Estimating Prion Adsorption Capacity of Soil by BioAssay of Subtracted Infectivity from Complex Solutions (BASICS)Memperkirakan Prion Adsorpsi Kapasitas Tanah oleh bioassay of dikurangi Kemudahan penularan dari Complex Solusi (DASAR)

ABSTRAK

Prion , agen infeksi scrapie , penyakit kronis wasting dan spongiform ensefalopati menular lainnya , yang gagal melipat protein yang sangat stabil dan tahan terhadap degradasi . Prion dikenal untuk mengasosiasikan dengan tanah liat dan komponen tanah lainnya , meningkatkan ketekunan mereka dan mengejutkan , transmisibilitas . Saat ini , beberapa metode deteksi dan kuantifikasi ada untuk prion dalam tanah , menghambat pemahaman tentang prion ketekunan dan penularannya di lingkungan. Variabilitas dalam titer menular jelas prion ketika terikat ke tanah telah mempersulit upaya untuk mengukur kapasitas pengikatan tanah untuk infektivitas prion . Di sini, kita mengukur kapasitas prion adsorpsi keseluruhan , tanah lempung berpasir ( SLS ) biasanya ditemukan di CWD daerah endemik di Colorado , dan lempung montmorillonit dimurnikan ( MTE ) , yang sebelumnya ditunjukkan untuk mengikat prion , oleh bioassay of dikurangi Kemudahan penularan dalam Solusi Complex ( DASAR ) . Kami diinkubasi prion positif 10 % homogenat otak dari tikus sakit parah terinfeksi dengan Rocky Mountain Lab strain prion mouse disesuaikan ( RML ) dengan 10 % SLS atau MTE . Setelah 24 jam sampel disentrifugasi lima menit pada 2006g dan supernatan bebas tanah itu intracerebrally diinokulasi ke prion tikus indikator rentan . Kami menggunakan jumlah hari pasca inokulasi penyakit klinis untuk menghitung titer menular yang tersisa dalam supernatan , yang kita dikurangi dari titer mulai menentukan kapasitas prion menular pengikatan SLS dan MTE . DASAR menunjukkan SLS terikat dan dihapus $ 95 % dari infektivitas . Dosis mematikan MTE terikat dan dihapus ( 99,98 % ) dari prion dari inokulum , efektif mencegah penyakit pada tikus . Data kami menunjukkan kapasitas prion mengikat signifikan tanah dan kegunaan BASICS untuk memperkirakan beban prion dan menyelidiki ketekunan dan dekomposisi di lingkungan. Selain itu, karena MTE berhasil diselamatkan tikus dari penyakit prion , MTE dapat digunakan untuk perbaikan dan dekontaminasi protokol .

IntroductionPrion adalah agen menular encephalopathies spongiform menular ( TSEs ) . Gagal melipat , isoform patologis ( PrPSc ) dari protein normal mamalia prion ( PrP C ) asosiasi dengan infektivitas prion , umumnya menolak degradasi protease , andoften membentuk larut , agregat amyloidogenic . Prion mampu transmisi horizontal antara hewan dan transmisi langsung dari lingkungan yang terkontaminasi . Untuk alasan yang tidak jelas , transmisi lingkungan langsung dari prion tampaknya terbatas pada scrapie dan penyakit kronis wasting ( CWD ) prion , dan tidak muncul untuk menjadi komponen ekologi bovine spongiform encephalopathy ( BSE ) atau lainnya TSEs . Fenomena ini mungkin berhubungan dengan scrapie dan berbagi lymphotropic serupa, shedding dan karakteristik transmisi CWD . Prion menular cenderung disetorkan ke lingkungan melalui penumpahan pencernaan , bahan plasenta , deposito tanduk beludru dan dekomposisi kematian prion - positif . Setelah di lingkungan , penelitian telah menunjukkan PrPSc untuk menyerap kuat untuk komponen tanah , tetap menular dan bertahan selama bertahun-tahun . Transmisi tidak langsung paling mungkin terjadi melalui konsumsi insidental dan geophagic tanah atau fomites terkontaminasi lainnya , serta perilaku rusa sign- pos seperti menggores dan menandai cabang menggantung.

