3
REVIEW Uneasy breather: the implications of dust mite allergens S. Sharma, P. M. Lackie* and S. T. Holgate* Acambis PLC, Peterhouse Technology Park, Cambridge and *Respiratory, Cell and Molecular Biology, Southampton General Hospital, Southampton, UK Epidemiological studies have demonstrated that there is a re- lationship between exposure to dust mite allergens and the incidence of allergic asthma. Surveys on the impact of the in- door environment on children and adults showed that this link between the potent allergens from house dust mite (HDM) Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) or Dermatophagoides farinae (Der f ) and the occurrence of allergic asthma in patients was unmistakable. Der p 1 is a major allergen from the house dust mite and nine different Der p antigens (Der p 1±9) have been identi®ed to date. Three of these, including Der p 1 are cysteine proteases while others are serine proteases. Der p 1 is a 30-kDa protein which is produced in the mid gut of the mite, where its role is to serve in the digestion of food substrates including human keratin [1]. Homes of patients who are HDM-sensitized contain high levels of Der p 1, Der p 2 and Der f 1 [2], although this is probably also the case in the homes of normal subjects. House dust mite faeces have been shown to contain high concentra- tions of Der p 1 (up to 10 mg/mL) and there exists a signi®cant association between the concentration of Der p 1 in house dust and the prevalence of sensitivity to HDM extracts and the IgE antibody levels [3]. The majority of adult asthmatics skin test positive to HDM and over 90% of dust mite allergic individuals have IgE antibody directed against Der p 1. As well as elevated IgE levels, these patients also have anti-Der p IgA and IgG, while normal subjects have only low titres of anti-Der p IgG [4]. It has recently been suggested that allergens such as Der p 1 are not only capable of provoking asthmatic attacks in sensi- tized patients, but are also causally linked to the origin of asthma in some individuals. It has been suggested that exposure to HDM allergens and asthma follows a two-step process, ®rstly the early exposure leading to sensitization and then repeated exposure leading to airway in¯ammation and bronchial hyper- reactivity. Several investigators have found that the relative risk of sensitization to HDM increases when levels of HDM increase [5, 6]. Increased levels of exposure result in a lower age of onset of the disease [7]. In asthmatic patients, seasonal variation in HDM levels has also been associated with variations in bron- chial hyper-responsiveness, where the levels of HDM seem to peak during late summer and autumn [8]. Despite the wealth of epidemiological data that implicates Der p 1 in the development of bronchial allergic in¯ammation, there are only limited data to address the exact molecular me- chanisms by which this might occur. Four main concepts for the action of Der p 1 have been suggested to account for the biological effects observed with Der p 1 in experimental in vitro and in vivo models (Fig. 1). There exists considerable evidence to show that Der p 1 acts as a potent allergen. In such cases, Der p 1 induces a Th2 lymphocyte-mediated immune response and the downstream consequences of an allergic in¯ammatory re- sponse. In humans, Der p 1 and other allergens from HDM induce local and systemic immunological and in¯ammatory changes in sensitized subjects. Bronchial challenge with these allergens results in the recruitment of helper and suppressor T lymphocytes [9], neutrophils, eosinophils and mast cells [10]. Activation of mast cells and eosinophils results in the release of potent pro-in¯ammatory mediators, such as histamine, prosta- glandin D 2 , cysteinyl leukotrienes, proteases, heparin, eosino- phil cationic protein and major basic protein [11]. Der p 1 and other HDM allergens may also in¯uence in¯ammatory pro- cesses through stimulating the secretion of mediators such as cytokines and enzymes, and up-regulation of pro-in¯ammatory adhesion molecules [12]. Der p 1 has been shown to bias human CD4 and CD8 T lymphocytes towards a type 2 cytokine pro®le thus impacting on immunological processes such as IgE up-regulation [13]. Der p 1 also affects immunological processes directly. CD23, the low-af®nity IgE Fc receptor, is a cell surface receptor found on B lymphocytes, eosinophils and dendritic cells. Whilst the precise role of CD23 on eosinophils and dendritic cells remains unclear, considerable evidence suggests that binding of IgE to CD23 on the surface of B lymphocytes provides a negative feedback signal to IgE synthesis. As the human CD23 molecule has been shown to be sensitive to cleavage by cysteinyl proteases such as Der p 1, it is reasonable to postulate that this will result in the enhancement of IgE synthesis through the inhibition of the normal suppressive feedback mechanism to the IgE- producing B lymphocytes [14]. In this scenario, synthesis of Der p 1-speci®c IgE and IgE against other allergens will be elevated, resulting in a non-speci®c enhancement of allergic responses. Recent studies have found that Der p 1 also cleaves the a sub-unit of the IL-2 receptor (CD25) from peripheral blood T lymphocytes. It has been shown that in doing so these cells show a markedly diminished proliferation and IFN-g produc- tion, suggesting that CD25 cleavage by Der p 1 may bias the immune response towards a Th2 pathway [15]. The importance of the cysteine protease activity of Der p 1 has been further demonstrated through its ability to enhance both total IgE and Der p 1-speci®c IgE synthesis in vivo, actions inhibited by the irreversible actions of the protease inhibitor E-64 [16]. Most recently, Ghaemmaghami and Shakib [17] have demonstrated that isolated human T lymphocytes can be conditioned through exposure to proteolytically active Der p 1 allowing them to trigger enhanced IgE synthesis from B lymphocytes. This is most likely due to a shift in the cytokine pro®le, with an elevation in IL-4 production and a concurrent reduction in IFN-g. Correspondence: S. Sharma, Acambis PLC, Peterhouse Technology Park, 100 Fulbourn Road, Cambridge, CB1 9PT, UK. E-mail: [email protected] Clin Exp Allergy 2003; 33:163±165 ß 2003 Blackwell Publishing Ltd 163

