La concentración de glucosa en el plasma se mide cotidianamente en el laboratorio con muestras de sangre que se recogen en tubos que, en algunos laboratorios, contienen fluoruro, un inhibidor de la glucólisis. La concentración de glucosa en el plasma en ayunas se mide después de un ayuno de 8 a 12 hrs. La concentración de glucosa en ayunas es el mejor parámetro para el diagnóstico de alteraciones del metabolismo glusídico. En las personas normales, su valor es de 70 a 100 mg/dl. Los valores entre 100 - 140 mg/dl, deben interpretarse como en el límite. Valores superiores a 140 mg/dl en dos ocasiones es patognomónica de diabetes mellitus. Es importante reconocer en cada caso las diferencias entre las mediciones realizadas con muestras de sangre, plasma o sangre capilar. Objetivo General

Realizar la determinación de glucosa Objetivos específicos

Realizar la curva de calibración de glicemia. Determinar los niveles de glucosa en muestras clínicas.

Procedimiento

Realizar la curva de calibración de la técnica según la indicación del fabricante. Controlar la técnica usando un control normal y un control patológico. Analizar muestras clínicas. Indicar cuales de ellas tienen valor crítico para ser informado al médico.

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Práctico 6: Test de Tolerancia a la Glucosa Clásicamente el diagnóstico de diabetes se hace según la respuesta del paciente a una sobrecarga de glucosa por vía oral. Primero se obtiene una muestra de sangre basal después de una noche de ayuno. El paciente de ingerir 75 gr de glucosa por vía oral, en unos 300 ml de agua que debe beberse en 5 minutos. La presencia de glucosa se mide a las 2 horas de ingerida la carga. El paciente debe estar confortablemente sentado durante el examen, no debe fumar ni realizar ejercicio y debe haber seguido una dieta normal durante al menos los 3 días anteriores al examen. Muchos exámenes de test de tolerancia a la glucosa (TTG) se realizan en forma innecesaria. Hay relativamente pocas indicaciones para éste:

Concentración de glucosa en el plasma en ayunas o posprandial en el límite. Excreción urinaria de glucosa persistente. Glucosurias en mujeres embarazadas. Mujer embarazada con historia familiar de diabetes mellitus y que previamente ha tenido

hijos grandes o muertes fetales inexplicadas. Objetivo General

Conocer el procedimiento para un adecuado test de tolerancia a la glucosa. Objetivos específicos

Realizar el procedimiento preanalítico del test de tolerancia a la glucosa Medir los niveles de glucosa en las muestras obtenidas. establecer las conclusiones en base a los resultados.

Procedimiento

Se trabajará en parejas Cada pareja decidirá quién se realizará el procedimiento. Extraer sangre en tubo con fluoruro de sodio (plomo) para el valor de glicemia basal. Pesar 75 gr de glucosa y disolverlo en 200 ml de agua, se sugiere colocarle unas gotas de

limón para hacerlo más agradable. Esperar 2 horas realizando el mínimo de ejercicio, el ideal es no hacer nada en ese período. Simultáneamente medir la glicemia del tubo basal, previo control normal y patológico,

usando la curva de calibración del práctico anterior. Extraer sangre en tubo con fluoruro de sodio (plomo) para el valor de glicemia post. Medir la glicemia del tubo post 75 gr y obtener conclusiones de sus resultados.

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Práctico 7: Casos Clínicos Diabetes Objetivo General

Analizar distintas variables que pueden influir al momento de validar los resultados relacionados con el diagnóstico y tratamiento de la diabetes.

Objetivos específicos

Analizar casos clínicos de diabetes tipo I Analizar casos clínicos de diabetes tipo II Analizar casos clínicos de diabetes lada Analizar casos clínicos de resistencia a la insulina.

Procedimiento

Con otro compañero analizar un caso clínico. Presentarlo al curso para discusión.

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Práctico 8: Amilasa y Lipasa La concentración sérica de amilasa se usa ampliamente como prueba de detección sistemática para la pancreatitis aguda en el paciente con dolor abdominal agudo o dolor de espalda. Un valor superior a 65 U/L hará cuestionable una pancreatitis aguda; concentraciones mayores de 130 U/L hacen más probable el diagnóstico, y valores tres veces mayores de lo normal lo establecen, siempre que se haya excluido previamente una perforación o un infarto intestinal. En la pancreatitis aguda, la amilasa sérica suele aumentar en las primeras 24 h del proceso, y permanece elevada durante uno a tres días. Las cifras retornan a la normalidad en tres a cinco días, salvo en el caso de que exista necrosis pancreática extensa, obstrucción incompleta de los conductos o formación de un pseudoquiste. Alrededor de 85% de los pacientes con pancreatitis aguda presentan un aumento de la amilasa sérica. No obstante, puede haber valores normales si: 1) se retrasa (de dos a cinco días) la obtención de muestras de sangre; 2) el trastorno subyacente es una pancreatitis crónica en vez de una pancreatitis aguda, y 3) hay hipertrigliceridemia. Se ha observado que los pacientes con hipertrigliceridemia y pancreatitis comprobada presentan valores falsamente bajos de amilasa y de actividad de lipasa. La amilasa sérica suele aumentar en otros procesos (cuadro 2), en parte porque la enzima se encuentra en muchos órganos además del páncreas (glándulas salivales, hígado, intestino delgado, riñón, trompa de Falopio) y en parte porque puede ser producida por diversos tumores (carcinoma de pulmón, esófago, mama y ovario). A este respecto, resulta útil recurrir a un análisis del tripsinógeno sérico (realizado por varios laboratorios comerciales). Dado que esta enzima es secretada específicamente por el páncreas, un valor de tripsinógeno sérico normal en un paciente con elevación mínima de la amilasa sérica prácticamente excluye la pancreatitis aguda. Las mediciones de la amilasa urinaria, incluida la tasa de aclaramiento de amilasa-creatinina, no superan en sensibilidad ni en especificidad la determinación de los valores sanguíneos de amilasa. La elevación de la amilasa en el líquido ascítico ocurre en la pancreatitis aguda y en: 1) la ascitis pancreatógena producida por rotura del conducto pancreático principal o un seudoquiste con escape del contenido, y 2) otros trastornos abdominales que simulan pancreatitis (p. ej., obstrucción intestinal, infarto intestinal y úlcera péptica perforada). Se produce un aumento de la amilasa en el líquido pleural en casos de pancreatitis aguda, pancreatitis crónica, carcinoma de pulmón y perforación esofágica. La lipasa puede ser ahora la enzima más indicada para establecer un diagnóstico de pancreatitis aguda. Los avances en los sustratos y la tecnología ofrecen al médico mejores opciones, en especial cuando se recurre a un análisis turbidimétrico. Los nuevos análisis de lipasa utilizan colipasa como cofactor y están totalmente automatizados. El análisis de tripsinógeno (o de inmunorreactividad de tipo tripsina) presenta una ventaja teórica sobre los análisis de amilasa y lipasa por el hecho de que el páncreas es el único órgano que contiene esta enzima. Esta prueba parece ser útil en el diagnóstico tanto de la pancreatitis aguda como de la crónica. La sensibilidad y la especificidad son comparables a las determinaciones de amilasa y lipasa. Dado que el tripsinógeno también se excreta por el riñón, se encuentran cifras elevadas en la insuficiencia renal, al igual que sucede con la amilasa y la lipasa séricas. Ninguna prueba sanguínea aislada es fiable para el diagnóstico de pancreatitis aguda en los pacientes con insuficiencia renal. Determinar si un paciente con insuficiencia renal y dolor abdominal tiene pancreatitis continúa siendo un problema clínico difícil. Un estudio reciente comprobó que en pacientes con disfunción renal, la concentración sérica de amilasa se elevaba sólo cuando el aclaramiento de creatinina era inferior a 50 ml/min. En tales pacientes, la concentración sérica de

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amilasa era invariablemente menor de 500 UI/L en ausencia de pruebas objetivas de pancreatitis aguda. En ese estudio, las concentraciones séricas de lipasa y tripsina discurrían paralelas a los valores de amilasa sérica. Un estudio reciente evaluó la sensibilidad y la especificidad de cinco análisis utilizados para diagnosticar pancreatitis aguda: dos análisis de amilasa, uno de lipasa, uno de inmunorreactividad de tipo tripsina (trypsin-like immunoreactivity, TLI) y uno de isoamilasa pancreática. Los datos obtenidos: 1) demuestran que si se utiliza el mejor valor discriminatorio, todos estos análisis tienen especificidades similares, y 2) sugieren que la amilasa sérica total es un indicador de pancreatitis aguda tan adecuado como los demás. Sin embargo, muchos de estos estudios presentan el problema de que la identificación y el diagnóstico de la pancreatitis aguda se basan en detectar un aumento de la amilasa sérica. La cuestión reside en si es posible demostrar que el resultado de cualquier prueba diagnóstica es superior al valor de amilasa sérica total cuando se requiere que exista hiperamilasemia para el diagnóstico. En otros estudios, cuando se ha necesitado una confirmación "objetiva" del diagnóstico clínico de pancreatitis (con ecografía, CT, laparotomía), la sensibilidad de la amilasa sérica ha tenido el reducido valor de 68%. Teniendo en cuenta estas limitaciones, las pruebas de detección que se recomiendan en la pancreatitis aguda son la amilasa sérica total y la lipasa sérica. Los valores de amilasa mayores del triple de lo normal son sumamente específicos. Objetivo General

Realizar la determinación de actividad enzimática de amilasa y lipasa. Objetivos específicos

Determinar la actividad enzimática de amilasa en muestras clínicas. Determinar la actividad enzimática de lipasa en muestras clínicas.

Procedimiento

Realizar calibración de la técnica según la indicación del fabricante. Controlar la técnica usando un control normal y un control patológico. Analizar muestras clínicas. Indicar cuales de ellas tienen valor crítico para ser informado al médico.

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Práctico 9: Colesterol Total El colesterol se encuentra en animales y seres humanos, en los cuales es también el principal esterol. Virtualmente todas las células y fluidos del organismo contienen algo de colesterol. Como los otros esteroles, el colesterol es un alcohol de alto pedo molecular y contiene el esqueleto del ciclo pentano perihidro fenantreno. La molécula contiene 27 átomos de carbono que tienen la numeración indicada en la figura siguiente:

El conocimiento del esqueleto estrano así como su sistema de enumeración es importante, porque el colesterol es el punto de partida de numerosas vías metabólicas. Entre ellas se incluyen la vía de la síntesis de la vitamina D, la síntesis de hormonas esteroidales y el metabolismo de ácidos biliares. El colesterol de la pared intestinal proviene de tres fuentes: de la dieta, de las secreciones intestinal y biliar y de las células. Prácticamente todo el colesterol en el intestino está presente en la forma de colesterol libre (no esterificado) y el colesterol esterificado de la dieta, rápidamente se hidroliza en el intestino a colesterol libre y ácidos grasos, por intermedio de la colesterol esterasa presente en la secreción pancreática y en el intestino delgado. Trastornos del metabolismo lipídico (disliproteinemia) son los principales factores de riesgo para la ateroesclerosis. Los diferentes factores de riesgo no aparecen aisladamente en el curso de una enfermedad, sino muchas veces en combinaciones y se influyen mutuamente. La reducción del 1 % de los valores de colesterol sérico reduce el riesgo cardiovascular en un 2%. El colesterol encontrado en el interior de las placas de ateroma proviene de los lípidos y lipoproteínas de la sangre.

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Objetivo General

Realizar la determinación de Colesterol Total. Objetivos específicos

Determinar los niveles de Colesterol Total en muestras clínicas. Procedimiento

Realizar calibración de la técnica según la indicación del fabricante. Controlar la técnica usando un control normal y un control patológico. Analizar muestras clínicas. Indicar cuales de ellas tienen valor crítico para ser informado al médico.

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Práctico 10: Colesterol HDL Las HDL (lipoproteínas de alta densidad), flotan entre d=1.063 y 1.210 g/ml. Son las moléculas responsables del transporte inverso del colesterol, es decir, absorben el colesterol de las células periféricas y lo transportan otra vez al hígado. Las HDL se dividen en varias fracciones en relación a su composición, tales como el contenido de proteínas y de lípidos, morfología y características funcionales:

HDL 1 = HDLc (1.055 – 1.085 g/ml)

HDL 2 = 1.063 - 1.120 g/ml

HDL 3 = 1.120 – 1.210 g/ml Los precursores de los HDL (partículas discoidales) se sintetizan en el tracto gastrointestinal y en el hígado siendo convertidos a su forma final en el plasma (HDL esféricas) con una composición aproximada de 50% de lípidos y 50% de proteínas. Uno de los métodos más utilizados es la precipitación de los quilomicrones, VLDL y las LDL, al agregar ácido fosfotúngstico y iones de magnesio. La ultracentrifugación posterior permite que sólo queden en el sobrenadante las HDL. Su contenido de colesterol se determina enzimáticamente. Las LDL colesterol corresponden a las lipoproteínas de baja densidad, flotan entre d= 1.019 y 1.063 g/ml, son productos metabólicos de las VLDL. Transportan el colesterol desde el hígado hasta las células periféricas, por ejemplo a las células musculares lisas de la pared arterial. La mayor parte de las LDL son catabolizadas en el hígado. Contienen aproximadamente 80% de lípidos y 20% de proteínas. Los lípidos más importantes que contienen son ésteres de colesterol y fosfolípidos. La sedimentación excesiva de LDL en la células periféricas contribuye al desarrollo de la placa de ateroma. La apolipoproteína característica de las LDL es la apo B, que es importante en el reconocimiento del receptor específico a nivel celular. Una de las formas de obtener la concentración de LDL, es mediante la siguiente fórmula de Fridewald:

Esta fórmula tiene la limitante que cuando los triglicéridos son superiores a los 400 mg/dl, la precipitación es incompleta interfiriendo los resultados.

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Objetivo General

Realizar la determinación de Colesterol HDL Objetivos específicos

Determinar los niveles de colesterol HDL en muestras clínicas. Procedimiento

Realizar calibración de la técnica según la indicación del fabricante. Controlar la técnica usando un control normal y un control patológico. Analizar muestras clínicas. Indicar cuales de ellas tienen valor crítico para ser informado al médico.