Bukti eksperimental menunjukkan bahwa hubungan sangat kuat adsorpsi prion untuk koloid tanah , atau tanah liat ( didefinisikan sebagai partikel , 4 mm ) , mungkin bertanggung jawab untuk umur panjang dalam lingkungan [ 18,19 ] . Penelitian telah menunjukkan konten persen - liat tanah secara signifikan mempengaruhi kapasitas tukar kation tanah dan muatan negatif secara keseluruhan [ 26 ] . Interaksi elektrostatik dan hidrofobik antara protein prion dan tanah liat diperkirakan untuk menengahi ini aktivitas adsorpsi non - spesifik [ 27-30 ] . Secara khusus , montmorillonite ( MTE ) , yang smectite clay yang paling sering terjadi , telah sebagian besar terlibat dalam adsorpsi prion di lingkungan [ 31 ] . MTE adalah 02:01 clay phyllosilicate terdiri dari 2 silika terdiri molekul tetrahedral mengapit satu aluminium oktahedral terdiri molekul , membentuk lembar . Sebuah ruang interlayer ada antara lembar mampu memperluas .2 nm tergantung pada konsentrasi kation dari solusi. Telah dihipotesiskan bahwa prion dapat memasuki daerah interlayer ini seperti protein lain . Namun, Johnson et al . [ 31 ] tidak menemukan bukti tentang hal ini dalam sistem eksperimental dan penelitian lain menunjukkan protein ekstensif berlangsung akan diperlukan [ 32 ] , yang tidak mungkin untuk PrPSc . MTE adalah lazim di seluruh barat gunung AS, termasuk CWD daerah endemis [ 33,34 ] . Model menunjukkan bahwa prevalensi MTE pada tingkat lanskap dapat menjelaskan dan memprediksi prevalensi CWD , yang dapat melebihi 20 % di cervids bebas mulai.

Komponen tanah lainnya seperti bahan organik , kuarsa , tanin dan asam humat juga telah terlibat dalam adsorpsi prion . Seluruh tanah juga termasuk zat humat sangat reaktif , yang memiliki besar luas permukaan spesifik dan tinggi kapasitas mengikat [ 40 ] . Asam humat dapat permukaan mantel mineral menanamkan muatan negatif bersih [ 41 ] . Namun, karena struktur tersier diketahui PrPSc , interaksi tertentu andadsorption dinamika ke tanah dan substrat humat belum diidentifikasi.Hubungan adsorpsi yang kuat antara protein prion dan tanah telah terbukti sulit untuk mengukur atau sebaliknya , membatasi sensitivitas deteksi prion , estimasi kapasitas adsorpsi prion tanah dan kemajuan umum dalam mempelajari prion di lingkungan. Selain itu , deteksi prion dalam tanah telah berhasil hanya dalam percobaan laboratorium dengan menggunakan berbagai metode yang berbeda termasuk antibodi pelabelan [ 38 ] , elektroforesis [ 37 ] , bioassay [ 22 ] , ekstraksi deterjen [ 36 ] dan protein misfolding amplifikasi siklik ( PMCA ).Sampai saat ini, hipotesis interaksi tanah sebagian besar telah ditunjukkan dengan protein prion rekombinan, yang mungkin berinteraksi secara berbeda dengan tanah daripada gagal melipat glycosolated, prion agregat. Investigasi sebelumnya hubungan tanah-prion menggunakan homogenat seluruh otak yang berisi tikus dan hamster prion diadaptasi telah berusaha untuk menghitung jumlah PrPSc terikat dengan tanah. Tapi PrPSc tidak selalu berkorelasi dengan infektivitas prion dan studi memperkirakan infektivitas menggunakan pecahan tanah prion terikat telah menghasilkan data yang bertentangan. Prion Tanah-terikat tampaknya meningkatkan infektivitas setelah inokulasi lisan [22], tetapi menurunkan infektivitas pada intraserebral (ic) inokulasi [23]. Untuk menghindari masalah ini, dan lebih akurat mengukur kapasitas pengikatan prion menular dari tanah, kami mengembangkan alat tes converse. Kami meneliti kapasitas adsorpsi prion ke tanah menggunakan assay pengurangan infektivitas dititrasi strain prion. Metodologi ini memungkinkan pengukuran terikat dan murni prion bukan prion terikat tanah, yang dapat mengubah infektivitas. Kami menghitung kapasitas adsorpsi dari dua jenis tanah, seluruh Colorado tanah lempung berpasir (SLS) dan lempung montmorillonit murni (MTE) dengan pengujian infektivitas sisa supernatan dari matriks prion-tanah menggunakan TgA20 bioassay tikus [45]. SLS terikat lebih dari 95% dari prion infektivitas dan MTE terikat lebih 99,99% infektivitas prion. Data ini mempromosikan DASAR sebagai alat yang efektif untuk mengukur adsorpsi prion ke tanah sebagai fungsi dari infektivitas dan MTE sebagai senyawa potensial untuk bioremediasi prion terkontaminasi solusi. Kami lebih lanjut mengusulkan bahwa DASAR dapat meningkatkan perkiraan kontaminasi lanskap yang mungkin ada di scrapie atau CWD daerah endemik, sehingga meningkatkan pemahaman kita tentang isu-isu yang lebih besar dari prion ketekunan lingkungan.