Uneasy breather: the implications of dust mite allergens

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Uneasy breather: the implications of dust mite allergens

������

���� � ���� � ��� ���������� �� ��� ���� ��� ���

�� ������� �� � ��� �� ��� �� �� ��������

������� �� �� ������� ���������� ����� �������� ��� �������� ���� ��� ��� ��������� �������� ��� ���� �� ������� ���� ��� ��� ���� ��� !"

�� ��� ���� ��� ���� �� ���� ������������ ���� ����� � � ���

��� ���� � ������� � ������ �� ���� � �� ��������� ��� ���

�� ����� �! ������ � ������� �����"� �� ��� ����� �! ��� ��

���� ��� ������� �� �� ����� ��� ������ ������ ���� �� � � ��

������� ��� ������ ��������� !��� ����� ���� � �� #�$%

#���� ���������� � ����������� #$�� �% �� #���� ����������

$������ #$�� ! % ��� ��� ���������� �! ������ � ������ � ��� ����

��� ��� ��������� $�� � & � � ��'�� �������� !��� ��� �����

���� � �� ��� � �� � !!����� $�� � ��� ���� #$�� � &()% ����

���� ���� *�� �� ����� ����� �! ������ ����� �� $�� � & ���

�"��� �� ��������� �� �� ������ ��� ��� �� ���������� $�� � & � �

+,��$� ����� � �� �� � �������� � ��� � � ��� �! ��� � ���

����� �� ���� � �� ����� � ��� � ���� �� �! !��� ����������

����� �� ����� ����� � -&.�

����� �! ��� ���� ��� ��� �$����� � /�� ����� � � ��

������ �! $�� � &� $�� � 0 ��� $�� ! & -0.� �������� �� � �

�������" ���� ��� ���� � ��� ����� �! ������ ���'����� �����

���� � �� !����� ���� ���� ����� �� ����� � � �� ����������

� ��� �! $�� � & #�� �� &,��1�% ��� ����� � ��� � � �� *����

����� �� �� ������� ��� ���������� �� �! $�� � & � ����� ����

��� ��� ���������� �! ���� � � �" �� �$ � ������ ��� ��� 2��

��� ���" ������ -+.� ��� ��'�� �" �! ����� ������� �� �� � ����

��� � �� �� �$ ��� ���� ),3 �! ���� � �� ������ � �� � �����

���� 2�� ��� ���" � ������ ��� ��� $�� � &� 4� ���� �� ��������

2�� ������� ����� ��� ���� ���� ���� ��� �$�� � 2�4 ��� 2�5�

�� �� ������ ���'���� ���� ���" ��� � ���� �! ��� �$�� � 2�5 -6.�

2� ��� �������" ���� ��������� ���� ��������� ���� �� $�� � &

��� ��� ���" ������� �! ������ �� ������� � ������� � ���� �

� /�� ��� ����� ��� ��� ���� �������" � ���� �� ��� �� � � �!