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Práctico 11: Triglicéridos En la nutrición humana, los triglicéridos son los ésteres de glicerol más abundantes. Constituyen el 95 % de las grasas almacenadas en los tejidos y son la forma predominante de ácidos grasos encontrados en los mono, di o triacilgliceroles varían considerablemente e incluyen combinaciones de ácidos grasos con 18 átomos de carbono y 2 dobles enlaces. Se les denomina grasas poli-insaturadas; en cambio, los triacelgliceroles de origen animal, especialmente los rumiantes tienen residuos de ácidos grasos de 12 carbonos y 0 dobles enlaces y se les denomina grasas saturadas. Los triacilgliceroles mediante la acción de las lipasas y ácidos biliares son hidrolizados en glicerol y ácidos grasos. Después de la absorción los triglicéridos son resintetizados en las células epiteliales y combinados con colesterol y apolipoproteínas para formar los quilomicrones. Objetivo General

Realizar la determinación de Triglicéridos. Objetivos específicos

Realizar la determinación de Triglicéridos en muestras clínicas. Procedimiento

Realizar calibración de la técnica según la indicación del fabricante. Controlar la técnica usando un control normal y un control patológico. Analizar muestras clínicas. Indicar cuales de ellas tienen valor crítico para ser informado al médico.

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Práctico 12: Perfil Lipídico Objetivo General

Realizar el procedimiento de medición y análisis de Perfil Lipídico. Objetivos específicos

Determinar los niveles de Colesterol Total en muestras clínicas. Determinar los niveles de Triglicéridos en muestras clínicas. Determinar los niveles de Colesterol HDL en muestras clínicas. Determinar los Niveles de Colesterol LDL en muestras clínicas

Procedimiento

Realizar calibración de cada técnica según la indicación del fabricante. Controlar cada técnica usando un control normal y un control patológico. Analizar muestras clínicas. Indicar cuales de ellas tienen valor crítico para ser informado al médico.

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Práctico 13: Creatin Kinasa (CK) y Creatin Kinasa MB La creatin kinasa es una enzima que se encuentra en el corazón, cerebro y músculo esquelético, jugando un rol preponderante en el metabolismo energético de las células. La CK se encuentra en tres formas principales, llamadas isoenzimas.

CK-MB, encontrada principalmente en el músculo cardiaco.

CK-BB, encontrada en el cerebro.

CK-MM, encontrada en los músculos, incluyendo el músculo cardíaco.

En forma normal, la CK que se encuentra en circulación corresponde a la isoenzima MM, no encontrándose la isoenzima BB. Es un marcador importante de lesión muscular y de infarto agudo al miocardio. Objetivo General

Realizar el procedimiento de medición de Creatin Kinasa (CK) y Creatin Kinasa fracción MB (CK-MB).

Objetivos específicos

Determinar la actividad enzimática de CK y CK-MB en muestras clínicas. Procedimiento

Realizar calibración de las técnica según la indicación del fabricante. Controlar las técnica usando un control normal y un control patológico. Analizar muestras clínicas. Indicar cuales de ellas tienen valor crítico para ser informado al médico.

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Práctico 14: Lactato deshidrogenasa (LDH) La LDH, es una enzima que encuentra en la mayoría de los tejidos del cuerpo (de forma intracelular), pero sólo una pequeña cantidad de estas son detectables en la sangre. Una vez que las células que la contienen son dañadas, estas se liberan al torrente sanguíneo, causando un aumento de sus niveles plasmáticos. Se utiliza como un marcado general de daño celular. El aumento de los niveles de LDH pueden ser medidos como LDH total o como una isoenzima de la LDH. La LDH total, es la medición de cinco isoenzimas diferentes de la LDH (versiones moleculares levemente diferentes de la LDH). La LDH total indica daño tisular inespecífico. Aunque con superposición, cada una de las 5 isoenzimas de la LDH tiende a encontrase concentradas en tejidos corporales específicos, por lo tanto pude usarse la determinación de las isoenzimas por separado, en asociación con otros parámetros para determinar sitio de daño tisular. En general las isoenzimas se ubican en:

LDH-1 , corazón, glóbulos rojos, corteza renal y células germinales.

LDH-2, corazón, glóbulos rojos, corteza renal (cantidades menores que LDH-1)

LDH-3, pulmones y otros tejidos.

LDH-4, leucocitos, nódulos linfáticos, músculo e hígado (en menor cantidad que LDH-5)

LDH-5, hígado y músculo. Por la presencia de la LDH-1 (principalmente) y la LDH-2 en los glóbulos rojos, es necesario que la muestra esté libre de hemólisis; junto con evitar el almacenamiento por mucho tiempo de la sangre, con la finalidad de evitar la hemólisis “in vitro”. Su relación con infarto agudo al miocardio se observa en la figura 2. Objetivo General

Realizar el procedimiento de medición de Lactato Deshidrogenasa. Objetivos específicos

Determinar los niveles de actividad enzimática de Lactato deshidrogenasa. Procedimiento

Realizar calibración de la técnica según la indicación del fabricante. Controlar la técnica usando un control normal y un control patológico. Analizar muestras clínicas. Indicar cuales de ellas tienen valor crítico para ser informado al médico.

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Práctico 15: Líquidos Biológicos LIQUIDO SINOVIAL. Estará indicada la punción articular para la toma de líquido sinovial en artritis con depósito de cristales, artritis sépticas, y en toda monoartritis de causa desconocida que se puede hallar en la clínica. Se extrae por punción articular en condiciones estériles. CARACTERISTICAS FISICAS Volumen El volumen de líquido depende del tamaño de la articulación, por ejemplo la rodilla contiene de 0,1 a 3,5 ml de líquido. En ausencia de derrame sinovial es prácticamente imposible obtener una muestra significativa de líquido sinovial de ninguna articulación, salvo, quizás, la rodilla. Color Normalmente es incoloro o ligeramente amarillo y transparente. La turbidez indica un proceso inflamatorio (artritis séptica). Un aspecto lechoso señala presencia de uratos, típica de la artritis gotosa. Un color rojo es consecuencia de traumatismos articulares. Un color amarillo intenso sugiere también un proceso inflamatorio. Características diferenciales del líquido sinovial en los diferentes síndromes articulares.

Normal Inflamatorio (A. reumatoide)

Séptico No inflamatorio

Aspecto Viscosidad Leucocitos Glucosa PMN (%) Microorganismos

Transparente incoloro Alta < 200/mm3

Normal < 25 No

Opaco o traslucido amarillo Baja 5.000-75.000/mm3

<50 % glicemia >50 No

Opaco, amarillo o verde Variable >50.000, a menudo <50 % glicemia <75 Frecuente

Transparente, amarillo Alta 200-2.000/mm3

Normal <25 No

Viscosidad El líquido sinovial normal es viscoso debido a la presencia de ácido hialurónico. La viscosidad se valora a simple vista dejando fluir lentamente una gota de líquido desde la punta de la aguja utilizada para la punción y viendo qué longitud alcanza el filamento antes de desprenderse la gota (normalmente de 2,5 a 5 cm). Esta propiedad se denomina filancia, disminuye en procesos inflamatorios y con la edad y aumenta en el hipotiroidismo. Si hace falta una medición más exacta puede utilizarse un viscosímetro.

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Densidad La cifra media es de 1,010 (1,008-1,015) g/ml. CARACTERISTICAS QUIMICAS Proteínas Los valores totales deben ser inferiores a 2,5 g/dl. La albúmina está en doble proporción respecto a las globulinas. No existe fibrinógeno. En derrames inflamatorios aumentan las globulinas gamma (IgM en artritis reumatoide) y las α-2. La β-2-microglobulina también es marcador de la inflamación articular. Además aparece fibrinógeno. En el líquido sinovial pueden determinarse componentes del complemento, actividad de factor reumatoide, anticuerpos antinucleares, inmunoglobulinas y otras sustancias, pero en general añaden poco a los datos ya facilitados por la bioquímica sanguínea. También pueden determinarse actividades enzimáticas, aunque su interés es escaso. Tienden a disminuir en la artrosis y a elevarse en la artritis reumatoide, sobre todo la aldolasa-deshidrogenasa, la AST, la fosfatasa ácida y la β-acetilglucosaminasa. Mucopolisacáridos El representante es el ácido hialurónico, con una concentración de 3,5 mg/g de liquido sinovial (no se expresa por mililitro debido a la alta viscosidad del líquido). Una forma rápida de valorar la cantidad y calidad de los mucopolisacáridos es el test de formación de coágulo de mucina, que se realiza añadiendo varias gotas de liquido sinovial a 20 ml de ácido acético al 5 %, debe proporcionar al cabo de un minuto un flóculo que no debe disgregarse al agitar el recipiente. Glucosa Se halla en una concentración ligeramente inferior a la glucemia. Está disminuida en infecciones y en procesos inflamatorios, especialmente la artritis reumatoide. Nitrógeno no proteico (urea y ácido úrico) Los valores normales oscilan entre 20 y 40 mg/dl. El ácido úrico, al igual que la glucosa, difunde libremente del plasma al líquido sinovial. pH Generalmente es de 7,4. Disminuye en los procesos inflamatorios.

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CELULAS Normalmente existen menos de 180 células/mm3, en su mayoría mononucleares (monocitos 48 %, linfocitos 25 %), con escasos polinucleares, células plasmáticas y células sinoviales (menos del 10 % en cada caso). Se incrementan en las artritis y derrames traumáticos, siendo más altos los valores en las artritis sépticas que en las que no lo son (tabla 5.1). En el examen en fresco se pueden observar “ragocitos”, que son polinucleares con inclusiones citoplásmicas, indicativos de inflamación en general. En el examen con tinción de Wright se pueden observar monocitos con polinucleares fagocitados o células de Reiter, es típico del síndrome de Reiter y de otras poliartritis como la espondiloartritis anquilopoyética. También es posible detectar células LE en el lupus, gránulos parduzcos citoplásmicos en la ocronosis, condrocitos sideróticos en la hemocromatosis y espículas de médula ósea si hay fractura intraarticular. CRISTALES Los más frecuentes son los de urato en la gota, que presentan birrefringencia negativa. Los microcristales de pirofosfato cálcico-dihidrato aparecen en la condrocalcinosis y dan, en cambio, birrefringencia levemente positiva. En ambos casos predominan los cristales de localización intracelular. Un hallazgo raro en la artritis reumatoide es la presencia de cristales de colesterol. Los cristales de hidroxiapatita son globulares y no muestran birrefringencia. ESTUDIO MICROBIOLÓGICO Siempre que se sospeche artritis infecciosa se debe enviar una muestra al laboratorio de bacteriología, preferiblemente en la propia jeringa para evitar contaminaciones. Se debe hacer inmediatamente una tinción de Gram, aunque su negatividad no excluye artritis séptica, y siembra en cultivos para bacterias piógenas y para bacilos ácido-alcohol resistentes si es pertinente desde el punto de vista clínico. DIAGNOSTICO DIFERENCIAL DE LAS DIFERENTES PATOLOGIAS Las afecciones articulares pueden encuadrarse en tres principales grupos: no inflamatorias, inflamatorias y sépticas. Cada uno presenta un líquido sinovial con una serie de características que lo diferencia (tabla 5.1). Aparte de las infecciones articulares se pueden producir otras alteraciones de tipo no inflamatorio e inflamatorio. Mediante el análisis de este líquido se podrá hacer un acercamiento al diagnóstico final.

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Clasificación de las patologías articulares según la actividad inflamatoria.

LIQUIDO NO INFLAMATORIO LIQUIDO INFLAMATORIO

Traumatismos Artrosis Meniscopatías Osteocondromatosis Osteocondritis disecante Artropatías metabólicas Tumores Necrosis aséptica Osteoartropatía hipertrófica pulmonar Artropatía neuropática Sinovitis vellonodular pigmentada Algunos casos de LES Algunos casos de fiebre reumática Eritema nodoso

Artritis reumatoide Lupus eritematoso sistémico Artritis microcristalinas Otras conectivopatías Fiebre reumática Sinovitis inducidas por cristales (gota, pseudogota) Espondiloartropatías seronegativas Crioglobulinemia mixta esencial Vasculitis Polimialgia reumática Artritis carcinomatosa Infecciones articulares

LIQUIDO PLEURAL. En el espacio pleural existe normalmente una mínima cantidad de líquido que actúa como sellador y lubricante. Siempre que exista un derrame pleural de origen desconocido hay que realizar toracocentesis diagnóstica, con técnica estéril. Se clasifica el líquido pleural según sea un ultrafiltrado plasmático en una pleura sana (trasudado) o un componente con similares características al plasma en una pleura enferma, con permeabilidad o drenaje linfático alterados (exudado). CARACTERISTICAS FISICAS Color Los derrames amarillentos corresponden a trasudados por congestión pasiva o por disminución de la presión oncótica del plasma o a exudados serofibrinosos. Los derrames hemorrágicos son de color rosado y tienen origen neoplásico, traumático, vascular (embolismo pulmonar), tuberculoso o paraneumónico. Los verdosos o amarillos-verdosos se observan en las ictericias. Los turbios se relacionan con supuraciones purulentas (pleuritis). Los blanquecinos son derrames quilosos o quiliformes. Los primeros contienen fundamentalmente triglicéridos y se deben a obstrucción linfática secundaria a neoplasia, traumatismo o filariasis. Los derrames quiliformes contienen sobre todo colesterol y suelen ser crónicos, de etiología diversa (neoplasias, tuberculosis).