Methods

MiceTikus TgA20 over-mengekspresikan tikus PrPC yang dihasilkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [45] dan memungkinkan untuk analisis kuantitatif LD50 infektivitas [46-48], didefinisikan sebagai dosis prion yang membunuh setengah dari tikus diinokulasiEthics StatementTikus dibiakkan dan dipelihara di Lab Animal Resources, diakreditasi oleh Asosiasi untuk Penilaian dan Akreditasi Lab Animal Care International, sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Komite Kelembagaan Perawatan Hewan dan Penggunaan di Colorado State University (Protokol ID: 09-1580A). Inokulasi intraserebral dilakukan di bawah anestesi Isoflurane, dan tikus eutanasia menggunakan CO2 inhalasi untuk efek diikuti oleh pemenggalan kepala. Semua upaya dilakukan untuk meminimalkan penderitaan.SoilSLS Whole digunakan untuk penelitian ini bersumber dari peternakan swasta di Southern Colorado terletak di sisi timur Pegunungan Rocky dan dalam unit manajemen permainan yang terus menguji negatif untuk CWD pada populasi cervid bebas mulai [49]. Tanah dikumpulkan dengan (AC Wyckoff) izin pemilik tanah, tidak ada izin tambahan atau izin yang diperlukan untuk studi lapangan dijelaskan. SLS adalah pasif udara kering, serial disaring terlebih dahulu melalui saringan 1 cm untuk menghilangkan batu dan puing-puing, kemudian melalui saringan 2 mm dan diautoklaf (tanah kering, 90 menit pada 120uC) untuk mengurangi agen insidental biotik alami ada di tanah. Montmorillonite (bubuk Western Bentonit) bersumber dari Panther Creek, Co dan dipasok oleh Ward Ilmu Pengetahuan Alam (San Luis Obispo, Ca).Soil AnalysesAnalisis klasifikasi tanah seluruh tanah dilakukan oleh Tanah Colorado State University , Air dan Tanaman Laboratorium Penguji ( Fort Collins , Co ) . X - ray analisis difraksi mineralogi dari seluruh tanah dilakukan oleh KT Geoservices , Inc ( Gunnison , Co ) . Analisis tanah Seluruh termasuk persentase XRD berat untuk sebagian besar (whole rock) dan fraksi liat ( , 4 mm ) , pH , persen bahan organik , dan klasifikasi tekstur tanah dari elemen dasar ( Tabel 1 ) . Definisi berikut ini digunakan untuk klasifikasi mineral lempung : Mixed -Layer Illit / Smektit - Sebuah kelompok mineral lempung yang mengandung interlayered atau interstratified Illit dan Smektit . Jenis lapisan campuran diidentifikasi oleh mineral yang terlibat ( Illit dan Smektit ) , jenis pesanan atau menumpuk di sepanjang sumbu Z ( acak atau tidak memerintahkan ) , dan proporsi mineral yang terlibat ( 10 % Illit dan 90% Smektit ) . Hilt dan Mica - Umum mineral non - berkembang yang silikat terhidrasi yang mengandung kalium , silika dan aluminium . Kaolinit dan Chlorite - non - memperluas mineral aluminium silikat liat hydrous umum . Lempung montmorillonit tidak dianalisa lebih lanjut , spesifik diperoleh dari Material Safety Data Sheet ( MSDS ) lembar yang disediakan oleh pemasok .Sources and Preparation of Prion InoculaThe Rocky Mountain Lab passage 5 strain tikus disesuaikan scrapie (RML5) sebelumnya dijelaskan [50]. Kami berasal strain TgA20RML dengan terjadi penyaluran RML5 ke tikus TgA20, sehingga inokulum dengan sekitar satu log lebih rendah titer infektivitas dibandingkan dengan RML5 asli (lihat Tabel 2). Homogenat otak tikus klinis sakit siap untuk 10% pengenceran di PMCA penyangga (4 mM EDTA, 150 nM NaCl dalam PBS) dan terdilusi menjadi 1% menjadi sama disiapkan 10% TgA20 homogenat otak yang normal (NBH) seperti yang dijelaskan sebelumnya.

