UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR … · INFORME DEL TRIBUNAL CALIFICADOR Quito, 11 de noviembre de 2015 Señora: Dra. Isabel Fierro DECANA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Presente

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS

Estudio comparativo de tres métodos analíticos para la determinación

de grasa en leche cruda

Autor: Paola Tatiana Toapanta Toapanta

[email protected]

Tesis para optar por el Título Profesional de:

QUÍMICO DE ALIMENTOS

Tutor: Dr. Iván Luis Tapia Calvopiña

[email protected]

Quito, noviembre 2015

i

Toapanta Toapanta, Paola Tatiana (2015). Estudio

comparativo de tres métodos analíticos para la

determinación de grasa en leche cruda. Trabajo de

investigación para optar por el grado de Químico de

Alimentos. Carrera de Química de Alimentos.

Quito: UCE. 145p.

ii

Dedicatoria A mis amados padres CARLOS y GLORIA por su inmenso amor, dedicación, paciencia y por

haberme brindado los recursos necesarios para poder culminar este sueño. Gracias a ellos y a

todas sus enseñanzas he logrado convertirme en una persona de bien, perseverante, dedicada y

con objetivos claros en la vida.

A mis adorados hermanos DAYSI y CARLOS quienes han sido mi fuente de inspiración, por ser

grandes en todo aspecto y acompañarme en todo momento, gracias por su apoyo incondicional.

Su esfuerzo, dedicación, perseverancia y tenacidad en la vida, me han enseñado que hay que

saber arriesgarse para llegar a conseguir lo que uno se propone.

A mí queridísimo hermano OMAR al que quiero demostrar que con constancia, esfuerzo y

dedicación se puede alcanzar la meta propuesta, así que ánimo hermano tú puedes salir adelante

y llegar a ser grande. Gracias hermanos no saben cuánto agradezco el privilegio de ser su

hermana, los amo demasiado.

A ti Steven quien ha sido un hermano más, gracias por ayudarme siempre y acompañarme en

todo momento, te quiero mucho.

A mi mejor amiga Vane, quien gracias a su justa y oportuna intervención hizo que mi vida

profesional tomara el rumbo correcto, gracias amiga por todo el apoyo incondicional. No puedo

dejar de nombrar al resto de mis amigas Miry, Eve, Anita, Mony y Albita quienes han sabido

comprenderme, aceptarme y ayudarme en todo momento, gracias a ustedes chicas todos los

momentos vividos en la facu serán los mejores recuerdos e inolvidables.

Como no dedicar este trabajo a dos excelentes amigas Gaby Ipiales y Gaby Garcés quienes

aparecieron en el momento preciso y han sido parte fundamental de los cambios en mi vida,

convirtiéndose en un apoyo incondicional, las admiro y quiero demasiado.

Paola Tatiana Toapanta Toapanta

iii

Agradecimientos

A Dios por haberme dado la fortaleza y sabiduría para poder culminar este proyecto y por

haberme brindado la mejor familia y amigos.

A mis amados padres y hermanos por todo su apoyo, por soportarme siempre y ayudarme en

todo momento, son los mejores.

A mi querida Universidad y por supuesto a mi Facultad en donde tuve la oportunidad de conocer

a profesionales de excelente nivel quienes han sabido impartir su conocimiento de la manera más

precisa, además de ser grandiosas personas.

A mi tutor de tesis, Dr. Iván Tapia, por la paciencia, colaboración y motivación que me ha

brindado para realizar este proyecto y por compartir conmigo sus amplios conocimientos y

experiencias.

A mí querida Inge Milene Díaz por ser más que una maestra una amiga incondicional y a mi

queridísima Dra. Lorena Goetschel quien llegó en el momento justo e hizo que el amor por nuestra

carrera sea aún más grande.

A AGROCALIDAD por haberme permitido desarrollar mi trabajo, a todo el personal del

Laboratorio de Control de Calidad de Leche por haber impartido todo su conocimiento.

A todos los que formaron parte de esta etapa de mi vida infinitas gracias.

iv




Yo, Paola Tatiana Toapanta Toapanta, en calidad de autor del trabajo de investigación o tesis

realizada sobre “ESTUDIO COMPARATIVO DE TRES MÉTODOS ANALÍTICOS PARA

LA DETERMINACIÓN DE GRASA EN LECHE CRUDA”, por la presente autorizo a la

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me

pertenecen o de parte de los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o

de investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización,

seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19

y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.

Quito, a los 09 días del mes de noviembre de 2015

Paola Tatiana Toapanta Toapanta

C.C. 172019973-4

v




Por la presente, dejo constancia que he leído la tesis presentada por la Señorita Paola Tatiana

Toapanta Toapanta para optar por el título profesional de Químico de Alimentos cuyo tema

es; “ESTUDIO COMPARATIVO DE TRES MÉTODOS ANALÍTICOS PARA LA

DETERMINACIÓN DE GRASA EN LECHE CRUDA”, la misma que reúne los

requerimientos, y los méritos suficientes para ser sometida a evaluación por el tribunal

calificador.

En la ciudad de Quito, a los 28 días del mes de octubre de 2015

Dr. Iván Tapia

C.I. 170846835-8

vi



INFORME DEL TRIBUNAL CALIFICADOR

Quito, 11 de noviembre de 2015

Señora:

Dra. Isabel Fierro

DECANA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

Presente

Señora Decana:

El Tribunal encargado de calificar la Tesis “ESTUDIO COMPARATIVO DE TRES

MÉTODOS ANALÍTICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE GRASA EN LECHE

CRUDA” presentada por: Paola Tatiana Toapanta Toapanta, estudiante de la Carrera de:

Química de Alimentos, luego del estudio y revisión correspondiente, resolvió:

APROBAR la Tesis con la NOTA de:…………… y autorizar para que la escriba

definitivamente.

REPROBAR la Tesis.

Es cuanto podemos informar.

Atentamente,

Dr. Iván Tapia

CI: 170846835-8

MSc. Lorena Goetschel

CI: 170971923-9

MSc. Raúl Bahamonde

CI: 171767638-9

vii

CONTENIDO

CAPÍTULO I....................................................................................................................1

INTRODUCCIÓN .........................................................................................................1

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................1

1.2 Formulación del Problema ...................................................................................3

1.2.1 Hipótesis de Trabajo ......................................................................................3

1.3 Objetivos ..............................................................................................................3

1.3.1 General ..........................................................................................................3

1.3.2 Específicos ....................................................................................................3

1.4 Importancia y Justificación de la Investigación ....................................................4

CAPÍTULO II ..................................................................................................................6

MARCO TEÓRICO .......................................................................................................6

2.1 ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN ........................................................6

2.2 FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA .........................................................................7

2.2.1 Leche ............................................................................................................7

2.2.2 Lípidos – Materia grasa .................................................................................8

2.2.2.1 Estructura del glóbulo de grasa ...............................................................9

2.2.2.2 Composición química .............................................................................9

2.2.3 Factores que afectan el contenido graso ....................................................... 11

2.2.4 Métodos para la determinación de grasa en leche ......................................... 12

2.2.4.1 Espectrometría de Absorción en el Infrarrojo ........................................ 12

2.2.4.1.1 Transformada de Fourier ................................................................. 13

2.2.4.1.2 Vibraciones moleculares ................................................................. 13

2.2.4.1.3 Tipo de vibraciones moleculares ..................................................... 14

2.2.4.1.4 MilkoScan™ FT+ ........................................................................... 15

2.2.4.2 Ultrasonido ........................................................................................... 16

2.2.4.2.1 Ekomilk Ultra Pro ........................................................................... 18

2.2.4.3 Método Gerber ..................................................................................... 18

2.2.5 Criterios de validación ................................................................................. 20

2.2.5.1 Validación de métodos .......................................................................... 20

2.2.5.2 Parámetros de validación ...................................................................... 21

2.2.5.2.1 Linealidad ....................................................................................... 22

viii

2.2.5.2.2 Exactitud......................................................................................... 22

2.2.5.2.3 Precisión ......................................................................................... 24

2.2.5.3 Proceso de Validación .......................................................................... 25

2.2.6 DISEÑO EXPERIMENTAL ....................................................................... 27

2.2.6.1 Contraste de significancia ..................................................................... 27

2.2.6.2 Estadística utilizada en la validación ..................................................... 27

2.2.6.2.1 Comparación de una media experimental con un valor conocido ..... 27

2.2.6.2.2 Diseño con Datos Anidados ............................................................ 28

2.2.6.3 Comparación de métodos ...................................................................... 29

2.2.6.3.1 Contraste “t” de datos emparejados ................................................. 29

2.2.6.3.2 Contraste “F” para la comparación de desviación estándar .............. 30

2.2.6.3.3 Comparación de un método analítico con el método de referencia ... 31

2.3 Fundamentación Legal ....................................................................................... 33

CAPITULO III............................................................................................................... 34

METODOLOGIA ........................................................................................................ 34

3.1 Tipo de Investigación ......................................................................................... 34

3.2 Variables de la Investigación.............................................................................. 34

3.2.1 Variable Independiente ................................................................................ 34

3.2.2 Variable Dependiente .................................................................................. 34

3.3 Población y Muestra .......................................................................................... 34

3.3.1 Población .................................................................................................... 34

3.3.2 Muestra ....................................................................................................... 34

3.4 Diseño Experimental .......................................................................................... 35

3.4.1 ETAPA 1 - Diseño para la validación: ......................................................... 36

3.4.1.1 Parámetros de validación ...................................................................... 36

3.4.2 ETAPA 2 - Diseño para la Comparación de Métodos: ................................. 39

3.4.2.1 Exactitud entre métodos: ....................................................................... 39

3.4.2.2 Precisión entre métodos: ....................................................................... 40

3.4.2.3 Correlación ........................................................................................... 41

3.5 Materiales y Métodos ......................................................................................... 42

3.5.1 Método espectroscópico para la determinación de grasa en leche cruda ....... 42

3.5.1.1 Materiales y equipos: ............................................................................ 43

3.5.1.2 Reactivos: ............................................................................................. 43

ix

3.5.1.3 Procedimiento: ...................................................................................... 44

3.5.2 Método Gerber para la determinación de grasa en leche cruda ..................... 46


3.5.2.2 Reactivos: ............................................................................................. 48

3.5.2.3 Procedimiento: ...................................................................................... 48

3.5.3 Método ultrasonido para la determinación de grasa en leche cruda............... 49


3.5.3.2 Reactivos: ............................................................................................. 50

3.5.3.3 Procedimiento: ...................................................................................... 50

CAPITULO IV ............................................................................................................... 52

ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS............................................... 52

4.1 Datos experimentales y resultados ...................................................................... 52

4.1.1 ETAPA 1 - Validación ................................................................................ 52

4.1.1.1 Exactitud .............................................................................................. 52

4.1.1.2 Precisión ............................................................................................... 54

4.1.2 Linealidad ................................................................................................... 63

4.1.3 ETAPA 2 - Comparación de métodos: ......................................................... 65

4.1.3.1 Exactitud entre métodos: ....................................................................... 65

4.1.3.1.1 Comparación del método infrarrojo medio con el método Gerber

Prueba t ....................................................................................................... 66

4.1.3.1.2 Comparación del método infrarrojo medio con el método de

ultrasonido Prueba t ...................................................................................... 67

4.1.3.2 Precisión entre métodos: ....................................................................... 68

4.1.3.2.1 Comparación del método infrarrojo medio con el método Gerber

Prueba F ....................................................................................................... 68

4.1.3.2.2 Comparación del método infrarrojo medio con el método de

ultrasonido Prueba F ..................................................................................... 70

4.1.4 Correlación entre métodos ........................................................................... 71

4.1.4.1 Correlación entre infrarrojo y ultrasonido ............................................. 72

4.1.4.2 Correlación entre infrarrojo y Gerber .................................................... 73

CAPÍTULO V ................................................................................................................ 75

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................................. 75

x

4.1 CONCLUSIONES .............................................................................................. 75

4.1.1 Conclusiones de la validación ...................................................................... 75

4.1.2 Conclusiones de la comparación de métodos para la determinación de grasa

en leche cruda....................................................................................................... 76

4.2 RECOMENDACIONES ...................................................................................... 77

BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 79

ANEXOS ........................................................................................................................ 81

xi

LISTA DE TABLAS

TABLA 1: TABLA OFICIAL DE PAGO AL PRODUCTOR MÁS CALIDAD .......................................2

TABLA 2 - COMPOSICIÓN DE LA LECHE ................................................................................7

TABLA 3 - COMPOSICIÓN DEL GLÓBULO DE GRASA DE LA LECHE BOVINA (MG/KG LECHE) .... 10

TABLA 4 – COMPOSICIÓN DE LA GRASA DE LA LECHE ......................................................... 10

TABLA 5 - REGIONES DEL ESPECTRO INFRARROJO .............................................................. 12

TABLA 6 - IDENTIFICACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN ...................................... 21

TABLA 7 – CONTINUACIÓN IDENTIFICACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN ............. 22

TABLA 8 - ALCANCE DE LA VALIDACIÓN ............................................................................ 25

TABLA 9 – VALIDACIÓN .................................................................................................... 35

TABLA 10 - COMPARACIÓN DE MÉTODOS ........................................................................... 35

TABLA 11 – VERACIDAD Y RECUPERABILIDAD (EXACTITUD) .............................................. 36

TABLA 12 – CONTINUACIÓN VERACIDAD Y RECUPERABILIDAD (EXACTITUD) ...................... 37

TABLA 13 – DISEÑO EXPERIMENTAL EN CONDICIONES DE PRECISIÓN (REPETIBILIDAD Y

REPRODUCIBILIDAD).................................................................................................. 38

TABLA 14 – DISEÑO EXPERIMENTAL PARA LINEALIDAD ..................................................... 38

TABLA 15 – PRUEBA T (MÉTODO INFRARROJO – MÉTODO GERBER) ................................... 39

TABLA 16 – PRUEBA T (MÉTODO INFRARROJO – MÉTODO ULTRASONIDO) .......................... 40

TABLA 17 – PRUEBA F (MÉTODO INFRARROJO – MÉTODO GERBER) ................................... 40

TABLA 18 – CONTINUACIÓN PRUEBA F (MÉTODO INFRARROJO – MÉTODO GERBER) .......... 41

TABLA 19 – PRUEBA F (MÉTODO INFRARROJO – MÉTODO ULTRASONIDO) .......................... 41

TABLA 20 – CORRELACIÓN ENTRE MÉTODOS ..................................................................... 41

TABLA 21 – CONTINUACIÓN CORRELACIÓN ENTRE MÉTODOS ............................................. 42

TABLA 22 – RESULTADOS VERACIDAD Y RECUPERABILIDAD (EXACTITUD) .......................... 52

TABLA 23 – CONTINUACIÓN RESULTADOS VERACIDAD Y RECUPERABILIDAD (EXACTITUD) . 53

TABLA 24 – RESULTADOS PRECISIÓN (REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD) MRC 1 ......... 54

TABLA 25 – ANÁLISIS DE VARIANZA PARA MRC 1 ............................................................. 54







xii











TABLA 42 – RESULTADOS PRECISIÓN (REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD) MRC 10 ....... 60

TABLA 43 – ANÁLISIS DE VARIANZA PARA MRC 10 ........................................................... 60

TABLA 44 – RESULTADOS PRECISIÓN (REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD) MRC 11 ....... 60

TABLA 45 – ANÁLISIS DE VARIANZA PARA MRC 11 ........................................................... 61

TABLA 46 - LÍMITES DE REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD ............................................ 61

TABLA 47 – COEFICIENTES DE VARIACIÓN......................................................................... 62

TABLA 48 – LINEALIDAD % GRASA ................................................................................... 63

TABLA 49 - PARÁMETROS DE LINEALIDAD ......................................................................... 64

TABLA 50 - PRUEBA T (MÉTODO INFRARROJO – MÉTODO GERBER) .................................... 66

TABLA 51 - PRUEBA T PARA MEDIAS DE DOS MUESTRAS EMPAREJADAS ............................... 66

TABLA 52 - PRUEBA T (MÉTODO INFRARROJO – MÉTODO ULTRASONIDO) ........................... 67

TABLA 53 - PRUEBA T PARA MEDIAS DE DOS MUESTRAS EMPAREJADAS ............................... 68

TABLA 54 - PRUEBA F (MÉTODO INFRARROJO – MÉTODO GERBER) .................................... 68

TABLA 55 – CONTINUACIÓN PRUEBA F (MÉTODO INFRARROJO – MÉTODO GERBER) .......... 69

TABLA 56 - PRUEBA F PARA VARIANZAS DE DOS MUESTRAS ............................................... 69

TABLA 57 - PRUEBA F (MÉTODO INFRARROJO – MÉTODO ULTRASONIDO) ........................... 70

TABLA 58 - PRUEBA F PARA VARIANZAS DE DOS MUESTRAS ............................................... 70

TABLA 59 - CORRELACIÓN ENTRE MÉTODOS ...................................................................... 71

TABLA 60 - ANÁLISIS DE LA CORRELACIÓN ENTRE IR Y ULTRASONIDO ............................... 72

TABLA 61 - ANÁLISIS DE LA CORRELACIÓN ENTRE IR Y GERBER ........................................ 73

xiii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - ESTRUCTURA GENERAL DEL GLÓBULO DE GRASA DE LECHE ................................9

FIGURA 2 - VIBRACIONES MOLECULARES ........................................................................... 14

FIGURA 3 - TIPO DE VIBRACIONES MOLECULARES ............................................................. 14

FIGURA 4 - EQUIPO MILKOSCANTM FT+ .......................................................................... 15

FIGURA 5 – PRINCIPIO DE LA MEDICIÓN ............................................................................. 16

FIGURA 6 - ESPECTRO DE FRECUENCIA DEL SONIDO ............................................................ 17

FIGURA 7 - EKOMILK ULTRA PRO ...................................................................................... 18

FIGURA 8 - BUTIRÓMETRO GERBER ................................................................................... 19

FIGURA 9 - CICLO DE VALIDACIÓN ..................................................................................... 21

FIGURA 10 - PROCESO DE VALIDACIÓN .............................................................................. 26

FIGURA 11 - RECTAS DE REGRESIÓN PARA COMPARAR MÉTODOS ANALÍTICOS. .................... 32

FIGURA 12 - MILKOSCANTM FT + .................................................................................... 43

FIGURA 13 - ZERO LIQUID CONCENTRATE ......................................................................... 43

FIGURA 14 - CLEANING AGENT ......................................................................................... 44

FIGURA 15 - FOSSCLEAN KIT ............................................................................................. 44

FIGURA 16 - CENTRIFUGADORA FUNKE GERBER ................................................................ 46

FIGURA 17 - BUTIRÓMETRO GERBER ................................................................................. 47

FIGURA 18 - BAÑO DE AGUA .............................................................................................. 47

FIGURA 19 - EKOMILK ULTRA PRO .................................................................................... 49

FIGURA 20– CURVA DE LINEALIDAD .................................................................................. 63

FIGURA 21 - CORRELACIÓN IR - ULTRASONIDO .................................................................. 72

FIGURA 22 - CORRELACIÓN IR - GERBER ........................................................................... 73

xiv

LISTA DE ANEXOS

ANEXO 1 - TABLA T STUDENT ........................................................................................... 81

ANEXO 2 - VALORES F (DISTRIBUCIÓN F FISHER) .............................................................. 82

ANEXO 3 - INSTRUCTIVO PARA LA TOMA DE MUESTRAS DE LECHE CRUDA ........................... 83

ANEXO 4 – NORMA TÉCNICA ECUATORIANA 9:2012 LECHE CRUDA REQUISITOS ................. 96

ANEXO 5 – NORMA AOAC PARA LA DETERMINACIÓN DE GRASA EN LECHE CRUDA ........... 102

ANEXO 6 – NORMA INEN 12. LECHE. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE GRASA ......... 105

ANEXO 7 – PLAN DE VALIDACIÓN AGROCALIDAD ...................................................... 115

ANEXO 8 - PORCENTAJE DE GRASA (MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADO) ............... 117

ANEXO 9 – CERTIFICADO TRADUCCIÓN RESUMEN ........................................................... 121

ANEXO 10 - FOTOGRAFÍAS .............................................................................................. 122

xv



CARRERA QUÍMICA DE ALIMENTOS

LUGAR DONDE SE REALIZARÓ LA INVESTIGACIÓN

La presente investigación en su fase experimental, se realizó en el Laboratorio de Control de

Calidad de Leche de AGROCALIDAD (Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la

Calidad del Agro), ubicado en la parroquia de Tumbaco, Av. Interoceánica Km. 14 1/2, La

Granja MAGAP, sector Este del Distrito Metropolitano de Quito.

xvi

RESUMEN DOCUMENTAL

La producción de leche en Ecuador mueve alrededor de 700 millones de dólares al año

generando alrededor de 5.100.000 litros de leche diarios que abastecen la demanda local;

uno de los problemas que presenta la leche fresca es la adulteración junto con el grado de

contaminación química y bacteriana que tiene debido a malas prácticas de ganadería y

manufactura lo cual incide en el pago del producto en función de su calidad.

La Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de Calidad del Agro – AGROCALIDAD, es la

autoridad nacional sanitaria, fitosanitaria y de inocuidad de los alimentos, la misma que es

la responsable de la definición y ejecución de políticas, regulación y control de actividades

productivas del agro nacional.

La investigación se dio ya que hoy en día se ha propuesto el pago por calidad de la leche, y

para esto se toma como parámetros de calidad, los porcentajes de grasa y proteína como

calidad nutricional, células somáticas como calidad sanitaria. Es por ello que el objetivo de

la presente proyecto es la comparación de tres métodos analíticos para la determinación de

grasa en leche cruda; el mediante el método de referencia (Método Gerber) y métodos de

tradicionalmente utilizados por el Laboratorio de Control de Calidad de Leche en

AGROCALIDAD (Método Infrarrojo y Ultrasonido). La comparación de los métodos se

realizó a diferentes niveles de trabajo; tomando como referencia el instructivo de validación

del laboratorio EURACHEM y se evalúo los siguientes parámetros: repetibilidad,

reproducibilidad, linealidad y exactitud, estos parámetros fueron estimados a través de

materiales de referencia certificados (MRC), y un blanco (leche cruda).

Finalmente con los resultados obtenidos para la validación del método infrarrojo, se

concluye que el mismo es técnicamente competente y con ello se asegura la confiabilidad de

los resultados obtenidos por este método, además de cumplir con los requisitos exigidos por

el Servicio de Acreditación Ecuatoriano SAE, Norma Internacional ISO/IEC 17025:2005.

Asimismo al comparar los tres métodos se afirma que no existen diferencias significativas

en los resultados de cada uno de ellos.

Palabras Clave: VALIDACIÓN, MÉTODO INFRARROJO, MATERIAL DE

REFERENCIA, LECHE CRUDA, GRASA EN LECHE, CALIDAD.

xvii

ABSTRACT

Milk production moves close to 700 million dollars in a year, generating approximately

5.100.000 liters of milk per day, which supplies for the local demand. However, one of the

problems found in fresh milk is adulteration, along with the levels of chemical and bacterial

contamination resulting from poor agriculture and processing practices, which is reflected

in the price of the product as a function of its quality.

The Ecuadorian Agency for the Assurance of Agricultural Quality – AGROCALIDAD, is

the national sanitary, plant safety, and food safety authority; it is responsible for defining

and executing policies and regulations, and controlling nationwide agricultural production.

This research takes place because nowadays, there is a proposal to pay based on the quality

of the milk produced, for which we consider quality parameters such as fat and protein

percentages as nutritional quality, and the presence of somatic cells as sanitary quality. The

objective of this research work is to compare three analytical methods for determining fat

content in raw milk; these include the reference method (Gerber method) and the methods

traditionally used by AGROCALIDAD (Infrared and Ultrasound). The method comparison

was carried out at different work levels, taking the EURACHEM laboratory validations

guide and assessing the following parameters; repeatability, reproducibility, linearity and

accuracy. These methods were assessed with certified reference materials (CRMs) and a

control (raw milk).

Finally, with the results obtained from the validation of the infrared method, this study

concludes that it is technically competent, assuring the reliability of its results. Additionally,

this method meets the requirements demanded by the Ecuadorian Accreditation Service

(SAE in Spanish) and ISO/IEC 17025:2005 Regulations. Further, this study affirms that

there is no significant differences between the results produced by the three methods.

Keywords: VALIDATION, INFRARED METHOD, REFERENCE MATERIAL, RAW

MILK, MILK FAT, QUALITY

1

CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La producción de leche en Ecuador genera alrededor de 700 millones de dólares al año dentro

de la cadena primaria. Mientras que en toda la cadena, que incluye transporte,

industrialización, comercialización, entre otros aspectos, se manejan más de 1.000 millones

de dólares anuales. En la actualidad la industria láctea en el Ecuador genera alrededor de

5.100.000 litros de leche diarios que abastecen la demanda local, con un excedente de más

o menos 200.000 litros. (AGROCALIDAD, 2013)

Uno de los problemas que presenta la leche fresca es la adulteración junto con el grado de

contaminación química y bacteriana que tiene debido a malas prácticas de ganadería y

manufactura; esto incide en el pago del producto en función de su calidad.

En el artículo 10 del Acuerdo Ministerial 394, se establece que: "El MAGAP fijará el precio

de sustentación más calidad, por litro de leche cruda pagada en finca"; esto debido a las

distorsiones que persisten en el sector lechero Ecuatoriano, generadas por las características

de los sistemas de producción, asimetrías en la comercialización y la presencia de agentes

económicos compradores y comercializadores de leche cruda a nivel nacional con

características heterogéneas. Por todo lo anterior, es necesaria la intervención del Gobierno

Nacional en la determinación de un precio mínimo del producto más componentes extra

como calidad higiénica, calidad sanitaria y Buenas Prácticas Ganaderas, que generarán

bonificaciones.

Por esta razón se ha establecido una Tabla Oficial Obligatoria para el pago por litro de leche

al productor en finca o centro de acopio por componentes, la cual se detalla en la Tabla 1 la

misma que especifica el precio de acuerdo al porcentaje de grasa y proteína que posea el

producto; se puede observar también que mientras mayor sea el porcentaje de estos dos

componentes mayor será el precio.

2

AGROCALIDAD siendo el organismo regulador, es el encargado de registrar y verificar el

correcto funcionamiento de los laboratorios para el control de calidad de la leche cruda, sean

estos públicos o privados; basándose en normas nacionales e internacionales utilizadas para

los análisis que permiten determinar la composición química y calidad higiénica de la leche

cruda, para así poder verificar que los pagos por calidad sean justos, por lo que es necesario

efectuar el análisis de su composición ya que dentro de estos parámetros se encuentra la

grasa que es uno de los componentes que le da calidad a la leche.

Tabla 1 - Tabla Oficial de pago al productor más calidad

PROPUESTA MAGAP

PRECIO BASE 0,4200 INGRESE SU PRECIO 0,4200 Índex % sobre precio de sustentación

Base contenido GRASA 3,00 $/kg GRASA 2,4 Por décima % GRASA 0,0024 0,5714

Base cont. PROTEÍNA 2,90 $/kg PROTEÍNA 4,5 Por décima % PROTEÍNA 0,0045 1,0714

Proteína

Grasa 2,8 2,9 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 3,8 3,9 4,0

3,0 0,4155 0,4200 0,4245 0,4290 0,4335 0,4380 0,4425 0,4470 0,4515 0,4560 0,4605 0,4650 0,4695

3,1 0,4179 0,4224 0,4269 0,4314 0,4359 0,4404 0,4449 0,4494 0,4539 0,4584 0,4629 0,4674 0,4719

3,2 0,4203 0.4248 0,4293 0,4338 0,4383 0,4428 0,4473 0,4518 0,4563 0,4608 0,4653 0,4698 0,4743

3,3 0,4227 0,4272 0,4317 0,4362 0,4407 0,4452 0,4497 0,4542 0,4587 0,4632 0,4677 0,4722 0,4767

3,4 0,4251 0,4296 0,4341 0,4386 0,4431 0,4476 0,4521 0,4566 0,4611 0,4656 0,4701 0,4746 0,4791

3,5 0,4275 0,4320 0,4365 0,4410 0,4455 0,4500 0,4545 0,4590 0,4635 0,4680 0,4725 0,4770 0,4815

3,6 0,4299 0,4344 0,4389 0,4434 0,4479 0,4524 0,4569 0,4614 0,4659 0,4704 0,4749 0,4794 0,4839

3,7 0,4323 0,4368 0,4413 0,4458 0,4503 0,4548 0,4593 0,4638 0,4683 0,4728 0,4773 0,4818 0,4863

3,8 0,4347 0,4392 0,4437 0,4482 0,4527 45720, 0,4617 0,4662 0,4707 0,4752 0,4797 0,48842 0,4887

3,9 0,4371 0,4416 0,4461 0,4506 0,4551 0,4596 0,4641 0,4686 0,4731 0,4776 0,4821 0,4866 0,4911

4,0 0,4395 0,4440 0,4485 0,4530 0,4575 0,4620 0,4665 0,4710 0,4755 0,4800 0,4845 0,4890 0,4935

4,1 0,4419 0,4464 0,4509 0,4554 0,4599 0,4644 0,4689 0,4734 0,4779 0,4824 0,4869 0,4914 0,4959

4,2 0,4443 0,4488 0,4533 0,4578 0,4623 0,4668 0,4713 0,4758 0,4803 0,4848 0,4893 0,4938 0,4983

4,3 0,4467 0,4512 0,4557 0,4602 0,4647 0,4692 0,4737 0,4782 0,4827 0,4872 0,4917 0,4962 0,5007

4,4 0,4491 0,4536 0,4581 0,4626 0,4671 0,4716 0,4761 0,4806 0,4851 0,4896 0,4941 0,4986 0,5031

4,5 0,4515 0,4560 0,4605 0,4650 0,4695 0,4740 0,4785 0,4830 0,4875 0,4920 0,4965 0,5010 0,5055

Fuente: (Ministerio de Agricultura, 2013)

Para lograr controlar el pago por calidad de la leche, AGROCALIDAD necesita realizar una

comparación entre los diferentes métodos que el laboratorio utiliza para la determinación de

grasa, con ello se podrá verificar si existe o no una diferencia significativa en los resultados

que otorguen los diferentes equipos, y con ello confirmar que los resultados no se alteraran

al realizarlos en uno u otro equipo o en diferentes laboratorios.

En el laboratorio de control de calidad de leche de AGROCALIDAD los métodos analíticos

que utilizan para realizar los diferentes análisis no están validados, es por ello que se

3

verificarán ciertos parámetros de validación para así poder demostrar que dicho laboratorio

es técnicamente competente y capaz de producir resultados reales.

1.2 Formulación del Problema

1.2.1 Hipótesis de Trabajo

H Investigación: No existe diferencia significativa en los resultados del análisis entre los

métodos (Infrarrojo, ultrasonido y Gerber) para la determinación de grasa

en leche cruda.

H Nula: Existe diferencia significativa entre los resultados del análisis entre los métodos

(Infrarrojo, ultrasonido y Gerber) para la determinación de grasa en leche

cruda.

1.3 Objetivos

1.3.1 General

- Realizar una comparación entre los métodos analíticos (Infrarrojo, Ultrasonido y

Tradicional - Gerber) para la determinación de grasa en leche cruda en el

Laboratorio de Control de Calidad de la Leche de AGROCALIDAD.

1.3.2 Específicos

- Establecer las condiciones a cumplir en la verificación de los parámetros de

validación para el método Infrarrojo.

- Verificar el cumplimiento de ciertos parámetros de validación para la

determinación de grasa por el método infrarrojo tomando como referencia las guías

para la validación de métodos analíticos.

- Comprobar que el método validado para la determinación de grasa en leche

proporciona datos confiables mediante la utilización de material de referencia

certificado y calculando el porcentaje de exactitud.

- Utilizar un diseño de factores anidados o jerárquicos para calcular el coeficiente de

variación de repetibilidad y reproducibilidad para el método a validar.

4

- Determinar si existe o no diferencias significativas entre los métodos (Infrarrojo,

Ultrasonido y Tradicional – Gerber) para la determinación de grasa en leche

utilizando el estadístico t de Student, F de Fisher.

1.4 Importancia y Justificación de la Investigación

La presente investigación fue realizada ya que AGROCALIDAD al ser el organismo

regulador de la calidad del AGRO y específicamente el Laboratorio de Control de Calidad

de Leche, se ve en la necesidad de inspeccionar con mayor eficacia uno de los principales

productos que se consumen en el Ecuador como es la leche. Esto se da debido a que hoy en

día se presenta el concepto del pago por calidad de este producto. Por esta razón es

importante controlar que los porcentajes de grasa según la norma INEN NTE 9 se cumplan,

ya que este componente es importante para la calidad del producto final y por ende para la

salud de consumidor.

En el laboratorio de AGROCALIDAD para realizar el análisis de la determinación de grasa

en leche cruda existen tres métodos, por infrarrojo, por ultrasonido y un tradicional. El

método por ultrasonido sólo se lo emplea para salidas de campo, es decir, sólo se efectúa el

análisis por este método cuando se realizan operativos y controles sorpresa en carretera; el

método tradicional es Gerber pero no es utilizado con frecuencia, sólo es una alternativa

pues el tiempo que lleva ejecutar un análisis por este método es considerable en relación a

los otros en estudio, por otro lado el método por infrarrojo es el principalmente utilizado

para realizar el análisis debido a que proporciona resultados inmediatos.

Por esto es importante para la empresa verificar que los resultados que se obtengan en cuanto

a grasa no tengan diferencias significativas al someter las muestras de leche a procedimientos

distintos y tener la seguridad que no habrá variación en los resultados.

El Laboratorio de Control de Calidad de la Leche de AGROCALIDAD, busca la

acreditación por el Sistema Ecuatoriano de la Calidad, Servicio de Acreditación Ecuatoriano

SAE, esto con el objetivo de demostrar las competencias técnicas que poseen en los

diferentes ensayos que realizan.

5

En la norma oficial “INEN NTE 012 – Leche. Determinación del Contenido de Grasa”, se

establece que podrá usarse al método Gerber como oficial para la determinación de grasa en

leche cruda, pero en el laboratorio de AGROCALIDAD los análisis para la determinación

de grasa son efectuados por el método infrarrojo en el equipo COMBIFOSS ya que este

proporciona resultados muy rápidos, es por esto que a AGROCALIDAD le interesa validar

este método para así tener la certeza que los resultados emitidos por este equipo son certeros.

6

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1 ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN

En el Acuerdo Ministerial #136 - 21 Abril de 2010 del Ministerio de Agricultura, Ganadería,

Acuacultura y Pesca (MAGAP) se citan diferentes artículos en los que se menciona que el

Estado regulará, controlará e intervendrá, cuando sea necesario, en los intercambios y

transacciones económicas, también indica que, por delegación expresa del Art. 14 de la Ley

de Desarrollo Agrario, el Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca, está en

la obligación de fijar políticas y arbitrar los mecanismos de comercialización y regulación

de precios para proteger al agricultor contra prácticas injustas de comercio, entre otros,

acuerdan:

• Establecer el precio mínimo de sustentación al productor por litro de leche cruda que estará

indexado en el 52,4% al precio de venta al público (PVP).

• Las industrias lácteas y en general toda persona natural o jurídica que adquieran leche cruda a

los productores deberán pagar el precio mínimo de sustentación de $ 0,3933, más lo estipulado

en la tabla oficial referencial de pago por componentes e higiene. Sin perjuicio de lo establecido,

las industrias lácteas y los productores lecheros podrán acordar el pago de incentivos adicionales

a los mencionados en el acuerdo.

• Facultar y disponer que la Subsecretaria de Fomento Ganadero en representación del Ministerio

de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca, ejerza todos los mecanismos de control con el

objeto de verificar el cabal cumplimiento del presente acuerdo ministerial, para lo cual deberá

contar con el apoyo de los técnicos de la autoridad sanitaria correspondiente, junto con las

autoridades responsables de control de precios y calidad

AGROCALIDAD es una institución pública adscrita al Ministerio de Agricultura,

Ganadería, Acuacultura y Pesca (MAGAP), que en sus facultades de Autoridad Fitozoo-

sanitaria Nacional es la encargada de la definición y ejecución de políticas de control y

regulación para la protección y el mejoramiento de la sanidad animal, sanidad vegetal e

inocuidad alimentaria. Esta entidad es la encargada de mantener y mejorar el estatus

7

sanitario de los productos agropecuarios del país, con el objetivo de precautelar la

inocuidad de la producción primaria, contribuir a alcanzar la soberanía alimentaria,

mejorar los flujos comerciales y apoyar el cambio de la matriz productiva del país.

(AGROCALIDAD, 2015)

En cuanto a datos relacionados a comparaciones de métodos para determinación de grasa

en leche cruda no se han encontrado reseñas, por ello, para el desarrollo de la presente

investigación no se puede hacer referencia a estudios previos. Es por esto que en el

Laboratorio de Control de Calidad de Leche de AGROCALIDAD existe el interés en

realizar esta investigación para poder verificar si existen o no diferencias significativas

en los resultados del análisis del porcentaje de grasa en leche por diferentes métodos.

2.2 FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA

2.2.1 Leche

La leche se define como la secreción nutritiva que se obtiene de las glándulas mamarias

de vacas saludables (Revilla, 1996), es uno de los alimentos más nutritivos puesto que

tiene un alto contenido de proteínas de alta calidad que proporcionan los diez

aminoácidos esenciales. Muchos factores, por ejemplo, climáticos, estacionales, raza

y edad del animal entre otros, producen importantes variaciones en los componentes

de la leche. En la tabla 1 se muestra la composición de la leche:

Tabla 2 - Composición de la leche

Nutriente %

Agua 86 – 90

Lactosa 4,5

Grasa 2 – 4

Proteína 2,5 – 4

Minerales 0,6 – 0,7

Vitaminas A, B, D, E

Fuente: (Alais, 1985)

8

2.2.2 Lípidos – Materia grasa

La materia grasa es el componente de la leche que varía en mayor proporción; parte

de la materia grasa se sintetiza en la glándula mamaria a partir de los ácidos grasos

volátiles; el resto se forma a partir de los ácidos grasos que se encuentran en la sangre.

El régimen alimenticio tiene por consiguiente, una influencia considerable sobre la

composición de la materia grasa de la leche; diversos factores influyen sobre este

porcentaje graso.

En la fase líquida de la leche se encuentran tres clases de sustancias asociadas:

1. Los lípidos neutros, es decir, la materia grasa propiamente dicha (sólida a

temperatura ambiente 20°C), constituida por glicéridos, aproximadamente el

80% del conjunto.

2. Los lípidos polares, son fosfolípidos de naturaleza compleja, constituyen

alrededor del 1% del conjunto.

3. Las sustancias insaponificables, de naturaleza diferente de las precedentes aunque

también insolubles en agua; entre ellas se encuentran las vitaminas.