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Densidad En los trasudados (derrame hidrostático o hipoproteinémico) es inferior a 1,014 y en los exudados (derrame inflamatorio, neoplásico y por obstrucción linfática) es superior a 1,016. CARACTERISTICAS QUIMICAS Proteínas El líquido pleural normal tiene un contenido bajo en proteínas. Un criterio utilizado para distinguir los exudados de los trasudados es el cociente de proteínas en líquido/proteínas en suero, que es superior e inferior a 0,5, respectivamente. Una concentración de proteínas inferior a 3 g/dl es también característica, pero no patognomónica, del trasudado pleural. Se determinan por espectrofotometría o con la prueba cualitativa de Rivalta que diferencia un derrame pobre en proteínas o trasudado frente a uno rico en proteínas o exudado. La fibronectina aumenta en los derrames pleurales tuberculosos. La β-2-microglobulina aumenta en los derrames causados por hemopatías. Enzimas Colinesterasa: Se eleva en derrames tuberculosos y en menor grado en los neoplásicos. Lactato-deshidrogenasa (LDH): Sirve también para aportar otros criterios para definir el tipo de derrame, aparte de la razón entre las proteínas séricas y pleurales antes citada. Un cociente LDH pleural/LDH sérico superior a 0,6 o unas concentraciones de LDH en el derrame superiores a 200 U.I./l, son diagnósticas de exudado. Se eleva en derrames neoplásicos y de forma leve en los inflamatorios. En los derrames pleurales malignos aumentan sobre todo la LDH-4 y 5. Concentraciones superiores a 1000 UI/ml son sugerentes de empiema pleural. Amilasa: Se encuentra en derrames de ciertos procesos en cantidad superior a las 500 U/ml y tiene valor diagnóstico, sobre todo, en el derrame pleural secundario a pancreatitis o a rotura esofágica. También puede elevarse en algunas neoplasias: páncreas, ovario, pulmón, y gastrointestinales. Adenosín-desaminasa (ADA): Un nivel por encima de 40 UI/l tiene una sensibilidad y especificidad muy elevadas para la tuberculosis. Existen falsos positivos en empiemas, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y linfomas (sugerente si es superior a 200 UI/l). Proteínas especiales Complemento: Es frecuente su descenso en el lupus eritematoso sistémico y la artritis reumatoide. Factor reumatoide: Títulos iguales o superiores a 1/320 o por encima de los niveles séricos sugieren que el derrame es secundario a artritis reumatoide, aunque también se pueden encontrar en neumonías o neoplasias.

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Anticuerpos antinucleares: Títulos superiores a 1/160 o por encima de los plasmáticos aparecen en el lupus eritematoso sistémico. Interferón gamma: concentraciones superiores a 140 pg/ml son muy sugerentes de derrame tuberculoso. Lípidos El quilotórax genuino contiene más de 110 mg/dl de triglicéridos y es pobre en colesterol. En el examen microscópico se detectan gotas de grasa. La turbidez no desaparece al añadir alcohol etílico. Por lo demás se comporta como un exudado. Los derrames quiliformes, de tipo crónico de etiología tuberculosa, neoplásica o autoinmune, contienen sobre todo colesterol, cuyos cristales son visibles al microscopio. La adición de etanol reduce la turbidez. Glucosa Las concentraciones de glucosa existentes en los trasudados son similares a las plasmáticas (superior al 50% de ésta), mientras que son inferiores a 60 mg/dl en los exudados. Un valor inferior a esta concentración se puede hallar en empiemas, tuberculosis o neoplasias. Los niveles muy bajos (<15 mg/dl) son característicos de la artritis reumatoide. pH El pH del líquido pleural normal y del de los trasudados pleurales es igual o ligeramente superior al sanguíneo. Es inferior en los exudados y en los derrames neoplásicos. El pH es inferior a 7,2 en muchos derrames exudativos de diversa etiología, especialmente en empiema pleural y en derrames neoplásicos. Sin embargo, en los derrames quilosos y los secundarios a embolismo pulmonar no desciende por debajo de este límite. En empiemas causados por algunas especies de Proteus el pH puede ser normal o estar elevado por su capacidad para desdoblar la urea. ELEMENTOS CELULARES El recuento celular es orientativo, ya que los trasudados tienen menos de 1000 leucocitos/ml y la mayoría de los exudados rebasan ampliamente esta cifra, aunque no de forma constante. Es más importante realizar un recuento diferencial. Neutrófilos. Predominan netamente en procesos inflamatorios agudos (neumonías, tromboembolismo) y suelen hacerlo en las fases iniciales de procesos crónicos (tuberculosis, neoplasias) e incluso en algunos trasudados. Los exudados suelen tener más de 1000 leucocitos/ml, con un 50% o más de polimorfonucleares en los procesos agudos. Estas cifras son típicas pero no definitorias de exudado.

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Linfocitos Con frecuencia suponen más del 50% de las células en los trasudados, pero también están elevados en los exudados en el curso de algunas enfermedades (tuberculosis, tumores, colagenosis, etc.). Eosinófilos. En el neumotórax y hemotórax pueden representar el 10% o más de todas las células. La eosinofilia (>10%) es también frecuente en la fase de resolución de infecciones, en el tromboembolismo pulmonar y en los derrames asociados a fármacos y asbesto. Células mesoteliales En casi todo proceso pleural que origine derrame representan más del 5% de las células. A veces pueden mostrar un aspecto que confunda con el de malignidad. Los derrames crónicos pueden presentar células mesoteliales con atipias que parecen neoplásicas. Un número de células mesoteliales superior al 5% descarta prácticamente una tuberculosis. Eritrocitos Se habla de hemotórax cuando su número es tan grande que exige un tratamiento especial. Más de 100.000 células/mm3 orientan a neoplasia, infarto o traumatismo. Entre 10.000 y 100.000 es indeterminado y menos de 10.000 suele corresponder a trasudados. En el hemotórax el hematocrito pleural es de más del 50% del sanguíneo. Células neoplásicas El examen citológico del líquido pleural sirve para confirmar el diagnóstico de las neoplasias pulmonares malignas, aunque su sensibilidad es baja. PLANTEAMIENTO DIAGNOSTICO GENERAL ANTE UN DERRAME PLEURAL Cuando se plantee la indicación clínica de realizar una toracentesis es necesario prever qué determinaciones han de realizarse. Como mínimo hay que extraer muestra para examen citológico y recuento celular, glucosa, proteínas, LDH y ADA, y bacteriología (inoculando directamente el líquido en frascos de hemocultivo). Para el pH lo mejor es enviar el remanente de líquido que quede en la jeringa de extracción. Dependiendo de qué etiología se sospeche, se tomarán muestras para determinaciones específicas: ANA, lípidos, amilasa, etc. En el caso concreto de un derrame metaneumónico en el que se sospeche evolución a empiema, hay que establecer la indicación de inserción de un tubo de drenaje cuando el pH es inferior a 7,2 y la glucemia es notablemente inferior a 60 mg/dl, especialmente si el líquido está loculado, es muy denso o claramente purulento o el Gram es positivo.

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LIQUIDO ASCITICO. CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS Normalmente la cavidad peritoneal contiene de 75 a 100 ml de líquido claro, de color pajizo, que facilita la lubricación de la membrana. En las ascitis se acumula líquido dentro de la cavidad peritoneal que puede presentar, según la causa, diversos aspectos. En la peritonitis infecciosa presenta un aspecto turbio o purulento. Puede ser hemorrágico en neoplasias, tuberculosis, pancreatitis y traumatismos. En la obstrucción linfática por trauma, neoplasias, tuberculosis, filariasis y anormalidades congénitas es quiloso. CARACTERISTICAS QUIMICAS Proteínas El líquido peritoneal normal es pobre en proteínas (< 2 g/dl). El contenido en proteínas del líquido ascítico es un criterio fundamental a la hora de clasificarlo como trasudado o exudado. La prueba cualitativa de Rivalta es poco exacta y siempre se debe realizar una determinación bioquímica. Los trasudados se deben a la salida de líquido desde los sinusoides hepáticos y los capilares intestinales al espacio peritoneal, por lo tanto son ultrafiltrados del plasma y su contenido en proteínas suele ser relativamente bajo (< 3 g/dl en el 80 % de los casos). Los exudados se producen por exudación de líquido por el propio peritoneo y su contenido en proteínas suele superar los 3 g/dl, aunque no de forma obligada. Por lo tanto, es necesario disponer de un criterio más discriminativo entre trasudado y exudado. Aparte de la información proporcionada por otros parámetros, se ha establecido que el gradiente plasma-ascitis de albúmina es un criterio más discriminativo. Un gradiente superior a 1,1 g/dl es indicativo de trasudado, especialmente de ascitis cirrótica, mientras que si está por debajo de este límite indica exudado. Sin embargo, en los trasudados secundarios a síndrome de Budd-Chiari, el gradiente puede ser inferior a 1,1 g/dl debido a que el líquido ascítico es más rico en proteínas que en la cirrosis. La fibronectina aumenta en la ascitis maligna. La β-2-microglobulina se eleva en los derrames causados por hemopatías. Enzimas Colinesterasa: Desciende en los trastornos hepáticos, pues es en el hígado donde se sintetiza, llegando a un nivel inferior a 600 U.I./l y se incrementa en la tuberculosis o en caso de neoplasias. Lactato-deshidrogenasa (LDH): Como en el derrame pleural, se halla elevada en los exudados ascíticos (>200 U.I./l) de la misma manera que la razón líquido ascítico/suero es superior a 0,6. Se eleva en derrames neoplásicos y de forma leve en los inflamatorios. Sus cinco isoenzimas aumentan en la ascitis maligna, siendo la LDH-2 la de mayor especificidad diagnóstica. Fosfatasa alcalina: Se observa en derrames asociados a cáncer ovárico.

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Amilasa y lipasa: La elevación de ambas es consecuencia segura de la presencia de un proceso pancreático (pancreatitis, tumores y traumatismos). El incremento aislado de la primera sugiere otros procesos extrapancreáticos, fundamentalmente tumorales (neoplasias ginecológicas, quiste ovárico, carcinoma pulmonar, etc.). Adenosín-desaminasa (ADA): Es útil para el diagnóstico de peritonitis tuberculosa, en la que aumenta por encima de 43 UI. Densidad Es paralela a la concentración proteica en todos los casos citados, presentando los trasudados valores inferiores a 1,016. pH El pH del líquido peritoneal del sujeto sano es superior a 7.35, tal como también sucede en los derrames hemáticos y en el exudado de la cirrosis hepática. Por otro lado, tanto en las peritonitis espontáneas (p.e. cirrosis), como en las secundarias, se produce un descenso de estos valores, lo que parece deberse al aumento del metabolismo anaerobio. Asimismo están disminuidos en la carcinomatosis peritoneal y en la peritonitis tuberculosa. Otro parámetro de interés es el gradiente del pH entre la sangre arterial y el líquido ascítico, que adquiere valor diagnóstico cuando es superior a 0,10. Lípidos Su incremento ocasiona la ascitis quilosa, que es secundaria a obstrucción linfática de cualquier etiología, que en la actualidad suele ser un linfoma. Tienen una alta concentración en triglicéridos y baja en colesterol. Lactato Suele ser inferior a 25 mg/dl y se eleva en las mismas situaciones en las que desciende el pH. También es útil el gradiente sangre/ascitis cuando supera los 15 mg/dl. ELEMENTOS CELULARES Neutrófilos Como los procedimientos microbiológicos son lentos y presentan muchos falsos negativos, su cuantificación se hace esencial en las peritonitis bacterianas espontáneas que complican la cirrosis, caracterizada por no presentar una fuente primaria de infección. Normalmente, en ausencia de infección, los leucocitos no superan los 300/μl y predominan los linfocitos, siendo la proporción de polimorfonucleares inferior al 25 %. Si se supera este porcentaje se considera que existe infección, aunque hay casos en que aun así el líquido se mantiene estéril. Más específica es la cantidad de neutrófilos, que es superior a los 250/μl en los procesos sépticos, dato definitivo si se acompaña de clínica. No obstante, los casos con más de 250/μl pero sin síntomas (ascitis neutrofílica) han de considerarse también como peritonitis bacteriana y se deben tratar como tales.

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Linfocitos Predominan en la tuberculosis, superando el 70 %. Pueden también verse incrementados en las neoplasias. Células mesoteliales Pueden aumentar sobre todo en procesos extraperitoneales como en la insuficiencia cardiaca congestiva o el síndrome nefrótico. Eritrocitos Muchas enfermedades, además de los traumatismos, pueden presentarlos elevados en el líquido peritoneal. Dignas de mencionar son las neoplasias, la insuficiencia cardiaca congestiva y la peritonitis tuberculosa. ESTUDIOS MICROBIOLÓGICOS Siempre que se realice una paracentesis diagnóstica se deben recoger muestras para microbiología. El rendimiento aumenta cuando se hace la inoculación directamente en frascos de hemocultivo, ya que las bacterias suelen ser escasas y dejan de ser viables en el tubo al cabo de pocas horas. En la peritonitis bacteriana espontánea (PBE) del cirrótico la positividad de los estudios bacteriológicos no supera el 70%. De ahí la necesidad de tratar las ascitis neutrofílicas. Por el contrario, hay casos con bacteriología positiva pero sin neutrofilia (bacterioascitis). Sólo el 38 % de estos casos evolucionan a PBE y por lo tanto se puede mantener una actitud expectante. Si se sospecha peritonitis tuberculosa se deben realizar cultivos en medios específicos e investigar la presencia de ADN micobacteriano, ya que la tinción de Ziehl-Neelsen raras veces es positiva.

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El líquido ascítico en el diagnóstico diferencial:

Causa Aspecto Proteínas (g/dl)

Gradiente albúmina plasma/ascitis

Leucocitos/μl Otros datos

Cirrosis Claro. Amarillo pálido o intenso si hay ictericia.

< 2,5 (80 %) > 1,1 < 300, predominio linfocitario

LDH < 60 % plasma

Neoplasia Variable: pajizo, hemático, quiloso...

> 2,5 g/dl < 1,1 Variable en cantidad y tipo celular

LDH > 60 % plasma Citología

Peritonitis bacteriana espontánea

Variable: opalino, turbio, raras veces purulento

< 2,5 g/dl > 1,1 > 250 PMN PH < 7,35

Peritonitis secundaria

Turbio o purulento

> 2,5 g/dl < 1,1 > 250 PMN (generalmente > 10.000)

Flora múltiple

Peritonitis tuberculosa

Variable: pajizo, quiloso o hemorrágico

> 2,5 g/dl > 1,1 (puede ser menor en cirróticos)

> 1000. Predominio linfocitario

ADA> 45 U.I../ml Cultivos específicos ADN micobacteriano

Insuficiencia cardiaca congestiva

Claro, amarillo pálido

> 2,5 g/dl > 1,1 (inconstante)

< 1000, abundan células mesoteliales

Pancreatitis Turbio o hemorrágico. Raras veces quiloso

> 2,5 g/dl < 1,1 Variable en cantidad y tipo celular

Amilasa y lipasa

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Objetivo General

Realizar el procedimiento de análisis de los líquidos biológicos. Objetivos específicos

Determinar cada una de las características que se determinan en el análisis de líquidos biológicos.