BioAssay of Subtracted Infectivity from Complex Solutions (BASICS)Kami melakukan sebuah uji infektivitas pengurangan untuk memperkirakan kapasitas pengikatan SLS dan MTE tanah (Gambar 1). Kami menyiapkan 10% w / solusi tanah vol dengan menambahkan tanah kering untuk disiapkan sebelumnya 10% homogenat otak (misalnya 30 mg tanah kering ditambahkan ke 270 ml homogenat). Semua inokulum, dengan dan tanpa tanah, diinkubasi pada 23uC selama 24 jam pada rocker untuk menyeimbangkan maksimal mengikat dalam matriks kompetitif dengan dekomposisi homogenat otak. Sampel kemudian disentrifugasi selama 5 menit pada 2006g (Accuspin Micro, Fisher Scientific, Waltham, Ma) untuk memperjelas solusi partikel tanah, sehingga mengurangi infektivitas prion terikat tanah atau MTE dari infektivitas prion yang tersisa dalam supernatan. Kelompok Inokulasi termasuk non-tanah diperlakukan TgA20RML dan RML5 untuk menetapkan dasar titer infektivitas, pengobatan eksperimental TgA20RML dan RML5 dengan SLS atau MTE tanah, dan kontrol negatif NBH dengan SLS.

Tikus dibius yang intracerebrally diinokulasi dengan 30 mlof inokulum ( dengan 1 % Pen - Strep ditambahkan) seperti yang dijelaskan sebelumnya [ 51 ] . Setiap kelompok perlakuan terdiri dari 5-7 tikus . Onset penyakit klinis diukur dengan mencetak tikus dari normal ( 0 ) untuk menunjukkan tanda-tanda klinis terminal ( 4 ) untuk 7 tanda-tanda klinis yang berbeda termasuk ataksia , akinesia , hiperaktif ( 0-3 skala ) , ekstensor refleks , ekor kekakuan ( 0-2 skala ) , penurunan berat badan dan tremor . Tikus yang mendapat skor komposit dari 9 atau lebih besar , skor klinis tunggal 4 , atau kelumpuhan menunjukkan eutanasia dan hari pasca inokulasi ( DPI ) untuk penyakit klinis dicatat. DPI digunakan untuk menghitung titer log infektivitas masing-masing inokulum berdasarkan penentuan LD50 sebelumnya untuk RML pada tikus TgA20 [ 2,45,52 ] . Kami menggunakan linear persamaan y = 11,45 - 0.088x ( y , logLD50 per gram dari otak , x , waktu inkubasi di DPI penyakit terminal ) untuk menghitung titer infektivitas sebagaimana dimaksud dalam Reed dan Muench [ 48 ] . Beberapa tikus non - klinis dari masing-masing kelompok MTE - diinokulasi juga eutanasia setelah 130 DPI , dan DPI 200 ( akhir penelitian ) untuk menguji jaringan otak mereka untuk tingkat sub - klinis prion oleh protein seri misfolding amplifikasi siklik ( sPMCA ) . Jaringan otak dikumpulkan dari semua tikus untuk blot Barat ( disimpan di 280uC ) dan subset dari otak tikus juga sampel untuk analisis histologis ( 2/3 otak itu tetap di 10 % formaldehida , bagian yang tersisa adalah beku ) . Analisis statistik kurva survival Kaplan - Meyer dan t - tes dari pelajar log infektivitas dilakukan dengan menggunakan Prism 5 ( GraphPad , La Jolla , Ca ).