Como en el caso de los glúcidos se pueden distinguir los lípidos libres (más

abundantes) y los lípidos ligados a las proteínas. Los primeros se pueden extraer por

medio de los disolventes ordinarios de las grasas, tras la ruptura de la emulsión, por

ejemplo con benceno, éter etílico y éter de petróleo; para extraer los segundos es

preciso utilizar una mezcla disociante y disolvente como etanol-cloroformo (2:1). En

la leche, los lípidos neutros están casi enteramente libres; la caseína no alcanza más

que el 0,05%; por el contrario, los fosfolípidos se encuentran en forma ligada y

principalmente en la membrana de los glóbulos grasos. Los lípidos se encuentran

dispersos en la leche en forma globular; esta dispersión es inestable y las sustancias

que la componen son las más fáciles de extraer de la leche, sin modificar los otros

componentes. (Alais, 1985)

Las proporciones de los diferentes ácidos grasos, los distintos tipos de fosfolípidos y

las diversas sustancias insaponificables de la materia grasa no son fijas. La materia

grasa se altera más lentamente que la lactosa; sus modificaciones no provocan

grandes cambios en la estructura fisicoquímica de la leche, pero son importantes por

ser causa de la aparición de los sabores desagradables (Alais, 1985).

9

2.2.2.1 Estructura del glóbulo de grasa

La grasa de la leche se encuentra en forma de pequeños glóbulos en emulsión

temporal; no son visibles a simple vista pero pueden ser observados con la ayuda de

un microscopio, cada glóbulo posee un núcleo (triglicéridos) rodeado de una película

o membrana, muy compleja y formada de varias capas como se observa en la figura

1.

Figura 1 - Estructura general del glóbulo de grasa de leche

Fuente: (Angulo A, 2009)

La capa inmediata al núcleo está constituida por triglicéridos de elevado punto de

fusión que encajan en una capa de fosfolípidos, y que además contienen moléculas

de vitamina A y colesterina. La capa de fosfolípidos está rodeada por la proteína de

la membrana, cuya estructura es similar a la de a globulina; a la proteína de la

membrana se le atribuye la capacidad de dispersión de la grasa en la leche y es en

esta capa donde también se encuentran algunas enzimas (fosfatasa), metales pesados

y sales; la superficie de la película posee carga eléctrica (tabla 3). Los glóbulos grasos

forman racimos a medida que se elevan, debido a su menor peso específico en

comparación con el líquido que los rodea, y forman una capa de crema en la

superficie del líquido. (Revilla, 1996).

2.2.2.2 Composición química

La grasa de la leche está compuesta de triglicéridos o ésteres de ácidos grasos con

glicerol en un 98%, fosfolípidos de 0,50 a 1,00% (tabla 4) y otras sustancias

10

alrededor del 1%. Las sustancias de estos dos últimos grupos tienen gran influencia

en las propiedades físicas y biológicas de la grasa.

Tabla 3 - Composición del glóbulo de grasa de la leche bovina (mg/kg leche)

Componentes Glóbulo de grasa de la leche

Núcleo MFGM

Proteínas 350

Glicéridos

Triglicéridos

Diglicéridos

Monoglicéridos

3800

100

10

670

Trazas

Trazas

Fosfolípidos

Esfingolípidos

AG

Esteroles

Vitaminas (A, D, E, K)

Agua

Otros

Trazas

Trazas

25

100

2

60

30

210

80

Trazas

15

80

Fuente: (Angulo A, 2009)

Tabla 4 – Composición de la grasa de la leche

DETALLE EN 100 GRAMOS DE GRASA EN 100 GRAMOS DE LECHE

Triglicéridos

Diglicéridos

Monoglicéridos

Otros glicéridos

Ácidos grasos libres

Fosfolípidos

Cerebrocidos

Esteroles

Carotenoides

Vitamina A

Vitamina D

Vitamina E

Vitamina K

97 – 98 g

250 – 480 mg

16 – 38 mg

872 – 1318 mg

100 – 444 mg

200 – 1000 mg

13 – 66 mg

220 – 410 mg

700 – 900 mg

600 – 900 mg

1 – 2 mg

2400 mg

100 mg

342 – 346 g

7 – 35 mg

7 – 14 mg

28 – 35 mg

71 – 86 UI

Trazas

7 – 175 µg

Trazas

Fuente: (Revilla, 1996)

Los glicéridos son compuestos en los cuales uno, dos o tres moléculas de ácidos

grasos son combinados; resultan de la unión de un glicerol con uno o más ácidos

grasos idénticos o diferentes. La cantidad de ácidos grasos saturados que se

encuentran en la grasa es de aproximadamente 62%, ácidos grasos no saturados 33%

11

y ácidos grasos no saturados con dos, tres, cuatro y cinco enlaces dobles, 4%.

También se sabe que la mayor parte de los ácidos grasos están formados por ácidos

volátiles de bajo peso molecular. Los principales ácidos grasos que forman parte de

la grasa, se muestran en la tabla:

Ácido Graso Fórmula

Fuente: (Revilla, 1996)

2.2.3 Factores que afectan el contenido graso

La composición de la leche varía de acuerdo con la especie, razas, ordeños, cuartos de

la ubre, periodo de lactancia, estado nutricional, composición del alimento, estaciones

del año, temperaturas ambientales, edad, salud de la ubre y enfermedades en general.

(Revilla, 1996)

El tamaño de partícula del forraje es importante ya que si es demasiado pequeño

(<1,5cm de media) el animal reduce la rumia lo que hace que se reduzca la secreción

salivar (tamponante) y se produce acidosis. La relación del forraje en cuanto al

concentrado deberá tener una relación mínima 40:60 en materia seca puesto que el

12

exceso de concentrado conduce a acidosis lo que hará que exista una reducción en la

digestión de la fibra y de la síntesis de grasa. El control del pH ruminal (acidosis)

permite controlar la reducción de grasa en la leche, al evitar la acidosis ruminal se

minimiza la reducción del contenido graso de la leche.

La proteína de la ración tiene poca influencia sobre la concentración grasa de la leche.

La grasa tiene un efecto energético que estimula la producción de leche y la producción

total de grasa, pero puede aumentar o reducir el contenido graso de la leche. Puede

existir la “transferencia” directa de ácidos grasos a la glándula mamaria, aumentando

el contenido graso de la leche y modificando el perfil (calidad) de la grasa láctea (AG

omega). (Kirk, Sawyer, & Egan, 1996)

2.2.4 Métodos para la determinación de grasa en leche

Para la presente investigación se utilizaron tres métodos para la determinación de grasa

en leche cruda, los cuales serán descritos a continuación:

2.2.4.1 Espectrometría de Absorción en el Infrarrojo

La región de espectro infrarrojo descrita en la tabla 5 abarca la radiación con números

de onda entre 12800 y 10cm-1 correspondientes a una longitud de onda de 0,78 a

1000µm-1. Este espectro se divide en tres regiones, cercano, medio y lejano; las

técnicas y las aplicaciones de los métodos basados en cada una de las regiones

difieren considerablemente. (Skoog D. A., 2005)

Tabla 5 - Regiones del Espectro Infrarrojo

Fuente: (Skoog D. A., 2005)

Las medidas en el espectro infrarrojo cercano se realizan con fotones y

espectrofotómetros similares, en lo que se refiere a su diseño y componentes; las

13

aplicaciones más importantes de esta región espectral están en el análisis cuantitativo

de materiales industriales y agrícolas.

La mayoría de los instrumentos para la región del infrarrojo medio son del tipo de la

transformada de Fourier; esta espectroscopía es una de las técnicas analíticas

disponibles más importantes para conseguir información sobre aspectos cualitativos

y cuantitativos de analitos en tiempo real en los procesos de manufacturación. (Skoog

D. A., 2005)

2.2.4.1.1 Transformada de Fourier

La espectroscopia infrarroja es una técnica que permite estudiar la vibración y

rotación de las moléculas en la región infrarroja del espectro electromagnético. La

espectroscopia de absorción es la medida de la cantidad de luz absorbida por un

compuesto en función de la longitud de onda de la luz. Para la región del infrarrojo

se han descrito dos tipos de instrumentos multiplex, en uno de ellos, la codificación

se consigue dividiendo la fuente en dos haces con trayectorias que pueden variar

su longitud periódicamente para dar modelos de interferencia. (Skoog, West,

Holler, & Crouch, 2005)

La espectrometría infrarroja media se está utilizando para análisis cuantitativos de

muestras complejas, como en la presente investigación que se analiza grasa en

leche.

2.2.4.1.2 Vibraciones moleculares

Se llama vibración molecular a aquella vibración que afecta a varios átomos en una

molécula. Algunas vibraciones moleculares están localizadas en un grupo

funcional, mientras que otras se extienden por toda la molécula. En la figura 2 se

muestra cómo un enlace covalente entre dos átomos se comporta como un resorte.

Si el enlace se alarga, aparece una fuerza restauradora que hace que los dos átomos

tiendan a juntarse hasta su longitud de enlace de equilibrio; si el enlace se

comprime, la fuerza restauradora hace que los átomos se separen. Cuando el enlace

se alarga o se comprime, y a continuación se deja en libertad, los átomos vibran.

(Wade, 2004)

http://www.datuopinion.com/vibracion

http://www.datuopinion.com/atomo

http://www.datuopinion.com/molecula

http://www.datuopinion.com/grupo-funcional

http://www.datuopinion.com/grupo-funcional

14

Figura 2 - Vibraciones moleculares

Fuente: (Wade, 2004)

2.2.4.1.3 Tipo de vibraciones moleculares

Pueden distinguirse dos tipos básicos de vibraciones: de tensión y de flexión. Una

vibración de tensión supone un cambio continuo en la distancia interatómica a lo

largo del eje del enlace entre dos átomos. Las vibraciones de flexión se caracterizan

por un cambio en el ángulo entre dos enlaces y son de cuatro tipos: de tijereteo, de

balanceo, de aleteo y de torsión, como se observa en la figura 3.

Las moléculas diatómicas simples tienen solamente un enlace, el cual se puede

estirar. Moléculas más complejas pueden tener muchos enlaces, y las vibraciones

pueden ser conjugadas, llevando a absorciones en el infrarrojo con frecuencias

características que pueden relacionarse a grupos químicos. En una molécula que

contiene más de dos átomos, pueden darse todos los tipos de vibraciones, además

puede producirse una interacción o acoplamiento de las vibraciones si estas

implican enlaces a un mismo átomo central, el resultado del acoplamiento es un

cambio en las características de las vibraciones.

Figura 3 - Tipo de Vibraciones Moleculares

Fuente: (Skoog, Holler, & Nieman, 2001)

15

2.2.4.1.4 MilkoScan™ FT+

MilkoScan™ FT+ (figura 4) es un espectrofotómetro FTIR (infrarrojo con

transformada de Fourier) de gran capacidad, totalmente automático y compatible,

el rendimiento es conforme a la AOAC (Association of Analytical Chemists) y la

IDF (International Dairy Federation). La tecnología FTIR proporciona el potencial

para el análisis de prácticamente cualquier parámetro de la leche, específicamente

grasa como objetivo de la investigación.

Figura 4 - Equipo MilkoScanTM

FT+

En este equipo básicamente se mide la absorbancia de radiación infrarroja en una

muestra de leche, esto es la cantidad de energía que se queda en la muestra. A

diferentes longitudes de onda absorbidas se pueden identificar los diferentes

parámetros en la leche. Su sistema de flujo y la pipeta con autolimpieza convierten

al sistema en muy fiable (figura 5), permitiendo el análisis de incluso las muestras

de leche más difíciles, como por ejemplo las muestras sucias de leche de oveja y

cabra, sin problemas.

16

Figura 5 – Principio de la Medición

El MilkoScanTM FT+ trabaja en la zona media del infrarrojo, y para el caso de la

grasa, la absorción se debe a las vibraciones entre los enlaces carbonilo de los

triglicéridos.

Los siguientes parámetros se pueden analizar con gran precisión: grasa, proteína

(cruda y real), caseína, lactosa, sólidos no grasos, sólidos totales, urea, ácidos

grasos libres, depresión del punto de congelación, ácido cítrico, pH y eficacia del

homogeneizador, ácidos grasos mono y poliinsaturados, así como ácidos grasos

totales insaturados y saturados además de temperatura de la muestra en la entrada.

2.2.4.2 Ultrasonido

Ultrasonido se define como el rango de oscilaciones en frecuencia entre 20kHz y

1GHz que no puede ser escuchado por el humano, como se puede observar en la

figura 6; por debajo de estas frecuencias se encuentra la región audible del sonido

que es percibida por el humano y va desde los 20KHz hasta los 20 Hz, abajo de esta

región se encuentra la zona infrasónica con frecuencias menores a 20 Hz. (Wilson,

Buffa, & Lou, 2007)

17

Figura 6 - Espectro de frecuencia del sonido

Fuente: (Wilson, Buffa, & Lou, 2007)

Cuando en un punto de un medio elástico se produce una deformación esta no

permanece localizada en él, sino que se propaga sucesivamente a los puntos

próximos. Si la deformación es debida a un movimiento vibratorio, este queda

caracterizado por su frecuencia, amplitud y velocidad instantánea de los átomos que

es cero. Para que existan ondas sonoras debe haber perturbaciones o vibraciones en

algún medio, la velocidad con que se propaga la perturbación de unos a otros puntos,

o velocidad de onda, depende del medio pero no de la frecuencia. (Wilson, Buffa, &

Lou, 2007)

Dado que ambos parámetros dependen de la temperatura, la velocidad de onda

también variará con esta. Como resultado de la perturbación, la presión en un punto

no es constante sino que varía con respecto a un valor medio.

Al atravesar los medios líquidos, las ondas sonoras producen la denominada

cavitación; generando ciclos alternativos de compresión y expansión y, como

consecuencia, la aparición de burbujas de gas en la masa del líquido. En sucesivos

ciclos, las burbujas crecen, alcanzan un tamaño crítico y, al superarlo implosionan.

Al chocar entre sí las moléculas del líquido como consecuencia del colapso, se

producen ondas de presión que se transmiten por el medio. (Gil Hernández, 2010)

18

2.2.4.2.1 Ekomilk Ultra Pro

El analizador de leche EKOMILK (figura 7) succiona una pequeña muestra de

leche y la somete al paso de una onda de ultrasonido; un microprocesador traduce

los resultados midiendo los siguientes parámetros: Materia grasa (0,5% - 9% ±

0,1%), sólidos no grasos (6% - 12% ± 0,2%), proteína (2% - 6% ± 0,2%), densidad

(1,0260 – 1,0330g/cm3 ± 0,0005g/cm3), punto de congelamiento y agua agregada

(0% - 60% ± 5%).

Figura 7 - Ekomilk Ultra Pro

2.2.4.3 Método Gerber

El método Gerber consiste en separar la grasa dentro de un recipiente medidor

llamado butirómetro (figura 8), medir el volumen e indicarlo en porcentaje de la

masa. La grasa reside en la leche en forma de pequeños glóbulos de diferente

diámetro, que oscila entre 0,1 y 10 micrómetros. Los glóbulos grasos forman una

emulsión permanente con el líquido lácteo; todos los glóbulos de grasa están

rodeados por una capa protectora, la membrana de los glóbulos de grasa compuesta

por fosfolípidos, proteínas de envoltura de los glóbulos de grasa y agua de

hidratación. La envoltura de los glóbulos de grasa evita la coalescencia de los

mismos y estabiliza el estado emulsionado. La separación completa de la grasa

precisa la destrucción de la envoltura protectora de los glóbulos grasos. (Catálogo de

laboratorio. Análisis para Lácteos - Gerber, 1904)

19

Ello se lleva a cabo por medio del ácido sulfúrico concentrado entre un 90% - 91%

de masa; este ácido oxida e hidroliza los compuestos orgánicos de la envoltura

protectora de los glóbulos de grasa, las fracciones de las albúminas de leche y la

lactosa. Aquí se produce calor por la dilución y también un gran calor debido a la

reacción; el butirómetro se calienta considerablemente, los productos de la oxidación

tiñen la solución resultante de color marrón. La grasa liberada de esta forma se separa

a continuación por la centrifugación; añadiendo alcohol amílico se facilita la

separación de la fase y, al final, resulta una línea divisoria clara entre la grasa y la

solución ácida. En la escala del butirómetro se puede leer el contenido en grasa de la

leche como contenido de masa en un tanto por ciento. Este procedimiento puede

aplicarse a la leche cruda y leche de consumo con un contenido de materia grasa de

entre el 0 y el 16%, así como a la leche que contenga un conservante adecuado y

leche homogenizada.

Figura 8 - Butirómetro Gerber

Fuente: (Catálogo de laboratorio. Análisis

para Lácteos - Gerber, 1904)

20

2.2.5 Criterios de validación

La validación de un método es un requisito importante en la práctica del análisis

químico, por lo cual a continuación se especificarán los parámetros a cumplirse para

realizar una validación.

2.2.5.1 Validación de métodos

La validación de un método se puede definir como el proceso para especificar una

necesidad analítica y confirmar que el método en cuestión tiene capacidades de

desempeño consistentes con las que requiere la aplicación. (Eurachem, 2005)

En el proceso de validación del método está implícito que los estudios para

determinar los parámetros de desempeño se realizan usando equipos que cumplan

ciertas especificaciones, por ejemplo que están trabajando correctamente y que están

calibrados adecuadamente.

En general, se establece que el laboratorio debe validar:

Métodos no normalizados: Métodos desarrollados por el laboratorio (métodos

nuevos), o bien, métodos que tradicionalmente se han utilizado en el laboratorio

pero que no están normalizados.

Métodos estándar o normalizados: Los métodos estándar son aquellos publicados

por organizaciones internacionales, regionales, nacionales o por organizaciones

técnicas respetables, se ejecutan tal como se describen en la norma. Aquellos

métodos especificados por fabricantes de equipos de análisis también son

considerados como métodos estándar. (Duffau B., 2010)

La validación es necesaria para:

Demostrar que el método utilizado por un laboratorio es adecuado para la

aplicación en la que se propone utilizar.

Demostrar que las modificaciones que pudieron haberse realizado no afectan su

desempeño, ni la confiabilidad de los resultados.

Para conocer la incertidumbre.

21

En ocasiones, lo que se busca a través de una validación es demostrar que un método

es equivalente a otro. En la figura 9 se esquematiza el ciclo de una validación, en

teoría éste se repite indefinidamente debido a los continuos avancen instrumentales

y al desarrollo de nuevas técnicas.

Figura 9 - Ciclo de validación

2.2.5.2 Parámetros de validación

Es necesario poner de manifiesto los parámetros que deben llevarse a cabo en el

proceso pues se tiene que demostrar que el método es el adecuado para el caso en

particular, por lo que es preciso determinar mediante estudios de laboratorio las

características de funcionamiento; para este fin la tabla 6 puede ser utilizada como

guía:

Tabla 6 - Identificación de los parámetros de validación

PARÁMETRO A

EVALUAR CARACTERÍSTICAS

MÉTODO

CUALITATIVO

MÉTODO CUANTITATIVO

NORMALIZADO MODIFICADO NUEVO

SELECTIVIDAD

Identificación analito

Interferencia de

matriz

Si No Si Si

LINEALIDAD Rango lineal No Si Si Si

Desarrollo del Método

Validación

Revalidación

Control de Calidad del Laboratorio

22

Tabla 7 – Continuación Identificación de los parámetros de validación

PARÁMETRO A

EVALUAR CARACTERÍSTICAS

MÉTODO

CUALITATIVO

MÉTODO CUANTITATIVO

NORMALIZADO MODIFICADO NUEVO

SENSIBILIDAD Pendiente No Si o No Si Si

LÍMITES

Critico (LC)

Detección (LOD)

Cuantificación (LOQ)

Si Si o No Si Si

PRECISIÓN Repetibilidad

Reproducibilidad No Si Si Si

VERACIDAD Sesgo (s)

Recuperación (R) No Si o No Si o No Si

ROBUSTEZ Test de Youden y

Steiner No No Si o No Si

APLICABILIDAD – Si SI Si Si

Fuente: (Validación de métodos y determinación de la incertidumbre de la medición, (Duffau

B., 2010)

2.2.5.2.1 Linealidad

La linealidad es la capacidad de un método de análisis, dentro de un determinado

intervalo, de dar una respuesta o resultados instrumentales que sean proporcionales

a la cantidad del analito que se habrá de determinar en la muestra de laboratorio.