������ � ���� �� � ������ 2� ��� ���� ��������� ���� � ������

���$��������� ��� ������ !������ � �������� �������� *����"

��� ����" � ������ ���� �� �� ���� � /�� �� ��� ���� ��������

� ������ ���� �� �� � ���" �7����� �� ��� ������ �� �"����

����� � �"� ������� ����� ������ ���� !���� ���� ��� ����� �� � ��

�! ���� � /�� �� ���$ �������� ���� ������ �!�$ �������

-8� 9.� 2�������� ������ �! � ������ ������ � � ����� ��� �! �����

�! ��� � ����� -:.� 2� ������� � ��� ����� �������� ��� �� �� �

�$ ������ ��� ���� ���� ����� ���� � �� ��� �� ��� � �����

�� �� �"����������� ������� ����� ��� ������ �! �$ ���� ��

���� ��� �� ���� ������ ��� ������ -;.�

$��� �� ��� ������ �! �� ��� ���� ��� ���� ���� ��� �����

$�� � & � ��� ����������� �! ������ �� ������ � �7����� ���

����� ��� ���" � � ��� ���� �� ������� ��� � ��� ��������� ���

���� ��� �" �� �� �� � � ��� ������ <��� �� � �������� !��

��� ��� �� �! $�� � & ���� ���� ��������� �� ������� !�� ���

� ���� ��� �!!���� �������� � �� $�� � & � � ��� ������ �� %� ��

��� �� %�%������� #< �� &%� ����� � ��� ���� ������� �� ����� ��

���� ���� $�� � & ���� �� � ������ ��������� 2� ���� ������ $�� �

& ������ � ��0 �"�����"������ ���� ����� �������� ��� ���

���������� �����=������ �! �� ������ � �7�������" ���

������� 2� ������� $�� � & ��� ����� ��������� !��� �$

����� ����� ��� �"���� � �������� ��� ��� �7�������"

������� � ���� � /�� ���'����� >����� �� ��������� � �� �����

��������� ������� � ��� ����� ����� �! ������ ��� ���������� �

�"�����"��� -).� �������� ��� ��� ���� �� ��� ���� ����� -&,.�

4�� ��� �� �! ���� ����� ��� ��� ���� �� ������� � ��� ������� �!

������ ���� �7�������" ��� ������ ���� �� � ���� ��� �������

����� � $0� �"��� �"� ������� ����� ���������� ����� �� ��� ���

�� � ��� �� � ����� � ��� ��'�� ��� � ����� � -&&.� $�� � & ���

����� �$ ��������� ��" ���� �7����� �7�������" ����

������ ������� �� ����� �� ��� ������ �� �! ��� ����� ���� ��

�"��� ��� ��� ��/"���� ��� ���������� �� �! ���� �7�������"

����� �� ��������� -&0.� $�� � & ��� ���� ����� �� � �� �����

?$6� ��� ?$;� � �"�����"��� ������� � �"�� 0 �"��� ��

���*�� ���� ����� �� �� �������� ��� ��������� ���� ��

2�� ���������� �� -&+.�

$�� � & ���� �!!���� �������� ��� ��������� � �����"� ?$0+�

��� �����!*� �" 2�� <� ��������� � � ���� ���!��� �������� !����

�� > �"�����"���� ��� ���� �� ��� ����� � � ������ @� ��� ���

���� �� ���� �! ?$0+ �� ��� ���� �� ��� ����� � � ����� ���� ��

�������� ���� ������� �� ����� �������� ���� � �� �� �! 2�� ��

?$0+ �� ��� ���!��� �! > �"�����"��� ���� ��� � ����� ��

!������� � ���� �� 2�� �"����� �� 4� ��� ����� ?$0+ ��������

��� ���� ����� �� �� ���� � �� �� �������� �" �"��� �"� ���������

���� �� $�� � &� � � ���������� �� ��������� ���� �� � � �� ������

� ��� ����������� �! 2�� �"����� � ������� ��� �� � � ��

�! ��� ������ �������� �� !������� ������ �� �� ��� 2���

������ �� > �"�����"��� -&6.� 2� �� � ������ �� �"����� � �!