Procedimiento

Práctico Examen de Líquidos Orgánicos. Muestra:

En las muestra de líquidos orgánicos se incluyen: o Líquido pleural. o Líquido sinovial. o Líquido pericárdico. o Líquido ascítico.

La toma de la muestra para estos líquidos es de responsabilidad del médico tratante. Preparación de reactivos:

Ferricianuro de potasio al 4 por mil.

Hidroxido de sodio al 1 N.

Reactivo de Ropes:

Solución de ácido acético glacial al 5% en agua destilada. Técnica: Examen Físico: Se indica el color, aspecto y se después de una hora coagula espontáneamente. Viscosidad del líquido sinovial: Dejar gotear por la aguja de la jeringa y medir la longitud del hilo formado hasta que se corte la gota. Valor Normal de 4 a 6 cm de longitud. Examen químico: Dosificación de glucosa: se utiliza el método de GOD-PAP. En todos los líquidos los valores son similares a los sanguíneos. Se debe considerar las diferencias entre los valores sanguíneos y los obtenidos en el líquido en estudio.

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Dosificación de Proteínas: Se utiliza el método de exton – rose, tomando en cuenta que hay que realizar una dilución del líquido 1:100 en suero fisiológico. Los valores normales son:

Líquido sinovial : 10 – 30 g/l Líquido pleural : 10 – 20 g/l Líquido pericárdico : 10 – 20 g/l Líquido Ascítico : 10 – 20 g/l

Reacción de Rivalta: En un matraz de 100 ml aforado con agua destilada y una gota de ácido acético glacial, dejar caer una o dos gotas del líquido en estudio y observar cuidadosamente. Si la reacción es positiva, se formarán estrias blanquecinas comparables al humo de cigarro. Esto indicará que la muestra es un exudado. Prueba de Hialuronidato en líquido sinovial: En un tubo colocar 4.0 ml de reactivo de Ropes + 1.0 ml de líquido sinovial. Observar el tipo de coágulo y el sobrenadante. Es normal, observar un coagulo rodeado por una solución clara. Se clasifica como “bueno”. Examen Microcópico Recuento Leucocitario: Realizar una dilución 1: 11 del líquido en estudio con solución de Hayem B. Cargar la cámara de Newbauer

Valores Normales: Líquido sinovial : Menos de 200/mm3 Líquido pleural : Menos de 200/mm3 Líquido pericárdico : Menos de 200/mm3 Líquido ascítico : Menos de 200/mm3

Formula Leucocitaria: Realizar una tinción simple con azul de metileno. Observar con inmersión y diferenciar entre mononucleares y polimorfonucleares. Características de un exudado y de un transudado.

Exudado Transudado

Origen Infeccioso Mecánico

Características Físicas Coagulan espontáneamente No coagulan espontáneamente

Glucosa Menos que en la sangre Similar a la sangre

Proteínas Más de 25 grs. Menos de 25 grs.

Rivalta Positivo Negativo

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Práctico 16: Liquido Cefalorraquideo DISTRIBUCIÓN Y FISIOLOGÍA DEL LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO. El líquido cefalorraquideo (LCR), se encuentra localizado en la profundidad del sistema nervioso central, dentro los ventrículos cerebrales, y también rodea la superficie del encéfalo y la médula espinal en el espacio subaracnoideo que se comunica que con los ventrículos a través de unos pequeños agujeros situados en el techo del IV ventrículo (agujeros de Luschka y Magendie).

En ser humano hay unos 140 mL de LCR de los cuales aproximadamente 30 mL se encuentran situados en el espacio subaracnoideo espinal. Este líquido como cualquier otro fluido biológico se produce y reabsorbe de forma continua para mantener un volumen y composición constante. Plexos coroideos. El LCR se produce principalmente en los plexos coroideos que son estructuras situadas en los ventrículos laterales, III y IV ventrículo, y compuestos de un núcleo vascular con tejido conectivo y rodeado de un epitelio simple. Las células epiteliales poseen en la superficie ventricular un borde en “cepillo” formado por microvilis y es semejante a otros epitelios implicados en el transporte de fluidos como el renal, pero a diferencia de este posee gruesas uniones intercelulares tipo desmosoma que lo hacen impermeable a un gran número de moléculas y constituyen la “base anatómica” de la barrera sangre/LCR. La membrana basal del epitelio es permeable a moléculas de 40.000 daltons y los capilares son también muy permeables. El transporte vía pinocitosis o transporte vesicular es muy frecuente. Es necesario saber que el transporte a través de los plexos coroideos no es unidireccional, si no que estas células son capaces de reabsorber moléculas desde el LCR.

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Capilares cerebrales. Los capilares cerebrales (figura 5) a diferencial de los “sistémicos”, poseen una gruesa membrana basal y gruesas uniones interendoletiales que sirven como un barrera para el movimiento de iones y moléculas hidrosolubles, por lo que la mayor parte del transporte debe realizarse por medio de vesículas o por difusión transendolial. Estos capilares poseen cuatro veces más mitocondrias que un capilar normal, lo que demuestra la dependencia del SNC del transporte activo. Epéndimo. El sistema ventricular está rodeado en toda su extensión de un membrana continua de células ependimarias debajo de la cual se encuentran una capa de fibras gliales. El intercambio de fluidos entre el LCR y el tejido nervios adyacente al epéndimo es fácil. Esta membrana continua se especializa en algunas zonas alrededor del III ventrículo, formando los llamados órganos circunferenciales a saber: la neurohipófisis, la eminencia media, la pineal, el órgano subcomisural , el órgano vasculosum de la lámina terminalis, el subfornical y el área postrema. En conjunto estas estructuras carecen de barrera hematoencefálica (BHE). Granulaciones aracnoideas o de Pachioni. Esta granulaciones son herniaciones de la aracnoides en la duramadre (seno sagital superior principalmente). Dichas granulaciones, que se ven a simple vista, son la principal vía de reabsorción del LCR y están compuestas por un núcleo de tejido conjuntivo y una “caperuza” de células aracnoideas, a través de las cuales el LCR alcanza el espacio venoso. El seno longitudinal superior no es la única vía venosa, existiendo granulaciones microscópicas que a través de las raíces nerviosas alcanzan las venas radiculares. Este mecanismo parece importante en la patógena de algunas enfermedades como el síndrome de Guillain-Barré. FISIOLOGIA del LCR. Producción. El LCR se produce dentro y fuera de los plexos coroideos(el epéndimo es capaz de formar LCR), a un ritmo aproximado de 0.35 mL/minuto. La formación del LCR se produce por diversos mecanismos como: Difusión pasiva, difusión facilitada, transporte activo y transporte vesicular y paracelular. La presión capilar hidrostática es el primero de los mecanismos implicados en la producción de LCR transfiriéndose agua e iones al tejido interticial y posteriormente al epitelio del plexo coroideo, que es atravesado por las uniones intercelulares o a través de las mismas células epiteliales. La secreción de LCR es directamente proporcional al transporte de sodio y que a su vez depende de la bomba Na/K-ATPasa dependiente, existiendo también otras bombas que intercambian cloro por bicarbonato en el extremo apical (superficie ventricular) y bicarbonato por cloro y sodio por hidrogeniones en el polo basal de la célula epitelial. La enzima carbónico anhidrasa se haya presente en el plexo coroideo y cataliza la formación de ácido carbónico desde CO2 y agua, el ácido carbónico se disocia para formar bicarbonato e hidrogeniones. La inhibición de esta enzima

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por la acetazolamida es uno de los principales tratamiento existentes para disminuir la formación de LCR. En la tabla 1 se muestra los diferentes sistemas de transporte. Estos datos sugieren dos mecanismos diferentes en la producción de LCR: una primera filtración desde el capilar y posterior “secreción activa” por parte de los plexos coroideos.

TABLA 1: Sistemas de transporte uni o bidireccionales demostrados in vivo o in vitro en los plexos coroideos.

Cationes Sodio, potasio, calcio y magnesio..

Aniones Tiocianato y sulfato

Acidos orgánicos 5-Hidroxi-indolacético, penicilina, metrotrexate, fenolsulfontaleina, ácido salicílico y prostaglandina E.

Bases orgánicas: Aminas primarias (serotonina y noradrenalina). Aminas terciarias (morfina, codeína). Aminas cuaternarias (hexametonio, colina).

Monosacáridos Glucosa y galactosa.

Purinas Xantinas.

Amino ácidos Básicos, ácidos y neutros.

Vitaminas: Vitamina A, tiamina, nicotinamida, riboflavina, piridoxina, ácido fólico.

Absorción del LCR. El volumen de absorción de LCR es directamente proporcional a la diferencia de presiones entre el líquido y los senos venosos durales y el flujo liquido/seno es unidireccional. La presión en que se produce la “apertura” de las vellosidades aracnoides es de 20-50 mm de agua. Cuando el gradiente de presión aumenta también aumenta el volumen de LCR reabsorbido, al menos en un rango de presiones que varia entre –100 y 300 mm de agua. El sistema es capaz de reabsorber diversos tamaños de partículas que van desde las 0.2 micras del oro coloidal hasta las 7 micras de los hematíes. El mecanismo íntimo de transporte aunque no es bien conocido parece ser debido a un mecanismo de transporte de vesículas gigantes. Otros mecanismos de absorción desde el LCR hasta el torrente circulatorio incluyen a losplexos coroideos y la difusión entre los capilares y el tejido cerebral cercano que son capaces de absorber el LCR que atraviesa el epéndimo. Este mecanismo también se emplea con algunas sustancias muy liposolubles como el CO2.

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Funciones del LCR Función de soporte físico del encéfalo: El LCR envuelve y protege al encéfalo. En condiciones habituales con un cerebro que pesa unos 1500 gr. sin LCR y con un contenido en agua del 80%, su peso cuando “flota” en el LCR se reduce a 50 gr. La importancia de este hecho se demuestra, cuando tras la realización de una neumoencefalografia el estiramiento de los vasos y meninges producía una severa cefalea. El volumen de LCR fluctúa recíprocamente con las variaciones del volumen del encéfalo y de la sangre cuando el cráneo está intacto, siendo esta función de “amortiguación”, también importante tras los cambios de presión registrados con el paso del decúbito al ortostatismo, el ejercicio físico y las variaciones en la presión arterial y el pulso. Función excretora: El LCR posee un función excretora. El SNC carece de linfáticos por lo que los productos del metabolismo cerebral, sólo pueden se evacuados por dos vías: Por el flujo capilar o por el LCR. La circulación cerebral es la vía más importante ( el flujo de 800 mL/minuto apoya este hecho) pero en condiciones patológicas la vía LCR (por ejemplo la excreción de lactato tras una convulsión) parece muy importante. Función de “fregadero”. Este concepto se basa en la demostración de que el LCR posee concentraciones de algunos solutos hidrófilos polares como el tiocianato o la sucrosa inferiores al encéfalo, este hecho permite un flujo lento pero continuo de dichos solutos hacia el LCR, ya que estos se mueven libremente entre el espacio intersticial cerebral y los ventrículos y espacio subaracnoideo. Transporte intracerebral de sustancias. Hay datos concluyente que demuestran que el LCR contribuye al transporte hacia el encéfalo de determinadas sustancias como por ejemplo la TRH y LRH desde su origen hipotalámico hacia la eminencia media a través del III ventrículo.

Tabla 3. Factores capaces de modificar la formación de LCR.

Efecto Sustancia Lugar de acción

Aumenta producción Tóxina de cólera Estímulo adrenérgico

Adenilciclasa Adenilciclasa

Disminuye producción Oubaina Acetazolamida Hiperosmolaridad Hipotermia Hormona natriurética Vasopresina Agonistas serotonina Antatogonistas D1

ATPasa Na/K Anhidrasa Carbónica Capilares de plexos Disminuye metabol. GMP cíclico Receptor coroideo para vasopr. Receptor coroideo serotonina Receptor coroideo D1

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Barrera hemato-encefálica y hemato-líquido cefaloraquídeo. El concepto de barrera-hematoencefálica ( BHE), aparece en 1885 cuando Ehrlich observa que tras la inyección de un colorante como el azul de metileno y otros derivados de las anilinas por vía intravenosa el encéfalo no se tiñe, a diferencia del resto del organismo. En 1913 Goldman muestra que si el colorante se inyecta directamente en las cisternas de la base del cráneo, el encéfalo se tiñe, suponiéndose pues, exista un barrera (la BHE) que impida su paso. El término BHE se ha diferenciado del término barrera hematocefalorraquídeo (BHLCR), que supone la existencia de otra barrera funcional entre el encéfalo y el LCR. Fundamental a este concepto es la existencia de una relativa estabilidad química entre el encéfalo y el LCR, a pesar de cambios en la sangre. Es esencial distinguir entre el cambio neto (acumulación) del turn-over. Así muchos compuestos como la glucosa o los aminoácidos que poseen transportadores específicos y entran rápidamente en el encéfalo no producen cambios netos en las concentraciones del cerebro o del LCR. De esta forma esta barrera debe considerarse como una interfaces dinámicas específicas para las sustancias.

Características de la BHE como un epitelio modificado.

1. Es una lámina de células sobre una membrana basal.

2. Las células están conectadas por uniones gruesas.

3. La permeabilidad es baja para las sustancias hidrófilas sin carga eléctrica, en ausencia de transportadores de membrana.

4. Existe un transporte facilitado de ciertos solutos orgánicos que presentan cinética de saturación , esteroespecificidad e interacciones competitivas entre compuestos semejantes.

5. Datos que apoyan la existencia de sólidas uniones epiteliares son: Alta resistencia eléctrica, permeabilidad iónica baja y baja conductancia hidráulica.