Con el fin de determinar el rango lineal se puede realizar un gráfico de

concentración versus respuesta, que se conoce como función respuesta

(normalmente llamada recta de calibrado). (Duffau B., 2010)

2.2.5.2.2 Exactitud

El manual del Codex Alimentarius define la exactitud como el grado de

concordancia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia. El término

“exactitud”, esta aplicado a un conjunto de resultados de un ensayo, y supone una

combinación de componentes aleatorios y un componente común de error

sistemático o sesgo. (Eurachem, 2005)

𝐸𝑥𝑎𝑐𝑡𝑖𝑡𝑢𝑑 = �̅� − 𝜇

%𝐸𝑥𝑎𝑐𝑡𝑖𝑡𝑢𝑑 =(�̅�−𝜇)

𝜇× 100

Ecuación 1

Ecuación 2

23

Cuando se aplica a un método de ensayo, el término “exactitud” se refiere a una

combinación de veracidad y precisión.

Veracidad: Determina el grado de coincidencia existente entre el valor medio

obtenido de una serie de resultados y un valor de referencia aceptado.

La veracidad puede ser determinada por sesgo o recuperación.

a) Sesgo (s): es la diferencia entre la expectativa relativa a los resultados de un

ensayo o una medición y el valor verdadero. En la práctica el valor convencional

de cantidad puede sustituir el valor verdadero. El sesgo es el error sistemático

total en contraposición al error aleatorio. Para determinar el sesgo puede

utilizarse material de referencia, material fortificado, material control o material

ensayo de aptitud. Para este fin, se debe medir un analito de concentración

conocido y se determina la diferencia en valor absoluto entre el valor conocido

y la media del valor obtenido.

𝑠 = 𝑋 − 𝑋𝑎

Dónde: 𝑠 = sesgo

𝑋 = lectura obtenida o valor promedio de las lecturas obtenidas.

𝑋𝑎 = valor asignado, valor certificado del material de referencia o valor

esperado.

Para evaluar el sesgo, se debe realizar la prueba t, en la cual el valor de t calculada

será menor al valor de t tabulada (tabs< tcrit). (Duffau B., 2010)

b) Recuperación (R): Es la fracción de la sustancia agregada a la muestra

(muestra fortificada) antes del análisis, al ser analizadas muestras fortificadas y

sin fortificar.

La recuperación permite ver el rendimiento de un método analítico en cuanto al

proceso de extracción y la cantidad del analito existente en la muestra original. Por

lo cual, la recuperación esta intrínsecamente relacionada a las características de la

matriz de la muestra.

Ecuación 3

24

%𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 =�̅�

𝜇× 100

Según la Guía de Laboratorio para la Validación de Métodos Eurachem, para

realizar exactitud y veracidad se deberá analizar con 10 repeticiones al material de

referencia. (Eurachem, 2005)

2.2.5.2.3 Precisión

Precisión es la proximidad de concordancia entre los resultados de pruebas

independientes obtenidos bajo condiciones estipuladas. (Eurachem, 2005)

La precisión podrá establecerse en términos de repetibilidad y reproducibilidad. El

grado de precisión se expresa habitualmente en términos de imprecisión y se

calcula como desviación estándar de los resultados.

a) Repetibilidad: Es la precisión bajo las condiciones de repetibilidad, es decir,

condiciones donde los resultados de análisis independientes se obtienen con el

mismo método en ítems de análisis idénticos en el mismo laboratorio por el

mismo operador utilizando el mismo equipamiento dentro de intervalos cortos

de tiempo. Se puede determinar registrando al menos 6 mediciones bajo las

mismas condiciones (mismo operador, mismo aparato, mismo laboratorio y en

corto intervalo de tiempo) de un analito en un material de referencia. Para su

estimación se puede calcular la Desviación Estándar (Sr) y el porcentaje de

coeficiente de variación (CVr%).

𝑟 = 𝑡∞ × √2 × 𝜎𝑟

b) Reproducibilidad: Es la precisión bajo las condiciones de reproducibilidad, es

decir, condiciones donde los resultados de los análisis se obtienen con el mismo

método en ítem idénticos de análisis en condiciones diferentes ya sea de

laboratorio, diferentes operadores, usando distintos equipos, entre otros. Para

determinar la precisión de la reproducibilidad intralaboratorio (Ri) (es decir, la

precisión dentro de un laboratorio), se sugiere realizar 3 mediciones de un

Material de Referencia (MRC o material control) una vez por cada semana o el

comportamiento de la curva de calibración en 3 días distintos. Calcular la

Ecuación 4

Ecuación 5

25

desviación estándar (SRi) y el porcentaje de coeficiente de variación (CVRi%).

(Duffau B., 2010)

𝑅 = 𝑡∞ × √2 × 𝜎𝑅

Para establecer que parámetros de validación se van a verificar, se puede observar

la tabla 7, aquí se expone el parámetro que necesita ser validado en función del tipo

de método utilizado.

Tabla 8 - Alcance de la validación

a Sólo para análisis a nivel de trazas (ppm, ppb, ppt)

b Sólo métodos cualitativos c Sólo método cuantitativos

d Sólo aplica para métodos o normalizados e Sólo para el análisis de aniones y cationes por ión selectivo

Fuente: (COFEPRIS, 2011)

En la presente investigación el método que se requiere validar es espectroscópico

por lo que los parámetros de desempeño que deberán llevarse a cabo serán:

intervalo lineal y de trabajo, recuperación, sesgo, repetibilidad, reproducibilidad.

2.2.5.3 Proceso de Validación

El proceso de validación de un método analítico se resume en la figura 10, tomando

en cuenta todos los aspectos que intervienen en la validación y dependiendo del tipo

de método.

Ecuación 7

26

Definición del método a validar:

cuali o cuantitativo - analito - matriz-

concentración - principio

Tipo de método

Normalizado

Verificación

Normalizado Modificado

No Normalizado: Nuevo o desarrollado por el laboratorio

Validación prospectiva

Establecer parámetros a evaluar

Establecer pruebas experimentales

Establecer criterios de cceptabilidad

Desarrolar pruebas experimentales

Evaluar resultados

INFORME DE VALIDACIÓN

REVISIÓN DE INFORME

No normallizado tradicional: Usado por el laboratorio hace

años

Validación

retrospectiva

Figura 10 - Proceso de Validación

Fuente: (Validación de métodos y determinación de la incertidumbre de la medición, (Duffau B.,

2010)

Si

Si

No ¿Tiene una modificación

significativa?

Se trata de un Método Normalizado No

Comparar Resultados vs

Criterios

27

2.2.6 DISEÑO EXPERIMENTAL

2.2.6.1 Contraste de significancia

Una de las propiedades más importantes de un método analítico es que debe estar

libre de errores sistemáticos; esto significa que el valor dado para la cantidad de

analito debe ser el valor verdadero. Esta propiedad de un método analítico se puede

contrastar al aplicar el método a una muestra de ensayo estándar que contenga una

cantidad conocida de analito; sin embargo, incluso si no existieran errores

sistemáticos, los errores aleatorios hacen poco probable que la cantidad medida sea

exactamente igual que la cantidad patrón conocida. Para decidir si la diferencia entre

la cantidad medida y la cantidad conocida se puede atribuir a estos errores aleatorios,

se puede aplicar una prueba estadística denominada contraste de significancia. Esta

aproximación contrasta si son significativas las diferencias entre los dos resultados

o si se puede justificar sólo por variaciones aleatorias. Los contrastes de significación

se utilizan ampliamente en la evaluación de los resultados experimentales. (Miller &

Miller, 2002)

La presente investigación se dividirá en dos etapas: en la primera etapa se realizará

la verificación de los parámetros de validación del método espectroscópico infrarrojo

medio en el equipo MilkoScan FT+ y en la segunda etapa se desarrollará el estudio

comparativo de los métodos Gerber y ultrasonido con el espectroscópico infrarrojo

medio; y para estas dos etapas se utilizarán los contrastes de significancia.

2.2.6.2 Estadística utilizada en la validación

La estadística utilizada para verificar los parámetros de la validación se basan en lo

siguiente:

2.2.6.2.1 Comparación de una media experimental con un valor conocido

Al hacer un contraste de significancia se prueba la veracidad de la hipótesis nula

H0 la cual describe que un método analítico no está sujeto a errores sistemáticos,

además el término nulo se emplea para indicar que no hay otra diferencia entre el

valor observado y el conocido que la atribuible a la variación aleatoria. Suponiendo

que esta hipótesis nula es verdadera, la teoría estadística se puede emplear para

calcular la probabilidad de que la diferencia observada entre la media muestral (�̅�),

28

y el valor verdadero (𝜇), que puede considerarse igual a la media de la población

se deba solamente a errores aleatorios. (Miller & Miller, 2002)

Para decidir si la diferencia entre �̅� y 𝜇 es significativa puede usarse el estadístico

“t” como se muestra en la ecuación 8.

𝑡 =(�̅� − 𝜇)√𝑛

𝑠

Donde �̅� = media muestral

𝑠 = desviación estándar muestral

𝑛 = tamaño muestral

De acuerdo a esto, para la presente investigación se pueden plantear las siguientes

hipótesis:

𝐻0: �̅� = 𝜇

𝐻𝑎 : �̅� ≠ 𝜇

Si el valor t es mayor que un cierto valor crítico entonces se rechaza la hipótesis

nula.

2.2.6.2.2 Diseño con Datos Anidados

En ciertos casos, un factor está anidado dentro de otro. Se llama así porque un nivel

subordinado de una variable se encuentra anidado (contenido) dentro de otra que

es jerárquicamente superior; por esta razón, este diseño se conoce también como

jerárquico, así:

Factor A: Día (i = 1, 2, 3)

Factor B: Analista y repeticiones (j = 1, 2, 3)

yij: Porcentaje de grasa de las muestras de leche

Ecuación 8

29

Días

Analista

Repeticiones

Entonces el factor B está anidado en el factor A, es decir, B ⊂ A. Por medio de este

diseño se lleva a cabo la verificación del parámetro precisión (repetibilidad y

reproducibilidad).

2.2.6.3 Comparación de métodos

A continuación se indica la estadística utilizada en la experimentación; para

contrastar los métodos en estudio se utilizaron estadísticos que se basan en la

comparación de medias y desviaciones estándar.

2.2.6.3.1 Contraste “t” de datos emparejados

Los resultados de un método analítico nuevo se pueden contrastar mediante una

comparación con los obtenidos utilizando un segundo método (quizá uno de

referencia). Por ejemplo si se tienen dos medias muestrales �̅�1 y �̅�2, tomando como

hipótesis nula que los dos métodos proporcionen el mismo resultado, es decir, H0:

µ1 = µ2, se necesita probar si (�̅�1 − �̅�2) difieren significativamente de cero. Si las

dos muestras tienen desviaciones estándar que no son significativamente

diferentes, se puede calcular una estimación conjunta de la desviación estándar, s,

a partir de dos desviaciones estándar individuales, s1 y s2. (Miller & Miller, 2002)

El contraste t de datos emparejados se utiliza, en la comparación de dos métodos

de análisis en los que se estudia muestras de ensayo que contienen sustancialmente

diferentes cantidades de analito. Si no existen diferencias entre los dos métodos,

las diferencias se obtienen de una población con media µd = 0. Para probar la

hipótesis nula, se prueba si 𝑑̅ difiere significativamente de cero utilizando el

estadístico t. (Miller & Miller, 2002)

𝑦111

𝒚𝟏𝟏𝟏

𝒚𝟏𝟏𝟐

𝒚𝟏𝟏𝟑

2

1 2 3

1 3

𝒚𝟏𝟏𝟏

𝒚𝟏𝟏𝟐

𝒚𝟏𝟏𝟑

𝑦113

𝑦112

30

𝑡 =𝑑̅√𝑛

𝑆𝑑

Dónde: 𝑑̅: Media de la diferencia entre los valores que forman cada par

𝑆𝑑: Desviación estándar de la diferencia entre los valores que forman cada

par

n: número de parejas

Con la prueba t se comparan las medias y las desviaciones estándar del grupo de

datos y se determina si entre esos parámetros las diferencias son estadísticamente

significativas o si sólo son diferencias aleatorias.

Es necesario que se realice el mismo número de medidas sobre cada muestra por

el primer método y análogamente por el segundo método; es decir, n medidas de

cada muestra por el método 1 y m por el método 2, donde m y n no tienen por qué

ser iguales.

Hay diferentes circunstancias por las cuales puede ser necesario o deseable diseñar

un experimento, de manera que cada muestra sea analizada por cada uno de los dos

métodos, proporcionando resultados que están emparejados de forma natural.

(Miller & Miller, 2002)

La investigación se centrará en la comparación entre los métodos Gerber y

ultrasonido con respecto al infrarrojo medio, el mismo que previamente será

validado; para llevar a cabo esto se utilizará un contraste t de datos emparejados

con 11 muestras de leche de 11 lotes diferentes por los métodos tres métodos.

2.2.6.3.2 Contraste “F” para la comparación de desviación estándar

En muchos casos es importante comparar las desviaciones estándar, es decir, los

errores aleatorios de dos conjuntos de datos; esta comparación, como en el caso de

los contrastes de medias, puede tomar dos formas. Se puede pretender probar si el

método A es más preciso que el método B (es decir, un contraste de una cola) o si

los métodos A y B difieren en su precisión (es decir, un contraste de dos colas).

Ecuación 1

31

El contraste F considera la razón de las varianzas muestrales, es decir, la razón de

los cuadrados de las desviaciones estándar, s21/ s

22. Para probar si es significativa

la diferencia entre dos varianzas muestrales, esto es, para probar H0:21 = 2

2, se

calcula el estadístico F:

𝐹 =𝑆1

2

𝑆22

Dónde: 𝑆12: Desviación estándar del método infrarrojo medio

𝑆22: Desviación estándar del método Infrarrojo medio o ultrasonido

El número de grados de libertad del numerador denominador son n1 – 1 y n2 – 2,

respectivamente. El contraste supone que las poblaciones de donde se extraen las

muestras son normales.

Si la hipótesis nula es verdadera entonces la relación de varianzas debería ser

próxima a 1; las diferencias respecto de 1 se deben a variaciones aleatorias; pero si

la diferencia es demasiado grande no se podrá atribuir a esta causa. Si el valor

calculado de F supera un cierto valor crítico de F depende del tamaño de las dos

muestras, del nivel de significación y del tipo de contraste realizado. (Miller &

Miller, 2002)

2.2.6.3.3 Comparación de un método analítico con el método de referencia

Cuando se quieren comparar la concentración estimada por dos métodos analíticos

a diferentes niveles de concentración, se prepara un conjunto de muestras en las

que la concentración de analito varía en el intervalo de valores más frecuentes que

van a encontrarse en la práctica, y se analizan con los dos métodos que se pretenden

comparar como se muestra en la figura 11. Los errores más comunes que pueden

obtenerse cuando el conjunto de muestras se analiza por dos métodos, pueden

ponerse de manifiesto mediante técnicas de regresión. La ausencia de todo error en

los datos se manifestaría mediante la obtención de una línea recta de pendiente

unidad y ordenada en el origen cero. La presencia de un error sistemático

proporcional llevaría a la obtención de una recta con pendiente distinta a la unidad

pero ordenada nula, mientras que la presencia de errores sistemáticos constantes

Ecuación 2

32

conduciría a la obtención de una recta con una ordenada en el origen distinta de

cero. Los errores aleatorios, que acompañan siempre a todo tipo de resultados,

darían lugar a una dispersión de los puntos experimentales alrededor de la línea de

regresión, afectando al valor del coeficiente de determinación. De este modo, la

presencia de los tres tipos de errores mencionados, aleatorios, sistemáticos

constantes y sistemáticos proporcionales daría lugar a la recta. (Miller & Miller,

2002)

Figura 11 - Rectas de regresión para comparar métodos analíticos.

Fuente: (James Miller, Jane Miller, 2002)

33

2.3 Fundamentación Legal

Los documentos oficiales que se utilizarán para el desarrollo de la investigación se

basarán en lo siguiente:

- Instructivo de toma de muestras AGROCALIDAD

- Instructivo del equipo MilkoscanTM FT+

- Instructivo del equipo Ekomilk

- Norma NTE INEN 009:2012 – Leche Cruda. Requisitos

- Norma NTE INEN 0012:73 - Leche. Determinación del contenido de grasa

- NORMA NTE INEN-ISO/IEC 17025: 2005 (Norma Internacional). Criterios

Generales de Acreditación de Laboratorios de Ensayo y Calibración. OAE CR

GA01 R00

- AOAC 33.2.27A – Determinación del contenido de grasa en leche (Método

Gerber)

- Artículo Ministerial 394, Ministerio de Agricultura Ganadería y Pesca

34

CAPITULO III

METODOLOGIA

3.1 Tipo de Investigación

La investigación fue de tipo experimental cuantitativa y estadística. Previamente se

realizó una investigación documental de los modelos teóricos aplicables a la validación

y de los métodos que se utilizarán para la determinación de grasa en leche cruda. Se

procedió a la recolección de datos en el Laboratorio de Control de Calidad de la Leche

de AGROCALIDAD.

3.2 VARIABLES DE LA INVESTIGACIÓN

3.2.1 Variable Independiente

Muestras de leche tomadas en la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Central

del Ecuador.

3.2.2 Variable Dependiente

Porcentaje de Proteína.

3.3 Población y Muestra

3.3.1 Población

La población utilizada para la validación del método infrarrojo medio se puede observar

en el anexo 8.

Para la comparación de métodos, se tomó 150mL de leche, recolectados en frascos

estériles con conservante Bronopol, dos veces al día por tres días.

3.3.2 Muestra

Las muestras que se utilizaron para la validación del método de espectroscopía en la

región del infrarrojo medio fueron estándares certificados (Materiales de Referencia

Certificados) en un rango de 11 concentraciones que van de 2,45 hasta 5,14% de grasa.

Los MRC fueron procedentes de la República Argentina y facilitados por la empresa INTI

35

LACTEOS, estos contenían leche cruda con un porcentaje de grasa conocido, más un

conservante (Bronopol) que actúa como bactericida.

Se tomaron 11 muestras de leche para realizar la comparación de métodos, estas fueron

recolectadas del ordeño de las vacas que se encuentran en la Facultad de Ciencias

Agrícolas de la Universidad Central del Ecuador ubicada en Tumbaco, sector La Morita.

El protocolo que se siguió para realizar el muestreo está descrito en el instructivo de Toma

de Muestras del Laboratorio de Control de Calidad de Leche de AGROCALIDAD (anexo

3).