$�� � &����� *� 2�� ��� 2�� ��� ��� ����� ��������� � �� ��

��������� ������ �� � � �������� *� ����������� �! ������ �

����������

A����� ���� �� ���� !���� ���� $�� � & ���� ������� ��� �

������ � �! ��� 2�0 �������� #?$08% !��� ��� ������ �����

� �"�����"���� 2� ��� ���� ����� ���� � �� �� �� ����� �����

���� � �������" � � � ���� ���� !���� �� ��� 2<B�� �������

� ��� ������� �� ���� ?$08 �������� �" $�� � & ��" � �� ���

����� �������� ������� � ��0 ������" -&8.� ��� ���������

�! ��� �"��� �� �������� ��� � �" �! $�� � & ��� ���� !������

������������ ������� �� �� � �" �� ������� ���� ����� 2�� ���

$�� � &����� *� 2�� �"����� � �� %�%�� ��� ��� �� � ��� �" ���

������� ��� ��� ��� �! ��� �������� �� � ��� ��96 -&9.� ���

�������"� 5���������� ��� ���� � -&:. ���� ������������

���� ������� ����� � �"�����"��� ��� �� ���� � ���� �������

� ������ �� �������"� ����" ��� �� $�� � & ����� �� ���� ��

�� ���� �������� 2�� �"����� � !��� > �"�����"���� �� � �

���� � ���" ��� �� � �� !� � ��� �"��� �� ���*��� � �� ��

������ �� � 2�6 ������� �� ��� � ���������� ������ �� �

2<B���

?�������������C �� ������� 4���� � �?� ���������� ���������" �����

&,, <������� A���� ?���� ���� ?>& )��� DE�

���� �C ������������F����� �����

?� � � � 4�����" 0,,+G ��C&9+(&98

� 0,,+ >�������� ���� �� �� �� &9+

Page 2: Uneasy breather: the implications of dust mite allergens

2� ��� � �� �� ��� �������� ��� ������� ������� ����� �"

�$ ���������� � ���� ����" ��� �� ���������� ���� �� $�� � &

��" ����� � ���� ������ �� ��� � ���" �� ���� �� �������

�� �"��� �"� �������� ��� � �"� 2� ��� ���� ����� ���� $�� � &

�������� ��� �� ������ �� ������� ������� � �" �� ����� ���

��� � �� ���� �� ���� �� �������� ���������� �! �������� �����

-&;.� @�� �� ��� -&)� 0,.� ���� ������������ ���� $�� � & ������

� ����� �� �! �� ���� �� ���� � ��� '���� ��� �" ����� �� ������ �

�� ����� �" ��� ������� �! ������� �������� �������� -&). ����

!�� � ��� �� ������� ���� �� �������� ��������� ��� $�� � &�

������ �������� ���������� ��" ���� ������� �7�������"

��������� � �� ��� � ��� -0&.� � ������ �! ����� ������ ��

�� ���� �� ����� �� %� �� �� $�� � & ��������� ������ ��� ��� ������

������ ��� �������� �������" �� � ������ �! �������� ������� ��

�" -00.� ����� �������� ��� ����� �� �� � ��� ������� ���

��� ��� �! � � ���" ������ ��� ������ �� ������� ��� �� � ��� �!

$�� � & ��&&,0; -0+.� A���� �� ��� -06.� ���� �������� � � ���

*�� ��� � �������� !�������� !����� � ���� � ��D�� ����"��

������� �"����� ���� �� ���� � ��� ���� �! ����� $�� � � �����

��� ���� �� ������� �� ���� �� ����������� � ��� ������� �! ����

���������� �� ������ ����� �!!���� ����� �� ���� ���� � ���

�������� �! ��� �"��� �� �������� �� � ��� ��96�

�&���� ��"�� � ���������� ��� �! ��� ��'�� ��� ��������� ��

������ � ��� ��������� � ������� �� �! ��� � ���" ��� ����

����� 2� �� � �� ��� ��� � �" �! ����� ��������� � ��� � ���"�

-08.� ���� �� �������� � �������� ��� ������ �� ���������� �� ��

����� ������ �� ����� �������� ������ -09.� ������� ��

�"��� �"� �������� ��� � �"� $�� � & ��" ���� �� � � ��� ��� � �"

�! �&���� ��"�� �� $����������� �� �! �&���� ��"�� � ��� � �"

����� ������ � ��� ���� �! ���� ��!���� ��� ��� �� ���� �� � ����

������ �" ����� ���������� ���� ������ �� �� ��� ������ ��

� ���" � �����

��� ���������� ��� ����� �" �! ������ � ������ ��� ���� ��

����� �� ������ ��� A������� ��� ��� �!!���� �!�$���������

��� ������ �����" ���� ���� �� ��� � ������� � ��� ���� ���

�� %� �� �"������ �� � ��� ���� ����������� �" ��� ���� �! �������

� ������� �� �� %�%� �� ��� ������� A������" 2�� �� ��� -0:.