sPMCA and Western BlottingJaringan otak tikus klinis dan non - klinis , serta sampel dari masing-masing inokulum yang diuji oleh blotting Barat sebelum dan sesudah sPMCA . Sebelum uji , jaringan otak yang dikumpulkan dari tikus homogen mengikuti metode Meyerett et al . [ 51 ] . sPMCA amplifikasi substrat terdiri dari 25 ml dari 10 % TgA20 NBH dikombinasikan dengan 25 ml sampel dalam 0,2 ml tabung . Tabung ditutup dengan parafilm , dimuat ke dalam holding tray dan ditempatkan dalam bak air 37uC di Misonix 4000 sonikator tanduk ( Qsonica Inc , Farmingdale , NY ) . Sampel disonikasi pada sekitar 200 watt ( daya max 70 % ) selama 40 detik setiap 30 menit selama 24 jam , yang merupakan satu putaran . Untuk setiap putaran berikutnya , 25 ml dari masing-masing sampel dari babak sebelumnya ditambahkan ke 25 ml segar NBH . Duplikat dari setiap sampel menjadi sasaran 6 putaran PMCA untuk menyeimbangkan sensitivitas yang diinginkan ( .80 % dari 1027 pengenceran sampel prion terdeteksi positif ) dan spesifisitas ( 0,98 % sampel NBH tetap negatif ) dari uji deteksi . Setiap kelompok sampel diolah dengan setidaknya lima kontrol negatif NBH dan satu kontrol plat positif ( CWD positif homogenat otak rusa E2 , 1:10.000 ) . Untuk visualisasi dengan western blot , 18 ml sampel dicerna dengan 2 mlof50 mg / ml proteinase K ( PK , Roche , Basel , Swiss ) selama 30 menit pada 45uC . Reaksi dihentikan dengan menambahkan lithium dodesil sulfat sampel loading penyangga ( Invitrogen , Carlsbad , Ca ) dan mendidih sampel selama 5 menit pada 95uC . Sampel dielektroforesis melalui 12 % gel sodium dodecyl sulfat poliakrilamida ( Invitrogen ) kemudian elektro - dipindahkan ke Immobilon PSQ PVDF membran ( Millipore , Billerica , Ma ) dalam transfer penyangga ( Invitrogen). Membran diblokir selama 1 jam dengan susu tanpa lemak 5 % dalam PBS dengan 0,1 % Tween 20 , dan diinkubasi semalam di 4uC di Superblock ( Pierce , Waltham , Ma ) dengan HRP - terkonjugasi anti - PrP Bar - 224 monoklonal antibodi ( SPI bio ) diencerkan 1:20.000 . Bercak dicuci min 6610 di PBS dengan 0,2 % Tween 20 sebelum memvisualisasikan protein menggunakan Immobilon chemiluminescent substrat ( Millipore ) dan sistem dokumentasi gel Fujifilm LAS 3000 .

ImmunohistochemistryJaringan membedah disiapkan dan bernoda untuk deteksi PrPSc seperti yang dijelaskan sebelumnya [51] dengan modifikasi berikut. Secara singkat, jaringan diobati dengan DAKO solusi pengambilan sasaran (DAKO, Carpinteria, Ca), kemudian dengan asam format untuk menurunkan PrPC. PrPSc diberi label dengan anti-PrP BAR224 diikuti dengan inkubasi dengan membayangkan sekunder HRP-terkonjugasi antibodi anti-tikus yang divisualisasikan dengan chromagen 3-Amino-9-ethylcarbazole (DAKO). Hemotoxylin dan glial berhubung dgn urat saraf asam protein (GFAP) noda astrosit diaktifkan dilakukan oleh Colorado State University Histologi dan Laboratorium Diagnostik seperti yang dijelaskan sebelumnya [51]. Secara singkat, slide diobati dengan DAKO sasaran solusi pengambilan kemudian diobati dengan anti-GFAP kelinci antibodi primer di 1:100 (Cell Marque, Rocklin, Ca). Antibodi anti-kelinci-kambing biotinillated sekunder digunakan dengan (BioGenex, San Romano, Ca) Peningkatan Alkaline Phosphatase Red Detection Kit (Ventana, Tucson, Az).