3.4 Diseño Experimental

El diseño experimental que se utilizó para realizar la investigación se detalla en las

siguientes tablas:

Tabla 9 – Validación

Parámetro Diseño experimental

Exactitud (en todos los puntos

del rango de trabajo)

Estadístico t

Error absoluto

Error relativo (%)

Recuperabilidad (%)

Precisión

Repetibilidad

Reproducibilidad

ANOVA de factores totalmente

anidados y homogéneos

Linealidad Pendiente

Coeficiente de Correlación

Tabla 10 - Comparación de métodos

Comparación de métodos

Parámetro Diseño experimental

Exactitud entre métodos Estadístico t

Precisión entre métodos Prueba F

Correlación Curvas de correlación

36

3.4.1 ETAPA 1 - Diseño para la validación:

3.4.1.1 Parámetros de validación

En la validación del método infrarrojo medio para la determinación de grasa en leche

cruda, los parámetros que se utilizaron fueron los siguientes:

Exactitud.- para esta prueba se trabajó con material de referencia certificado (MRC)

en un rango de concentraciones de grasa (11 niveles); se efectuaron 15 repeticiones

para cada concentración y mediante el porcentaje de recuperabilidad se verificó que

se cumpla esa condición.

Veracidad: Para verificar la veracidad se utilizó material de referencia, se

determinó la media y la desviación estándar y se comparó contra el valor

caracterizado del material de referencia. Posteriormente se determinó el

porcentaje de recuperabilidad.

Recuperabilidad: El rango de aceptabilidad se obtuvo mediante los parámetros

establecidos previamente por la empresa (%R= 90 – 110%).

Tabla 11 – Veracidad y recuperabilidad (exactitud)

Día

s

N° de

Lecturas

(Repeticiones

Material de

Referencia)

Porcentaje de grasa en leche (%)

Con

cen

traci

ón

1

Con

cen

traci

ón

2

Con

cen

traci

ón

3

Con

cen

traci

ón

4

Con

cen

traci

ón

5

Con

cen

traci

ón

6

Con

cen

traci

ón

7

Con

cen

traci

ón

8

Con

cen

traci

ón

9

Con

cen

traci

ón

10

Con

cen

traci

ón

11

Día

1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Día

2

6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

37

Tabla 12 – Continuación Veracidad y recuperabilidad (exactitud)

Día

s

N° de

Lecturas

(Repeticiones

Material de

Referencia)


Con

cen

traci

ón

1

Con

cen

traci

ón

2

Con

cen

traci

ón

3

Con

cen

traci

ón

4

Con

cen

traci

ón

5

Con

cen

traci

ón

6

Con

cen

traci

ón

7

Con

cen

traci

ón

8

Con

cen

traci

ón

9

Con

cen

traci

ón

10

Con

cen

traci

ón

11

Día

3

11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

12 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

13 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Total 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15

Precisión.- esté parámetro fue establecido en términos de repetibilidad y

reproducibilidad

Repetibilidad y Reproducibilidad.- Para la ejecución de esta prueba se trabajó con

un rango de concentraciones de grasa (11 niveles) con material de referencia

certificado; el diseño experimental que se aplicó en esta parte fue un diseño de

factores completamente anidados, en el que el factor B (analistas y repeticiones)

está anidado en el factor A (días), es decir, B ⊂ A.

Se utilizó la prueba estadística que sigue la distribución F de Fisher, para esto se

realizó a los once niveles de concentraciones de grasa un análisis de varianza

ANOVA como se muestra en la tabla 12; para cada nivel de concentración se

efectuaron 5 repeticiones en tres días de análisis, dando un total de 15 datos; a más

de esto se calcularon los límites de repetibilidad y reproducibilidad.

38

Tabla 13 – Diseño experimental en condiciones de precisión (repetibilidad y

reproducibilidad)

Repeticiones

MRC


Total Día 1 Día 2 Día 3

Analista 1 Analista 2 Analista 3

1 1 1 1 3

2 1 1 1 3

3 1 1 1 3

4 1 1 1 3

5 1 1 1 3

Total 5 5 5 15

Linealidad.- para la realización de esta prueba se trabajó con material de referencia

certificado (MRC) en un rango de 11 niveles de concentración de grasa; se efectuó

la lectura de cada uno de los valores reportados en la ficha técnica mediante el equipo

MilkoScanTM FT+ y se determinaron los parámetros de linealidad (pendiente,

ordenada al origen y coeficiente de correlación).

Tabla 14 – Diseño experimental para Linealidad

Valores reportados en la ficha

técnica del MRC, usando el

método Gerber

Valores del MRC reportados

por el laboratorio de

AGROCALIDAD, usando el

método espectroscópico IR

2,13 1

2,45 1

2,64 1

3,08 1

3,38 1

3,62 1

3,69 1

3,96 1

4,46 1

4,85 1

5,14 1

39

3.4.2 ETAPA 2 - Diseño para la Comparación de Métodos:

3.4.2.1 Exactitud entre métodos:

En esta etapa se realizó la comparación del método validado frente a los métodos

para la determinación de grasa, es decir; se efectuaran dos comparaciones: el método

infrarrojo con el método Gerber y el método infrarrojo contra el método del

ultrasonido.

Aquí se utilizó leche cruda con conservante bronopol, se tomaron 11 muestras y se

realizó una medición de cada una por los tres métodos (infrarrojo, ultrasonido y

Gerber). La prueba estadística que se utilizó para verificar este parámetro fue un

contraste t para datos emparejados y se determinó si existe o no diferencia

significativa entre cada método.

Tabla 15 – Prueba t (Método infrarrojo – Método Gerber)

Lote


Método infrarrojo

medio Método Gerber

1 1 1

2 1 1

3 1 1

4 1 1

5 1 1

6 1 1

7 1 1

8 1 1

9 1 1

10 1 1

11 1 1

Total 11 11

40

Tabla 16 – Prueba t (Método infrarrojo – Método ultrasonido)

Lote


Método infrarrojo

medio

Método

ultrasonido

1 1 1

2 1 1

3 1 1

4 1 1

5 1 1

6 1 1

7 1 1

8 1 1

9 1 1

10 1 1

11 1 1

Total 11 11

3.4.2.2 Precisión entre métodos:

Esta prueba se realizó para comparar las precisiones de cada método mediante sus

desviaciones estándares utilizando la prueba estadística que sigue la distribución F

de Fisher. Se tomaron 11 muestras de leche cruda con conservante bronopol y se

efectuó una medición para cada una por los tres métodos en cuestión.

Tabla 17 – Prueba F (Método infrarrojo – Método Gerber)

Lote


Método infrarrojo


1 1 1

2 1 1

3 1 1

4 1 1

5 1 1

6 1 1

7 1 1

8 1 1

41

Tabla 18 – Continuación Prueba F (Método infrarrojo – Método Gerber)

Lote


Método infrarrojo


9 1 1

10 1 1

11 1 1

Total 11 11

Tabla 19 – Prueba F (Método infrarrojo – Método ultrasonido)

Lote


Método infrarrojo

medio

Método

ultrasonido

1 1 1

2 1 1

3 1 1

4 1 1

5 1 1

6 1 1

7 1 1

8 1 1

9 1 1

10 1 1

11 1 1

Total 11 11

3.4.2.3 Correlación

Con los datos obtenidos por los tres métodos estudiados (Infrarrojo, Gerber y

ultrasonido) se determinó el grado de correlación.

Tabla 20 – Correlación entre métodos

Lote


Método

infrarrojo

Método

ultrasonido

Método

Gerber

1 1 1 1

2 1 1 1

42

Tabla 21 – Continuación Correlación entre métodos

Lote


Método

infrarrojo

Método

ultrasonido

Método

Gerber

3 1 1 1

4 1 1 1

5 1 1 1

6 1 1 1

7 1 1 1

8 1 1 1

9 1 1 1

10 1 1 1

11 1 1 1

Total 11 11 11

3.5 Materiales y Métodos

Se utilizó como referencia los siguientes métodos para la determinación de grasa en

leche cruda:

Método AOAC 972.16: 1972 Fat, Lactose, Protein, and solids in milk Mid-

Infrared Spectroscopic Method.

Método AOAC 989.05: 1992 Determinación de Grasa

Método Norma INEN NTE 12:1973-06. Leche. Determinación del contenido

de grasa (Gerber y Rosë Gottlieb).

3.5.1 Método espectroscópico para la determinación de grasa en leche cruda

Discusión general.- para este método es necesario tomar en consideración que las

muestras de leche cruda tendrán que estar a una temperatura aproximada de 40°C,

además deberán estar lo más homogéneas posible para esto se recomienda agitar muy

bien a las muestras.

43

3.5.1.1 Materiales y equipos:

MilkoScanTM FT+

Figura 12 - MilkoScanTM FT +

Planchas de calentamiento con sistema de agitación magnética

Agitador magnético pequeño

Purificador de agua

Baño María

Probetas de 100, 250, 1000 y 2000 cm3

3.5.1.2 Reactivos:

S-6060 Zero Liquid Concentrate

Figura 13 - Zero Liquid Concentrate

S-470 Cleaning Agent

44

Figura 14 - Cleaning Agent

FossClean kit

Figura 15 - FossClean kit

Agua Destilada tipo II

3.5.1.3 Procedimiento:

1. Preparación de muestras

a) Calentar la muestra aproximadamente por 5 minutos en un baño de agua hasta

observar que la muestra esté homogénea.

b) Si la muestra se encuentra en fundas recolectoras o envases que no tienen el

tamaño necesario para el análisis en el equipo MilkoScan FT+, luego de

realizar el paso anterior se agita suavemente y se trasvasa al frasco apropiado.

c) Las muestras en los frascos apropiados se colocan en los racks de 10 puestos

del equipo MilkoScan FT+, para ser agitados con movimientos suaves, entre

10 a 15 veces.

d) Se procede a transportarlos las muestras en los racks al equipo MilkoScan FT+

para el análisis.

45

2. Técnica

Para ejecutar los análisis de grasa, proteína, sólidos totales, sólidos no grasos,

punto crioscópico, mediante el uso del equipo, se realiza los siguientes pasos:

a) Encender el equipo MilkoScan FT+ y el computador abriendo el software Start

Foss Integrator.

b) Al momento del encendido del equipo, empieza preparar las soluciones de

trabajo. descritas en el Anexo II (S-6060 Zero Liquid Concentrate, S-470

Cleaning Agent,

c) Cuando la ventana de eventos de sesión de trabajo indique 0 de 0, se habilita la

opción de Play y se inicia el análisis.

d) Colocar las muestras sobre el conveyor 5000 Basic.

e) Escoger en la ventana de Registro de Muestras la opción de “Nueva Tarea-

Análisis”. Se incluyen los siguientes datos:

Producto: Predeterminado MilkoScan FT+

Tipo de tarea: Normal

Nombre: Identificación de muestra y sus códigos de la muestras o rangos.

Total: Número de muestras a analizar

Otros (comentarios)

Agregar lista a tareas

f) Hacer Clic en “Play” y el equipo automáticamente corre las muestras y ejecuta

el análisis.

g) Los resultados son registrados electrónicamente en el software que permite su

recuperación como archivo electrónico.

h) Luego de terminar los análisis, iniciar los respectivos tratamientos de limpieza

(Lavado de pipeta, purga, limpieza).

i) Apagar el equipo y cerrar el software “Start Foss Integrator”.

Notas:

• Para realizar los ensayos de células somáticas y composición se puede escoger

en la opción de predeterminado: MilkoScan FT+ + Foosomatic FC.

• Durante los análisis verificar que las soluciones y reactivos en uso se

encuentren en una cantidad adecuada para el análisis y con tiempo de vida útil

vigente.

46

• Si durante el análisis el Fossomatic indica un mensaje de error o de alerta

reportar al personal al RT.

• Al finalizar realizar un nuevo lavado. (limpieza de pipetas, purgas)

• Verificar que el MilkoScanTM FT+ se encuentre fuera de línea, apagado y

desconectado.

• Las muestras luego de ser procesadas son almacenadas temporalmente por un

período de aproximadamente máximo 15 días y colocadas en los

compartimientos bajos de la refrigeradora.

3.5.2 Método Gerber para la determinación de grasa en leche cruda

Discusión general.- para este método es necesario tomar en consideración que al

momento de colocar el ácido sobre las muestras el mismo debe caer muy lentamente

para así no quemarlas y poder obtener resultado esperado.


Centrifugadora Funke Gerber

Figura 16 - Centrifugadora Funke Gerber

47

Butirómetros Gerber.

Figura 17 - Butirómetro Gerber

Baño de agua, con regulador de temperatura ajustado a 65°C ± 2°C

Figura 18 - Baño de agua

48

Pipeta aforada de 10cm3, para ácido sulfúrico.

Pipeta aforada de 1cm3, para alcohol amílico

Pipeta aforada de 10.94cm3, para medir la muestra.

Agua destilada tipo II.

Piceta

3.5.2.2 Reactivos:

Ácido sulfúrico concentrado para análisis, con densidad 1,815 ± 0,003 g/cm3 a

20°C.

Alcohol amílico compuesto principalmente de 3-metil-butanol, 2-metil-butanol,

prácticamente exento de alcoholes amílicos secundarios o terciarios y furfural;

deberá tener una densidad de 0,811 ± 0,002 g/cm3 a 20°C.

Agua destilada.


1. Preparación de la muestra

a) Llevar la muestra a temperatura de aproximadamente 20°C y mezclarla

mediante agitación suave hasta que esté homogénea, cuidando que no haya

separación de grasa por efecto de la agitación. Si se forman grumos de crema

y estos no dispersan, calentar la muestra en baño maría hasta 35-40°C,

mezclando cuidadosamente e incorporando cualquier partícula de crema

adherida al recipiente y enfriar rápidamente hasta 18-20°C. Si quedan

partículas blancas o grumos de grasa adheridos a las paredes del recipiente, la

determinación no dará resultados exactos.

2. Técnica

a) Verter 10 cm3, exactamente medidos, de ácido sulfúrico en el butirómetro

respectivo, cuidando de no humedecer con ácido el cuello del butirómetro.

b) Invertir lentamente tres o cuatro veces la botella que contiene la muestra

preparada y pipetear 10,94 cm3 de leche, de tal manera que el borde inferior

del menisco coincida con la línea de calibración de la pipeta después de limpiar

con papel absorbente la parte exterior de su punta de descarga. Luego,

sosteniendo la pipeta con su punta pegada al borde inferior del cuello del

butirómetro, descargar cuidadosamente la leche en el mismo hasta que el

49

menisco se detenga, dejar transcurrir 3 segundos y frotar la punta de la pipeta

contra la base del cuello del butirómetro.

c) Verter 1 cm3 exactamente metido, de alcohol amílico en el butirómetro,

cuidando de no humedecer con alcohol el cuello del butirómetro, el alcohol

amílico debe añadirse siempre después de la leche.

d) Tapar herméticamente después de la agitación, centrifugar el butirómetro con

su tapa colocada hacia afuera. Si no hay un número de butirómetros para llenar

completamente la centrífuga, colocarlos simétricamente, equilibrándolos con

uno que contenga igual volumen de agua en caso de ser necesario. Una vez que

la centrífuga alcanza la velocidad necesaria, continuar la centrifugación

durante un tiempo no menor a cuatro minutos ni mayor a cinco minutos, a tal

velocidad. Retirar el butirómetro de la centrífuga y colocarlo con la tapa hacia

abajo, en el baño de agua a 65°C ± 2°C durante un tiempo no menor de 4

minutos ni mayor de 10 minutos, manteniendo la columna de grasa

completamente sumergida en el agua.

3.5.3 Método ultrasonido para la determinación de grasa en leche cruda

Discusión general.- para este método es necesario tomar en consideración la limpieza

del equipo, pues este factor es crítico en el resultado final.


Ekomilk Ultra Pro

Figura 19 - Ekomilk Ultra Pro

50

Vasos de precipitación de 50 cm3

Agua destilada tipo II.

Piceta

3.5.3.2 Reactivos:

Agua destilada tipo II


1. Preparación de la Muestra

a) Las muestras de leche deben estar entre 5-35°C. Si la temperatura de la leche

es superior a 38°C el mensaje “Muestra caliente” aparecerá en la pantalla.

b) Si se trata de analizar muestras frías las cuales tienen la grasa/crema separada,

es muy probable que los resultados sean erróneos, especialmente para el

análisis de grasa. En este caso es necesario calentar las muestras a temperaturas

de 40-42°C, mezclar la leche para disolver la grasa separada, luego enfriarla a

20-25°C y finalmente analizarla con el EKOMILK

c) La acidez de las muestras de leche debe ser menor a 25°C para vaca, búfalo y

cabra y menor a 28°C para la leche de oveja.

d) Usar las muestras solamente una vez. Cuando la medición se ha llevado a cabo,

desechar la muestra.

2. Actividades

a) Inserte el tapón de plástico con el tubo de vinil en lugar del émbolo.

b) Llene la taza de medición con la muestra de leche a medir.

c) Coloque la taza de medición en el soporte de plástico con el tubo en la muestra

de leche.

d) Pulse MODE y por medio de los botones de búsqueda ▲, ▼ seleccione el

modo deseado:

e) *LECHE DE VACA 1: análisis de la leche cruda de vaca

f) Cuando se muestra el tipo adecuado de leche, pulse OK para iniciar la

medición.

g) La leche automáticamente es impulsada a la cámara de medición.

h) El mensaje ANALIZANDO aparece en la pantalla, mientras la medición está

pasando.

51

i) Cuando la medición se completa la leche regresa de forma automática a la taza

y la pantalla muestra los resultados obtenidos de los parámetros de la leche.

j) Antes de comenzar una nueva medición, hay una posibilidad para borrar la

última medición de la memoria del analizador. Pulse el botón ▼ y luego

presione el botón ▲sin soltar el botón ▼. El mensaje que aparecerá en la

pantalla será registro descartado.

k) En caso de leche insuficiente en la cámara (o daño en el sistema de medición)

el mensaje que aparecerá en la pantalla será “cámara vacía”. Colocar más leche

y empezar el análisis de nuevo.

l) Después de que se complete la medición los resultados se podrán imprimir

pulsando el botón ▲ en el panel frontal del analizador. Los resultados se

imprimen cada vez que se pulsa este botón.

m) El número de mensaje: 001 aparece en la pantalla si el analizador trabaja en el

modo “recolección e impresión de datos”, el número máximo de registros

puede ser 120. Si usted intenta escribir más registros aparece en la pantalla “NO

ESPACIO EN LA MEMORIA”. En este caso, debe transferir los datos a un

ordenador y limpiar/vaciar la memoria del analizador.