���� �������!���" ���� � /�� �� ����� �� �� �$ ��������� ��

������� � ���!�� ����� �! ���� �����" ���� � /�� �� �� �$

-0:.� ��� �������" � ��� ���� ����� ���� ������ �� �! � �����

�$ � ����� ������� � � ������� � /�� �� ����� �� ������

��� ���� � � � ��������������� ������ 7� � �� �� ���� ����

!�� �� ����� : ��"� -0;.� <������ ���� �� �� �$ � ������ ���

!������ �� � !!����� ������ �! ���� � /�� �� � ����� �� ������

� �� ��� ���� �! 2�� � ��������� ������ ���� �7����� �� -0).�

� ���� �� �� �� �� ���� ����� ��� � ��� ����� �! ������ � �����

�� �� �"����������� ������� �� ��� �" ������������ � ������ ��

�$ � ������ �� ������ ���� $�� � & ����! ���"� � � ����� ���� �

��� ��=� � � �� �! � ���" �"����������� ������ ��� �7�����

� �� -+,.�@� ���� ���� � � ���" ������ ��� ������ �� ������� ���

�� � ��� �! $�� � & ��&&,0; �� �� � � ���� � ���" �"����

������� ������ ��� �7����� ��� ���� *����" ��� ���� � ��

A������ �$ ���� *� 2�� ������ � ����� � �� ��&&,0;

��������� �������� ��� ������� �7�������" ��������� @� ���

���� �� ������������ ����� � ���� � � ��� ���� � � ��� � � � �� �������� ���� �� �������� � ���� ���� ������ ������ � ��������� ��� ����������� � � ������������� ���

��� �& ������ �� ���

� 0,,+ >�������� ���� �� �� ��� ������� ��� '(������� �� �������� ����������

Page 3: Uneasy breather: the implications of dust mite allergens

���" ������ ���� ��������� ����� �������� � �� �?2$ �����

������ �� ����" ��� ��� ������� �! ������� ���" � !�� ���� ����

�$ ��������� �� ��� ���� � / �� ����� ��� "�� �� � � ���

��� ���� �������� ������� ��� !�� � ��'�� ������ � ���������

�! ������ � ������� ������" �� ��� -+&.� ������������ ����

�?2$� �� � �� ��� ���� ����� ��� ������ ����� �����������

����� ��� �!��� ������� ����� �'��� �� � �� $�� � &� ���� � �

����� �� �$ ��������� ������� ������ �� �"����

������� ������ ��� ���� �" ��0 �"��� ��� 2�6 ��� 2�8

�������� ��� ���� �! 2�� ��� ��� ���� �� � �� � �������� ���

��������

����� � ������" � ���� !�� ���� �������� �� ��� ������ �!

����� ������� ����� �� ��� ��� �! ��������� �������� �� ���

����� � ����� #������ ���� ��� ����� � �� �� ������ �� ���

�������" �����H%� 2������ ���"� ����� � ���� �� ����� ���� ���

��� �� � � ���� ��� ��� � �" �! ��������� ���� �� ��� � ���� �� �

��� ���� ����� ���� �� ������ ���������� �� �� � ���� ���

������� �� ������� �� ����� ���� ���� �! ����� ��� ��� !�������

������ / �� ���� ������ � � �� =�� � ����� �! �������

���� ����

& 4�� �� 5� ������� ��� �4�� ��� � ����" �! ���� � ��� ���

��� ����� �� �� �! � �� ��������� � ������ � � ������ I 4�����" ?� �

2������ 0,,&G &,:C�6,9(&+�

0 ���� �� I� ?����� ?� $������ �� ��� 2����� � �� ��������� �

��� ���� � �� ���� �����" ������" � � �� � ������ ��������� 4�����"