6. Estas características son comunes para la BHE y la barrera entre el plexo coroideo y el LCR (barrera hemato-LCR).

Bases morfológicas de la BHE. La base morfológica de la BHE son los capilares cerebrales con las características ya comentadas, en la tabla 4 se observan las características de este epitelio. Desde el punto de vista morfológico además de las uniones interendoteliales juegan un papel mal conocido: La membrana basal, los pericitos y los pies de los astrocitos. Es necesario conocer que la contigüidad entre el espacio extracelular cerebral y el LCR hacen que su composición sea muy similar.

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Fisiología de la BHE. Las BHE posee una especial permeabilidad para diversos solutos, así el la razón entre las concentraciones LCR/plasma es inversamente proporcional al peso molecular (PM) de las sustancias, un ejemplo de esto es la proporción entre el LCR y el plasma en el caso de la albúmina con PM de 69.000 daltons, que es de 1/200 y existiendo relativamente más albúmina que gamma globulinas con PM de 150.000 daltons. Otros factores importantes son las propiedades físicas de los solutos como: la liposulubilidad, su unión a proteínas plasmáticas y su grado de ionización a pH fisiológico. Los solutos hidrosolubles y polares atraviesan la BHE con dificultad a no ser que dispongan de transportadores especiales como en el caso de la glucosa y los aminoácidos. La BHE posee una importante regulación osmótica siendo casi libre el paso del agua (el 93% de una sola inyección difunde al encéfalo), pero presentando una importante restricción al paso de lo cationes como el sodio o el potasio, que a pesar de poseer transportadores específicos sólo logran el equilibrio con el plasma horas después de la inyección. En la figura 8 se observa la relación entre la solubilidad lipídica y paso de la BHE. Otros factores implicados en la permeabilidad son la carga negativa del capilar cerebral ( la albúmina catiónica pasa mejor que la neutra) y el sistema de transporte coroideo, ya que como se ha comentado previamente la relación entre el LCR y el líquido intersticial cerebral es muy estrecha. La BHE y el LCR actúan como un sistema que mantiene la homeostasis del SNC, facilitando la entrada de los metabolitos necesarios e impidiendo su paso o facilitando la excreción de los innecesarios. Homeostasis del intercambio iónico. Las concentraciones de los iones más importantes se observan en la tabla 2 En general las concentraciones son semejantes al plasma excepto en el caso del cloro, posiblemente debida a la ausencia de proteínas aniónicas en el LCR. Sodio. La concentración de sodio es muy similar entre el LCR y plasma. Su concentración depende de un mecanismo de transporte activo, pero también influye las fuerzas osmóticas. La hipo o hipernatremia plasmática tienen una correlación en LCR, pero el tiempo para alcanzar los nuevos niveles es de 2-4 horas. Potasio. Los niveles de potasio en LCR se mantienen en límites aún más estrechos que en el plasma. Existen dos mecanismos de control: el transporte activo de sangre a LCR vía plexos coroideos y la reabsorción activa desde los capilares cerebrales. Las concentraciones de potasio en LCR disminuyen progresivamente desde los plexos coroideos a la cisterna magna y a la cisterna pericallosa, lo que implica la existencia de un proceso de reabsorción distal a los plexos. Calcio. Los niveles de calcio son inferiores a los plasmáticos y no existe el gradiente rostro caudal del potasio, su mecanismo de entrada al LCR es por un transportador, inhibible por la ouabaina . La correlación sangre/LCR y los niveles licuorales está poco o nada afectados por la paratohormona. Magnesio. Los niveles son superiores a los del plasma y parece haber un gradiente rostrocaudal semejante al del potasio. Las concentraciones en LCR aumenta rápidamente tras la muerte lo que sugiere un sistema activo de reabsorción. Cloro. Los niveles de cloro son mas altos que en plasma y a diferencia del potasio existe un gradiente rostrocaudal positivo, siendo mayores las concentraciones en cisterna magna que en el

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plexo, lo que implica un aporte extracoroideo. El mecanismo de transporte más importante plasma/LCR parece ser pasivo. Glucosa. Existen 5 transportadores que producen una difusión facilitada. Esto transportadores son estero específicos, ya sólo permiten el paso de la D-glucosa. Los transportadores que son independientes de la insulina, se hayan situados en capilares y plexos coroideos. Micronutrientes, vitaminas y BHE. Como se puede ver en la tabla siguiente algunas vitaminas muestran una mayor concentración en LCR que plasma lo que sugiere un mecanismo de transporte activo tal vez desde el plexo coroideo o por captación y difusión desde el SNC. Las concentraciones de tiamina (incluyendo sus formas fosforiladas y no fosforiladas) son más elevadas en la infancia que en la edad adulta. La tiamina se encuentra dentro del SNC principalmente en la forma fosforilada, pero en LCR sólo se encuentran formas libres y escasamente fosforilada. La vitamina E (alfa- tocoferol), posee en el LCR una baja concentración aproximadamente 1000 veces menos en LCR, respecto al suero, lo que posiblemente guarda relación con su unión a las lipoproteínas del plasma.

Concentraciones en sangre y LCR de algunas vitaminas.

Vitaminas Plasma (microM/L) LCR (MicroM/L) Ratio

Acido ascórbico 57 232 4.1

Folato 89 472 5.3

Tiamina 0.41 0.36 0.9

Nicotinamida 0.50 0.70 1.4

Piridoxina 0.30 0.39 1.3

Alfa-tocoferol 26 mM 26 nM 0.001

Aminoácidos. El contenido total de aminoácidos es de 1/3 de la concentración plasmática. La glutamina es el aminoácido con niveles más altos lo que confirma su importancia en la el metabolismo del amonio. Existen mecanismos específicos de transporte para los aminoácidos ácidos básicos y neutros localizados en los capilares cerebrales y plexos.

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Aspectos farmacológicos de las BHE. No sólo las moléculas biológicas, sino también los fármacos están sometidos a control por la BHE. Los factores a tener en cuenta en la evaluación de su potencial difusibilidad son: Tamaño molecular y su unión a las proteínas plasmáticas (los fármacos que mas se unen atraviesan peor la barrera, ya que sólo la atraviesa la fracción libre); La solubilidad en lípidos (los polares e hidrosolubles la atraviesan mal y bien los liposolubles como el etanol); el pH, la acidez o alcalinidad del medio influye en la disociación de fármacos (bases o ácidos débiles), los pH plasmáticos bajos favorecen el paso de los ácidos al aumentar su concentración no iónica y viceversa con las bases; su farmacocinética, los fármacos pueden competir entre si o con diversos sistemas de transporte. Técnica de la punción lumbar. El objetivo de esta técnica es obtener LCR de la región lumbar, para su examen y análisis, dado que su composición es muy semejante al LCR obtenido de los plexos coroideos y de las cisternas de la base. En general es una técnica fácil y segura si se sigue un mínimo de técnica y rutina. Es fundamental la colocación del paciente. El enfermo se coloca en decúbito lateral con las piernas flexionadas (en posición fetal), siendo necesario en ocasiones un colaborador para ayudar a mantener esta postura. Es fundamental que la espalda sea perpendicular al plano de la cama, lo que evitará errores en la localización del espacio subaracnoideo espinal. La punción lumbar es poco dolorosa si se realiza con un mínimo de destreza, pero es fundamental conversar y tranquilizar al paciente sobre el procedimiento, que popularmente se considera como muy doloroso y molesto. La punción se realiza generalmente sobre los espacios intervertebrales L3-L4, que conectan sobre una línea imaginaria que une la cresta iliaca con la columna vertebral. La punción lumbar se realiza con siempre con anestesia local, (procaina, novocaina al 1-2 %) cuando el sujeto esta consciente, previa desinfección de l piel con un antiséptico local (Pavidona) y con guantes y paños estériles. Habitualmente se emplea una aguja del 20 o 22 con un fiador, siendo necesario saber que existe una clara relación entre tamaño de la aguja y cefalea postpunción lumbar. El bisel de la aguja se introduce paralelo al suelo para evitar romper las fibras del ligamento longitudinal posterior. Una vez atravesada la duramadre se siente un “escalón” y se retira el fiador obteniéndose el LCR, si esto no ocurre se debe gira la aguja 90 º antes de realizar un nuevo intento. Complicaciones de la punción lumbar. Herniación cerbral. Esta es la complicación (herniación uncal o de las amígdalas cerebelosas) es la complicación más grave y temida. Puede se inmediata o retrasarse horas y es debida al gradiente de presión creado entre el encéfalo y el espacio subaracnoideo lumbar. Sin embargo aunque temible sólo ocurre en el 1-3% de los casos según las series antiguas. Cefalea postpunción lumbar. Es muy fecuente entre el 10-20% de los casos y es una cefalea frontal u occipital que empeora con el Valsalva y el ortostatismo y cede con el decúbito, habitualmente se acompaña de vómitos y puede haber rigidez de nuca. Se previene utilizando agujas de pequeño diámetro, con técnica depurada y reposos postpunción. Se trata con reposo, cafeína y en raras ocasiones parches de sangre espinales.

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La diplopia, habitualmente por parálisis del VI par infrecuente. La pérdida de audición transitoria y el tinitus son frecuentes. El dolor lumbar difuso por pinchazo en el disco intervertebral o el dolor radicular al “rozar” una raíz se describen en el 10% de los casos y son habitualmente transitorios. Las infecciones son infrecuentes y el uso del fiador del trocar previene la implantación de partículas de piel que con el tiempo producían “tumores epidermoides”. Otras complicaciones como los hematomas subdurales y hemorragias subaracnoideas son infrecuentes. Esto se previene evitando de forma opcional las punciones en pacientes con menos de 50.000 plaquetas y evitándolas ( se requeriría transfusión de plaquetas) con menos de 20.000. Estudio Líquido Cefalorraquídeo El estudio del líquido cefalorraquideo permite la evaluación del sistema nervioso central, frente a noxas del origen bacteriano, viral o mecánicas. Permite diferenciar entre una infección bacteriana o viral (meningitis o encefalitis). El estudio del LCR, consta de dos etapas: un exámen físico-químico y citológico. Para lo cual se realiza: Físico-Químico Color. El color normal del LCR es Agua de Roca (incoloro). Patológicamente puede presentarse:

Hemorrágico, que no se debe confundir con la hemorragia que en ocasiones causa la propia punción (generalmente el tinte hemático va disminuyendo conforme sale el líquido y la centrifugación lo elimina por completo al decantarse los hematíes).

Xantocrómico, que consiste en un color amarillo procedente de la hemoglobina en procesos hemorrágicos. Aparece excepcionalmente en las ictericias (bilirrubinorraquia). Aparece principalmente en recién nacido, por la presencia de bilirrubina alta en sangre.

Aspecto: El aspecto normal del LCR es cristalino. En el caso de tener elementos en estado de suspensión se habla de opalescente, hasta llegar a turbio. pH: Se mide con papel pH, su valor normal es de 8.0 – 8.5. Una disminución en el pH sería indicativo de presencia de metabolismo bacteriano.

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Densidad: Se mide por ejemplo con tiras de orina o con densímetro. Su valor es de 1.005 – 1.010. A mayor concentración de elementos en el líquido mayor será su densidad. Sangre: Presencia de sangre macroscópica, la que podría indicar una punción traumática. Glucorraquia: Se determina la glucosa en el LCR, con el fin de poder evaluar rápidamente la presencia de bacterias en el líquido; debido al consumo de la glucosa por las bacterias, la glucorraquia baja considerablemente. Su cifra normal es de 40 a 70 mg/dl en el adulto y de 60 a 80 mg/dl en el niño. Siempre hay que compararla con el nivel de glucemia, ya que la glucorraquia normal es del 60 al 70% de la glucemia medida simultáneamente y en ayunas. La hiperglucorraquia carece de significado patológico. La hipoglucorraquia (< 40 mg/dl) indica consumo excesivo de glucosa por elementos celulares en el LCR. La glucorraquia tiene valor diagnóstico diferencial en las meningitis de líquido claro. Baja en las de etiología bacteriana y fúngica y normal en la de etiología viral. Proteínorraquia: Su concentración es menor que en el suero. Los valores normales están comprendidos entre 0,20 y 0,45 g/l. El proteinograma normal en el LCR es muy similar al plasmático:

— Prealbúmina (2,3-6,9%) — Albúmina (52,8-73%) — Alfa-1 (3,7-8,1%) — Alfa-2 (4,2-8,8%) — Beta (7,3-14,5%) — Gamma (3,0-9,0%)

La elevación de la albúmina y de las globulinas suele ser paralela a la elevación del número de células, pero algunas veces no ocurre así; es lo que se llama disociación albumino-citológica, que puede tener un alto valor diagnóstico. Los procedimientos turbidimétricos son los que normalmente se utilizan para cuantificar las proteínas espectrofotométricamente. El aumento de proteínas en LCR es un dato poco específico, ya que aparece en numerosos procesos inflamatorios, infecciosos, neoplásicos, etc. La disociación albúmino-citológica consiste en un aumento desproporcionado de las proteínas en relación con las células. Es propio de situaciones de bloqueo del flujo del LCR a lo largo del conducto espinal por tumores, procesos inflamatorios, etc. Se da también en el síndrome de Guillain-Barré. Su grado máximo es el denominado síndrome de Froin en el que la elevada concentración de proteínas da al líquido un

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color amarillento. Por el contrario, en procesos inflamatorios meníngeos sin bloqueo de LCR suele predominar el aumento de células sobre el de proteínas. En la actualidad es posible medir fracciones y subfracciones proteicas en LCR, lo que tiene gran valor diagnóstico en diversas enfermedades. Es el caso de la proteína básica de mielina (normal por debajo de 4 μg/l) y de múltiples antígenos microbianos para los que existen técnicas de detección rápida que permiten tomar decisiones terapéuticas inmediatas en enfermos con meningitis purulentas. En enfermos con infección por VIH la β-2 microglobulina se eleva si existe complejo demencia-SIDA, aunque pierde especificidad porque también lo hace en infecciones oportunistas, que han de ser descartadas. Las gammaglobulinas difunden pasivamente desde la sangre y no son producidas en el espacio intratecal. En algunas enfermedades hay un aumento específico de IgG, como ocurre en algunas meningitis crónicas, infecciones por virus lentos y enfermedades desmielinizantes, lo que sugiere una producción local. La forma de calcular este incremento tomando como base los valores habituales del laboratorio se basa en la siguiente fórmula

Normalmente esta IgG forma una banda única mediante técnicas de isoelectroenfoque, pero en las esclerosis múltiples es frecuente que se diferencien dos o más bandas, denominadas bandas oligoclonales, que además no están presentes en el suero. Este hallazgo no es específico de la esclerosis múltiple, pero su ausencia debe hacer plantearse otras posibilidades diagnósticas. Enzimas: Creatincinasa (CK): El valor medio es inferior a 4 U/l. Se eleva en lesiones cerebrales isquémicas. Adenosín-desaminasa (ADA): Los valores normales están alrededor de 0,4 U/l. Aumenta de forma característica en la meningitis tuberculosa, pero también en infiltración por linfomas. Lactato-deshidrogenasa (LDH): Sus niveles normales son un 10% de la concentración sérica. Aumenta en traumatismos cerebrales, afecciones degenerativas, convulsiones, meningoencefalitis y tumores. Existen varias isoenzimas de la LDH. La LDH4 y la LDH5 están muy elevadas en las meningitis meningocócicas, pero cuando aparecen la LDH1 y la LDH2 constituye indicación de que hay afección de la corteza cerebral. Lisozima: Su aumento es habitual en las meningitis bacterianas agudas.