52

CAPITULO IV

ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

4.1 Datos experimentales y resultados

4.1.1 ETAPA 1 - Validación

4.1.1.1 Exactitud

Tabla 22 – Resultados veracidad y recuperabilidad (exactitud)

Día

s

N° de

Lecturas

(Repeticiones

Material de

Referencia)


Con

cen

traci

ón

1

Con

cen

traci

ón

2

Con

cen

traci

ón

3

Con

cen

traci

ón

4

Con

cen

traci

ón

5

Con

cen

traci

ón

6

Con

cen

traci

ón

7

Con

cen

traci

ón

8

Con

cen

traci

ón

9

Con

cen

traci

ón

10

Con

cen

traci

ón

11

Valor de Referencia

Certificado 2,13 2,45 2,64 3,08 3,38 3,62 3,69 3,96 4,46 4,85 5,14

Día

1

1 1,88 2,20 2,34 2,84 3,13 3,39 3,46 3,76 4,17 4,66 4,91

2 1,88 2,20 2,34 2,85 3,13 3,40 3,46 3,76 4,20 4,66 4,91

3 1,89 2,21 2,35 2,85 3,13 3,41 3,47 3,76 4,27 4,69 4,92

4 1,97 2,24 2,35 2,87 3,13 3,43 3,50 3,78 4,28 4,70 4,94

5 1,98 2,26 2,43 2,89 3,18 3,45 3,51 3,80 4,29 4,72 4,95

Día

2

6 1,89 2,20 2,38 2,85 3,13 3,39 3,46 3,76 4,28 4,67 4,93

7 1,89 2,21 2,38 2,86 3,14 3,40 3,47 3,77 4,29 4,67 4,93

8 1,89 2,24 2,75 2,87 3,14 3,40 3,49 3,77 4,29 4,73 4,94

9 1,98 2,24 2,42 2,89 3,14 3,45 3,51 3,83 4,29 4,73 4,95

10 1,97 2,27 2,43 2,89 3,20 3,45 3,53 3,83 4,30 4,74 4,97

Día

3

11 1,89 2,20 2,35 2,85 3,13 3,39 3,46 3,78 4,28 4,68 4,91

12 1,89 2,21 2,41 2,86 3,14 3,40 3,49 3,79 4,28 4,69 4,92

13 1,96 2,24 2,42 2,86 3,20 3,40 3,49 3,84 4,28 4,72 4,94

14 1,96 2,25 2,42 2,89 3,21 3,45 3,49 3,84 4,29 4,73 4,95

15 1,99 2,27 3,05 2,93 3,25 3,48 3,53 3,86 4,30 4,75 4,98

53

Tabla 23 – Continuación Resultados veracidad y recuperabilidad (exactitud)

Día

s

N° de

Lecturas

(Repeticiones

Material de

Referencia)


Con

cen

traci

ón

1

Con

cen

traci

ón

2

Con

cen

traci

ón

3

Con

cen

traci

ón

4

Con

cen

traci

ón

5

Con

cen

traci

ón

6

Con

cen

traci

ón

7

Con

cen

traci

ón

8

Con

cen

traci

ón

9

Con

cen

traci

ón

10

Con

cen

traci

ón

11

�̅� 1,93 2,23 2,45 2,87 3,16 3,42 3,49 3,80 4,27 4,70 4,94

𝒔𝒑𝒐𝒏𝒅𝒆𝒓𝒂𝒅𝒂 0,0476 0,0278 0,1928 0,0244 0,0357 0,0315 0,0258 0,0303 0,0316 0,0302 0,0213

𝒕 𝒔𝒕𝒖𝒅𝒆𝒏𝒕 -16,49 -30,73 -3,72 -33,30 -23,99 -24,66 -30,38 -21,03 -22,94 -18,92 -36,99

𝒕𝟗𝟓% 2,15 2,15 2,15 2,15 2,15 2,15 2,15 2,15 2,15 2,15 2,15

𝒕𝟗𝟗% 2,98 2,98 2,98 2,98 2,98 2,98 2,98 2,98 2,98 2,98 2,98

𝑬𝒙𝒂𝒄𝒕𝒊𝒕𝒖𝒅 0,20 0,22 0,19 0,21 0,22 0,20 0,20 0,16 0,19 0,15 0,20

% 𝑬𝒙𝒂𝒄𝒕𝒊𝒕𝒖𝒅 9,51 9,01 7,02 6,82 6,55 5,54 5,47 4,16 4,20 3,04 3,96

% 𝑹𝒆𝒄𝒖𝒑𝒆𝒓𝒂𝒃𝒊𝒍𝒊𝒅𝒂𝒅 90,49 90,99 92,98 93,18 93,45 94,46 94,53 95,84 95,80 96,96 96,04

Nota: En la tabla 23 se muestra el resultado de la t de student al 95 y 99% de confianza,

exactitud, % de exactitud y % de recuperabilidad; utilizando las ecuaciones de las páginas

22, 24 y 28.

Para todos los casos del material de referencia certificado se aplicó el estadístico

t y mediante el cálculo correspondiente se rechaza la hipótesis nula ya que t

calculada es mayor que t tabulada al 95% y 99% de confianza.

Los límites para el porcentaje de recuperación fueron previamente definidos por

la empresa como se puede observar en el anexo 7, por lo que todos los valores

calculados están dentro de lo establecido, es decir, 90 – 100%, cumpliendo

satisfactoriamente con el criterio de validación planteado.

54

4.1.1.2 Precisión

Repetibilidad y reproducibilidad

Tabla 24 – Resultados precisión (repetibilidad y reproducibilidad) MRC 1

Repeticiones

MRC




1 1,88 1,89 1,89 1,89

2 1,88 1,89 1,89 1,89

3 1,89 1,89 1,96 1,91

4 1,97 1,98 1,96 1,97

5 1,98 1,97 1,99 1,98

�̅� 1,92 1,92 1,94 1,93

Tabla 25 – Análisis de varianza para MRC 1

Origen de las variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los cuadrados

F Probabilidad Valor

crítico para F

Entre grupos 0,00089 2 0,00045 0,19706 0,82375 3,8853

Dentro de los grupos

0,02720 12 0,00227 Ns

Total 0,02809 14


Repeticiones

MRC




1 2,20 2,20 2,20 2,20

2 2,20 2,21 2,21 2,21

3 2,21 2,24 2,24 2,23

4 2,24 2,24 2,25 2,24

5 2,26 2,27 2,27 2,27

�̅� 2,22 2,23 2,23 2,23

55


Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad


F Probabilida

d

Valor crítico para F

Entre grupos 0,00041 2 0,00021 0,26724 0,76993 3,88529


0,00928 12 0,00077 Ns

Total 0,00969 14


Repeticiones

MRC




1 2,34 2,38 2,35 2,36

2 2,34 2,38 2,41 2,38

3 2,35 2,75 2,42 2,51

4 2,35 2,42 2,42 2,40

5 2,43 2,43 3,05 2,64

�̅� 2,36 2,47 2,53 2,45


Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad


F Probabilida

d


Entre grupos 0,07281 2 0,03641 0,97964 0,40356 3,88529


0,44596 12 0,03716 ns

Total 0,51877 14

56


Repeticiones

MRC




1 2,84 2,85 2,85 2,85

2 2,85 2,86 2,86 2,86

3 2,85 2,87 2,86 2,86

4 2,87 2,89 2,89 2,88

5 2,89 2,89 2,93 2,90

�̅� 2,86 2,87 2,88 2,87


Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad


F Probabilida

d


Entre grupos 0,0008 2 0,0004 0,7039 0,5140 3,8853


0,0072 12 0,0006 ns

Total 0,0080 14


Repeticiones

MRC




1 3,13 3,13 3,13 3,13

2 3,13 3,14 3,14 3,14

3 3,13 3,14 3,20 3,16

4 3,13 3,14 3,21 3,16

5 3,18 3,20 3,25 3,21

�̅� 3,14 3,15 3,19 3,16

57


Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad


F Probabilida

d


Entre grupos 0,0059 2 0,0029 2,2924 0,1435 3,8853


0,0153 12 0,0013 ns

Total 0,0212 14


Repeticiones

MRC




1 3,39 3,39 3,39 3,39

2 3,40 3,40 3,40 3,40

3 3,41 3,40 3,40 3,40

4 3,43 3,45 3,45 3,44

5 3,45 3,45 3,48 3,46

�̅� 3,42 3,42 3,42 3,42


Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad


F Probabilida

d


Entre grupos 0,0002 2 0,0001 0,0872 0,9170 3,8853


0,0119 12 0,0010 ns

Total 0,0121 14

58


Repeticiones

MRC




1 3,46 3,46 3,46 3,46

2 3,46 3,47 3,49 3,47

3 3,47 3,49 3,49 3,48

4 3,50 3,51 3,49 3,50

5 3,51 3,53 3,53 3,52

�̅� 3,48 3,49 3,49 3,49


Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad


F Probabilida

d


Entre grupos 0,0005 2 0,0002 0,3618 0,7038 3,8853


0,0080 12 0,0007 ns

Total 0,0084 14


Repeticiones

MRC




1 3,76 3,76 3,78 3,77

2 3,76 3,77 3,79 3,77

3 3,76 3,77 3,84 3,79

4 3,78 3,83 3,84 3,82

5 3,80 3,83 3,86 3,83

�̅� 3,77 3,79 3,82 3,80

59


Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad


F Probabilida

d


Entre grupos 0,0063 2 0,0032 3,4420 0,0658 3,8853


0,0110 12 0,0009 ns

Total 0,0174 14


Repeticiones

MRC




1 4,17 4,28 4,28 4,24

2 4,20 4,29 4,28 4,26

3 4,27 4,29 4,28 4,28

4 4,28 4,29 4,29 4,29

5 4,29 4,30 4,30 4,30

�̅� 4,24 4,29 4,29 4,27


Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad


F Probabilida

d


Entre grupos 0,0071 2 0,0035 3,5467 0,0616 3,8853


0,0120 12 0,0010 ns

Total 0,0191 14

60


Repeticiones

MRC




1 4,66 4,67 4,68 4,67

2 4,66 4,67 4,69 4,67

3 4,69 4,73 4,72 4,71

4 4,70 4,73 4,73 4,72

5 4,72 4,74 4,75 4,74

�̅� 4,69 4,71 4,71 4,70


Origen de las variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad


F Probabilidad Valor

crítico para F

Entre grupos 0,0022 2 0,0011 1,1941 0,3365 3,8853


0,0109 12 0,0009 ns

Total 0,0131 14


Repeticiones

MRC




1 4,91 4,93 4,91 4,92

2 4,91 4,93 4,92 4,92

3 4,92 4,94 4,94 4,93

4 4,94 4,95 4,95 4,95

5 4,95 4,97 4,98 4,97

�̅� 4,93 4,94 4,94 4,94

61


Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad


F Probabilida

d


Entre grupos 0,0009 2 0,0004 0,9853 0,4016 3,8853


0,0054 12 0,0005 ns

Total 0,0063 14

𝐻0: 𝐸𝑥𝑖𝑠𝑡𝑒 𝑟𝑒𝑝𝑒𝑡𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑦 𝑟𝑒𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 (𝑁𝑜 𝑒𝑥𝑖𝑠𝑡𝑒𝑛 𝑑𝑖𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑠 𝑠𝑖𝑔𝑛𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎𝑠 )

𝐻𝑎 : 𝑁𝑜 𝑒𝑥𝑖𝑠𝑡𝑒 𝑟𝑒𝑝𝑒𝑡𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑦 𝑟𝑒𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 (𝐸𝑥𝑖𝑠𝑡𝑒𝑛 𝑑𝑖𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑠 𝑠𝑖𝑔𝑛𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎𝑠 )

Para todos los Materiales de Referencia Certificados MRC se obtuvo:

El estadístico F, utilizando la ecuación 10 de la pág. 31, con estos resultados se

observa que para las todas las muestras Fcalc es menor que Ftab, lo que nos indica

que NO existe diferencia significativa entre el valor real y el valor calculado; es

decir, existe reproducibilidad y repetibilidad en los datos, cumpliendo así con el

criterio de validación establecido y aceptando la hipótesis nula.

Límites de repetibilidad y reproducibilidad

Tabla 46 - Límites de repetibilidad y reproducibilidad

Material

de

referencia

certificado

Desviación Estándar Límites

Repet. Reprod. Varianza Repet. Reprod.

Sr SR S2

I r R

1 0,04761 0,04074 0,00061 0,13197 0,11293

2 0,02781 0,02418 0,00019 0,07708 0,06701

3 0,19278 0,19212 0,00025 0,53435 0,53254

4 0,02443 0,02319 0,00006 0,06771 0,06428

5 0,03573 0,04274 0,00055 0,09904 0,11847

6 0,03152 0,02629 0,00030 0,08736 0,07287

7 0,02576 0,02285 0,00014 0,07139 0,06334

8 0,03033 0,04085 0,00075 0,08407 0,11324

9 0,03162 0,04300 0,00085 0,08765 0,11919

10 0,03017 0,03113 0,00006 0,08362 0,08628

11 0,02129 0,02124 0,00000 0,05902 0,05887

62

En la tabla 46 se obtuvo para todos los casos la desviación estándar de

repetibilidad y reproducibilidad Sr y SR respectivamente; además de los límites;

valores que nos sirven para calcular el coeficiente de variación para cada material

de referencia certificado.

Coeficiente de Variación

Tabla 47 – Coeficientes de Variación

Material de

Referencia

Certificado

F Calculada P-value

(%Probabilidad)

Coeficiente de

variación (%)

1 2,13 0,1971 0,8237 2,47%

2 2,45 0,2672 0,7699 1,25%

3 2,64 0,9796 0,4036 7,85%

4 3,08 0,7039 0,5140 0,85%

5 3,38 2,2924 0,1435 1,13%

6 3,62 0,0872 0,9170 0,92%

7 3,69 0,3618 0,7038 0,73%

8 3,96 3,4420 0,0658 0,80%

9 4,46 3,5467 0,0616 0,74%

10 4,85 1,1941 0,3365 0,64%

11 5,14 0,9853 0,4016 0,43%

En la tabla 47 se muestra el porcentaje del coeficiente de variación obtenido para

cada material de referencia certificado está dentro de lo establecido ya que en la

mayoría de los casos es inferior a lo señalado en los objetivos del Plan de

validación de AGROCALIDAD (anexo 7); adicionalmente los valores de P-

value (probabilidad de ocurrencia) son relativamente altos, por tal razón se

acepta la hipótesis nula y se rechaza la hipótesis alterna ya que no existen

diferencias significativas.

63

4.1.2 Linealidad

Tabla 48 – Linealidad % Grasa

Valores reportados en la ficha

técnica del MRC, usando el

método Gerber

Valores del MRC reportados

por el laboratorio de

AGROCALIDAD, usando el

método espectroscópico IR

2,13 1,93

2,45 2,23

2,64 2,45

3,08 2,87

3,38 3,16

3,62 3,42

3,69 3,49

3,96 3,80

4,46 4,27

4,85 4,70

5,14 4,94

𝐻0: 𝜌 = 0 (𝑁𝑜 𝑒𝑥𝑖𝑠𝑡𝑒 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑙𝑖𝑛𝑒𝑎𝑙)

𝐻𝑎: 𝜌 ≠ 0 (𝐸𝑥𝑖𝑠𝑡𝑒 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑙𝑖𝑛𝑒𝑎𝑙)

Figura 20– Curva de linealidad

y = 1,0115x - 0,2357R² = 0,9996

0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 4 5 6% G

rasa

(V

alo

r re

po

rtad

o p

or

el la

bo

rato

rio

de

co

ntr

ol d

e le

che,

usa

nd

o e

l mét

od

o e

spec

tro

scó

pic

o

IR)

% Grasa (Valor reportado en la ficha técnica del MRC)

Curva de Linealidad

64

Tabla 49 - Parámetros de linealidad

Pendiente b 1.0115

Desviación estándar de la

pendiente Sb 0.0065

Ordenada al origen a -0.2357


ordenada Sa 0.0325


correlación Sx/y 0.0200

Coeficiente de determinación R2 0.9996

Coeficiente de correlación r 0.9998

𝑡𝑛−2 =𝑟

√1 − 𝑟2

𝑛 − 2

𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎 = 149,98

𝑡𝑡𝑎𝑏𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎 95% = 2,26

Límite de confianza de la pendiente

b ± t(n−2)Sb = 1,0115 ± (2,26 × 0,0065)

LC= 1,0115 ± 0,0147

LC superior = 1,0262

LC inferior = 0,9968

Límite de confianza de la ordenada al origen

a ± t(n−2)Sa = −0,2357 ± (2,26 × 0,0325)

LC= −0,2357 ± 0,0735

LC superior = -0,1622

LC inferior = -0,3092

65

En la figura 20 se puede observar una correlación positiva muy fuerte

(Hernández, Fernández, & Baptista, 2010) entre los valores reportados en la ficha

técnica del MRC y los valores obtenidos por el método espectroscópico IR, en la

53 se presentan los cálculos relacionados a la gráfica: pendiente, ordenada al

origen, desviaciones estándar de la ordenada, pendiente y correlación, también

el coeficiente de determinación y de correlación.

Para determinar el grado de correlación de la curva se utilizó el coeficiente de

correlación r, que para este caso es de 0.9998, aplicando el estadístico t se

rechazó la hipótesis nula y se determinó que el coeficiente de correlación es

significativo ya que el valor de t calculado es mayor al valor tabulado.

Este alto grado de correlación indica que los resultados obtenidos en el

laboratorio no son significativamente diferentes de los resultados reportados del

material de referencia certificado, cumpliendo así con el criterio de validación

establecido.

4.1.3 ETAPA 2 - Comparación de métodos:

4.1.3.1 Exactitud entre métodos:

Para realizar la comparación entre los tres métodos se plantearon las siguientes

hipótesis:

𝐻𝐼𝑛𝑣𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑎𝑐𝑖ó𝑛 : 𝑁𝑜 𝑒𝑥𝑖𝑠𝑡𝑒 𝑑𝑖𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑠𝑖𝑔𝑛𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑜𝑠 𝑟𝑒𝑠𝑢𝑙𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑛á𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 𝑒𝑛𝑡𝑟𝑒

𝑙𝑜𝑠 𝑚é𝑡𝑜𝑑𝑜𝑠 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑙𝑎 𝑑𝑒𝑡𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒 𝑐𝑟𝑢𝑑𝑎.

𝐻𝑁𝑢𝑙𝑎 : 𝐸𝑥𝑖𝑠𝑡𝑒𝑛 𝑑𝑖𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑠 𝑠𝑖𝑔𝑛𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑙𝑜𝑠 𝑟𝑒𝑠𝑢𝑙𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑛á𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 𝑒𝑛𝑡𝑟𝑒

𝑙𝑜𝑠 𝑚é𝑡𝑜𝑑𝑜𝑠 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑙𝑎 𝑑𝑒𝑡𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒 𝑐𝑟𝑢𝑑𝑎.

66

4.1.3.1.1 Comparación del método infrarrojo medio con el método Gerber Prueba t

Tabla 50 - Prueba t (Método infrarrojo – Método Gerber)

Lote


Diferencia Método

infrarrojo medio

Método Gerber

(tradicional)

1 3,59 3,55 0,04

2 3,56 3,55 0,01

3 3,57 3,50 0,07

4 3,47 3,50 -0,03

5 3,47 3,50 -0,03

6 3,59 3,65 -0,06

7 3,66 3,70 -0,04

8 3,41 3,50 -0,09

9 3,61 3,65 -0,04

10 4,59 4,55 0,04

11 3,78 3,80 -0,02

�̅� 3,66 3,68 -0,01

𝒔 0,32315 0,30607 0,04822

Sesgo 0,01

Tabla 51 - Prueba t para medias de dos muestras emparejadas

% Grasa IR % Grasa Gerber

Media 3,66364 3,67727

Varianza 0,10443 0,09368

Observaciones 11 11

Coeficiente de correlación de Pearson 0,98972

Diferencia hipotética de las medias 0

Grados de libertad 10

Estadístico t -0,93787 Ns

P (T<=t) una cola 0,18521

Valor crítico de t (una cola) 1,81246

P (T<=t) dos colas 0,37041

Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,22814

En la tabla 50 se realiza la comparación entre el método validado (IR medio) y

un tradicional (Ultrasonido); con estos resultados se procedió a calcular el

67

estadístico t de datos emparejados (tabla 51) el mismo que indica que no hay

diferencia significativa entre los dos métodos, siendo el valor de t = -0,937 y al

compararlo con el valor crítico de la tabla de distribución t se observa que a una

probabilidad del 0,05 le corresponde 2,228 de t.

Como los valores obtenidos son menores que los del valor t se acepta la hipótesis

de investigación y se rechaza la hipótesis nula.