&))9G 8&C9++()�

+ @����� 4� >'������� >��� � 4E������ ?� ����� ?� E'������

B2� ?� ������ ������ ��� � ������ �� ����� ���������C ��� � ��

������ ��� ����� ���� � �� ���� � � �"� ��� ��� 4�����" 2������ &))9G

:C9&(:�

6 ������� ��� �4� ?������ $� $��� � ���C ��������"� ������ �

� ������ ��� ��� ��������� �������� I 4�����" ?� � 2������ &);:G

;,C:88(:8�

8 ������� ��� �4� �� @ �� 4� $��� � �� ��������� ��� ������C

� ������� �� �������� I 4�����" ?� � 2������ &);)G ;+C6&9(0:�

9 ���� IE� @������� 4I� ���� � � �" �� ������ ���������C ����� �� ��

���� �����" �"������ ��� ������ �� �"���������� ������ �

�� ����� !��� ����� � !!����� �� ��� � ����� �! 4������ �� ?� � � �

4�����" &))&G 0&C8:+(;&�

: ���� � A� ������� ��� ������� ��� �4� ?�������� I� � ������ ��

����� ���� � �� �������� #$�� � &% ��� ��� ����������� �! ������ �

�� ������� B ���� I �� &)),G +0+C8,0(:�

; ��� ��� �� �� �� �� ����" I5� �� J� �� E� >���� �� ��

E��!!��� �<� �������� ��� �� �� � � ���" �"���������� ������

��� ������� � ������ �� ����� ���� � �� ��������� � ��� ���� � ��

������� I 4�����" ?� � 2������ &))6G )+C6:,(8�

) 5��/���/ ?� $ �/ �� 5������ ���� <A� 4� � � �� ?������� K�

E�" 4>� 4�������� ������ ����� ����� �! ��������������� ������

#KE�6% ��� ���������� #KE�;% ������� � ������� A���� ��

�������� � KE�; ����� � � ���� ����" ���������� �������� � ��

����� � ���������� ����������� 4�A��A��� � $ � &);:G &+9C9,,(6�

&, � � 2� <�� ��� 4�� KL>"��� � �� ��� ?������ � �������� ���*�� �!

������ ������ �!��� ��������� ������ ������� � ����������

4� A�� A��� � $ � &))0G &68C&098()�

&& $ �/ �� 5��/���/ ?� 5������ ���� <A �� ��� �����"��� ���

��� ����� � ��������������� ������ ��� �� ��������� ������

���������� ������� � ����� ���4�A��A��� �$ � &);)G &+)C&+;+()�

&0 �������� 4>� A��� �� A4� A�������� $I� 2�������� ���

!���� ��� �! ��� ��������" �� ���� ��� ���A��� � I &))8G ;C&0:(6)�

&+ 5���������� 4� A�� �� 4� 5���� � ������ �<� ���� � <�

����� � ���� ������ ���� ����� ������ ��� �" ��� ��� �� �

�������" �! ��� ���C ��� �������"� � ��� � �" �! ��� ��'�� � ��

�������� $�� � & ���� � ��� � ����� �� ������� ���� 2�6 ��� ����

2<B��� ��� I 2������ 0,,&G +&C&0&&(9�

&6 ��� �� ?A4� >����4������ >I� �� ������$2�4��'�� ����� ����

� �� �������� � ������ ��� 2����������� � � ������� �" ������ � �"

����� �� ?$0+C ����� ������� �� �" ��� ���������� I � ��� &))8G

&;0C&8+:(66�

&8 �����/ K� ������ �<� ���� � <� �������"� � �������� �! ?$08�

��� ����� ����� � �! ��� ����� � ���� �������� � 0 ��������� �"

$�� � &� � ��'�� � �� �������� � �� �"��� �� �������� ��� � �"�

I � � �� &));G &;:C0:&(8�

&9 5���� � �����/ K� ������ �<� ���� � <� ��� �"��� �� ��������

��� � �" �! ��� ��'�� ���� � �� �������� $�� � & ������ ���" ��������

��� ����������� � � ��� ���" ��������� I � � �� &)))G

&),C&;):(),&�

&: 5���������� 4� ���� � <� ����� � ����� ���� ���� ����

���� � ���� �" �������"� � ��� � �" �! ��� ��'�� ���� � �� ��������

$�� � & �� ���� �������� ����������� � � �"����� � �" > ������

?� � � � 4�����" 0,,0G +0C:0;(+0�

&; ������� ?4� E �� ?� A �� �? �� ��� 4�������� �� �!