ResultsDalam studi ini kami mengumpulkan tanah dari daerah di selatan Colorado dengan komposisi tanah yang mirip dengan CWD daerah endemik tetapi dengan tidak ada kasus dilaporkan CWD. Analisis komponen tanah mengungkapkan kandungan liat mirip dengan yang ditemukan di daerah Colorado menunjukkan prevalensi tinggi (Tabel 1). Secara khusus, tanah liat smektit MTE, sebelumnya terbukti rajin mengikat prion [31] merupakan sekitar 2% dari total tanah dan 19,1% dari kandungan liat total dalam sampel kami.

Inkubasi dari 1 % TgA20RML dan 1 % RML5 prion dengan baik SLS atau MTE secara signifikan mengurangi infektivitas bioassay , mengakibatkan penyakit tertunda klinis ( p , 0,05 , Gambar 2 dan Tabel 2 ) . Secara khusus , SLS inkubasi mengurangi infektivitas bioassay dari TgA20RML sebesar 28,2 kali lipat , penurunan 96,5 % pada infektivitas . Infektivitas inokulum yang sama diinkubasi dengan MTE berada di bawah batas deteksi bioassay ( 130 DPI [ 46 ] ) , yang menyebabkan semua tikus yang masih hidup sampai akhir studi pada 200 DPI tanpa tanda-tanda klinis penyakit . Demikian juga , infektivitas inokulum RML5 berkurang sebesar 21,4 kali lipat , atau 95,3 % , setelah inkubasi dengan SLS . Kapasitas pengikatan rata-rata SLS untuk RML prion di kedua inokulum adalah unit LD50 / g tanah . Inkubasi RML5 dengan MTE menghasilkan total removal dekat infektivitas dengan hanya satu tikus menjadi sakit , menyamakan dengan setidaknya penurunan 1.380 kali lipat dalam infektivitas . MTE -benar dihapus dosis mematikan prion TgA20RML ( 1,76104 unit LD50 ) , menunjukkan bahwa kapasitas mengikat RML5 adalah setidaknya 5,636108 unit LD50 / g MTE .

Untuk menentukan apakah tikus non-klinis sakit direplikasi tingkat subklinis prion, kami berusaha untuk memperkuat jumlah menit prion dari otak mereka menggunakan sPMCA. Kami mendeteksi prion dalam 2/7 otak dari tikus non-klinis diinokulasi dengan TgA20RML pra-terserap dengan MTE dan 2/4 otak dari tikus non-klinis diinokulasi dengan MTE teradsorbsi RML (Gambar 3, Tabel 3). Hasil ini menunjukkan bahwa tingkat sub-klinis prion ada pada beberapa individu meskipun kurangnya penyakit klinis. Untuk mengkonfirmasi pengamatan ini, kami juga menyelidiki neuropatologi dalam tikus dan membandingkannya dengan tikus sakit klinis. Pemeriksaan histologis untuk deposito PrPSc, spongiosis dan astrogliosis mengungkapkan perbedaan antara histopatologi tikus prion-diinokulasi SLS-terserap dan tunggal MTE teradsorbsi RML5-tikus yang diinokulasi menjadi sakit klinis (Gambar 4). Kami tidak terdeteksi PrPSc atau spongiform lesi dan hanya astrogliosis ringan pada otak dari tikus non-klinis diinokulasi dengan kontrol NBH (panel A dan G) dan MTE-terserap TgA20RML (D dan J). Kami mendeteksi deposit kecil PrPSc dan spongiosis dan sedikit lebih astrogliosis di otak mouse klinis sakit tunggal diinokulasi dengan MTE-teradsorpsi RML5 (F dan L). Sebaliknya, kami mengamati baik menyebar dan belang-belang PrPSc agregat dan ringan sampai parah dan spongiosis astrogliosis dalam otak dari tikus sakit klinis diinokulasi dengan prion tak teradsorbsi (B dan H) dan seluruh tanah teradsorbsi TgA20RML (C dan I) dan RML (E dan K). Bersama dengan analisis biokimia, data ini mengkonfirmasi infeksi prion pada tikus sakit klinis, serta infeksi sub-letal pada tikus non-klinis, yang sekarang kita sebut sub-klinis tikus sakit.