4.1.3.1.2 Comparación del método infrarrojo medio con el método de ultrasonido

Prueba t

Tabla 52 - Prueba t (Método infrarrojo – Método ultrasonido)

Lote


Diferencia Método

infrarrojo medio

Método

ultrasonido

1 3,59 3,57 0,02

2 3,56 3,55 0,01

3 3,57 3,49 0,08

4 3,47 3,50 -0,03

5 3,47 3,44 0,03

6 3,59 3,64 -0,05

7 3,66 3,67 -0,01

8 3,41 3,41 0,00

9 3,61 3,60 0,01

10 4,59 4,54 0,05

11 3,78 3,74 0,04

�̅� 3,66 3,65 0,01

𝒔 0,32315 0,31135 0,03668

Sesgo -0,01

68

Tabla 53 - Prueba t para medias de dos muestras emparejadas

% Grasa IR % Grasa Ultrasonido

Media 3,66364 3,65

Varianza 0,10443 0,09694

Observaciones 11 11

Coeficiente de correlación de Pearson 0,99401

Diferencia hipotética de las medias 0

Grados de libertad 10

Estadístico t 1,23299 ns

P(T<=t) una cola 0,12289

Valor crítico de t (una cola) 1,81246

P(T<=t) dos colas 0,24578

Valor crítico de t (dos colas) 0,05 2,22814

En la tabla 52 se realiza la comparación entre el método validado (IR medio) y

el método por ultrasonido; con estos resultados se procedió a calcular el

estadístico t de datos emparejados (tabla 53) el mismo que indica que no hay

diferencias significativas entre los dos métodos, siendo el valor de t = 1,233 y al

compararlo con el valor crítico de la tabla de distribución t se observa que a una

probabilidad del 0,05 le corresponde 2,228 de t.

Como los valores obtenidos son menores que los del valor t se acepta la hipótesis

de investigación y se rechaza la hipótesis nula.

4.1.3.2 Precisión entre métodos:

4.1.3.2.1 Comparación del método infrarrojo medio con el método Gerber Prueba F

Tabla 54 - Prueba F (Método infrarrojo – Método Gerber)

Lote


Método infrarrojo

medio

Método Gerber

(tradicional)

1 3,59 3,55

2 3,56 3,55

3 3,57 3,50

4 3,47 3,50

69

Tabla 55 – Continuación Prueba F (Método infrarrojo – Método Gerber)

Lote


Método infrarrojo

medio

Método Gerber

(tradicional)

5 3,47 3,50

6 3,59 3,65

7 3,66 3,70

8 3,41 3,50

9 3,61 3,65

10 4,59 4,55

11 3,78 3,80

�̅� 3,66 3,68

𝒔 0,32315 0,30607

Tabla 56 - Prueba F para varianzas de dos muestras

%Grasa IR % Grasa Gerber

Media 3,66 3,68

Varianza 0,10443 0,09368

Observaciones 11 11

Grados de libertad 10 10

F 1,11468 ns

P(F<=f) una cola 0,43353 Valor crítico para F (una cola) 2,97824

Al comparar los métodos IR medio y Gerber se determina que el valor de F

calculada (1,115) es menor que el valor registrado en la tabla F de Fisher (2,978),

entonces la probabilidad p es mayor que 0,05, se dice que las varianzas son

iguales (estadísticamente), homogéneas. Por lo que se acepta la hipótesis de

investigación, con esto se confirma que las diferencias entre las medias se deben

a errores aleatorios; resultados que se puede evidenciar en las tablas 54, 55 y 56.

70

4.1.3.2.2 Comparación del método infrarrojo medio con el método de ultrasonido

Prueba F

Tabla 57 - Prueba F (Método infrarrojo – Método ultrasonido)

Lote


Método infrarrojo

medio

Método

ultrasonido

1 3,59 3,57

2 3,56 3,55

3 3,57 3,49

4 3,47 3,50

5 3,47 3,44

6 3,59 3,64

7 3,66 3,67

8 3,41 3,41

9 3,61 3,60

10 4,59 4,54

11 3,78 3,74

�̅� 3,66 3,65

𝒔 0,32315 0,31135

Tabla 58 - Prueba F para varianzas de dos muestras

%Grasa IR

% Grasa Ultrasonido

Media 3,66 3,65

Varianza 0,10443 0,09694

Observaciones 11 11

Grados de libertad 10 10

F 1,07722 ns

P(F<=f) una cola 0,45434

Valor crítico para F (una cola)

2,97824

Al comparar los métodos IR medio y ultrasonido como se observa en las tablas

57 y 58, se determina que el valor de F calculada (1,077) es menor que el valor

registrado en la tabla F de Fisher (2,978), entonces la probabilidad p es mayor

71

que 0,05, se dice que las varianzas son iguales (estadísticamente), homogéneas.

Por lo que se acepta la hipótesis de investigación, con esto se confirma que las

diferencias entre las medias se deben a errores aleatorios.

4.1.4 Correlación entre métodos

Con los datos obtenidos por los tres métodos estudiados (infrarrojo, Gerber y

ultrasonido) se determinó el grado de correlación.

Tabla 59 - Correlación entre métodos

Lote


Método

infrarrojo

Método

ultrasonido

Método

Gerber

1 3,59 3,57 3,55

2 3,56 3,55 3,55

3 3,57 3,49 3,50

4 3,47 3,50 3,50

5 3,47 3,44 3,50

6 3,59 3,64 3,65

7 3,66 3,67 3,70

8 3,41 3,41 3,50

9 3,61 3,60 3,65

10 4,59 4,54 4,55

11 3,78 3,74 3,80

En la tabla 59 se muestran los porcentajes de grasa en leche cruda obtenidos por

cada método, los mismos que se utilizaron para realizar los gráficos de

correlación entre cada método.

72

4.1.4.1 Correlación entre infrarrojo y ultrasonido

Figura 21 - Correlación IR - ultrasonido

Tabla 60 - Análisis de la correlación entre IR y ultrasonido

Pendiente b 0,95772

Ordenada al origen a 0,14127

Coeficiente de determinación R2 0,98805

Coeficiente de Correlación r 0,99401

Desviación estándar de la pendiente Sb 0,03554

Desviación estándar de la ordenada Sa 0,15244

Desviación estándar de la correlación Sx/y 0,03588

El coeficiente de correlación es una medida de asociación entre dos variables, en

este caso métodos para la determinación de grasa en leche; el valor del

coeficiente de correlación varía en el intervalo de -1 a 1. En la figura 21 se obtuvo

una recta inclinada hacia la derecha, positiva, con una pendiente de 0,958 y un

coeficiente de correlación de 0,994; el mismo que indica que existe una relación

lineal entre los dos métodos en cuestión.

y = 0,9577x + 0,1413R² = 0,988

3,00

3,20

3,40

3,60

3,80

4,00

4,20

4,40

4,60

4,80

3,20 3,40 3,60 3,80 4,00 4,20 4,40 4,60 4,80

% G

rasa

(ULT

RA

SON

IDO

)

% Grasa (INFRARROJO)

Correlación IR - ultrasonido

73

En la tabla 60 se presentan los cálculos relacionados a la gráfica: pendiente,

ordenada al origen, desviaciones estándar de la ordenada, pendiente y

correlación, también el coeficiente de determinación y de correlación.

4.1.4.2 Correlación entre infrarrojo y Gerber

Figura 22 - Correlación IR - Gerber

Tabla 61 - Análisis de la correlación entre IR y Gerber

Pendiente b 0,93742

Ordenada al origen a 0,24289

Coeficiente de determinación R2 0,97954

Coeficiente de Correlación r 0,98972

Desviación estándar de la pendiente Sb 0,04571

Desviación estándar de la ordenada Sa 0,19605

Desviación estándar de la correlación Sx/y 0,04615

El coeficiente de correlación es una medida de asociación entre dos variables, en

este caso métodos para la determinación de grasa en leche; el valor del

y = 0,9374x + 0,2429R² = 0,9795

3,00

3,20

3,40

3,60

3,80

4,00

4,20

4,40

4,60

4,80

3,20 3,40 3,60 3,80 4,00 4,20 4,40 4,60 4,80

% G

rasa

(GER

BER

)

% Grasa (INFRARROJO)

Correlación IR - Gerber

74

coeficiente de correlación varía en el intervalo de -1 a 1. En la figura 22 se obtuvo

una recta inclinada hacia la derecha, positiva, con una pendiente de 0,937 y un

coeficiente de correlación de 0,989; el mismo que indica que existe una relación

lineal entre los dos métodos (IR y Gerber).

En la tabla 61 se presentan los cálculos relacionados a la gráfica: pendiente,

ordenada al origen, desviaciones estándar de la ordenada, pendiente y

correlación, también el coeficiente de determinación y de correlación.

75

CAPÍTULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

4.1 CONCLUSIONES

4.1.1 Conclusiones de la validación

- Mediante la validación se logró confirmar que el método para determinar grasa

en leche cruda por el método de absorción en el infrarrojo tiene capacidades de

desempeño consistentes.

- Para determinar la repetibilidad se trabajó con un analista el cual realizó cinco

réplicas en las mismas condiciones de ensayo, es decir, utilizando el mismo

equipo, material (MRC) y en el mismo laboratorio; para medir la

reproducibilidad se realizó el mismo ensayo de repetibilidad variando el analista

en diferentes espacios de tiempo, trabando así bajo condiciones de

reproducibilidad; por lo que se puede que existe repetibilidad y reproducibilidad

en el método de espectroscopía de absorción en el infrarrojo para determinación

de grasa en leche cruda en un rango de trabajo de 2,13 a 5,14% de grasa, no

existiendo diferencias significativas en los resultados y obteniendo un

coeficiente de correlación aceptable.

- Los porcentajes de recuperación obtenidos en la experimentación varían entre

90 a 100%, estos valores están dentro de los parámetros establecidos por el

Laboratorio de Control de Calidad de Leche en AGROCALIDAD; concluyendo

así que en las condiciones operativas el método es exacto.

- La determinación de grasa en leche cruda por el método Infrarrojo medio cumple

con los parámetros de validación: exactitud y precisión establecidas dentro del

76

plan de validación del Laboratorio de Control de Calidad de Leche en

AGROCALIDAD.

4.1.2 Conclusiones de la comparación de métodos para la determinación de grasa en

leche cruda

- En las condiciones de trabajo del laboratorio no existen diferencias significativas

entre los resultados obtenidos por los métodos para la determinación de grasa en

leche cruda (infrarrojo – Gerber e infrarrojo – ultrasonido), esto se logró

comprobar mediante la aplicación de diferentes estadísticos (t de Student y F de

Fisher); concluyendo de esta manera que los métodos para la determinación de

grasa en leche cruda son exactos y precisos.

- Las pruebas de correlación muestran baja dispersión entre los métodos de

espectroscopia por infrarrojo – Gerber o espectroscopia por infrarrojo –

ultrasonido; esto se logró evidenciar con el alto coeficiente de correlación

obtenido.

- Al no existir diferencias significativas entre los métodos en estudio se logra

concluir que los resultados obtenidos en los análisis que realiza el laboratorio

son técnicamente competentes y no afecta el tipo de método que se utilice.

- De acuerdo a los resultados obtenidos se logra concluir que el método para la

determinación de grasa en leche cruda por espectroscopia infrarroja es apto para

el propósito que a la empresa le interesa, pues al compararlo con los otros dos

métodos (ultrasonido y Gerber) se logró evidenciar que es uno de los métodos

más rápidos en obtener resultados.

- Considerando el tiempo y el número de muestras, el uso del equipo MilkoScanTM

FT+ por el método infrarrojo es beneficioso, pues al compararlo con el método

77

tradicional (Gerber) el tiempo para ejecutar el análisis de una muestra lleva

alrededor de 30 minutos, mientras que al realizar el mismo análisis con el equipo

se obtienen resultados inmediatos.

4.2 RECOMENDACIONES

El presente trabajo de investigación propone las siguientes recomendaciones en

función de los resultados obtenidos:

- Que para realizar la validación, los materiales de referencia estén certificados y

vigentes.

- Que antes de correr las muestras en el equipo de infrarrojo medio Milkoscan FT

estas estén homogéneas y a una temperatura adecuada (40°C ± 2).

- Que para obtener mejores resultados se deberá trabajar con un mayor número de

repeticiones para cada concentración del material de referencia.

- El método de espectroscopia infrarroja muestra un sesgo significativo al analizar

los materiales de referencia certificados, se podría mejorar la exactitud de este

minimizando las fuentes de error instrumental.

- El método de ultrasonido requiere calibración permanente del equipo Ekomilk

Ultra Pro, los ajustes deben realizarse diariamente previo a su uso, pueden

emplearse materiales de referencia certificados o muestras de leche con

concentraciones conocidas.

- Se recomienda seguir un cronograma de calibración para evitar introducir errores

sistemáticos en los análisis.

- Es recomendable realizar un análisis de costo entre los diferentes equipos ya que

de esta marera se podrá verificar los beneficios que le proporciona a la empresa

78

efectuar el análisis por uno u otro método. Además se podría evaluar todos los

ahorros obtenidos con el equipo tomando en cuenta el tiempo que toma analizar

una muestra en relación al costo del equipo y los reactivos utilizados.

79

BIBLIOGRAFÍA

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81

ANEXOS

Anexo 1 - Tabla t Student

Fuente: (Anzaldua, 1996)

82

Anexo 2 - Valores F (Distribución F Fisher)

Fuente: (Anzaldua, 1996)

83

Anexo 3 - Instructivo para la toma de muestras de leche cruda

Objeto

El presente documento tiene por objeto establecer el procedimiento de muestreo para leche

cruda de vaca, en los diversos lugares, tales como: predios o grajas, centros de acopio,

vehículos de transporte, sitios de recolección para las plantas procesadoras e industria con el

fin de garantizar que las condiciones de la toma de muestra y transporte hasta el laboratorio,

no alteren la calidad de la misma y no afecte los resultados.

Alcance

Este procedimiento es aplicable al muestreo de la leche obtenida directamente en el ordeño

de las vacas, contenida en tarros o bidones, tanques de enfriamiento, tanqueros, centros de

acopio, silos de la industria láctea y laboratorios que realicen el análisis de leche cruda.

Este procedimiento hace referencia a la toma de muestras y contramuestras representativas

de leche cruda, para determinar su calidad físico-química, microbiológica y organoléptica.

Referencias

Los documentos utilizados como referencia para elaboración del presente procedimiento

son:

• PGC/LA/01, Procedimiento Gestión de documentos.

• Norma Técnica Ecuatoriana INEN 4 1R. Leche y productos lácteos. Muestreo

• Norma Chilena NCh1011/1-2007. Leche cruda de vaca- Muestreo

• Manual de procedimiento para el control de leche cruda (2013)

• Documentos a utilizar conjuntamente con el presente procedimiento:

• Se utilizan documentos en su versión vigente, para la ejecución del presente

procedimiento:

• INT/CL/010-FO01 Registro de datos para la toma de muestras de leche y análisis

de campo.

• Formato PGC/LA/03-FO04 Orden de trabajo Laboratorio de Calidad de Leche.

General

Es responsabilidad del cliente el muestreo y la toma adecuada de la muestra y su transporte

al Laboratorio.

84

El Procedimiento de toma de muestra de leche cruda, debe estar disponible para los clientes

internos o externos que así lo necesitan o requieran.

Para evitar conflictos de interés, quien ejecuta el ensayo no debe efectuar muestreo de leche

cruda.

Definiciones

Leche cruda de vaca

Producto de la secreción normal de las glándulas mamarias, obtenida a partir del ordeño

integro e higiénico de vacas sanas, sin adición ni sustracción alguna, exento de calostro y

libre de materias extrañas a su naturaleza, destinada al consumo humano en su forma natural

o a la elaboración de subproductos. Esta denominación se aplica para la leche que no ha

sufrido tratamiento térmico, salvo el de enfriamiento para su conservación, ni ha tenido

modificación alguna en su composición natural.

Muestra

Porción de material o cantidad representativa extraída al azar de un lote.

Lote

Cualquier cantidad de material de características similares, provenientes de una fuente

común.

Muestreador (es) o Encargado(s) del muestreo

Persona(s) habilitada(s) para realizar el muestreo en lugares tales como predios, centros de

acopio y sitios recolectores de las plantas procesadoras de leche, cuidando que las

condiciones de la toma de muestra y trasporte hasta el laboratorio no alteren la calidad de la

muestra.

Muestreo

Procedimiento mediante el cual se recolectarán las muestras representativas para el análisis

de leche cruda.

Regla

85

Instrumento manual de medición de volumen, el cual deberá adaptarse y calibrarse al

volumen y tipo de recipiente a medir, permitiendo la medida entre el 10% y el 100% del

volumen nominal de la tina o tanque de refrigeración y el 100% del volumen nominal del

tarro. El volumen comprendido entre dos marcas sucesivas de la regla será menor o igual al

0,5% del volumen nominal del recipiente. Las marcas deben ser claras y el error de medición

aceptable deberá ser inferior o igual al 0,5% del volumen medido. Este instrumento debe ser

usado junto con una tabla de conversión de centímetros a litros provista por el fabricante del

tarro y/o del tanque.

Contramuestra

Cantidad representativa de la muestra extraída que quedará en poder de una tercera parte que

deberá ser neutral, con la finalidad de que se puedan contrastar y definir en caso de

controversia los resultados de los análisis de las muestras obtenidas por las dos partes

involucradas en el operativo: la planta procesadora, transportista, productor, etc., y la entidad

de control.

Preservante

Cualquier sustancia añadida a un alimento o muestra de alimento con el propósito de

prevenir o retardar su deterioro.

Azidiol (azida de sodio)

Inhibidor del desarrollo bacteriano en las muestras de leche cruda.

Bronopol (2-bromo-2-nitropropano-1,3 diol)

Preservante en muestras de leche cruda.

Cuartos

Cada una de las cuatro glándulas mamarias que componen la ubre de la vaca.

Mastitis

Enfermedad definida como inflamación de la glándula mamaria por una infección causada

por la penetración y multiplicación de bacterias dentro de ésta glándula.

Células somáticas

86

Leucocitos y células descamativas de los epitelios secretores y conductos de la glándula

mamaria presentes en la leche, por la inflamación que presenta dicha glándula como

consecuencia de agresión de patógenos y/u otros factores traumáticos.

Brucelosis

Conjunto de enfermedades ocasionadas, tanto en el hombre como en los animales, por

microorganismos del género Brucella spp, que son un grupo de pequeños cocos y

cocobacilos gramnegativos aeróbicos, inmóviles y de crecimiento lento. Se reconocen

actualmente nueve especies distintas de Brucella, siete de ellas afectan a animales terrestres

(B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, B. canis, B. neotomae y B. microti) y dos a

mamíferos marinos (B. ceti y B. pinnipedialis).

Acidez

Constituye, una medida de la concentración de proteínas y de fosfatos presentes en leches

de buena calidad higiénica-sanitaria, además la acidez es desarrollada debida al ácido láctico

y a otros ácidos procedentes de la degradación microbiana de la lactosa, y eventualmente de

los lípidos, en leches en vías de alteración.

Abreviaturas

SGC: Sistema de Gestión de Calidad y Competencia Técnica, basado en los requisitos de la

norma NTE INEN ISO/IEC 17025.

DL: Director de Laboratorios

RC: Responsable de Calidad

RT: Responsable Técnico

A(s): Analista(s)

NA: No aplica

CCS: Células somáticas

CBT: Contaje total de Bacterias

AFQ: Físico químicos

BCL: Brucelosis

Responsabilidades

Las principales responsabilidades y autoridad en la ejecución de las actividades del presente

procedimiento se describen en la siguiente matriz.