������� � �" � ��� ������ �� �� ���� �� �" ��� ����� ���� � ��

�������� $�� � &� 4� A�� A��� � ?��� �� > �� &))8G &0C+9)(:;�

&) @����@ ������ �������? �� ���$�� � & !�� � ����� ������� ���� ��

�������� ��� ���" �" � ����� �� �! � ��� '���� ���� I ?� � 2����� &)))G

&,6C&0+(++�

0, @�� �� @ ���� �� ������� ? �� ��� M���� ��� �� ���������� ���

� ����� ��� ����"��� �! � ��� '���� �� �"��� �� !����� �� � ������

�! �� ���� �� ����� �� ����� ���� � �� �������� $�� � &� ?� � � �

4�����" 0,,,G +,C9;8();�

0& ��'�!��� I�� ������� <� ������� ?54� ��� ���� ��� �������� ��� ���

������� ���� � ��� � ���" ������ ��� �� ���� �� �������

���� ��� ��� 4� A�� A��� � ?� � ?��� �� &))9G &8+C&999(:6�

00 A��/��� ?� ����!��� AI� $���� � I �� ��� ? ������� �����

������ ���� ����� ���� � �� ��������� ������ ������� �

������� � �" �! ����� ������ �� �� ���� �� ����� �� %� ��� 4� I

A��� � ?��� �� > �� &)))G 0,C&0+;(8,�

0+ I��� AI� A��/��� ?� A��'�� � ����� 45� 4��������� �

��� �� �� <���� ���� �!!���� �! ��� �� � � �� �! ��� �"��� ��

�������� ��� � �" �! ��� ��'�� ����� ���� � �� �������� $�� � & �"

� ����� ���� �������� �� � ���� ?� � � � 4�����" 0,,,G +,C:;6()+�

06 A���� B� ?� ��� �?� >������ B��� I�� �N ?� ������ 5I�

#���� ���������� � ����������� ��� � ������� � ������� �� �! � ���"

�� ���� ��C ���� �! �"��� �� ���������� ��� A��� � I 0,,,G &9C+,)(&8�

08 ?������ I4� A����� >>� � !��� AB� ���� �� �E� < ������ I�

@�� �� ��� ��� � ����� � ����� ����� &���� ��"�� � � �������� �

� �� ��� ���� I ?� � 2����� &);;G ;0C09(+9�

09 ��� ����������� @� 4���� &���� ��"�� � ��*� ���"C �� ����� ���

4��� ?� � >��� &))+G 6;C&:&(;)�

0: 2�� 4� ������� � ���� O� ������� �� �! �� ��� � � ���� � �

��� ���" ��� ��� ��� ����� ���� � �� � ������ #���� ����������

� ������������ � ����� ��'������ I�� I � � �� &)::G 6:C+::(;+�

0; �� ����A� � ��O��� ��4��@�����O�?������O�?���?�A�

��� ������ ������ � � ���" �7����� �� � �� ��� � ��� 2�� 4���

4�����" 2������ &)):G &&0C0)8(+,0�

0) ����� $>� ?��� >� @������ @ �� ��� 4�� �2�� �!*���" � ��� ��

������������ � ��������� �� ��� ������ �! �������� ���� � ��� ���

I 4�����" ?� � 2������ 0,,&G &,:C&,08(++�

+, ������ �� �� � �4� ?�����?? �� ��� �!!���� �! ��&&,0;� � � ���"

������ �� �� � ��� !�� $�� �&� �� ����� ���� � �� � ������ ������

� ���" �"�������� � �"� �7����� �� ��� �"���� � ���� � ��� ��

� ��� >���� B����" ���� 4� I A��� � ?� � ?��� �� 0,,&G &9+C

4;90�

+& ������" E5� E �� I?� ������� A4� ��� ��������� ������ � ���"

�"���������� ������ � � ����������� �� ���� ����� �! ������

� � ���� ��� 2�6 ��� 2�8 ���������� I 2������ 0,,&G

&99C9);0()&�

��� ������� ���� �$ ��� �� � ��������� ���

� 0,,+ >�������� ���� �� �� ��� ������� ��� '(������� �� �������� ����������