IgG del LCR (mg/dl) x albúmina sérica (g/dl)

Indice IgG =

IgG del suero (g/dl) x albúmina del LCR (mg/dl)

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Pandy: Este parámetro se utiliza sólo con el reactivo de pandy, el cual es una solución sobresaturada de fenol, que tiene la facultad de evaluar de forma muy macro si dentro de las proteínas presentes en el LCR hay inmunoglobulinas. Es una evaluación semicuantitativa. Clorurorraquia: Se mide la presencia de ión cloro en el LCR, sien su valor normal entre 119 – 121 mmol/l. Citológico: En adultos el número debe ser inferior a 5/mm3 (μl), correspondiendo a los linfocitos un 60-70 %, a los monocitos un 30-50 % y a los neutrófilos un 1-3 %. El significado de un recuento entre 5 y 10 células es dudoso, pero por encima de 10 células es inequívocamente patológico. En niños las cifras de leucocitos aumentan hasta 20-30/mm3, sobre todo en los menores de un año. La pleocitosis con 100-500/mm3 o más células se manifiesta en las meningitis supuradas (predominio polinuclear), linfocitarias y tuberculosa grave (predominio linfocitario) y en la ruptura de abscesos cerebrales. La pleocitosis ligera (10-30/mm3) y moderada (30-100/mm3) con predominio linfocitario se presenta también en procesos crónicos: abscesos cerebrales y, a veces, en la esclerosis múltiple y la neurosífilis. Asimismo existe una pleocitosis en la encefalitis por herpes zoster y en tumores cerebrales y medulares. Las meningitis asépticas, como la recurrente de Mollaret, la secundaria a sarcoidosis o la del lupus eritematoso diseminado suelen cursar con pleocitosis linfocitaria. La pleocitosis eosinófila se debe a parasitosis como la cisticercosis cerebral. En ciertos tumores pueden encontrarse células tumorales. Recuento de Leucocitos (elementos): Se realiza el recuento de leucocitos en cámara de newbauer. Permite determinar si estamos en presencia de infección. Formula diferencial: Se realiza diferenciando solamente las células Polimorfonucleares de las células Mononucleares. Lo que permite diferenciar claramente una infección bacteriana de una viral. En forma paralela a este estudio se realizan otros exámenes tales como Gram de LCR para evaluar la presencia de bacterias en el LCR; Látex de LCR que cosiste en evaluar la presencia de antígenos de bacterias en el líquido frente a partículas de látex bacterio-específicas; Cultivo de LCR. En el caso de sospecha de infección viral actualmente se está solicitando la determinación de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para los virus más frecuentes como Herpes tipo I y II, Citomegaluvirus u otros.

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El líquido cefalorraquídeo (LCR) en el diagnóstico diferencial de las meningitis.

Parámetro LCR normal Meningitis purulenta Meningitis viral Meningitis tuberculosa

Aspecto Células Proteínas Glucosa Cloruros Lactato

Claro (“agua de roca”)

< 5 /μl, linfocitos > 70 %

< 45 mg/dl > 40 mg/dl (70 %

glucemia) 116-122 mmol/l

1-2 mmol/l

Turbio amarillento

10-10.000/μl, neutrófilos > 80 %

> 45 mg/dl < 40 mg/dl

Normales o disminuidos > 2 mmol/l

Claro u opalino

> 100/μl, predominio

mononuclear > 45 mg/dl

Normal

Normales

Normal

Claro o ligeramente turbio

> 100/μl, predominio mononuclear

> 45 mg/dl < 40 mg/dl

Disminuidos

> 2 mmol/l

Observaciones: En las fases muy iniciales de la meningitis tuberculosa puede haber predominio de polimorfonucleares. Las meningitis luética y por hongos se comportan de forma similar a la tuberculosa. En la luética la serología es fundamental. La presencia de eosinófilos es sugerente de etiología helmíntica o medicamentosa. Siempre se debe realizar tinción de Gram y remitir muestra para cultivo

Objetivo General

Realizar el procedimiento de análisis del líquido cefalorraquídeo (LCR) Objetivos específicos

Determinar cada una de las características que se determinan en el análisis de líquido cefalorraquídeo (LCR).

Procedimiento

En un tubo limpio y transparente evaluará el color y el aspecto.

Medirá el pH con cinta de pH, o bien con una tira de orina

Medirá la densidad del líquido usando una tira de orina (puede ser la misma del punto 2)

Observará si la muestra tiene sangre macroscópica y la evaluará en cruces : o No hay: Sin cruces o Escasa Cantidad: + o Regular Cantidad: ++ o Abundante Cantidad: +++

Colocará a centrifugar una cantidad suficiente de líquido para realizar los otros procedimientos dejando muestra sin centrifugar para realizar el recuento de leucocitos.

Una vez centrifugada, del sobrenadante realizar glucorraquia por método de GOD-PAP.

Realizar Proteinorraquia por método de Exton-Rose.

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En un tubo transparente colocar 1- 2 ml de reactivo de pandy y dejar caer 1- 2 gotas de LCR. Se interpreta como positivo si aparece un aspecto de humo de cigarro. Se evalúa:

o No hay: Sin cruces o Escasa Cantidad: + o Regular Cantidad: ++ o Abundante Cantidad: +++

Medir el Cloro presente en el líquido usando un equipo de electrolitos.

De la muestra sin centrifugar realizar una mezcla 1:1 entre el LCR y reactivo de Hayem B.

Cargar la cámara de newbauer y contar todos los elementos (leucocitos) que estén en todos los cuadrantes y multiplicarlos por el factor de dilución.

Obtener el sedimento del tubo centrifugado, extenderlo en un portaobjeto, secarlo a la llama del mechero y teñirlo con una tinción simple de azul de metileno durante 5 minutos, lavar y miran con inmersión.

Preparación de reactivo Reactivo de Pandy: Pesar 8.0 gr de fenol cristalizado, disolver en agua destilada. Aforar a 100 ml. Agitar bien la mezcla y dejar en estufa a 37ºC por dos días, agitando de vez en cuando. Utilizar la capa líquida que sobrenada la capa oleosa que se forma. Solución de Hayem B: Tomar 6.0 ml de ácido acético glacial y completar volumen a 200 ml con agua destilada. Agregar gotas de azul de metileno hasta obtener un color celeste brillante pálido. Solución de azul de metileno:

Azul de metileno 0.30 gr Etanol p.a. 30.0 ml Agua destilada 100.0 ml

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Práctico 17: Líquido Amniótico El líquido amniótico juega un papel fundamental en el crecimiento y desarrollo del feto, le protege, le permite moverse, participa en la homeostasis hidroelectrolítica, permitiendo un desarrollo correcto del aparato digestivo, motor y respiratorio. Inicialmente el líquido amniótico es muy semejante en su composición al plasma materno por lo que se puede considerar un simple dializado. PRODUCCION Y CIRCULACION La edad gestacional condiciona la producción, circulación, composición y volumen, relacionándose también este último con el peso fetal. Inicialmente la fuente de producción es la membrana amniótica, el agua la atraviesa sin necesidad de transporte activo, dependiendo de las modificaciones en la presión osmótica. El área corial, que se correlaciona con la placenta (placa corial) debido a las interconexiones con estructuras vasculares subyacentes, tiene un papel especial en la producción del líquido amniótico. La membrana amniótica se vuelve avascular, por lo que aunque inicialmente el epitelio amniótico tenga características secretoras, éstas se reducen o desaparecen después del primer trimestre. Al final del primer trimestre la producción-circulación está condicionada por el corion, el cordón umbilical, la piel fetal, la deglución-absorción intestinal, la diuresis y, más tarde, el sistema respiratorio fetal. La composición es cada vez más parecida a la orina fetal, ya que ésta es la que contribuye en mayor parte de su producción. La queratinización de la piel disminuye el intercambio a través de ella de forma muy importante a partir de la 17ª semana. El cordón umbilical y las glándulas sudoríparas tienen menos importancia en la producción de líquido amniótico, aunque estas últimas eliminan componentes al líquido amniótico por lo que intervienen en su composición. La mayor parte del líquido pulmonar no llega al espacio amniótico sino que es deglutido por el feto por lo que sí forma parte de la circulación. VOLUMEN Tanto la diuresis como la deglución aumentan hasta la 40ª semana, para disminuir de forma moderada posteriormente. El compartimiento amniótico está conectado con las circulaciones fetomaternas existiendo un intercambio continuo y constante.

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El volumen aumenta desde el principio hasta el final de la gestación y su relación con el volumen embriofetal, que inicialmente es favorable al líquido amniótico y se equilibra en la mitad de la gestación (20ª semana). Se modifica desde los 50 ml en la semana 12ª hasta los 500 ml en la semana 22ª, 1000 ml en la semana 34ª y 600 ml en la 40ª semana. Estos valores son medias con gran dispersión, sobre todo al final de la gestación. Las modificaciones en la hidratación materna sólo en casos extremos modifican el volumen del líquido amniótico. Lo mismo ocurre con la homeostasis de la hidratación fetal, los fetos con exceso de agua pueden transferirlo al líquido amniótico y al contrario los deshidratados absorben más agua y reducen la producción por vasoconstricción. Las modificaciones en el volumen de líquido amniótico pueden ser en los dos sentidos. El oligoamnios se puede asociar a:

Rotura de la bolsa.

Alteraciones estructurales que cursan fundamentalmente con anuria y falta de producción pulmonar.

Situaciones de insuficiencia placentaria por déficit en la perfusión renal. El polihidramnios se asocia a:

Exceso de producción: Metabolopatías maternas, defectos abiertos del tubo neural, hemangiomas coriales, situaciones de hipervolemia (feto receptor en el síndrome de transfusión feto fetal- STFF).

Procesos obstructivos que afecten a la circulación: Obstrucciones digestivas altas.

La evaluación del volumen se hará fundamentalmente por ecografía de forma semicuantitativa mediante diversos índices de líquido amniótico, prescindiendo actualmente de las mediciones cuantitativas con colorantes y solutos. COMPOSICION Inicialmente la composición y la osmolaridad del líquido amniótico son similares a las del suero materno fetal, es un dializado. Al finalizar el 1er trimestre su composición se parece cada vez más a la orina fetal, lo que condiciona que en la mitad del 2º trimestre sea cada vez más hipotónico con respecto al suero materno y fetal, disminuyendo el cloro y el sodio y aumentando la creatinina y la urea lo que refleja la evolución del sistema renal fetal. Componentes del líquido amniótico: Agua y electrolitos: Durante toda la gestación se produce un intercambio de agua y solutos entre la madre, el feto y el líquido amniótico. Si al principio es isotónico se transforma en hipotónico con niveles de sodio y urea similares a los fetales. Proteínas: Proceden tanto de la madre como del feto y se eliminan por deglución fetal. Tienen concentraciones 20 veces menores que en plasma materno. Algunas de origen fetal pueden usarse como marcadores de defectos congénitos, como la alfafetoproteína, originada en el hígado fetal.

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Su aumento se relaciona con defectos abiertos del tubo neural y su disminución con algunas cromosomopatías. Aminoácidos: Su concentración en líquido amniótico es aproximadamente la mitad que en plasma materno. Hormonas: Las proteicas no atraviesan la placenta. Se producen en el feto y se excretan por la orina al líquido amniótico. La de mayor utilidad clínica es la gonadotropina coriónica. Su aumento se usa como marcador de cromosomopatías durante el 1er y 2º trimestres de la gestación así como para el control de la enfermedad trofoblástica. El lactógeno placentario fue muy utilizado el 3er trimestre para valorar la función placentaria aunque actualmente está en desuso. Enzimas: La acetilcolinesterasa, relacionada con defectos del tubo neural, y la fosfatasa alcalina aumentan en los casos de preeclampsia. Sin embargo, el diagnóstico es ecográfico. Lípidos: Los fosfolípidos aumentan su concentración con la edad gestacional. Su origen es fundamentalmente pulmonar (surfactante). UTILIDAD CLINICA DEL LIQUIDO AMNIOTICO La valoración del volumen va a permitir sospechar malformaciones fetales, insuficiencia placentaria o rotura de la bolsa. El líquido amniótico constituye el medio adecuado para investigar la madurez pulmonar (surfactante) mediante una amniocentesis tardía. Las determinaciones a realizar son el índice lecitina/esfingomielina, el test de Clements, la concentración de fosfatidil glicerol y la cuantificación de cuerpos lamelares. En el 2º trimestre es uno de los medios más adecuados para el estudio citogenético del feto (amniocentesis precoz). Objetivo General

Realizar el procedimiento de análisis del líquido amniótico. Objetivos específicos

Determinar cada una de las características que se determinan en el análisis de líquido amniótico.