87

Cargo Responsabilidad Autoridad

RT

Entregar el procedimiento de toma de

muestras de leche cruda a los clientes

internos o externos que lo requieran.

Informar a quienes toman la muestra

la importancia de cumplir con un

adecuado muestreo.

Autorizar al personal del

laboratorio a que realice

muestreos, si así se lo requiere.

A Apoyar en el criterio técnico para

ejecutar el muestreo.

Instrucciones de Seguridad

Antes de iniciar el proceso de toma de muestras, el encargado se debe lavar las manos y los

brazos con suficiente agua y jabón durante 1 min, a fin de retirar materias extrañas adheridas

y reducir la carga microbiana. Concluido el lavado, se debe secar con una toalla de papel

desechable nueva (sin uso anterior).

Es muy importante la utilización de ropa especial como: mandil, guantes, mascarilla y cofia

para evitar la contaminación de las muestras.

Evite el contacto de los preservantes con los ojos y la piel, así como también la inhalación o

ingesta de los mismos.

En caso de que algunos de los preservantes entre en contacto con los ojos, mantener los ojos

bien abiertos y enjuagar con abundante agua durante 15-20 min, remover los lentes de

contactos (si los tuviera) en los primeros 5 min y continuar el enjuague con agua, luego

acudir a un médico.

Si hay contacto con la piel, retirar la ropa y lavar con abundante agua la zona afectada durante

15-20 min y acudir a un médico. Si los preservantes (azidiol ó bronopol) son inhalados,

trasladar la persona a un lugar ventilado y llamar inmediatamente a un médico.

En caso de ingestión del bronopol, consultar un médico de manera inmediata, no provocar

el vómito al menos que el médico lo indique, y dar de beber un vaso de agua si la persona

está consciente y puede tragar. Si se produce la ingesta de azidiol provocar inmediatamente

el vómito y consultar a un médico.

Descripción

El análisis de la calidad de la leche cruda es una práctica cotidiana y muy utilizada en el

sector lácteo. Este se realiza con diferentes objetivos: comerciales (pago al productor según

la calidad remitida), control de la materia prima que ingresa a la planta procesadora,

88

direccionamiento de leche de diferente calidad para la elaboración de productos, control

sanitario, etc.

La obtención de resultados válidos surge de una secuencia de pasos que se inicia con la toma

de la muestra de leche y finaliza con la comunicación de los resultados en tiempo y forma al

usuario final.

Consecuentemente, el muestreo de la leche cruda constituye la primera etapa que condiciona

el logro de buenos resultados. En este sentido, los dos requisitos básicos que debe cumplir

una muestra son:

Ser representativa del volumen total de leche de donde se extrajo.

Ser conservada y manejada convenientemente de manera que mantenga, hasta su

procesamiento en el laboratorio o campo, todas las características originales.

El operario encargado de aplicar los procedimientos de muestreo, constituye un eslabón muy

importante en el proceso global de calificación de la leche. Cualquier error en alguno de

estos procesos redundará en resultados no válidos, por lo que es necesario contar con

personal capacitado, para evaluar en campo, las características que presenta la leche cruda

obtenida de la ordeña a nivel de predio, tomar decisiones de aceptación y extraer las muestras

sobre las cuales se determina el nivel de calidad del producto.

El alto riesgo de deterioro microbiológico de la leche cruda requiere, adicionalmente,

adoptar estrictas medidas de aseo de los equipos, implementos y envases para las muestras

y contramuestras, y de higiene en las operaciones de extracción y manejo posteriores de

éstas.

Equipos, materiales y reactivos

Equipos

Cooler o refrigerador portátil

Materiales

• Gradillas para frascos recolectores

• Geles refrigerantes (en caso de usar cooler)

• Envases recolectores estériles de 50 ml (frascos de plástico, polietileno y

polipropileno), contando como mínimo con 2 de repuestos por cada muestreo

• Termómetro de 0 a 50 °C

89

• Agitador manual de acero inoxidable esterilizado, de tamaño acorde al recipiente a

muestrear

• Cucharón o bastón para la toma de muestra de acero inoxidable esterilizado, de

tamaño acorde al recipiente a muestrear

• Regla y tabla de conversión del recipiente a ser muestreado.

• Papel absorbente desechable

• Marcador de tinta indeleble

• Linterna

• Jarra graduada de 1 L de capacidad

• Registro de datos para la toma de muestras de leche y análisis de campo (Formato:

PGC/LA/03-FO04)

Reactivos

Alcohol antiséptico (alcohol etílico al 70%)

Solución de hipoclorito de sodio al 4% (en caso de muestrear leche en cuartos)

Pastillas del conservante azidiol

Pastillas de conservante bronopol

Agua

Preparación

Previo a la realización del muestreo, se deberá verificar la disponibilidad de todos los

equipos, materiales y reactivos indicados.

Todos los equipos e implementos a ser empleados en la toma de muestras y que tengan

contacto con la leche cruda, deberán ser previamente esterilizados, usando para ello alguno

de los siguientes métodos:

Esterilización por medio de calor seco en estufa a una temperatura de 175°C, durante un

mínimo de 30 minutos.

Esterilización por medio de calor húmedo en autoclave a 121°C y 15lbs de presión por 15

minutos.

El material esterilizado se almacenará sin retirar el empaque colocado para su esterilización

(papel, etc.), y se transportará en recipientes adecuados que garanticen su asepsia hasta su

uso. No se guardarán materiales esterilizados por más de 2 semanas a pesar de que estén

90

protegidos adecuadamente, cumplido este tiempo se deberá esterilizar nuevamente antes de

su uso.

Como métodos alternativos, cuando no es posible emplear alguno de los métodos de

esterilización antes descritos, se pueden utilizar los siguientes:

Sumergiendo el material en una solución de etanol al 70% (v/v)

Flameando a llama directa de las superficies que tendrán contacto con la leche cruda.

Ignición con etanol de 96% (v/v) de las superficies que tendrán contacto con la leche cruda

Inmersión de los materiales en una solución de hipoclorito de sodio o de calcio, de una

concentración mínima de 100 ppm de cloro activo.

Sumergiendo los materiales en una solución desinfectante de amonio cuaternario.

El material utilizado para el muestreo deberá lavarse y secarse antes y después de la toma de

la muestra y luego se lo colocará en su lugar de almacenamiento correspondiente.

Realización

Consideraciones generales para el muestreo

Cuando se toma la muestra evitar las corrientes de aire, no fumar ni hablar mientras esté

abierto el frasco para la toma de la muestra.

No tomar muestras de la parte superior o superficial del recipiente que contiene la leche.

No tomar muestras de la manguera de descarga del camión ni del grifo del tanque.

La muestra deberá ser colocada en envases esterilizados o desinfectados e inertes a la acción

de la leche cruda y de los productos químicos que se agreguen en su interior para conservarla,

además de estar provistos con tapas adecuadas para un sellado hermético. Se recomiendan

frascos o tubos de plástico, polietileno, polipropileno o de otro material inocuo y/o

esterilizado para el almacenamiento y transporte de las muestras de leche cruda.

Se recomienda utilizar envases que puedan ser diferenciables a simple vista según el análisis

previsto o el destino de la muestra contenida, por ejemplo, envases provistos de una tapa de

un color determinado u otro sistema de fácil apreciación, y que puedan ser etiquetados,

rotulados o marcados con la identificación de la muestra.

Los envases para recolectar muestras deben tener una capacidad mínima de 50 ml (frascos),

y deberán ser lavados y desinfectados totalmente previo a su uso, y esterilizados cuando

corresponda.

Los instrumentos que se utilizan para la toma de muestras deben estar limpios, estériles para

no alterar las características de la leche cruda o su composición, y todas las superficies deben

ser lisas, sin grietas y con bordes redondeados, resistentes a la manipulación y transporte.

91

Se deberá mantener las muestras refrigeradas hasta la llegada al laboratorio. No permitir en

ningún momento la congelación de las mismas. La temperatura de refrigeración se

especifica.

Deberá evitarse la contaminación y el deterioro de las muestras en todas las fases, ya que

podrían afectar los resultados analíticos.

Las muestras deberán ser selladas herméticamente e identificadas, y deberán ser entregadas

al Laboratorio de Control de Leche, junto a la orden de trabajo (Formato: PGC/LA/03-

FO04), adjuntando también el Registro de datos para la toma de muestras de leche y análisis

de campo (Formato: INT/CL/010-FO01) si el caso lo amerita.

Toma de muestras de leche de cuartos

Este procedimiento se aplica cuando se quiere analizar la leche de manera individual en cada

cuarto y en una vaca en particular, generalmente cuando se sospecha de la presencia de

mastitis en un hato.

Instrucciones para la toma de muestra

Rotular los frascos o tubos previos al muestreo.

Lavar con agua y jabón la ubre por 2 min para retirar la suciedad, y secar completamente

con una toalla de papel.

Descartar los primeros chorros de leche del pezón y observar si la leche o la glándula

presentan signos clínicos de mastitis. Anotar las observaciones en el "Registro de datos para

la toma de muestras y análisis de campo" (INT/CL/010-FO01).

Sumergir los cuartos en una solución germicida, como hipoclorito de sodio al 4%, por un

tiempo de 30 segundos.

Secar los pezones completamente con toalla de papel.

Se debe evitar que los pezones ya limpios tomen contacto con suciedad de la cola o las patas

del animal.

Tomar las muestras de leche de los cuartos individuales y conservarlas en frascos por

separado correctamente identificados.

Para tomar la muestra, sacar la tapa del tubo de recolección sin tocar su parte interna y sin

dejarla sobre el piso, y sostener el tubo en un ángulo de 45° durante la toma de la muestra.

Evitar que la boca del tubo toque la punta del pezón.

Descartar el primer chorro y recolectar 1 a 3 chorros de leche (aproximadamente 40 ml), e

inmediatamente colocar la tapa asegurando un cierre hermético.

92

Para tomar una muestra compuesta (de los 4 cuartos en un solo tubo), comenzar la toma de

muestra por el pezón más cercano y continuar con los pezones más alejados de la ubre,

tomándose aproximadamente 10 ml de cada cuarto de la ubre. Es necesario indicar, que éste

tipo de muestreo aumenta el riesgo de contaminación porque los tubos permanecen abiertos

por mayor período de tiempo.

Colocar los tubos con las muestras recolectadas dentro del cooler o refrigerador, y llevarlas

inmediatamente al laboratorio para su análisis.

NOTA: Las muestras tomadas serán recolectadas y conservadas de acuerdo al análisis que

se vaya a realizar en la misma, siguiendo el procedimiento indicado. Por lo general, la leche

tomada en cuartos está destinada para el CCS.

Toma de muestras de leche contenida en tarros, bidones o tanques

Para este caso, la agitación, la medición de volumen, la medición de la temperatura y el

muestreo se lo realiza de forma manual.

Medición del volumen de la leche contenida en los envases

En caso de requerir medir el volumen exacto de la leche en un contenedor, solicitar al

propietario del contenedor la regla y medir el volumen como sigue:

Colocar los envases que contienen la leche a muestrear en una superficie plana, nivelada y

firme. No agitar, la leche deberá estar en total reposo.

Eliminar la espuma con la punta de la regla.

Introducir la regla verticalmente en el tacho.

Retirar la regla y leer el nivel a la altura del ojo. Considerar el nivel superior si el registro

estuviese entre dos marcas.

Secar la regla con papel absorbente descartable.

Anotar el volumen en el "Registro de datos para la toma de muestras de leche y análisis de

campo" (INT/CL/010-FO01).

Repetir los pasos anteriores en cada tarro que contenga leche.

Agitación

Introducir el agitador manual hasta el fondo del tarro.

Levantar el agitador de manera tal que se origine un movimiento de la leche desde el fondo

hacia la superficie.

Repetir la operación al menos 6 veces por tacho o no menos de 30 segundos.

93

Medición de la Temperatura de la leche contenida en los envases

Usar un termómetro con rango de 0 a 50°C. Colocar el bulbo del termómetro como mínimo

5 cm por debajo del nivel de leche.

Esperar como mínimo 2 minutos.

Leer la temperatura.

Registrar la lectura de la temperatura en el "Registro de datos para la toma de muestras de

leche y análisis de campo" (INT/CL/010-FO01).

Instrucciones para la toma de muestra

Abrir el envase recolector de muestra y sostener la tapa con la misma mano.

Introducir el cucharón dos veces en la leche volcando el contenido dentro del mismo tarro.

Extraer la muestra introduciendo el cucharón como mínimo 15-20 cm por debajo del nivel

de leche.

Volcar el contenido del cucharón dentro del envase recolector de muestra y llenarlo evitando

derrames.

Cerrar herméticamente el envase de la muestra e identificarlo.




se vaya a realizar en la misma, siguiendo el procedimiento indicado en el punto 5.7.

Toma de muestras de leche contenida en tanques fríos

Medición del volumen de la leche en el tanque frío

En caso de requerir medir el volumen exacto de la leche contenida en el tanque frío, solicitar

al propietario del contenedor la regla y medir el volumen como sigue:

Retirar la regla del tanque de leche cruda, y limpiar los primeros 20 cm debajo el nivel

superior marcado por la leche con una toalla de papel absorbente desechable. Anotar en el

"Registro de datos para la toma de muestras de leche y análisis de campo" (INT/CL/010-

FO01), la medición en milímetros leída de la regla y su correspondiente equivalencia en

litros, de acuerdo a la tabla de relación entre la altura de la leche y su volumen en litros,

misma que es propia y específica del tanque frío muestreado.

Medición de la temperatura de la leche en el tanque frío

94

Generalmente los tanques fríos poseen dentro de su sistema de refrigeración un medidor de

temperatura interno, por lo tanto, se deberá tomar la lectura de temperatura que muestre la

pantalla del tanque, y anotarla en el "Registro de datos para la toma de muestras de leche y

análisis de campo" (INT/CL/010-FO01). Si la unidad de refrigeración está enfriando, la

persona que está realizando el muestreo debe esperar a que se detenga, y una vez alcanzada

la temperatura a la cual está regulado el tanque, se deberá registrar la temperatura mostrada

en la pantalla.

Agitación

La muestra debe ser tomada sobre la leche cruda homogénea, para lo cual se deberá agitar

el contenido del tanque por 5 min, como mínimo.

Instrucciones para la toma de muestras

El muestreo se debe realizar inmediatamente después de terminada la agitación del contenido

del tanque.


Tomar la muestra sumergiendo el cucharón de muestreo hasta aproximadamente la mitad de

la altura de leche contenida en el tanque.

Volcar el contenido del cucharón dentro del envase recolector de muestra y llenarlo evitando

derrames.






Toma de muestras de leche contenida en silos

Previo a la toma de muestra, anotar en el "Registro de datos para la toma de muestras de

leche y análisis de campo" (INT/CL/010-FO01) el volumen y la temperatura de la leche

contenida en el silo. Generalmente estos equipos están provistos de sistemas para medir estos

parámetros de la leche que se encuentra en su interior, por lo que se deberá solicitar éstos

datos al personal de producción. En caso de que el silo no tenga un medidor de volumen y

temperatura, anotar en el registro el volumen aproximado de leche, y medir la temperatura

en las muestras tomadas.

95

Encender el agitador del silo por lo menos 5 - 20 min previo al muestreo.

Desinfectar la llave del silo con alcohol antiséptico (alcohol al 70%), colocándolo con un

atomizador en cantidad abundante.

Abrir la llave del silo y dejar correr aproximadamente un litro de leche.


Introducir bajo la llave del silo el envase recolector de muestra y llenarlo evitando derrames.

(Si es necesario utilizar una jarra estéril para luego verter al envase apropiado)

Cerrar la llave del silo.






96

Anexo 4 – Norma Técnica Ecuatoriana 9:2012 Leche cruda requisitos

97

98

99

100

101

102

Anexo 5 – Norma AOAC para la determinación de grasa en leche cruda

103

104

105

Anexo 6 – Norma INEN 12. Leche. Determinación del contenido de Grasa

106

107

108

109

110

111

112

113

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Anexo 7 – Plan de Validación AGROCALIDAD

PLAN DE VALIDACIÓN Laboratorio de Control de Calidad de Leche

PGT/LA/03 - FO01

Revisión: 1

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MÉTODO: Espectroscopia Infrarroja – Grasa

1. OBJETIVO: Determinar el porcentaje de grasa en leche cruda, utilizando espectroscopia infrarroja que cumpla con los requisitos de desempeño del método de análisis.

2. NECESIDAD ANALITICA:

- Demostrar que los objetivos de validación seleccionados, permiten obtener resultados confiables para el cliente. - Ejecutar análisis de leche cruda, para evaluar la calidad de acuerdo a lo establecido en la NTE INEN 9: 2012.

- Garantizar que los resultados emitidos por el laboratorio pueden ser utilizados como valores referenciales para laboratorios de control nacional.

3. PUESTA A PUNTO: Se realizan corridas con reactivos de verificación y ceros.

4. METODO DE ENSAYO Y DE REFERENCIA:

INTERNO PEECL002 DETERMINACION DE COMPOSICION DE LECHE CRUDA

REFERENCIA Método AOAC 972.16: 1972Fat, Lactose, Protein, and solids in milk Mid-Infrared Spectroscopic Method.

5. DEFINICION PARAMETROS Y OBJETIVOS DE VALIDACION

PARAMETROS Aplica No aplica Objetivos de Validación Observaciones/Comentario:

SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD/ OTROS x

INTERVALO DE TRABAJO x Cumplimiento de objetivos de

validación en rangos bajo y alto. 2.5-5.80 %

LIMITE DETECCION x No aplica debido a que el porcentaje de grasas es alto y no se

requiere determinación del LD.

LIMITE CUANTIFICACION x

No aplica debido a que el porcentaje de grasas es alto, sin

embargo se confirmará en el rango bajo en cumplimiento de los

objetivos de validación planteados.

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EXACTITUD / PRECISIÓN

a. VERACIDAD x %R (90-110)

Se utilizará un MRC para rango bajo, medio y alto (INTI LACTEOS).

Se realizara 1 Análisis con 3 lecturas, para 3 niveles dentro del

rango establecido.

b. REPETIBILIDAD x %CVr ≤ 0,5%

Se realizara en 5 días, En cada día 4 repeticiones (total 20

datos) con leche cruda en ensayos independientes.


datos) con leche cruda con preservantes en ensayos

independientes.

c. REPRODUCIBILIDAD x %CVR ≤ 0,8%


datos) con leche cruda en ensayos independientes.


datos) con leche cruda con preservantes en ensayos

independientes. ( Con otro Analista)

LINEALIDAD

a. FUNCION RESPUESTA x

Y = mX + b

b = Menor al 20% del valor

promedio

m = 0,8 - 1,2

Se realizará con estándares EUROFINS para 12 niveles a lo

largo de la curva.

Se realiza la corrida de los 12 estándares, en 5 tiempos

independientes.

Se Calculará del promedio de intercepto, pendiente y

desviación estándar de las 5 curvas.

b. COEFICIENTE CORRELACION x R ≥ 0.6 (De preferencia mayor a

0,9)

Los límites establecidos en el FOSS Performance Qualification

MIlkoScan FT+ establecen un rango de 0,6-1 de coeficiente de

correlación.

Se calculará de los promedios de las 5 curvas.

INCERTIDUMBRE x %CVR ≤ 10%

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Anexo 8 - Porcentaje de Grasa (Material de Referencia Certificado)

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Anexo 9 – Certificado Traducción Resumen

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Anexo 10 - Fotografías

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Documents

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR … · INFORME DEL TRIBUNAL CALIFICADOR Quito, 11 de noviembre de 2015 Señora: Dra. Isabel Fierro DECANA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Presente