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Procedimiento ESTUDIO DE LIQUIDO AMNIOTICO ASPECTO

Tipo I Opalescente Tipo II Opalescente escaso Vernix Tipo III Turbio Vernix Abundante Tipo IV Lechoso

Sangreo y/o meconio Citología Líquido Amniótico

o 2 gotas de L.A. o 1 gota Azul de nilo

Observar al microscopio con 40 X

o < 1% < 34 semanas o 1 – 10 % 34 – 38 semanas o 10 – 50 % 38 – 41 semanas o > 50 % > 41 semanas

TETS DE CLEMENS En una serie de tubos colocar:

L.A (ml) Suero Fisiológico (ml) Etanol 95 % (ml) %

1 1.0 ---- 1.0 100

2 0.75 0.25 1.0 75

3 0.50 0.50 1.0 50

4 0.25 0.75 1.0 25

5 0.20 0.80 1.0 20

Agitar 15 segundos observar burbujas a los 2 minutos. Presencia de burbujas (+)

- - - - No existen burbujas: Inmadurez pulmonar + + - - - Intermedio: 50 % de probabilidad + + + - - Madurez pulmonar

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TAP TEST

o 1 ml de L.A. o 1 gota HCl 6N o 1.5 ml de dietileter

Agitar fuerte 3 veces. A los 2 minutos se lee. Más de 5 burbujas (-) OPALESCENCIA A 650 nm

Blanquear con metanol a 650 nm. Colocar el L.A. en un tubo y leer absorbancia.

Mayor a 0.100 madurez pulmonar. FOSFATIDIL GLICEROL.

Colocar en un tubo 1 ml L.A, 1 ml Metanol, 1 ml cloroformo

Agitar bien

Centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos.

Sacar capa inferior a vidrio reloj o tubo precalentado

Evaporar entre el 80 – 90 %

Cargar en un placa de silica 20 a 30 microlitros

Correr en tubo con Cloroformo: metanol: Agua (8:3:0.5)

Teñir con vapores de yodo metálico

El fosfatidil glicerol aparece a los 2.3 cm. (de una corrida de 5 cm).

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Práctico 18: Espermiograma En los últimos años se han logrado avances notables en el conocimiento de los mecanismos de la reproducción humana, así como en los métodos de investigación y diagnóstico de los trastornos de la fertilidad. A pesar de esto, el análisis del semen sigue siendo un examen imprescindible en el estudio del hombre que acude a consulta por infertilidad; luego se realizan otros exámenes según los resultados del mismo. En la literatura, el análisis del semen o análisis seminal ha recibido distintos nombres, como: espermograma, espermiograma, espermatograma, espermocitograma, espermocinetograma. El término espermograma es uno de los más utilizados en las publicaciones de América Latina, mientras que espermiograma es más utilizado en las provenientes de España, los otros son de uso mucho menos común. Nosotros preferimos utilizar espermograma o simplemente análisis seminal. Un análisis seminal completo nos informa sobre las propiedades del semen en su conjunto, tanto de la producción de espermatozoides como de la función de las glándulas sexuales accesorias, aspectos que analizaremos a continuación. Para llegar a conclusiones se recomienda realizar al menos 2 análisis seminales, con no menos de 15 d ni más de 90 d de separación entre ambos, además es recomendable una abstinencia sexual de 3 a 5 d, que nunca debe ser menor de 2 d ni mayor de 7. Si cualesquiera de los indicadores es normal en uno de los exámenes se considera que ese indicador es normal, pero si está alterado en ambos se concluye como anormal. Si los resultados de estos 2 análisis seminales son marcadamente diferentes debe repetirse un tercer examen antes de hacer conclusiones pues la producción de espermatozoides puede variar considerablemente, tanto en algunos hombres normales como en ciertas circunstancias anormales. Los indicadores o marcadores utilizados para evaluar la calidad del semen en el espermiograma "clásico, estándar o tradicional" son fundamentalmente los siguientes: conteo de espermatozoides por mililitro (concentración o densidad), conteo total de espermatozoides, movilidad, viabilidad y morfología normal de los espermatozoides; también deben evaluar-se otras características físicas del semen como su apariencia, volumen de semen eyaculado, viscosidad o consistencia y pH del semen, así como conteo de células, en especial leucocitos. Ha de recordarse que existe un grupo elevado de hombres que acuden a consulta por infertilidad y tienen un espermograma estándar normal (48,3 % en nuestra consulta y 49,2 % en el estudio multicéntrico de la OMS), a estos los clasificamos en la categoría diagnóstica de "Causa no demostrable". Esto nos indica que en ocasiones son necesarios otros elementos que permitan definir mejor la capacidad de fertilización de los espermatozoides. En la tabla mostramos los criterios de normalidad al examinar una muestra de semen. En la literatura, la nomenclatura usada para describir las distintas alteraciones del espermograma no ha sido uniforme, lo cual con frecuencia confunde al lector no especializado, pues un mismo término se ha utilizado con diferentes acepciones y también, diferentes términos para describir una misma alteración. Por estos motivos la Asociación Internacional de Andrología y el Grupo de Expertos de la OMS han recomendado utilizar una clasificación descriptiva de dichas alteraciones que permita uniformidad y evite confusiones. Esta clasificación descriptiva la iremos analizando en esta revisión, pero a continuación mostramos un resumen.

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TABLA. Valores normales de los indicadores del espermograma

Indicadores Valores normales

Volumen eyaculado 1,5 - 6,0 mL

pH del semen 7,2 - 8,0

Concentración espermatozoides/mL $ 20 000 000

Conteo total de espermatozoides $ 40 000 000

Movilidad lineal progresiva (a+b) $ 50 %

Movilidad lineal rápida (a) $ 25 %

Morfología normal $ 50 %

- Criterio estricto $ 30 %

Viabilidad $ 50 %

Aglutinaciones # 10 %

NOMENCLATURA DESCRIPTIVA DE LOS HALLAZGOS DEL ESPERMOGRAMA - Normozoospermia: Concentración de espermatozoides 20.000.000/mL. - Oligozoospermia: Concentración de espermatozoides 20.000.000/mL. - Astenozoospermia: Menos del 50 % de espermatozoides con progregresión lineal (movilidad a+b) o menos del 25 % con progresión rápida (movilidad a). - Teratozoospermia: Menos del 50 % de espermatozoides con morfología normal. - Azoospermia: Ausencia de espermatozoides en el eyaculado. - Aspermia: Ausencia de eyaculado externo. - Leucocitospermia: Presencia de 1.000.000, de leucocitos/mL. La interpretación de las características de las distintas cualidades del semen que ofreceremos se basa fundamentalmente en nuestra experiencia, aunque también nos apoyamos en las recomendaciones de la OMS y en las experiencias de otros autores de reconocido prestigio. CONTEO DE ESPERMATOZOIDES/mL (CONCENTRACIÓN O DENSIDAD) Las cifras "normales" tomadas de una población general, sin tener en cuenta su fertilidad, han variado a través del tiempo; de la cifra entre 60 y 120.000.000/mL que aparece en libros de texto antiguos se ha llegado al criterio actual de normalidad (normozoospermia), que un comité de expertos de la OMS ha situado en la cifra de 20.000.000/mL o más. Sin embargo, en lo referente a cuáles son las cifras "fértiles" la discusión es aún mayor, como veremos más adelante. Se ha definido como oligozoospermia a la concentración de espermatozoides menor de 20.000.000/mL, a su vez esta puede dividirse en 3 grados: a) oligozoospermia ligera: cifras entre 10 y 20.000.000/mL, b) oligozoospermia moderada: concentración entre 5 y 10.000.000/mL y c)

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oligozoospermia severa cuando el conteo está por debajo de 5.000.000/mL. La severidad de la oligozoospermia no nos permite conocer la causa del trastorno y en cuanto al pronóstico actualmente sólo es posible afirmar que cifras inferiores a 5.000.000/mL (oligozoospermia severa) tienen una relación inequívoca con el grado de fertilidad del sujeto en cuestión; por encima de esa cantidad los resultados son variables pues no se ha hallado una relación constante y resulta frecuente observar embarazos con concentraciones entre 10 y 20.000.000/mL. Creemos que el límite de 10.000.000/mL expresa cambios de importancia en el epitelio germinal o en el testículo en general, pues por debajo de este límite hemos encontrado elevación de las gonadotropinas (FSH y LH) y disminución de testosterona y dihidrotestosterona en plasma, lo cual no se observa con cifras mayores. La azoospermia se define como la ausencia de espermatozoides en el semen e indica un daño severo del epitelio germinal (azoospermia secretora), cuyas causas más comunes son la aplasia germinal o síndrome de sólo células de Sertoli y la detención de la maduración espermática o arresto de la espermatogénesis, también puede deberse a una obstrucción total de las vías seminales (azoospermia obstructiva); el hallazgo de azoospermia en una muestra de semen, ya sea secretora u obstructiva, es siempre de muy mal pronóstico, según nuestra experiencia, prácticamente nunca responde al tratamiento aunque se conozca su causa precisa. CONTEO TOTAL DE ESPERMATOZOIDES El conteo total de espermatozoides suele reflejar el estado de la espermatogénesis, pero también está en relación directa con el volumen eyaculado y con el período de abstinencia sexual previo. Se calcula con una simple operación aritmética de multiplicador la concentración de espermatozoides/mL por el volumen eyaculado. En la actualidad se considera normal cuando la cifra es de 40.000.000 de espermatozoides o más. Este indicador tiene las mismas implicaciones y limitaciones que la concentración/mL. MOVILIDAD DE LOS ESPERMATOZOIDES Para la correcta evaluación de la movilidad, el espermograma debe haber sido hecho en las primeras 2 horas de haberse producido el eyaculado, a un mayor intervalo de tiempo desde la eyaculación se hallará un menor porcentaje de espermatozoides móviles. En años recientes se han desarrollado nuevas técnicas que permiten medir objetivamente y con medios computadorizados las características del movimiento de los espermatozoides, pero los equipos no están disponibles en muchos centros, pues son costosos. Por esta razón, la OMS recomienda un sistema simple de medir la movilidad espermática sin necesidad de equipos complejos, para esto la movilidad se divide en 4 categorías, a saber: a) movilidad progresiva rápida, b) movilidad progresiva lenta, lineal o no, c) movilidad no progresiva y d) inmovilidad (espermatozoides inmóviles). Se considera normal cuando el 50 % de los espermatozoides o más presentan una movilidad progresiva rápida (categoría a). La disminución de la movilidad se denomina astenozoospermia, puede ser un hallazgo aislado en el espermograma o acompañarse de alteraciones en la concentración y morfología normal de los espermatozoides (que es lo más común), en este último caso indica un daño global de la espermatogénesis. La disminución de la movilidad espermática tiene múltiples causas que no son posible diagnosticar por el simple análisis seminal y en la mayoría de los casos tampoco es posible establecer un pronóstico por este examen. Una excepción a lo dicho anteriormente es el hallazgo de una movilidad menor del 5 % o incluso nula por completo, asociada a densidad, morfología y viabilidad espermática normal o muy cercanas a lo normal, en este caso es muy probable se trate de un síndrome de cilias inmóviles, trastorno de causa genética que es irreversible y que por tanto hasta el presente los pacientes son

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definitivamente estériles; el diagnóstico de certeza se realiza por medio de la microscopia electrónica. Se considera que es menos probable que un hombre sea fértil si tiene menos del 40 % de espermatozoides con movimiento lineal progresivo, pero no existe una relación directa entre el porcentaje de espermatozoides móviles y la fertilidad potencial de un individuo. En ocasiones, al analizar el semen por el microscopio, se observan espermatozoides aglutinados, estas aglutinaciones pueden ser cabeza-cabeza, cola-cola, pieza intermedia-pieza intermedia o cualquier otra combinación. La aglutinación puede ser un fenómeno normal siempre que no afecte a más del 10 % de los espermatozoides del eyaculado. Cifras mayores pueden deberse a trastornos inmunológicos o a infecciones. Es importante conocer que la aglutinación puede interferir la medición de la movilidad y si tenemos una muestra de semen donde se informa aglutinación y movilidad disminuida es necesario repetir el examen antes de hacer conclusiones. VIABILIDAD DE LOS ESPERMATOZOIDES Cuando en un espermograma se comprueba astenozoospermia es necesario medir la viabilidad o porcentaje de espermatozoides vivos; esto permite precisar si la baja movilidad se debe en realidad a que existe un gran número de espermatozoides muertos, lo que habitualmente tiene un peor pronóstico. En 1986, la OMS daba como valor normal el hallazgo de 60 % o más de espermatozoides vivos, en la segunda edición del Manual de laboratorio de la OMS para el examen del semen humano, se daba como valor normal 50 % o más de espermatozoides vivos, mientras que en la tercera edición de este Manual la cifra normal se considera 75 % o más. En nuestro laboratorio la cifra normal, basada en un estudio de hombres sanos, es de 50 %. Estas diferencias demuestran la importancia de que cada laboratorio establezca sus valores normales. El hallazgo en un espermograma de una disminución de la movilidad espermática con un porcentaje normal de espermatozoides vivos sugiere la existencia de anomalías estructurales de la cola de los espermatozoides, cuyo diagnóstico de certeza sólo puede hacerse por microscopia electrónica; estas anomalías, entre las que se incluye el síndrome de cilias inmóviles mencionado anteriormente, tienen muy mal pronóstico. Si la concentración y la morfología de los espermatozoides es normal y el porcentaje de espermatozoides muertos es mayor de lo normal el trastorno se ha denominado necrozoospermia. Este hallazgo se consideró muy raro, de pésimo pronóstico y de etiología desconocida. En la actualidad, la mayoría de los investigadores dudan de su existencia y lo atribuyen a defectos en la técnica de tinción, incluso en la última edición del Manual de la OMS no se incluye este término. En el laboratorio de nuestro Instituto nunca hemos encontrado un caso en más de 30 años de trabajo. MORFOLOGÍA NORMAL DE LOS ESPERMATOZOIDES El criterio de nivel normal de la morfología espermática ha variado a través del tiempo. Los estudios clásicos de la era moderna consideran como normal el hallazgo del 50 % o más de espermatozoides de morfología normal, cifra que utilizamos en nuestro laboratorio y que era la recomendada por la OMS. En fecha reciente se ha sugerido que cuando se utilizan criterios "estrictos" de normalidad, el límite debe ajustarse en un nivel inferior. Aunque no hay estudios clínicos que permitan hacer conclusiones definitivas, empíricamente muchos autores (incluyendo los expertos de la OMS) han recomendado tomar como valor de referencia la cifra de 30 % o más de formas normales. y en fecha más reciente se ha sugerido que el límite normal es 14 %. El uso de los criterios estrictos, descriptos por Kruger, tiene el inconveniente de que es necesaria una tinción especial que no está disponible en todos los laboratorios. El aumento de formas anormales

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puede existir aisladamente y se denomina teratozoospermia, pero con más frecuencia se asocia a alteraciones de la concentración y movilidad de los espermatozoides. La relación de la morfología espermática con la fertilización es de difícil interpretación pues en un mismo eyaculado se presenta una gran variabilidad y en muchos espermatozoides anormales se observan múltiples defectos. No es frecuente que en un paciente dado se presente un defecto único en todos los espermatozoides o en la mayoría de ellos. Por estas razones, en la literatura no hay un acuerdo sobre si el resultado de la morfología debe expresarse en forma global (total de espermatozoides normales y anormales) o si es más conveniente especificar el porcentaje de ellos con anomalías de la cabeza, pieza intermedia y cola; incluso se ha sugerido que el número promedio de defectos por espermatozoide puede ser un predictor de su función. La teratozoospermia puede observarse en un gran número de trastornos, como el varicocele, la sepsis seminal, el estrés y la exposición a agentes externos nocivos, entre otros, por lo cual su presencia no es suficiente para establecer un diagnóstico causal. En cuanto a su valor pronóstico, también es muy difícil de establecer, aunque es necesario aclarar que en raras ocasiones se encuentran anomalías morfológicas que invariablemente den lugar a esterilidad, entre estas tenemos los espermatozoides de cabeza redonda, los de cabeza en forma de pera y los de cabeza en forma de cabeza de alfiler. Para comunicarle al paciente su mal pronóstico recomendamos que se haya comprobado que esta anomalía existe en más del 95 % de sus espermatozoides. OTRAS CÉLULAS EN EL SEMEN El semen eyaculado invariablemente contiene otras células además de los espermatozoides, entre ellas se incluyen células epiteliales de la uretra, células espermatogénicas inmaduras de distintos tipos y leucocitos. La concentración del total de células debe medirse y dar su resultado en porcentaje; se considera normal que el eyaculado no contenga más del 5 % de estas células. La presencia de células espermatogénicas inmaduras en el eyaculado es un signo de irritación del epitelio germinal y en ocasiones hemos observado este fenómeno si se producen eyaculaciones repetidas o después de un tratamiento de la oligozoospermia idiopática. Su presencia no es útil para establecer un diagnóstico causal ni para conocer el pronóstico. Las células de mayor importancia son los leucocitos; se considera que en un eyaculado normal debe haber menos de 1.000.000/mL. La presencia de cantidades mayores de leucocitos se denomina leucocitospermia y no siempre se debe a procesos infecciosos, pero la ausencia de ellos tampoco nos asegura que no exista una sepsis de las vías seminales. No obstante, aunque la leucocitospermia per se no asegura el diagnóstico de infección sí se considera un signo de sospecha, que en asociación con otros signos seminales y clínicos confirman dicho diagnóstico. Estos signos y síntomas son los siguientes: leucocitospermia repetida, dolor al eyacular, antecedentes de infección genitourinaria o de enfermedades de transmisión sexual, examen anormal de la próstata, epidídimos y vesículas seminales, análisis anormal del líquido prostático, alteraciones de las características físicas o bioquímicas del plasma seminal y análisis bacteriológico anormal. Seguimos los criterios de la OMS en cuanto a la combinación de 2 o más de estos signos para establecer el diagnóstico de sepsis de las vías seminales. La importancia de este diagnóstico radica en la posibilidad de su tratamiento inmediato con antibióticos específicos para así evitar secuelas a largo plazo. Nosotros no hemos encontrado relación entre infecciones subclínicas (por gonococo u otros microorganismos) y alteraciones del espermograma antes ni después del tratamiento específico; tampoco hemos hallado diferencias entre pacientes infértiles con infecciones seminales subclínicas y sin ellas. Otros autores han obtenido resultados similares, por lo cual está

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en duda que la infección seminal tenga un efecto deletéreo inmediato sobre la fertilidad, esto no significa que no deba ponerse tratamiento inmediato al paciente. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DEL SEMEN Las características físicas del semen, como son su apariencia, viscosidad o consistencia, volumen y pH tienen valor sobre todo cuando se analizan en conjunto con los otros indicadores. ASPECTO El semen normal recién eyaculado tiene una apariencia homogénea y gris-opalescente a la inspección simple. Si la apariencia es anormal, el laboratorio debe consignar qué tipo de anormalidad existe. En ocasiones, el semen puede aparecer menos opaco si la concentración de espermatozoides es muy baja, otras veces es de color carmelita, pardo o marrón si contiene hematíes. En los pacientes con esta última alteración, conocida con el nombre de hemospermia o hematospermia, es necesaria una valoración cuidadosa por un urólogo. CONSISTENCIA O VISCOSIDAD No se conoce la causa por la cual en algunos pacientes se observa una consistencia aumentada o la presencia de bridas mucosas, aunque algunos autores han sugerido que podría ser un signo de infección. La importancia de este hallazgo es que el médico debe conocer que esta alteración puede interferir la medición de otros indicadores como la concentración y la movilidad de los espermatozoides; por tanto, cuando se informa esto y hay alteraciones de esos indicadores es necesario repetir el espermograma antes de dar conclusiones al paciente. VOLUMEN EYACULADO Los criterios de normalidad en relación con el volumen de semen eyaculado también han sufrido variaciones. En nuestro laboratorio consideramos como normal el volumen entre 1,5 y 6 mL, mientras que en la última edición del Manual de la OMS se considera normal 2 mL o más; según este último criterio nunca podría hablarse de un volumen aumentado. Nosotros seguimos aceptando como límites normales las primeras cifras, o sea entre 1,5 mL y 6 mL, por razones que expondremos a continuación. El volumen puede hallarse disminuido (< 1,5 mL) en los pacientes con obstrucciones totales o parciales de las vías seminales. En el síndrome de ausencia funcional de los conductos eyaculadores se halla un volumen muy disminuido, habitualmente menos de 1 mL, acompañado de otras alteraciones del eyaculado que analizaremos más adelante. Otros trastornos que pueden dar lugar a un volumen disminuido son el síndrome de Klinefelter y el hipogonadismo hipogonadotrópico, por la baja estimulación androgénica de las vesículas seminales. La ausencia total de eyaculado, que se denomina aspermia, se observa con más frecuencia en pacientes con eyaculación retrógrada o con hipogonadismo severo. Algunos autores han sugerido que un volumen seminal aumentado (> 6 mL) puede ser un signo de infección de las vías seminales y, en particular, de las vesículas seminales. Nosotros no hemos encontrado ninguna relación entre el volumen seminal y la presencia de infecciones, pero sí hemos observado que cuando un paciente tiene un volumen aumentado con gran frecuencia se asocian alteraciones de otros indicadores seminales.

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pH DEL SEMEN El pH del semen varía normalmente en un rango muy estrecho (7,2 - 8,0), pocos son los trastornos capaces de alterarlo. Es importante asegurarse que el laboratorio esté usando el papel de pH adecuado pues de otra manera las lecturas pueden ser falsas; el mejor es el papel con rango 6,4 - 8,0, que es el que más se ajusta al pH del semen, pero en su defecto puede usarse el de rango 6,1 - 10,0. Nosotros hemos visto estudios de otros laboratorios donde se ha informado un valor de 10,0 y hasta 11,0, lo que desde el punto de vista biológico es totalmente imposible. Se ha sugerido que un pH elevado (> 8) puede considerarse un signo de infección seminal si se asocia a otros síntomas y signos de sospecha, mientras que un pH disminuido (< 7,2) se observa cuando existe un déficit de la función de las vesículas seminales, en especial en pacientes con el síndrome de ausencia funcional de los conductos eyaculadores. ANÁLISIS BIOQUÍMICO DEL PLASMA SEMINAL Aunque el análisis bioquímico del plasma seminal no forma parte del espermograma tradicional, en la actualidad, en muchos laboratorios se están realizando mediciones de varios marcadores de la función de las glándulas sexuales accesorias. PRINCIPALES MARCADORES SEMINALES DE LA FUNCIÓN DE LAS GLÁNDULAS SEXUALES ACCESORIAS

Glándulas accesorias Marcadores

Epidídimos Alfaglucosidasa

Carnitina libre

Glicerilfosforilcolina

Vesículas seminales Fructosa

Prostaglandinas

Próstata Ácido cítrico

Fosfatasa ácida

Cinc (Zn)

El análisis bioquímico está indicado especialmente cuando el volumen eyaculado se encuentra por debajo de lo normal (< 1,5 mL), cuando existe una rápida disminución de la movilidad de los espermatozoides o cuando se quiere investigar el efecto de medicamentos, tóxicos u otros factores sobre la función de las glándulas sexuales accesorias. Estas mediciones también deben indicarse en todos los pacientes azoospérmicos. En general, la disminución de la función secretoria de dichas glándulas se refleja en una disminución en el plasma seminal del marcador específico. Un inconveniente de estas determinaciones es que en ocasiones hay trastornos, por ejemplo infecciones, que causan

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disminución de la función secretoria de una glándula, pero la cantidad total del marcador todavía se mantiene en el rango "normal"; también puede ocurrir que la infección cause un daño irreversible del epitelio secretor y que entonces, incluso después de curada ésta con tratamiento, el valor del marcador se mantenga por debajo del rango normal. Además de las infecciones seminales, que son la causa más común, otros trastornos que pueden afectar la capacidad secretora de las glándulas sexuales accesorias son las inflamaciones (de cualquier causa), así como las obstrucciones totales o parciales de las vías seminales, generalmente secuelas de infecciones o inflamaciones. Aunque, teóricamente, los tumores de la región y las anomalías congénitas de las glándulas accesorias también pueden provocar disminución de su función, en la práctica clínica diaria estos trastornos son muy raros. SÍNDROME DE AUSENCIA FUNCIONAL DEL LOS CONDUCTOS EYACULADORES Este síndrome seminal que fue descrito en 1972, no se puede considerar raro en modo alguno, pues se ha hallado hasta en el 14,8 %, aproximadamente, de los pacientes azoospérmicos. El diagnóstico se basa en la alteración de varios tipos de indicadores del semen; se caracteriza por azoospermia, volumen eyaculado disminuido (generalmente < 1 mL), pH ácido (< 7,0), marcadores de la función de las vesículas seminales muy disminuidos (en especial la fructosa), y marcadores de la función prostática elevados (en especial la fosfatasa ácida y el ácido cítrico). En aquellos laboratorios en que no sea posible la determinación cuantitativa de los distintos marcadores de la función de las glándulas sexuales accesorias, al menos podrían valerse de la determinación cualitativa de fructosa, que es un método muy sencillo, de fácil realización y que en estos casos el resultado es negativo. Es muy importante el diagnóstico de este síndrome, pues su tratamiento sólo es posible en centros muy especializados que cuenten con métodos sofisticados, ninguno de ellos disponible en nuestro medio. Las causas más frecuentes son la agenesia de los vasos deferentes y vesículas seminales y la obstrucción, congénita o adquirida, de los conductos eyaculadores. Recientemente hemos descrito 2 hermanos con agenesia de los vasos deferentes, que constituyen el segundo informe en la literatura de la presentación familiar de este trastorno. Objetivo General

Realizar el procedimiento de análisis de espermiograma. Objetivos específicos

Determinar cada una de las características que se determinan en el análisis de espermiograma.

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Procedimiento Examen macroscópico. Al líquido seminal se le determina los siguientes aspectos macroscópicos.

Volumen (ml) : Valor Referencia 1,5 – 6,0 ml pH : Valor Referencia 7,2 – 8,0 Color : Valor Referencia Blanco Grisáceo Olor : Valor Referencia Jugo de Castaña Mucolisis : Valor Referencia Completa (15 – 30 minutos) Viscosidad : Valor Referencia Menor a 2 cm

Examen microscópico. Se realiza un examen directo dentro de la primera hora en la cual se informa:

o Densidad espermática (Buena, regular, mala cantidad de espermatozoides) o Vitalidad (si los espermatozoides están vivos o muertos) o Motolidad (Si los espermatozoides vivos presentan motilidad progresiva)

En la misma muestra se determina el grado de motilidad:

o Grado 0 : Inmóviles <40% o Grado I-II : Movimiento pendular sin desplazamiento <40% o Grado III – IV : Movimiento progresivo rápido >40%

Además determinar la viabilidad:

o Muertos : no se mueven < 40% o Vivos : Que se mueven > 60%

Se realiza un recuento de espermatozoides: llave. Coloque la solución en una cámara de Newbauer, espere 5 minutos y lea con aumento mayor las 4 esquinas y el centro del reticulado central, multiplique por 45, por la dilución, el factor cámara y por 100, para llevar el recuento a 1 ml. Este valor se multiplica por el volumen eyaculado para obtener el recuento total en la muestra

o Recuento espermático ( millones/mm3) : > 20 x 10 esp/mm3 o Recuento total : > 40 x 10 esp/ muestra

Además se aprovecha contar los posibles leucocitos presentes en la muestra (< 1 x 10/mm3) y las células inmaduras (< 0,1 x 10/mm3).

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Morfología espermática Se realiza un frotis (como para extendido de sangre) y se fija con calor (mechero), se deja secar y se observa directamente con aumento mayor, se cuentan 100 espermatozoides clasificándolos en

o Normales: > 60 % o Anormales: <40 %

De los anormales se clasifican en:

o Defectos de cabeza o Defectos pieza media o Defectos de cola

Nomenclatura del espermiograma

o Normozoospermia : Concentración de espermatozoides > 20 x 10/mm3 o Oligozoospermia : Concentración de espermatozoides < 20 x 10/mm3 o Astenozoospermia : Menos del 50% de espermatozoides con progresión lineal

(movilidad III + IV o menos del 25% con progresión rápida (motilidad IV) o Teratozoospermia : Menos del 50 % de espermatozoides con morfología normal. o Azoospermia : Ausencia de espermatozoides en el eyaculado. o Aspermia : ausencia de eyaculado externo o Leucocitospermia : > 1 x 10 leucocitos/mm3.